NADPH oxydase Nox4 native et recombinante : Composés quinoniques, éléments de régulation

Reactive oxygen species (ROS) are considered as intracellular messengers; they are produced mainly by the NADPH oxidases (Nox) family of which Nox4 is one of the representatives. The dysfunction of Nox4 is associated to diseases of aging as tumour development, atherosclerosis, pulmonary hypertension or osteoarthritis. Regulation of Nox4 activity is still poorly understood. The objective of this thesis work is to study Nox4 NADPH oxidase and diaphorase activities (initiation of electron transfer). Two variants (Nox4A, full length isoform and Nox4B, isoform lacking an NADPH binding domain) of Nox4 were identified by cloning the specific gene. Establishment of two cellular (HEK293E cells) and acellular (recombinant truncated Nox4 proteins) models led to the following results:1) The NADPH oxidase activity of Nox4A overexpressed in HEK293E cells is constitutive and the cytosolic part of Nox4 has a diaphorase activity (cell free system). On the contrary, Nox4B is inactive.2) The NADPH oxidase activity of Nox4 is inhibited by a series of quinone compounds slightly substituted (benzoquinone, hydroquinone, tMetBQ) and is stimulated by other quinones (tBuBQ, tBuBHQ, duroquinone, AA-861). Involvement of calcium and 5-lipoxygenase in the stimulation process of AA-861 and tBuBHQ was excluded. Our data converge on the hypothesis of a direct action of quinones on the N terminal membrane part of Nox4.We therefore showed that the NADPH oxidase activity of Nox4 is not only constitutive but also modulated by different quinones. The molecular mechanism is under work.
Les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) sont considérés comme des messagers intracellulaires et sont produits principalement par les NADPH oxydases (Nox) dont Nox4 est l'un des représentants. Le dysfonctionnement de Nox4 est relié à de nombreuses pathologies (cancer, athérosclérose, hypertension pulmonaire ou arthrose). La régulation de l'activité NADPH oxydase de Nox4 est encore peu connue. L'objectif de ce travail est d'étudier l'activité NADPH oxydase et diaphorase (initiation du transfert d'électron) de Nox4.Le clonage du gène de Nox4 a mis en évidence deux isoformes protéiques (Nox4A, forme entière et Nox4B, forme délétée d'un domaine de fixation du NADPH). La mise en place de deux modèles d'étude cellulaire (cellules HEK293E) et acellulaire (protéines recombinantes Nox4 tronquées) a permis d'obtenir les résultats suivants:1) L'activité NADPH oxydase de Nox4A surexprimée dans les cellules HEK293E est constitutive et la partie C terminale cytosolique en milieu acellulaire possède une activité diaphorase. Par contre, Nox4B est inactive. 2) L'activité NADPH oxydase de Nox4 est inhibée par une série de composés quinones faiblement substitués (benzoquinone, hydroquinone, tMetBQ) et stimulée par d'autres quinones (tBuBQ, tBuBHQ, duroquinone, AA-861). L'implication du calcium et de la 5-lipoxygénase dans le mécanisme d'action des composés AA-861 et tBuBHQ a été écartée. Nos données convergent vers l'hypothèse d'une action directe des quinones sur la partie N terminale membranaire de Nox4.Nous avons donc démontré que l'activité NADPH oxydase de Nox4 n'est pas seulement constitutive mais modulable par différentes quinones. Le mécanisme moléculaire précis reste à définir.