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Trypanosoma congolense, T. vivax, and T. brucei brucei are the causative agents of a devastating disease of livestock, known as African animal trypanosomiasis (AAT) or nagana, occurring in 38 African countries in the sub-Saharan region. Without a vaccine, the control of the disease relies on vector control, chemotherapy, and diagnosis, which is essential for appropriate treatment and follow-up. Serological diagnosis, although applicable in the field according to the test format, has limitations. It lacks antigen standardization, sensitivity and specificity, with rapid diagnostic tests (RDTs) being often inaccessible. The aims of this thesis were to: (i) characterize the diagnostic potential of proteins identified and studied in the host laboratories, (ii) select, from "omics" data, new targets and evaluate their diagnostic potential individually and in combination, and, (iii) identify immunogenic proteins from proteomic and immunoinformatic analysis of the trypanosome secretome. Diagnostic potential of candidate proteins was explored, after their expression and purification, by indirect ELISA with bovine sera from experimental infections and sera from cattle naturally infected by trypanosomes. Individually, the proteins showed low sensitivity. However, combining proteins of equivalent immunoreactivity significantly increased the sensitivity of the tests with a specificity that remained satisfactory. These results constitute a proof of concept of the performance of protein combinations in the diagnosis of AAT. It provides an opportunity to explore new innovative approaches, including the combination of immunogenic peptides of different immunoreactive proteins in the form of chimeras for serological diagnosis. Furthermore, and in consideration of their performance, none of the newly tested proteins could be included individually in an RDT. To find appropriate candidates, we identified trypanosome secreted/excreted proteins by mass spectrometry. Using epitope prediction analysis, we identified approximately 100 putatively immunogenic proteins with multiple epitopes in their sequences. The reactivity analysis of sera from different bovine breeds with the trypanosome secretome showed that the proteins were strongly recognized by the antibodies of the sera used and corresponded mainly to four molecular sizes. At these sizes, a significant number of proteins characterized in silico as immunogenic were detected. These results provide a reliable data for selection of new proteins to be include in serological tests for AAT. They also provide a better understanding of the differences in humoral responses of cattle breeds with different susceptibility to trypanosomosis., Trypanosoma congolense, T. vivax et T. brucei brucei sont les agents responsables d’une maladie dévastatrice du bétail, appelée trypanosomose animale africaine (TAA) ou nagana, qui touche 38 pays africains de la région subsaharienne. En absence du vaccin, le contrôle de la maladie repose sur la lutte anti-vectorielle, la chimiothérapie et le diagnostic, une étape indispensable à la mise en place des traitements appropriés et au suivi. Le diagnostic sérologique, bien qu’applicable sur le terrain selon le format du test, rencontre toutefois des limitations. Il manque de standardisation des antigènes, de sensibilité et de spécificité avec des tests de diagnostic rapide (TDR) souvent peu accessibles. Les objectifs de cette thèse étaient de : (i) caractériser le potentiel diagnostique de protéines identifiées et étudiées dans les laboratoires d’accueils, (ii) sélectionner à partir des données « omiques », de nouvelles cibles et évaluer leur potentiel diagnostique individuel et en combinaison, et (iii) identifier les protéines immunogéniques à partir d’analyse protéomique et immuno-informatique du sécrétome de trypanosomes. L’exploration du potentiel diagnostique de protéines candidates a été réalisée, après leur expression et leur purification, par ELISA indirect avec des sérums de bovins issus d’infections expérimentales et des sérums issus de bovins infectés naturellement par les trypanosomes. Testées individuellement, les protéines ont montré une faible sensibilité. Cependant, la combinaison des protéines d’immuno-réactivité équivalente a permis d’augmenter significativement la sensibilité des tests avec une spécificité qui reste satisfaisante. Ces résultats constituent une preuve de concept, de la performance des combinaisons de protéines dans le diagnostic de la TAA. Il offre la possibilité d’explorer de nouvelles approches innovantes, notamment l’association de peptides immunogéniques de différentes protéines immunoréactives sous forme de chimères pour le diagnostic sérologique. D’autre part, et au regard de leur performance, aucune des protéines nouvellement testées ne pourra être incluse de manière individuelle dans un TDR. Pour trouver des candidats adaptés, nous avons identifié des protéines sécrétées/excrétées de trypanosomes par spectrométrie de masse. Grâce à une analyse de prédiction d’épitopes, nous avons identifié une centaine de protéines putativement immunogéniques présentant plusieurs épitopes dans leurs séquences. L’analyse de la réactivité des sérums provenant de différentes races bovines avec le sécrétome de trypanosomes a permis de détecter des protéines fortement reconnues par les anticorps des sérums utilisés et correspondant principalement à quatre tailles moléculaires. À ces tailles, un grand nombre de protéines caractérisées in silico comme immunogéniques avaient été détectées. Ces données fournissent une base de sélection fiable des nouvelles protéines à inclure dans les tests sérologiques de la TAA. Elles permettent également de mieux comprendre les différences de réponses humorales de races bovines présentant une susceptibilité différente aux trypanosomoses.

Scorpionism is a serious public health problem in tropical areas, especially in Africa, southern India, the Middle East, and Latin America. There are about 12 species of scorpions that are dangerous to humans and all belong to the Buthidae family. In particular, venom on scorpion Androctonus australis hector is particularly toxic to humans. Serotherapy uses antibodies or fragments of antibodies to target the neurotoxins of the scorpion venom. Nanobodies, camelid-derived antibodies, are more effective than the conventional fragments of antibodies due to their low molecular weight (15 kDa). The Laboratoire des Venins et Molécules Thérapeutiques of the Pasteur Institute of Tunis (LVMT-IPT, Tunis, Tunisia) has produced the bispecific nanobodies against the neurotoxins of the Androctonus australis hector scorpion.In this doctoral project, the production of the bispecific nanobodies NbF12-10 and CH10-12 as recombinant proteins in Escherichia coli was studied. Two clones of the NbF12-10 strain were used (NN and NO), and strain E. coli WK6 was used as reference. The four strains were characterized in rich medium (TB) and defined minimal medium (MM) in shake-flask cultures. In TB, all strains grow at an average µ=0.4h-1. The strains WK6 and CH10-12 had a µmax=0.6h-1 in MM. The clone NbF12-10 NO could not grow in MM, and the clone NbF12-10 NN had a µmax=0.2h-1 in MM. The yield YX/S was 0.4g/g in MM for all strains and the yield of acetate on glucose was between 0.06 and 0.14g/g. The periplasmic extraction of the nanobodies NbF12-10 and CH10-12 was tested in TB, an improvement of 300% in the release of periplasmic proteins was achieved, compared to conventional methods. The strain CH10-12 produced 20-fold higher nanobody than the strain NbF12-10 NN (1.58 vs 0.08mg/L). The quantification of the nanobody was made through a densitometry protocol developed during this thesis. The protocol uses a processing image program (ImageJ) to quantify the optical density profiles of electrophoresis gels. The band of 50kDa of the molecular weight marker was used as reference for 750ng of recombinant protein. This was the subject of an article published in MicrobiologyOpen (Wiley).The production of the nanobodies CH10-12 and NbF12-10 were tested in bioreactor cultures in high cell density cultures in MM (>25gcdw/L) through a specific fed-batch strategy. The effect of the temperature (28–37°C) during protein expression and the duration of the induction phase (6–38h) were studied. The lower temperatures (28°C, 30°C) produced the highest titer of nanobody CH10-12 (2.3mg/L) after 10h and 12h of induction, respectively. In high temperature cultures (33°C, 37°C) the production of the nanobody was lower (0.4, 0.2mg/L). In cultures where the induction phase was longer (>30h), the production of the nanobody CH10-12 was hampered and reached a plateau after 10h (32°C, 0.7mg/L) to 25h (29°C, 1.4mg/L). The nanobody NbF12-10 also reached a plateau after 10h of induction (0.7mg/L). The metabolic burden was lowered by decreasing the temperature of induction, allowing the production of higher titers of recombinant nanobody. The effect of the low specific growth rate (0.02h-1) and the long exposure to the inducer (IPTG, >30h) could have produced a stringent response in the strain. High maintenance metabolism was found during the induction phase, and the consumption of citrate could hint an inadequate composition of the culture medium for the induction phase. Two non-specific proteins were found in the purified nanobody samples: a low molecular weight (11kDa), degradation product of the nanobody caused by a high temperature, and a high molecular weight protein (84kDa), protein aggregate produced as a response to an inadequate medium composition and the low specific growth rate. The generation of unknown proteins in the purified samples of nanobody could be a response of the strain to the low specific growth rate and the long exposure time to the inducer.; Le scorpionisme est un grave problème de santé publique dans les zones tropicales. Il existe environ 12 espèces de scorpions qui sont dangereuses pour l'homme et qui appartiennent toutes à la famille des Buthidae. La sérothérapie utilise des anticorps ou des fragments d'anticorps pour cibler les neurotoxines du venin de scorpion. Les nanobodies, des anticorps dérivés de camélidés, sont plus efficaces que les fragments d'anticorps classiques en raison de leur faible poids moléculaire (15kDa). Le Laboratoire des Venins et Molécules Thérapeutiques de l'Institut Pasteur de Tunis (Tunisie) a produit les nanobody bispécifiques contre les neurotoxines du scorpion Androctonus australis hector.Dans ce projet de doctorat, la production des nanobody bispécifiques NbF12-10 et CH10-12 comme protéines recombinantes chez Escherichia coli a été étudiée. Deux clones de la souche NbF12-10 ont été utilisés (NN et NO), et la souche E. coli WK6 a été utilisée comme référence. Les quatre souches ont été caractérisées en milieu riche (terrific broth, TB) et ont défini un milieu minimal (MM) dans des cultures en flacons agités. Dans le TB, toutes les souches croissent à une moyenne de µ=0.4h-1. Les souches WK6 et CH10-12 avaient un µmax=0.6h-1 en MM. Le clone NbF12-10 NO ne pouvait pas se cultiver en MM, et le clone NbF12-10 NN avait un µmax=0.2h-1 en MM. Le rendement YX/S était de 0.4g/g en MM pour toutes les souches et le rendement d'acétate sur glucose était compris entre 0.06 et 0.14g/g. L'extraction périplasmique des nanobody NbF12-10 et CH10-12 a été testée dans TB, une amélioration de 300% de la libération des protéines périplasmiques a été obtenue, par rapport aux méthodes conventionnelles. La souche CH10-12 a produit 20 fois plus des nanobody que la souche NbF12-10 NN (1.58 contre 0.08mg/L). La quantification du nanobody a été réalisée grâce à un protocole de densitométrie développé au cours de cette thèse. Le protocole utilise un programme de traitement d'images (ImageJ) pour quantifier les profils de densité optique des gels d'électrophorèse. Cela a fait l'objet d'un article publié dans MicrobiologyOpen (Wiley).La production des nanobody CH10-12 et NbF12-10 a été testée dans des cultures en bioréacteur dans des cultures à haute densité cellulaire en MM (>25gcdw/L) par une stratégie spécifique de fed-batch. L'effet de la température (28-37°C) pendant l'expression des protéines et la durée de la phase d'induction (6-38h) ont été étudiés. Les températures les plus basses (28°C, 30°C) ont produit le titre le plus élevé de nanobody CH10-12 (2.3mg/L) après 10h et 12h d'induction, respectivement. Dans les cultures à haute température (33°C, 37°C), la production du nanobody était plus faible (0.4, 0.2 mg/L). Dans les cultures où la phase d'induction était plus longue (>30h), la production du nanobody CH10-12 a été entravée et a atteint un plateau après 10h (32°C, 0.7 mg/L) à 25h (29°C, 1.4mg/L). Le nanobody NbF12-10 a également atteint un plateau après 10h d'induction (0.7mg/L). La charge métabolique a été réduite en diminuant la température d'induction, permettant la production de titres plus élevés de nanobody. Un métabolisme de maintenance élevé a été constaté pendant la phase d'induction, et la consommation de citrate pourrait laisser supposer une composition inadéquate du milieu de culture pour la phase d'induction. Deux protéines non spécifiques ont été trouvées dans les échantillons de nanobody purifiés: une protéine de faible poids moléculaire (11kDa), produit de dégradation du nanobody causé par une température élevée, et une protéine de poids moléculaire élevé (84kDa), agrégat de protéines produit en réponse à une composition inadéquate du milieu et au faible taux de croissance spécifique. La génération de protéines inconnues dans les échantillons purifiés de nanonody pourrait être une réponse de la souche au faible taux de croissance spécifique et à la longue durée d'exposition à l'inducteur.

Mycobacterium tuberculosis causes one of the diseases with the highest mortality and morbidity rate in the Americas and around the world. In developing countries, the diagnosis of tuberculosis (TB) is based on smear microscopy and bacteriological cultures. The first method has low sensitivity, and the second take several weeks to reach a confirmatory diagnosis. The lack of a rapid diagnosis compromises the efforts to control TB, favoring its transmission to the susceptible population. Currently, magnetic nanoparticles (MNPs) functionalized with biomolecules have been used in biomedicine, due the magnetic, electrical and optical properties. In this way, applying external magnetic fields, bio-functionalized MNPs is used to detect and concentrate cells and biomolecules from biological samples.In this work we present the synthesis, characterization and bio-functionalization of magnetic nanoparticles, to develop a sandwich ELISA assay associated to MNPs to detect antigens from M. tuberculosis. For this purpose, magnetic nanoparticles were synthesized by co-precipitation method. The MNP surface was amine-silanized (MNP@Si@NH2) and characterized by physical-chemical methods.The MTB antigens evaluated in this study were: Hsp16.3, CFP10, ESAT6, MTC28, MPT64, 38 kDa protein, Ag85B and MoeX. Cloning ad expression of recombinant proteins were made in E. coli BL21 (DE3) pLysS system. Polyclonal antibodies were produced in New Zealand rabbits and BALB/C mice, previously immunized with purified recombinant antigens. Specific antibodies (ab) were immobilized in the amine-silanized MNP surfaces. The MNP@Si@ab were associated in a colorimetric sandwich ELISA assay to capture and detect native MTB antigens from sputum samples.The XRD, Mössbauer spectroscopy, zeta potential, TEM and FTIR demonstrated the successful preparation of the MNPs showing a diffraction crystal diameter of ~12.5 nm (10.48 ± 2.56 nm), superficial net charge of ᶎ: +23.57 ± 2.87 mV, characteristic patterns of magnetite and a spherical structure. Additionally, a magnetization saturation of 37.06 emu.g-1 was observed. For the functionalization of nanoparticle surfaces with antibodies, active ester method (coupling agent EDC/NHS) were used for peptide bond formation. Parameters such as time of incubation, concentration of coupling agents and surface saturation level of amine-silanized MNPs (MNP@Si@NH2), were previously standardized.Finally, antibody functionalized on MNPs were used to capture and detect recombinant and native M. tuberculosis antigens in an ELISA-MNP@Si@ab sandwich test (in a reaction time

The sheep pox virus is omnipresent in small ruminant farms in North African countries andparticularly in Tunisia despite the annual vaccination campaigns set up by the Tunisian veterinaryauthorities. The optimization of the used vaccine strain involves the development of the so-called newgeneration vaccines such as subunit vaccines and this, using proteins recognized to induce a protectivehumoral response in the immunized animal. This could be considered as an alternative to currentcontrol strategies limiting virus spread in Tunisia. Few data exist on protective antigens specific toviruses in the genus Capripoxvirus. By homology to vaccinia virus proteins, this thesis work hastargeted four proteins in the genus Capripoxvirus belonging to the potentially immuno-dominantcontagious nodular dermatosis virus named LSDV60, LSDV117, LSDV122 and LSDV141respectively homologues of proteins L1, A27, A33 and B5. First, an in silico structural analysis hasallowed to identify the essential domains of each protein and to check the conservation rate of theseproteins among different viruses belonging to the poxvirus family. A thorough structural analysisidentifying the primary, secondary and tertiary structure of the A27 protein was conducted. Followingthis structural study, the proteins were produced in two different expression systems, namely theeukaryotic system and the baculovirus-insect cell system, in order to characterize their antigenicity tosera from immunized or proven animals. The recognition of the proteins of interest in the eukaryoticexpression vector has not been conclusive. On the other hand, the BEVS expression systemsuccessfully allowed the production of the A27 protein (L1, A33 and B5 in progress) in a solubleform, which was correctly recognized by sera from challenged naïve goats. Identifying trimeric andhexameric forms confirms its antigenicity. An immunodetection of the peptides corresponding toprotein A27 synthesized on membranes (PepScan) combined with an in silico analysis led to identifyzones capable of constituting recognized epitopic regions located predominantly in part N-terminal ofthe protein., Le virus de la variole ovine est omniprésent dans les élevages de petits ruminants dans les pays d’Afrique du Nord et particulièrement en Tunisie malgré les campagnes de vaccination annuelles mises en place par les autorités vétérinaires du pays. L’optimisation de la souche vaccinale utilisée passe par le développement de vaccins dits de nouvelle génération tels que les vaccins sous unitaires utilisant des protéines reconnues pour induire une réponse humorale protectrice chez l’animal immunisé. Ceci pourrait être une alternative aux stratégies de lutte actuelles permettant de limiter la dissémination du virus en Tunisie. Peu de données existent sur les antigènes protecteurs spécifiques des virus du genre Capripoxvirus. Ce travail de thèse a ciblé, par homologie aux protéines du virus de la vaccine, quatre protéines du genre Capripoxvirus appartenant au virus de la dermatose nodulaire contagieuse potentiellement immuno-dominantes nommées LSDV60, LSDV117, LSDV122 etLSDV141 respectivement homologues des protéines L1, A27, A33 et B5. En premier lieu, une analyse structurale in silico a permis d’identifier les domaines essentiels de chaque protéine et de vérifier le taux de conservation de ces protéines parmi différents virus appartenant à la famille des poxvirus. Une analyse structurale approfondie mettant en évidence la structure primaire, secondaire et tertiaire de la protéine A27 a été réalisée. Suite à cette étude structurale, les protéines ont été produites dans deux systèmes d’expression différents ; le système eucaryote et le système baculovirus-cellules d’insectes afin de caractériser leur antigénicité vis-à-vis de sérums provenant d’animaux immunisés ou éprouvés.La reconnaissance des protéines d’intérêt en vecteur d’expression eucaryote n’a pas été concluante. En revanche, le système d’expression BEVS a permis la production de la protéine A27 (L1, A33 et B5 encours) avec succès sous forme soluble qui a été correctement reconnue par des sérums provenant de caprins naïfs challengés. La mise en évidence de formes trimériques et hexamériques confirment sonantigénicité. Une immunodétection des peptides correspondants à la protéine A27 synthétisés surmembranes (PepScan) combinée à une analyse in silico ont permis d'identifier des zones susceptibles de constituer des régions épitopiques reconnues situés majoritairement en partie N terminale de la protéine.

L’infertilité affecte jusqu’à 15-20% des couples en âge de se reproduire. C’est pourquoi, mieux comprendre les mécanismes à la base de la fécondation est essentiel pour l’identification de nouvelles causes d’infertilité et l’optimisation des techniques de reproduction assistée. La capacitation est une étape de la maturation des spermatozoïdes qui se déroule dans le tractus génital femelle. Elle est requise pour la fécondation d’un ovocyte. Notre laboratoire a démontré que des protéines du plasma séminal bovin, appelées protéines Binder of SPerm (BSP), se lient aux phospholipides portant des groupements choline à la surface de la membrane des spermatozoïdes lors de l’éjaculation et promeuvent la capacitation. Ces protéines exprimées par les vésicules séminales sont ubiquitaires chez les mammifères et ont été étudiées chez plusieurs espèces dont l’étalon, le porc, le bouc et le bélier. Récemment, l’expression de gènes homologues aux BSP a été découverte dans les épididymes d’humains (BSPH1) et de souris (Bsph1 et Bsph2). Notre hypothèse est que les BSP chez ces deux espèces sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de la maturation épididymaire et ont des rôles dans les fonctions spermatiques, similaires à ceux des protéines BSP bovines. Les protéines BSP humaines et murines représentent une faible fraction des protéines totales du plasma séminal. Pour cette raison, afin d’étudier leurs caractéristiques biochimiques et fonctionnelles, des protéines recombinantes ont été produites. Les protéines recombinantes ont été exprimées dans des cellules Escherichia coli origami B(DE3)pLysS en utilisant un vecteur d’expression pET32a. Suivant la lyse cellulaire, les protéines ont été dénaturées avec de l’urée et purifiées par chromatographie d’affinité sur ions métalliques immobilisés. Une fois liées à la colonne, les protéines ont été repliées à l’aide d’un gradient d’urée décroissant avant d’être éluées. Cette méthode a mené à la production de trois protéines recombinantes (rec-BSPH1 humaine, rec-BSPH1 murine et rec-BSPH2 murine) pures et fonctionnelles. Des expériences de chromatographie d’affinité et de co-sédimentation nous ont permis de démontrer que les trois protéines peuvent se lier à des ligands connus des protéines BSP comme la gélatine et l’héparine en plus de pouvoir se lier aux spermatozoïdes. Nos études ont également révélées que les deux protéines rec-BSPH1 peuvent se lier aux liposomes de phosphatidylcholine (PC) et sont capable de promouvoir la capacitation des spermatozoïdes. À l’opposé, rec-BSPH2 ne peut ni se lier aux liposomes de PC, ni stimuler la capacitation. Finalement, les protéines recombinantes n’ont aucun effet sur la réaction acrosomique ou sur la motilité des spermatozoïdes. Chez les bovins, les protéines BSP induisent la capacitation grâce des interactions avec les lipoprotéines de haute densité (HDL) et les glycosaminoglycanes. Puisque le HDL est également un joueur important de la capacitation chez la souris, le rôle de la protéine native BSPH1 murine au niveau de la capacitation induite par le HDL a été étudié. Les résultats obtenus suggèrent que, in vivo, la protéine BSPH1 de souris serait impliquée dans la capacitation via une interaction directe avec le HDL. Comme les protéines BSPH1 humaines et murines sont orthologues, ces résultats pourraient aussi s’appliquer à la fertilité humaine. Les résultats présentés dans cette thèse pourraient mener à une meilleure compréhension de la fertilité masculine et aider à améliorer les techniques de reproduction assistée. Ils pourraient également mener au développement de nouveaux tests diagnostiques ou de contraceptifs masculins., Infertility can affect as much as 15-20% of couples of reproductive age. Therefore, elucidating mechanisms occurring during fertilization is needed to resolve cases of infertility and optimize assisted reproductive technology procedures. Sperm capacitation is a maturation step that takes place in the female genital tract and is deemed to be essential for sperm to fertilize an oocyte. Our laboratory has demonstrated that proteins from bovine seminal plasma called Binder of SPerm (BSP) proteins bind to choline phospholipids on the sperm membrane upon ejaculation and promote capacitation. These proteins expressed in seminal vesicles are ubiquitous amongst mammals and have been studied in many species including stallion, boar, ram and goat. More recently, the expression of BSP-homologous genes has been discovered in the epididymis of humans (BSPH1) and in mice (Bsph1 and Bsph2). We hypothesized that the BSP homologs in these two species are added to sperm during epididymal maturation and play similar roles in sperm functions as bovine BSP proteins. BSP proteins in humans and mice constitute only a minute percentage of the seminal plasma proteins. Thus, to study their biochemical and functional characteristics recombinant proteins were produced. Recombinant proteins were expressed in Escherichia coli origami B(DE3)pLysS cells using a pET32a expression vector. Following cell lysis, proteins were denatured using urea and purified by immobilized metal ion affinity chromatography. Once bound to the resin, proteins were refolded using a decreasing urea gradient after which they were eluted. This method led to the production of three pure, functional recombinant proteins (human rec-BSPH1, mouse rec-BSPH1 and mouse rec-BSPH2). Using affinity chromatography and co-sedimentation experiments, we were able to demonstrate that all three recombinant proteins bind known ligands of BSP proteins including gelatin, heparin and have the ability to bind to sperm. Studies also revealed that both rec-BSPH1 proteins bind to phosphatidylcholine (PC) liposomes and promote sperm capacitation. However, rec-BSPH2 neither binds to PC liposomes nor stimulates capacitation. Recombinant proteins had no effect on acrosome reaction or sperm motility. In bovine, BSP proteins promote sperm capacitation through interactions with high-density lipoproteins (HDL) and glycosaminoglycans. Since in mice HDL is also a major factor implicated in capacitation, the role of the native murine BSPH1 protein in HDL-induced capacitation was investigated. Results obtained suggest that, in vivo, murine BSPH1 protein could act in capacitation via a direct interaction with HDL. As human and murine BSPH1 are orthologs, these results could possibly also apply to human fertility. The results presented in this thesis could lead to a better understanding of male fertility and help improve assisted reproduction technology procedures. They could also lead to the development of diagnostic tests as well male contraceptives.

Osteoarthritis (OA) is a chronic rheumatism which drug management is based on antalgic and anti-inflammatory drugs, which requires the need to search for other therapeutic targets. One of these potential targets may be galectin 3, a lectin secreted in the joint during the pathogenesis of the disease. This lectin binds its ligands on the surface of the joint cells and thus, leads to inflammatory reactions and matrix catabolism phenomena, making it an attractive target in the treatment of OA. The 1st aim of our research project was to characterize the biological activity of galectin 3 on chondrocyte metabolism. The 2nd aim was to design and produce several truncated forms of galectin 3. The 3rd aim was to evaluate the presumed galectin 3-inhibiting activity of the truncated forms. This objective is part from the perspective of gene therapy for OA. Our work shows that galectin 3 is a proinflammatory, procatabolic but also an antianabolic factor in chondrocytes. Several recombinant truncated forms of galectin 3 were designed and produced. Preliminary tests of biological activity in vitro show that the chosen truncated lectin partially inhibits the biological activity of galectin-3 on human chondrocytes under a few conditions. This work is the proof of concept of a broader project of which perspective is gene therapy in OA, L’arthrose (OA) est un rhumatisme chronique dont la prise en charge médicamenteuse repose principalement sur les antalgiques et anti-inflammatoires, ce qui justifie la nécessité de rechercher d’autres cibles thérapeutiques. L’une de ces cibles potentielles est la galectine 3, une lectine sécrétée dans l’articulation au cours de la pathogenèse de cette maladie. Cette lectine interagit avec ses ligands à la surface des cellules articulaires pour engendrer des réactions inflammatoires et des phénomènes de catabolisme matriciel au niveau des tissus ostéo-articulaires, ce qui en fait une cible intéressante dans le traitement de l’OA. Le 1e objectif de ce projet de recherche est de mieux caractériser les effets biologiques de la galectine 3 sur le métabolisme chondrocytaire. Le 2e objectif est de concevoir des formes tronquées de galectine 3 et le 3e objectif est de démontrer leur potentiel d’inhibiteur de la forme entière de galectine 3 dans l’articulation. Ces travaux montrent que la galectine 3 est un facteur pro-inflammatoire, pro-catabolique mais aussi anti-anabolique dans le chondrocyte. Plusieurs formes tronquées recombinantes de galectine 3 ont été produites. Des tests préliminaires d’activité biologique in vitro démontrent que dans certaines conditions, l’une d’elles inhibe partiellement les effets biologiques de la galectine 3 sur des chondrocytes humains. Ces travaux de recherche constituent la preuve de concept d’un projet global s’inscrivant dans une perspective de thérapie génique pour l’OA

La publication d’un article scientifique sur les effets néfastes d’un hybride de maïs transgénique exprimant une δ-endotoxine du Bacillus thuringiensis contre des larves du papillon monarque causait, il y a quelques années, une controverse sans précédent sur l’impact environnemental des caractères recombinants introduits au bagage génétique des cultures agricoles. Le présent article de synthèse, complémentaire à un article de ce même numéro abordant la migration des transgènes dans l’environnement (Michaud 2005), discute de l’impact des caractères recombinants encodés par les transgènes sur l’incidence et le développement des différents organismes vivants du milieu. L’impact des nouveaux caractères est d’abord considéré à l’échelle des écosystèmes, à la lumière des effets exercés par les pratiques agricoles courantes sur la diversité biologique au champ. L’impact de ces caractères est ensuite considéré en fonction des interactions spécifiques établies au champ ou en conditions de laboratoire entre la plante modifiée et une gamme d’espèces modèles incluant des ravageurs herbivores secondaires, des arthropodes prédateurs et différents organismes du sol., A scientific communication reporting the deleterious effects on monarch butterfly larvae of a transgenic corn hybrid expressing a Bacillus thuringiensis δ-endotoxin has caused, a few years ago, an unprecedented controversy on the environmental impact of recombinant traits introduced into the genome of agricultural crops. This review, complementing a review in this same issue on transgene migration in the environment (Michaud 2005), addresses the impact of these new traits on the development and survival of different non-target living organisms present in the environment. The impact of these new traits is first considered at the ecosystem level, in relation with the effects of current agricultural practices on field biodiversity. The impact of these traits is then considered in relation with the specific interactions established in the field or under laboratory conditions between the modified plant and a collection of model organisms including secondary herbivorous pests, predatory arthropods and different species of the soil community.

Catalytic antibodies are investigated in order to understand their role under physio-pathological situations. But they also appear to be revolutionary tools to perform studies at the interface between chemistry, biochemistry, biology and immunology. Consequently, the knowledge of structure–function relationships is of great interest. We explored two expression systems for the production of a model catalytic antibody displaying a beta-lactamase activity. The recombinant scFv fragment was produced in the prokaryotic expression system. scFv fragments are often described as proteins being laborious to produce. An efficient method was developed to produce large quantities of refolded soluble catalytic scFv. Whole catalytic antibody was also produced by exploiting eukaryotic expression system. Mammalian cells were used because they are able to retain the original protein folding, assembly and post-translational modifications. The secondary structure of the catalytic scFv has been analyzed by circular dichroism to ensure that the refolded scFv is consistent with a native scFv fold. The functionality of the catalytic scFv and whole catalytic antibody has been validated by two approaches: (1) development of enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) and surface plasmon resonance (SPR) approaches for testing that the binding characteristics of an inhibitory peptide have been retained, and (2) proof of the subtle catalytic properties conservation through the development of a new sensitive catalytic assay using a fluorogenic substrate. This will lead to consider potential biotechnological and therapeutic applications of catalytic antibodies.; Les anticorps catalytiques sont étudiés pour comprendre leur rôle en conditions physiopathologiques. Ils semblent aussi représenter des outils révolutionnaires pour des études à l'interface entre la chimie, la biochimie, la biologie et immunologie. Par conséquent, la connaissance des relations de structure- fonction représente un grand intérêt. Nous avons exploré deux systèmes d'expression pour la production d'un anticorps catalytique modèle présentant une activité bêta-lactamase. Le fragment scFv recombinant a été produit dans le système d'expression procaryote. Les scFv sont souvent décrits comme des protéines difficiles à produire. Une méthode efficace a été développée pour produire de grandes quantités de scFv solubles et correctement repliés. L'anticorps catalytique entier a aussi été produit en exploitant le système d'expression eucaryote. Des cellules de mammifères ont été utilisées car elles peuvent conserver le repliement original des protéines, leur assemblage et les modifications post-traductionnelles. La structure secondaire du scFv catalytique a été analysée par dichroïsme circulaire pour s’assurer que la renaturation du scFv est en accord avec le repliement des scFv natifs. La fonctionnalité du scFv catalytique et de l'anticorps catalytique entier a été validée par deux approches : (1) le développement d’un test immuno-enzymatique (ELISA) et la résonance plasmonique de surface (RPS) et (2) le développement d'un test catalytique sensible utilisant un substrat fluorogénique. Ce travail amène à considérer de potentielles applications biotechnologiques et thérapeutiques des anticorps catalytiques.

Conducting tissue healing and regeneration through biomaterials and morphogens is still an unrealized goal. Understand the multiple roles of the extracellular matrix (ECM) is indeed essential for the design of successful regenerative medicine strategies. During tissue repair and healing, cells receive numerous signals from their immediate ECM microenvironment and adhere by receptor-mediated interactions with ECM components by specialized adhesion receptors, such as integrins. As such, design and modulation of ECM analogs to ligate specific integrins is a promising approach to control cellular processes. Through production of variants of the 9th to 10th type III repeat of fibronectin (FN, FN III9-10) with variable stabilities, we engineered ligands that present different specificities for the integrin α5β1. Furthermore, the FN fragments have been engineered in order to be covalently incorporated into fibrin, a clinical relevant matrix for regenerative medicine. We demonstrated the capacity of α5β1 integrin-specific engagement to influence human mesenchymal stem cell behavior, showing that α5β1 integrin has an important role in the control of their osteogenic differentiation. Specifically, compared to FN, FN fragments with increased specificity for α5β1 versus αvβ3 integrins (FN III9*-10) results in significantly enhanced osteogenic differentiation in 2D and in a clinically relevant fibrin matrix system, while cell attachment/spreading and proliferation were comparable. On the other hand, growth factors (GFs) are key molecules for tissue morphogenesis and healing. However, while they are really promising molecules for a use in regenerative medicine applications, they often fail to prove cost-effective or even clinically efficacious during clinical trials. One of the reasons for this poor translation may lie in the rapid clearance of GFs from tissue sites in vivo, leading to the development of strategies controlling their release. Since FN has been shown to bind GFs from very different families, we first explored the possibility of FN to bind GFs much more broadly, and secondly the possibility of using FN fragments as an anchor for GF retention into fibrin matrix. We found that the 12th to 14th type III repeats of FN (FN III12-14) promiscuously bind GFs from the platelet-derived GF, fibroblast GF, transforming GF-β and neurotrophin families. Overall, 25 new binding interactions were demonstrated, supporting that GF binding may be one of FN's main physiological functions. However, the reasons for such promiscuous binding capacity were still unclear, while evidences from the literature suggested that the close proximity of the major integrin-binding domain, FN III9-10, allows joint integrin/GF-receptor signaling triggered by a complex FN/GFs. Accordingly, we found that FN fragments containing both the integrin- and GF-binding domains (FN III9(*)-10/12-14) could drastically enhance GF activities in vitro. In addition, testing which integrins were involved within these synergistic effects, we found that α5β1 integrin was mainly involved. By the use of FN III9(*)-10/12-14 and fibrin, we could engineer a specific microenvironment allowing sequestration of multiple wild-type GFs, while triggering synergistic signaling between GF-receptors and integrins. In a delayed wound healing model in mouse and in a calvarial bone defect model in rat, GFs delivered with the FN fragment microenvironment were drastically improved in their ability to induce tissue healing, even though a single low dose of GFs was used. Specifically, we established integrin/GF-receptor synergistic activities as a key parameter for GF translation into regenerative medicine treatments and demonstrate a method to exploit this phenomenon. This thesis highlights the absolutely critical role of the microenvironment in modulating signaling of GFs and in driving these molecules forward toward more widespread clinical use.

The present work focuses on the development of a new innovating technology, called PAT Friday®, aiming at producing recombinant proteins into the extra-foliar fluid of modified carnivorous plants. Two objectives were assigned to this work : 1- to realize a proof of concept of the technology on the experimental model Drosera rotundifolia, transformed with marker and human genes, to confirm the occurence of the recombinant proteins into glu ; and 2 - to evaluate and develop, the technology on the model Nepenthes alata, more adapted to industrial scaling-up. The results indicate the presence of two marker proteins GUS and GFP inside the tissues and into the glu of modified Drosera rotundifolia plants. The same plant species has also been transformed with human gamma interferon and intrinsic factor genes. The corresponding human recombinant proteins have been detected into the plant tissues. Potential industrial scaling-up has been studied with the species Nepenthes alata. The results show a potential productivity of 10 to 15 kg of total proteins per hectare per year, thanks to non-destructive repeated harvests, and possibility to efficiently control the natural proteinase activity. The elaboration of a regeneration protocol has been undertaken through indirect organogenesis and somatic embryogenesis, with a view to transform genetically this plant. PAT Friday® technology, with simplified extraction and purification methods of the proteins of interest targeted into the liquid secretions, opens new perspectives in the field of therapeutical proteins produced in plants, Le travail présenté porte sur le développement d?une nouvelle technologie innovante, nommée PAT Friday®, visant à produire des protéines recombinantes au sein des sécrétions extracellulaires de plantes carnivores génétiquement modifiées. Deux objectifs ont été fixés : Réaliser la preuve de concept de la technologie sur le modèle expérimental Drosera rotundifolia, en transformant la plante avec des gènes marqueurs et humains afin de mettre en évidence la présence des protéines recombinantes dans la glu ; et développer, après évaluation, la technologie sur un modèle potentiellement industrialisable, Nepenthes alata. Les résultats ont indiqué la présence des deux protéines marqueurs GFP et GUS dans les tissus et dans la glu de Drosera rotundifolia transformées. Les plantes ont également été transformées génétiquement avec les gènes humains de l?interféron gamma et du facteur intrinsèque. Les protéines recombinantes humaines ont été mises en évidence au sein des tissus végétaux. Le potentiel industriel du modèle Nepenthes alata a ensuite été étudié : 10 à 15 kg de protéines totales par hectare et par an peuvent être produits, grâce notamment à des récoltes successives non destructrices, et la possibilité de contrôler l?activité des protéases digestives naturelles. L?élaboration d?un protocole de régénération de la plante a été entreprise par embryogénèse somatique et organogénèse indirecte, en vue de sa transformation génétique. La technologie PAT Friday®, avec des étapes simplifiées d?extraction et de purification des protéines d?intérêt produites dans le liquide digestif, offre de nouvelles perspectives dans le domaine des protéines thérapeutiques produites à partir de plantes

Reactive oxygen species (ROS) are considered as intracellular messengers; they are produced mainly by the NADPH oxidases (Nox) family of which Nox4 is one of the representatives. The dysfunction of Nox4 is associated to diseases of aging as tumour development, atherosclerosis, pulmonary hypertension or osteoarthritis. Regulation of Nox4 activity is still poorly understood. The objective of this thesis work is to study Nox4 NADPH oxidase and diaphorase activities (initiation of electron transfer). Two variants (Nox4A, full length isoform and Nox4B, isoform lacking an NADPH binding domain) of Nox4 were identified by cloning the specific gene. Establishment of two cellular (HEK293E cells) and acellular (recombinant truncated Nox4 proteins) models led to the following results:1) The NADPH oxidase activity of Nox4A overexpressed in HEK293E cells is constitutive and the cytosolic part of Nox4 has a diaphorase activity (cell free system). On the contrary, Nox4B is inactive.2) The NADPH oxidase activity of Nox4 is inhibited by a series of quinone compounds slightly substituted (benzoquinone, hydroquinone, tMetBQ) and is stimulated by other quinones (tBuBQ, tBuBHQ, duroquinone, AA-861). Involvement of calcium and 5-lipoxygenase in the stimulation process of AA-861 and tBuBHQ was excluded. Our data converge on the hypothesis of a direct action of quinones on the N terminal membrane part of Nox4.We therefore showed that the NADPH oxidase activity of Nox4 is not only constitutive but also modulated by different quinones. The molecular mechanism is under work., Les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) sont considérés comme des messagers intracellulaires et sont produits principalement par les NADPH oxydases (Nox) dont Nox4 est l'un des représentants. Le dysfonctionnement de Nox4 est relié à de nombreuses pathologies (cancer, athérosclérose, hypertension pulmonaire ou arthrose). La régulation de l'activité NADPH oxydase de Nox4 est encore peu connue. L'objectif de ce travail est d'étudier l'activité NADPH oxydase et diaphorase (initiation du transfert d'électron) de Nox4.Le clonage du gène de Nox4 a mis en évidence deux isoformes protéiques (Nox4A, forme entière et Nox4B, forme délétée d'un domaine de fixation du NADPH). La mise en place de deux modèles d'étude cellulaire (cellules HEK293E) et acellulaire (protéines recombinantes Nox4 tronquées) a permis d'obtenir les résultats suivants:1) L'activité NADPH oxydase de Nox4A surexprimée dans les cellules HEK293E est constitutive et la partie C terminale cytosolique en milieu acellulaire possède une activité diaphorase. Par contre, Nox4B est inactive. 2) L'activité NADPH oxydase de Nox4 est inhibée par une série de composés quinones faiblement substitués (benzoquinone, hydroquinone, tMetBQ) et stimulée par d'autres quinones (tBuBQ, tBuBHQ, duroquinone, AA-861). L'implication du calcium et de la 5-lipoxygénase dans le mécanisme d'action des composés AA-861 et tBuBHQ a été écartée. Nos données convergent vers l'hypothèse d'une action directe des quinones sur la partie N terminale membranaire de Nox4.Nous avons donc démontré que l'activité NADPH oxydase de Nox4 n'est pas seulement constitutive mais modulable par différentes quinones. Le mécanisme moléculaire précis reste à définir.

The sugar N-acetylgalactosamine (Ga1NAc) is a constituent of many glycoproteins, glycolipids and proteoglycans. It is the immunodominant sugar in blood group and oncofetal antigens which are potential therapeutic targets. However, the chemical synthesis of these antigens is time consuming and expensive. In vivo, GaINAc is incorporated into glycoconjugates by specific GaINAc transferases using UDPGa1NAc as the donor substrate. At présent, the chemo-enzymatic synthesis of glycans is hampered by the difficulties involved in the synthesis of large amounts of UDPGa1NAc. To overcome these limitations we have developed the chemo-enzymatic synthesis of Ga1NAc bearing glycoconjugates based on the simple substrates Ga1NAc, UTP and creatine-P and the use of four enzymes. In this method UDP-Ga1NAc is synthesized as an intermediate and the product UDP immediately recycled to UDP-Ga1NAc. With this technique an oligosaccharide and several mg of a small glycoprotein were synthesized and the immune response of mice to the synthesized glycoprotein investigated. The system developed to synthesize the UDP-GaINAc intermediate could be adapted to produce large amounts of UDP-Ga1NAc and we could show that it accepts also derivatives of Ga1NAc which allows the rapid synthesis of •UDP-Ga1NAc analogues. These molécules have been tested as probes for the active site of polypeptide aGa1NAc transferase Tl by kinetic studies and by STD-NMR.; Le Ga1NAc est présent dans un grand nombre de glycoprotéines, protéoglycanes et glycolipides. Il est le sucre immunodominant des antigènes de groupes sanguins et oncofoetaux qui sont des cibles thérapeutiques. Cependant, la synthèse par voie chimique de ces glycoconjugués à Ga1NAc est longue et coûteuse. In vivo, le Ga1NAc est incorporé par des Ga1NActransférases, enzymes spécifiques qui transfèrent le Ga1NAc de l'UDP-GaINAc sur un substrat accepteur. Mais la synthèse chimio enzymatique des glycanes est freinée par l'obtention difficile de quantités importantes d'UDP-Ga1NAc.Nous avons mis au point un système de synthèse chimio enzymatique de glycoconjugués à Ga1NAc qui utilise 4 enzymes et des substrats simples comme le Ga1NAc, l'UTP et la créatine-P. Ce système permet la synthèse rapide et efficace de glycopeptides et d'oligosaccharides à GaINAc ; il a été utilisé pour glycosyler l'antigène MUC1 et nous avons pu évaluer la réponse immunitaire murine contre la petite glycoprotéine obtenue.Le système de synthèse d'UDP-Ga1NAc peut accepter certains dérivés de Ga1NAc et permettre ainsi la synthèse d'analogues d'UDP-Ga1NAc. Ces molécules sont des sondes appréciables pour étudier l'interaction entre substrats et enzymes par les techniques physicochimiques comme la STDNMR.

TFIIH is a general transcription factor involved in class II gene transcription as well as nucleotide excision repair. In human, mutations in both helicases of TFIIH, XPD and XPB, are directly incriminated in three diseases: the Xeroderma Pigmentosum, the Cockayne Syndrome and trichothiodystrophie. During my PhD studies, I have been interested in the structure and function relationships of the TFIIH human factor. We have characterized the recombinant TFIIH complex in electronic microscopic and its structure was identical to the endogenous one. We have used this structure to dock the biochemical informations obtain by protein-protein interaction studies and we propose a general model of the molecular organization of the human TFIIH. Finally a study aimed to put TFIIH with natural substrates, DNA or partners, was done. I was implicated in the development of a new technology designed to immobilize DNA on a solid support suitable for electron microscopy observation. We also reconstruct a cryo-negative staining model of TFIIE, which interacts physically with TFIIH, at 1.6nm resolution. Finally, we obtain 3D crystals of the homologue of XPD helicase in an archaebacteria, Le facteur TFIIH est un facteur multi-protéique impliqué, via ses dix sous-unités, dans la transcription des gènes de classe II et dans la réparation de l'ADN. Chez l'homme, des mutations dans les gènes codant pour des hélicases XPB et XPD de TFIIH sont à l'origine de trois maladies: le Xeroderma Pigmentosum, la Trichothiodystrophie et le Syndrome de Cockayne. Au cours de mes études doctorales, je me suis intéressée aux liens entre la structure et la fonction du facteur TFIIH humain. Nous avons observé le complexe TFIIH produit sous forme recombinante dans les cellules d'insectes en microscopie électronique et sa structure est identique à celle du facteur endogène. Nous y avons ensuite intégré les données biochimiques d'interaction protéine-protéine et nous proposons un modèle général de l'architecture du complexe. Afin de comprendre le rôle de TFIIH dans l'initiation de la transcription ou dans la réparation de l'ADN, nous avons développé une nouvelle technologie visant à observer les complexes ADN-protéine en microscopie. Nous avons également déterminé un modèle en cryomicroscopie du facteur TFIIE, qui interagit physiquement avec TFIIH, à une résolution de 1.6nm. Finalement, nous avons obtenu des cristaux de l'homologue de l'hélicase XPD chez une archaebactérie.

The control of glycosylation of recombinant proteins presents a considerable stake in the development of therapeutic proteins production in heterologous expression systems. Indeed glycosylation plays a key role in their properties, in particular pharmacokinetic properties. The remodelling of N-glycosylation of recombinant proteins was considered via the use of glycosynthase Cel7B E197A from Humicola insolens. This enzyme must first of all be modified in order to be able to accomodate an N-acetylglucosaminyl group in the acceptor subsite +1. Molecular modelling studies highlighted two amino acids which could prevent from positioning a carbohydrate unit substituted in position 2. Various mutants were prepared by site-directed mutagenesis in order to study their substrate specificity. Their glycosynthase activities were characterized, showing the influence of the introduced mutations. Even if the desired substrate specificity has not been obtained, a modification of the regioselectivity of the glycosynthase was highlighted with a substrate substituted in position 2 by an azido group., Le contrôle de la glycosylation des protéines recombinantes présente un enjeu considérable dans le développement de la production de protéines d'intérêt thérapeutique dans des systèmes d'expression hétérologues. La glycosylation joue en effet un rôle essentiel dans leurs propriétés, notamment pharmacocinétiques. Le remodelage de la N-glycosylation des protéines recombinantes a été envisagé via l'utilisation de la glycosynthase Cel7B E197A d'Humicola insolens. Cette enzyme doit tout d'abord être modifiée afin de pouvoir fixer un groupement N-acétylglucosaminyle dans le sous-site accepteur +1. Des études de modélisation moléculaire ont mis en évidence deux acides aminés qui pourraient empêcher le positionnement d'une unité glucosidique substituée en position 2. Différents mutants ont été préparés par mutagénèse dirigée afin d'étudier leur spécificité de substrat. Leurs activités glycosynthases ont été caractérisées, montrant l'influence des mutations introduites. Même si la spécificité de substrat désirée n'a pu être obtenue, une modification de la régiosélectivité de la glycosynthase a été mise en évidence vis-à-vis d'un substrat substitué en position 2 par un groupement de type azido.

Measles virus is a negative-strand RNA virus, member of the family Paramyxoviridae. Its replicative complex is composed of three main viral proteins : the RNA-dependent RNA polymerase (L), the nucleoprotein (N) and the phosphoprotein (P). This thesis presents a structural study, using biochemical and biophysical methods, of the phosphoprotein and of the nucleoprotein produced in the bacteria Escherichia coli. I have studied the regions involved in the polymerisation of N and identified a variant of interest for the study of N using X-ray crystallography. I have also set up the purification of a complex of N and P, a prelude to its structural study. Besides, I have shown that the N-terminal moiety of P is intrinsically disordered. I was able to extend this result to the P proteins of numerous related virus using biocomputing methods. Then, I have demonstrated the importance of structural disorder within the replicative complex of Paramyxoviridae (both from a functional point of view and because of its abundance). Beyond their immediate practical interest, these results indicate that the replicative machinery of these viruses might constitute a model system for the study of structural disorder in proteins. Furthermore, they raise numerous questions, and command a rethink of our vision of the replicative complex of these viruses, the study of which has a major importance in human health., Le virus de la rougeole est un virus à ARN négatif, membre de la famille des Paramyxoviridae. Le complexe de réplication viral comprend trois protéines principales : la polymérase à ARN ARN-dépendante (L), la nucléoprotéine (N) et la phosphoprotéine (P). Cette thèse présente une étude structurale, par des méthodes biochimiques et biophysiques, de la phosphoprotéine et de la nucléoprotéine produites dans la bactérie Escherichia coli. J'ai étudié les déterminants de la polymérisation de N et identifié un variant intéressant pour l'étude de N par cristallographie aux rayons X. J'ai aussi mis au point la purification d'un complexe de N et P, prélude à son étude structurale. Par ailleurs, j'ai montré que la partie N-terminale de P est intrinsèquement désordonnée. J'ai pu étendre ce résultat aux protéines P de nombreux virus apparentés par une étude bio-informatique. J'ai ensuite démontré l'importance du désordre structural au sein du complexe réplicatif des Paramyxoviridae #à la fois par son abondance et d'un point de vue fonctionnel#. Au-delà de leur intérêt pratique immédiat, ces résultats indiquent que la machinerie réplicative de ces virus pourrait constituer un système modèle pour l'étude du désordre structural dans les protéines. De plus, ils soulèvent de nombreuses questions et sont donc un prélude à une refonte de notre vision du complexe réplicatif de ces virus dont l'étude revêt une importance majeure en santé humaine.

One limitation to the therapeutic use of insect cell-produced recombinant glycoproteins is their glycosylation potential which mainly leads to short O- and N-glycans. Thus, our work is part of a global effort to "humanize" the glycoproteins produced in Lepidopteran cells.Our first concern was to understand the N-glycan processing pathway by metabolically labeling Sf9 cells. The use of processing inhibitors and of an intracellular trafficking inhibitor led us to the identification of key intermediates, thus confirming the hypothesis that the N-glycan processing pathway in insect cells parallels the one of mammalian cells up until the formation of the GlcNAcMan3[Fuc]GlcNAc2. In insects, this structure is the substrate for a β-N-acetylglucosaminidase, yielding Man3[Fuc]GlcNAc2.Nonetheless, this processing pathway can be diverted to the synthesis of complex-type N-glycans by adding the lacking glycosyltransferases. As an example, the expression of a β1,4-galactosyltransferase allows the formation of GalGlcNAcMan3[Fuc]GlcNAc2.We were then interested in engineering the sialylation in insect cells, which is complicated by the lack of the sialic acid donor, CMP-Neu5Ac. Our strategy was to express Trypanosoma cruzi trans-sialidase on the plasma membrane of insect cells, so that the enzyme can sialylate secreted glycoproteins, using sialylated donors from the medium. The construction was expressed by a baculovirus vector and found to encode an active enzyme which is partially located on the membrane and in the envelope of viral particles, while an increasing amount is soluble. However, the system can achieve the quantitative sialylation of exogenous acceptors.Our study contributes to demonstrate that engineering the glycosylation pathways in insect cells can be considered. The trans-sialidase is a potential alternative to sialyltransferases to address the question of the sialylation.; L'utilisation thérapeutique de glycoprotéines recombinantes produites dans le système baculovirus-cellules d'insectes reste limitée par le potentiel de glycosylation de ces cellules, qui produisent essentiellement des structures O- et N-glycanniques courtes. Notre travail s'inscrit donc dans un effort global d'"humanisation" de la glycosylation des protéines produites dans les cellules de Lépidoptères.Nous nous sommes d'abord attachés à comprendre la voie de maturation des N-glycannes dans des cellules Sf9. L'utilisation d'inhibiteurs de la maturation ou du trafic intracellulaire nous a permis d'identifier des intermédiaires clés et de confirmer l'hypothèse que la maturation des N-glycannes dans les cellules d'insectes et de mammifères suivent un chemin métabolique parallèle jusqu'à la formation de l'espèce GlcNAcMan3[Fuc]GlcNAc2. Chez les insectes, cette structure est ensuite substrat d'une β-N-acétylglucosaminidase qui produit l'espèce finale Man3[Fuc]GlcNAc2.Cette voie de maturation peut néanmoins être déviée vers la synthèse de N-glycannes de type complexe par l'addition de glycosyltransférases absentes : ainsi, l'expression d'une β1,4-galactosyltransférase permet la synthèse de l'espèce GalGlcNAcMan3[Fuc]GlcNAc2.Notre intérêt s'est ensuite porté sur l'ingénierie de la sialylation dans les cellules d'insectes, compliquée par l'absence du donneur d'acides sialiques, le CMP-Neu5Ac. Notre stratégie a été d'exprimer la trans-sialidase de Trypanosoma cruzi sur la membrane plasmique des cellules, afin qu'elle puisse sialyler les glycoprotéines sécrétées en utilisant des donneurs du milieu. La construction exprimée grâce à un vecteur baculovirus code une enzyme active, dont une partie est retrouvée sur la membrane plasmique et sur l'enveloppe des particules virales, tandis qu'une partie, croissante avec l'infection, est soluble. Néanmoins, le système permet une sialylation quantitative d'accepteurs exogènes.Notre étude contribue à montrer que l'ingénierie de la glycosylation dans le système baculovirus-cellules d'insectes est envisageable. Pour résoudre le problème de la sialylation, la trans-sialidase est une alternative possible aux sialyltransférases.

The market for recombinant therapeutic proteins (including antibodies) is estimated to be greater than $50-billion and has a compounded annual growth rate of around 20%. More than 50% of all approved processes for manufacturing recombinant proteins use mammalian cells as expression hosts due to their ability to carry out complex assembly and processing, human-like glycosylation and secretion of proteins. This percentage is not expected to change and should even increase with time. Classically, these manufacturing processes use stable cell lines for protein expression, wherein the plasmid coding for the protein of interest is stably integrated into the host cell chromosomes (Stable Gene Expression, SGE). An alternative method for expressing recombinant proteins is Transient Gene Expression (TGE). Herein, the expression of the protein of interest takes place from plasmids which are transfected into the cells and are maintained extra-chromosomally. TGE has become a rapid and easy method for obtaining proteins for structural, biochemical or pre-clinical studies, where only small amounts of one or more proteins might be required. As yet, TGE has not been used for manufacturing recombinant proteins for clinical testing or approved clinical use due to the requirement of large amounts of protein of consistent quality. Even though TGE has been scaled-up to the 100-liter scale and is being attempted at the 1000-liter scale, due to low specific productivity, low volumetric yields and the high cost of DNA, TGE processes are not able to economically produce sufficient amounts of proteins for such purposes. Therefore, the goal of this thesis was to improve TGE in order to create high-titer processes, which would be economically more feasible for manufacturing large-amounts of recombinant proteins. This was achieved by: Improving and simplifying gene delivery – by the combination of high cell density at time of transfection and in-situ complex formation (as apposed to a-priori complex formation), we could enhance protein expression levels and gene delivery. This made implementation more robust and easy, with greater choice of media which could be used and cell density which could be maintained. Improving gene expression – by using a combination of inhibitors of histone deacetylases like valproic acid, and growth factors like acidic fibroblast growth factor, we could enhance specific productivity by ∼20-fold. Enhancing the cell densities at which cells could be maintained after transfection – by the combination of cell cycle regulators like human p18 and p21 and treatment with inhibitors of histone deacetylases, we blocked cell growth which allowed cells to be maintained at significantly higher cell densities, allowing us to enhance volumetric productivity by ∼100-fold. Overall these improvements allowed antibody titers in excess of 1 g/l. The gram per liter range of volumetric productivity has previously only been reported for optimized SGE based manufacturing processes. We therefore improved the economic feasibility of TGE for manufacturing recombinant proteins and reduced the difference in manufacturing costs between TGE and SGE, for a given amount of protein, by an estimated 50-fold. With some further development work and study of related issues like protein quality, TGE based processes can be expected to become part of mainstream recombinant protein manufacturing in the future.

La microcine J25 (MccJ25) est un peptide antimicrobien de 21 acides aminés produit selon la voie ribosomiale et sécrété par une souche d'Escherichia coli. MccJ25 présente une structure très originale dite en lasso, impliquant un cycle lactame formé entre l'extrémité N-terminale et la chaîne latérale de l'acide glutamique en position 8, la région C-terminale étant piégée et fermement maintenue stériquement dans le cycle. De telles structures en lasso ont été décrites également pour quelques peptides naturels inhibiteurs d'enzymes, mais la voie de biosynthèse de tous ces peptides est inconnue. Le système génétique de MccJ25 est bien caractérisé. Il comporte un gène codant McjA, le précurseur de la microcine constitué de 58 acides aminés, un gène codant McjD, une protéine impliquée dans l'export de MccJ25 conférant à la souche productrice la résistance à MccJ25, et deux gènes codant McjB et McjC, deux protéines supposées être impliquées dans la maturation de McjA pour former la microcine active. Les recherches d'homologies ne permettent pas de prévoir la fonction de McjB et McjC, et par conséquent de proposer un mécanisme de maturation du précurseur McjA. Dans le but de caractériser la voie de biosynthèse de MccJ25, nous avons entrepris des expériences d'inactivation/complémentation des gènes mcjB et mcjC, qui ont montré que les deux protéines McjB et McjC sont requises pour la production de MccJ25 par la souche productrice. Parallèlement, les protéines recombinantes McjA, McjB et McjC munies d'une étiquette histidine ont été surexprimées puis purifiées afin de réaliser des expériences de reconstitution in vitro de la biosynthèse de MccJ25. La formation de MccJ25 a été détectée (i) par des tests d'activité antimicrobienne spécifique de MccJ25 et (ii) par couplage chromatographie liquide haute performance - spectrométrie de masse. Nous avons montré qu'in vitro, la protéine His6-McjA peut être convertie en MccJ25 sous l'action combinée de His6-McjB et His6-McjC, en présence d'ATP et de Mg2+. Ce résultat est la première reconstitution in vitro de la maturation d'un peptide en lasso et présente un intérêt biotechnologique important en terme de biosynthèse de peptides de structure complexe.