Search

Lymphatic vessels are an integral part of the immune system that defends us against bacteria and viruses. These vessels are a drainage system for returning interstitial tissue fluid and immune cells into the blood circulation. A dysfunctional lymphatic system causes swelling of tissues due to excess fluid, known as lymphedema. The primary factor that stimulates the growth of lymphatic vessels (lymphangiogenesis) is vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). Although this has been known since 1997, many mechanistic details of VEGF-C’s action have only been recently uncovered. VEGF-C needs to be activated by the removal of its C- and N-terminal propeptides before it can generate new vessels, and this activation requires the CCBE1 helper protein and one of several proteases. VEGF-C can be a drug target for diseases involving the lymphatics, such as lymphedema, cancer, and heart diseases. However, the main limitation is our incomplete understanding of the actual mechanisms of VEGF-C activation for developing a functional lymphatic vasculature. The primary aim of my studies has been to identify additional puzzle pieces in VEGF-C activation, which will prove instrumental in future attempts to therapeutically target VEGF-C. In study I, we have characterized the role of the individual domains of VEGF-C and CCBE1 in the activation of VEGF-C. Our study determined the crucial role of the C-terminal domain of VEGF-C for efficient VEGF-C activation. In addition, we established differential roles of C- and N-terminal domains of CCBE1 for VEGF-C activation. The N-terminal domain is essential for mobilizing VEGF-C to the endothelial cell surface to form the VEGF-C/ADAMTS3/CCBE1 cleavage complex, whereas the C-terminal domain aids ADAMTS3-mediated VEGF-C processing. We have also proposed a model of VEGF-C activation where VEGF-C can be activated when bound to VEGFR-3/HSPGs on the cell surface or to ECM as well as in the soluble phase. In study II, we discovered additional proteases activating VEGF-C. We identified both VEGF-C and VEGF-D as substrates for KLK3 and cathepsin D. The presence of KLK3, VEGF-C, and CCBE1 in sperm plasma suggested a role of KLK3-activated VEGF-C in reproduction. KLK3 and cathepsin D cleavage of VEGF-C and VEGF-D generated N-terminally different forms that varied in their affinities towards VEGFR-2 and VEGFR-3. Cathepsin D-cleaved VEGF-C was VEGFR-3 specific and lost its angiogenic properties, whereas cathepsin-D-activated VEGF-D was VEGFR-2 specific and lost its lymphangiogenic properties. Identification of novel VEGF-C activating proteases has opened ways to therapeutically target VEGF-C in reproduction and metastatic cancer besides lymphedema treatment. In study III, we described for the first time a method to produce biologically active VEGF-C from E. coli using a combination of redox-modified Origami strain and maltose binding protein (MBP) tag. There are no reports of successful attempts to produce active VEGF-C in E. coli without the need for refolding from inclusion bodies. Such bacterial VEGF-C could be a readily available cost- and time-effective source of VEGF-C for in vitro studies. In study IV, we analyzed the occurrence of PDGF/VEGF homologs in different animal clades. We identified Cnidaria as the simplest animals containing PDGF/VEGF-like proteins. Almost all cnidarian PDGF/VEGFs contain the BR3P repeat characteristic for the C-terminal domain of VEGF-C. This finding suggests a VEGF-C-like protein as the earliest PDGF/VEGF to emerge during evolution. Interestingly, we showed a complete absence of PlGF in Amphibia and VEGF-B in crocodiles and birds. In addition, the presence of VEGF-F was not limited to venomous reptiles but could also be found in non-venomous lizards and gekkos. Due to recent advancements in our understanding of the development of fish vasculature, we also analyzed the heterogeneity of PDGF/VEGF molecules in fishes, including verification of gene prediction with mRNA sequencing data. This study provides a basis for choosing appropriate animal models for vascular biology research. With these studies, we primarily advance the understanding of VEGF-C biology and thus lay the groundwork for developing VEGF-C into a therapeutic target for diseases involving the lymphatic system. Imusuonet ovat olennainen osa immuunijärjestelmää, joka suojaa meitä bakteereilta ja viruksilta. Nämä suonet keräävät interstitiaalisen kudosnesteen ja immuunisolut palauttaakseen ne takaisin verenkiertoon. Viallinen imusuonisto aiheuttaa kudosten turvotusta ylimääräisen nesteen vuoksi, mikä tunnetaan nimellä lymfedeema. Ensisijainen imusuonten kasvua (lymfangiogeneesiä) stimuloiva tekijä on verisuonten endoteelin kasvutekijä-C (VEGF-C). Ennen kuin VEGF-C voi luoda uusia suonia, se on aktivoitava poistamalla sen C- ja N-terminaaliset propeptidit, ja tämä aktivaatio vaatii CCBE1-auttajaproteiinin sekä yhden useista proteaaseista. VEGF-C voi olla lääkinnällinen kohde sairauksissa, jotka liittyvät imusuonistoon, kuten lymfedeema, syöpä ja sydänsairaudet. Suurin rajoitus liittyy kuitenkin epätäydelliseen ymmärrykseemme VEGF-C:n aktivaation todellisista mekanismeista toimivan imusuoniston kehittämiseksi. Tämän tutkimuksen ensisijaisena tavoitteena oli tunnistaa lisää sellaisia palapelin palasia VEGF-C:n aktivaatiossa, jotka osoittautuisivat tärkeiksi tulevissa yrityksissä VEGF-C:n terapeuttisessa kohdistamisessa. Tutkimuksessa I on karakterisoitu VEGF-C:n ja CCBE1:n yksittäisten domeenien rooli VEGF-C:n aktivoinnissa. Tutkimus osoitti VEGF-C:n C-terminaalisen domeenin ratkaisevan roolin tehokkaassa VEGF-C-aktivaatiossa. Lisäksi selvitettiin CCBE1:n C- ja N-terminaalisten domeenien erilaiset roolit VEGF-C-aktivaatiossa. N-terminaalinen domeeni on välttämätön VEGF-C:n mobilisoimiseksi endoteelisolujen pintaan VEGF-C/ADAMTS3/CCBE1-kompleksin muodostamiseksi, kun taas C-terminaalinen domeeni auttaa ADAMTS3-välitteistä VEGF-C:n prosessointia. Tutkimuksessa on myös esitetty malli VEGF-C-aktivaatiosta, jossa VEGF-C voidaan aktivoida sekä solun pinnalla VEGFR-3/HSPG:eihin sitoutuneena, että liukoisena solunulkoisessa väliaineessa. Tutkimuksessa II havaittiin lisää proteaaseja, jotka aktivoivat VEGF-C:tä. Sekä VEGF-C että VEGF-D ovat substraatteja KLK3:lle ja katepsiini D:lle. KLK3:n, VEGF-C:n ja CCBE1:n läsnäolo siemenplasmassa viittasi KLK3-aktivoidun VEGF-C:n rooliin lisääntymisessä. KLK3 ja katepsiini D pilkkovat VEGF-C:n ja VEGF-D:n N-terminaaliset päät niin, että muodostuu N-terminaalisesti erilaisia muotoja, joiden affiniteetit vaihtelevat VEGFR-2:ta ja VEGFR-3:a kohtaan. Katepsiini D:llä pilkottu VEGF-C oli VEGFR-3-spesifinen ja menetti angiogeeniset ominaisuutensa, kun taas katepsiini-D-aktivoitu VEGF-D oli VEGFR-2-spesifinen ja menetti lymfangiogeeniset ominaisuutensa. Uusien VEGF-C:tä aktivoivien proteaasien tunnistaminen on avannut tapoja kohdistaa VEGF-C:tä terapeuttisesti hedelmöityshoidoissa ja metastaattisissa syövissä lymfedeemahoidon lisäksi. Tutkimuksessa III kuvattiin ensimmäistä kertaa menetelmä biologisesti aktiivisen VEGF-C:n tuottamiseksi E. colissa. Tässä hyödynnettiin redox-modifioidun Origami-kannan ja maltoosia sitovan proteiinin (MBP) yhdistelmää. Tämä menetelmä tuotti biologisesti aktiivista proteiinia, joka on aiemmissa raportoiduissa yrityksissä vaatinut uudelleenlaskostamisen inkluusiokappaleista. Tällainen bakteeriperäinen VEGF-C voisi olla helposti saatavilla oleva kustannus- ja aikatehokas VEGF-C:n lähde in vitro -tutkimuksiin. Tutkimuksessa IV analysoitiin PDGF/VEGF-homologien esiintymistä eri eläinkladeissa. Cnidaria-pääjaksoon kuuluvat lajit tunnistettiin yksinkertaisimmiksi PDGF/VEGF:n kaltaisia proteiineja sisältäviksi eläimiksi. Havaittiin, että VEGF-C:n kaltainen proteiini on varhaisin muoto PDGF/VEGF-tyyppisistä proteiineista, joka on ilmaantunut evoluution aikana. Mielenkiintoista on, että PlGF puuttui täysin sammakkoeläimistä ja VEGF-B puuttui krokotiileista ja linnuista. Lisäksi huomattiin, että VEGF-F:n esiintyminen ei rajoittunut vain myrkyllisiin matelijoihin, vaan sitä voitiin löytää myös ei-myrkyllisistä liskoista ja gekkoista. Tämä tutkimus tarjoaa pohjan sopivien eläinmallien valinnalle verisuonibiologian tutkimuksiin. Näillä tutkimuksilla edistetään ensisijaisesti VEGF-C:n biologian ymmärtämistä ja luodaan pohja imusuoniston sairauksien hoidolle.

Lignin is a phenolic polymer that is found in certain specialised plant cell walls (CWs). For example, the CWs of water-transporting cells in xylem and the CWs of sclerenchyma cells lignify. As many plants and especially trees have many lignified cells, lignin is the second-most abundant terrestrial biopolymer after cellulose. Lignin polymers are composed of monolignols, which are synthesised in the cytoplasm of plant cells by enzymes of the monolignol biosynthesis pathway, which belongs to a larger, multibranch pathway called the general phenylpropanoid pathway. Next, the monolignols are transported through the plasma membrane (PM) to the CW where they are oxidised by laccases (LACs) and/or class III peroxidases (PRXs). Finally, the oxidised monolignol radicals polymerise to form lignin, which provides strength to the CW and resistance against pests and pathogens. This PhD thesis is composed of three studies that are related to monolignols and membrane proteins of Norway spruce (Picea abies L. Karst). The toxicity of the monolignol coniferyl alcohol (CA) to plant cells was studied to resolve how non-lignifying plant cells respond to externally supplemented monolignols, and whether anything about transport could be deduced from the results. CA turned out to be toxic to tissue-cultured tobacco (Nicotiana tabacum L.) Bright-Yellow-2 (BY-2) cells in a concentration-dependent manner. This was detected by hindered growth, local ectopic lignin formation, and decreased viability. CA was observed to be degraded into various compounds in the culture medium, mostly non-enzymatically. The cells were able to glycosylate CA and many of the degradation compounds. Altogether, the results suggest that externally supplemented CA is toxic to BY-2 cells and part of the toxicity may be due to degradation products that are all detoxified via glycosylation. Although it was not clear how the toxic effect was caused at the molecular level, it seems that lignifying cells would benefit from glycosylation of monolignols, or from a plasma membrane (PM) transporter that exports CA from the cytosol into the apoplast. The details of monolignol transport through the PM have remained unclear, although multiple well-justified hypotheses have been suggested and excellent studies have been executed. In the second study of this thesis, the theory of active transport of monolignols was tested biochemically with microsomal vesicles that were prepared from lignin-forming-tissues and cultured cells of Norway spruce. Active transport of CA was not detected. However, the vesicles were capable of active transport of coniferin and p-coumaryl alcohol glucoside. Based on inhibitor assays, the transporter(s) is secondarily active utilising an H+ -gradient and co-locates with the V-ATPase on vacuolar and /or endomembranes. It is not yet clear if the role of this transporter(s) is to detoxify possible excesses of monolignols after glucosylation or to mediate secretion of monolignol glucosides to the CW via the vacuole or endosomal vesicles. LC-MS/MS proteomics analysis of spruce membranes and gene co-expression analysis of pre-existing Norway spruce datasets provided candidate genes that could code for the transporter(s) of monolignol glucosides. Additional ABC transporters were identified as candidates for monolignol transport based on literature. Testing the candidates remains a future task. In the third study, a PM protein of Norway spruce, respiratory burst oxidase homolog 1 (PaRBOH1) was studied. RBOHs use cytoplasmic nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) to produce superoxide to the other side of the membrane. In the apoplast, this superoxide is converted to hydrogen peroxide. The presence of hydrogen peroxide in the CW of a lignifying cell is important for PRXs to oxidise monolignols. PaRBOH1 had been set as a candidate enzyme to produce hydrogen peroxide based on previous research with a lignin-forming cell culture and gene expression studies. In the study, the involvement of this protein for developmental lignin polymerisation in Norway spruce could not be concluded, but the regulation of the enzyme activity was successfully studied. As is common for plant RBOHs, PaRBOH1 enzyme activity was upregulated by Ca2+ and phosphorylation, suggesting that the regulatory mechanisms of RBOHs are conserved. Individual residues in the N-terminal sequence of PaRBOH1 were recognised as targets of phosphorylation, but future studies will be needed to reveal the responsible kinases. Cellular membranes and their proteins are important for the function of cells. They are also involved in lignification, and the studies included in this thesis add to the accumulating knowledge on lignification in Norway spruce. There is a need in future studies to consider in detail the membrane components when delving deeper into the details of lignin biosynthesis. Ligniini on fenolinen polymeeri, jota on tiettyjen kasvisolujen soluseinissä. Esimerkiksi johtosolukoiden vettä kuljettavien puusolujen ja tukea antavien sklerenkyymisolujen soluseinät ovat vahvasti lignifikoituneita. Ligniini vahvistaa soluseiniä ja toimii kasvin puolustuksessa kasvituholaisia ja kasvitauteja vastaan. Koska lignifikoituvien kasvisolujen määrä on hyvin suuri varsinkin puuvartisilla kasveilla, ligniini on maailman toiseksi yleisin terrestrinen polymeerityyppi selluloosan jälkeen, ja sen osuus kasviperäisestä biomassasta on huomattava. Ligniini koostuu fenolisista yksiköistä, monolignoleista, jotka syntetoidaan sytosolissa monolignolien biosynteesireitin entsyymien avulla. Biosynteesin jälkeen monolignolit kuljetetaan solukalvon läpi soluseinään. Tästä kuljetusmekanismista on esitetty monia eri teorioita, joista osa on saanut myös tukea tutkimuksissa. Soluseinässä monolignolit hapetetaan soluseinän lakkaasi- ja/tai peroksidaasientsyymien avulla. Näin syntyvät monolignoliradikaalit reagoivat keskenään muodostaen kovalenttisia sidoksia ja viimein ligniinipolymeerin, joka sijoittuu soluseinän polysakkaridien väliin. Väitöskirjani koostuu monolignoleihin ja kuusen (Picea abies L. Karst) kalvoproteiineihin liittyvistä kolmesta osatutkimuksesta. Ensimmäinen tutkimus toimii pohjustuksena monolignolien kuljetusta käsittelevälle tutkimukselle. Siinä tarkasteltiin monolignoli koniferyylialkoholin myrkyllisyyttä kasvisolulle käyttämällä testisolukkona tupakan (Nicotiana tabacum L.) Bright-Yellow-2 (BY-2) liuosviljelmäsolukkoa. Tutkimuksessa ilmeni, että koniferyylialkoholi aiheuttaa ulkoisesti liuosviljelmään lisättynä kasvun hidastumista, paikallista ektooppisen ligniinin muodostumista ja jopa solukuolemaa, mikäli käsittelypitoisuus oli kyllin korkea. Koniferyylialkoholi kuitenkin hajosi liuosviljelmässä pääosin ei-entsymaattisesti useiksi eri yhdisteiksi, joita solut kykenivät glykosyloimaan. Tulosten perusteella oli pääteltävissä, että koniferyylialkoholi on myrkyllinen kasvisoluille ja kasvisolun olisi perusteltua pienentää koniferyylialkoholipitoisuutta sytosolissaan aktiivisesti glykosyloimalla sitä, tai mahdollisesti siirtämällä ulos solusta kuljetusproteiinin avulla. Toisessa tutkimuksessa testattiin teoriaa monolignolien aktiivisesta solukalvokuljetuksesta. Tutkimusmateriaalina käytettiin kuusen kehittyvää puusolukkoa ja ligniiniä tuottavaa liuosviljelmäsolukkoa. Kuusen ligniini koostuu lähes yksinomaan koniferyylialkoholiyksiköistä ja lisäksi pienestä määrästä p-kumaryylialkoholiyksiköitä. Kehittyvän puusolukon tiedetään sisältävän myös glukosyloitua koniferyylialkoholin sokerijohdannaista, koniferiinia, jota on ehdotettu myös soluseinään kuljetettavaksi monolignolimuodoksi. Kuusen lignifikoituvista solukoista valmistettiin mikrosomaalisia vesikkeleitä, jolla tarkoitetaan sekoitusta solun kaikista kalvorakenteista peräisin olevia pieniä kalvorakkuloita. Näitä vesikkeleitä muodostuu, kun solukko jauhetaan ja sekoitetaan nesteeseen. Mikrosomaalisissa vesikkeleissä havaittiin adenosiinitrifosfaatista (ATP) riippuvaista koniferiinin kuljetusta, muttei kuitenkaan koniferyylialkoholin kuljetusta. Inhibiittorikokein koniferiinin kuljetuksen pääteltiin olevan peräisin vakuolin tai endomembraanikalvolston kuljettajaproteiinista, joka hyödyntää kalvon protonigradienttia energian lähteenä kuljetusprosessissa. Yllättävää oli, että samankaltaista koniferiinin kuljetusaktiivisuutta havaittiin myös tupakan BY-2 soluista valmistetuissa mikrosomaalisissa vesikkeleissä. Tämä tulos kyseenalaistaa koniferiinin kuljettajaproteiinin osallisuuden suoranaisesti lignifikaatioon. Tulokset viittaavat ennemmin kuusen kuljettajaproteiinin olevan vastuussa monolignolien biosynteesireitin toiminnan säätelystä rajoittamalla monolignolien määrää sytoplasmassa siirtämällä monolignolien glukosidimuotoja vakuoliin. Ilman kuljettajaproteiinin tunnistusta lopullisia johtopäätöksiä on kuitenkin haastava tehdä. Siksi kalvovesikkelien proteiinit analysoitiin nestekromatografia-massaspektrometrialla (LC-MS/MS), ja proteiinit tunnistettiin kuusen genomiseen sekvenssin verraten. Lisäksi kuusesta tehtyjä geeniekspressiotutkimuksia hyödynnettiin, kun selvitettiin, mitkä kuljettajaproteiinit ilmenevät yhdessä monolignolien biosynteesientsyymejä koodaavien geenien kanssa. Kuusen kalvoilta havaittujen proteiinien ja geeniekspressioanalyysissä esiintulleiden geenien joukosta tunnistettiin kandidaatteja, jotka mahdollisesti vastaavat koniferiinikuljetuksesta. Analyyseistä saatiin tunnistettua myös joukko kiinnostavia ATP binding cassette (ABC)-kuljettajaproteiineja, sillä tämän ryhmän proteiineja on aiemmin kirjallisuudessa liitetty monolignolien kuljetukseen. Myös muita lignifikaatioon liittyviä proteiineja tunnistettiin ja ne voivat vastaisuudessa toimia lähtökohtana uusille tutkimuksille. Kolmannessa tutkimuksessa siirryttiin lähemmäs ligniinin polymerisaatiota. Peroksidaasien on näytetty olevan aktiivisia kuusen lignifikoituvassa puusolukossa ja ligniiniä tuottavassa solukkoviljelmässä. Peroksidaasit tarvitsevat vetyperoksidia hapettimeksi reagoidessaan monolignolien kanssa, joten vetyperoksidin läsnäolo soluseinässä on välttämätöntä peroksidaasivälitteiselle monolignolihapetukselle. Soluseinän vetyperoksidilähteiden lisäksi yksi mahdollisista lähteistä ovat solukalvolla sijaitsevat entsyymit. Picea abies respiratory burst oxidase homolog 1 (Parboh1) on kuusen puusolukossa vahvasti ilmentyvä geeni, jonka koodaama proteiini, PaRBOH1, käyttää sytosolista nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaattia (NADPH) tuottaakseen superoksidia apoplastiin. Superoksidi taas muuttuu entsymaattisesti tai ei-entsymaattisesti vetyperoksidiksi soluseinässä. Tutkimuksessa Parboh1 kloonattiin ja sen tuottaman entsyymin aktiivisuutta tutkittiin human embryogenic kidney (HEK)-soluissa. Kalsiumin ja PaRBOH1:n sytosolisen N-terminaalialueen fosforylaation havaittiin aktivoivan superoksidin tuottoa HEK-soluissa. Tämä on tyypillistä RBOH-entsyymeille, mutta osoitettiin olevan säätelymekanismi nyt ensimmäisen kerran myös paljassiemenisessä kasvissa. Tarkkaa fosforylaatiokohtaa(-ia) tutkittiin HEK-soluissa aminohappoja mutatoimalla sekä in vitro-kinaasikokeiden avulla. Näillä selvisi useita N-terminaalissa sijaitsevia aminohappoja, joiden fosforylaatiolla on mahdollista säädellä PaRBOH1:n entsyymiaktiivisuutta. Solun kalvostot ja niiden proteiinit ovat olennaisia solun toiminnalle. Ne ovat mukana myös lignifikaatiossa ja tämän kirjan tutkimukset lisäsivät tietoa tästä prosessista myös kuusen puusolukossa. Tulevaisuuden tutkimukset ottavat toivottavasti huomioon myös kalvojen biokemian ja biofysiikan luodatessaan yhä syvemmälle ligniinin biosynteesiin.

Epithelial morphogenesis is one of the crucial processes of tissue development, and is mediated by cell-cell communication. A key characteristic of epithelial cells is their polarization along the apical-basal axis. Loss of cell polarity often leads to neoplasia in metazoans, therefore several key components involved in apicobasal polarity formation have been identified to be tumour suppressors. However, it remains largely unknown how epithelial polarity and growth control are mutually coordinated. By using Drosophila melanogaster wing development and mammalian cell culture as model systems, this study aims to address mechanisms underlying apicobasal polarity and tissue development. In the Drosophila wing imaginal disc, via studying polarity determinant Scribble (Scrib), this study reveals that cell polarity is regulated through intercellular mechanism. Conditional knockdown of scrib in a stripe of cells in the wing imaginal disc results in loss of polarity in adjacent wild type cells, ultimately leading to neoplasia. Yorkie activity, an effector of the Hippo signalling pathway, is required for the expansion of loss of cell polarity. The data show that genetic interaction between the septate junction (SJ), Scribble and α-Catenin axis plays an important role in intercellular regulation of cell polarity. Next, this study demonstrates that Scribble physically interacts with α-catenin (α-Cat), and this interaction is conserved in Drosophila and mammals. The Scrib-α-Cat association helps stabilize localization of Scribble and regulates tissue homeostasis in Drosophila. The complex of Scrib and α-Cat regulates cell proliferation through the Hippo pathway in Drosophila and mammalian cells. In Drosophila, BMP/Dpp signalling is crucial for wing vein morphogenesis. In pupal wing, Dpp is expressed in the longitudinal veins (LVs) and is transported to the posterior crossvein (PCV) region to induce PCV morphogenesis. This study reveals that Scribble is required for PCV development. The data show that Scribble regulates BMP signalling by affecting the internalization of BMP type I receptor Thickveins (Tkv) in the PCV region. BMP signalling induces Scribble transcription, thus forming a feedback loop between Scrib and BMP signalling, which play a crucial role in PCV morphogenesis. Overall, this study reveals that Scribble plays a unique role in tissue growth in a non-autonomous manner through regulating apicobasal polarity at the tissue level. Conserved roles of interaction between Scribble and α-Cat in vertebrates and invertebrates provide important insights into tissue growth and homeostasis. Finally, Scribble contributes to pattern formation by forming a feedback loop with BMP signalling in tissue development. Taken together, this thesis work provides novel insights into how polarity determinant Scribble is utilized for tissue development through its interactions with multiple partners. Tiivistelmä ei saatavilla.

Ensuring the integrity of the genome during DNA replication is central in preserving the normal functions of cells and avoiding malignancy or cell death. The frontline protection against replication errors is the DNA mismatch repair (MMR) system, which repairs base-base mismatches and small insertion-deletion loops, thus preventing them from becoming permanent mutations. MMR-deficiency predisposes cells to accumulation of replication errors, and the most well-known signature of MMR-deficiency is microsatellite instability (MSI). Microsatellites are short, repetitive sequences that are especially vulnerable for insertion-deletion mutations. However, not all genomic regions enjoy equal MMR-protection against replication errors. DNA mismatch repair system has been shown to interact with the histone modification H3K36me3 and decrease the mutational burden in these regions. H3K36me3 is especially enriched in the 3′ exons of transcribed genes. However, in vivo studies of the relationship between H3K36me3-mediated MMR and local replication error burden are still lacking. To investigate this, we employed a highly sensitive single-cell whole exome sequencing to dissect the mutational landscape in Mlh1+/+ (MMR-proficient) and Mlh1-/- (MMR-deficient) macroscopically normal, non-malignant murine T cells. We found small deletions to be the best reporter of replication errors. We provide evidence that in transcribed genes, 3′ exons are naturally more prone to replication errors and that these exons are protected by the H3K36me3-mediated MMR recruitment. The data presented here shows differential, local MMR-recruitment and, consequently, differential MMR-repair activity within genes. Further, we expanded this to investigate how the global amount of MMR, meaning the copy number of functional Mlh1-gene, affects the genomic stability at microsatellite sequences in mouse small intestine and spleen, utilizing single-molecule PCR. We measured the microsatellite instability and Mlh1 expression in Mlh1+/+, Mlh1+/- and Mlh1+/+ murine small intestine and spleen. Indeed, we found that MSI rates do correlate with MLH1 protein expression. However, opposite trends were found between microsatellite expansions and contractions; microsatellite contractions inversely correlated with MLH1 expression, while expansions showed no correlation or even a weak positive correlation with MLH1 expression. Given the clues from differential dynamics of insertions and deletions, we utilized data obtained from single-cell exome sequencing of T cells and single-molecule PCR analysis of small intestine from Mlh1+/+ and Mlh1-/- mice to further explore the different characteristics and dynamics of microsatellite instability in vivo. We found that small deletions accumulate especially to A/T mononucleotide repeats of length 10 to 14 nucleotides long. Interestingly, insertions appeared to accumulate to short, less than 11 nucleotides long repeats in similar frequencies regardless of the nucleotide composition and showed no genotype dependent difference. In addition, mononucleotide repeat expansions appear to accumulate to genes that are replicated during early S phase, while deletions at mononucleotide repeats were found in genes that are on average, replicated later in S phase. Taken together, the findings presented here provide further evidence of differential dynamics of insertions and deletions at mononucleotide repeats in addition to the differential correlation of these mutation types with the expression of Mlh1 gene. Lastly, I explored the possible mutational target genes and their characteristics in MMR-deficient T cells prior neoplasia. Genes affected with mutations in Mlh1-/- samples were almost exclusively devoid of mutations in Mlh1+/+ samples, suggesting that these genes are protected against replication errors by MMR-mediated repair. Huwe1 and Mcm7 emerged as potential early mutational target genes in T cells prior neoplasia. Taken together, this thesis presents studies on de novo replication errors and DNA mismatch repair in vivo at single DNA molecule resolution. We show evidence that the amount of available MMR proteins influences the replication error repair not only locally within genes, but also on a global level. In addition, we explore the differences and similarities in microsatellite insertion and deletion dynamics to dissect the repeat instability signatures in MMR-deficiency. Lastly, this thesis presents possible mutational target genes and their characteristics in MMR-deficient T cells prior neoplasia. Perimän stabiilisuuden säilyttäminen solun jakautumisen aikana on tärkeää solun normaalin toiminnan kannalta. Korjaamattomat DNA:n kahdentumisen aikana syntyneet virheet jäävät perimään mutaatioina, jotka pahimmassa tapauksessa voivat johtaa syövän syntymiseen. Soluilla on kuitenkin useita mekanismeja, jotka korjaavat ja suojaavat sen perimää mutaatioiden syntymistä vastaan, ja yksi näistä on MMR (mismatch repair) -systeemi. Häiriöt tässä korjausmekanismissa altistavat solut mutaatioiden kertymiselle, erityisesti lyhyisiin toistojaksoihin, joita kutsutaan mikrosatelliiteiksi. MLH1-proteiini on yksi MMR-mekanismin komponenteista, ja ilman sitä koko MMR-systeemi on toimimaton. H3K36me3-modifikaatio histoniproteiinissa, jonka ympärille DNA on kiertynyt, on osoitettu rekrytoivan MMR-koneiston näille perimän alueille. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli tutkia, miten paikallinen, geenitasolla oleva MMR-mekanismin määrä, sekä Mlh1-geenin kopioluku perimässä ja sen ilmentäminen vaikuttavat perimän stabiilisuuteen hiiren kudoksissa. Tämän lisäksi tutkimuksen tarkoitus oli kartoittaa ja analysoida erilaisia MMR-puutoksen aiheuttamia mutaatioita. Tätä varten hyödynsimme yksisolu eksomisekvensointia, sekä yhden DNA-molekyylin PCR analyysia. Ensimmäisessä osatyössä kartoitimme DNA:n kahdentumisen aikana syntyneiden virheiden sijaintia eri geeneissä hiiren T-soluissa yksisolu eksomisekvensointia hyödyntäen. Tutkimus paljasti, että korkean ekspression geenit ja erityisesti niiden loppupäät ovat alttiita näille virheille, ja niiden korjausaktiivisuus MMR-koneistolla on korkeampi H3K36me3-histonimodifikaatiosta johtuvasta MMR-systeemin rekrytoinnista. Toisessa osatyössä tutkimme mikrosatelliittien stabiilisuutta hiiren T-soluissa. Tutkimuksessa havaitsimme, että pienet emäsparien deleetiot kertyivät eri pituisiin ja eri emäspareista koostuviin toistojaksoihin kuin pienet insertiot. Löysimme myös viitteitä DNA:n kahdentumisen ajoituksen vaikutuksesta näiden pienten deleetioiden ja insertioiden syntymiseen. Ensimmäisen ja toisen osatyön tulokset paljastivat Mcm7- ja Huwe1-geenien olevan erityisen alttiita kahdentumisen aikana syntyville virheille, ja että näitä geenejä suojellaan H3K36me3-välitteisen MMR-systeemin avulla. Nämä geenit ovat tärkeitä T-solujen normaalin kehityksen kannalta. Kolmannessa osatyössä tutkimme, miten Mlh1-geenin kopioluku ja geenin ekspressio vaikuttavat kahden mikrosatelliitin stabiilisuuteen hiiren ohutsuolessa ja pernassa. Havaitsimme pienten deleetioiden määrän mikrosatelliiteissa kasvavan, kun Mlh1-geenin ekspressio väheni, kun taas pienten insertioiden määrä kasvoi Mlh1-geenin ekspression kasvaessa.

In order to survive, all organism require sugars, amino acids and lipids, which are used for energy and growth. The nutritional needs of an organism vary tremendously between species, depending on their environment and physiological period. Despite dietary differences, every organism must maintain their metabolic homeostasis, otherwise they will suffer harmful – and eventually deadly – complications. For example, excess sugar consumption has been linked to metabolic diseases such as metabolic syndrome and type II diabetes. The maintenance of metabolic homeostasis requires regulation and sensing of nutrient levels. Amino acids, lipids and sugars are sensed and monitored through distinct mechanisms that initiate transcriptional responses, which then activate corresponding downstream pathways. Intracellular sugars are sensed by the highly conserved transcription factor ChREBP and Mondo, which heterodimerize with Mlx. The complex then binds to the carbohydrate response elements of their target genes, regulating a variety of metabolic pathways, including glycolysis and lipogenesis. However, despite recent discoveries of new sugar sensors, our understanding of the ChREBP/Mondo-Mlx network remains incomplete. As metabolic regulation, including sugar sensing, is highly conserved between mammals and Drosophila, this organism has been widely used in in vivo studies. Drosophila provides an extensive genetic toolkit, lack of genetic redundancy and a fully sequenced, annotated genome. These features make Drosophila an optimal model for sugar sensing studies. Genome-wide sequencing allows researchers to study organisms’ entire genome at once. However, the organization and analysis of such a large amount of data requires computational methods. A variety of strategies, carried out by computational algorithms, have been developed to best analyze different types of biological data. The focus of this thesis is on usage of in silico methods to uncover novel genetic regulators in sugar sensing. By using in silico methods for both pre-existing and novel data we identified two new sugar responsive members of the Mondo-Mlx sugar sensing network in Drosophila: transcription factors Grain and Clockwork orange (Cwo). Further, we revealed that Grain converges on lipid metabolism with Sugarbabe, a previously known sugar responsive transcription factor. While binding to overlapping genomic sites, Grain contributes to lipogenic gene expression mainly on a low sugar diet, and Sugarbabe under high sugar conditions. We also uncovered tissue-specificity of the sugar-inducible expression of Grain, and established Cwo as a regulatory link between Mondo-Mlx and Myc, both in Drosophila and mouse hepatocytes. We also describe the connection between ChREBP, DEC1 and DEC2 (mammalian orthologs of Cwo) in the regulation of ribosome biogenesis. Lastly, we demonstrate reprogramming of carbohydrate pathways in a relatively short evolutionary timeframe within closely related species. Finally, we identified genes involved in genomic variation of sugar tolerance. All results were achieved through a close co-operation between computational and experimental research. In conclusion, the results of this thesis highlight the potential of computational analyses in driving the identification of new candidate regulators of sugar responsive gene regulation. Jokainen eliö tarvitsee energiaa kasvaakseen ja selviytyäkseen. Tämä edellyttää sokerien, amino- ja rasvahappojen tuotantoa ja/tai saamista ravinnosta. Eri lajien ravintoaineiden tarpeet vaihtelevat todella paljon, ja riippuvat niin eliön elinympäristöstä kuin kasvuvaiheesta. Ravintoaineiden tarpeista riippumatta jokaisen eliön on säädeltävä ja ylläpidettävä aineenvaihdunnallista tasapainoaan, sillä epäonnistuminen johtaa vahingollisiin – jopa kuolettaviin – seurauksiin. Esimerkiksi sokerin liikakäyttö on yhdistetty aineenvaihdunnallisiin sairauksiin kuten metaboliseen syndroomaan ja II-tyypin diabetekseen. Aineenvaihdunnallisen tasapainon säilyttäminen vaatii ravintoaineiden aistintaa ja säätelyä. Amino-, rasvahappojen ja sokerien valvonta ja säätely tapahtuu erilaisten mekanismien kautta, jotka vuorostaan säätelevät ja käynnistävät transkriptionaalisia vasteita ja biologisia reittejä. Evolutiivisesti säilyneet transkriptiofaktori ChREBP ja Mondo ovat pääosin vastuussa solunsisäisestä sokerin aistinnasta. Yhdessä sitoutumiskumppaninsa Mlx:n kanssa ne sitoutuvat kohdegeeneihinsä säädellen useita metabolisia reittejä, kuten glykolyysiä ja lipogeneesiä. Uusia sokerisäätelijöitä on viime aikoina tunnistettu, mutta siitä huolimatta ymmärryksemme ChREBP/Mondo-Mlx säätelyverkosta on vajavainen. Aineenvaihdunnan säätely, mukaan lukien sokerisäätely, on evolutiivisesti hyvin säilynyt nisäkkäiden ja banaanikärpäsen (Drosophila) välillä. Banaanikärpäselle on myös kehitetty suuri määrä geneettisiä työkaluja sekä sen genomi on täysin sekvensoitu. Näistä syistä banaanikärpänen onkin laajasti käytetty malliorganismi, ja soveltuu hyvin myös sokerisäätelyn tutkimukseen. Genominlaajuinen sekvensointi mahdollistaa koko eliön perimän tutkimuksen kerralla. Kuitenkin näin suuren datamäärän analysointi vaatii laskennallisia metodeja. Laskennallisilla metodeilla toteutettavia erilaisia strategioita on kehitetty erityyppisten biologisten datojen analysointiin. Tässä väitöskirjassa keskitytään uusien geneettisten säätelijöiden löytämiseen sokerisäätelyssä laskennallisia (in silico) metodeja käyttäen. Käyttämällä in silico -metodeja sekä olemassa olevaan että väitöskirjaa varten tuotettuun dataan, tunnistimme kaksi uutta sokerisäätelijää Mondo-Mlx säätelyverkossa banaanikärpäsessä: transkriptiofaktorit Grain ja Clockwork orange (Cwo). Osoitamme että Grain ja Sugarbabe, tunnettu sokerisäätelijä, säätelevät yhdessä rasvametaboliaa. Grain säätelee rasvametaboliaa matalan verensokerin aikana, kun taas Sugarbabe osallistuu säätelyyn korkean verensokerin aikana. Lisäksi osoitimme Cwo:n toimivan ribosomien biogeneesissä säätelijänä Mondo-Mlx:n ja Myc:n välillä niin banaanikärpäsessä kuin hiiressäkin. Selvitimme myös yhteyden ChREBP, DEC1 ja DEC2 (nisäkkäiden Cwo ortologi) välillä ribosomien biogeneesissä. Lopuksi osoitimme hiilihydraattien säätelymekanismien uudelleenohjelmoinnin olevan mahdollista suhteellisen lyhyellä evolutiivisella aikavälillä läheisten lajien välillä. Viimeiseksi tunnistimme sokerisäätelyn perinnölliseen säätelyyn osallistuvia geenejä. Kaikki nämä tulokset saavutettiin laskennallisen ja kokeellisen tutkimuksen tiiviinä yhteistyönä. Johtopäätöksenä tämän väitöskirjan tulokset korostavat laskennallisten menetelmien mahdollisuuksia uusien geneettisten sokerisäätelijöiden tunnistamisessa.

Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is a dangerous viral pathogen that causes a severe neurological disease. Like other members of the Flavivirus family, the virus has a positive-strand RNA genome that forms a nucleocapsid (NC) with multiple copies of the capsid (C) protein. The NC is surrounded by a lipid envelope derived from host membranes. The viral envelope (E) and membrane (M) proteins are embedded into the bilayer, and form an icosahedrally symmetric lattice on the virion surface. The aim of my thesis work was to understand what sets TBEV apart from other flaviviruses, as well as to increase our knowledge of TBEV particle assembly. To identify open questions in the field, I performed a literature review on TBEV structural biology. My review highlighted that despite the danger it poses, TBEV has been under-studied, especially in comparison to other flaviviruses. Consequently, our understanding of TBEV biology relies heavily on extrapolation from other species, and many aspects of the virus’ lifecycle remain unknown. To better understand the unique features of the TBEV virion, I purified the virus, and used cryogenic electron microscopy (cryo-EM) combined with single-particle reconstruction to build a 3.3 Ångström-resolution three-dimensional model of the virus. The reconstruction revealed a novel M protein conformation that may be unique to TBEV based on sequence alignment. Additionally, the cryo-EM reconstruction allowed me to characterize the protein-protein and protein-lipid contacts that affect TBEV virion stability. I discovered that the M proteins form lateral contacts on the virion surface, stabilizing the virus. These interactions compensate for the lack of E-E contacts in TBEV compared to other flaviviruses. Additionally, I showed that the E and M proteins coordinate ordered phosphatidylcholine molecules that increase the stability of the virion. Despite the central role the envelope plays in particle stability and virus entry, the contribution of lipid interactions in virion assembly has received little attention. To understand the role of lipids in NC formation, I investigated the C protein interactions with membranes. I used liposome sedimentation assays, quartz-crystal microbalance with dissipation monitoring measurements with supported lipid bilayers, and Langmuir-Blodgett trough-based tensiometry to characterize the interactions of the C protein with membranes. I showed that the C protein can bind and insert into membranes only in the presence of lipids with negatively-charged headgroups and that it can recruit RNA while membrane-bound. I characterized the TBEV lipidome and observed that the lipids the C protein needs for membrane binding to are also incorporated into the virion envelope confirming the physiological relevance of the biophysical findings. My results show that while there are commonalities between flaviviruses, generalising from one taxon to the others is not always applicable, and thorough investigation is needed to establish pan-flaviviral characteristics. Additionally, it is evident that both protein-protein and protein-lipid interactions play important roles in TBEV biogenesis and particle stability, and merit further study. Puutiaisaivokuumevirus (tick-borne encephalitis virus, TBEV) on hengenvaarallisia hermosto-oireita aiheuttava patogeeni, joka kuuluu Flavivivirus-sukuun. Muiden suvun edustajien tavoin TBEV-virioni koostuu positiivisjuosteisesta RNA-genomista, jota ympäröi kapsidiproteiinista (capsid, C) rakentunut nukleokapsidi. Nukleokapsidia ympäröi isäntäsolulta ryöstetyistä lipideistä koostuva vaippa, johon viruksen pintaproteiinit M (membrane, ”kalvo”) ja E (envelope, ”vaippa”) ovat kiinnittyneet. Väitöskirjatyössäni tutkin TBEV-partikkelien rakentumista sekä sitä, kuinka TBEV eroaa muista flaviviruksista rakenteellisesti. Ensimmäiseksi kirjoitin katsausartikkelin TBEV:n rakennebiologiasta ymmärtääkseni, mitkä osat viruksen elinkierrosta ovat huonosti tunnettuja. Katsaus osoitti, että vaarallisuudestaan huolimatta TBEV:tä on tutkittu huomattavasti muita flaviviruksia vähemmän. Tämän lisäksi selvisi, että NC:n rakentumisprosessin eri vaiheet ovat epäselvät kaikille Flavivirus-suvun edustajille. Ymmärtääkseni paremmin TBEV-virionin omalaatuisia piirteitä, rakensin siitä kolmiulotteisen kryoelektronimikroskopiarekonstruktion. Mallin resoluutio oli 3,3 Ångströmiä, mikä mahdollisti tärkeimpien TBEV-virionia koossa pitävien molekulaaristen vuorovaikutusten kuvaamisen. Rekonstruktion perusteella TBEV-partikkelissa M-proteiini on aikaisemmin tuntemattomassa konformaatiossa, joka saattaa olla uniikki TBEV:lle sekvenssilinjauksen perusteella. M-proteiinin uusi konformaatio johtaa virionin rakennetta vahvistavien M-M-vuorovaikutusten muodostumiseen viruspartikkelin pinnalla. Nämä kompensoivat vastaavien E-E-vuorovaikutusten vähäisempää määrää muihin flaviviruksiin verrattuna. Rekonstruktio osoitti myös, että E- ja M-proteiinit muodostavat kaksi lipidimolekyylejä sitovaa taskua, jotka ylläpitävät virionin rakennetta. Tutkin TBEV-nukleokapsidin rakentumista selvittämällä, mikä on lipidikalvojen rooli prosessissa. Käytin liposomisedimentaatiokokeita, kvartsikristallinmikrovaakamittauksia yhdistettynä tuettuihin lipidikaksoiskalvoihin sekä tensiometriaa Langmuir-Blodgett-kaukalossa. Havaitsin, että C-proteiini tarvitsee negatiivisesti varautuneita lipidejä sitoutuakseen kalvoihin. Tämän lisäksi tutkimukseni osoitti, että C proteiini kykenee työntymään kalvojen sisään, sekä sitomaan paikalle RNA:ta kalvoihin kiinnittyneenä. Kuvasin myös TBEV-lipidomin käyttäen massaspektrometriaa ja varmistin samalla aikaisempien havaintojeni biologisen merkityksen, sillä tulosteni perusteella C-proteiinin sitoutumiseen tarvittavia varautuneita lipidejä päätyy myös virionin vaippaan. Tutkimukseni osoittaa, että vaikka flavivirukset ovat monin tavoin samankaltaisia, ei yksittäisistä taksoneista voi välttämättä vetää suoria johtopäätöksiä toisiin. Tämän lisäksi tutkimukseni myötä on selvää, että TBEV-partikelin rakentuminen ja koossa pito vaatii useita proteiini-proteiini- ja proteiini-lipidivuorovaikutuksia, joita on tutkittava lisää.

Mosquitoes (Diptera, Culicidae) are amongst the most socioeconomically important animals in the world, with many species being vectors of disease-causing pathogens, including bacteria, helminths, protozoa and viruses. While not subjected to the same mosquito-borne disease burden as the tropics, Finland nonetheless has three known mosquito-borne viruses which cause disease in humans. Sindbis virus (Togaviridae: Alphavirus), which causes Pogosta disease, as well as Inkoo Virus and Möhkö strains of Chatanga virus (Peribunyaviridae: Orthobunyavirus). Three insect-specific flaviviruses have also been isolated from mosquitoes in Finland, Hanko, Ilomantsi and Lammi viruses (Flaviviridae: Flavivirus) as well as one Negevirus, Mekrijärvi negevirus. Knowledge of the mosquitoes, however, had become outdated, with no significant records of mosquitoes published since 1979 when distribution maps for each of the 38 recorded species were created using historical and contemporary collections. Additionally, the viruses which have been isolated from mosquitoes in Finland have been found in pools of unidentified specimens, which means that no vector or invertebrate host species have been confirmed for five of the seven aforementioned viruses. The aims were therefore to increase the knowledge of the composition and distribution of the Finnish mosquito fauna and the viruses associated with them. Adult and immature mosquito collections were made around the country in all 19 regions (corresponding to the European NUTS-3 divisions) between 2012–2018. The main collection efforts were made in 2014–2017 along transects in Lapland, southern Finland and the mainland of the Åland Archipelago (Ahvennanmaa). All specimens were morphologically identified, where possible, and stored in one of a variety of ways suitable for either virus cell culture experiments, virus PCR experiments, DNA studies or morphological studies. Study I was the first to focus on the mosquitoes of the Åland Archipelago, which is situated between Finland and Sweden in the Baltic Sea. From the collections made on mainland (Fasta) Åland in late 2015 and across 2016, 12 new species records were observed. This included the first country record for Aedes geminus Peus and reconfirmation of Anopheles maculipennis s.s. Meigen and Ochlerotatus sticticus (Meigen) following their recent removal from the fauna of Finland. It also recorded what later became the only confirmed record of Dahliana geniculata (Olivier) in Finland. The Finnish mosquito fauna increased from 38 to 41 species. Study II used DNA sequences extracted from specimens of the Anopheles maculipennis complex to identify which species are present in Finland. This resulted in the discovery of a new country record for Anopheles daciae Linton, Nicolescu & Harbach, a sibling species of An. messeae Falleroni. The Finnish mosquito fauna increased from 41 to 42 species. Study III utilised records for all 52,466 specimens from 1,031 collections to create distribution maps for 40 of the 43 recorded species that were collected for this thesis. Specimens of Aedes rossicus Dolbeškin, Gorickaja & Mitrofanova, Culiseta subochrea (Edwards) and Ochlerotatus cyprius (Ludlow) were not collected, nor mapped, but have been recorded previously. These new collection data significantly extended the recorded distributions for several species, while other common species were still found across the country. Questions were raised about the presence of Ochlerotatus riparius, since only adult specimens were identified, which are easily confused with closely related species. This study provides a solid foundation for future studies to build upon. Study IV explored the RNA viromes of nine man-biting Ochlerotatus species collected in Finland using next generation sequencing. In total, 514 viral polymerases were sequenced, which grouped into 159 species belonging to 25 families or equivalent taxonomic groups as follows: Aliusviridae (1), Aspiviridae (1), Botybirnavirus (8), Chrysoviridae (5), Chuviridae (14), Endornaviridae (2), Flaviviridae (9), Iflaviridae (17), Negevirus (41), Partitiviridae (55), Permutotetraviridae (6), Phasmaviridae (13), Phenuiviridae (58), Picornaviridae (5), Qinviridae (7), Quenyavirus (2), Rhabdoviridae (21), Sedoreoviridae (10), Solemoviridae (15), Spinareoviridae (1), Togaviridae (1), Totiviridae (205), Virgaviridae (7), Xinmoviridae (9) and Yueviridae (1). Twelve of these species have previously been described, while 147 were novel viruses. The host-vector associations of these viruses are yet to be established. Overall, studies I–IV contribute a wealth of contemporary knowledge about the mosquitoes of Finland. More research is required to complete our understanding of mosquito distributions in the country and mosquito-virus associations and interactions, but this thesis provides a solid foundation upon which future research can now be built. Hyttyset (Diptera, Culicidae) ovat sosioekonomisesti maailman tärkeimpiä eläimiä, ja monet lajit ovat sairauksia aiheuttavien patogeenien - bakteerien, loismatojen, alkueläinten ja virusten - levittäjiä. Vaikka Suomessa ei ole samanlaista hyttysten levittämää tautitaakkaa kuin tropiikissa, Suomessa tunnetaan kuitenkin kolme hyttysten levittämää virusta, jotka ovat ihmisen taudinaiheuttajia: Sindbis-virus (Togaviridae: Alphavirus), joka aiheuttaa pogostantautia, Inkoo-virus ja Chatanga-virus (Peribunyaviridae: Orthobunyavirus). Suomessa on hyttysistä eristetty myös kolme hyönteisspesifistä flavivirusta, Hanko-, Ilomantsi- ja Lammi-virukset (Flaviviridae: Flavivirus) sekä yksi Negevirus, Mekrijärvi-negevirus. Tieto hyttysistä on kuitenkin vanhentunut, eikä merkittävää tietoa Suomen hyttyslajeista ole julkaistu sitten vuoden 1979, jolloin kunkin 38 rekisteröidyn lajin levinneisyyskartat luotiin käyttämällä historiallisia ja silloin tehtyjä keräyksiä. Lisäksi virukset on aiemmin eristetty lajitasolle tunnistamattomista hyttyspooleista, joten viidelle edellä mainitusta seitsemästä viruksesta ei ole varmistettu yhtään levittäjähyttyslajia tai selkärangatonta isäntälajia. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli lisätä tietoa Suomen hyttyslajien kirjosta ja levinneisyydestä sekä niihin liittyvistä viruksista. Aikuisten ja kehittymättömien hyttysten keräyksiä tehtiin ympäri maata kaikissa 19 maakunnassa (vastaten Euroopan NUTS-3-jakoa) vuosina 2012–2018. Tärkeimmät keräystyöt tehtiin vuosina 2014–2017 poikkileikkaustutkimuksilla Lapissa, Etelä-Suomessa ja Ahvenanmaan saaristossa (Åland). Kaikki näytteet tunnistettiin morfologisesti, mikäli mahdollista, ja säilytettiin lisäksi virusviljelyä, virologisia PCR_tutkimuksia, sekä DNA- ja morfologisia tutkimuksia varten. Osatyö I keskittyi Ahvenanmaan saariston hyttysiin. Manner-Ahvenanmaalla (Fasta) vuoden 2015 lopulla ja vuoden 2016 aikana tehdyistä keräyksistä havaittiin 12 uutta lajimerkintää. Tämän osatyön myötä Aedes geminus Peusille havaittiin ensimmäistä kertaa Suomessa ja Anopheles maculipennis s.s. Meigen ja Ochlerotatus sticticus (Meigen), jotka oli äskettäin poistettu Suomen hyttyslajistosta, lisättiin siihen uudestaan. Tässä tutkimuksessa tehtiin myös ainoa vahvistettu havainto Dahliana geniculata (Olivier) -lajista Suomessa. Löytöjen myötä Suomen hyttyslajien hyttyslajien määrä kasvoi 38 lajista 41 lajiin. Osatyössä II käytettiin Anopheles maculipennis -kompleksin näytteiden DNA-sekvenssejä Suomessa esiintyvien lajien selvittämiseen. Tämän seurauksena löydettiin Suomessa uusi laji Anopheles daciae Linton, Nicolescu & Harbach, joka on An. messeae Falleronin sisaruslaji ja tämän myötä Suomen hyttyslajisto kasvoi 41 lajista 42 lajiin. Osatyössä III käytettiin tietueita kaikista 52 466 yksilöstä, jotka kuuluivat yhteensä 1 031 erilliseen kokoelmaan levinneisyyskarttojen luomiseksi tätä väitöskirjatyötä varten kerätyille 40:lle 43:sta Suomessa kirjatusta lajista. Aedes rossicus Dolbeškin, Gorickaja & Mitrofanova, Culiseta subochrea (Edwards) ja Ochlerotatus cyprius (Ludlow) yksilöitä ei kerätty eikä kartoitettu, mutta ne on tallennettu aiemmin. Nämä uudet keräystiedot laajensivat merkittävästi useiden lajien kirjattuja levinneisyysalueita, kun taas muita yleisiä lajeja löydettiin edelleen eri puolilla maata. Ochlerotatus riparius -lajin esiintyminen herätti kysymyksiä, koska siitä tunnistettiin vain aikuisia yksilöitä, jotka on mahdollista sekoittaa läheisiin lajeihin. Tämä osatyö antaa hyvän pohjan tuleville tutkimuksille. Osatyössä IV tutkittiin RNA-viromeja kaikkiaan yhdeksästä Suomessa ihmisiä pistävästä Ochlerotatus-lajinsta uuden sukupolven sekvensointimenetelmillä. Yhteensä sekvensoitiin 514 viruksen polymeraasigeeniä, jotka ryhmiteltiin kuuluviksi 159 lajiin, ja edelleen 25 heimoon tai vastaavaan taksonomiseen ryhmään seuraavasti: Aliusviridae (1), Aspiviridae (1), Botybirnavirus (8), Chrysoviridae (5), Chuviridae (14), Endornaviridae (2), Flaviviridae (9), Iflaviridae (17), Negevirus (41), Partitiviridae (55), Permutotetraviridae (6), Phasmaviridae (13), Phenuiviridae (58), Picornaviridae (5), (7), Quenyavirus (2), Rhabdoviridae (21), Sedoreoviridae (10), Solemoviridae (15), Spinareoviridae (1), Togaviridae (1), Totiviridae (205), Virgaviridae (7), Xinmoviridae (9) ja Yueviridae (1). Vain 12 näistä ehdotetuista lajeista on kuvattu aiemmin, ja 147 on uusia viruksia. Vielä ei täysin ymmärretä, toimivatko nämä yhdeksän lajia näiden virusten isäntinä vai vektoreina. Kaiken kaikkiaan tämän väitöskirjatyön tutkimukset tuovat runsaasti uutta tietoa Suomen hyttysistä. Lisää tutkimusta tarvitaan täydentämään ymmärrystämme hyttysten leviämisestä maassa sekä hyttysten ja virusten yhteyksistä ja vuorovaikutuksista, mutta tämä väitöskirjatyö tarjoaa vankan perustan, jolle tulevaa tutkimusta voidaan nyt rakentaa.

Understanding the genotype-phenotype map (GPM), or how specific genetic variation relates to specific phenotypic variation, is a fundamental objective of biology. Particularly for the study of evolution, the GPM is important since it bridges genes, the heritable units, with the traits that interact with the environment and determine fitness. The applied field of quantitative genetics approximates the GPM using linear statistical models. This approximation is the basis of many important applications, including methods to predict the response to selection in a population. The other major field concerned with the GPM is evolutionary developmental biology or evo-devo, which studies the gene and cell interactions by which the phenotype is built through the process of development. A main result from this field is that the GPM is notoriously complex and nonlinear, with genetic effects being highly dependent on genetic background, biophysical factors and the environment. This can be in conflict with the linear approximation of quantitative genetics. Because evo-devo and quantitative genetics have developed independently, there is a gap in the understanding of how these conceptualizations of the GPM fit with each other, what are their limitations, and if there is a potential to improve our ability to make prediction about evolutionary systems by combining insights from both approaches. This thesis deals with these issues. The thesis can be divided in two parts. The first part consists of theoretical work studying in detail how quantitative genetics predictions and models behave under complex and nonlinear GPMs that arise from development. For this, I performed large-scale evolutionary simulations using a realistic representation of the GPM given by a computational model of tooth development. Using this set of simulations, I first studied how well the linear approximation of quantitative genetics is able to predict the response to selection. I found that predictions using the linear approximation can be biased when the GPM is nonlinear. In other words, there can be a significant part of the response to selection that is missed by the linear approximation. Using the same set of simulations, I studied how the linear approximation evolves in a complex GPM. I found that the evolutionary dynamics of the linear approximation are highly dependent on the GPM, and differ substantially from what is expected for a linear GPM. These dynamics are not purely stochastic, but rather deterministic ways in which the linear approximation changes as a reflection of the curvature of the GPM. In the second part of my thesis, I use the insight obtained in the first part to develop an applied method that uses techniques of quantitative genetics, combined with insight from evo-devo, to provide better predictions of evolutionary response to selection. The method uses a Kalman filter to combine information from selection acting on each generation, with information from the evolutionary time-series. I test the method with the simulated dataset using the model of tooth development, and also with an artificial selection experiment on the wing of the fruit fly, where 16000 flies were measured. The new method is able to improve predictions and is a promising path to combine knowledge from both fields studying the GPM. In this way, the work in this thesis shows that rather than being a nuisance, the nonlinear nature of the GPM contains information that can improve our understanding of evolutionary processes. Ett centralt mål inom biologin är att förstå hur genetisk variation är kopplad till fenotypisk variation, det så kallade genotyp-fenotypförhållandet eller GPM (genotype-phenotype map). För studiet av evolutionen är GPM viktig eftersom det kopplar ihop generna, som ärvs från en generation till nästa, med fenotyper, som är de egenskaperna hos organismen som interagerar med miljön och bestämmer fitness. Det finns två stora områden som studerar GPM. Å ena sidan finns det kvantitativ genetik, som approximerar GPM med linjära statistiska modeller. Denna approximation används i många viktiga tillämpningar inklusive metoder för att förutsäga evolution. Å andra sidan finns det evolutionär utvecklingsbiologi eller evo-devo, som studerar gen- och cellinteraktionerna genom vilka fenotypen byggs upp. Ett viktigt resultat från detta område är att GPM är komplex och olinjär, med genetiska effekter som är beroende av andra gener, biofysiska faktorer och miljön. Detta kan stå i konflikt med den linjära approximationen av kvantitativ genetik. I min doktorsavhandling undersöker jag hur idéerna om GPM som kommer från evo-devo och kvantitativ genetik passar ihop, vilka deras begränsningar är och om det är möjligt att kombinera båda områdena för att förbättra evolutionära förutsägelser. Avhandlingen är baserad på tre separata studier (artiklarna I–III). I den första artikeln undersökte jag hur väl kvantitativ-genetiska modeller kan förutsäga evolution i en komplex GPM genererad från en beräkningsmodell för tandutveckling. Med dessa simuleringar fann jag att evolutionära förutsägelser som använder kvantitativ genetik kan vara fel när GPM är olinjär. I den andra artikeln studerade jag hur den linjära approximationen förändras under evolutionen på en komplex GPM. Jag fann att dynamiken för den linjära approximationen beror starkt på GPM, och skiljer sig väsentligt från vad som förväntas för en linjär GPM. I den tredje artikeln utvecklade jag en metod som använder tekniker för kvantitativ genetik, kombinerat med insikt från evo-devo, för att ge bättre evolutionära förutsägelser. Jag testade metoden med ett urvalsexperiment på fruktflugans vinge, där 16 000 flugor mättes. Den nya metoden kan förbättra förutsägelser och är en lovande väg för att kombinera kunskap från båda områdena som studerar GPM.

This thesis addresses the genetic background of five spontaneous canine models of rare human disease. By utilizing genome-wide mapping methods, next-generation sequencing analyses and variant validation combined with detailed clinical and post-mortem examinations, we characterized new canine models, identified novel disease-associated variants and dissected their effects on health and morphology. In Study I, next-generation sequencing analysis in a Central Asian Shepherd dog affected by epidermolysis bullosa revealed a nonsense variant in COL7A1. Validation of the variant in 190 dogs confirmed the disease type as recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Immunohistochemical stainings in skin samples illustrated the lack of full-length type VII collagen protein in the affected dog. In Study II, genome-wide association analysis combined with next-generation sequence analysis identified a locus and candidate variant associated with recessive pituitary dwarfism in Karelian Bear Dogs. A splice site variant in POU1F1 was confirmed with validation in over 8000 dogs. Computational predictions indicated weakening of the splice acceptor site at the affected intron-exon junction. In Study III, homozygosity mapping combined with next-generation sequence analysis identified candidate regions and variants associated with recessive congenital hearing loss in Rottweilers. A missense variant in LOXHD1 was confirmed with validation in over 800 000 dogs, revealing a link between the variant and Rottweiler breed background. In Study IV, variant screening combined with clinical examinations and statistical analyses revealed novel morphological consequences of a previously described variant in DVL2. The findings showed that the variant is involved in variable caudal vertebral anomalies and contributes to a brachycephalic phenotype. Varying allele frequencies were identified across populations, indicating the differential impact of the variant on the genetic health of dog breeds. In Study V, clinical and post-mortem examinations revealed malignant polymorphic ventricular arrhythmia and sudden cardiac death in young Leonberger dogs. The high prevalence of the disorder in litters and families strongly indicated a genetic aetiology. However, genome-wide association analyses failed to reveal associated loci, likely due to genetic or phenotypic heterogeneity. Future studies aim to overcome these obstacles with expanded cohorts and improved clinical and molecular phenotypes. Our findings have multiple scientific and practical implications. The discoveries facilitate diagnostics and treatment by revealing the molecular and pathophysiological mechanisms of the disorders. Affected dogs also provide novel large animal models for preclinical studies, benefitting both human and veterinary medicine. Finally, the development of gene tests support dog owners and breeders in revising breeding programmes to improve the health of dog breeds. Tässä väitöskirjatyössä selvitettiin viiden koirilla esiintyvän perinnöllisen sairauden taustaa. Tutkimuksissa käytettiin genominlaajuista assosiaatioanalyysiä, seuraavan sukupolven sekvensointianalyysiä ja geneettisten varianttien validaatiota yhdessä yksityiskohtaisten kliinisten ja patologisten tutkimusten kanssa. Työn tuloksena kuvattiin uusia koirilla esiintyviä sairauksia ja tunnistettiin sairauksia aiheuttavia geenimuunnoksia ja niiden vaikutuksia koirien terveyteen ja ruumiinrakenteeseen. Osatyössä I tunnistettiin seuraavan sukupolven sekvensointianalyysillä keskiaasiankoirien epidermolysis bullosa -ihosairauteen liittyvä ehdokasgeenivirhe COL7A1-geenissä. Geenivirheen yhteys sairauteen varmennettiin 190 koiran perimässä, ja sairauden alatyypiksi tarkennettiin resessiivinen dystrofinen epidermolysis bullosa. Immunohistokemialliset värjäykset ihonäytteissä paljastivat täyspitkän kollageeni VII -proteiinin puutoksen sairastuneen koiran ihossa. Osatyössä II tunnistettiin genominlaajuista assosiaatioanalyysiä ja seuraavan sukupolven sekvensointianalyysiä käyttäen karjalankarhukoirien aivolisäkeperäiseen lyhytkasvuisuuteen liittyvä perimän alue ja ehdokasgeenivirhe. POU1F1-geenin silmukointialueella sijaitsevan geenivirheen yhteys sairauteen varmennettiin yli 8000 koiran perimässä. Laskennallinen ennuste viittasi geenivirheen sisältävän introni-eksoni -liitoksen silmukointialueen heikentymiseen. Osatyössä III tunnistettiin homotsygotiakartoitusta ja seuraavan sukupolven sekvensointianalyysiä käyttäen rottweilerien synnynnäiseen kuurouteen liittyviä perimän ehdokasalueita ja -geenivirheitä. LOXHD1-geenissä sijaitsevan geenivirheen yhteys sairauteen varmennettiin yli 800 000 koiran perimässä. Varmennus paljasti myös geenivirheen esiintyvän lähes yksinomaan rottweiler-taustaisissa koirissa. Osatyössä IV tarkennettiin varianttiseulontaa, kliinisiä tutkimuksia ja tilastoanalyysejä käyttäen aiemmin kuvatun DVL2-geenivirheen vaikutuksia koirien ruumiinrakenteeseen. Tulokset osoittivat geenivirheen yhteyden erilaisiin kaudaalinikamien epämuodostumiin ja kuonon pituuden lyhenemiseen. Vaihteleva frekvenssi osoitti geenivirheeseen liittyvien terveysongelmien kuorman eroavan rotujen välillä. Osatyössä V tunnistettiin kliinisiä ja patologisia tutkimuksia käyttäen pahanlaatuisia kammiorytmihäiriöitä ja äkillisiä sydänperäisiä kuolemia nuorissa leonberginkoirissa. Sairauden korkea esiintyvyys pentueittain ja suvuittain viittasi perinnölliseen taustaan, mutta genominlaajuista analyysiä käyttäen ei tunnistettu ehdokasalueita perimästä. Tämä johtui todennäköisesti geneettisestä tai fenotyyppisestä heterogeniasta, mikä pyritään tulevissa analyyseissä huomioimaan suuremmalla otoskoolla ja tarkemmilla kliinisillä ja molekyylitason tutkimuksilla. Väitöstyön tuloksilla on useita tieteellisiä ja käytännön vaikutuksia. Löydökset edistävät diagnostiikkaa ja hoidon kehittämistä paljastamalla sairauksien taustalla olevat molekyylitason patofysiologiset mekanismit. Sairastuneet koirat voivat toimia mallieläiminä prekliinisissä tutkimuksissa, mikä hyödyttää sekä ihmis- että eläinlääketiedettä. Löydöksiin perustuvat geenitestit tukevat lisäksi koiranomistajia ja -kasvattajia jalostussuunnitelmien kehittämisessä terveempään suuntaan.

Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is an important flavivirus that affects the central nervous system, and is endemic in many parts of Europe, Russia and China. Despite its importance, TBEV is less extensively studied in comparison to its mosquito-borne relatives and much of the knowledge about TBEV is extrapolated from these. In this thesis work, I use an integrative structural biology approach, combining cryo-electron microscopy and cross-linking mass spectrometry to study the structure of TBEV and its interaction with host cells. Thus, identifying key differences and similarities between TBEV and its mosquito-borne relatives. The TBEV virion structure of the Kuutsalo-14 isolate was solved using cryo-electron microscopy to a resolution of 3.3 Å. The high-resolution structure allowed the visualisation of structural- and sequence-based differences among flaviviruses, which may influence their interaction with host proteins. In addition, the structure reveals conformational switching of the peripheral and transmembrane helices of the membrane protein (M), resulting in a previously unobserved M-M interaction. The residues responsible for the interactions are highly conserved in TBEV, but not mosquito-borne flaviviruses. Furthermore, two lipid interaction sites were resolved in the envelope protein (E), corroborating the presumed role of lipid pockets in stabilising TBEV virions. I examined the methodologies in the field of receptor identification and recognised a lack of cell-based proteomic approaches. Therefore, a novel method was developed to identify virus-host interactions on the surface of cells using cross-linking mass spectrometry. During this process, it became evident that cross-link validation methods for proteome-wide studies were poorly established. Using the intraviral protein cross-links as an internal control, I assessed the cross-link confidence level, and filtered the dataset to remove false positives arising due to poor cross-linked peptide spectrum matches. In total, 59 virus-host interactions were detected using cross-linking mass spectrometry. Notably, I identified an interaction between the surface of TBEV and the substrate-binding domains of HSP74 and BiP, two entry receptors for multiple flaviviruses. I also identified host proteins involved in endocytosis, cytoskeletal rearrangement, or located within the cytoskeleton, suggesting that both clathrin-mediated endocytosis and macropinocytosis may be used as entry mechanisms for TBEV. Puutiaisaivokuumevirus (TBEV) on vaarallinen keskushermostoa vahingoittava flavivirus, jota esiintyy Euroopassa, Venäjällä ja Kiinassa. Vaarallisuudestaan huolimatta sitä on tutkittu huomattavasti vähemmän kuin sen hyttysten välityksellä tarttuvia sukulaisia. Tästä johtuen virukseen liittyvissä kysymyksissä joudutaan usein tyytymään toisista flaviviruksista johdettuun tietoon. Väitöskirjatyössäni tarkastelin virusta integratiivisen rakennebiologian näkökulmasta ja yhdistin kryoelektronimikroskopiaa (cryo-EM) ja massaspektrometriaa tutkiakseni TBEV-partikkelien rakennetta ja vuorovaikutusta isäntäsolujen kanssa. Tutkimukseni paljastivat keskeisiä eroja TBEV:n ja muiden flavivirusten välillä. Rakensin cryo-EM-rekonstruktion Kuutsalo-14-kannan TBEV-virionista. 3,3 Å malli mahdollisti rakenteellisten erojen tarkastelun TBEV:n ja muiden flavivirusten välillä, mikä auttaa ymmärtämään, kuinka TBEV-virionit sitoutuvat isäntäsolujensa pinnalle. Rekonstruktio paljasti myös konformationaalisia muutoksia viruksen M-proteiinin trans- ja perimembraaniheelikseissä. Havaitussa konformaatiossa M-proteiinit vuorovaikuttivat tavalla, jota ei ole aikaisemmin kuvattu missään flaviviruslajissa. Vuorovaikuttavat aminohappotähteet ovat konservoituneet suurimmassa osassa TBEV-kantoja, mutta eivät hyttysten levittämissä flaviviruksissa. Havaitsin myös viruksen E- proteiinissa kaksi lipiditaskua, mikä tukee aikaisempaa näkemystä siitä, että lipidit vakauttavat TBEV-partikkeleja. Tutustuessani virusreseptorien tutkimusta koskevaan kirjallisuuteen huomasin, että virus-solujärjestelmien proteomisessa tutkimuksessa on puutteita. Tämän johdosta kehitin menetelmän, jolla TBEV-viruksen ja sen isäntäsolujen pintaproteiinien välisiä vuorovaikutuksia voidaan tutkia käyttäen proteiinien ristisitoutumiseen perustuvaa massaspektrometriaa. Menetelmää kehittäessäni havaitsin myös, että datan validoimismenetelmissä on suuria puutteita. Tästä syystä käytän viruspartikkelien sisäisiä ristisidoksia kontrolleina, joiden avulla voidaan karsia suuri osa huonolaatuisesta datasta ennen varsinaista analyysiä. Menetelmäni paljasti 59 erilaista virus-isäntäproteiinivuorovaikutusta. Havaitsin, että kaksi aikaisemmin flavivirusten reseptoreiksi tiedettyä proteiinia, HSP74 ja BiP, sitoutuvat myös TBEV-partikkelien pinnalle. Muut paljastuneet vuorovaikutukset liittyivät endosytoosiin sekä solutukirankaan ja sen muutoksiin vaikuttaviin proteiineihin. Tulokseni viittaavat siihen, että sekä klatriinivälitteinen endosytoosi että makropinosytoosi ovat tärkeitä TBEV- virionien tunkeutumiselle isäntäsoluihin.

Protein homeostasis is essential for the whole cell function. Therefore, cells monitor protein synthesis, folding, and degradation closely. Disturbances in secretory and membrane protein folding can cause accumulation of misfolded and unfolded proteins in the endoplasmic reticulum (ER). This condition, called ER stress, can predispose for manifestation of various diseases including neurodegenerative diseases such as Parkinson’s disease. Cells activate the unfolded protein response (UPR) to alleviate ER stress and restore homeostasis. Members of a novel neurotrophic factor family, cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF) and mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF), are components of the UPR machinery. They are small proteins widely expressed in mammalian tissues and mostly localized to the ER lumen. CDNF and MANF can reduce ER stress with a mechanism that is not fully understood. In addition, they also promote survival of neuronal and non-neuronal cells in different animal disease models. In animal models of Parkinson’s disease, they both protect and even restore the function of midbrain dopamine neurons. However, the involvement of endogenous CDNF and MANF in the maintenance and regulation of dopamine neurons in mice is not known. The aim of this thesis was to examine the role of endogenous CDNF and MANF deletion in UPR regulation in vivo. We also aimed to investigate the role of their deficiency in the maintenance and function of midbrain dopamine neurons as knockdown of MANF results in changes in the dopamine system in fruit fly and zebrafish. In this thesis, we characterized CDNF and MANF knockout mice and analyzed their UPR gene expression and the midbrain dopamine system by gene expression analyses, immunohistochemical methods, and behavioral tests. Compensation between CDNF and MANF was investigated in the third study where we developed and characterized mice lacking both CDNF and MANF. This study demonstrates that MANF ablation causes an increase in UPR gene expression in the developing, adult, and aged brain in vivo and in cortical neurons in vitro. In particular, the inositol-requiring enzyme 1 α (IRE1α) pathway of UPR is persistently activated in the MANF-deficient brain. CDNF ablation, instead, induces UPR gene upregulation in the skeletal muscle, which is aggravated by MANF ablation. This indicates that MANF can functionally compensate for CDNF. We show that vice versa, CDNF cannot compensate for MANF function in the tissues studied. Furthermore, this thesis addresses the role of CDNF and MANF in the function and maintenance of the midbrain dopamine system. We investigated the integrity of dopamine fibers and dopamine neurons in aged mice lacking CDNF, MANF, or both. Furthermore, motor behavior of these mice was investigated to measure the function of the dopamine system. Our data indicated that these mice did not show degeneration of the midbrain dopamine system upon aging although CDNF-deficient mice display functional changes in dopamine neurons. In conclusion, this thesis work elucidates the importance of CDNF and MANF in regulating the UPR with tissue specificity in vivo. In addition, we provide data about the role of endogenous CDNF and MANF in the maturation and maintenance of the midbrain dopamine system. Proteiinitasapaino on elintärkeää solujen toiminnalle. Tästä syystä solut seuraavat proteiinien tuotantoa, laskostumista ja hajotusta tarkasti. Häiriöt eritettävien tai kalvoproteiinien laskostumisessa voivat aiheuttaa väärin laskostuneiden tai laskostumattomien proteiinien kertymistä solulimakalvostoon (endoplasmic reticulum, ER). Tätä tilaa kutsutaan ER-stressiksi, joka voi altistaa useiden sairauksien puhkeamiselle. Etenkin hermorappeumasairauksissa, kuten Parkinsonin taudissa, ER-stressin on osoitettu olevan osa taudin syntyä. Solut käynnistävät ER-stressiä lievittääkseen reaktion nimeltä laskostumattomien proteiinien vaste (unfolded protein response, UPR). Uuden hermokasvutekijäperheen jäsenet – dopamiinihermokasvutekijä (CDNF) ja mesenkefaalinen astrosyyttiperäinen hermokasvutekijä (MANF) – ovat osa UPR-koneistoa. Ne ovat pieniä proteiineja, joita tuotetaan laajasti nisäkkäiden eri kudoksissa. Solussa ne sijaitsevat pääosin ER:n ontelossa. Sekä CDNF että MANF vähentävät ER-stressiä toistaiseksi tuntemattomalla tavalla. Tämän lisäksi ne suojelevat hermosoluja sekä muita soluja erilaisten tautien eläinmalleissa. Parkinsonin taudin eläinmalleissa ne suojaavat dopamiinihermosoluja ja pystyvät palauttamaan näiden hermosolujen toiminnan. Toistaiseksi ei tiedetä osallistuvatko endogeenisesti tuotetut CDNF ja MANF dopamiinisolujen ylläpitoon ja säätelyyn hiirillä. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli tutkia endogeenisen CDNF:n ja MANF:n poiston vaikutusta UPR:n säätelyyn. Me myös tutkimme niiden puutteen vaikutusta keskiaivojen dopamiinisolujen selviytymiseen ja toimintaan, koska MANF:n puuttumisen on aiemmin osoitettu aiheuttavan muutoksia dopamiinisoluissa niin banaanikärpäsillä kuin seeprakaloilla. Tässä työssä analysoimme poistogeenisiä hiiriä, joilta on poistettu CDNF:n tai MANF:n ekspressio hiirten kehitysvaiheessa. Näiden hiirten avulla selvitimme CDNF: ja MANF:n poiston vaikutuksia analysoimalla muutoksia geenien ja proteiinien ekpressiossa, hyödyntämällä immunohistokemiallisia menetelmiä, sekä tutkimalla hiirten käytöstä. Kompensaatiota CDNF:n ja MANF:n välillä tutkittiin väitöskirjan kolmannessa osatutkimuksessa, jossa tuotettiin ja analysoitiin hiiriä, joilta puuttuu sekä CDNF että MANF. Tämä väitöskirjatutkimus osoittaa, että MANF:n poisto aiheuttaa UPR-geenien ekspression lisääntymistä niin kehittyvien, aikuisten, kuin ikääntyneiden hiirten aivoissa sekä kortikaalisissa hermosoluissa. UPR:n reiteistä erityisesti IRE1α-reitti (inositolia vaativa entsyymi 1 α) säilyy aktivoituna aivoissa, joista MANF puuttuu. CDNF:n poisto sen sijaan aktivoi UPR-geenien ekspressiota luustolihaksessa ja tämä aktivaatio voimistuu, kun MANF poistetaan myös. Tämä viittaa siihen, että MANF voi korvata CDNF-proteiinin toimintaa. Tämä ei kuitenkaan ole vastavuoroista, sillä CDNF ei näytä kompensoivan MANF-proteiinia tutkituissa kudoksissa. Lisäksi tämä työ havainnollistaa CDNF:n ja MANF:n roolia keskiaivojen dopamiinisolujen toiminnassa. Dopamiinisäikeiden ja dopamiinisolujen tilaa tutkittiin hiiriltä, joilta puuttui CDNF, MANF tai molemmat. Lisäksi motorista käytöstä tutkittiin selvittääksemme dopamiinisolujen toimintaa. Tulokset osoittivat, että näillä hiirillä ei ollut havaittavissa dopamiinisysteemin degeneraatiota ikääntymisen myötä vaikkakin CDNF-puutteisilla dopamiinisoluilla oli muutoksia toiminnassa. Johtopäätöksenä voimme sanoa, että tämä väitöskirjatyö havainnollistaa CDNF:n ja MANF:n tärkeää osaa UPR:n säätelyssä ja osoittaa, että niiden vaikutus UPR:n säätelyyn riippuu kudoksesta. Lisäksi päättelemme, että malliemme perusteella nämä proteiinit eivät ole välttämättömiä dopamiinisolujen kehitykselle tai selviytymiselle. .

The aim of this thesis project was to improve the methods of molecular genetic mutation analysis in neuromuscular disorders, mainly focusing on challenging repetitive intragenic regions and making these methods more accessible. The large skeletal muscle genes nebulin and titin contain large repetitive, i.e., segmental duplication regions. These regions cause hurdles for standard copy number variation detection methods and are therefore often omitted from analysis. The segmental duplication region of nebulin has been previously shown to harbor pathogenic copy number variants; when the number of duplicated blocks deviates by two or more blocks per allele from the normal number, the alteration is considered a pathogenic recessive mutation. We developed a custom comparative genomic hybridization array for the detection of copy number variants in neuromuscular disorder-causing genes. The array covers all 11 known nemaline myopathy genes and 176 additional known and potential neuromuscular disorder genes. The genes are divided by coverage into three groups, all of which allow copy number variant detection at the exon level. Using the array, we detected the largest nebulin deletion (loss of genetic material) hitherto in a patient presenting with an asymmetric distal myopathy. We were also able to determine that the deletion was present in the patient in a mosaic state, which may contribute to the asymmetric phenotype of the patient. The deletion is the first causative dominant de novo deletion described in nebulin. We have previously used the comparative genomic hybridization array for routine screening of samples from patients in whom a copy number variant in the nebulin segmental duplication region is suspected to be a causative mutation. Moreover, the array detected previously unrecorded recurrent copy number variation in the segmental duplication region of titin. The array, however, is both relatively costly and laborious to run and yields far more data than necessary. In addition, the repetitive nature of the titin segmental duplication region does not allow for exact copy number determination by the comparative genomic hybridization array alone. We, therefore, set out to develop custom droplet digital PCR assays for routine screening of the nebulin segmental duplication region and assays to verify the copy number variation of the titin segmental duplication region. Using the droplet digital PCR assays targeting the nebulin segmental duplication region, we were able to determine the copy number of the region adequately. The droplet digital PCR assays targeting the titin segmental duplication region confirmed that the region is subject to copy number variation, revealing a novel putative pathogenic or modifying mechanism in the gene. Målet med detta doktorsavhandlingsarbete var att förbättra de molekylärgenetiska metoderna för mutationsanalys vid neuromuskulära sjukdomar med speciellt fokus på repetitiva regioner inom gener, och att göra dessa metoder lättare tillgängliga. De stora skelettmuskelgenerna nebulin och titin innehåller stora segmentella duplikationsregioner. Dessa regioner utmanar standardmetoderna inom analysen av förändringar i antalet segmentkopior, och lämnas därför ofta bort vid analyser. Den segmentala duplikationsregionen i nebulin har tidigare visats vara föremål för sjukdomsorsakande varianter i antalet segmentkopior; när antalet duplicerade block avviker med två eller fler stycken per allel från det normala antalet, anses förändringen vara en recessiv sjukdomsorsakande mutation. Vi utvecklade en komparativ genomisk hybridisations-mikromatris för att påvisa förändringar i antalet kopior av gener för neuromuskulära sjukdomar. Mikromatrisen täcker alla 11 kända nemalinmyopatiorsakande gener, tillsammans med 176 andra kända eller möjliga gener för neuromuskulära sjukdomar, populärt kallade muskelsjukdomar. Generna är indelade i tre grupper på basis av täckning, varav alla möjliggör bestämning av förändringar i antalet kopior på exonnivå. Med hjälp av mikromatrisen kunde vi hitta den största nebulindeletionen (det största bortfallet av genetiskt material) hittills i en patient med en asymmetrisk distal myopati. Vi kunde också se att deletionen var närvarande i mosaiktillstånd, vilket kan bidra till den asymmetriska muskelsvagheten hos patienten. Deletionen uppstod som en nymutation och är den första sjukdomsorsakande dominanta de novo deletion som beskrivits i nebulingenen. Vi har tidigare använt mikromatrisen för rutinanalys av prover från patienter hos vilka en förändring i antalet nebulinsegmentkopior har misstänkts vara sjukdomsorsakande. Ytterligare upptäckte vi med hjälp av mikromatrisen tidigare okänd kopieantalsvariation i titinets segmentala duplikationsområdet. Mikromatrisen är dock både såväl förhållandevis dyrt som arbetsdrygt, och producerar mycket mer data än vad som är nödvändigt. Dessutom tillåter inte den repetitiva naturen av titinets segmentala duplikationsregion inte exakt bestämning av antalet kopior med hjälp av endast mikromatrisen. Därmed satsade vi på att utveckla målspecifika droplet-digital-PCR-primers och hydrolysprober för rutinsållning och kopieantalsbestämning av nebulinets segmentala duplikationsregion, och primers och hydrolysprober i ett försök att verifiera variationen i antalet segmentkopior i titinets segmentala duplikationsregion. Droplet-digital-PCR primer-hydrolysprobparen för nebulinets segmentala duplikationsområde kunde adekvat bestämma antalet kopior i regionen. Droplet-digital-PCR-primer-hydrolysprobparen för titinets segmentala duplikationsområdet bekräftade förekomsten av förändringar i antalet kopior i området, och avslöjade därmed en möjlig ny sjukdomsorsakande eller modifierande mekanism hos genen.

Teeth are essential organs for the feeding process of the vast majority of vertebrates. Parameters such as tooth shape, size, identity, and number can have substantial implications on the ecology of a given species. However, understanding the development of many of these parameters has been limited by the lack of available model organisms. Indeed, most dental research has been so far performed on a single mammalian species, the house mouse, which has a highly derived and reduced dentition. Furthermore, one of the most characterizing features of many vertebrate dentitions, continuous tooth renewal, is not present in the mouse. Reptiles are one of the most diversified vertebrate clades, with over 10,000 species representing numerous ecologies and habitats. In particular, lizards in the clade Acrodonta possess many of these understudied dental features, including tooth renewal (polyphyodonty) and dentitions that vary along the length of the jaws (heterodonty), and thus offer valuable models for studying these fundamental properties. This thesis explores tooth development and replacement focusing on one Acrodontan species, the bearded dragon, which possesses a heterodont dentition with replacing anterior teeth and non-replacing posterior teeth. In this thesis, I show that in bearded dragon, tooth replacement is dependent on two putative dental stem cell populations. Unlike in other species with no tooth replacement, non-replacing teeth in bearded dragon do not show signs of degradation of the dental lamina, a key structure for tooth renewal. Instead, they lack one of the stem cell populations and show decreased expression of previously uncharacterized dental genes, thus losing the ability to produce replacement teeth from the dental lamina. In addition, I characterize the role of EDA signalling in the bearded dragon and show how changes in the activity of this pathway may alter dental formula through changes in tooth size. Finally, I show a universal rule guiding the correlation between tooth formula and size in Acrodonta, suggesting a previously undiscovered mechanism underlying the evolution of dentitions. Altogether, this thesis elucidates multiple central phenomena in vertebrate dentitions, and bridges our understanding of the relationship between the development and evolution of teeth in reptiles. Hampaisto on pääosalle selkärankaisista elintärkeä rakenne, joka mahdollistaa esimerkiksi ravinnonhankinnan. Hampaiden ominaisuudet, kuten niiden muoto ja lukumäärä, voivatkin merkittävästi vaikuttaa lajien ekologiaan. Hampaiston ja sen kehittymisen tutkiminen on siten olennaista selkärankaisten biologian ymmärtämiseksi. Tutkimus on kuitenkin aiemmin keskittynyt lähinnä muutamiin malliorganismeihin, erityisesti hiireen, mikä on rajoittanut käsitystämme hampaiston monimuotoisuudesta. Esimerkiksi hiirellä on hyvin erikoistunut hampaisto, ja siltä puuttuu yksi keskeinen selkärankaisille tavallinen ominaisuus, hampaiden jatkuva uusiutuminen (regeneraatio). Matelijat ovat yksi monimuotoisimmista selkärankaisryhmistä, ja erityisesti Acrodonta-kehityslinjan lajeilla on hampaissaan monia piirteitä, joiden kehittymistä on tutkittu aiemmin vähän, kuten uusiutumiskyvyltään sekä hammasrivistön sisällä muodoltaan vaihtelevat hampaat. Nämä lajit ovatkin mahdollisesti arvokkaita uusia malliorganismeja näiden ominaisuuksien ymmärtämiselle. Tässä tutkielmassa olen tutkinut sekä hampaiston kehittymistä että regeneraatiota keskittyen erityisesti yhteen Acrodonta-ryhmän lajiin, parta-agamaan. Parta-agaman hampaistossa anterioriset ja posterioriset hampaat eroavat toisistaan sekä muodoltaan että uusiutumiskyvyltään, mahdollistaen näiden ominaisuuksien tarkan vertailun. Tutkielmassani osoitan, että parta-agaman hampaiden regeneraation taustalla on kaksi eri oletettua kantasolupopulaatiota. Toisin kuin on aiemmin nähty muilla lajeilla, parta-agaman uusiutumiskyvyttömät (posterioriset) hampaat eivät osoita merkkejä hammaslaminan, regeneraatiolle olennaisen rakenteen, häviämisestä. Sen sijaan niiltä puuttuu toinen oletetuista hammaskantasolupopulaatioista, minkä lisäksi ne ilmentävät anteriorisia hampaita vähemmän tiettyjä geenejä, menettäen siten kykynsä regeneraatioon. Tutkielmassani selvitän lisäksi erään hampaille olennaisen molekulaarisen signalointireitin (EDA-signalointi) roolia parta-agamassa ja osoitan, että muutokset tässä reitissä voivat muuntaa hampaistoa vaikuttamalla solunjakautumiseen. Osoitan lisäksi, että koko hampaiston kehittyminen vaikuttaa sekä parta-agamilla että muilla Acrodonta-ryhmän lajeilla noudattavan samaa, aiemmin tuntematonta sääntöä. Tutkielmani valottaa yleisesti niitä molekulaarisia mekanismeja joilla selkärankaisille tärkeät ominaisuudet kehittyvät ja muuntuvat. Lisäksi ne selventävät hampaiden biologiaa erityisesti matelijoilla, joka on aiemmin ollut eräs huonoimmin tutkituista selkärankaisten kehityslinjoista, lisäten ymmärrystämme elinten ja niiden kehittymisen monimuotoisuudesta sekä evoluutiosta.

Mitochondria are organelles found in all eukaryotic cells and essential for metabolic functions and cell fitness. Mammalian mitochondria contain their own genome and ribosomes to synthesize 13 proteins that are core components of oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. The majorityof the mitochondrial proteome is encoded by the nuclear genome and are synthesized in the cytoplasm for transport into the organelle. Once imported into mitochondria, the 80 nuclear-encoded structural proteins assemble with the 13 mitochondrial-encoded counterparts to form multi-subunit complexes known as the OXPHOS system. Mitochondrial gene expression is the process of translating the information encoded on the mitochondrial genome into proteins that make up the OXPHOS complexes. This process involves nuclear-encoded factors and therefore requires tight coordination between mitochondrial and nuclear genome. During mitochondrial protein synthesis, nascent chains emerging from the ribosomes are inserted into the inner membrane for assembly into OXPHOS complexes and those that failed to insert or assemble into complexes are targeted for degradation. The co-translational insertion and degradation of mitochondrial nascent chain are regulated by a dedicated set of quality control machinery. Quality control of mitochondrial gene expression is a collective term for surveillance mechanisms that monitor molecular events leading to protein translation. In this dissertation, I have identified the chaperone protease complex composed of AFG3L2 subunits as the key component in co-translational quality control of mitochondrial nascent chains. AFG3L2 dysfunction triggers the activity of metalloprotease OMA1, which proteolytically process the dynamin-related GTPAse OPA1 and remodels the mitochondrial membrane morphology. Failure to counteract this stress response in a timely manner affects mitochondrial membrane dynamics and generates negative feedback on mitochondrial gene expression. My research establishes that this stress response is due exclusively to defects in quality control of mitochondrial nascent chains. Co-translational insertion of mitochondrial nascent chain is mediated by OXA1L insertase. Here, I have shown how OXA1L cooperates with AFG3L2 in regulating the insertion and turnover of mitochondrial nascent chains. In the absence of OXA1L, MT-ATP6 nascent chains are not inserted into the inner membrane and rapidly degraded by AFG3L2. These data have demonstrated how the activities of OXA1L and AFG3L2 determine the fate of a nascent chain. In addition, I have also found that translation of a specific pathogenic MT-ATP6 variant has a profound effect on mitochondrial gene expression. In the absence of AFG3L2 or OXA1L, this variant exhibits severe mitochondrial translation defect. Overall, these findings have provided new insights into the role of mitochondrial protein quality control mechanism in regulating mitochondrial gene expression. The last part of the dissertation addresses the frequency of errors at the 3' end of mitochondrial mRNAs. The human mitochondrial genome is transcribed into long polycistronic RNA transcripts that must be processed to release individual RNAs (rRNAs, tRNAs and mRNAs). Errors in the RNA processing step will generate aberrant mRNAs that interfere with the translation of fully functional proteins. To determine the error rate and diversity of aberrant mitochondrial mRNAs, a novel next generation sequencing approach was developed to provide comprehensive analysis of the 3’ end of mitochondrial transcripts. My results show the presence of aberrant mRNAs and variations in mitochondrial post-transcriptional modifications in health and disease. In addition, a significant proportion of these aberrant mRNAs lack a complete stop codon and are associated with translating mitochondrial ribosomes. Together, these observations demonstrate an inherent error rate in mitochondrial gene expression that requires quality control mechanisms to maintain functional protein synthesis. In conclusion, my thesis has identified critical steps in co-translational quality control of mitochondrial nascent chain synthesis and investigated the functional consequences of defective quality control system on mitochondrial gene expression. Mitokondriot ovat organelleja, joita esiintyy kaikissa eukaryoottisoluissa ja jotka ovat välttämättömiä aineenvaihduntatoiminnoille ja solujen kunto. Nisäkkäiden mitokondriot sisältävät oman genomin ja ribosomit syntetisoivat 13 proteiinit, jotka ovat oksidatiivisen fosforylaation (OXPHOS) kompleksien ydinkomponentteja. Suurin osa mitokondrioproteomista on ydingenomi koodaama ja syntetisoituu sytoplasmassa kuljetettavaksi organelliin. Mitokondrioihin tuotuaan 80 tuman koodaamaa rakenneproteiinia yhdistyvät 13 mitokondrioiden koodaaman vastineen kanssa muodostaen monialayksikkökomplekseja, jotka tunnetaan nimellä OXPHOS järjestelmä. Mitokondrioiden geeniekspressio on prosessi, jossa käännetään koodattu tieto mitokondrioiden genomista proteiineihin, jotka muodostavat OXPHOS-kompleksit. Tämä prosessi sisältää ydinkoodaamia tekijöitä ja vaatii siksi tiukkaa koordinointia mitokondrioiden ja ydingenomin välillä. Mitokondrioiden proteiinisynteesin aikana ribosomeista nousevat ketjut liitetään sisäkalvoon OXPHOS-komplekseiksi kokoontumista varten, ja ne, jotka eivät onnistuneet liittämään tai koota komplekseiksi, kohdennetaan hajoamiseen. Mitokondrioiden syntymässä olevan ketjun yhteistranslaatiota ja hajoamista säätelee omistettu laadunvalvontakoneisto. Mitokondrioiden geeniekspression laadunvalvonta on yhteistermi seurantamekanismeille jotka valvovat proteiinien translaatioon johtavia molekyylitapahtumia. Tässä väitöskirjassa olen tunnistanut AFG3L2-alayksiköistä koostuvan kaperoniproteaasikompleksin avainkomponentiksi mitokondrioiden syntymässä olevien ketjujen kotranslationaalisessa laadunvalvonnassa. AFG3L2 toimintahäiriö laukaisee metalloproteaasi OMA1 toiminnan, joka prosessoi proteolyyttisesti dynamiiniin liittyvää GTPAasia OPA1 ja muokkaa mitokondrioiden kalvon morfologiaa. Epäonnistuminen vastustaa tätä stressireaktiota ajoissa vaikuttaa mitokondrioiden kalvodynamiikkaan ja tuottaa negatiivista palautetta mitokondrioiden geeniekspressiosta. Tutkimukseni osoittaa, että tämä stressireaktio johtuu yksinomaan mitokondrioiden syntymässä olevien ketjujen laadunvalvonnan puutteista. OXA1L-insertaasi välittää mitokondrioiden syntymässä olevan ketjun yhteistranslationaalisen insertion. Täällä minä ovat osoittaneet, kuinka OXA1L tekee yhteistyötä AFG3L2 kanssa säädellessäsi lisäystä ja kiertoa mitokondrioiden syntymässä olevat ketjut. OXA1L puuttuessa MT-ATP6 nousevia ketjuja ei lisätä sisäkalvoon ja AFG3L2 hajottaa sen nopeasti. Nämä tiedot ovat osoittaneet, kuinka OXA1L ja AFG3L2 aktiivisuudet määräävät syntymässä olevan ketjun kohtalon. Lisäksi olen myös havainnut, että spesifisen patogeenisen MT-ATP6-variantin translaatiolla on syvällinen vaikutus mitokondrioiden geeniekspressioon. AFG3L2 tai OXA1L puuttuessa tällä variantilla on vakava mitokondrioiden translaatiovirhe. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot ovat antaneet uusia näkemyksiä mitokondrioiden proteiinien laadunvalvontamekanismin roolista mitokondrioiden geeniekspression säätelyssä. Väitöskirjan viimeisessä osassa käsitellään virheiden esiintymistiheyttä mitokondrion 3'-päässä mRNA. Ihmisen mitokondrion genomi transkriptoidaan pitkiksi polykistronisiksi RNA-transkripteiksi joita on käsiteltävä yksittäisten RNA (rRNA, tRNA ja mRNA) vapauttamiseksi. Virheet RNA-käsittelyvaiheessa synnyttävät poikkeavia mRNA:ita, jotka häiritsevät täysin toimivien proteiinien translaatiota. Poikkeavien mitokondrioiden mRNA virhesuhteen ja monimuotoisuuden määrittämiseksi kehitettiin uusi seuraavan sukupolven sekvensointimenetelmä, joka tarjoaa kattavan analyysin mitokondrioiden transkriptien 3'-päästä. Tulokseni osoittavat poikkeavien mRNA läsnäolon ja variaatioita mitokondrioiden transkription jälkeisissä modifikaatioissa terveydessä ja sairaudessa. Lisäksi merkittävältä osalta näistä poikkeavista mRNA:ista puuttuu täydellinen lopetuskodoni ja ne liittyvät mitokondrioiden ribosomien translaatioon. Yhdessä nämä havainnot osoittavat luontaisen virhesuhteen mitokondrioiden geeniekspressiossa, joka vaatii laadunvalvontamekanismeja toiminnallisen proteiinisynteesin ylläpitämiseksi. Yhteenvetona totean, että opinnäytetyöni on tunnistanut kriittiset vaiheet yhteiskäännösten laadunvalvonnassa mitokondrioiden syntymässä olevaa ketjusynteesiä ja tutkinut viallisen toiminnallisia seurauksia mitokondrioiden geeniekspression laadunvalvontajärjestelmä.

The Developmental Origins of Health and Disease (DOHaD) hypothesis states that several prenatal, perinatal, childhood, and adolescence factors may program the future health of an individual. These preprograming factors include maternal stress, anxiety, depression, or sleep during pregnancy or adverse life experiences in childhood or stress during adolescence. The programming processes may be changes in deoxyribonucleic acid (DNA) methylation or shortening of leukocyte telomere length (LTL). DNA methylation refers to an epigenetic mechanism that affects gene expression and is modified by external conditions. Telomere shortening is an event where the end of a chromosome shortens slightly in each cell division, ultimately leading to programmed cell death. Therefore, LTL is considered a marker for biological age. We studied this with a large birth cohort of newborns and calculated based on existing literature that our sample size was sufficient to detect previously reported findings. Despite sufficient statistical power, we could not replicate previous findings. Several reasons for this are discussed. Childhood is a phase of rapid brain development, and adverse events in early life are linked to a wide range of adverse health outcomes in adulthood. Several mechanisms behind this association have been proposed, among them LTL shortening. In turn, this shortening is also affected by current mental health disorders, stress, and lifestyle factors. We studied the effect of adverse life events (ACE) during childhood on adult LTL in a large, population-based nationally representative cohort of adults. Current mental disorders, stress, sleep, and various lifestyle and socioeconomic variables were considered. While current stress or mental health did not affect LTL, early adverse experiences had a cumulative effect on adult LTL, even when confounding factors were considered. This suggests that programming of cellular age can occur during childhood and persist into adulthood independent of later health and lifestyle. Adolescence is another phase where rapid brain development occurs and thus the brain is vulnerable to external and internal stressors. We explored this by studying epigenome-wide methylation in a sample of adolescent boys with or without depression and sleep disturbances. Due to the small sample size, we could not identify any significant genome-wide results. However, when the 500 best differentially methylated positions (DMP) were explored, a pathway related to synaptic pruning, the long-term depression (LTD) pathway, was identified as the most significant pathway. In a post-hoc analysis, a flattened slow-wave sleep dissipation, tiredness, and depression correlated with several individual sites in that pathway, suggesting that methylation changes in the LTD pathway may be one potential mechanism behind widespread adverse effects of sleep disturbances. Biological programming may occur in rapid phases of brain development and these effects may last for longer periods of time. However, careful methodological consideration is required to detect these effects. Terveyden ja hyvinvoinnin kehitykselliset juuret- hypoteesi esittää, että useat syntymää edeltävät sekä syntymän jälkeiset sekä lapsuuden ja nuoruuden aikaiset tekijät voivat ohjelmoida yksilön tulevaa terveyttä. Näihin ennalta ohjelmoiviin tekijöihin voivat lukeutua esimerkiksi äidin raskaudenaikainen stressi, ahdistus, masennus tai univaikeudet. Myös lapsuuden epäsuotuisat kokemukset tai nuoruudessa koettu stressi voivat ohjelmoida terveyttä tulevaisuuteen. Näitä ohjelmoivia tapahtumia voivat olla muutokset DNAn metylaatiossa tai valkosoluista mitatun telomeerin lyheneminen. DNA metylaatiomuutokset viittaavat epigeneettiseen säätelymekanismiin, jossa ulkopuoliset tekijät muuttavat perintötekijöiden ilmenemistä. Telomeerien lyheneminen puolestaan viittaa tapahtumaketjuun, jossa jokaisen solujakautumisen yhteydessä kromosomien päässä oleva telomeeri lyhenee hieman, johtaen lopulta ohjattuun solukuolemaan. Tästä syystä telomeerien pituutta on pidetty biologista ikää kuvaavana tekijänä. Tutkimme äidin raskausajan voinnin vaikutusta syntyvän lapsen telomeeripituuksiin suuressa syntymäkohortissa, ja tekemiemme voimalaskelmien perusteella aineistomme koon pitäisi riittää vähintään aiemmin raportoitujen havaintojen toistamiseen. Huolimatta riittävän suuresta aineistosta, emme kyenneet toistamaan aiempia havaintoja. Tälle on useita mahdollisia selityksiä, joita pohdimme työssämme. Lapsuus on aivojen nopean kasvun ja kehityksen vaihe ja siksi lapsuuden epäsuotuisien kokemusten onkin osoitettu olevan yhteydessä erilaisiin terveyden tilan heikkenemisiin aikuisuudessa. Tälle on ehdotettu useita mahdollisia välittäviä tekijöitä tai merkkejä, joista yhtenä on kuvattu valkosolujen telomeerien lyhentyminen. Myös aikuisuuden mielenterveysongelmien ja stressin on osoitettu olevan yhteydessä telomeeripituuteen. Tutkimme lapsuuden vastoinkäymisten merkitystä aikuisiän telomeeripituuteen suurella yleisväestöä edustavalla kohortilla. Ajankohtainen mielenterveys, stressi, uni, sosioekonominen tilanne tai elintavat eivät selittäneet yhteyttä telomeeripituuteen, sen sijaan lapsuuden kokemuksilla oli yhteys, vaikka kaikki em. tekijät huomioitaisiinkin. Lapsuuden epäsuotuisten kokemusten vaikutus näyttääkin yltävän pitkälle aikuisuuteen riippumatta aikuisiän tekijöistä. Nuoruus on vaihe, jossa aivot kehittyvät nopeasti ja ovat siten haavoittuvia sisäisille ja ulkoisille kuormitustekijöille. Tutkimme masennuksen ja univaikeuksien vaikutusta valkosoluista mitattuun koko perimän laajuiseen DNA metylaatioon vertaamalla nuorilla pojilla masennuksesta ja univaikeuksista kärsiviä terveisiin verrokkeihin. Liittyen aineiston pienuuteen emme havainneet perimänlaajuisia eroja, mutta eniten metylaation suhteen eroavat alueet rikastuivat geeneihin, jotka polkuanalyysissä liittyivät synapsien muovautuvuuteen, niin sanottuun Long Term Depression-polkuun. Syväunen määrän muutokset, väsymys ja masennus olivat jälkikäteisanalyysissä yhteydessä moniin tuon polun geenien metylaatiokohtiin viitaten siihen, että metylaatiomuutokset tuon polun geeneissä voisivat olla yksi mahdollinen tekijä masennukseen ja unihäiriöihin liittyvien laaja-alaisten vaikeuksien taustalla. Herkkyytemme biologiamme muovautumiselle saattaa olla lisääntynyt niissä kasvun ja kehityksen vaiheissa, joissa aivojen kehitys on nopeimmillaan ja nämä muovautumiset saattavat vaikuttaa pitkänkin aikaa eteenpäin. Näiden muutosten havaitseminen vaatii kuitenkin menetelmien osalta huolellisuutta ja tarkkuutta. Julkaistu painettuna: Helsinki: Unigrafia, 2021

Molecular genetics of late-onset neuromuscular diseases is often challenging to study due to limited patient and family material. This thesis aimed to unravel the genetics of late-onset myopathy patients with inclusion body myositis (IBM) and yet unknown inherited distal myopathy phenotype. IBM is an inflammatory myopathy of idiopathic nature showing characteristic quadriceps and finger flexor muscle weakness and rimmed vacuolar pathology. The molecular etiology of IBM is of key interest due to co-existing cytotoxic T-cell activity. However, the precedence of degenerative pathology and autoimmune features remain unclear, hampering the eventual development of appropriate therapeutic options. Using DNA and RNA sequencing-based data analysis, we aimed at understanding the different components of the molecular pathomechanisms in IBM. Using a limited case-control study, we identified the association of HLA-DQB1 in Finnish IBM patients. Additionally, by performing a comprehensive transcriptomics analysis we observed differential expression and splicing patterns in genes associated with maintaining calcium homeostasis, particularly during different T-cell activity and regulation stages. Disturbed antigen-driven T-cell hyperactivity and eventual loss of T-cell apoptosis could be one of the mechanisms behind the refractoriness of immune therapies in IBM patients. Patients with late-onset rare diseases often experience a long diagnostic journey in multiple and often invasive diagnostic procedures and ineffective symptomatic treatments. Due to limited study material, it is often difficult to ascertain the molecular diagnosis of previously unknown inherited myopathies. Identifying new rare disease-causing genes requires collaborations from different diagnostic centers, sharing deep phenotypic and genomic data. We identified a novel type of slowly progressing late-onset distal myopathy with rimmed vacuoles caused by mutations in the small muscle protein X-linked (SMPX) gene in patients from five different countries. Our genetic analysis revealed four different missense mutations, including two different founder mutations in Europe, indicating that the prevalence of this disease may be higher, and therefore SMPX should be considered in all unsolved male patients with late-onset rimmed vacuolar myopathy. Molekylgenetik vid sent debuterande neuromuskulära sjukdomar är ofta utmanande att studera på grund av begränsat patient- och familjematerial. Syftet med denna avhandling var att klarlägga genetiska faktorer hos sent debuterande myopatipatienter med inklusionskroppsmyosit (IBM) och en hittills okänd genetisk distal myopati. IBM är en inflammatorisk myopati av idiopatisk natur som uppvisar karakteristisk muskelsvaghet i anteriora lårmuskler och fingerflexorer samt rimmad vakuolär muskelpatologi. IBMs molekylära etiologi är av avgörande intresse på grund av den coexisterande inflammatoriska cytotoxiska T-cellaktiviteten. Men vad som är primärt, den degenerativa patologin eller de autoimmuna egenskaperna, är fortfarande oklart och hindrar förståelsen av etiologin och eventuell utveckling av lämpliga terapeutiska alternativ. Med hjälp av DNA- och RNA-sekvensbaserad dataanalys syftade vi till att förstå de olika komponenterna i de molekylära patomekanismerna i IBM. Med hjälp av en begränsad fallkontrollstudie identifierade vi en association men HLA-DQB1 hos finska IBM-patienter. Dessutom, via en omfattande transkriptomikanalys, observerade vi differentierad expression och splitsningsmönster hos gener associerade med att upprätthålla kalciumhomeostasen, särskilt under olika stadier och regleringen av T-cellaktivitet. Störd antigen-pådriven T-cell hyperaktivitet och eventuell förlust av T-cell apoptos kan vara en av mekanismerna bakom bristande effekt av immunterapier för IBM-patienter. Patienter med sällsynta muskelsjukdomar genomgår ofta en långvarig diagnostisk precedur omfattande multipla och ofta invasiva diagnostiska undersökningat och ineffektiva symptomatiska behandlingar. På grund av begränsade studiematerial är det ofta svårt att fastställa den molekylära diagnosen hos sent debuteande ärftliga myopatier. Identifiering av nya generna som orsakar sällsynta sjukdomar kräver samarbete mellan olika diagnostiska centra innefattande detaljerade fenotypuppgifter och genetiska data. Vi har identifierat en ny typ av sent debuterande distal myopati med rimmade vakuolär patologi förorsakad av mutationer i small muscle protein X-linked (SMPX) genen hos patienter från fem olika länder. Vår genetiska analys avslöjade fyra olika missense -mutationer, inkluderande två olika grundarmutationer i Europa, vilket indikerar att förekomsten av denna sjukdom torde vara högre, och SMPX bör screenas för mutationer i andra ouppklarade sent debuterande vakuolära myopatier hos män.

The endoplasmic reticulum (ER) is a continuous network of multiple functional and structural subdomains. This largest membrane-bound organelle in eukaryotic cells is comprised of the nuclear envelope and a dynamic network of peripheral interconnected sheets and tubules. ER function requires an intricate balance between its dynamic, structures, and functions. ER sheets and tubules orchestrate a complex yet not fully understood role in giving ER its explicit structure and function. The ratio of sheet and tubule conformations differs significantly within cell types and during the cell cycle. Such balance is possible with a well-functioning set of factors that communicate with each other throughout the cell cycle, and are responsible for shaping the ER sheets and tubules. These factors bring about the dynamic nature of the ER. The ER membrane harbors many key proteins involved in lipid metabolism, protein synthesis, and membrane shaping, maintenance, and remodeling. This PhD thesis is centered on the study of the family with sequence similarity 134, member C protein (FAM134C) using advanced microscopy techniques. FAM134C localizes to high curvature ER: sheet edges and tubules. Similar to Reticulon family proteins (RTNs) and FAM134B, it promotes ER tubulation upon overexpression through its reticulon homology domain (RHD). Importantly, FAM134C maintains the ER shape, and the shape and structure of the ER accommodate its function. Multiple functions are associated with the ER; however, very little is known about the relative distribution of these functions within the ER subdomains. How various functions are spread within the ER network is an intriguing question in cell biology. The thesis dissected the ER structural subdomains using a combination of light microscopy and quantitative immuno-electron microscopy. The distribution of function in the ER network is highly dynamic and most likely shifting upon changes in the cellular environment and nutrient availability. Thus far, it is arguable that no subdomain is responsible for hosting one function exclusively. The ER is a communicative organelle and contacts almost all other organelles in the cell. It is the site for organelle biogenesis, such as phagophore formation. Phagophore, or the isolating membrane, is the central organelle in autophagy (cellular self-eating). Our functional studies on FAM134C revealed its specific role in regulating the size, number, and cargo of autophagosomes upon amino acid starvation. Obviously, structural proteins, either individually or in complex, serve not only structural-maintenance roles but also other crucial functions in the cell. Lastly, we investigated the subcellular localization of the structural protein, Golgi reassembly stacking protein (GRASP55), in autophagy flux. Upon glucose starvation, GRASP55 shifts its localization from medial- and trans-Golgi cisternae to the surface of autophagosome-lysosome, where it facilitates the membrane fusion between autophagosome and lysosome through its interaction with LC3 and LAMP2. The results obtained during this project have strengthened our understanding of the proteins and factors involved in ER structure, function, and biogenesis, and thereby provided valuable insights into normal cell functions. Identification of the proteins and forces that maintain the ER structural and functional subdomains would be a pivotal step towards unraveling the relation between many diseases and the ER. This in turn could be the basis for summoning future strategies with therapeutic potentials. Endoplasma- eli solulimakalvosto (engl. endoplasmic reticulum, ER) muodostuu useista toiminnallisista ja rakenteellisista osastoista. Tämä eukaryoottisolujen suurin, kalvon ympäröimä organelli koostuu tumakotelosta ja perifeerisesti yhdistettyjen laattojen ja tubulusten dynaamisesta verkostosta. ER:n toiminnan kannalta on ensisijaisen tärkeää, että sen dynaamiset rakenteet ovat kaiken aikaa tasapainossa sen toimintojen kanssa. ER:n alati muokkautuvat laatat ja tubulukset muodostavat monimutkaisen kokonaisuuden, ja niiden merkitystä ER:n toiminnolle ei vielä täysin tunneta. Laatta- ja tubulusrakenteiden suhde vaihtelee huomattavasti solutyypistä ja solusyklin vaiheesta riippuen. Rakenteiden tasapaino on mahdollista saavuttaa vain, jos kaikki siihen vaikuttavat tekijät kommunikoivat keskenään koko solusyklin ajan. Yllä mainituista tekijöistä johtuen ER on luonteeltaan dynaaminen. ER:n kalvossa on useita tärkeitä proteiineja, jotka osallistuvat lipidien aineenvaihduntaan ja proteiinisynteesiin sekä säätelevät kalvojen rakennetta, ylläpitoa ja uudelleen muokkausta. Tässä väitöskirjassa on keskitytty tutkimaan yhtä proteiiniperheen FAM134 (engl. family with sequence similarity 134) jäsentä, FAM134C:tä, käyttäen kehittyneitä mikroskopiatekniikoita. FAM134C paikallistuu kaareville ER:n rakenteille, joita ovat ER:n tubulukset ja laattojen reunat. Samoin kuin Reticulon-perheen (RTN) proteiinit ja FAM134B, myös FAM134C:n retikulonihomologi-alue (RHD) aikaansaa ER:n tubuloitumista proteiinia yli-ilmennettäessä. FAM134C on tärkeä tekijä ER:n muodolle ja rakenteelle, joka puolestaan mahdollistaa ER:n toiminnallisuuden. ER:ssä tapahtuu useita toimintoja, ja vaikka ER:n toimintojen jakautuminen ER-verkostossa on kiehtova solubiologinen kysymys, toistaiseksi siitä tiedetään hyvin vähän. Opinnäytetyössä ER:n toimintoja ja eri rakenneosia analysoitiin käyttämällä valomikroskopiaa ja kvantitatiivisista immuno-elektronimikroskopiaa. Toimintojen jakautuminen ER:n verkostossa on erittäin dynaamista ja siihen todennäköisesti vaikuttavat mm. soluympäristö ja ravinteiden saatavuus. Nykytiedon mukaan voidaan sanoa, ettei yksikään ER:n rakenneosa ole yksinään vastuussa jostain tietystä toiminnosta. ER on kommunikoiva organelli ja on kontaktissa lähes kaikkien muiden organellien kanssa. ER:ssä tapahtuu organellien biogeneesi, kuten esimerkiksi fagoforin muodostuminen. Fagofori eli autofagosomia eristävä kalvo, on autofagian (solujen itsesyöminen) keskeinen organelli. FAM134C:tä koskevat tutkimuksemme paljastivat, että sillä on erityinen rooli autofagosomien koon, lukumäärän ja sisällön säätelyssä ravinneköyhissä kasvuolosuhteissa. On selvää, että rakenneproteiinit, joko yksittäin tai yhdessä, palvelevat paitsi rakenteen ylläpitotehtävissä myös muissa tärkeissä solun toimintoja tukevissa tehtävissä. Lopuksi tutkimme Golgin rakenneproteiinin, GRASP55:n, paikantumista autofagiassa. Kun solujen ravintoliuoksesta poistetaan glukoosi, GRASP55 siirtyy mediaalisesta Golgi-sisternoista ja trans-Golgi-sisternoista autofagosomi-lysosomien pinnalle, missä se on vuorovaikutuksessa LC3:n ja LAMP2:n kanssa aikaansaaden autofagosomin ja lysosomin kalvojen yhdistymisen. Tämän projektin tulokset ovat lisänneet ymmärrystämme ER:n rakenteeseen, toimintaan ja biogeneesiin liittyvistä proteiineista ja muista tekijöistä, ja antaneet siten arvokasta tietoa solujen normaaleista toiminnoista. ER:n rakenteellisia ja toiminnallisia osastoja ylläpitävien proteiinien ja toimintojen tunnistaminen on keskeinen askel kohti ER:n virhetoiminnoista johtuvien sairauksien selvittämistä. Tämä puolestaan tarjoaa perustan uusille kehitettäville strategioille, joilla voi olla terapeuttisia sovelluksia.

Induction of neuronal plasticity by drugs and physiological mechanisms has been an important topic in the modern neuroscience investigations due to its potential to restore functions in a wide range of disorders. However, significant progress in this area has been hampered by the lack of knowledge on the precise mechanisms and underlying molecular pathways. Perineuronal nets (PNNs), extracellular matrix structures that are particularly abundant around parvalbumin-containing (PV+) neurons, mature towards the end of the critical period in the brain development and inhibit neuronal plasticity. However, molecular pathways affected by PNN composition are not well known. On the other hand, tropomyosin receptor kinase B (TRKB), receptor for brain-derived neurotrophic factor (BDNF), is a well-recognized facilitator of plastic changes in the central nervous system. Whether these two opposing mechanisms converge on any common molecular pathway has not been identified previously. In the first study, we identified that perineuronal nets inhibit flexibility of neuronal cells and circuits through binding to receptor-like protein tyrosine phosphatase sigma (PTPσ), which subsequently dephosphorylates and inactivates TRKB. Specifically, we found that PNN component aggrecan restricts TRKB phosphorylation, while PNN removal by enzymatic activity of chondroitinase ABC (chABC) increases TRKB phosphorylation in neuronal cultures in vitro. We also found that a well-known ability of chABC to induce ocular dominance plasticity in the adult brain is dependent on TRKB, as mice deficient for TRKB in parvalbumin neurons (PV-TRKB+/-) do not exhibit enhanced plasticity in the visual cortex after chondroitinase treatment. We discovered that genetic knockdown of the PNN receptor PTPσ facilitates TRKB activation in vitro and in vivo, and that adult PTPσ+/- mice have juvenile-like plasticity in the visual cortex. We confirmed that TRKB and PTPσ display interaction in vitro, and identified that interaction occurs in the transmembrane domain. Finally, we found that the interaction between TRKB and PTPσ is diminished by antidepressant fluoxetine in vitro and in vivo. Altogether, our study suggests that chABC and antidepressant treatment induce plasticity through activation of TRKB by relaxing dephosphorylating control of PTPσ over it. In the second study, we focused on studying the molecular and behavioral phenotype of increased tonic plasticity displayed by genetic deficiency of PTPσ. We found that PTPσ+/- mice have increased phosphorylation of PLCγ1 but not Akt or Erk, suggesting that PTPσ specifically modulates PLCγ1 but not the other TRKB downstream signaling pathways. We did not find any changes in the expression levels of PSD-93, PSD-95 or in the number of excitatory synapses in their brain, suggesting that their phenotype cannot be explained by an altered number of synapses. We carried out a battery of behavior tests and discovered that PTPσ+/- mice have improved short-term and deteriorated long-term memory, as evident from their performance in the novel object recognition and fear conditioning tests. Finally, these mice do not exhibit any behavior abnormalities in elevated plus maze, open field, marble burying or forced swim test, suggesting that their behavioral changes are specific for tests requiring cognitive flexibility. We propose the term "hyperplasticity" to describe the PTPσ+/- mouse phenotype. Altogether, the current PhD project investigated the interaction between perineuronal nets, transmembrane phosphatase PTPσ and tyrosine receptor kinase TRKB in mediating plasticity in the brain. Neuronal plasticitet är en förmåga hos hjärnan att anpassa sig till miljöförändringar. Farmakologiska behandlingar som syftar till att öka plasticiteten är ofta fördelaktiga vid flera tillstånd, inklusive depression, hjärnskador, neuroutvecklings- och neurodegenerativa störningar. Men exakta mekanismer som orkestrerar plasticitet i hjärnan är inte helt kända. Det aktuella arbetet har belyst de endogena mekanismerna för plasticitet i den vuxna hjärnan, såväl som på de molekylära vägar genom vilka populära metoder för att framkalla plasticitet fungerar. I synnerhet avslöjade det att perineuronala nät, nätliknande strukturer som omger vissa typer av neuroner i hjärnan, begränsar plasticiteten genom att binda till PTPσ, en receptor som finns på neuroncellmembranen. Vid interaktion med perineuronala nät deaktiverar PTPσ TRKB, en receptor för hjärnhärledd neurotrofisk faktor och en viktig plasticitetspromotor i hjärnan. Vi fann också att möss genetiskt modifierade för att ha minskade nivåer av PTPσ i hjärnan uppvisar en fenotyp av "hyperplasticitet". Specifikt lär de sig bättre än vildtypsmössen, men deras minne är instabilt och de glömmer snabbt vad de har lärt sig. Resultaten av denna studie förbättrar vår förståelse av mekanismerna för plasticitet i hjärnan och kan främja utvecklingen av effektiva, säkra och riktade behandlingar för ett brett spektrum av hjärnsjukdomar.

Traditional Chinese medicine (TCM) has obvious efficacy on disease treatments and is a valuable source for novel drug discovery. However, the underlying mechanism of the pharmacological effects of TCM remains unknown because TCM is a complex system with multiple herbs and ingredients coming together as a prescription. Therefore, it is urgent to apply computational tools to TCM to understand the underlying mechanism of TCM theories at the molecular level and use advanced network algorithms to explore potential effective ingredients and illustrate the principles of TCM in system biological aspects. In this thesis, we aim to understand the underlying mechanism of actions in complex TCM systems at the molecular level by bioinformatics and computational tools. In study Ⅰ, a machine learning framework was developed to predict the meridians of the herbs and ingredients. Finally, we achieved high accuracy of the meridians prediction for herbs and ingredients, suggesting an association between meridians and the molecular features of ingredients and herbs, especially the most important features for machine learning models. Secondly, we proposed a novel network approach to study the TCM formulae by quantifying the degree of interactions of pairwise herb pairs in study Ⅱ using five network distance methods, including the closest, shortest, central, kernel, as well as separation. We demonstrated that the distance of top herb pairs is shorter than that of random herb pairs, suggesting a strong interaction in the human interactome. In addition, center methods at the ingredient level outperformed the other methods. It hints to us that the central ingredients play an important role in the herbs. Thirdly, we explored the associations between herbs or ingredients and their important biological characteristics in study III, such as properties, meridians, structures, or targets via clusters from community analysis of the multipartite network. We found that herbal medicines among the same clusters tend to be more similar in the properties, meridians. Similarly, ingredients from the same cluster are more similar in structure and protein target. In summary, this thesis intends to build a bridge between the TCM system and modern medicinal systems using computational tools, including the machine learning model for meridian theory, network modelling for TCM formulae, as well as multipartite network analysis for herbal medicines and their ingredients. We demonstrated that applying novel computational approaches on the integrated high-throughput omics would provide insights for TCM and accelerate the novel drug discovery as well as repurposing from TCM. Perinteinen kiinalainen lääketiede (TCM) on ilmeinen tehokkuus taudin hoidoissa ja on arvokas lähde uuden lääkkeen löytämiseen. TCM: n farmakologisten vaikutusten taustalla oleva mekanismi pysyy kuitenkin tuntemattomassa, koska TCM on monimutkainen järjestelmä, jossa on useita yrttejä ja ainesosia, jotka tulevat yhteen reseptilääkkeeksi. Siksi on kiireellistä soveltaa Laskennallisia työkaluja TCM: lle ymmärtämään TCM-teorioiden taustalla oleva mekanismi molekyylitasolla ja käyttävät kehittyneitä verkkoalgoritmeja tutkimaan mahdollisia tehokkaita ainesosia ja havainnollistavat TCM: n periaatteita järjestelmän biologisissa näkökohdissa. Tässä opinnäytetyössä pyrimme ymmärtämään monimutkaisten TCM-järjestelmien toimintamekanismia molekyylitasolla bioinformaattilla ja laskennallisilla työkaluilla. Tutkimuksessa kehitettiin koneen oppimiskehystä yrttien ja ainesosien meridialaisista. Lopuksi saavutimme korkean tarkkuuden meridiaaneista yrtteistä ja ainesosista, mikä viittaa meridiaaneihin ja ainesosien ja yrtteihin liittyvien molekyylipiirin välillä, erityisesti koneen oppimismalleihin tärkeimmät ominaisuudet. Toiseksi ehdoimme uuden verkon lähestymistavan TCM-kaavojen tutkimiseksi kvantitoimisella vuorovaikutteisten yrttiparien vuorovaikutuksen tutkimuksessa ⅱ käyttämällä viisi verkkoetäisyyttä, mukaan lukien lähin, lyhyt, keskus, ydin sekä erottaminen. Osoitimme, että ylä-yrttiparien etäisyys on lyhyempi kuin satunnaisten yrttiparien, mikä viittaa voimakkaaseen vuorovaikutukseen ihmisellä vuorovaikutteisesti. Lisäksi Center-menetelmät ainesosan tasolla ylittivät muut menetelmät. Se vihjeitä meille, että keskeiset ainesosat ovat tärkeässä asemassa yrtteissä. Kolmanneksi tutkimme yrttien tai ainesosien välisiä yhdistyksiä ja niiden tärkeitä biologisia ominaisuuksia tutkimuksessa III, kuten ominaisuudet, meridiaanit, rakenteet tai tavoitteet klustereiden kautta moniparite-verkoston yhteisön analyysistä. Löysimme, että kasviperäiset lääkkeet samoilla klusterien keskuudessa ovat yleensä samankaltaisia ominaisuuksissa, meridiaaneissa. Samoin saman klusterin ainesosat ovat samankaltaisempia rakenteissa ja proteiinin tavoitteessa. Yhteenvetona tämä opinnäytetyö aikoo rakentaa silta TCM-järjestelmän ja nykyaikaisten lääkevalmisteiden välillä laskentatyökaluilla, mukaan lukien Meridian-teorian koneen oppimismalli, TCM-kaavojen verkkomallinnus sekä kasviperäiset lääkkeet ja niiden ainesosat Osoitimme, että uusien laskennallisten lähestymistapojen soveltaminen integroidulle korkean suorituskyvyttömiehille tarjosivat TCM: n näkemyksiä ja nopeuttaisivat romaanin huumeiden löytöä sekä toistuvat TCM: stä.

“Structure is more conserved than sequence”. This unanimously accepted concept, which states that two proteins with low sequence similarity (~30%) still feature the same fold, holds true only regarding the correlation between the sequence and the secondary structure elements (mainly helices and sheets) thanks to which an ordinate, three-dimensional arrangement is formed (i.e. in globular domains). For this reason, proteins lacking defined secondary motifs usually display no tertiary structure and are therefore designated as “disordered”. As such, their sequence offers no information about their structure. Interestingly, multi-domain proteins face a similar problem. That is because, although the sequence is informative about the structure of the individual globular domains, their three-dimensional arrangement depends on the domains’ surfaces and degree of freedom upon folding, which cannot be drawn from the sequence. That also means that, while (as stated before) the fold of the individual domains is mainly resistant to mutations, their relative position may be easily altered by them. That is the reason why multi-domain proteins often exert the biological functions of adaptors or scaffold elements instead of performing catalytic activity, for which the formation of an active site at the domain-domain interface is usually required. Due to the limitations of deriving a biological function from sequences of multi-domain proteins, this study structurally and functionally characterizes a three-domain protein (BUBL), formed by an intein flanked by two ubiquitin-like-domains (ubl). It is here demonstrated that BUBL exerts both catalytic and decoying functions as it can conjugate by protein XI splicing one of the three domains (N-ubl) either to itself or to a separate protein (TthRas GTPase) which is specifically lured by the C-ubl (baiting function). Resulting non-canonical ubiquitination, occurring in a single, concerted step and without energy consumption, is a representative example of how molecular evolution can produce the same biological goal by subverting the structural conservation normally required for its achievement. In the case presented here, two different post translational modifications (ubiquitination and protein splicing) are shown to functionally coexist in a unique combination forming a post translational platform, originated by the serendipitous insertion of the intein domain which, in most cases, is biologically inconsequential. This thesis discusses the proposed scientific hypothesis by using bioinformatics, modelling and simulation approaches in combination with experimental techniques of biochemistry and structural biology. Struktuuri on konservoituneempi kuin sekvenssi” on yleisesti hyväksytty konsepti, jonka mukaan kaksi proteiinia jotka ovat sekvenssiltään erilaisia (~30% asti) silti omaavat saman laskostumisrakenteen. Tämä pitää paikkansa proteiinin sekundäärirakenteiden osalta (yleisimmin kierre- ja levyrakenteet), jotka vuorostaan määrittävät proteiinin kolmiulotteisen (tertiäärisen) rakenteen. Vastaavasti proteiinit, joiden sekundäärimotiivit eivät ole selviä, usein eivät myöskään omaa tertiäärirakennetta ja ovat siten ”epäjärjestäytyneitä”. Tällaisten proteiinien joukkoon kuuluvat myös monidomeeniset proteiinit, joiden laskostumisrakenne ja siten biologiset toiminnot eivät ole ennustettavissa sekvenssistä. Monidomeenisten proteiinien sekvenssin perusteella voidaan osittain ennustaa ketjun yksittäisiä pallomaisia rakenteita, mutta ei näistä muodostuvaa kolmiulotteista rakennetta. Kolmiulotteiseen rakenteeseen vaikuttavat laskostuvien domeenien rajapintojen lisäksi domeenien välisten ketjujen pituus ja sitä seuraava laskostumisen vapausaste. Muodostuvat kolmiulotteiset rakenteet ovat herkkiä mutaatioille, minkä vuoksi monidomeeniset proteiinit esiintyvät luonnossa usein toiminnoissa, jotka sallivat suuremman laskostumisen vapausasteen (kuten proteiinien sovitus). Vastaavasti, monidomeenisia proteiineja ei usein esiinny katalyyttisissä toiminnoissa, jotka vaativat luonnossa konservoituneen laskostumisrakenteen aktiivisen kohdan muodostumiseksi. Rakenteen vaikean ennustettavuuden vuoksi monidomeenisten proteiinien biologisista toiminnoista ymmärretään vielä rajallisesti. Tässä tutkimuksessa luonnehditaan erään kolmidomeenisen proteiinin (BUBL) biologisia toimintoja ja rakennetta, joka koostuu kahden ubikitiinin kaltaisen domeenin (ubl) ympäröimästä inteiinistä. Tutkimus kuvaa kuinka BUBL voi silmukoinnin avulla konjugoida yhden kolmesta domeenista (N-ubl) itseensä tai toiseen proteiiniin (TthRas GTPaasi), jonka houkuttelee paikalle C-ubl (houkutin toiminto). Väitöskirjassa osoitetaan että BUBL voi yhdessä askeleessa toimia sekä katalyyttisesti että houkuttimena ilman energiankulutusta. Tämä löydös toimii esimerkkinä siitä, miten molekulaarinen evoluutio voi johtaa vaihtoehtoisiin tapoihin suorittaa biologinen toiminto, jotka yleensä vaatii luonnossa konservoituneen tarkan laskostumisrakenteen. Tutkimuksessa esitetään kuinka kaksi eri translaation jälkeistä muutosta (ubikitinylaatio ja proteiinisilmukointi) voivat toimia samanaikaisesti ja muodostaa translaation jälkeisen alustan inteiinidomeenin lisäyksen aktivoimana – domeenilla ei useimmiten ei ole biologista toimintoa. Väitöskirja lähestyy esitettyjä tieteellisiä hypoteesejä hyödyntäen bioinformatiikan, mallintamisen ja simuloinnin menetelmiä, yhdessä kokeellisen biokemian ja rakenteellisen biologian menetelmien kanssa.

Mismatch repair (MMR) proteins are involved in maintaining genome integrity in somatic and germline cells. Defects in MMR leads to various abnormalities, such as tumorigenesis in Lynch syndrome (LS) and infertility. MLH1 (a central MMR protein) along with other MMR proteins are involved in repair of replication-induced errors arising due to inaccurate DNA polymerase. If unrepaired (due to defective MMR), these errors accumulate and give rise to a cellular phenotype known as microsatellite instability (MSI). MSI is a hallmark of tumors associated with LS and results from complete loss of MMR; LS patients have high incidence of colorectal cancer. It is still poorly understood why certain tissues in LS, in particular the gastrointestinal (GI) tract, are more vulnerable to MSI-associated tumors. Also, how heterozygosity of MMR genes impact the germline genomic integrity is not known. We hypothesized that certain tissues, in particular those with high proliferating rates, are vulnerable to MMR associated abnormalities compromising microsatellite stability (prior to complete loss of MMR function) in a tissue-specific manner before tumorigenesis. Our aim was to understand how MMR protein levels contribute to MSI in vivo. In the research presented here, we used Mlh1 heterozygous mice (Mlh1+/- mice) as model of LS to investigate how decreased MLH1 levels contribute to tissue-specific MSI, and whether MSI is detectable prior to loss of MMR function and to neoplastic growth. We tested MSI and measured MLH1 levels in primary cells derived from different organs, focusing on the comparison between highly proliferating small intestine and low proliferating spleen. Further, we tested MSI in sperm cells of Mlh1+/- mice. In addition, we studied the association of loss of heterozygosity (LOH) and Mlh1 promoter methylation to tissue-specific MLH1 expression and MSI. The studies were conducted at 4- and 12-month time point. We discovered that highly proliferating normal tissues (small intestine and sperm) of Mlh1+/- mice display MSI which increases with age, while low proliferating spleen was microsatellite stable. Further, Mlh1+/- small intestine showed sporadic decrease in MLH1 levels which associated with the observed MSI, while Mlh1+/- spleens showed expected MLH1 expression (i.e. approximately 50% of wildtype expression). We observed soma-wide Mlh1 promoter methylation in a subset of Mlh1+/- mice; these mice were the most vulnerable to MLH1 expression level decrease and to MSI in the small intestine, while MLH1 expression in other somatic tissues remained unaffected. In brief, we showed that normal small intestine of Mlh1+/- mice is particularly susceptible to MLH1 depletion giving rise to MSI long before neoplasia. Further, we demonstrated that Mlh1+/- sperm exhibit MSI which associates with germline Mlh1 promoter methylation. DNA:n kahdentumisvirheiden korjaukseen (engl. mismatch repair, MMR) osallistuvat proteiinit pitävät yllä genomin eheyttä. Puutteet MMR-proteiinien toiminnassa johtavat moninaisiin poikkeavuuksiin, kuten syövän syntyyn Lynchin oireyhtymässä ja hedelmättömyyteen. MLH1-proteiini, jolla on keskeinen rooli MMR:ssä, osallistuu DNA:n kahdentumisvirheiden korjaamiseen, jotka syntyvät, kun DNA-polymeraasi kopioi genomista sekvenssiä epätarkasti. Jos virheet jäävät korjaamatta toimimattoman MMR:n vuoksi, ne kertyvät soluihin aiheuttaen ilmiasun, jota kutsutaan mikrosatelliittien epävakaudeksi (engl. microsatellite instability, MSI). Täydellisestä MMR-puutoksesta johtuva MSI on tunnusomaista Lynchin oireyhtymään (Lynch syndrome, LS) liittyville syöpäkasvaimille; LS-potilailla on korkea paksusuolen syövän ilmaantuvuus. Edelleen ymmärretään huonosti, miksi LS:ssa vain tietyt kudokset, erityisesti ruuansulatuskanavan kudokset, ovat alttiimpia mikrosatelliittien epävakaudelle ja siihen liittyville kasvaimille. Lisäksi ei ole tiedossa, miten MMR-geenien heterotsygotia vaikuttaa ituradan genomiseen eheyteen. Hypoteesimme oli, että tietyt kudokset, erityisesti voimakkaasti jakautuvat, ovat alttiita MMR:n häiriöille, jotka puolestaan vaarantavat mikrosatelliittien vakauden (ennen MMR:n täydellistä puutosta) kudostyyppikohtaisesti ennen karsinogeneesiä. Tavoitteemme oli ymmärtää miten MMR-proteiinitasot vaikuttavat mikrosatelliittien epävakauteen in vivo. Tässä tutkimuksessa käytimme Mlh1 heterotsygoottisia hiiriä (Mlh1+/-) Lynchin oireyhtymän mallina selvittääksemme, kuinka alentunut MLH1-proteiinitaso vaikuttaa mikrosatelliittien vakauteen eri kudoksissa, ja onko MSI:tä havaittavissa jo ennen MMR:n toiminnan menettämistä ja solujen hillitsemätöntä kasvua. Määritimme MSI:n ja MLH1-proteiinin tasot eri elimistä peräisin olevista primäärisoluista, vertaamalla nopeasti jakaantuvia ohutsuolen soluja pernan soluihin, jotka jakaantuvat vain harvoin. Lisäksi määritimme, kuinka epävakaita mikrosatelliitit ovat Mlh1+/- hiirten siittiösoluissa. Tutkimme myös, kuinka heterotsygotian menetys (loss of heterozygosity, LOH) ja Mlh1:n promoottorialueen metylaatio liittyvät kudoskohtaiseen MLH1:n ilmentymiseen ja mikrosatelliittien epävakauteen. Tutkimukset suoritettiin 4 ja 12 kuukauden ikäisistä hiiristä kerätyissä kudokssa. Havaitsimme, että Mlh1+/- -hiirissä, nopeasti jakaantuvien kudosten solut (ohutsuoli ja siittiöt) ilmentävät MSI:tä, joka lisääntyy iän myötä, kun taas hitaasti jakaantuva pernassa mikrosatelliitit pysyivät vakaina. Lisäksi Mlh1+/--hiirten ohutsuolessa esiintyi satunnaista laskua MLH1-proteiinitasoissa ja samoissa näytteissä havaittiin korkeampaa MSI:ta, kun taas Mlh1+/--pernassa MLH1-ekspressiotaso oli odotusten mukainen (eli noin 50 % villityypin tasosta). Osalla Mlh1+/--hiiristä löytyi Mlh1-promoottorialueen metylaatio kaikista tutkituista kudoksista. Nämä hiiret olivat alttiimpia MLH1-tason laskulle ja MSI:lle ohutsuolessa, kun taas MLH1:n ekspressio muissa kudoksissa säilyi ennallaan. Mlh1+/--hiirien normaali ohutsuoli on siis erityisen herkkä MLH1-tason laskulle, mikä johtaa mikrosatelliittien epävakauteen jo kauan ennen kasvainten syntyä. Lisäksi osoitimme, että mikrosatelliitit ovat epävakaita myös Mlh1+/--siittiössä, ja epävakaus assosioi ituradan Mlh1-promoottorialueen metylaation kanssa.

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCLs) constitute an incurable, chronic, heterogeneous group of non-Hodgkin lymphomas, characterized by a malignant population of mature T-lymphocytes that infiltrate the skin. The incidence of CTCLs has increased worldwide. Symptoms vary from indolent skin patches to aggressive skin tumors. In addition to the skin, lymph nodes, blood, and other body organs are affected depending on the stage and subtype of the disease. Difficulties in differentiating early symptoms from other skin conditions and complex diagnostic criteria make CTCLs challenging to diagnose, often delaying the diagnosis for years. Despite intensive research, the pathogenesis of CTCLs remains mostly unknown. This study emphasizes the impact of the tumor microenvironment (TME) and the tumor cell-released extracellular vesicles (EVs) on the pathogenesis of CTCLs. Particularly, this study examines the role of the tryptophan pathway-associated enzymes indoleamine 2,3-deoxygenase 1 (IDO1) and tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO). IDO induces immune tolerance in the TME by inflammation and T-cell activation. While TDO catabolizes the same metabolic pathway as IDO1, its role in tumors is poorly characterized. We showed that both IDO1 and TDO are expressed in CTCL tissues and cell lines. Interestingly, different CTCL subtypes show unique patterns of expression. In addition, elevated serum kynurenine/ tryptophan ratios observable in plasma samples of mycosis fungoides (the most common subtype of CTCL) patients correlated with advanced disease. Furthermore, four tryptophan catabolic route metabolites were upregulated, and two were downregulated. These observations could be exploited in clinical tests, and therapeutic potential for CTCLs may result from blocking IDO activity. EVs are small membranous vesicles released into the extracellular milieu by most cell types – also by cancer cells. The EVs released from cancer cells contain various proteins, lipids, amino acids, and metabolites and have proven to be an essential form of intercellular communication. Malignant cells can release EVs into TME and the circulation to reprogram target cells or prepare a pre-metastatic niche. Such transfer could occur at a very early stage in tumor progression because the small size of EVs allows them to cross barriers that cells cannot. Consequently, the molecular cargo of EVs reflects the cell of origin, which is also detectable in the circulation by the non-invasive liquid biopsy method. This study shows that human endogenous retrovirus, type W (HERV-W)-coded syncytin-1 in CTCL cells and CTCL cell-derived EVs is upregulated. Functionally, upregulated syncytin-1 can promote cell-to-cell fusion. Cell-to-cell fusion in cancers can induce genomic instability and aneuploidy and contribute to tumor heterogeneity, drug resistance, and metastasis. Although the molecular mechanisms of EVs are not fully characterized, syncytin-1 could be involved in binding EVs to target cells to facilitate the progressing fusion. Our functional study suggested that EV-harbored syncytin-1 promoted giant plasma membrane-surrounding fusion cells in the recipient T-cell leukemia cells. In addition, we studied alterations of EV-derived metabolite cargo in CTCL, prostate carcinoma, and colon carcinoma cell lines and compared these with the cargo of their healthy counterparts. In cancers, the expression of metabolites is commonly reregulated due to oncogenes or tumor suppressor mutations. The enhanced metabolism supports cancer cell proliferation and survival. Previously, numerous cancer-associated metabolites have been detected, but little is known of their role in cancer-derived EVs. This study shows that despite the differences among the studied cancer types, all cell line-derived EVs shared a common metabolomic feature: upregulation of proline and succinate. In addition, in CTCL- and prostate cancer-derived EVs, folate and creatinine were upregulated. This doctoral thesis explores the role of EVs and the kynurenine pathway in the pathogenesis of CTCLs. These observations could impact diagnosis and have therapeutic value for currently incurable, complex CTCLs. In addition, our results from three different cancer cell line-derived EVs show that metabolomic reprogramming of cancer cells influences the EV metabolome. In particular, this finding suggests that proline, succinate, folate, and creatinine could constitute a metabolomic fingerprint of cancer, which could serve as a peripherally detectable cancer marker. Thus, exploring the function of EVs in cancer progression will prove valuable in next-generation cancer diagnosis and treatment. Ihon T-solulymfoomat ovat kroonisia ihosairauksia, joiden ilmaantuvuus on kasvanut maailmanlaajuisesti. Ne jaetaan yhdeksään eri alaryhmään. Sairaudelle on ominaista pahanlaatuisiksi muuntuneiden imusolujen, T-lymfosyyttien kertyminen ensisijaisesti ihoon. Oireet vaihtelevat ihossa esiintyvistä ekseemaa tai psoriaasia muistuttavista läiskistä aggressiivisiin ihokasvaimiin. Pahanlaatuiset T-solut voivat taudin edetessä levitä imusolmukkeisiin sekä muualle elimistöön. Ihon T-solulymfoomien varhainen diagnosointi ja erottaminen muista ihosairauksista on vaikeaa. Tämän vuoksi taudin toteaminen usein viivästyy jopa vuosia ensimmäisen oireiden ilmaantumisesta. Ihon T-solulymfoomia on tutkittu jo pitkään, mutta edelleenkin niiden syntymekanismi on tuntematon. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää kuinka ihon T-solulymfooman mikroympäristön tekijät vaikuttavat taudin kehittymiseen. Aiempien tutkimusten mukaan elimistön välttämättömät aminohapot synnyttävät immuniteettiä hillitseviä molekyylejä. Solut, joissa on aminohappoja hajottavia entsyymejä, muodostavat suojaverkon kasvainsolujen ympärille eikä elimistön oma immuunivaste pääse tuhoamaan niitä. Tryptofaanin kataboliareitin indoliamiini 2,3-dioksigenaasi 1 (IDO1) on tällainen entsyymi ja se toimii hajottamalla tryptofaanin kynureniiniksi. IDO1 on immuunijärjestelmän säätelijä, joka estää puolustusjärjestelmää tuhoamasta syöpäkasvainta. Vähemmän tutkittu tryptofaani 2,3-dioksigenaasi (TDO) -entsyymi vaikuttaa samaan metaboliareittiin. Tulokset osoittivat, että molemmat entsyymit ilmentyvät ihon T-solulymfoomista eristetyissä solulinjoissa, syöpäsoluissa sekä kasvainta ympäröivissä tulehduksellisissa soluissa. Lisäksi eri iholymfooma-alatyypeillä oli oma erityinen ilmentymisprofiilinsa. Tutkimalla potilaiden plasmanäytteitä selvitimme, että ihon T-solulymfoomien yleisimmän alatyypin (mycosis fungoides) potilailla kynureniini/ tryptofaanisuhde oli korkeampi verrattuna terveisiin kontrolleihin mikä oli myös merkkinä pitkälle edenneestä sairaudesta. Kartoitimme tutkimuksessamme myös muita tryptofaanin kataboliareitin metabolitteja. Löydöksemme mukaan neljä metabolittia olivat yli-ilmentyneitä ja kaksi ali-ilmentyneitä mycosis fungoides-potilailla verrattuna terveisiin verrokkeihin. Tutkimuksessa selvitettiin myös syöpäsolujen erittämien solunulkoisten vesikkelien merkitystä syövän mikroympäristössä. Solut käyttävät vesikkeleitä viestintään ja voivat siirtää niihin pakattuja proteiineja, lipidejä, nukleiinihappoja sekä metaboliitteja verenkierron välityksellä kauaskin alkuperäisestä solusta. Vesikkeleillä on tärkeä rooli syövän kehityksessä. Niiden avulla syöpäsolu voi kuljettaa syövälle ominaisia molekyylejä terveisiin soluihin sekä muodostaa elimistöön esimetastaattisia lokeroita. Vesikkelit ovat hyvin pieniä, joten ne pystyvät helposti siirtymään kudoksesta toiseen jo ennen kuin syöpää on välttämättä edes havaittu. Tämän vuoksi ne ovat hyviä merkkiaineita syövän varhaiseen toteamiseen. Ihmisen genomiin on muinaisten retrovirusinfektoiden jäljiltä jäänyt endogeenisiä retroviruksen geenejä. Eräs tällainen retrovirusgeeniä ilmentävä proteiini on synsytiini-1, jolla tiedetään olevan keskeinen tehtävä istukkakudoksen synnyssä. Tutkimuksessamme synsytiini-1 oli yli-ilmentynyt ihon T-solulymfoomista eristetyissä solulinjoissa sekä solunulkoisissa vesikkeleissä. Synsytiini-1 on osallisena solujen välisissä fuusioissa. Solufuusiot syövissä aiheuttavat genomista epätasapainoa, aneuploidiaa, kasvainsolujen heterogeenisuutta, lääkeaineresistenssiä sekä etäpesäkkeiden muodostumista. Toiminnallinen tutkimuksemme osoitti, että vesikkeleihin sitoutunut synsytiini-1 lisäsi vastaanottajasoluissa suuria fuusioituneita soluja. Lisäksi tutkimuksemme kartoitti ihon T-solulymfoomien, eturauhassyövän ja paksusuolen syövän solunulkoisten vesikkelien metabolomiikkaa. Osoitimme, että näiden syöpien aineenvaihdunnassa tapahtui muutoksia verrattuna vastaavien kudosten hyvänlaatuisiin soluihin. Aiemmin syövälle tyypillisiä, eri tavoin ilmentyviä metaboliitteja on löydetty syöpäsoluista, mutta solunulkoisten vesikkelien roolia on tutkittu vähemmän. Tulokset osoittivat, että kaikilla tutkituilla syöpätyypeillä oli yhteisiä vesikkeleihin sitoutuneita metaboliitteja. Proliini ja sukkinaatti olivat merkitsevästi yli-ilmentyneet ihon T-solulymfoomien, eturauhassyövän ja paksusuolen syövän solulinjojen vesikkeleissä. Lisäksi foolihappo ja kreatiniini olivat yli-ilmentyneet ihon T-solulymfooman ja eturauhassyövän solujen vesikkeleissä. Tämä tutkimus tarjoaa uutta tietoa syövän mikroympäristöstä ihon T-solu lymfoomassa, eturauhassyövässä sekä paksusuolen syövässä. Erityisesti tutkimus selvitti solunulkoisten vesikkelien ja tryptofaanin hajotukseen osallistuvien immunosuppressivisten metaboliittien osuutta ihon T-solulymfoomien synnyssä. Tuloksia voidaan hyödyntää ihon T-solulymfoomien varhaisemmassa ja tarkemmassa diagnosoinnissa sekä uusien lääkeaineiden kehityksessä. Lisäksi tutkimuksen uutena löydöksenä oli aiemmin syövän kehitykseen liitettyjen metaboliittien yli-ilmentymisen toteaminen syöpäsolujen solunulkoisissa vesikkeleissä. Näitä metaboliitteja on mahdollista tulevaisuudessa hyödyntää reaaliaikaisena syövän merkkiaineena. Tutkimustuloksemme lisäävät myös yleisemminkin tietoa syövän leviämiseen ja syntyyn vaikuttavista mekanismeista.

The mammary gland, a specialized organ providing nutrition for mammalian offspring, commences during embryogenesis with the formation of an epithelial thickening known as, placode. Subsequently, the placode enlarges creating a hillock and invaginates into underlying mesenchyme, marking the transition to a bulb stage. By the time of birth, the primary rudimentary ductal tree forms through branching morphogenesis. The development of the organ continues postnatally, and its full maturation is accomplished during pregnancy and lactation. Signaling pathways involved in mammogenesis are well characterized. Among them ectodysplasin (Eda) is key regulator of ectodermal appendages formation in all vertebrates. Eda belongs to tumor necrosis factor family and mediates signaling through transcription factor NF-κB. In humans, mutations in Eda or other components of this signaling pathway lead to hypohidrotic ectodermal dysplasia (HED), characterized by sparse hair, missing teeth, and defects in several exocrine glands including the breast. Mice overexpressing Eda (K14-Eda) exhibit supernumerary mammary glands and a hyperbranching phenotype. Despite growing knowledge on molecular signaling regulating mammogenesis, cellular mechanisms are still poorly characterized. The aim of this thesis work was to uncover how Eda regulates mammary gland development and to identify the key cellular mechanisms driving mammary bud formation. In this thesis work, molecular and cellular mechanisms of early mammary gland development were studied. The transcriptional target genes of Eda were identified, among them members of Wnt, Fgf, TNF, Tgfβ, chemokine and Hh signaling pathways. It was shown that in K14-Eda mice supernumerary glands also formed in the neck region, whereas formation of ectopic mammary placodes on the flank was mediated through Eda-dependent Wnt pathway upregulation. Using the Fgf20 null mouse model the role of Eda target gene, Fgf20 in mammogenesis was studied. Results showed that while Fgf20 is dispensable for mammary placode formation, its depletion led to the bud size defect. Cellular mechanisms driving early mammary primordium development were elucidated using 3D and 4D confocal microscopy. It was shown that early mammary rudiment growth is predominantly mediated through migration-driven cell influx, with cell hypertrophy and cell proliferation making minor contributions in this process. Additionally, cell migration in the mammary placode stage was documented by live imaging for the first time. The invagination of the mammary bud was shown to be mediated through contractile rim of epidermal keratinocytes adjacent to the bud, named ring cells. Conditional deletion of Myh9, encoding heavy chain of non-muscle myosin IIA, led to decreased actomyosin network and a compromised ring cell shape indicative of their impaired function. In addition, abnormal mammary bud shape and defective invagination was observed suggesting an essential role of NMIIA in this process. Maitorauhanen on pitkälle erikoistunut avoeritteinen rauhanen, joka tuottaa ravintoa nisäkkäiden imeväisille. Maitorauhasen kehitys alkaa, kun sikiön ektodermaaliseen epiteelikudokseen muodostuu paksuuntuma eli plakodi (”placode”). Plakodi suurenee kumpareeksi (”hillock”) ja tunkeutuu alla olevaan mesenkyymiin alkaen muistuttaa ensin muodoltaan silmua (”bud”) ja sitten hehkulamppua (”bulb”). Tämän jälkeen maitorauhanen alkaa haaroittua ja syntymään mennessä muodostuu alkeellinen rauhaspuun rakenne. Maitorauhasen kehitys jatkuu syntymän jälkeen ja saavuttaa täyden toimintavalmiutensa raskauden ja imetyksen aikana. Maitorauhasen kehitystä ohjaavat signaalinvälitysketjut on hyvin karakterisoitu. Niihin lukeutuu ektodysplasiini (Eda), joka on ektodermaalisten elinten kehityksen keskeinen säätelytekijä selkärankaisissa. Eda kuuluu tuumorinekroositekijäperheeseen (TNF) ja sen käynnistämä signaalinvälitysketju säätelee NF-κB transkriptiotekijän kohdegeenien ilmentymistä. Mutaatiot Eda:ssa tai muissa signaalivälitysketjun osasissa aiheuttaa geneettisen sairauden nimeltä hypohidroottinen ektodermaalinen dysplasia (HED), joka ilmenee heikkona hiusten ja karvojen kasvuna, puuttuvina hampaina ja puutteina rauhasten toiminnassa, rintarauhanen mukaan luettuna. Eda:n yli-ilmentäminen hiirissä (K14-Eda) johtaa ylimääräisten maitorauhasten muodostumiseen, sekä liialliseen kasvuun ja haaroittumiseen. Vaikka tietous maitorauhasen kehityksen molekyylisäätelystä on lisääntynyt, ovat sen solumekanismit verrattain heikosti ymmärretty. Tämän väitöskirjatutkimuksen tavoitteena oli selvittää miten Eda signaalipolku säätelee maitorauhasen kehitystä ja tunnistaa maitorauhasen varhaiskehitystä ohjaavat solubiologiset mekanismit. Tässä väitöskirjassa tutkittiin maitorauhasen varhaiskehityksen molekyyli- ja solumekanismeja. Eda:n kohdegeeneiksi tunnistettiin Wnt, Fgf, TNF, Transformoiva kasvutekijä β, kemokiini ja Hedgehog -signaalinvälitysketjujen osasia. K14-Eda hiirimallissa havaittiin, että kaulalle muodostui ylimääräisiä maitorauhasplakodeja ja osoitettiin ylimääräisten plakodien syntyvän Wnt signaalinvälitysketjun aktiivisuuden seurauksena. Eräs löydetyistä Eda:n kohdegeeneistä oli Fgf20, jonka roolia tutkittiin tarkemmin poistogeenisessä hiirilinjassa. Fgf20 ei ollut välttämätön plakodien muodostukselle, mutta maitorauhasten silmut ovat normaalia pienempiä. Tutkin myös maitorauhasen muodostumisen solumekanismeja kolmi- ja neliulotteisella (so. elävän kudoksen aikaviivekuvantamisella) konfokaalimikroskopialla. Näytin ensi kertaa eläviä soluja kuvantamalla, että maitorauhasaihion varhainen kasvu on seurausta solujen liikkeestä. Solujen koon kasvulla ja solujakautumisella sen sijaan oli pienempi vaikutus. Maitorauhassilmun työntyminen alla olevaan mesenkyymiin oli riippuvainen sitä reunustavista ektodermin epiteelisoluista (keratinosyyteistä), jotka muodostivat supistuvan kehän sen ympärille. Supistuvan kehän merkitys kävi selväksi tutkimalla hiirten sikiöitä, joiden ei-lihasperäisen myosiini-IIA:n (NMIIA) raskasta ketjua koodaava Myh9 -geeni oli inaktivoitu ektodermissä. Myh9:n puute johti kehäsolujen aktiini-myosiini-verkoston heikkenemiseen ja niiden muotojen pyöristymiseen. Lisäksi havaitsin maitorauhassilmun muotoutumisen ja mesenkyymiin työntymisen olevan puutteellista, mikä osoitti NMIIA:n tärkeän roolin varhaisessa maitorauhasen kehityksessä.

The complexity of organisms has astonished biologists for centuries. How complexity has evolved, has given rise to much debate. Many have claimed that natural selection is the main factor that made it possible to achieve high degrees of complexity. On the contrary, others argue that this is far from the truth, as complexity can increase passively, without the need of natural selection. Either way, the exact mechanisms by which complexity has increased in some groups of organisms remains largely unknown. For morphology, to understand which mechanisms have enabled an increase in complexity, requires to study development. As development is the process that establishes morphology, any evolutionary change in morphology is preceded by a change in its development. Additionally, to understand how morphological complexity evolves, it is necessary to comprehend the phenotypic variation that different developmental mechanisms can produce. The two main questions that I am interested to answer in this dissertation are: 1. Are there some logical requirements that developmental mechanisms should fulfill in order to lead to complex morphologies? 2. How does morphological complexity affect evolution? To tackle these questions, I used a general computational model of development, EmbryoMaker. EmbryoMaker is a general model that allows to simulate the development of 3D morphologies of any type. It is precisely this generality of EmbryoMaker which was vital for this dissertation, since it allowed an unconstrained exploration of developmental mechanisms, without being limited to certain organisms or systems. This allowed me to tackle the questions I posed in a general way. The general results obtained are: 1. The development of complex morphologies does not require cell signaling or complex gene networks. 2. Extracellular signaling enhances robustness through the compartmentalization of the embryo into different regions of gene expression 3. Complex morphologies are rare 4. The more complex a morphology is, the more finely tuned its developmental parameters need to be 5. The more complex the morphology, the larger the mutational asymmetry towards simplicity 6. The more complex morphology, the more complex the GPM These results indicate that there are qualitative differences in the way complex and simpler morphologies evolve. Complex morphologies evolve under a complex GPM and higher developmental instability. Additionally, complex morphologies produce a higher morphological diversity than simpler morphologies for the same amount of genetic variation, therefore offspring of complex individuals spread across large regions of the morphospace. Finally, these results also indicate that the evolution of morphological complexity becomes progressively slower as complexity increases, until possibly arriving at a complexity trap, where it cannot effectively increase. Luonnosta löytyvien muotojen moninaisuus on ällistyttänyt tutkijoita vuosisatoja ja muotojen kompleksisuuden synnystä on väitelty paljon. Yhtäältä on väitetty luonnonvalinnan olevan ensisijainen eliöiden muodon kompleksisuutta ajava tekijä ja toisaalta on ehdotettu kompleksisuuden voivan kehittyä passiivisesti luonnonvalinnasta riippumatta. Muodon monimutkaistumisen taustalla vaikuttavat mekanismit ovat pitkälti tuntemattomia. Kompleksisuuden lisääntymisen ymmärtäminen edellyttää ymmärrystä yksilönkehityksestä; muodot syntyvät yksilönkehityksen aikana, joten evolutiivinen muutos muodossa edellyttää muutoksia yksilönkehityksessä. Ymmärtääksemme, miten kompleksisuus lisääntyy evoluution myötä, on ymmärrettävä millaista ilmiasujen muuntelua yksilönkehitys voi tuottaa. Kaksi väitöskirjassani käsiteltävää pääkysymystä ovat: Vaaditaanko kehitysmekanismeilta tiettyjä ominaisuuksia, jotta ne voivat tuottaa kompleksisia muotoja? Miten muotojen kompleksisuus vaikuttaa evoluutioon? Käytän työssäni tietokonemallia, EmbryoMakeria, joka mahdollistaa minkä tahansa muodon kehityksen mallinnuksen kolmiuloitteisesti. EmbryoMakerin simulaatiot eivät rajoitu tiettyihin mallieliöihin tai järjestelmiin, mikä on olennaista tutkimukselleni. Tutkimukseni päätulokset ovat: Kompleksisten muotojen kehitys ei edellytä soluviestintää tai monimutkaisia geeniverkostoja. Solujen välinen viestintä lisää kehitysmekanismin vakautta jakamalla alkion rajattuihin geenien ilmentymisalueisiin. Kompleksiset muodot ovat harvinaisia. Mitä kompleksisempi muoto on, sitä tarkemmin sen kehitystä on säädeltävä. Mitä kompleksisempi muoto on, sitä todennäköisemmin mutaatiot johtavat muodon yksinkertaistumiseen. Mitä kompleksisempi muoto on, sitä kompleksisempi on sen taustalla toimiva geeni-ilmiasu-kartta. Tulokseni viittaavat laadullisiin eroihin kompleksisten ja yksinkertaisten muotojen evoluution välillä. Kompleksisten muotojen evoluution taustalla vaikuttava geeni-ilmiasukartta on monimutkaisempi kuin yksinkertaisilla muodoilla. Lisäksi kompleksisten muotojen kehitys on epävakaampaa kuin yksinkertaisten muotojen kehitys. Yksinkertaisiin muotoihin verrattuna kompleksiset muodot johtavat suurempaan monimuotoisuuteen vaikka geneettinen muuntelu taustalla olisi yhtä suurta; tämän vuoksi kompleksisten yksilöiden jälkeläiset levittäytyvät laajoille alueille muotoavaruudessa. Tulokseni osoittavat myös, että kompleksisuuden lisääntyessä kompleksisuuden evoluutio hidastuu, kunnes saavutetaan ’kompleksisuusansa' jossa kompleksisuus ei voi enää lisääntyä.

The RET receptor tyrosine kinase is a versatile receptor which responds to multiple signalling cues. The signalling of RET plays a central role in cell proliferation, differentiation and maintenance. Its dysregulation contributes to various human diseases through gain- and loss-of-function, such as Hirschsprung’s disease and thyroid and lung cancers. Mutations at the cysteine-rich domain (CRD) of RET lead to constitutive activation through receptor dimerization via an intermolecular disulfide bond. However, due to the lack of functional and structural studies of RET and its ligands, the molecular mechanisms of RET activation under normal and pathological conditions is unclear. In this thesis project, a combination of biochemical and biophysical tools are used to characterize the activation of RET with an emphasize on three aspects: studying (1) its extracellular domain (ECD) complex formation with ephrin As (efn-As) and the growth and differentiation factor 15 (GDF15)/the glial cell-derived neurotrophic factor receptor a-like (GFRAL), (2) the oncogenic C634R mutation, which accounts for the majority of the multiple endocrine neoplasia type 2A (MEN2A) cases and (3) the solubilization and purification of full-length RET. To explore the binding between RET and efn-As, I first demonstrated that functional zebrafish RETECD (zRETECD) and efn-A5 (zefn-A5) can be expressed using insect cells. In contrast to previous cellular studies, I showed that zRETECD does not interact directly with zefn-As and postulated that another binding partner is required to mediate their interaction for the reverse signalling of efn-As. Unlike zRETECD, I found that human RETECD (hRETECD) expressed in insect cells is non-functional; therefore, I established a mammalian expression platform for functional expression of hRETECD, demonstrating its superiority to insect cell expression in which hRET is prone to misfold. Using recombinantly expressed proteins, I reconstituted the wild-type (WT) hRETECD/hGDF15/hGFRALECD complex and was able to reconstruct an 8-Å cryo-EM map of the complex, which revealed a “butterfly”-shaped tripartite complex. For the expression of the hRETECD(C634R) mutant, I used a C-terminal Fc tag to successfully drive the receptor dimer formation, as the mutant protein is otherwise monomeric. I studied the resulting apo-hRETECD(C634R) dimer and its complex with GDF15/GFRALECD using structural tools. Comparison of the cryo-EM structure of the hRETECD(WT)/hGDF15/hGFRALECD complex and the negative stain EM maps of the apo-hRETECD(C634R) dimer and the mutant hRETECD(C634R)/hGDF15/hGFRALECD complex revealed significant conformational changes that provide a structural model for the oncogenic activation of RET. Finally, I established a membrane protein production pipeline for full-length RET that will enable future structural studies in a more biologically native system. RET-tyrosiinikinaasireseptori on monipuolinen reseptori, joka vastaa useaan signaalimerkkiin. RET-signalointi on keskeinen tekijä solujen jakautumisen, erilaistumisen ja ylläpidon ohjaamisessa. Sen toimintaa lisäävät tai vähentävät säätelyn häiriöt vaikuttavat erilaisten ihmisen sairauksien, kuten Hirschsprungin taudin ja kilpirauhas- ja keuhkosyövän, ilmentymiseen. Mutaatiot RET:in kysteiinipitoisella osuudella (CRD) johtavat reseptorin jatkuvaan aktivaatioon reseptorin dimerisoiduttua molekyylien välisen disulfidisidoksen kautta. Kuitenkin, johtuen RET:in ja sen ligandien toiminnallisten ja rakenteellisten tutkimuksen vähyydestä, RET-aktivaation molekyylitason mekanismit normaaleissa ja patologisissa tilanteissa ovat epäselviä. Tässä väitöskirjassa käytetään sekä biokemiallisia että biofysikaalisia työkaluja RET:n aktivaation selvittämiseksi, pääpainon ollessa sekä (1) RET:n solun ulkopuolisen (ECD) kompleksin muodostumisen ephrin As (efn-As) ja kasvu- ja erilaistumistekijä 15 (GDF15)/hermotukikudossolusta johdetun alphan kaltaisen neurotrooppisen tekijän reseptorin (GFRAL) kanssa, että (2) onkogeenisen C634R-mutaation, josta johtuu valtaosa useista sisäerityksen tyypin 2A (MEN2A) -neoplasiatapauksista, tutkimisessa ja myöskin (3) täyden pituuden RET:in liukoistamisessa ja puhdistamisessa. Jotta RET:n ja efnA:n välistä sitoutumista voitaisiin tutkia, osoitin ensin, että hyönteissoluissa tuotettu seeprakalan RETECD (zRETECD) ja efn-A5 (zefn-A5) ovat funktionaalisia. Koska havaitsin, että toisin kuin aikaisemmin julkaistuissa solukokeissa, zRETECD ei interaktoi suoraan zenf-As:n kanssa, arvelin, että näiden proteiinien interaktioon tarvitaan kolmas proteiini efnAs:n käänteissignaloinnin aikaansaamiseksi. Toisin kuin zRETECD:n kohdalla, huomasin, että hyönteisoluissa tuotettu ihmisen RETECD (hRETECD) ei ole funktionaalista; tästä syystä pystytin nisäkäsolutuottosysteemin funktionaalisen hRETECD:n tuottamiseksi ja osoitin sen paremmuuden pääasiassa väärin laskotunutta hRET:iä tuottavaan hyöntesolutuottosysteemiin nähden. Koostin rekombinattiproteiineista hRETECD/hGDF15/hGFRALECD - kompleksin ja sain kuvattua tästä 8-Å:n tarkuudella kryo-EM kartan, joka paljasti perhosmaisen, kolmiosaisen kompleksin. hRETECD(C634R)-mutantin tuotossa lisäsin proteiinin C-terminukseen FC-hännän joka ohjasi muutoin monomeerisen mutanttiproteiinin dimerisaatiota. Tutkin aikaansaamani dimeerisen apo-hRETECD(C634R):n ja GDF15/GFRALECD:n muodostamaa kompleksia rakennebiologisilla menetelmillä. hRETECD(WT)/hGDF15/hGFRALECD kompleksin kryo-EM rakenteen ja apo-hRETECD(C634R) dimeerin sekä hRETECD(C634R)/hGDF15/hGFRALECD-mutanttikompleksin negatiivivärjäys-EM:stä saatujen karttojen vertailu paljasti huomattavia konformationaalisia eroja, joiden avulla pystyin luomaan rakenteellisen mallin RET:n onkogeeniselle aktivaatiolle. Lopuksi, pystytin kokopitkän hRET:n tuottamiseen käytettävän kalvoproteiinintuottoprosessin, joka mahdollistaa RET:n rakenteellisen tutkimisen luonnollisemmassa yhteydessä.

Disruption of chamber-specific gene regulatory networks underlies malformation of the heart and results in congenital heart disease. Re-activation of fetal gene regulatory networks in adults occurs during cardiac injury, and transcription factors composing these networks represent candidate therapeutic targets to impede heart failure progression. The identification of molecular markers and underlying regulators of cardiac chamber specification is thus an important step in understanding the aetiology of cardiovascular disease. Moreover, the examination of chemical modulation of molecular processes occurring during development allows for a more detailed understanding of the teratogenic effects of chemical compounds and could lead to the development of small molecule-based strategies for stimulating or impeding well-characterized developmental processes in the adult heart. To this end, this thesis is comprised of three studies related to the differentiation of atrial and ventricular cardiomyocytes and the selective modulation of this process. Study I led to the generation of an in vitro model of cardiomyocyte subtype specification of pluripotent stem cells for the use in studies II-III. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis of native embryonic atrial and ventricular tissue confirmed the robust ventricular-specific expression of myosin light chain 2 (Myl2) and also indicated the lack of an endogenous atrial-specific marker during early embryogenesis. Genome editing was used to integrate a fluorescent reporter into the endogenous Myl2 locus to mark cells of the ventricular lineage, whereas atrial cells were traced by an atrial-specific transgene driven by the slow myosin heavy chain 3 (SMyHC3) promoter. Atrial and ventricular reporter expression were confirmed in vivo by laser-assisted morula injection of reporter mouse embryonic stem cells (mESCs) and microscopy of chimeric embryos. In addition to this in vivo validation, spontaneous differentiation of reporter mESCs was characterized by qRT-PCR, indicating dynamic expression of retinoic acid signalling components. Differentiation assays were developed based on chemical perturbation of undifferentiated progenitor cells and differentiated cardiomyocytes, respectively. Members of the retinoid family, known teratogens and modulators of anterior-posterior patterning, were tested for effects on the activation of atrial and ventricular reporter genes. Additionally, a directed-differentiation assay was developed based on highly pure multipotent progenitor cells and differentiation assessment in a 384-well format. In this assay, chemical inhibitors of Wnt and Transforming growth factor β (Tgfβ) pathways led to promotion of ventricular reporter expression when added at the multipotent progenitor stage, but not after the onset of spontaneous beating. Additionally, exogenous all-trans retinoic acid added to undifferentiated progenitors led to an inhibition of ventricular differentiation, whereas addition following the onset of spontaneous beating led to activation of the ventricular reporter gene. In addition to chemical probes described in study I, novel compounds targeting the protein-protein interaction of core cardiac transcription factors Gata transcription factor 4 (Gata4) and NK2 homeobox 5 (Nkx2-5) were examined in study II. Specifically, the effects of GATA-targeted compounds on the differentiation of atrial and ventricular cardiomyoyctes were explored. Lead compound 3i-1000 increased the proportion of atrial and ventricular reporter cells after 10-day treatment in the spontaneous differentiation assay. Further exploration of the effects of GATA4 targeted compounds revealed that a shorter treatment (2-day) of cells prior to the onset of spontaneous beating led to an upregulation of ventricular reporter genes in a directed differentiation assay. An acetyl-lysine like domain among active compounds, in addition to analysis of the GATA4 interactome by Bio-ID revealed the potential association of bromodomain-containing proteins with chamber-specific gene expression. This was further investigated by combinatorial treatment with the Bromo- and Extra- Terminal domain family (BET) bromodomain inhibitor JQ1 and GATA-targeted compounds in reporter gene assays. Finally, the effects of GATA compounds on cardiomyocyte maturation were explored by compound treatment and global run-on sequencing (GRO-seq) in primary cardiomyocytes, revealing the upregulation of several targets previously identified as regulators of cell fate determination and regeneration. Study III detailed the embryonic/cardiac expression of proCholecystokinin (proCCK), a classical gut and neuropeptide. Analysis of mRNA-seq data suggested that proCCK is a transcriptional target of the TBX5 transcription factor in mESC-derived cardiomyocytes. Native, endogenous mRNA levels were characterized in embryonic hearts by whole mount in situ hybridization and optical projection tomography, revealing that proCck mRNA is present prior to the linear heart tube stage and that it is upregulated in the ventricles compared to the atria in the newly formed embryonic heart. Interestingly, mRNA of proCck and its receptors Cckar/Cckbr is mostly restricted to the atrial chambers in neonatal stages, in line with its potential role in regulating cardiac rhythm. In silico analysis implicated both TBX5 and MEF2C as regulators of proCck transcription, and this regulation was confirmed by conducting in vitro reporter gene assays. Additionally, proCCK was induced by endothelin-1 (ET-1), another peptide associated with maladaptive remodelling during heart failure. Furthermore, proCck mRNA levels declined in the left ventricles of rats following myocardial infarction (MI). Finally, exogenous cholecystokinin octapeptide (CCK-8) exerted no effects on the differentiation process of pluripotent stem cells (PSCs) to the cardiomyocyte fate. Collectively, these studies led to the generation of new methodology for the study of chamber-specific cardiac gene regulatory networks. Additionally, they led to an improved understanding of the dynamics of chamber-specific marker localization and upstream transcription factors governing their expression, potentially important to biomarker development. Finally, these studies have indicated that specific chemical compounds are capable of influencing chamber-specific gene regulatory networks. This knowledge might be utilized to develop novel therapeutic strategies for the treatment of heart failure. Geenisäätelyverkostojen häiriöt kammioissa ja eteisissä aiheuttavat niille tyypillisiä sydämen epämuodostumia ja synnynnäisiä sydänsairauksia. Aikuisten sydänlihasvaurioissa havaitaan sikiöaikaisten geenisäätelyverkostojen uudelleenaktivoitumista, joten näihin verkostoihin liittyvät transkriptiotekijät ovat mahdollisia lääkevaikutuksen kohteita sydämen vajaatoiminnan etenemisen hidastamisessa. Sydäntautien etiologian ymmärtämisen kannalta onkin oleellista tunnistaa spesifisesti kammioiden ja eteisten erilaistumista sääteleviä molekulaarisia tekijöitä. Lisäksi kemiallisten yhdisteiden molekulaaristen vaikutusten tutkiminen sydämen kehityksen aikana lisää tietoa niiden teratogeenisista ominaisuuksista, mikä voi johtaa uusien pienimolekyylisten yhdisteiden kehittämiseen kehitysbiologisten mekanismien aktivoimiseksi tai estämiseksi aikuisten sydämessä. Tämä väitöskirja koostuu kolmesta tutkimuksesta, jotka keskittyvät sydämen eteisten ja kammioiden sydänlihassolujen erilaistamiseen ja niiden erilaistumisen valikoivaan säätelyyn. Tutkimuksessa I kehitettiin in vitro-menetelmä pluripotenttien kantasolujen erilaistamiseksi eteis- ja kammiolihassoluiksi tutkimuksiin II-III. Alkion eteis- ja kammiokudoksen kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR)-analyysi vahvisti myosiinin kevyen ketjun 2 (Myl2) voimakkaan tarkkarajaisen ilmentymisen kammioissa ja osoitti myös endogeenisen eteisspesifisen merkkigeenin puuttumisen varhaisen alkion kehityksen aikana. Kammiosolujen tunnistamiseksi käytettiin geenimuokkausta integroimalla fluoresoiva merkkigeeni endogeeniseen Myl2-lokukseen, eteissolut puolestaan jäljitettiin eteisspesifisellä merkkigeenillä, jota ohjasi hidas myosiinin raskasketju 3 (SMyHC3)-promoottori. Eteisen ja kammion merkkigeenien ilmentyminen vahvistettiin in vivo laseravusteisella injektiolla morula-vaiheessa reportterihiiren alkion kantasoluihin (mESC) ja kimeeristen alkioiden mikroskopialla. Tämän in vivo -validoinnin lisäksi hiiren alkion kantasolujen, joihin oli integroitu merkkigeenit, spontaania erilaistumista tutkittiin qRT-PCR:llä, jolloin havaittiin ilmentymismuutoksia retinoiinihapon signaalitransduktiojärjestelmässä. Erilaistumismenetelmät kehitettiin perustuen kemiallisten yhdisteiden vaikutuksiin erilaistumattomiin esisoluihin ja erilaistuneisiin sydänlihassoluihin. Retinoidien, jotka ovat tunnettuja teratogeenejä ja säätelevät sydämen anteriorista -posteriorista akselia, vaikutuksia tutkittiin eteis- ja kammiomerkkigeenien aktiivisuuteen. Lisäksi kehitettiin kohdennettu erilaistamismenetelmä, joka perustui pelkkiin monipotentteisiin esisoluihin ja erilaistumisen arviointiin 384-kuoppalevyillä. Tässä menetelmässä Wnt:n ja transformoivan kasvutekijän β (Tgfβ) signaalireittien estäjät lisäsivät kammiomerkkigeenin ilmentymistä, kun ne lisättiin monipotenttisiin esisoluihin, mutta ei spontaanin sykkimisen alkamisen jälkeen. Lisäksi erilaistumattomiin esisoluihin lisätty eksogeeninen all-trans-retinoiinihappo esti kammioerilaistumista, kun taas spontaanin sykkimisen alkamisen jälkeen tapahtunut lisäys aktivoi kammiomerkkigeenin. Tutkimuksessa I kuvattujen pienimolekyylisten yhdisteiden lisäksi tutkimuksessa II tutkittiin uusia yhdisteitä, jotka vaikuttavat sydämen keskeisten transkriptiotekijöiden Gata4 ja Nkx2-5-proteiini-proteiini-vuorovaikutukseen. Erityisesti tutkittiin GATA4-kohdennettujen yhdisteiden vaikutuksia erikseen eteisten ja kammioiden sydänlihassolujen erilaistumiseen. Johtoyhdiste 3i-1000 lisäsi eteisen ja kammion merkkigeenisolujen osuutta 10 vuorokauden hoidon jälkeen spontaanissa erilaistamismenetelmässä. GATA4-kohdennettujen yhdisteiden vaikutusten jatkotutkimus osoitti, että lyhyempi solujen käsittely (2 vuorokautta) ennen spontaanin sykkimisen alkamista aktivoi kammioreportterigeenin kohdennetussa erilaistamismenetelmässä. Aktiivisten yhdisteiden asetyylilysiinin kaltainen domeeni, yhdessä GATA4-vuorovaikutus Bio-ID-analyysin kanssa, tuki bromodomeeniproteiinien mahdollista yhteyttä kammiospesifiseen geenien ilmentymiseen. Tätä yhteyttä tutkittiin edelleen merkkigeenimäärityksissä BET (Bromo- ja Extra-Terminal domain) bromodomeeniestäjän JQ1 ja GATA4-kohdennettujen yhdisteiden yhdistelmähoidolla. Lopuksi tutkittaessa GATA-kohdennettujen yhdisteiden vaikutuksia sydänlihassolujen kypsymiseen primaarisissa sydänlihassoluissa GRO-sekvensoinnilla (global run-on sequencing), havaittiin useiden solujen kehitykseen ja uusiutumiseen liittyvien geenien ilmentymisen lisääntyvän. Tutkimuksessa III kuvattiin prokolekystokiniinin (proCCK), klassisen suolisto- ja neuropeptidin, ilmentyminen alkiossa/sydämessä. mRNA-sekvenssitietojen analysointi viittasi siihen, että proCCK on hiiren alkion kantasoluista erilaistetuissa sydänlihassoluissa TBX5-transkriptiotekijän kohde. Kun endogeenisiä mRNA-tasoja tutkittiin alkion sydämissä in situ -hybridisaatiolla ja optisella projektiotomografialla, huomattiin että proCck-mRNA ilmentyy ennen lineaarista sydänputkivaihetta ja että sen ilmentyminen paikantui kehittyvässä hiiren alkion sydämessä lähinnä kammioihin verrattuna eteisiin. Kiinnostavaa oli myös, että sekä proCck:n että sen reseptorien, Cckar/Cckbr, mRNA rajoittui vastasyntyneisyysvaiheessa pääasiassa eteisiin, yhdenmukaisesti aikaisempien havaintojen kanssa joissa on todettu proCck:n säätelevän sydämen rytmiä. In silico -analyysi viittasi sekä TBX5:n että MEF2C:n merkitykseen proCck-transkription säätelijöinä; tämä löydös vahvistettiin in vitro merkkigeenimäärityksien avulla. Endoteliini-1 (ET-1), joka myös on yhdistetty sydämen vajaatoiminnan aikana tapahtuviin sydänlihaksen rakennemuutoksiin, indusoi proCCK:ta. Lisäksi havaittiin, että rottien vasemmassa kammiossa proCck-mRNA-tasot pienenivät kokeellisen sydäninfarktin jälkeen. Lopuksi todettiin, että kolekystokiniinioktapeptidi (CCK-8) ei vaikuttanut pluripotenttien kantasolujen erilaistumiseen sydänlihassoluiksi. Kokonaisuudessaan tutkimukset johtivat uuden menetelmän kehittämiseen sydämen kammiospesifisten geenisäätelyverkostojen tutkimiseen. Lisäksi tutkimustulokset lisäsivät käsitystä kammiospesifisten tekijöiden ajallisista ja paikallisista muutoksista sekä niiden ilmentymistä säätelevistä ylävirran transkriptiotekijöistä, mikä voi olla tärkeää biomarkkerien kehittämiselle. Lopuksi nämä tutkimukset osoittivat, että tietyt kemialliset yhdisteet vaikuttavat valikoivasti kammiospesifisiin geenisäätelyverkostoihin. On mahdollista, että tätä tietoa voitaisiin hyödyntää kehittäessä uusia lääkehoitoja sydämen vajaatoiminnan hoitoon.

Vision is an important sensory modality for most vertebrates. The eye is a highly complex optical system at the center of which the neural retina acts as a sensory array. A stem cell population residing at the peripheral margin of the retina and Müller glia cells in the central retina mediate lifelong retinal growth and regeneration in fish and amphibians. The capacity for such retinal neurogenesis is reduced in birds and yet more limited in mammals. However, little is known about retinal development, postnatal growth and regeneration in squamate reptiles (lizards and snakes). Squamates occupy a central phylogenetic position among amniotes and display considerable morphological as well as functional diversity of the eye. This thesis explores various aspects of the squamate retina, particularly the neurogenic potential from embryonic development to postnatal growth and regeneration. First, the thesis elucidates the embryonic origins of the retinociliary junction (RCJ), a newly identified active stem/progenitor niche maintained in the postnatal retinal margin of squamates. The thesis then demonstrates a diverse spectrum of differing activity levels in the squamate RCJ. These variations in proliferative activity correlate with the diverse eye sizes, which is partly derived from differing ocular growth rates linked to RCJ activity. Next, although acute retinal damage does not stimulate a regenerative RCJ response, the thesis still highlights Müller glia cells as a potential source for regeneration in the squamate central retina. Finally, in the context of previously described vertebrate species, the thesis concludes that the squamate retina offers a new, more nuanced view on the field of vertebrate retinal growth and regeneration. Näkökyky on elintärkeä ominaisuus useimpien eläinten selviytymiselle. Verkkokalvo muodostaa silmässä sen rakenteen, joka vastaa valon vastaanottamisesta ja havaitsemisesta. Verkkokalvon kehittymistä ja paranemista silmävaurion jälkeen onkin tutkittu monissa eri selkärankaisryhmissä. Jotkut ryhmät, kuten kalat ja sammakkoeläimet, kykenevät lisäämään verkkokalvoon hermosoluja aikuisuudessa, ja tämä mahdollistaa sekä verkkokalvon jatkuvan kasvun että uusiutumis- ja paranemiskyvyn. Tunnetuimmat lähteet näille uusille hermosoluille ovat verkkokalvon keskiosassa sijaitsevat Müllerin gliasolut sekä verkkokalvon reunaosien kantasolut. Toiset selkärankaisryhmät, kuten linnut ja nisäkkäät, eivät juuri kykene lisäämään uusia hermosolujen verkkokalvoon syntymän jälkeen. Sen sijaan suomumatelijoissa, eli liskoissa ja käärmeissä, verkkokalvon kasvua, kehitystä ja uusiutumista on ennen tätä väitöskirjatutkimusta tutkittu hyvin vähän. Suomumatelijat, ja erityisesti niiden silmät, ovat mielenkiintoinen tutkimuskohde. Ensinnäkin suomumatelijat sijaitsevat evolutiivisesti keskeisessä asemassa selkärankaisten sukupuussa. Lisäksi suomumatelijoiden silmät ja näkökyky ovat erittäin monimuotoisia, sillä ryhmän sisällä on runsaasti vaihtelua täysin näkökyvyttömistä lajeista aina erinomaisella yönäöllä varustettuihin matelijoihin asti. Tässä väitöskirjassa tutkin siten useiden eri suomumatelijalajien verkkokalvon kehitystä ja uusiutumista. Tutkimuksessa tarkastelin ensin suomumatelijoiden verkkokalvon normaalia kehittymistä ja kypsymistä. Kiinnitin erityisesti havaitsemaani uuteen rakenteeseen, verkkokalvon ja sädelihaksen yhtymäkohtaan (”retinociliary junction”, RCJ), joka sijaitsee verkkokalvon reunamilla. Joissain tutkimissani suomumatelijalajeissa tämä rakenne säilyy aktiivisena pitkälle eläimen aikuisuuteen niin, että sen solut jatkavat jakautumista sekä yksilönkehityksen aikana havaittujen molekulaaristen merkkiaineiden tuottamista. Lisäksi lajienväliset erot RCJ-rakenteen aktiivisuudessa korreloivat silmien suhteellisen koon ja kasvunopeuden kanssa – lajeilla, joilla on suuremmat ja nopeammin kasvavat silmät on myös aktiivisempi RCJ. En kuitenkaan havainnut muutoksia RCJ-rakenteen aktiivisuudessa vasteena verkkokalvon vahingoittumiselle. Näistä tuloksista päättelin, että RCJ on tärkeä rakenne verkkokalvon kasvun ja kehityksen aikana, mutta että sillä ei ole merkitystä verkkokalvon uusiutumiselle silmävaurion jälkeen. Tutkimuksen myöhemmässä vaiheessa keskityin erityisesti suomumatelijoiden verkkokalvon uusiutumisen tutkimiseen. Toisin kuin RCJ-rakenteella, havaitsin että verkkokalvon keskisosissa sijaitsevilla Müllerin gliasoluilla ei ole merkitystä verkkokalvon normaalille kasvulle ja kehitykselle. Sen sijaan eräässä tutkimassani lajissa, parta-agamassa, nämä gliasolut alkoivat jakautua aktiivisesti sen jälkeen kun verkkokalvoon oli aiheutettu vaurio. Lisäksi ne alkoivat tuottaa uusien hermosolujen syntymisestä kertovia merkkiaineita. Müllerin gliasoluilla vaikuttaa siten olevan verkkokalvon normaalin kasvun sijaan rooli vaurion jälkeen aktivoituvien korjausmekanismien käynnistämisessä. Yleisesti tutkimukseni viittaa siihen, että suomumatelijoiden kyky syntymän jälkeiseen verkkokalvon kasvuun ja uusiutumiseen on muihin selkärankaisryhmiin verrattuna keskitasoa. Tämä väitöskirjatutkimus suomumatelijoiden silmistä antaa siten uuden, monimuotoisemman näkemyksen verkkokalvon kasvusta ja uusiutumisesta selkärankaisten keskuudessa.

Chronic insufficient sleep affects basic physiological processes and increases risk for various mental and somatic disorders. Despite the growing number of omics-studies, sleep laboratory studies conducted in human samples, as well as various experiments in animals, the biological mechanisms underlying the health consequences of curtailed sleep are not fully understood. This thesis was inspired by the hypothesis that the consequences of sleep loss may be reflected as changes in the epigenetic processes, with DNA methylation (DNAm) selected as the most feasible to study. The aim of this thesis was to elucidate biological pathways associated with chronic insufficient sleep, as well as to explore how transient and reversible DNAm changes triggered by sleep loss are. In the first study, a cross sectional genome-wide DNAm analysis (Epigenome-wide Association Analysis, EWAS) was performed in relation to self-reported insufficient sleep in individuals from a population-based sample and in relation to insufficient sleep (shift work disorder) among shift-workers from an occupational cohort. No genome-wide significant differences in DNAm were observed in cases versus controls. The study revealed that insufficient sleep was accompanied by the loss of methylation and DNAm alterations in genes enriched in nervous system development pathway. The karyoplot evidenced for several clusters of CpGs on various chromosomes, including a cluster of 12 CpGs on chromosome 17. The genes corresponding to these CpGs were previously associated with a rare genetic condition accompanied by disturbed sleep and inverted circadian rhythm. The second study examined dynamic DNAm changes in relation to recovery from a shift work disorder in the occupational cohort of shift workers across the genome. The results indicated that recovery during vacation leads to the restoration of DNAm and specifically affects genes involved in the activity of N-methyl-d-aspartate (NMDA) glutamate receptors. These findings provide evidence for the dynamic nature of human methylome and suggest CpG sites in genes Glutamate Ionotropic Receptor NMDA Type Subunit 2C (GRIN2C), cAMP Responsive Element Binding Protein 1 (CREB1), and Calcium/calmodulin Dependent Protein Kinase II Beta (CAMK2B) as putative indicators of recovery in a shift worker with shift work disorder. In the third study, we studied the effect of depressed sleep on DNAm in a sample of adolescents with comorbid depression and insomnia as compared to healthy controls. No genome-wide significant differences in DNAm appeared in cases versus controls. However, the top findings of DNAm analyses were enriched in the synaptic long-term depression (LTD) pathway, emphasizing the role of sleep in synaptic plasticity and the widespread physiological consequences of disturbed sleep. Based on these findings, it can be concluded that chronic insufficient sleep is associated with a specific DNAm pattern in blood leukocytes, evidencing for the systemic physiological wide-spread consequences of curtailed sleep. Some of these specific DNAm alterations appeared to be reversible, once individuals restored sleep during two weeks of vacation. Altogether, this thesis contributes to an understanding of the changes triggered by sleep loss in a highly complex and dynamic regulatory mechanism, human DNA methylome. Univaje on terveydelle haitallista ja lisää pitkäaikaisena psykiatristen ja somaattisten sairauksien riskiä. Univajeen patofysiologisia mekanismeja on tutkittu erilaisissa tutkimusasetelmissa ja kokeellisissa malleissa, mutta sen aiheuttamien terveyshaittojen taustalla olevat molekyylibiologiset mekanismit ovat vielä pitkälti tuntemattomia. Tämän väitöskirjan kantavana hypoteesina oli, että univaje johtaa epigeneettisten prosessien – erityisesti DNA:n metylaation – muutoksiin. Selvitimme ensimmäisessä osatyössä riittämättömän unen ja veren valkosolujen DNA-metylaation välisiä yhteyksiä yleisväestössä ja vuorotyötä tekevillä. Tutkimus osoitti, että riittämättömään yöuneen liittyy matalampia DNA:n metylaatiotasoja ja metylaatiotasojen muutoksia hermoston kehitykseen ja toimintaan liittyvissä geeneissä. Osa poikkeavasti metyloituneista geeneistä on liitetty aiemmin sellaisiin harvinaisiin perinnöllisiin sairauksiin, joiden oireina on unen ja vuorokausirytmin häiriöitä. Tarkastelimme toisessa osatyössä valkosolujen DNA:n metylaation dynaamisia muutoksia vuorotyötä tekevillä työjakson aikana sekä vuosiloman jälkeen. Tulokset osoittivat, että vuorotyö-unihäiriöstä kärsivillä oireiden väistyminen ja palautuminen lomajakson aikana johti myös DNA-metylaatiomuutosten palautumiseen. Työssä osoitettiin DNA:n metylaation dynaaminen luonne erityisesti NMDA-glutamaattireseptorien kohdalla ja siten niiden mahdollinen merkitys vuorotyöunihäiriön synty- ja palautumismekanismeissa. Selvitimme kolmannessa tutkimuksessa DNA-metylaatiomuutoksia nuorilla masennuksesta ja unettomuudesta kärsivillä potilailla. Polkuanalyysit antoivat viitteitä siitä, että muistimekanismeihin liittyvän synaptisen polun geenien metylaatiotasot olivat potilailla poikkeavat terveisiin verrokkeihin verrattuna. Löydös sopii hyvin siihen, että riittävä yöuni on tärkeää muistin ja oppimisen toiminnan kannalta. Tulosten perusteella voidaan päätellä, että pitkäaikaiseen univajeeseen liittyy veren valkosolujen DNA-metylaation muutoksia, jotka voivat välittää univajeeseen liittyviä laajoja fysiologisia seuraamuksia. Osa muutoksista oli palautuvia lepojakson jälkeen. Kaiken kaikkiaan väitöskirjatutkimus lisää osaltaan ymmärrystä siitä, kuinka univajeen fysiologiset vaikutukset välittyvät epigeneettisten mekanismien ja erityisesti DNA:n metylaation kautta.

Synaptic adhesion molecules play a key role in the regulation of synapse development and maintenance. Several families of leucine-rich repeat (LRR) domain containing synaptic adhesion molecules have been characterized, including synaptic adhesion-like molecules (SALMs), and the LRR transmembrane (LRRTM) proteins. These proteins localize mostly in postsynaptic neurons in excitatory synapses and interact with presynaptic adhesion protein families; neurexin (NRXN) and leukocyte common antigen-related protein tyrosine phosphatases (LAR-RPTPs). Dysfunction of the synaptic adhesion molecules is linked to cognitive disorders, such as autism spectrum disorders and schizophrenia. This thesis work comprises the structural and functional study of SALM3 and SALM5 proteins from the SALM family, and their interaction with PTPσ from the LAR-RPTPs family. In addition, this thesis includes the work on the development of an inhibitory screening assay for synaptic adhesion molecules interactions, here targeting the LRRTM2-NRXN interaction. The SALM family proteins include five members, SALM1-5. We have solved the crystal structures of the mouse SALM5 LRR-Ig, and SALM3 LRR constructs at 3.1 Å and 2.8 Å resolution, respectively. Both the structures show the LRR domain mediating the dimerization, also verified by biophysical studies. We determined the binding affinity of SALM3 and SALM5 as 2-23 µM towards PTPσ, and solved the solution structure of the SALM3-PTPσ complex using small-angle X-ray scattering (SAXS), revealing a 2:2 complex formation similar to that observed for SALM5 and PTP. Based on our structure-function studies, SALM3 dimerization is vital for the SALM3-PTPσ complex to exert synaptogenic activity. We also developed an inhibitor screening method for the adhesion proteins interactions, focusing on the LRRTM2-NRXN interaction. We utilized the AlphaScreen technology to identify inhibitors with moderate IC50-values and established an orthogonal in-cell western blot assay to verify the obtained hits. This paves the way for the future development of high affinity compounds by further high throughput screening of larger compound libraries. The studies conducted in this thesis and the results have contributed to a better understanding of the role of SALM proteins in synapse formation, and possibly these structure-based studies will help to understand their implications in disease. The inhibitor screening assay developed can be adapted towards other synaptic adhesion interactions, and the inhibitors obtained could be used for functional studies, or towards drug discovery. Synapsien ahdeesiomolekyylit ovat keskeisiä aivojen hermosolujen välisten liitosten kehityksessä ja ylläpidossa. Useita leusiiinirikkaita (LRR) toistodomeeneja sisältäviä adheesioproteiiniryhmiä on karakterisoitu, kuten LRRTM ja SALM proteiinit. Nämä proteiinit paikantuvat useimmiten postsynaptisiin neuroneihin eksitatorisissa synapseissa ja sitoutuvat presynaptisiin reseptoreihin kuten neureksiineihin ja proteiini tyrosiini fosfataaseihin (PTP) muodostaen hermosoluliitoksen ja edistäen presynaptista erillaistumista. Synaptisten adheesioproteiinien toiminnan häiriöt liittyvät geneettisesti kogntiivisiin häiriöihin, kuten esimerkiksi autismikirjon häiriöihin ja skitsofreniaan. Tässä tutkimuksessa on tutkittu SALM-perheen adheesionproteiinien molekyylirakenteita sekä niiden toimintaa solu- ja proteiinsitoutumiskokeiden avulla, ja eritysesti karakterisoitu SALM-proteiinien sitoutumista presynaptiseen PTP-delta proteiiniin. Lisäksi väitöstyössä on kehitetty inhibiittoriseulontamenetelmä synapsin adheesiointeraktioille, erityisesti kemiallisten yhdisteiden löytämiseksi LRRTM2-neureksiini vuorovaikutuksen inhiboimiseksi bioteknologisia sovelluksia varten. SALM proteiineja on karakterisoitu viisi (SALM1-5). Tässä tutkimuksessa on määritetty SALM3 ja SALM5 proteiinien solunulkoisten domeenien molekyylikiderakenteet 3.1 Å ja 2.8 Å resoluutiolla. Keskeinen havainto on LRR domeenien tärkeä rooli proteiinien järjestäytymisessä funktionaalisiksi dimeereiksi, tutkimuksessa on myös määritetty affiniteetit SALM3-PTP ja SALM5-PTP vuorovaikutuksilla. Lisäksi pienkulma röntgensirontamenetelmällä määritettiin SALM3-PTPdelta kompleksin rakenne ja selvitettiin domeeniorganisaatio ja reseptorikompleksin stoikiometria. Kaikkiaan SALM3 sitoutuu PTP reseptoreihin samoin kuin aiemmin on todettu SALM5:lle ja ilmeisesti SALM-proteiinit näin ollen toimivat samalla mekanismilla soluadheesiossa. Erityisesti ne kaikki muodostavat samanlaisia dimeerirakenteita, joka poikkeavat muista synaptisista ahdeesiomolekyyleistä, jotka yleensä ovat monomeerisia. Tällä todennäköisesti on funktionaalista merkitystä synapsien signaalinvälityksessä. Kaikkiaan tehty tutkimus ovat antanut laajemman käsityksen SALM ja PTP adheesioproteiinien toiminnasta. LRRTM2-neureksiini vuorovaikutuksen inhibitiomenetelmän kehitys luo pohjaa tuleville pienmolekyyliseulontatutkimuksille neureksiiniligandeja vastaan, mahdollistaen kemiallisen intervention in vivo tutkimuksissa esimerkiksi hiirimalleissa, ja mahdollisesti avaten uusia reittejä neurologisten häiriöiden lääkekehitykseen.

The motor protein myosin binding to filamentous actin and dislocating it, forms the basis for all eukaryotic cells and tissues to undergo higher order transformations such as cell division, migration and differentiation. Whereas e.g. fine motor skills and rhythmic contractions of the heart depend on highly organized sarcomeres, each undergoing similar degree of shortening through thin actin filaments sliding in-between the myosin filaments, the non-muscle cells exhibit much more dynamic actomyosin structures: the stress fibers. Although the composition, function and regulation of stress fibers have been studied quite extensively, we do not have a comprehensive understanding of how they are generated and maintained in various cells and tissues displaying diverse morphology and notable plasticity in the means of utilizing these contractile structures. In this thesis work, I studied the formation, maintenance and recycling of stress fiber structures in human osteosarcoma (U2OS), mouse embryonic fibroblast (MEF) as well as in canine kidney epithelial (MDCK) cells. First, I revealed that stress fiber assembly does not always need pre-existing stress fiber precursors as previously documented, but they can also coalesce directly from the actin cortex driven by non-muscle myosin II (NMII) pulses. Secondly, in-depth analysis of NMII assembly and its recruitment to stress fibers unraveled the role of a chaperone UNC-45a in regulating both of these events, and further extended its chaperone activity to assist the cortical myosin 1C assembly. Thirdly, we uncovered that stress fiber precursors are reorganized and packed into peripheral thin bundles upon epithelial cell-cell contact formation and this can be reversed by inhibiting AMPK-VASP pathway. Lastly, we demonstrated that actin stress fibers have an intimate and reciprocal, plectin-mediated relationship with vimentin intermediate filaments that extends to controlling the morphogenesis and nucleus positioning in migrating cells. Taken together, these studies bring forth the principal protein controlling the NMII-filament assembly and stability, broaden our understanding on the versatility in generating contractile actomyosin structures in different cell types and demonstrate how interconnected stress fibers are to other cytoskeletal elements. Myosiinikimppujen sitoutuminen aktiinisäikeisiin ja näiden kahden rakenteen liikkuminen toistensa lomaan muodostaa perustan kaikille aitotumallisten solujen keskeisille mekanistisille toiminnoille. Tyypin II myosiinia sisältävien lihassolujen supistuminen perustuu peräkkäin järjestäytyneiden perusyksikköjen, sarkomeerien, täsmälliseen ja samanasteiseen lyhentymiseen. Muissa solu- ja kudostyypeissä, voimantuotto pohjautuu stressisäikeiden toimintaan. Stressisäikeet lisäksi kiinnittävät solut ympäröivään kudokseen ja välittävät solulle tietoa kudoksen mekaanisesta tilasta. Vaikka stressisäikeiden rakenne muistuttaa sarkomeereja ne ovat vähemmän organisoituneita, selkeästi dynaamisempia ja sisältävät keskeisenä komponenttina non-muscle myosiini II (NMII) proteiinia. Vaikkakin stressisäikeiden rakenne ja toimintaperiaatteet tunnetaan jo varsin hyvin, niiden muodostumismekanismit ja säätely eri solu- ja kudosympäristöissä ovat vielä varsin puutteellisesti ymmärrettyjä. Tässä väitöskirjassa esitetyissä tutkimuksissa olen tutkinut stressisäikeiden muodostumista, niiden kierrätystä rakennettaessa uusia kudosspesifisiä stressisäikeitä ja vuorovaikutusta muiden solun tukirakenteiden kanssa. Julkaisussa I, kuvatessamme solun pohjan aktiini-tukiverkkoa, huomasimme stressisäikeitä muodostuvan suoraan tästä aktiinisäikeiden verkostosta. Verkoston organisoituminen stressisäikeeksi tapahtui NMII-pulssin kautta. Pulssista peräisin olevan myosiinin lomittuminen aktiinisäikeisiin järjesti erisuuntaiset tukiverkon säikeet enemmän lineaarisiksi, mahdollistaen myöhemmin myös uuden stressisäikeen kiinnittymisen alustaansa. Itse NMII:n proteiinitason säätely ja sen integroituminen muodostuviin stressisäikeisiin ovat luonnollisesti oleellisia tekijöitä stressisäikeiden synnyssä mutta edelleen puutteellisesti tunnettuja. Julkaisussa II, selvitimme UNC-45a saperonin kriittisen roolin sekä NMII:en laskostumisessa että tämän myosiinin integroinnissa stressisäikeisiin, jotka mielenkiintoisesti tapahtuvat UNC-45a saperonin eri domeenien ohjaamana. Epiteelisolukon solu-solukontakteja kiertävät vyöliitokset jotka yhdistyvät solujen laidoilla oleviin solunsisäisiin supistumiskykyisiin säikeisiin. Julkaisussa III, osoitimme miten nämä epiteelispesifiset säikeet muodostuvat stressisäikeiden kierrätyksen tuloksena. Epiteelisolujen kohdatessa, stressisäikeet pakkautuvat kohti solujen reunoja ja yhdistyvät paksummiksi, vyöliitoksiin liittyviksi stressisäikeiksi. Samanaikaisesti stressisäikeiden supistumiskyky lisääntyy AMPK-VASP signalointipolun välityksellä. Viimein, julkaisussa IV, havaitsimme kuinka stressisäikeet ja keskikokoiset säikeet vuorovaikuttavat keskenään vaikuttaen solun liikkumiseen sekä määrittävät tuman solunsisäisen sijainnin. Yhdessä nämä tulokset osoittavat stressisäikeiden laajan muunneltavuuden ja kuinka monin eri tavoin niitä voidaan muodostaa eri solu ja kudostyypeissä. Lisäksi se tuo myös ilmi UNC-45a saperonin roolin ensisijaisena säätelijänä NMII:ta sisältävien rakenteiden muodostumisessa ja kuinka laajassa vuorovaikutuksessa stressisäikeet ovat myös muiden solun tukirakenteiden kanssa.

The conservation, characterization, and sustainable utilization of farm animal genetic resources have far-reaching socioeconomic effects. Finnsheep, which is native to Finland, is globally known for its exceptional prolificacy and has been exported to several countries to improve the productivity of local breeds. Prolificacy, mainly determined by the ovulation rate and litter size phenotypes, has high economic importance in sheep farming systems. The ovulation rate is associated with the number of ovulatory follicles produced during the follicular growth phase of the estrous cycle, and successful implantation of the conceptus ensures maximum litters. The primary aim of this study was to evaluate the exceptional prolificacy of Finnsheep. Another important and overarching aim was to explore the genetic aspects of two important reproductive events leading to ovulation and successful pregnancy in sheep. To gain an insight into how these two processes are regulated genetically and non-genetically, the whole transcriptomes of selected reproductive tissues relevant to folliculogenesis (first phase, ovary) and early pregnancy prior to implantation (second phase, corpus luteum (CL) and endometrium) were analyzed. In the main experiment, the ovaries of 31 Finnsheep (n = 11) and Texel (n = 11) ewes as well as their F1 crosses (n = 9) collected during surgery were biopsied; other tissues, including the CL and endometrium, were collected at the slaughterhouse. Half of the animals were maintained on a flushing diet during the entire experiment to study the influence of nutrition during early pregnancy. In addition, the transcriptomes of the ovarian and endometrial tissues of Finnsheep ewes were compared to those of European feral mouflons. For transcriptomic analysis, cDNA libraries targeting mRNAs and microRNAs were sequenced using the Illumina HiSeq 2000 system with 100-base pair (bp) paired-end and 50-bp single-end techniques, respectively. Gene expression results from the first phase of the experiment revealed that the flushing diet strongly affected the Texel and, to some extent, the F1-crosses of sheep; however, Finnsheep were not affected by the diet. Likewise, the gene expression profiles of the F1 crosses were more similar to those of Finnsheep than of Texel, possibly because of the parent-of-origin effects, such as genomic imprinting. While no major candidate genes reportedly associated with prolificacy were differentially or highly expressed, FecGF polymorphism (V371M) in GDF9 was present in half of the experimental Finnsheep and F1 crosses but completely absent in the Texel sheep. The second phase of the experiment provided an insight on the cross-talk between the CL and endometrium, as revealed by both the shared and tissue-specific genes. Finnsheep had a higher embryo mortality rate than Texel. The top expressed genes were associated with progesterone formation and events (elongation and attachment), leading to blastocyst implantation. Several endogenous retroviruses (ERVs) were expressed in the endometrium samples. Immune-related genes and pathways appeared to be differentially expressed and/or regulated in the CL of pure-breds. During the preimplantation stage, the immune system of the Finnsheep ewes appeared superior to that of the Texel ewes. Owing to the influence of interferon tau in massive gene expression changes starting around day 13, the gene expression profiles of the endometrium samples in response to elongated embryos were remarkably different from those in response to spherical embryos. Moreover, several interferon-stimulated genes were upregulated in the endometrium samples having elongated embryos. In addition to differentially expressed genes between the reproductive tissues of domestic (Finnsheep) and feral (European mouflon) sheep, we identified novel genes and miRNAs and their regulatory mechanisms associated with reproductive traits. A few novel structural findings were obtained as part of this work. Maternally imprinted miRNA cluster on chromosome 18 (C18MC), which is conserved exclusively among placental mammals, was reported for the first time in sheep. With 46 expressed miRNAs, sheep C18MC may be the largest miRNA cluster among all mammalian species. The miRNAs (>500) quantified in this thesis are valuable, given that only 153 sheep miRNAs have been identified till date. A novel ERV transcript with high similarity to the genomic region within the FecL locus and known to affect prolificacy was identified, indicating that ERV plays an important role in reproduction and may even contribute to litter size differences. Overall, the work presented in this thesis explored two critically important aspects of reproduction, i.e., ovulation and preimplantation, in sheep using state-of-the-art genomics and bioinformatics tools. The resources and findings from this thesis are highly relevant to both breeders and researchers studying sheep. The comprehensive list of genes and miRNAs expressed in the three key reproductive tissues is a useful resource for understanding transcriptional patterns during the follicular growth phase and preimplantation stage leading to pregnancy in sheep. The diet- and F1 cross-related experimental results will be valuable for implementing sheep breeding strategies aimed at achieving an optimum reproductive capacity. Furthermore, these results will provide a foundation for future research, and the data may have additional applications following the advancement of analysis tools and technologies. Lammas on ollut ihmisen kotieläimenä 9 000 – 11 000 vuotta. Se on yksi varhaisimmista kotieläimistä. Lampaan ja muiden kotieläinten geenivarojen tutkimisella, säilyttämisellä ja kestävällä hyödyntämisellä on pitkäaikaisia taloudellisia ja yhteiskunnallisia merkityksiä. Suomen alkuperäinen lammasrotu, suomenlammas, ja rodun geenit ovat maailmanlaajuisesti tärkeä eläingeenivara. Rotu on tunnettu poikkeuksellisesta hedelmällisyydestä ja sitä on viety useisiin maihin monien lammasrotujen hedelmällisyyden parantamiseksi. Naarashedelmällisyydellä, joka ilmenee ovulaatioasteena eli kiimakierrossa irtoavien munasolujen lukumääränä ja vuonuekokona eli karitsoiden lukumääränä, on huomattava taloudellinen merkitys lammastaloudelle. Suomenlampaan hedelmällisyyteen vaikuttavat geenit ovat kuitenkin huonosti tunnettuja. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tarkastella, mitkä geenit edistävät lampaan ja erityisesti suomenlampaan poikkeuksellista hedelmällisyyttä ja miten nämä geenit toimivat. Lisäksi tutkittiin, miten ruokinta vaikuttaa geenien toimintaan ja siten naarashedelmällisyyteen. Tutkimuksen pääasiallinen eläinaineisto koostui ruokintakokeessa olleista suomenlammas- ja texelrotuisista uuhista sekä näiden kahden rodun ensimmäisen polven risteytysuuhista (50% suomenlammas ja 50% texel). Uuhia oli ruokintakokeessa yhteensä 31 ja puolet kunkin roturyhmän (suomenlammas, texel ja F1-polvi) uuhista sai lisäenergiaa rehustuksessa toisen puolen ollessa vertailuryhmänä, joka oli ilman lisäenergiaa. Lisäenergian tarjoamisen on todettu nostavan uuhen ovulaatioastetta. Geenien toimintaa tarkasteltiin kahdessa eri lisääntymiskauden vaiheessa. Ensimmäinen vaihe oli follikkeleiden kasvuvaihe, jossa munasarjojen munarakkuloissa (follikkeleissa) kypsyy munasoluja. Tässä vaiheessa tutkimus kohdistui geenien toimintaan uuhien munasarjoissa. Toinen näytteiden keruuvaihe oli preimplantaatiovaihe eli vaihe ennen hedelmöittyneiden munasolujen kiinnittymistä kohdun limakalvoon eli endometriumiin. Tällöin tarkasteltiin geenien ilmentymistä munasarjojen keltarauhasissa (corpus luteum, CL) ja endometriumissa. Kudosnäytteistä eristettiin RNA. RNA-näytteet sekvensoitiin eli määritettiin geenien ilmentyneet osat uuden sukupolven sekvensointilaitteella. Näiden RNA-sekvenssien lisäksi tarkasteltiin niin sanottuja lyhyitä mikro-RNA-molekyylejä, jotka toimivat geenien säätelyssä vaikuttaen geenien toiminnan hiljentämiseen, toisin sanoen siihen, mistä perimän DNA:sta koodatuista RNA-sekvensseistä tuotetaan proteiineja. Bioinformatiikan menetelmiä hyödyntäen voitiin määrittää, mitkä geenit ovat ilmentyneet eri kudosnäytteissä ja mikä kunkin geenin ilmentymistaso on ollut eri roturyhmissä. Tutkimus tuotti runsaasti uutta tietoa lampaan naarashedelmällisyyteen liittyvästä geenien toiminnasta ja alkuperäisen suomenlampaan perinnöllisistä erityisominaisuuksista. Follikkeleiden kasvuvaiheen tarkastelu osoitti, että lisäenergian antaminen rehustuksessa vaikutti voimakkaimmin texel-lampaiden geenitoimintoihin ja ovulaatioasteen, lievästi F1-risteytysuuhin, mutta ei juurikaan suomenlammasuuhiin. Lisäksi F1-uuhien geenien toiminta muistutti enemmän suomenlampaan kuin texelin geenien ilmentymistä. Tämä viittaa niin sanottuun ei-mendelistiseen, epigeneettiseen periytymiseen (imprinting), jossa suomenlampaasta peräisin olevien geenien toiminta on ollut aktiivisempaa risteytys-F1-uuhien munasarjoissa kuin texelin geenien. Lisäksi todettiin tunnetusta hedelmällisyysgeenistä, GDF9:stä (Growth Differentiation Factor 9), pistemutaatio suomenlampaalla, minkä oletetaan kohottavan ovulaatioastetta. Preimplantaatiovaiheessa suomenlampaasta todettiin yli kaksi kertaa enemmän keltarauhasia munasarjassa (keskimäärin 4.1/munasarja) kuin texelillä (1.7) todistaen alkuperäisrodun korkeaa ovulaatioastetta. Sitä vastoin suomenlammas osoittautui hedelmöittyneiden munasolujen suhteen ”tuhlailevammaksi” kuin texeluuhet, sillä suomalampaalla ilmeni kohdussa enemmän alkiokuolemia kuin texelillä. Tutkimus antoi todistetta siitä, että suomenlampaalla on geneettisesti tehokas immuunijärjestelmä. Suomenlampaan keltarauhasessa MHC-proteiinien ja sytokiinien tuottamiseen vaikuttavien geenien ilmenemistaso oli korkea edistäen organismin puolustuskykyä haitallisia bakteereja ja viruksia vastaan. Tutkimus antoi alustavaa viitettä siitä, että suomenlampaalla voisi olla kyky alkioiden diapaussiin eli alkioiden myöhästyneeseen kiinnittymiseen eli implantaatioon kohdun limakalvoon. Alkioiden diapaussin säätelyssä yhdeksi tärkeäksi geeniksi on aikaisemmissa tutkimuksissa todettu TXNL1 (Thioredoxin-like protein 1), jonka geenitoiminta oli huomattavan aktiivista suomenlammas- ja F1-uuhilla. Geeniperusteinen todiste diapaussin mahdollisuudesta suomenlampaalla voi johtua rodun korkeasta ovulaatioasteesta ja pitkästä lisääntymiskaudesta. Kiinnostava havainto oli niin ikään endogeenisistä retroviruksista (ERV:ista) lähtöisin olevat RNA-sekvenssit kohdun endometriumnäytteissä ja niiden rooli hedelmällisyydessä. Endogeeniset retrovirukset ovat viruksesta lähtöisin olevaa perimän osia, jotka ovat liittyneet isäntälajin perimään evoluution kuluessa. Tutkimuksessa tunnistettiin uusi ERV-transkriptio, joka oli hyvin samankaltainen X-kromosomissa sijaitsevan FecL-lokuksen genomialueen kanssa ja jonka tiedettiin vaikuttavan hedelmällisyysominaisuuksiin. Tulos osoittaa, että kyseisellä ERV:llä on tärkeä rooli lisääntymisessä ja se voi selittää vuonuekoon eroja eri lammasroduilla. Lisäksi endogeenisillä retroviruksilla on osoitettu olevan merkitystä kohdun suojaamisessa virusinfektioilta, istukan kehityksessä ja alkioiden varhaiskehityksessä kohdussa. Väitöskirja tuotti uutta tietoa myös geenitoimintojen säätelystä lampaalla. Lyhyiden mikro-RNA-molekyylien tarkastelu osoitti, että maternaalisesti leimautunut mikro-RNA-klusteri (”rypäs”) sijaitsee lampaan kromosomissa 18, josta löydettiin 46:n mikro-RNA:n muodostama klusteri. Tämä mikro-RNA-klusteri on konservoitunut yksinomaan istukallisilla nisäkkäillä, ja se raportoitiin nyt ensimmäisen kerran lampaalla. Tässä tutkimuksessa tunnistettiin yli 500 erilaista mikro-RNA:ta, mikä on huomattavan paljon enemmän, mitä aiemmin on tunnistettu lampaalla (vain 153 lampaiden mikro-RNA:ta oli tunnistettu ennen tätä tutkimusta). Tämän väitöskirjan tuottama kattava luettelo geeneistä ja mikro-RNA:ista, jotka ilmentyvät kolmessa keskeisessä lisääntymiskudoksessa kahdessa eri lisääntymisvaiheessa, on hyödyllinen tutkimusresurssi geenien funktioiden ymmärtämiseen follikkeleiden kasvuvaiheessa ja alkionkehityksen preimplantaatiovaiheessa, mitkä lopulta johtavat uuhien tiinehtymiseen. Nämä tulokset tarjoavat perustan tuleville tutkimuksille ja niitä voidaan hyödyntää genomitutkimuksen analyysimenetelmien kehityksessä.

Behavioural traits are complex, influenced by multiple genes and environmental factors and they can also affect the health and welfare of individuals. Behaviour is equally important for companion animals, cats and dogs. Furthermore, some of their behavioural traits resemble human psychiatric diseases. Despite behaviour’s importance, its biological background is still poorly known in these animals. This thesis examines the complexity of behaviour by studying the genetic and environmental factors influencing behaviour, as well as behavioural intercorrelations simultaneously in two companion animal species: the dog and the cat. This comparative perspective may reveal insights into the background of behaviour that could also be generalized to human behaviour. Specifically, this thesis aims to study 1) breed differences of dogs and cats and heritability of behaviour in cats, 2) behaviour correlations in both species, and 3) environmental factors influencing aggression in dogs and multiple behavioural traits in cats. Behavioural and background data was collected from the dog and cat owners through online questionnaires. In both species, the frequency of fear, aggression, and abnormal repetitive behaviour was examined. Sociability and level of activity was also examined in cats and impulsivity/inattention in dogs. Large datasets of 13 715 dogs and 5726 cats were collected and analysed with different methods, including multiple logistic regression for the environmental factors of behaviour and Bayesian multivariate model for heritability analyses. The results of this thesis show that both dog and cat breeds differ in behaviour, that behaviour is heritable, that many behavioural traits are correlated, and that many environmental factors are associated with behavioural traits. Heritability estimates varied between 0.40 and 0.53 for all behavioural traits and breeds. Especially fear and aggression correlated strongly and these traits were also associated with abnormal repetitive behaviour in both species. Social environment in both early life and at the time of answering was associated with lower incidence of aggression and abnormal repetitive behaviour. The results closely paralleled in both companion animal species and showed some parallels to human psychiatry as well. This finding indicates that the biological background of behaviour is similar in dogs and cats, and likely in humans as well. The findings of this thesis had great scientific and practical impact, as, for example, regulations for separating a kitten from its mother was adapted accordingly. Käyttäytymispiirteet ovat monimutkaisia piirteitä, sillä niihin vaikuttavat useat geenit ja ympäristötekijät. Lisäksi käyttäytyminen vaikuttaa yksilöiden terveyteen ja hyvinvointiin. Käyttäytyminen on yhtä tärkeä tekijä myös seuraeläimillä, kissoilla ja koirilla. Lisäksi jotkin niiden käyttäytymispiirteet muistuttavat ihmisten mielenterveyden häiriöitä. Käyttäytymisen tärkeydestä huolimatta sen biologinen tausta tunnetaan seuraeläimillä huonosti. Tässä väitöskirjassa tarkastellaan käyttäytymisen monimutkaisuutta tutkimalla siihen vaikuttavia geneettisiä ja ympäristötekijöitä kahdessa eri eläinlajissa samanaikaisesti: kissoissa ja koirissa. Tämä vertaileva näkökulma voi paljastaa käyttäytymiseen liittyviä tekijöitä, jotka voisivat olla yleistettävissä myös ihmisten käyttäytymiseen. Tämän väitöskirjan tarkkoina tavoitteina on tutkia 1) käyttäytymisen rotueroja kissoilla ja koirilla sekä käyttäytymisen perinnöllisyyttä kissoilla, 2) käyttäytymispiirteiden välisiä yhteyksiä kummallakin lajlla, ja 3) aggressiivisuuteen vaikuttavia ympäristötekijöitä koirilla ja useaan käyttäytymispiirteeseen vaikuttavia ympäristötekijöitä kissoilla. Käyttäytymis- ja ympäristötekijäaineisto kerättiin internet-kyselyillä. Molemmissa eläinlajeissa selvitettiin pelon, aggressiivisuuden ja epänormaalin toistavan käyttäytymisen yleisyyttä. Kissoilla tutkittiin lisäksi ihmissosiaalisuutta ja aktiivisuutta ja koirilla impulsiivisuutta/ keskittymiskyvyttömyyttä. Kerätty aineisto koostui 13 715 koirasta ja 5726 kissasta ja sen analysoinnissa käytettiin erilaisia menetelmiä, kuten logistista regressiota käyttäytymisen ympäristötekijöiden tutkimuksessa ja Bayesilaisia monitekijäisiä malleja periytyvyyden tutkimuksessa. Tämän väitöskirjatyön tulokset osoittivat, että sekä koira- että kissarotujen välillä on käyttäytymiseroja, käyttäytyminen on perinnöllistä, monet käyttäytymispiirteet ovat korreloituneita keskenään ja että monet ympäristötekijät ovat yhteydessä käyttäytymispiirteisiin. Kaikissa käyttäytymispiirteissä ja kaikilla roduilla perinnöllisyysaste vaihteli 0.40 ja 0.53 välillä. Erityisesti pelokkuus ja aggressiivisuus korreloivat vahvasti ja nämä piirteet olivat yhteydessä myös epänormaalin toistavaan käyttäytymiseen. Varhaisiän ja vastausajankohdan sosiaalinen ympäristö oli yhteydessä pienempään aggressiivisuuden ja epänormaalin toistavan käyttäytymisen esiintyvyyteen. Väitöskirjatyön tulokset olivat hyvin samankaltaisia kummallakin eläinlajeilla ja osa tuloksista oli havaittu aiemmin myös ihmisillä. Tämä havainto viittaa siihen, että käyttäytymisen biologinen tausta on samanlainen sekä kissoilla että koirilla, ja todennäköisesti myös ihmisillä. Tämän väitöskirjan havainnoilla oli suurta tieteellistä ja käytännön merkitystä, sillä esimerkiksi kasvatussääntöjä muutettiin kissojen vieroitusiän suhteen väitöskirjatyön perusteella.

Cancer is a dynamic disease driven by complex molecular and environmental interactions. Therefore, the traditional “one gene, one drug, one disease” strategy is insufficient to treat most cancer patients. Drug combination therapy targeting various molecular mechanisms has become increasingly popular in treating cancer and other complex diseases. In comparison to monotherapy, combination therapy has the following advantages: possibility to reduce the dose of each single drug to minimize toxic side effects; achieving at least additive, multi-targeting effects, or even “greater-than-additive” effects, so called synergy; and reducing the likelihood of treatment resistance. However, even with the advanced high-throughput technologies currently used in drug combination screening, it remains infeasible to test systematically all the possible drug combinations across different cancer types, as the number of combination experiments grows exponentially. In addition, it remains difficult to understand the synergy mechanisms of many drug combinations, which poses further challenges for their clinical approval. Therefore, there is a timely need for computational tools that can help in identifying synergistic drug combinations for each individual patient, revealing the mechanisms of action of the drug combinations in the specific cellular context, as well as discovering potential predictive biomarkers for the synergistic responses in a systematic and reproducible way. In this thesis, I implemented a systematic computational framework for identification and validation of synergistic drug combinations for each individual patient. Firstly, I developed machine learning models to predict drug combination effects by utilizing drug-target interaction networks, drug sensitivity profiles as well as genomic profiles of each patient. The models further enable one to identify both synergistic and cancer-selective drug combinations specific for each patient, therefore avoiding broadly toxic combinations. Secondly, to experimentally validate the predicted synergistic drug combinations, I developed software tools to help designing multi-dose drug combination experiments, to facilitate the semi-automated drug screening process, as well as to analyze the high-throughput drug combination screening data. Thirdly, I demonstrated the potential of constructing patient-specific cancer vulnerability networks to investigate the mechanisms of action of the personalized drug combinations, which is of importance to accelerate anticancer therapy discovery for precision oncology. All of the computational tools developed in this thesis are distributed as open-source tools, making it possible for others to reproduce the results and apply to their data, or to extend the tools to new applications, as well as to integrate the tools as part of in-house drug combination analysis pipelines. Cancer är en dynamisk sjukdom som drivs av komplexa molekylära och miljömässiga interaktioner. Därför är den traditionella strategin "en gen, ett läkemedel, en sjukdom" otillräcklig för att behandla de flesta cancerpatienter. Kombinationsbehandling med läkemedel som riktas mot olika molekylära mekanismer har blivit allt populärare vid behandling av cancer och andra komplexa sjukdomar. Jämfört med monoterapi har kombinationsbehandling följande fördelar: möjligheten att sänka dosen av varje enskilt läkemedel för att minimera toxiska biverkningar; uppnå åtminstone additiva, multi-targeting effekter, eller till och med "större än additiva" effekter, så kallad synergi; och minska sannolikheten för behandlingsresistens. Men även med den avancerade teknik för hög genomströmning som för närvarande används vid läkemedelskombinationsscreening är det fortfarande omöjligt att systematiskt testa alla möjliga läkemedelskombinationer vid olika cancertyper, eftersom antalet kombinationsexperiment växer exponentiellt. Dessutom förstår vi fortfarande inte synergimekanismerna hos många läkemedelskombinationer, vilket innebär ytterligare utmaningar innan deras kliniska godkännande. Därför finns det ett aktuellt behov av beräkningsverktyg som kan hjälpa till att identifiera synergistiska läkemedelskombinationer för varje enskild patient, avslöja verkningsmekanismerna för läkemedelskombinationerna i det specifika cellulära sammanhanget, samt upptäcka potentiella prediktiva biomarkörer för de synergistiska svaren på ett systematiskt och reproducerbart sätt. I denna avhandling implementerade jag en systematisk beräkningsram för identifiering och validering av synergistiska läkemedelskombinationer för varje enskild patient. Först utvecklade jag maskininlärningsmodeller för att förutsäga läkemedelskombinationer genom att använda läkemedelsinteraktionsnätverk, läkemedelskänslighetsprofiler samt genomiska profiler för varje patient. Modellerna gör det vidare möjligt att identifiera både synergistiska och cancerselektiva läkemedelskombinationer som är specifika för varje patient, och med dem kunde man till stor del undvika toxiska kombinationer. För att experimentellt validera de förutspådda synergistiska läkemedelskombinationerna, utvecklade jag dessutom ett programvaruverktyg för att hjälpa till att designa ett multidos-läkemedelskombinationsexperiment, för att underlätta den halvautomatiserade läkemedelsscreeningsprocessen, samt för att analysera screeningsdata för läkemedelskombination med hög kapacitet. Slutligen visade jag potentialen att bygga patientspecifika cancersårbarhetsnätverk för att undersöka verkningsmekanismerna för de personifierade läkemedelskombinationerna, vilket märkbart kunde påskynda upptäckt av cancerterapi för precisionsonkologi. Alla beräkningsverktyg som utvecklats i denna avhandling distribueras som öppna källkodsverktyg, vilket gör det möjligt för andra att reproducera resultaten och tillämpa deras data, att utvidga verktygen till nya applikationer, samt att integrera verktygen som en del av interna pipelines för analys av läkemedelskombinationer.

Cardiometabolic diseases such as metabolic syndrome and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) are risk factors for cardiovascular disease and type 2 diabetes. NAFLD can be seen as the hepatic manifestation of the metabolic syndrome and obesity increases the disease risk, but also a genetic component plays a role in the development of NAFLD. The I148M variant of PNPLA3 (PNPLA3-I148M) and E167K variant of TM6SF2 (TM6SF2-E167K) have been strongly associated with NAFLD. However, these variants cause a fatty liver without systemic metabolic complications, and TM6SF2-E167K has even been shown to protect from myocardial infarction. New treatment possibilities for cardiovascular diseases have risen from studies of loss-of-function (LOF) variants of ANGPTL3. Subjects lacking ANGPTL3 have increased activity of lipoprotein lipase (LPL), low plasma levels of VLDL, LDL and HDL as well as increased insulin sensitivity. In this thesis study we aimed to elucidate the function of PNPLA3 and TM6SF2 in lipid metabolism of human hepatocytes, and to clarify the mechanism underlying the association between the variants of these genes and increased hepatic lipid accumulation. We also investigated the function of ANGPTL3 in human hepatocytes and characterized the plasma lipoprotein lipidomes of subjects homozygous for ANGPTL3 LOF variants. In these studies, we utilized different lipidomics approaches as well as complementary methods such as microscopy and transcriptomics. We found using labelled lipid precursors that overexpression of PNPLA3-I148M in hepatocytes leads to a net accumulation of unlabelled triacylglycerols (TAGs) when compared to PNPLA3 wild type (PNPLA3-WT) overexpressing or control cells, but the level of newly synthesized TAGs did not change. Closer examination of the lipid species profiles and further experiments led us to the conclusion that PNPLA3 is a remodelling protein that transfers fatty acids from TAG to phosphatidylcholine (PC) and that PNPLA3-I148M performs this function less efficiently, which may lead to increased hepatic TAG levels. The noticed lipid accumulation could also be related to a more extensive association of PNPLA3-I148M to lipid droplets compared to PNPLA3-WT, which was also observed in our study. We mimicked the effect of TM6SF2-E167K by knocking down TM6SF2 in hepatocytes. TM6SF2 depletion increased the level of TAGs and cholesterol esters (CEs) and changed the membrane lipid composition of the cells by reducing the amount of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) and increasing the levels of saturated and monounsaturated fatty acids in the lipids. The size of the lipoprotein-like particles secreted by the TM6SF2 deficient cells was reduced, as was β-oxidation of fatty acids. Both of these observations could explain the increased lipid accumulation caused by TM6SF2 depletion. In addition, TM6SF2 knock-down increased lipid turnover and the amount of late endosomes/lysosomes in the cells. Depletion of ANGPTL3 in hepatocytes lead to PUFA enrichment in major membrane phospholipids and CEs, and the production of PUFA-derived lipid mediators was also increased. In addition, the total level of CEs as well as their synthesis was reduced in ANGPTL3 depleted cells. An examination of the lipidome of lipoproteins derived from ANGPTL3 deficient or control subjects revealed that, in addition to reducing the total levels of all lipid classes, ANGPTL3 deficiency modifies the species composition of the core and surface lipids of lipoproteins, which likely reflects the increased activity of LPL. These findings increase the knowledge on how genetic NAFDL caused by PNPLA3-I148M or TM6SF2-E167K variant develops and how ANGPTL3 depletion affects the liver and the secreted lipoproteins. This information provides tools for creating future prevention and treatment strategies for cardiometabolic diseases. Kardiometabolisiksi luonnehditut aineenvaihduntahäiriöt, kuten metabolinen oireyhtymä ja alkoholista riippumaton rasvamaksa, lisäävät riskiä sairastua sydän- ja verisuonitauteihin ja tyypin 2 diabetekseen. Alkoholista riippumatonta rasvamaksaa voidaan pitää metabolisen oireyhtymän ilmentymänä maksassa, ja lihavuus on sen suurin yksittäinen riskitekijä, mutta myös geneettiset seikat vaikuttavat maksan rasvoittumiseen. PNPLA3-geenin I148M-variantti (PNPLA3-I148M) sekä TM6SF2-geenin E167K-variantti (TM6SF2-E167K) lisäävät rasvamaksaan sairastumisen riskiä, mutta niiden aiheuttamiin aineenvaihduntahäiriöihin ei liity insuliiniresistenssiä, ja TM6SF2-E167K jopa suojaa sydäninfarktilta. Myös henkilöillä, joilta puuttuu toiminnallinen ANGPTL3-geeni, on vähäisempi riski sairastua sydän- ja verisuonitauteihin, ja siksi ANGPTL3-proteiinin toiminnan estäminen verenkierrossa tai sen tuotannon estäminen maksassa ovat jo edenneet kliinisiin kokeisiin uusina sydän- ja verisuonitautien hoitomuotoina. Tässä väitöskirjatyössä selvitettiin PNPLA3- ja TM6SF2-proteiinien toimintaa maksasolujen rasva-aineenvaihdunnassa (lipidimetaboliassa) sekä mekanismeja, joilla PNPLA3-I148M ja TM6SF2-E167K aiheuttavat maksan rasvoittumista. Lisäksi tutkittiin ANGPTL3:n puutteen vaikutusta maksasolujen lipidimetaboliaan ja maksasta eritettyjen lipoproteiinien lipidikoostumukseen. Työssä hyödynnettiin etenkin erilaisia lipidomiikan menetelmiä. Havaitsimme, että PNPLA3 osallistuu glyserolipidien glyserolirunkoon kiinnittyneiden rasvahappojen vaihdantaan. PNPLA3-I148M sai tämän lipidien välisen rasvahappojen siirron häiriintymään, ja lisäksi PNPLA3-I148M hakeutui suuremmissa määrin maksasolujen varastorasvapisaroiden yhteyteen kuin normaali PNPLA3. Nämä tekijät voivat vaikuttaa maksasolujen rasvoittumiseen. Myös TM6SF2:n määrän vähentäminen maksasoluissa, mikä vastaa TM6SF2-E167K:n vaikutusta, muutti solujen lipidimetaboliaa ja johti solujen rasvoittumiseen. Havaituista muutoksista etenkin eritettyjen lipoproteiinin kaltaisten partikkelien koon pieneneminen sekä rasvahappojen β-oksidaation väheneminen selittäisivät maksasolujen rasvoittumista. ANGPLT3:n puute kasvatti maksasolujen monityydyttymättömien rasvahappojen suhteellista osuutta solun kalvolipideissä sekä rasvapisaroiden kolesteroliestereissä, ja lisäksi näistä rasvahapoista valmistettujen lipidimediaattorien tuotanto tehostui. ANGPTL3:n puutos vähensi maksasta eritettyjen lipoproteiinien lipidimääriä sekä vaikutti myös lipoproteiinien pintakalvon ja ytimen lipidien koostumukseen, mikä todennäköisimmin johtui lipoproteiinilipaasin aktiivisuuden suurenemisesta. Tämän väitöskirjatyön tulokset tarjoavat mekanistista perustietoa erityyppisten kardiometabolisten sairauksien ennaltaehkäisyn ja hoidon kehittämiseen.

The speed of DNA and RNA sequencing has long ago surpassed the capacity of laboratories to assign function to these sequences by direct experiment. Fortunately, function and other information can be effectively transferred to novel data from previously accumulated knowledge by sequence homology. This has resulted in the development of hundreds of novel homology-based methods. However, the tendency of method developers to be overoptimistic about their own results, biases in the evaluation metrics used to rank methods, inconsistency between different rankings and evaluation metrics, misplaced popularity of methods relative to their performance all indicate that, in many cases, clear knowledge of the comparative performance of different methods is lacking. This has two main consequences. First, researchers use suboptimal tools. Second, method development may go astray because the merits used for guiding method optimization are biased or unclear. To avoid these difficulties, further research is needed into methodology of evaluation and comparative studies. One core approach for transferring function by sequence homology is to create a multiple sequence alignment (MSA) that represents a given group of similar sequences. The resulting alignment can be applied to annotate novel sequences using profile hidden Markov models (HMMs), to create phylogenetic trees or to compare structural features. The application of MSAs and profile HMMs for genome annotation was explored in publication (I). Creating MSA has been addressed by a vast field of research, however there is a lack of independent comparative studies and no comparative studies for alignment strategies. In publication (II) a novel modular MSA aligner was implemented to aid in comparative evaluation of different MSA strategies. Different MSA strategies were then compared to each other and to the state-of-the-art MSA software on three benchmark databases. Another core approach has been to combine homology searches with assignment of annotation terms from a controlled vocabulary such as the Gene Ontology (GO). Hundreds of methods that assign GO terms to novel sequences have been introduced. The research community has also invested into the objective evaluation of these methods via third party competitions. However, the evaluation metrics and merits used in these competitions are still under active debate and need further research and development. In publication (III) a novel framework was introduced for the development of unbiased high-quality evaluation metrics. By testing 37 variations of popular metrics, our approach revealed strong differences between metrics, a list of clearly biased metrics, and a list of high-quality metrics that are well suited for the evaluation of GO annotations. In summary, this thesis presents novel frameworks and implementation platforms for comparative evaluation of two important classes of homology-based methods: MSA aligners and GO sequence classifiers. These results will be instrumental for developing more accurate MSA aligners, for eliminating many forms of bias inherent in contemporary evaluation protocols, for producing informative method rankings for non-specialist users and for guiding method development towards merits that truly reflect the utility of the designed tools. Johtuen DNA ja RNA sekvensointiteknologian nopeasta kehityksestä suurin osa sekvenssien biologisista kuvauksista tuotetaan sekvenssihomologiaan perustuvilla automaattisilla menetelmillä. Homologiaan perustuvia menetelmiä on kehitetty satoja, mikä korostaa objektiivisen ja riippumattoman menetelmävertailun merkitystä. On monia virhelähteitä, jotka vääristävät ja hankaloittavat menetelmävertailua: oman menetelmän yliarviointi, ylisovittaminen, valikoitu raportointi, sekä harhaiset ja keskenään ristiriitaiset arviointimetriikat. Harhaisella menetelmävertailulla on kaksi merkittävää seurausta: (1) epäoptimaaliset menetelmät päätyvät tutkijayhteisön käyttöön, (2) menetelmäkehitys harhaantuu, koska kehitystä ohjaavat arviointikriteerit ovat harhaisia tai epäselviä. Edellä mainittuja vaikeuksia voidaan välttää kohdentamalla tutkimusta itse vertailevaan menetelmäarviointiin. Monisekvenssilinjaus (MSL) on sekvenssihomologiaan perustuva menetelmä, jolla on hyvin laaja sovelluskenttä molekyylibiologisessa tutkimustyössä. Julkaisussa (I) tutkittiin MSL-linjausten ja Markovin piilomallien soveltamista bakteerigenomien kuvaukseen. MSL-kentällä on edelleen puutetta riippumattomasta menetelmäarvioinnista, ja erityisesti eri MSL-algoritmiratkaisuja vertailevista tutkimuksista. Julkaisussa (II) esitettiin uusi modulaarinen MSL-ohjelma, jonka avulla useita MSL-algoritmiratkaisuja vertailtiin toisiinsa ja MSL-alan huippusovelluksiin kolmella vertailutietokannalla. Vertailun perusteella annettiin selkeitä suosituksia optimaalisista MSL-algoritmiratkaisuista ja parhaista MSL-ohjelmista. Sekvenssikuvauksia tuottavat automaattiset menetelmät useimmiten käyttävät geeniontologian (GO) termistöä. Koska vuosittain julkaistaan satoja GO-menetelmiä, tutkimusyhteisö on panostanut kyseisten menetelmien vertailevaan arviointiin. Kuitenkin GO-menetelmävertailun kentällä arviointikriteerit ovat vakiintumattomia ja monet käytössä olevat arviointimetriikat ovat joko harhaisia tai keskenään ristiriitaisia. Julkaisussa (III) ehdotetaan ratkaisuksi uutta menetelmää, jonka avulla on mahdollista testata ja kehittää korkealaatuisia ja harhattomia arviointimetriikoita. Julkaisussa (III) testattiin useita arviointimetriikoita ja osoitettiin, että monet tällä hetkellä käytössä olevat GO-arviointimetriikat ovat voimakkaasti harhaisia. Testauksen perusteella annettiin myös selkeitä suosituksia arviointimetriikoista, jotka takaavat harhattoman menetelmävertailun.

Mesenchymal stromal cells (MSC) are a potential tool for cell-based therapies subject to intensive investigation. MSCs display immunomodulatory functions and a broad differentiation capacity, and thus have several potential therapeutic applications, such as treatment of immunological disorders and correction of tissue defects. MSCs have been widely studied and utilized in treatment of Graft-versus-Host disease, a severe complication of stem cell transplantation, and have also been evaluated in treatment of Crohn’s disease, multiple sclerosis, and chronic inflammation. The repair of bone and cartilage defects is another application of significant interest. MSCs are classified as advanced therapy medicinal products (ATMPs), which are manufactured under supervision by regulatory authorities. The aim of regulation is to produce safe and effective medicinal products, and therefore safety risks and sources of alterations or impairment of functionality should be evaluated carefully. MSCs are somatic cells, which can be isolated from various sources, such as from bone marrow, adipose tissue, or umbilical cord. For production of medicinal products, MSCs are usually expanded extensively in cell cultures. Culture conditions are known to affect to the characteristic and functionality of MSCs. Animal-derived components during culture such as bovine serum are to be avoided if possible, due to risks of immune reactions and zoonotic infections. Therefore, animal serum-free culture medium is considered safe option for MSC cultures. This thesis focuses on determining optimal expansion and differentiation conditions for clinical-grade bone marrow-derived MSCs by using platelet-derived culture medium supplements to replace bovine serum. This study also aimed to improve quality of MSCs products by introducing an imaging-based screening method to detect aging-related morphological changes in MSC cultures. Finally, we investigated how additional freezing steps during the manufacturing process affect the basic manufacturing parameters and alter the cellular aging process. We found in this study that platelet lysate with two freeze-thaw cycles effectively supported MSC expansion and maintained their functionality in ambient oxygen concentration. Platelet lysate also promoted osteogenic differentiation at least equally with bovine serum in two-dimensional plate culture and slightly better if a three-dimensional matrix was used. We were able to detect and quantify aging-related morphological changes from MSCs cultures and found that a rapid increase in cell size reflects the expression of aging markers. We found that freezing at early phases of cell cultures did not alter the characteristics or functionality of the MSC. This study has yielded insights into the establishment and scaling up of animal-serum free MSC cultures. In addition, our screening method for aged cells could be implemented into the clinical-grade manufacturing of MSCs to monitor cell quality during processing. Mesenkymaaliset stroomasolut (MSC) ovat olleet vilkkaan tutkimuksen kohteina johtuen niiden kyvystä vaimentaa immuunireaktioita ja erilaistua erilaisiksi solutyypeiksi, kuten luu- ja rustosoluiksi. MSC:n ominaisuudet tekevät niistä merkittävän potentiaalisen työkalun erilaisten sairauksien, kuten immunologisten häiriöiden tai kudospuutosten, hoitoon. MSC:ja on laajasti käytetty ja tutkittu akuutin käänteishyljinnän, Crohnin taudin ja kroonisten tulehdustilojen yhteydessä sekä luu- ja rustopuutosten hoidossa. MSC:t luokitellaan kehittyneen terapian lääkevalmisteiksi, joiden tuotantoa säädellään tiukasti lailla ja joiden valmistusta valvovat lääkevalvontaviranomaiset. Sääntelyn tarkoituksena on taata potilaalle turvallinen ja tehokas lääkevalmiste. MSC:t ovat somaattisia soluja, joita voidaan eristää erilaisista lähteistä, kuten terveen luovuttajan luuytimestä, rasvakudoksesta tai napanuorasta. Eristettyjä soluja on viljeltävä laboratoriossa laajamittaisesti soluvalmistetta varten. Viljelyolosuhteiden tiedetään muokkaavan solujen ominaisuuksia ja toimintaa. Hoitoon tarkoitettujen soluvalmisteiden tuotannossa tulisi myös pyrkiä eroon eläinperäisten materiaalien kuten nautaseerumin käytöstä niihin liittyvien taudinaiheuttajien ja immuunireaktioiden riskin vähentämiseksi. Tämän vuoksi MSC:n viljelyssä tulisi käyttää ihmisperäisiä rikasteita, kuten verihiutaleista valmistettua lysaattia. Tässä väitöstutkimuksessa keskityttiin kehittämään optimaalisia nautaseerumivapaita viljelyolosuhteita MSC:n laajamittaista viljelyä ja luuksi erilaistamista varten. Tutkimuksessa selvitettiin myös keinoja tunnistaa MSC ikääntymiseen liittyviä morfologian muutoksia kuvantamistekniikkaan perustuvaa seulontamenetelmää hyödyntäen. Tutkimme myös, miten MSC:n viljelyprosessin aikana tehtävät solujen pakastusvaiheet vaikuttavat niiden ominaisuuksiin ja ikääntymiseen. Havaitsimme, että kahdesti pakastettu ja sulatettu verihiutalelysaatti tuki MSC:n jakautumista ja erilaistumista luuksi ja ylläpiti solujen toiminnalliset piirteet viljelyn ajan. Verihiutalelysaatin havaittiin myös tukevan luuksi erilaistumista vähintään samalla tavoin kuin nautaseerumilla kaksiulotteisessa maljaviljelmässä ja hieman paremmin silloin, kun soluja viljeltiin käyttämällä kolmiulotteista matriisia. Onnistuimme havaitsemaan solujen ikääntymiseen liittyviä muutoksia solujen muodossa ja osoitimme, että solujen koon nopea muutos heijastaa myös ikääntymismarkkerien esiintymistä soluissa. Lopuksi havaitsimme, että tuotantoprosessin aikana tehdyt pakastamisvaiheet eivät vaikuta solujen toimintaan haitallisesti eivätkä muuta solujen normaalia ikääntymisprosessia. Tämä väitöstutkimus on tuottanut uutta tietoa eläinseerumivapaan MSC viljelmän optimoinnista ja laajentamisesta sekä esittää kuvantamiseen perustuvan menetelmän, jolla solujen laatua voitaisiin tutkia tuotantoprosessin aikana.

Nicotine dependence is a major cause of tobacco-related illnesses. Although tobacco smoking continues to be the leading cause of preventable death, and although the harmful health effects resulting from it are well known, about 20% of the global population continues to smoke. The addiction-causing substance in tobacco, nicotine, acts through dopamine pathways in the brain to produce several pleasurable experiences as a result of cigarette smoking. There are significant individual differences in how nicotine affects the body, and these differences in both the neurological and metabolic pathways of nicotine may determinate the degree of the subsequent nicotine addiction. Thus, both genetic and epigenetic factors related to nicotine metabolism and nicotine-induced dopamine metabolism can have an important role in influencing individual smoking behaviour. In this thesis, in addition to the potential nicotine metabolism-related gene, CYP2D6, a few selected genes acting in dopamine routes, namely, MAOA, MAOB, and SLC6A3, were genotyped for their several known variants, together with their selected DNA methylation sites. The polymorphisms and variations in DNA methylation levels of the genes included in the study were examined in relation to numerous smoking-related phenotypes in a well characterized study population of 1,230 Caucasians of Russian origin. The aim was to discover novel relations among several smoking-related phenotypes and methylation of the studied genes, as well as to verify some findings of the previous genetic studies on this topic. Our results indicate that the poor metabolic capacity associated-CYP2D6 genotype, defined by the data derived from eight functional polymorphic sites of the gene, is related to cigarette consumption such that the carriers of this genotype have reduced risk of heavy smoking compared to the carriers of the extensive metabolism-associated genotype. We also discovered that the poor metabolizer genotype occurred more frequently with higher methylation values, which was found to be inversely related to heavier smoking. The studies on dopamine related genes revealed that the MAOA 1460 T variant allele, variable number of tandem repeat (VNTR) high-activity alleles (3.5R, 4R, and 5R), and MAOB int13 common G allele were more prevalent in female smokers than non-smokers. Additionally, the 5R allele of 30bp VNTR and the 9R allele of 40bp VNTR in SLC6A3 were associated with negligible smoking history. Moreover, although the carriers of 9R allele had somewhat higher Fagerström Test for Nicotine Dependence (FTND) scores, they were also more likely to successfully cease smoking. When methylation levels were explored, we found that current smokers were 2.5 times more likely to have increased SLC6A3 mean methylation levels compared to ex-smokers, whereas in MAOA and MAOB genes the methylation levels of single CpG sites were independently related to smoking behaviour. In addition, some of the alterations in DNA methylation levels at individual CpG sites showed a high degree of dependence on the genetic polymorphisms studied, while others did not. As expected, age and gender were found to be major contributing factors in determining the DNA methylation levels. Our findings indicate that the CYP2D6-related metabolic capacity may be associated with cigarette consumption both through genetic and epigenetic mechanisms. Additionally, our results suggest that both the genetic and the epigenetic profiles of MAO and SLC6A3 genes modify the availability of dopamine and thereby shape the risk of developing nicotine dependence. Due to the complexity of nicotine addiction and the related phenotypes, more high-quality research is needed to verify these novel findings. Tupakointi on edelleen maailmanlaajuisesti suurin ennaltaehkäiseviin kuolemiin johtava syy. Nikotiiniriippuvuus on tärkeä syy tupakoinnin jatkamiseen, ja sitä kautta sillä on tärkeä rooli tupakkaperäisten sairauksien kehittymisessä. Nikotiini vaikuttaa aivojen dopamiinireitillä aiheuttaen useita miellyttäviä kokemuksia tupakoinnin seurauksena. Merkittävät yksilölliset erot nikotiinin neurologisella ja aineenvaihdunnallisella reitillä voivat määrätä yksilölle tupakoinnista aiheutuvan nikotiiniriippuvuuden asteen, jolloin näillä poluilla vaikuttavilla geneettisillä ja epigeneettisillä tekijöillä voi olla merkittävä vaikutus yksilölliseen tupakointikäyttäytymiseen. Tässä väitöskirjassa tutkittiin hyvin karakterisoidussa 1230 venäläisestä henkilöstä koostuvassa tutkimusaineistossa potentiaalisen nikotiiniaineenvaihduntaan osallistuvan CYP2D6-entsyymin ja dopamiinireiteillä toimivien entsyymien, MAOA, MAOB ja SLC6A3, aktiivisuuteen vaikuttavien geenimuunnosten ja valittujen DNA-metylaatiokohtien suhdetta useisiin tupakointiin liittyviin fenotyyppeihin. Tavoitteena oli sekä löytää uusia kytköksiä useiden tupakointiin liittyvien fenotyyppien ja tutkittujen geenien metylaatiotasojen välillä että varmistaa joitain aikaisempien geenitutkimusten tuloksia. Tulosten perusteella CYP2D6 -metaboliakyky vaikuttaa savukkeiden kulutuksen määrään sekä geneettisen että epigeneettisen mekanismin kautta. Runsaan tupakoinnin havaittiin liittyvän sekä nopean metaboliakyvyn geenimuotoihin että alhaisiin CYP2D6 -metylaatiotasoihin. Lisäksi tulokset viittaavat siihen, että sekä MAO- että SLC6A3-geenien geneettinen ja epigeneettinen profiili vaikuttaa dopamiinin saatavuuteen elimistössä ja muokkaa sitä kautta yksilöllistä alttiutta nikotiiniriippuvuuden kehittymiseen. Tutkittujen geenimuunnosten havaittiin liittyvän erityisesti tupakoinnin aloittamisen ja lopettamisen fenotyyppeihin. Keskimääräisiä metylaatiotasoja koskevissa tutkimuksissa puolestaan havaitsimme SLC6A3 -metylaatiotasojen olevan merkittävästi korkeammat nykyisillä tupakoijilla verrattuna entisiin tupakoitsijoihin, kun taas MAOA- ja MAOB-geeneissä yksittäisten CpG-kohtien metylaatiotasot liittyivät toisistaan riippumattomasti tupakointikäyttäytymiseen. Tutkimuksessamme havaittiin myös merkittäviä alueellisia eroja metylaatiotasojen vaihteluissa tutkittujen geneettisten monimuotoisuuskohtien, iän ja sukupuolen suhteen. Tupakointiriippuvuuden ja siihen liittyvien fenotyyppien monitahoisuuden vuoksi tarvitaan luonnollisesti vielä lisää laadukkaita tutkimuksia näiden uusien löydösten varmistamiseksi.

Aging is a biological process where tissue functions deteriorate leading to morbidity. Gastrointestinal tract is a key system for organismal health converting external energy sources to a useful form for the body. With age, intestinal function declines in humans as the absorptive capacity decreases and recovery from damage slows down. Absorptive epithelium is constantly renewed by actively proliferating intestinal stem cells (ISC) that are intermingled between specialized secretory cells named Paneth cells. These cells are located at the bottom of intestinal crypts that forms a specialized microenvironment, the stem cell niche, participating to the maintenance of ISCs and their function. What is the role of the niche in age related changes of ISC function remains poorly characterized. In this dissertation age-associated changes in the communication between ISCs and the neighboring Paneth cells are analyzed and the outcome for regenerative capacity and homeostatic maintenance of the epithelium is studied. Under homeostasis, old epithelium is functional, but ISCs are biased to differentiate towards the secretory lineage. Using in vitro organoid culture, we show that reduced regenerative function of old epithelium is due to defects in both ISCs and the supporting Paneth cells. Aged Paneth cells produce excess amount of Notum, a secreted Wnt-inhibitor, that reduces the canonical Wnt-activity in the neighboring ISCs. Moreover, old crypts have enlarged morphology reducing the physical curvature of the niche, and potentially increasing the size of ISCs in vivo. Alterations in size and shape of old ISCs can contribute to decreased capacity to receive signals from the niche. Supplementation of Wnt-ligands, genetic ablation of Notum or culture on bioengineered topologically young scaffolds improved the regenerative growth of old epithelium in vitro. Moreover, inhibition of Notum in vivo with a small molecule ABC99 enhanced recovery of old intestine from 5-Fluorouracil induced chemotherapeutic insult. These findings demonstrate that Notum inhibition could be used as a prophylactic treatment to reduce harmful side-effects in elderly patients undergoing chemotherapy. In addition, cellular shape as a facilitator of cell-cell communication in the ISC niche suggest that modulation of the tissue topology could result in enhanced stem cell function. Ikääntyminen on biologinen prosessi, missä kudosten toiminnan heikentyminen johtaa lopulta yksilön kuolemaan. Suolisto on merkittävä osa kehon toiminnan ylläpitämisessä vastaten energian talteen ottamisesta ravinnosta. Iän myötä, ihmisen suoliston toimintakyky heikkenee ja etenkin ravinnon hyödyntäminen ja vaurioiden korjaaminen hidastuu. Suoliston sisäreunaa vuoraa yksikerroksinen epiteeli, minkä tehtävä on kuljettaa energiaa sulatetusta ravinnosta muiden kudosten käyttöön ja samalla estää haitallisten patogeenien pääsy kehoon. Epiteeli uusiutuu jatkuvasti, kun suoliston kantasolut tuottavat uutta solukkoa korvaamaan kuluneen epiteelin. Kantasolut sijaitsevat nk. Lieberkühnin kryptien pohjalla erityisessä mikroympäristössä, nk. kantasolulokerossa, missä ne ovat välittömässä kosketuksessa erilaistuneiden Panethin solujen kanssa. Panethin solut ohjaavat kantasolujen toimintaa ja muodostavat täten merkittävän osan kantasolulokerosta. Kuinka paljon ikääntyminen vaikuttaa suoliston kantasolujen ja niiden mikroympäristön väliseen vuorovaikutukseen ja sitä kautta kudoksen toimintaan on tunnettu huonosti. Tässä väitöskirjassa selvitetään minkälaisia muutoksia ikääntyminen aiheuttaa suoliston epiteelin ylläpitoon, uusiutumiskykyyn sekä Panethin ja kantasolujen väliseen vuorovaikutukseen. Normaalitilassa, vanhan epiteeli on toiminnallinen, mutta kantasoluilla on suurempi taipumus muodostaa sekretorisen linjan solukkoa. Käyttämällä organotyyppisiä soluviljelymalleja, havaittiin, että vanhan epiteelin uusiutumiskyky on heikompi johtuen sekä kanta- että niitä tukevien Panethin solujen toiminnan muutoksesta. Vanhat Panethin solut tuottavat ylimäärin Wnt molekyylejä inaktivoivaa entsyymiä nimeltään Notum. Wnt molekyylit ovat elintärkeitä kantasoluille ja lisääntynyt Notumin määrä vanhassa mikroympäristössä heikentää kantasolujen toiminnallisuutta. Tämän lisäksi, vanhan mikroympäristön muoto ja kantasolujen koko on muuttunut, mikä voi madaltaa naapuruston viestien vastaanottokykyä. Antamalla vanhoille kantasoluille ylimäärin Wnt molekyylejä tai estämällä Notum entsyymin toiminta geenisaksilla, voitiin lisätä kudoksen uusiutumiskykyä soluviljelymallissa. Lisäksi, pakottamalla vanha epiteeli nuoren kaltaiseen muotoon kyettiin parantamaan uuden epiteelin muodostumista. Pienmolekyyli, jolla estetään Notumin toiminta, edisti vanhan kudoksen paranemista eläinmallissa, missä normaali kudos oli vaurioitunut syöpälääkkeen, 5-Fluorourasiili, saamisen jälkeen. Yhdessä nämä tulokset havainnollistavat, että Notumin toiminnan estämistä voitaisiin tulevaisuudessa käyttää ennaltaehkäisevästi vähentämään syöpähoitojen sivuvaikutuksia etenkin vanhoilla potilailla. Lisäksi, osoitus solujen muodon merkityksestä niiden väliseen vuorovaikutukseen kantasolulokerossa viittaa mahdollisuuteen parantaa kantasolujen toimintaa muokkaamalla kudoksen fysikaalista muotoa.

The anterior hindbrain segment rhombomere 1 (r1) generates in its ventral (basal) region GABAergic and serotonergic neurons that give rise to various nuclei in the adult brainstem that participate in the modulation of mood and motivation. This thesis focuses on the function of specific transcription factors (TFs) and their co-regulators that control the differentiation of r1derived neurons and their subtypes. First, we characterized early ventral r1 development to determine which neurons are generated in this area. In general, the developing neural tube can be divided dorso-ventrally into multiple progenitor domains that have distinct gene expression patterns and give rise to diverse cell types. We found that ventral r1 contains at least three different progenitor domains. Using genetic fate mapping in the mouse, we determined that the two most ventral progenitor domains (Nkx2-2+ rp3 and rpvMN) produce serotonergic neurons and oligodendrocytes, whereas the more dorsal progenitor domain (Nkx6-1+ rp2) generates GABAergic and glutamatergic neurons. By combining single-cell RNA sequencing (scRNAseq) and expression analyses of subtype-specific TFs, we show that embryonic ventral r1 contains molecularly distinct populations of post-mitotic GABAergic and glutamatergic precursors. We further report that GABAergic neurons from ventral r1 give rise to multiple GABAergic nuclei in the anterior brainstem, such as the posterior substantia nigra pars reticulata (pSNpr), rostromedial tegmental nucleus (RMTg) and ventral tegmental nucleus (VTg), whereas GABAergic neurons of the dorsal tegmental nucleus (DTg) originate from progenitors located in dorsal region of r1. Second, we analysed the functions of GATA TFs and their regulators in the development of r1derived GABAergic neurons by conditional mouse mutagenesis. We showed that GATA2 and GATA3, together with their co-factor TAL1, act as neuron-type selectors in early post-mitotic precursors to promote a GABAergic over glutamatergic neuron fate. Analysis of these mutants during later developmental stages showed that GABAergic neurons in the pSNpr, RMTg and VTg were absent, while the number of glutamatergic neurons was increased in other nuclei such as the interpeduncular nucleus (IPN) and the laterodorsal tegmental nucleus (LDTg). We found that ZFPM1 and ZFPM2, two GATA cofactors, are also expressed in GABAergic neuron precursors in r1. However, ZFPM2 does not function as a neuron-type selector in these cells, but rather is required for the proper development of pSNpr, RMTg and VTg GABAergic neurons. Finally, we studied the role of GATA2, GATA3 and ZFPM1 in the development of dorsal raphe (DR) serotonergic neurons in r1. Conducting overexpression experiments in chicken embryos, we demonstrated that GATA2 and GATA3 guide the differentiation of serotonergic neurons in the absence of their TAL1 partner, which is vital for GABAergic differentiation. We determined that GATA2 acts as a neuron-type selector and is important for all post-mitotic serotonergic neuron precursors to acquire serotonergic identity, whereas GATA3 is required for the differentiation of specific subtype of serotonergic neurons from r1. In addition, GATA2 and GATA3 are necessary for the development of non-serotonergic glutamatergic neurons in the DR. It was further shown that the GATA cofactor ZFPM1 is essential for the correct development of serotonergic neurons in DR subregions DRVL (ventrolateral part of dorsal raphe) and DRD (dorsal part of dorsal raphe). Loss of ZFPM1 function resulted in increased anxiety-like behaviour and elevated contextual fear memory, a phenotype that was alleviated by chronic treatment with fluoxetine, a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI). In conclusion, this work reveals neuronal subtypes present in and mechanisms involved with anterior brainstem development and that are important in the determination of behavioural phenotypes. Furthermore, it demonstrates that a complex gene regulatory system, where functions of GATA family selector TFs are modulated by their cofactors, is employed to achieve cell diversity in the central nervous system, mechanisms of which share marked similarities with cell fate determination programs in other developing tissues, such as the hematopoietic system. Alkion taka-aivojen etummainen osa, rhombomeeri 1 (r1), tuottaa aivorungon tumakkeiden GABAergisia, glutamatergisia ja serotonergisia hermosoluja, jotka osallistuvat mm. mielialan ja motivaatiokäyttäytymisen säätelyyn. Tämä väitoskirja käsittelee transkriptiotekijöitä (engl. transcription factors, TF) ja niiden liittyviä säätelyproteiineja, jotka ohjaavat hermosolutyyppien kirjon kehittymistä vatsanpuoleisessa (ventraalisessa) r1:ssa. Kuvasimme ensin millaisia hermosoluja alkion ventraalisesta r1:stä syntyy. Kehittyvä hermostoputki jakautuu selkä-vatsa akselilla useisiin jakautuvien hermokantasolujen alueisiin, joista syntyy kullekkin alueelle tyypillisiä hermosoluja. Havaitsimme hiirialkion ventraalisessa r1:ssa ainakin kolme hermokantasolualuetta. Geneettisellä solulinjastojen seurannalla osoitimme, että ventraalisimmat kantasolualueet (Nkx2-2 ilmentävät rp3 ja rpvMN) tuottavat serotonergisia hermosoluja ja oligodendrosyytti- hermotukisoluja, kun taas niiden selänpuoleinen alue (Nkx6-1 ilmentävä rp2) tuottaa GABAergisia ja glutamatergisia hermosoluja. Yksittäisten solujen mRNA sekvenoinnilla (engl. single cell mRNA sequencing, scRNAseq) ja TF:n ilmenemisanalyyseillä osoitimme, että alkion ventraalinen r1 sisältää kirjon erilaisia solusyklistä poistuneita ja hermosoluerilaistumisen aloittaneita GABAergisten ja glutamatergisten hermosolujen esiastesoluja. Tämän lisäksi kuvasimme miten ventraaliset GABAergiset esiastesolut osallistuvat aivorungon tumakkeiden, kuten posteriorisen substantia nigra pars reticulatan (pSNpr), rostromediaalisen tegmentaalisen tumakkeen (RMTg) ja ventraalisen tegmentaalisen tumakkeen (VTg), kehitykseen. Toisaalta osoitimme VTg:n vieressä sijaitsevan dorsaalisen tegmentaalisen tumakkeen (DTg) GABAergisten solujen olevan peräisin toisesta selänpuolisemmasta esiastesolujen joukosta. Seuraavaksi tutkimme GATA perheen TF:n ja niihin liittyvien säätelyproteiinien tehtäviä ventraalisen r1:n GABAergisten hermosolujen kehityksessä. Käyttäen kudoskohdennettua mutageneesiä hiirialkiossa osoitimme, että GATA2 ja GATA3 sekä niihin liittyvä TF TAL1 ohjaavat solusyklistä poistuneiden hermosolujen esiastesolujen erilaistumista GABAergisiksi hermosoluiksi ja estävät niitä erilaistumasta glutamatergisiksi hermosoluiksi. Tämän seurauksena hiiriltä, joilla nämä TF geenit on mutageneesillä tuhottu, puuttuvat pSNpr:n, RMTg:n, ja VTg:n GABAergiset hermosolut, kun taas glutamatergisten hermosolujen määrä interpedunkulaarisessa tumakkeessa (IPN) ja laterodorsaalisessa tumakkeessa (LDTg) on lisääntynyt. Havaitsimme myös, että GATA TF:n liittyvät säätelyproteiinit ZFPM1 ja ZFPM2 ilmenevät ventraalisen r1:n GABAergisten hermosolujen esiastesoluissa. Osoitimme, että ZFPM2 ei ole välttämätön esiastesolun GABAergisen hermosoluidentiteetin valinnalle, mutta se ohjaa pSNpr:n, RMTg:n ja VTg:n tumakkeiden myöhempää kehitystä. Lopuksi tutkimme GATA2, GATA3 ja ZFPM1 TF:n tehtäviä r1:ssä sijaitsevan dorsaalisen raphe (DR) tumakkeen serotonergisten hermosolujen kehityksessä. Kana-alkioilla tehdyllä kokeilla osoitimme, että GATA2 ja GATA3 ohjaavat serotonergisten hermosolujen erilaistumista ilman TAL1 TF kumppania, toisin kuin GABAergisissa soluissa, joissa GATA2, GATA3 ja TAL1 toimivat yhteistyössä. Osoitimme, että GATA2 on serotonergisen hermosoluidentiteetin selektorigeeni, joka vaaditaan kaikkien serotonergisten hermosolujen esiastesolujen erilaistumiseen. GATA3 puolestaan vaaditaan osassa kehittyviä serotonergisia hermosoluja ja GATA2 ja GATA3 yhdessä ohjaavat DR tumakkeen keskellä sijaitsevien ei-serotonergisten hermosolujen kehitystä. GATA TF:n säätelytekijä ZFPM1 on tärkeä DR:n ventrolateraalisen (DRVL) serotonergisten hermosolujen kehitykselle. Osoitimme että hiiret, joiden ZFPM1 geeni on inaktivoitu, ovat ahdistuneempia ja niillä on kohonnut pelkoehdollistumisen taso, joka on normalisoitavissa selektiivisellä serotoniinin takaisinoton estäjällä (SSRI fluoxetine). Yhteenvetona tämä työ kuvaa aivorungon etuosan hermosolujen alaryhmiä, niiden molekylaarisia erityispiirteitä, kehityksellisiä mekanismeja ja merkitystä käyttäytymiselle. Työ osoittaa, että samoin kuin eräissä muissa kehittyvissä kudoksissa, kuten hematopoieettisissa soluissa, GATA tekijöiden ja niihin liittyvien TF:n ohjaama geenisäätelyverkosto ohjaa aivorungon solujen kirjon kehitystä.

Knowledge of the defense responses of mosses against pathogens has gained less attention than has our knowledge of the pathogens of vascular plants. Recently, the use of mosses has gained attention because mosses are used for greenhouse production as well as landscaping. In particular, the landscaping and greening of buildings have become popular because these initiatives offer one solution for mitigating urban problems such as heat islands and flooding. Mosses are an easy and lightweight solution for greening purposes as they can survive the harsh rooftop environment and have great stormwater retention. However, the health of plants is fundamental to achieving the benefits of greening. Like vascular plants, mosses also are susceptible to plant diseases. Many fungi damage mosses by causing brown patches of greenish moss. Brown patches on mosses are a characteristic sign of fungal infection. However, plants have various defense mechanisms, the first of which consists of preexisting structural and chemical defenses. Second, the plant immune system uses specific receptors with which to recognize the molecular structures of microbes that are not present on the surface of the plant's own cells. Receptor-mediated sensing of these structures can trigger early defense responses of plant, which can make the plant resistant to the attacking microbe. The model moss Physcomitrella patens, like the vascular plants, senses the molecular structures of microbes. For example, exposure of P. patens to chitosan—a component of the fungal cell wall—significantly increases peroxidase activity and oxygen radical formation. Oxygen radicals in turn affect many biological events; they can directly damage the pathogen or stimulate the plant's defenses. Currently, little is known about the peroxidase-based defense as well as chitosan-induced signaling pathways of P. patens. The aim of the research presented in this thesis was to study the pathogens of green roof mosses and establishes the host range of the isolated pathogens; the study also utilized a Physcomitrella mutant collection to identify genes involved in chitosan-induced signaling pathway. Fungal species that naturally inhabit mosses at a moss farm in Japan and on green roof environments in southern Finland were isolated and the ability of these fungi to infect and cause disease symptoms on the model moss P. patens was tested. In addition, the pathogenicity of fungus species towards vascular plants was also assessed. To elucidate the genes involved in chitosan-induced peroxidase activity, part of the Physcomitrella mutant collection was screened using the oxidation of 2,2´-azino-bis(3-ethylbenzothiazoine-6-sulfonic acid) as an indicator of peroxidase activity. Genome walking analyses were used to identify which genes were mutated within each moss line of interest. The work described in this thesis demonstrates that mosses used for greening are colonized by many different fungal isolates. These studies reveal that several fungal genera such as Fusarium, Trichoderma, Phoma and Alternaria cause severe symptoms in P. patens. Moreover, our results demonstrate that mosses and vascular plants have common pathogens. The fungal isolates Fusarium avenaceum and Cladosporium oxysporum obtained from moss panels caused disease symptoms on barley and carrots, respectively, and also on two different moss species. The results also demonstrate that the Physcomitrella mutant collection is a valuable source for identifying genes involved in the chitosan-induced signaling pathway. Screening of part of the mutant collection and further analyses revealed that Rossmann fold protein is a significant part of the signaling chain leading to upregulated peroxidase activity induced by chitosan. In addition, this Rossmann fold protein is an important factor for normal lipoxygenase (LOX) expression and might contribute to defense against fungal pathogens. The results from this doctoral thesis provide new insights into the pathogens of green roofs, the host range of the pathogens and the molecular mechanisms involved in disease control and defense responses in moss. The knowledge gained concerning the pathogenicity of Trichoderma isolates and the host range of pathogenic fungi should be considered when planting moss farms and cultivating crops in close proximity to each other or when applying biological control agents containing Trichoderma species to green roofs. Furthermore, these results may encourage the use of the Physcomitrella mutant collection to identify candidate genes for signaling pathways to elucidate the molecular mechanisms underlying the defense responses of mosses. Viherrakentamisen avulla voidaan lievittää hellesaarekeilmiön ja hulevesien aiheuttamia ongelmia kaupunkiympäristössä. Sammalet ovat helppo ja kevyt ratkaisu viherrakentamiseen. Sammalet voivat selviytyä katolla, jossa elinolosuhteet voivat olla ajoittain hyvinkin ankarat ja lisäksi sammalet pidättävät kasvustoonsa merkittäviä määriä sadevesiä. Kuten putkilokasvit, myös sammalet sairastuvat kasvitauteihin. Kasveilla on monenlaisia puolustusmekanismeja. Kasvit tunnistavat spesifisten reseptorien välityksellä mikrobien molekulaarisia rakenteita, joita ei ilmene kasvin omien solujen pinnoilla. Näiden rakenteiden tunnistaminen voi käynnistää puolustusvasteita, jotka saattavat tehdä kasvin taudinkestäväksi. Malliorganismina käytetty nuppusammal aistii myös mikrobien molekulaarisia rakenteita. Nuppusammalen altistaminen kitosaanille, sienen soluseinän komponentille lisää merkittävästi peroksidaasiaktiivisuutta ja happiradikaalien muodostumista. Tutkimuksen tavoitteena oli määrittää sammalviherkattojen taudinaiheuttajia sekä eristettyjen taudinaiheuttajien isäntälajikirjoa. Lisäksi väitöskirjatutkimuksessa käytettiin nuppusammalen mutanttikokoelmaa kitosaanin indusoiman signaalireittiin osallistuvien geenien identifioimiseksi. Väitöskirjatyön tulokset osoittavat, että viheriöittämisessä käytetyt sammallajit asuttavat monia sieni-isolaatteja, joista Fusarium, Trichoderma, Phoma ja Alternaria -sukuihin kuuluvat sienet voivat aiheuttaa vakavia oireita nuppusammalelle. Tutkimuksissa havaittiin myös, että sammalilla ja putkilokasveilla on yhteisiä taudinaiheuttajia. Tulokset osoittavat, että nuppusammalen mutanttikokoelma on arvokas lähde kitosaanin indusoiman signaalireitin osallistuvien geenien tunnistamiseen. Mutanttikokoelman osittaisella seulonnalla osoitettiin, että proteiini, jossa on Rossmann-laskos, on merkittävä osa signaalireittiä, joka johtaa kitosaanin indusoimaan peroksidaasiaktiivisuuteen. Lisäksi tämä proteiini on tärkeä tekijä normaalissa lipoksigenaasin (LOX) ilmentymisessä. Väitöskirjatutkimuksen tulokset antavat uutta tietoa viherkattojen taudinaiheuttajista, niiden isäntälajikirjosta sekä molekyylimekanismeista, jotka liittyvät taudinpuolustukseen. Trichoderma-isolaattien taudinaiheuttamiskyvystä saatua tietoa voidaan hyödyntää käytettäessä Trichoderma-lajeja sisältäviä biologisia kasvinsuojeluaineita viherkatoilla. Lisäksi väitöskirjatyön tulokset voivat rohkaista nuppusammalen mutanttikokoelman käyttöä geenien tunnistamiseksi signalointireiteille sammalten puolustusvasteiden taustalla olevien molekyylimekanismien selvittämiseksi.

Neuromuscular disorders (NMD) are highly heterogenic with around 1000 reported different subtypes. Most are genetic in origin, and some 500 genes are currently identified to cause NMDs. Massively parallel sequencing (MPS) approaches have been widely used to increase the cost-effectiveness and diagnostic yield in the work-up of the genetic molecular diagnosis and to speed up the process. Copy number variants (CNVs), deletions and duplications larger than 50 base pairs, explain approximately 10% of the Mendelian disorders. No best practices pipelines have been developed yet for CNV analysis from MPS data. Therefore, the detection and verification of CNV findings has often involved complementary methods, such as array comparative genomic hybridization (array CGH), multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) and quantitative PCR approaches. Recently, various CNV detection programs have been developed, but for widely different types of designated research settings, which complicates choosing the correct approach for NMDs. These individual programs have generally exhibited less than ideal sensitivity and specificity for CNV detection. Our aim was to develop a comprehensive pipeline for the detection and annotation of CNVs with high accuracy from targeted gene panel sequencing and whole exome sequencing (WES) data of patients with NMDs. Four different CNV analysis programs were chosen for this study: CoNIFER, XHMM, ExomeDepth and CODEX. The targeted gene panel MYOcap includes 349 genes for myopathic disorders and MNDcap 302 genes for neurogenic disorders in their current panel versions. 2359 samples were sequenced with MYOcap, 942 samples with MNDcap and 262 samples with WES. This included for the targeted gene panels 24 positive control samples with previously characterized CNVs and 31 negative control samples with certain genes verified to not have CNVs. A detection sensitivity of 100% and specificity of 100% were reached for these control samples. Previously undetected CNVs from MYOcap or MNDcap sequenced samples were verified as true positive detections in 36 cases with MLPA, PCR or array CGH, and eight CNVs were verified as false positive detections. These and the positive control samples were utilized in validation of a predictive logistic regression model. In silico CNV generation into MYOcap sequenced samples provided 18,677 specific and 3892 unspecific CNV detections to initially train the model. The model was trained to differentiate true positive detections from false positive detections in order to increase the specificity of the CNV detection pipeline. The advantage of using four different CNV detection programs compared to using them individually, or with any other combination, was demonstrated by CNV detection sensitivity from the set of in silico CNVs. The predictive model with variables from all four programs provided the highest sensitivity (96.6%) and specificity (87.5%) for predicting CNV detections correctly, indicating an accuracy of 95.5% (95% CI 87.3–99.1%). The CNV detection pipeline together with the predictive model was validated for WES samples with control samples with 235 previously characterized CNVs. For CNVs spanning at least three exons, the detection sensitivity was 97.3% and the sensitivity of the predicative model was 99.3% after adjusting the model threshold for WES data. The CNV annotation platform cnvScan was expanded to contain the most recent CNV population databases as well as in-house CNV databases for all the sequenced sample sets. CNV detection results were filtered by < 1% frequency with reciprocal overlap of 90% in the common CNV population databases, with both it and < 5% frequency with 50% reciprocal overlap in the in-house CNV database, and by the true positive prediction with the model. These procedures significantly decreased the workload (with 3–13% of the original CNV detections preserved) in evaluating the CNVs further regarding clinical significance. The added value, i.e. the additional diagnostic yield from CNVs for both the targeted gene panel sequenced samples and WES samples was estimated to be 1.9%. Altogether 39 final genetic diagnoses were solved with these CNV findings. In addition, 18 patient cases had a likely pathogenic finding, and five had a heterozygous CNV likely pathogenic for a recessive disease without association to the patient’s phenotype. The clarified cases included six different DMD deletions or duplications causing dystrophinopathies. In three sequenced familial cases, the detected CNVs in CACNA1A, SGCD and TTN genes co-segregated with the disease. One case had two separate genetic diseases, tibial muscular dystrophy (TMD) and BMD, caused by the founder mutation FINmaj in the gene TTN and a deletion in DMD. Some of the solved cases had novel findings: the second ever reported large intragenic deletion in NEB causing dominant disease, and the first CNV, an intragenic deletion, in TIA1 in a patient diagnosed with Welander distal myopathy (WDM). Some of the genes associated with NMDs are challenging to analyze from short-read sequencing data due to homology or repetitive regions. An additional script was thus written to differentiate copy numbers of the highly homologous genes, SMN1 and SMN2. Two SMN1/SMN2 copy number 0/3 control cases were successfully recognized, and five cases were identified with a possible exon 7 conversion in SMN1 and a compatible spinal muscular atrophy phenotype. The latter findings were considered likely pathogenic and are awaiting further validation on the genomic level. Comparison of CNV detections within the in-house CNV database revealed divergences in the CNV detections within the triplicate repetitive region of NEB with potentially clinically significant changes. One array CGH validated change correlated well with the nemaline rod pathology observed in the patient. CNV analysis utilizing MPS data from targeted gene panels and WES samples provided increased diagnostic yield as reported also in other studies on NMDs. Our multi-algorithm and -platform approach decreased the workload in variant analysis and provided more insight into the many difficult to analyze genomic regions involved in NMDs. In the future, whole genome sequencing and long-read sequencing will likely provide higher resolution for CNV detections and reveal an even wider spectrum of structural genomic variants, together with other emerging comprehensive methods, such as optical mapping. Lihastaudit ovat hyvin heterogeenisiä, ja niistä on kuvattu noin tuhat alatyyppiä. Suurin osa on perinnöllisiä tauteja, ja tähän mennessä on tunnistettu noin 500 eri lihastauteja aiheuttavaa geeniä. Massiivista rinnakkaissekvensointia (MPS) on käytetty laajalti perinnöllisten tautien diagnostisen prosessin nopeuttamiseksi, kustannustehokkuuden parantamiseksi ja lopullisen geeniperäisen diagnoosin saavuttamiseksi. Kopiolukumuutokset, yli 50 emäsparin deleetiot tai duplikaatiot, aiheuttavat arviolta 10 % Mendelin mukaisesti periytyvistä taudeista. Kopiolukumuutosten havaitsemiseen sekvensointidatasta ei ole vielä kehitetty yleisesti hyväksyttyjä ja suositeltuja käytänteitä. Kopiolukumuutosten havaitsemiseksi ja varmistamiseksi käytetäänkin usein täydentäviä menetelmiä, kuten vertaileva genominen hybridisaatio sirulla (aCGH), rinnastettu ligaatio-riippuvainen alukemonistus (MLPA) ja kvantitatiivinen PCR. Kopiolukumuutosten havaitsemiseen sekvensointidatasta on kehitetty useita työkaluja vaihtelevissa tutkimusasetelmissa, mikä hankaloittaa oikean lähestymistavan valitsemista lihastaudeille. Yksittäisten ohjelmien on todettu tuottavan usein epätäsmällisiä ja herkkyydeltään vaihtelevia tai riittämättömiä havaintoja. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää kattava menetelmä kopiolukumuutosten havaitsemiseen ja annotointiin suurella tarkkuudella kohdennetun geenipaneelin ja koko eksomin (WES) sekvensointidatasta lihastautipotilailta. Tutkimukseen valittiin neljä kopiolukumuutosanalyysin työkalua: CoNIFER, XHMM, ExomeDepth ja CODEX. Kohdennetuista geenipaneeleista MYOcap kattaa 349 geeniä lihaspainotteisille taudeille ja MNDcap 302 hermopainotteisille taudeille nykyisissä paneeliversioissa. MYOcap:lla sekvensointiin 2359 näytettä, MNDcap:lla 942 ja WES:llä 262. Kohdennetuilla geenipaneeleilla sekvensointiin 24 positiivista kontrollinäytettä, joissa on aiemmin tunnistettu kopiolukumuutos, ja 31 negatiivista kontrollinäytettä, joissa tietyt geenit oli varmistettu kopiolukumuutoksia sisältämättömiksi. Kontrollinäytteille saavutettiin kehittämällämme menetelmällä 100 % havaitsemisherkkyys ja 100 % tarkkuus. MYOcap:lla tai MNDcap:lla sekvensoiduista näytteistä havaituista kopiolukumuutoksista 36 varmistettiin todellisiksi havainnoiksi MLPA:lla, PCR:lla tai aCGH:llä ja kahdeksan varmistettiin vääriksi positiivisiksi. Nämä ja positiiviset kontrollinäytteet sisällytettiin logistiseen regressioon perustuvan tilastollisen mallin validointiin. Erottelumallin kehitysvaiheessa MYOcap-sekvensoituihin näytteisiin tehtiin in silico kopiolukumuutoksia, mikä tuotti 18677 spesifiä ja 3892 ei-spesifiä kopiolukumuutoshavaintoa mallinnukseen. Malli kehitettiin erottelemaan todelliset kopiolukumuutoshavainnot vääristä positiivista havainnoista havaintomenetelmän tarkkuuden lisäämiseksi. Neljän ohjelman havaintojen käyttämisen paremmuus verrattuna ohjelmien käyttämiseen yksittäin tai muilla yhdistelmillä todennettiin in silico kopiolukumuutosten havaitsemisen herkkyyden tuloksilla. Erottelumalli, jossa oli muuttujia kaikilta neljältä ohjelmalta, saavutti korkeimman herkkyyden (96,6 %), täsmällisyyden (87,5 %) ja tarkkuuden 95,5 % (95 % CI 87,3–99,1 %) kopiolukumuutosten erottelulle. Kopiolukumuutoshavaitsemismenetelmä ja erottelumalli validoitiin WES-kontrollinäytteillä, joissa oli 235 aiemmin tunnistettua kopiolukumuutosta. Havaitsemisherkkyys kopiolukumuutoksille, jotka sisältävät vähintään kolme eksonia oli 97,3 %, ja erottelumallin herkkyys oli 99,3 % kunhan mallin arviointiraja oli uudelleensäädetty WES-datalle. Kopiolukumuutosten annotaatiotyökalu cnvScan laajennettiin sisältämään uusimmat kopiolukumuutospopulaatiotietokannat ja talonsisäinen kopiolukumuutostietokanta kaikista sekvensointinäytejoukoista. Alkuperäiset kopiolukumuutoshavainnot neljältä ohjelmalta suodatettiin 1 % enimmäisyleisyyden ja vastavuoroisen 90 % muutoksen kattamisen vaatimuksella yleisissä kopiolukumuutospopulaatiotietokannoissa, tällä sekä 5 % enimmäisyleisyyden ja vastavuoroisen 50 % muutoksen kattamisen vaatimuksella talonsisäisessä tietokannassa, ja lisäksi erottelumallilla todellisiin havaintoihin. Nämä toimenpiteet vähensivät merkittävästi työmäärää kliinisen merkityksen arvioinnille kopiolukumuutoksille säästäen 3–13 % alkuperäisistä havainnoista. Lisääntyneiden diagnoosien määrä kopiolukumuutoshavaintojen myötä sekä kohdennetuilla geenipaneeleilla että WES-sekvensoiduilla näytteillä oli noin 1,9 %. Kopiolukumuutoshavainnoilla saavutettiin 39 lopullista geneettistä diagnoosia potilaille. Lisäksi 18:lla tutkitulla oli todennäköisesti patogeeninen löydös, ja viidellä tutkitulla havaittiin heterotsygoottinen kopiolukumuutos, jonka arvioitiin olevan patogeeninen peittyvästi periytyvän taudin variantti ilman yhteyttä potilaan taudinkuvaan. Selvitettyihin tapauksiin sisältyi kuusi eri DMD-geenissä olevaa deleetiota tai duplikaatiota, jotka aiheuttivat dystrofinopatioita. Kolme potilasta, joilla oli oireisia perheenjäseniä, sekvensointiin perhetapauksina, ja havaitut kopiolukumuutokset geeneissä CACNA1A, SGCD ja TTN segregoituivat yhdessä taudin kanssa. Yhdellä tutkitulla havaittiin kaksi perinnöllistä tautia, tibiaalinen lihasdystrofia (TMD) ja BMD, joiden aiheuttajina olivat perustajamutaatio FINmaj TTN-geenissä ja deleetio DMD-geenissä. Osalla selvitetyistä tapauksista oli ennen havaitsemattomia löydöksiä: NEB-geenissä toinen koskaan raportoitu iso geeninsisäinen deleetio, joka aiheuttaa vallitsevasti periytyvän taudin, sekä TIA1-geenin geeninsisäinen deleetio, joka on ensimmäinen havaittu kopiolukumuutos TIA1:ssä Welanderin distaalimyopatiaa (WDM) sairastavalla potilaalla. Jotkin geeneistä, jotka on liitetty lihastauteihin, ovat haastavia analysoitavia lyhytlukuisesta sekvensointidatasta homologian ja toistojaksojen takia. Hyvin homologisille geeneille SMN1 ja SMN2 kehitettiin erillinen ohjelma erottelemaan geenien kopiolukumäärät. Kaksi kontrollitapausta tunnistettiin onnistuneesti SMN1 ja SMN2 kopiolukumäärillä 0 ja 3, ja lisäksi tunnistettiin viisi tapausta, joilla on mahdollisesti eksonin 7 konversio SMN1:ssä ja yhteensopiva spinaalinen lihasatrofia. Jälkimmäiset löydökset luokiteltiin todennäköisesti patogeeniseksi, ja ne odottavat genomista lisävarmistusta. Kopiolukumuutoshavaintojen vertailu NEB-geenin triplikaattitoistoalueella talonsisäisessä tietokannassa paljasti eroavaisuuksia, joilla on potentiaalisesti kliinisesti merkitystä. Yksi aCGH:llä varmistettu muutos korreloi selkeästi nemaliinisauvakappalepatologian kanssa, joka potilaalla oli havaittu. Kopiolukumuutoshavainnointi käyttäen sekvensointidataa kohdennetusta geenipaneelista tai WES-näytteistä lisäsi diagnoosien määrää kuten aiemmissa vastaavissa tutkimuksissa lihastaudeille. Käyttämämme usean algoritmin ja alustan lähestymistapa vähensi varianttianalyysin työmäärää ja tarjosi lisää tietoa useista hankalasti analysoitavista genomisista alueista, jotka on liitetty lihastauteihin. Tulevaisuudessa koko genomin sekvensointi ja pitkälukuinen sekvensointi tarjonnevat paremman resoluution kopiolukumuutoksille ja paljastavat enemmän rakenteellisia genomin muutoksia yhdessä muiden kehitteillä olevien kattavien menetelmien kanssa, kuten optinen kartoitus.

Background: A wide range of diseases, normal variations in physiology and development of different species are caused by alterations in gene regulation. The study of gene expression is thus crucial for understanding both normal physiology and disease mechanisms. High-throughput mea- surement technologies allow the profiling of tens of thousands of genes simultaneously. However, the high volume of data thus generated poses methodological challenges in inferring biological consequences from gene expression changes. Traditional gene wise analysis of high dimensional data is overwhelming, prone to noise and unintuitive. The analysis of sets of genes (gene set analysis, GSA), solves the problem by boosting statistical power and biological interpretability. Despite more than a decade of research on gene set analysis, there are still serious limitations in the existing methods. Aims of the study: The objectives of this study were: (1) development of an efficient p-value estimation method for GSA; (2) development of an advanced permutation method for GSA of multi-group gene expression data with fewer replicates; and (3) implementation of the developed methods for the identification of novel smoking induced epigenetic signatures at biological pathway level. Materials and methods: The first study involved the assessment of four different statistical null models for modeling the distribution of gene set scores calculated with the Gene Set Z-score (GSZ) function from permuted gene expression data. A new GSA method - modified GSZ (mGSZ) - based on GSZ and the most optimal distribution model was developed. mGSZ was evaluated by comparing its results with seven other popular GSA methods using four different publicly available gene expression datasets. The second study involved the evaluation of six different permutation schemes for GSA of multi-group (more than two groups) datasets based on the identification of reference gene sets generated using a novel data splitting approach. A new GSA method based on a modification of mGSZ (mGSZm) was developed by implementing the best permutation method for the analysis of multi-group data with fewer than six replicates per group. mGSZm was evaluated by contrasting its performance with seven other state-of-the-art GSA methods suitable for multi-group data. The evaluation was based on three different publicly available multi-group datasets. The third study involved an implementation of mGSZ for GSA of genome-wide DNA methylation data from the Cardiovascular Risk in Young Finns study (YFS) cohort with gene sets downloaded from the Molecular Signature Database (MSigDB). Methylation measurements were done on a subset of 192 individuals from whole-blood samples from the 2011 follow-up study using Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChips. Results: Overall, efficient and robust GSA methods were developed (studies I-II) and implemented (study III). In study I, the results demonstrated a clear advantage of asymptotic p-value estimation over empirical methods. mGSZ, a GSA method based on asymptotic p-values, requires fewer permutations which speeds up the analysis process. mGSZ outperformed state-of-the-art methods based on three different evaluations with three different datasets. In study II, results from a novel evaluation approach with two different datasets suggested that the proposed advanced permutation method outperformed the naive permutation method in GSA of multi-group data with fewer than six replicates. Evaluation of mGSZm, a GSA method equipped with the advanced permutation method and asymptotic n/a

Lynch syndrome (LS, previously known as hereditary non-polyposis colorectal cancer, HNPCC) is an inherited cancer predisposition syndrome caused by DNA mismatch repair (MMR) malfunction. MMR mechanism is a post-replicative repair pathway. The mismatch in the DNA is recognised and bound by MutSα, heterodimer of the proteins MSH2 and MSH6, or less often by MutSβ (MSH2+MSH3), after which the recruitment of MutLα (MLH1+PMS2) heterodimer initiates the repair process. Up to 90% of LS causing mutations are found in MLH1, MSH2 and MSH6 genes, whereas PMS2 has been suggested to be only a low-risk LS susceptibility gene due to small number of families segregating a disease causing PMS2 mutation. Cancer predisposition in Lynch syndrome is inherited dominantly through one defective MMR gene allele and tumorigenesis starts only after the loss of the second allele, giving rise most commonly to early-onset colorectal and endometrial cancers, and more rarely cancers of the uterine, stomach, urinary tract, ovary, small intestine or bile tract. The risk of developing colorectal cancer is higher in MLH1 and MSH2 mutation carriers than in MSH6 and PMS2 mutation carriers. However, the risk of developing endometrial cancer seems to be the highest in MSH6 mutation carriers. Early diagnosis of LS families and MMR gene mutation carriers is extremely important, since risk-reducing clinical surveillance and prophylactic surgeries have been shown to reduce cancer-related mortality. LS diagnosis is generally based on cancer history of the family and on tumour studies, followed by genetic testing to determine a predisposing mutation. However, the atypical clinical phenotypes such as late age at onset, lower penetrance and different tumour spectrums associated with MSH6 and PMS2 families, as well as the increasing number of variants of uncertain significance (VUS) found in sequencing, complicate LS diagnosis and highlight the need for pathogenicity assessment. The present work aimed to study the functional effect of lowered MMR gene expression as indication of Lynch syndrome and to assess the pathogenicity of MMR gene variants of uncertain clinical significance. Here, we studied how decreased MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 gene expression levels affect MMR efficiency. Using a stable shRNA knockdown approach we generated and studied altogether eleven cell lines retaining 23%, 50% and 74% of MLH1, 26%, 47% and 68% of MSH2, 50% and 79% of MSH6, and 19%, 33% and 53% of PMS2 mRNA expression. The results of an in vitro MMR assay showed that the repair efficiency was not only associated with gene expression level but the expression decrease affected different genes differently. For MSH2 and MSH6 genes, an expression decrease to 75% already caused a significant decrease in MMR efficiency, while for PMS2 the repair capability decreased significantly near the mutation carrier level (~50%), and for MLH1 gene only at the lowest expression level (23%). Unexpectedly, 19% and 33% of PMS2 expression resulted in higher MMR efficiency than the carrier-like level, 53%, suggesting some kind of functional compensation for PMS2 repair activity in the cell. The functional significance of five MLH1 and four MSH2 VUSs found in suspected LS families was determined by the in vitro MMR assay. For that, nine recombinant MLH1 and MSH2 protein variants were used to complement MMR-deficient cancer cell lines lacking the normal respective protein. A MMR gene variant whose protein retained repair efficiency in the assay was determined MMR proficient, while variants that resulted in the lack of repair were determined MMR deficient. Here, the MLH1 variants p.Leu348Ser, p.Arg474Pro and p.Glu605Ala were shown to be MMR proficient and p.Gly101Ser and p.Leu260Arg deficient, while only one MSH2 variant p.Lys82Glu was MMR proficient and the variants p.Gly669Val, p.Phe694Ser and p.Pro696Leu deficient. Our results, together with the clinical and tumour data collected from the families, allowed the pathogenicity assessment of the MMR gene variants and Lynch syndrome diagnosis in the families. Findings from these studies provide new insights into the severity of the malfunction that decreased levels of different MMR genes expression may cause. Furthermore, the results show that the functional assessment of variants of uncertain significance considerably helps their pathogenicity assessment. Both of these findings may have an important impact on Lynch syndrome diagnosis in future. Lynch oireyhtymä (LS, aiempi nimi periytyvä ei-polypoottinen paksusuolisyöpä, HNPCC) on perinnöllinen syöpäalttiusoireyhtymä, joka liittyy puutteelliseen emäspariutumavirheiden korjaukseen (mismatch repair, MMR). MMR–mekanismi on DNA:n kahdentumisen eli replikaation jälkeen toimiva korjausmekanismi, jossa MSH2- ja MSH6-proteiinien muodostama heterodimeeri, MutSα, tai harvemmin MutSβ (MSH2 ja MSH3), tunnistaa ja sitoutuu virheeseen, jonka jälkeen MutLα (MLH1+PMS2) -proteiinikompleksin sitoutuminen siihen käynnistää korjausprosessin. Jopa 90% Lynch oireyhtymää aiheuttavista mutaatioista on löydetty MLH1-, MSH2- ja MSH6-geeneistä. Neljännen PMS2- alttiusgeenin on oletettu olevan vain matalan riskin alttiusgeeni, koska siitä löydetyt taudille altistavat mutaatiot ovat suhteellisen harvinaisia. LS periytyy vallitsevasti toiselta vanhemmalta, mutta syövän kehitys alkaa vasta kun toinenkin MMR-geenin kopio eli alleeli inaktivoituu. Syövät kehittyvät nuorella iällä yleisimmin paksusuoleen ja kohdunrunkoon, mutta kasvaimia voi kehittyä myös muun muassa mahalaukkuun, virtsateihin, munasarjoihin, ohutsuoleen ja sappiteihin. MLH1- ja MSH2 mutaatioiden kantajilla on korkeampi paksusuolisyöpäriski kuin MSH6- ja PMS2-mutaatioiden kantajilla, mutta riski kohdunrungon syöpään on havaittu olevan korkein MSH6-mutaation kantajilla. MMR-geenimuutosten kantajien ja LS-perheiden varhainen tunnistaminen on erityisen tärkeää, sillä korkean syöpäriskin henkilöille suunnatun ennaltaehkäisevän kliinisen seurannan ja kirurgisten toimenpiteiden on osoitettu vähentävän syöpäkuolemia huomattavasti. Nykyinen LS-diagnostiikka perustuu vahvasti syöpäpotilaan perheen syöpähistoriaan ja kasvaintutkimuksiin, jonka jälkeen syöville altistava geenimuutos pyritään löytämään geenitesteillä. Diagnosointia kuitenkin vaikeuttavat MSH6- ja PMS2-perheiden epätyypilliset kliiniset ilmiasut ja matalampi taudin penetraatio, sekä sekvensoinnilla MMR-geeneistä löytyvä alati kasvava määrä geenivariantteja, joiden kliininen merkittävyys on tuntematon (variant of uncertain significance, VUS) ja joiden patogeenisuuden todentaminen on siksi diagnoosin tekemiselle ensiarvoisen tärkeää. Tämän työn tavoitteena oli toiminnallista in vitro MMR-testiä käyttämällä selvittää neljän eri MMR-geenin alentuneen ilmentymisen (ekspression) vaikutusta geenin koodaaman proteiinin korjaustehokkuuteen osoituksena Lynch-oireyhtymästä sekä yhdeksän MLH1- ja MSH2-geeneistä löydetyn VUS:n patogeenisuus. Erityisenä tavoitteena oli selvittää miten erilaiset MLH1-, MSH2-, MSH6- ja PMS2-geenien alentuneet ilmentymistasot vaikuttavat geenien MMR-korjauskykyyn. Käyttäen stabiilia shRNA-hiljennysmenetelmää työssä rakennettiin ja tutkittiin yhteensä 11 solulinjaa, joissa oli 100% kontrolliin verrattuna jäljellä joko 23%, 50% tai 74% MLH1 mRNA:ta, 26%, 47% tai 68% MSH2 mRNA:ta, 50% tai 79% MSH6 mRNA:ta, tai 19%, 33% tai 53% PMS2 mRNA:ta. Toiminnallisella in vitro MMR-testillä osoitimme, että MMR-proteiinien korjauskyky ei pelkästään liittynyt geenien ilmentymistasoihin, mutta mRNA:n määrän väheneminen vaikutti varsin eri lailla eri geeneissä. Merkitsevä korjauskyvyn heikkeneminen tapahtui MSH6-geenillä jopa jo 79%:n ja MSH2-geenillä 68%:n ilmentymistasolla, kun taas PMS2-geenillä merkittävä korjaustehokkuuden lasku havaittiin mutaation kantajan tasoa vastaavalla ilmentymistasolla (53%). Sen sijaan MLH1-geenillä vastaava toiminnan heikentyminen vaati selkeästi suuremman laskun mRNA:n määrässä (23% jäljellä normaalitasosta). Huomattavaa oli, että PMS2-geenillä 19%:n ja 33%:n ilmentymistasoilla saavutettiin korkeammat MMR-tehokkuudet kuin 53%:n tasolla. Tämä voisi selittyä jonkinlaisella solun sisäisellä toiminnallisella kompensaatiomekanismilla. Toiminnallista MMR-testiä käytettiin myös selvittämään epäillyistä Lynch syndrooma-perheistä löydettyjen viiden MLH1- ja neljän MSH2-geenin VUS:ien vaikutusta proteiinien korjauskykyyn. Siinä variantin sisältämällä rekombinanttiproteiinilla komplementoitiin solulinjauute, joista kyseinen normaali MMR-proteiini oli poistettu. Variantit, joiden rekombinanttiproteiini palautti korjaustehokkuuden, tulkittiin MMR-toiminnallisiksi ja ne, jotka eivät kyenneet palauttamaan korjauskykyä, tulkittiin MMR-toimimattomiksi. Tutkituista MLH1-varianteista p.Leu348Ser, p.Arg474Pro ja p.Glu605Ala palauttivat korjauskyvyn ja tulkittiin MMR-toiminnallisiksi, kun taas p.Gly101Ser ja p.Leu260Arg tulkittiin MMR-toimimattomiksi. MSH2-varianteista ainoastaan p.Lys82Glu palautti korjauskyvyn, kun taas p.Gly669Val, pPhe694Ser ja p.Pro696Leu tulkittiin MMR-toimimattomiksi. Yhdessä perheistä kerätyn kliinisen tiedon ja syöpäkasvaimista kerätyn tiedon kanssa tuloksemme mahdollistivat MMR-geenivarianttien patogeenisyyden luotettavan arvioinnin ja LS diagnoosin tekemisen tai poissuljennan perheissä. Tämä väitöskirja tuotti täysin uutta tietoa MMR-geenien erilaisten ilmentymistasojen vaikutuksista solujen MMR-korjauskykyyn. Lisäksi tulokset osoittivat, että VUS:ien toiminnallinen analysointi auttaa huomattavasti kyseisten varianttien patogeenisuuden arvioinnissa. Näistä havainnoista voi olla suuresti hyötyä Lynch oireyhtymän diagnosointiin tulevaisuudessa.

The tumor suppressor kinase, LKB1 (encoded by STK11), plays important functions in regulating diverse cell processes, including cell growth, metabolism, and polarity. As a bioenergetic sensor, LKB1 is required for metabolic balancing and maintenance of stem cell homeostasis in the haematopoietic system (Gurumurthy et al. 2010; Gan et al. 2010; Nakada, Saunders, and Morrison 2010) and in muscle (Shan et al. 2014). Intestinal stem cells (ISCs) are regulated by various cues from their niche-derived paracrine signals such as NOTCH and WNT (Clevers and Batlle 2013), and metabolic status (Rodríguez-Colman et al. 2017; Schell et al. 2017). Study I of this thesis aimed to investigate whether the metabolic regulator, LKB1, has a role in actively cycling ISCs, and identified it as a critical factor for maintaining ISC homeostasis. Mechanistically, LKB1 represses the transcription of the secretory lineage gatekeeper, Atoh1, via pyruvate dehydrogenase kinase 4 (PDK4) in ISCs and restricts ISC differentiation towards secretory cell lineages. These findings define LKB1 as an essential regulator of ISCs, and provide a connection between metabolism and fate determination of ISCs. Germline mutations inactivating LKB1 lead to gastrointestinal tumorigenesis in Peutz-Jeghers Syndrome (PJS) patients (Ylikorkala et al. 1999) and mouse models (Rossi et al. 2002; Bardeesy et al. 2002). However, little is known about the cell types and signaling pathways that underlie tumor formation, not much has been learnt about the progression of PJS polyposis neither. The upregulation of Cyclooxygenase-2 (COX-2) is a feature of PJS polyposis (Rossi et al. 2002; H. Takeda et al. 2004), and COX-2 inhibition reduces polyp growth in Lkb1+/− mice modelling PJS polyposis (Udd et al. 2004). Study II of this thesis evaluated the effect of the mutagenic carcinogen, N-methylnitrosourea (MNU), on gastrointestinal tumorigenesis in Lkb1+/− mice and concluded that MNU aggravates Peutz-Jeghers polyposis independently of COX-2. Study III of this thesis demonstrated that the loss of Lkb1 in mesenchymal progenitor or stromal fibroblasts leads to the clonal expansion of stromal cells and to the induction of an inflammatory program involving the IL-11–JAK/STAT3 pathway, which is critical for tumorigenesis. The findings from Studies II and III provide further understanding of the function of LKB1 in Peutz-Jeghers tumorigenesis, and suggest potential therapeutic avenues for related tumor diseases. Tuumorinsuppressorikinaasi LKB1 (STK11) säätelee useita erilaisia ​​soluprosesseja, kuten solujen jakautumista, aineenvaihduntaa ja polaarisuutta. LKB1 ylläpitää homeostaasia ja metabolista tasapainoa veren kantasoluissa (Gurumurthy ym. 2010; Gan ym. 2010; Nakada, Saunders ja Morrison 2010) sekä lihaksissa (Shan ym. 2014). Suolen kantasolujen homeostaasia säätelevät erilaiset kantasolujen mikroympäristön solujen lähettämät parakriinisignaalit, kuten NOTCH ja WNT -ligandit (Clevers ja Batlle 2013). Tämä lisäksi suolen kantasolujen toimintaa säätelee myös solun metabolinen tila (Rodríguez-Colman ym. 2017; Schell ym. 2017). Tämän väitöskirjatyön ensimmäisen osatyössä osoitettiin, että LKB1 ylläpitää suolen kantasoluja estämällä transkriptiofaktori Atoh1:n ilmentymistä pyruvaattidehydrogenaasikinaasi 4: n välityksellä kantasoluissa, ja rajoittaa täten suolen epiteelisolujen erilaistumista erityssoluiksi. Nämä löydokset osoittavat, että LKB1 ylläpitää solun metabolista tasapainoa ja sitä kautta säätelee suolen kantasolujen toimintaa. Ituratamutaatiot LKB1:ssa aiheuttavat perinnöllistä Peutz-Jeghersin syndroomaa (PJS), jossa potilaille kehittyy mahasuolikanavan kasvaimia. Tuumorigeneesiä aiheuttavat solutyypit ja mekanismit ovat suurelta osin tuntemattomia. Cyclooxygenase-2 (COX-2) -entsyymin aktivaatio on yleistä PJS polypoosissa (Rossi et al. 2002; H. Takeda et al. 2004), ja COX-2 inhibitio vähentää tuumorigeneesiä Lkb1+/− -hiirissä, jotka toimivat PJS:n hiirimallina (Udd et al. 2004). Tämän tutkimuksen toisessa osatyössä tutkittiin mutageenisen syöpää aiheuttavan N-metyylnitrosourean (MNU) vaikutusta maha-suolikanavan tuumorigeneesiin Lkb1+/− -hiirissä. Työssä osoitettiin, että MNU pahentaa PJS-polypoosia COX-2:sta riippumatta. Kolmannessa osatyössä osoitettiin, että Lkb1:n poisto mesenkyymin esiastesoluissa tai fibroblasteissa johtaa stroomasolujen klonaaliseen laajentumiseen ja tulehdusvasteeseen, joka aktivoi tuumorigeneesille kriittisen IL-11 – JAK/STAT3-signaalireitin. Osatöistä II ja III saadut tulokset lisäävät tietoa LKB1:n toiminnasta PJS-tuumorigeneesissä, ja avaavat uusia näkökulmia PJS-tuumorigeneesin hoidon kehittämiseen.

This thesis addresses the genetic background of hip dysplasia, a complex hereditary disorder common in many species, including dogs and humans. The highly polygenic nature of hip dysplasia has become evident after many years of arduous research conducted in numerous studies that have explained only a small proportion of the disease heritability in dogs. The studies included in this thesis revealed multiple new loci, a novel regulatory variant for a gene that is imperative to normal joint development and validated numerous loci that have been associated with the disorder. In Study I, genome-wide association analyses uncovered four loci that associated with the disorder with either protective or risk effects. A subsequent targeted resequencing and variant analysis found disease associated variants for multiple genes. Deletion variants in the putative regulatory region of the gene NOG were found to protect against moderate-to-severe hip dysplasia. These variants were shown to downregulate reporter gene expression in vitro. In Study II, different hip dysplasia and osteoarthritis phenotypes were investigated. The genome-wide association analyses revealed three novel loci associated with hip joint incongruity and osteoarthritis. New candidate genes were identified: NOG and NANOS1 for hip joint incongruity and NOX3 and ARID1B for osteoarthritis. In Study III, a total of 21 loci on 14 different chromosomes were validated in across- and within-breed association analyses in a large cohort of dogs comprised of 10 breeds. One locus was specific to the across-breed data. Neddylation-pathway was found to be significantly enriched in a candidate gene set that included 254 genes from the 21 validated loci. These studies have generated new, long-awaited knowledge about the complex genetic background of hip dysplasia and related osteoarthritis in dogs. They also highlighted that mild hip dysplasia and the more severe disease forms may be induced by partially different genetic factors. Validation of associated loci for hip dysplasia has not been conducted to this extent before these studies, so an important step forward was taken in our latest study. Finally, finding causal variants has been uncommon. The regulatory NOG variants were an exciting finding, although their causality in hip dysplasia is yet to be revealed. Overall, our studies emphasise the complexity of the genetic background of hip dysplasia. Tässä väitöskirjatutkimuksessa selvitettiin lonkkaniveldysplasian geneettistä taustaa. Lonkkaniveldysplasia on yleinen monitekijäinen sairaus, jota esiintyy kaikilla nisäkkäillä, kuten koirilla ja ihmisillä. Tämän sairauden perinnöllistä taustaa on selvitetty monissa eri tutkimuksessa lähes kahden vuosikymmenen ajan, mutta tulokset ovat selittäneet vain pienen osan sairauden periytymisasteesta. Tutkimuksemme toi esiin useita uusia perimän alueita, jotka liittyvät sairauteen. Löysimme myös uuden perimän muutoksen, joka sijaistee nivelten normaalille kehitykselle oleellisen geenin mahdollisella säätelyalueella. Lisäksi vahvistimme useita aiemmin julkaistuja perimän alueita. Ensimmäisessä osatyössä löysimme neljä perimän aluetta kahdessa eri kromosomissa, jotka liittyivät lonkkaniveldysplasiaan, ja joilla oli joko lonkkaniveldysplasialta suojaavia tai sairastumisriskiä lisääviä vaikutuksia. Yhden tällaisen alueen kohdennettu sekvensointi ja varianttianalyysi paljasti useita muutoksia koirien perimässä, jotka liittyivät lonkkaniveldysplasian ilmiasuun. NOG-geenin mahdollisella säätelyalueella olevat 24-27 emäksen häviämien havaittiin suojaavan koiria vakavammilta lonkkaniveldysplasian muodoilta. Osoitimme, että nämä häviämät vähensivät reportterigeenin ekspressiota in vitro. Toisessa osatyössä tutkimme erilaisia lonkkaniveldysplasiaa kuvaavia ilmiasuja sekä nivelrikkoa. Perimänlaajuinen assosiaatioanalyysi paljasti kolme perimän aluetta kolmesta eri kromosomista, jotka liittyivät eri lonkkanivelen epäyhdenmukaisuutta eli inkongruenssia kuvaavaan ilmiasuun sekä nivelrikkoon. Löysimme näiltä perimän alueilta useita kandidaattigeenejä. Geenit NOG ja NANOS1 sijaitsivat lonkan inkongruenssiin liittyvällä alueella, kun taas geenit NOX3 ja ARID1B olivat nivelrikkoon liittyvällä perimän alueella. Kolmannessa osatyössä käytimme suurta, kymmenen eri rotua sisältävää, aineistoa ja suoritimme analyysit sekä rotujen välillä että niiden sisällä. Vahvistimme yhteensä 21 perimän aluetta neljässätoista eri kromosomissa. Yksi näistä alueista ilmeni vain analyysissä, joka tehtiin yli rotujen. Vahvistetuilta perimän alueilta kootuista 254 kandidaattigeenistä tehtiin vuorovaikutusanalyysi, jossa havaitiin, että neddylaatio-polku oli rikastunut tässä geenisarjassa. Tämä väitöskirjatutkimus on tuottanut merkittävää uutta tietoa lonkkaniveldysplasian sekä nivelrikon perinnöllisestä taustasta. Tuloksemme korostavat, että lievä lonkkaniveldysplasia eroaa tämän sairauden vakavammista muodoista perimän tasolla. Lonkkaniveldysplasiaan liittyvien perimän alueiden validointi on ollut harvinaista ennen tätä tutkimusta, joten useiden perimän alueiden vahvistaminen tässä väitöskirjatutkimuksessa oli huomattava edistysaskel tutkimusalalle. Myös kausaalisten perimän muutosten löytäminen on ollut hidasta. NOG-geenin häviämä-muutosten löytäminen ja niiden funktionaalisen merkityksen osoittaminen oli erityisen arvokasta, vaikka niiden kausaalisuus lonkkaniveldysplasiaan on vielä osoittamatta. Kaikkiaan tässä väitöskirjatutkimuksessa tuotettu tieto korostaa sitä, kuinka monimutkainen lonkkaniveldysplasian perinnöllinen tausta oikeasti on.

Our studies focused on using Candida glabrata (C. glabrata) as a model organism to isolate and investigate the role of C. glabrata cell wall proteases as host protein- degrading virulence factors and the inhibition of their action. The cell wall proteins of microbes are in the frontline of first contact with the host cells in oral mucosa. C. glabrata is the second most prominent Candida yeast, and it is commonly found in the normal oral microbial flora causing opportunistic yeast infections, particularly in hospitalized patients. It is considered innately azole- resistant and treatment is more difficult compared to the typical Candida albicans (C. albicans) infections. Azoles are the most commonly used antifungal agents used in candidosis. There is an urgent need of development of topical antimicrobial agents, and wild berries such as lingonberry, have been increasingly studied. Lingonberries are known to have antioxidant, anti-inflammatory, antimicrobial and anticancerous properties and are considered beneficial to health. To this background we studied in vitro and in vivo the effects of a patented, fermented lingonberry juice (Lingora®, from now on abbreviated as FLJ). It was specially developed to be used as a mouthwash on C. glabrata and other typical microbes of the oral flora related to yeast infections and caries. Our primary goal was to isolate, identify and characterize C. glabrata cell wall proteases with biochemical methods: enzymatic treatment of C. glabrata cells, MDPF-zymography, SDS-PAGE, 2D-PAGE and LC-MS/MS. These methods may be used to isolate and identify novel Candida cell wall proteases enabling their further characterization and inhibition studies. Further in vitro studies were conducted on the effect of FLJ on intracellular protein expression of C. glabrata with the 2D-DIGE method. The proteins were identified by LC-MS/MS. The inhibition of proliferation and invasion of two aggressive oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC) lines (HSC-3, SCC-25) with FLJ and curcumin were measured in vitro by colorimetric ELISA and three- dimensional Myogel spheroid assay. Finally, we conducted a clinical pilot study including oral examinations, microbial cultivations and measurements of active MMP-8 concentrations using PerioSafe® point-of-care test. FLJ was used as a mouthwash to see if it has also in vivo effects on three microbes of the oral microbiota. From the C. glabrata cell wall we identified a novel, uncharacterized 25 kDa serine protease, Cwp1.2., with an estimated pI of 7.6 and gelatinolytic activity. This activity was inhibited by PMSF, a known serine protease inhibitor. Certain C. glabrata intracellular protein expressions related to glycolysis, oxidative phosphorylation, oxidative stress and biofilm formation were significantly diminished after treatment with FLJ. These proteins include e.g. heat shock protein and redoxin, which are expressed by C. glabrata when predisposed to stress. Downregulation of these proteins causes C. glabrata cells to be more vulnerable to environmental stress and may cause lower virulence. FLJ showed to inhibit proliferation and invasion of two aggressive OTSCC cell lines similar to curcumin. FLJ is safe, has no known interactions with medications and could be studied to be used as an adjunctive therapy in management of OTSCC. The clinical mouthwash pilot study with FLJ results showed statistically significant reduction in Candida and S. mutans counts. Our in vitro studies also indicate growth inhibitory effect on the most common periodontitis- related bacteria. Bleeding on probing (BOP), visible plaque index (VPI) and trend of active matrix metalloprotease-8 (aMMP-8) values were also reduced during the FLJ mouthwash period. Lactobacilli counts increased during the mouthwash period. Although lactobacilli are thought to be related to caries the clinical parameters and clinical outcome indicate a balancing effect on the oral microbial flora from a dysbiotic to a symbiotic direction. This diminished microbial related inflammatory burden should be studied further in context with broader positive general health effects. The results show several beneficial aspects of FLJ in the oral environment. The methodology used in these studies might be applicable to other oral microbes in developing novel antimicrobial agents related to cell wall proteases of Candida. Combined in vitro and in vivo studies showed effects of FLJ on C. glabrata intracellular proteins, host cell derived proteins including anti-inflammatory effects, tongue carcinoma cells and oral microbiota. Suun paikallishoitona käytettäviä aineita on rajatusti ja nykytutkimus on laajentunut luonnonmarjojen tutkimiseen. Marjojen katsotaan olevan osa terveellistä ruokavaliota. Puolukalla tiedetään olevan antioksidatiivisia, anti-inflammatorisia, antimikrobiaalisia ja tiettyjä syöpiä ehkäiseviä ominaisuuksia, mutta sen vaikutuksia suuhun ei ole tutkittu. Suukäyttöön soveltuvaksi puolukkamehusta poistettiin patentoidulla menetelmällä valtaosa luontaisista sokereista fermentoimalla (Lingora®). Sen vaikutuksia tutkittiin sekä laboratoriokokeilla että kliinisesti suun hiivasienitulehduksissa esiintyvien Candida- lajien ja karieksessa esiintyvien mikrobien (Streptococcus mutans, laktobasillit) kasvua ehkäisevänä aineena. Lisäksi laboratoriokokeessa tutkittiin fermentoidun puolukkamehun vaikutusta kahden aggressiivisen kielisyöpäsolulinjan jakaantumiseen ja leviämiseen. Candida glabrata (C. glabrata) on toiseksi yleisin suun mikrobiomissa esiintyvä Candida- hiivasienilaji, joka aiheuttaa vaikeita tulehduksia varsinkin sairaalapotilailla. Mikrobien soluseinä on kontaktissa suun limakalvon soluihin ja yksi tutkimusten tavoite olikin käyttää C. glabrataa malliorganismina ja tunnistaa uusia C. glabratan soluseinän proteaaseja sekä tutkia fermentoidun puolukkamehun vaikutusta C. glabratan solunsisäisten proteiinien määrään, joilla saattaa olla merkitystä sen taudinaiheuttamiskyvylle. C. glabratan soluseinästä löydettiin uusi proteaasi, jota tutkimalla on mahdollista kehittää uusia hiivasienilääkkeitä. Tutkimuksissa käytettyjä menetelmiä voi soveltaa proteaasien tutkimukseen muillakin mikrobeilla uusien antimikrobiaalisten aineiden kehittämisessä. C. glabratan solunsisäiseen aineenvaihduntaan ja stressinsietoon liittyvien proteiinien määrät vähenivät fermentoidulla puolukkamehulla. Tällä on hiivasienten kasvua sekä mahdollisesti taudinaiheuttamiskykyä heikentävä vaikutus. Laboratoriokokeissa fermentoitu puolukkamehu esti myös merkittävästi kielisyöpäsolujen kasvua ja leviämistä. Kliinisessä kokeessa fermentoitu puolukkamehu esti merkittävästi Candida- hiivasienten ja Streptococcus mutans- bakteerien kasvua. Laktobasillien määrä lisääntyi, jonka katsotaan olevan hyödyllistä yleisterveydelle. Ienverenvuoto (BOP) ja näkyvän plakin määrä (VPI) vähenivät myös ja aMMP-8 määrässä näkyi laskeva trendi. Jatkotutkimukset ovat meneillään. Fermentoitu puolukkamehu on turvallinen, eikä sillä ole tunnettuja merkittäviä lääkeaineinteraktioita. Nämä laboratorio- ja kliinisen kokeen tulokset osoittavat sillä olevan useita hyödyllisiä vaikutuksia ja sitä voidaan käyttää suun kotihoidon tukena.

Although most cancers are sporadic, a considerable proportion is due to genetic susceptibility. Many cancer types display moderate to high heritability, but predisposition genes have been established for only a few. In this thesis project, we have utilized the data in the Finnish Cancer Registry (FCR) and the Population Information System (PIS) databases to identify cancer patients with a potential genetic predisposition. For most of the patients in the FCR archival tissue material in the form of paraffin-embedded formalin-fixed (FFPE) blocks is available in the pathological department of their local hospital, which makes genetic studies on selected cases possible. The Finnish population is due to its demographic history more homogenous than most populations, and thus optimal for studies on germline predisposition to disease. This thesis includes studies on two cancer types currently lacking well-established susceptibility genes: lung adenocarcinoma (LUAD), and angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL). In addition, my thesis work examines esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and hereditary diffuse gastric cancer (HDGC) susceptibility. A fraction of these cancers can be attributed to germline mutations in RHBDF2 and CDH1, respectively. We utilized exome sequencing in all studies with the aim to discover novel susceptibility genes for the different phenotypes. Gastric cancer is the second leading cause of cancer mortality. Three distinct hereditary gastric cancer syndromes are recognized: HDGC, familial intestinal gastric cancer, and gastric adenocarcinoma and proximal polyposis of the stomach. Up to one third of HDGC families have heterozygous germline mutations in CDH1, which encodes E-cadherin. Most cases showing familial aggregation do not, however, have a known genetic basis. The aim of the first study was to find the putative cancer-predisposing gene defect in an HDGC family that had previously been tested negative for CDH1 mutations. We identified three candidate variants: p.Glu1313Lys in INSR, p.Arg81Pro in FBXO24 and p.Pro1146Leu in DOT1L. INSR is of special interest as insulin signaling has been shown to modulate E-cadherin glycosylation and stability. ESCC represents the most common subtype of esophageal cancer, a common and often fatal malignancy. Although ESCC shows familial clustering and moderate to high heritability, few studies on moderate to high penetrance predisposition exist. We have previously found familial aggregation of classic Kaposi sarcoma by performing family name at birth and municipality at birth based clustering of all cancer cases in the FCR. In study II, we used the same clustering algorithm to find potential familial cases of ESCC. We managed to find a geographical population subset that showed enrichment of clustered ESCC patients. The finding may indicate that a susceptibility variant is enriched in this population subset. We collected FFPE tissue material and exome sequenced a total of 30 ESCC cases. Six variants passed filtering and analysis criteria, the most frequent being a nonsense mutation in DNAH9 detected in four unrelated patients. One patient's tumor showed loss of the wild type allele of DNAH9, suggesting a tumor-suppressive function. The other candidate genes GKAP1, BAG1, NFX1, FCSK, and DDOST harbored missense variants. A rare variant in EP300, a gene that has previously been implicated in ESCC carcinogenesis, was discovered to segregate in three affected individuals in a single family. Lung cancer is the most common cancer in the world and the leading cause of cancer death in both men and women. It is well established that the primary cause of the malignancy is cigarette smoke, however, other factors are involved as only approximately 15% of smokers develop lung cancer and an estimated 10-25% of all lung cancers occur in never smokers. Gender influences the risk of lung cancer and women are overrepresented among never smokers with the disease. Because of a possible difference in the molecular basis, we chose to study never-smoker women with LUAD in study III. We selected the youngest patients listed in the FCR, who are more likely to harbor a predisposing germline mutation. We managed to collect normal FFPE tissue material from 21 never-smoker women who had been diagnosed with lung adenocarcinoma before the age of 45. Potentially pathogenic variants were found in eight Cancer Gene Census germline genes: BRCA1, BRCA2, ERCC4, EXT1, HNF1 A, PTCH1, SMARCB1, and TP53. The variants in TP53, BRCA1, and BRCA2 are very likely to have contributed to the early-onset lung cancer in the respective patients. This supports the idea that lung adenocarcinoma can be a component of certain cancer predisposition syndromes. In addition, fifteen genes displayed potentially pathogenic mutations in at least two patients: ABCC10, ATP7B, CACNA1S, CFTR, CLIP4, COL6A1, COL6A6, GCN1, GJB6, RYR1, SCN7A, SEC24A, SP100, TTN, and USH2A. Some of these candidate genes may explain a subset of female lung adenocarcinoma. AITL is a subtype of peripheral T-cell lymphoma with a bleak prognosis. Somatic driver mutations have been found in TET2, IDH2, DNMT3A, RHOA, FYN, PLCG1, and CD28, whereas germline susceptibility to AITL has to our knowledge not been studied. In study IV we performed an exome-wide rare variant analysis in 23 AITL patients. No germline mutations were found in the driver genes, indicating that they are not frequently involved in genetic AITL predisposition. Potentially pathogenic variants present in at least two patients and showing significant enrichment in our sample set were found in ten genes: POLK, PRKCB, ZNF676, PRRC2B, PCDHGB6, GNL3L, TTC36, OTOG, OSGEPL1, and RASSF9. The most significantly enriched variants were p.Lys469Ter in a splice variant of POLK and p.Pro588His in PRKCB. These two are intriguing candidates, as Polk deficient mice display a spontaneous mutator phenotype and PRKCB has been found somatically mutated in 33% in adult T-cell lymphoma, another form of peripheral T-cell lymphoma. These studies show that rarely performed next-generation sequencing of DNA extracted from FFPE tissue samples is well suited for research and should be utilized to a greater extent. We found plausible candidate genes for the phenotypes under study. However, due to relatively small sample sets, our findings need to be genetically validated in independent sample series and through functional studies to prove causality. Syövän syntyyn vaikuttavat ympäristötekijät, sattuma sekä perimä. Valtaosa syövistä on sporadisia, eli ne kehittyvät pääosin ympäristötekijöiden (joihin lukeutuvat elintavat) ja sattuman seurauksena. Osa kuitenkin aiheutuu ensisijaisesti geneettisestä alttiudesta. Geneettinen alttius muodostuu riskimutaatioista ituradassa, ja nämä mutaatiot sekä niiden aiheuttamat riskit periytyvät vanhemmilta lapsille. Useita alttiusgeenejä ja -mutaatioita on jo tunnistettu ja karakterisoitu, mutta on todennäköistä, että huomattava määrä on yhä löytämättä. Tämän väitöskirjan osatöissä tutkimme eksomisekvensoinnin avulla perinnöllistä alttiutta neljälle eri syövälle: diffuusille mahasyövälle, ruokatorven levyepiteelisyövälle, keuhkon adenokarsinoomalle sekä angioimmunoblastiselle T-solulymfoomalle. Tavoitteenamme oli löytää uusia alttiusgeenejä näille syöpätyypeille ja sitä kautta lisätä ymmärrystä syövän syntymekanismeista sekä edistää kyseisten syöpien ennaltaehkäisyä ja hoitoa. Suomen väestö on geneettisesti yhtenäinen, eli siinä on vähemmän vaihtelua kuin väestöissä yleensä, mikä helpottaa tauteja aiheuttavien geenimuutosten löytämistä. Hyödynsimme geneettiseen tutkimukseen hyvin soveltuvan väestön lisäksi Suomen Syöpärekisteriä sekä väestötietojärjestelmää. Nämä rekisterit ovat kattavia ja korkeatasoisia, ja niissä olevan tiedon avulla on mahdollista löytää potilaita, jotka ovat korkealla todennäköisyydellä geneettisesti alttiita jollekin syöpätyypille. Tällaiseen alttiuteen voi viitata esimerkiksi nuori sairastumisikä, useat primäärikasvaimet ja syöpätyypin rikastuminen potilaan suvussa. Syöpäpotilaiden diagnosoinnissa käytettyä kudosmateriaalia arkistoidaan yleisesti formaliinifiksoimalla ja parafiiniin upottamalla. Näistä FFPE-kudosnäytteistä voidaan eristää DNA:ta geneettisiä analyysejä varten, mutta niitä käytetään kuitenkin melko harvoin lähtömateriaalina eksomisekvensoinnissa. Tämä johtuu siitä, että fiksointi ja säilöminen vahingoittavat DNA:ta, ja vaikeuttavat siten sen sekvensointia sekä analyysejä. Osatöissä II-IV käytimme eksomisekvensoinnin lähtömateriaalina FFPE-näytteitä. Väitöskirjatyöni osoittaa, että FFPE-kudosnäytteistä eristetty DNA soveltuu varsin hyvin eksomin laajuisiin sekvensointiprojekteihin. Tunnistimme potentiaalisia alttiusvariantteja tutkituille syöpätyypeille. Osatyön II tulokset tukevat ajatusta, että keuhkosyöpä on osa tiettyjen syöpäoireyhtymien syöpäkirjoa, sillä osa potilaista kantoi variantteja BRCA1-, BRCA2- ja TP53-geeneissä. Osatyössä havaitut variantit ovat väestössä hyvin harvinaisia ja ominaisuuksiltaan sellaisia, että ne ovat suurella todennäköisyydellä patogeenisiä.

Lymphangiogenesis, the growth of the lymphatic vasculature, is a crucial process during embryonic development, and - if compromised by genetic damage - can lead to hereditary lymphedema. Although the molecular mechanisms that regulate the growth, development, and maintenance of the lymphatic vasculature have been researched with increasing intensity over the last 25 years, the therapeutic regeneration of lymphatic vessels is still a work in progress in the treatment of conditions such as lymphedema. Vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) is the primary growth factor responsible for the growth and development of the lymphatic vasculature. VEGF-C is activated by a complex process, which is indispensable for its ability to induce lymphangiogenesis via its primary receptor, VEGFR-3. The understanding of this process is a key factor for the development of VEGF-C as a drug target. The goal in my studies has been to increase our insights into VEGF-C activation at the molecular level, to identify its regulatory factors, and to establish its role in the lymphangiogenic process. Absence of the collagen- and calcium-binding EGF domains 1 (CCBE1) protein interrupts the lymphangiogenic process at about the same developmental stage when VEGF-C is first required. We utilized cell-based assays and adeno-associated viral-based gene transduction to investigate the role of CCBE1 on VEGF-C activation. In study I, we identified A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs-3 (ADAMTS3) as a protease that cleaves and activates VEGF-C, resulting in the major mature form of VEGF-C. We showed that CCBE1 acts as a cofactor in this process by enhancing the ability of ADAMTS3 to activate VEGF-C. Correspondingly, CCBE1 augmented the lymphangiogenic potential of VEGF-C in vivo. The presence of N- and C- terminal domains and their proteolytic cleavage characterize both CCBE1 and VEGF-C. In study II, we investigated the role of these domains for VEGF-C activation and the lymphangiogenic process. Our study demonstrated a requirement for the C-terminal domain of VEGF-C for the robust activation of VEGF-C both in vitro and in vivo. Moreover, we identified that the N- and C-terminal domains of CCBE1 have independent roles in the process of VEGF-C activation. The C-terminal domain accelerates the proteolytic cleavage, while the N-terminal domain aids in the assembly of the VEGF-C/ADAMTS3/CCBE1 cleavage complex by mobilizing VEGF-C to the endothelial cell surface. In study III, we searched for additional proteases that can cleave VEGF-C. We identified kallikrein-related peptidase 3 (KLK3) in seminal plasma and cathepsin D in saliva as proteases that cleave and activate VEGF-C. In human seminal plasma, we found substantial amounts of VEGF-C, which became activated concurrently with the semen liquefaction process. The newly identified VEGF-C cleavage sites are conserved in VEGF-D and we found that KLK3 and cathepsin D were able to activate VEGF-D as well. We also found that cleaved forms of VEGF-C and VEGF-D differ in their abilities to activate VEGFR-2 and VEGFR-3. When their N-termini were progressively shortened, the ability of VEGF-D to bind to and activate VEGFR-3 was decreased, while VEGF-C lost preferentially its ability to bind to and activate VEGFR-2. These findings contribute to the existing knowledge on the mechanisms of VEGF-C activation and the functional consequences thereof, and provide new opportunities to target VEGF-C for therapeutic purposes.

Technological advances especially in the last two decades have made it feasible to study virus structures to atomic or near-atomic resolution by a combination of cryogenic electron microscopy (cryo-EM) and image reconstruction or by X-ray crystallography. Drawing from these data, intertwined concepts of “viral self” and structure-based viral lineages been put forward and refined during the last decade. In order to address these theories, I used cryo-EM, 3D image reconstruction, homology modelling and de novo atomic modelling of proteins to study five viruses with icosahedrally symmetric protein capsids. The capsid structures of bacteriophage Bam35, two African horse sickness virus serotypes (AHSV-4 and AHSV-7 tVP2), archaeal head-tailed virus HSTV-1, and Nora virus (NORAV) that infects Drosophila melanogaster were solved to subnanometer resolution. I examine the methodological advances in the field of cryoEM and image processing that have occurred over the time span of the original articles included in the thesis, giving an empirical perspective on the important changes required to reach atomic resolution in virus structural determination. These included improved imaging, data recording, automation, and software developments. Notably, grid preparation is the area where the next strides need to be made to improve reproducibility and throughput. The results contribute to the general field of structural virology as well as shedding light into more specific areas, such as biological membrane modulation, archaeal viruses and vaccine development. Moreover, the hosts of the viruses studied span all three domains of life (bacteria, archaea and eukaryotes). This unusually wide sampling of the viral universe, or virosphere, creates an excellent basis for testing the utilisation of capsid structure in structure-based virus classification as well as verification of structure-based viral lineages. The results allowed unambiguous structure-based classification of the five studied viruses into the four previously postulated virus lineages; the picornavirus-like lineage, the HK97-like tailed-phage lineage, the PRD1/adenovirus lineage and the icosahedral dsRNA virus lineage. Furthermore, the NORAV reconstruction at 2.7 Å resolution provided structural evidence suggesting that NORAV is a representative of a new virus family within the order Picornavirales; a result not achievable by genetic evidence alone and a benchmark example of structure-based virus classification. Virusten rakenteiden tarkka kuvantaminen on mahdollista käyttäen kryogeenista elektronimikroskopiaa (kryo-EM) tai vaihtoehtoisesti röntgenkristallografiaa. Alan teknologinen kehitys viimeisen kahden vuosikymmenen aikana on ollut merkittävää, ja saatujen tulosten perusteella on kehitetty hypoteeseja virusten pohjimmaisesta olemuksesta sekä virusten kuorirakenteisiin perustuvista sukulinjoista. Väitöskirjassani tarkastelen viiden viruksen rakennetta näiden teorioiden valossa. Käytin kryogeenista elektronimikroskopiaa, tiheyskartan rekonstruointia, proteiinirakenteita vertailevaa mallinnusta ja de novo proteiinirakenteen mallinnusta viiteen virioniin joiden kuorirakenteet noudattavat 20 -tahoista eli ikosahedraalista symmetriaa. Selvitimme yhtä nanometriä paremmalla erotuskyvyllä kuorirakenteen bakteerivirus Bam35:stä, kahdesta afrikkalaista hevosruttoa aiheuttavasta viruksesta (AHSV-4 ja AHSV-7 tVP2), arkeoneja infektoivasta viruksesta (HSTV-1) ja Drosophila melanogaster -kärpästä infektoivasta Nora -viruksesta (NORAV). Työssäni tarkastelen kryo-EM-kuvantamis- ja rekonstruktiomenetelmien kehitystä alkuperäisjulkaisujen kattamalta ajanjaksolta. Pitkälle ajanjaksolle levittäytyvien tutkimustulosten rinnakkaisvertailu avaa yleisnäkymän niihin kriittisiin kehitysaskeliin jotka ovat olleet tarpeen atomiresoluution saavuttamisessa kryo-EM:ään perustuvassa virusten rakennetutkimuksessa. Nämä kehitysaskeleet perustuvat parannuksiin kuvan muodostuksessa, kuvan tallennusmenetelmissä, automaatiossa ja ohjelmistoissa. Näytehilojen valmistaminen näyttäytyy tärkeänä tulevaisuuden kehitysalueena. Saavutetut tutkimustulokset edistävät yleisemmällä tasolla rakennevirologian tietämystämme, valottaen lisäksi kapea-alaisempia kysymyksiä liittyen mm. biologisten kalvorakenteiden vuorovaikutuksiin, arkeonien viruksiin ja rokotuskehitykseen. Tutkittujen virusten isäntäsolut kattavat kaikki kolme eliökunnan päähaaraa (bakteerit, arkeonit ja aitotumalliset). Tämä virusten maailman, virosfäärin, laaja-alainen kattavuus tarjoaa erinomaiset lähtökohdat rakenteeseen perustuvan virusluokittelun käytännön kokeiluun sekä jo olemassa olevien luokitteluhypoteesien varmentamiseen. Tulokset mahdollistivat kaikkien viiden tutkitun viruksen kiistattoman luokittelun neljään aikaisemmin esitettyyn rakennepohjaiseen sukulinjaan: pikornavirusten kaltaisten virusten sukulinjaan, HK97-viruksen kaltaisten hännällisten faagien sukulinjaan, PRD1/adenovirus-sukulinjaan ja ikosahedraalisten kaksijuoste-RNA-virusten sukulinjaan. Lisäksi NORAV:n 2,7 Ångströmin tarkkuuden saavuttanut rakenne osoittaa että kyseinen virus edustaa aikaisemmin tuntematonta virusperhettä Picornavirales-lahkossa. Tutkimustulokseen ei olisi päästy pelkin geneettisin menetelmin ja se on erinomainen esimerkki rakennepohjaisesta virusluokittelusta.