Functional and structural analysis of RET receptor tyrosine kinase and its complexes

The RET receptor tyrosine kinase is a versatile receptor which responds to multiple signalling cues. The signalling of RET plays a central role in cell proliferation, differentiation and maintenance. Its dysregulation contributes to various human diseases through gain- and loss-of-function, such as Hirschsprung’s disease and thyroid and lung cancers. Mutations at the cysteine-rich domain (CRD) of RET lead to constitutive activation through receptor dimerization via an intermolecular disulfide bond. However, due to the lack of functional and structural studies of RET and its ligands, the molecular mechanisms of RET activation under normal and pathological conditions is unclear. In this thesis project, a combination of biochemical and biophysical tools are used to characterize the activation of RET with an emphasize on three aspects: studying (1) its extracellular domain (ECD) complex formation with ephrin As (efn-As) and the growth and differentiation factor 15 (GDF15)/the glial cell-derived neurotrophic factor receptor a-like (GFRAL), (2) the oncogenic C634R mutation, which accounts for the majority of the multiple endocrine neoplasia type 2A (MEN2A) cases and (3) the solubilization and purification of full-length RET. To explore the binding between RET and efn-As, I first demonstrated that functional zebrafish RETECD (zRETECD) and efn-A5 (zefn-A5) can be expressed using insect cells. In contrast to previous cellular studies, I showed that zRETECD does not interact directly with zefn-As and postulated that another binding partner is required to mediate their interaction for the reverse signalling of efn-As. Unlike zRETECD, I found that human RETECD (hRETECD) expressed in insect cells is non-functional; therefore, I established a mammalian expression platform for functional expression of hRETECD, demonstrating its superiority to insect cell expression in which hRET is prone to misfold. Using recombinantly expressed proteins, I reconstituted the wild-type (WT) hRETECD/hGDF15/hGFRALECD complex and was able to reconstruct an 8-Å cryo-EM map of the complex, which revealed a “butterfly”-shaped tripartite complex. For the expression of the hRETECD(C634R) mutant, I used a C-terminal Fc tag to successfully drive the receptor dimer formation, as the mutant protein is otherwise monomeric. I studied the resulting apo-hRETECD(C634R) dimer and its complex with GDF15/GFRALECD using structural tools. Comparison of the cryo-EM structure of the hRETECD(WT)/hGDF15/hGFRALECD complex and the negative stain EM maps of the apo-hRETECD(C634R) dimer and the mutant hRETECD(C634R)/hGDF15/hGFRALECD complex revealed significant conformational changes that provide a structural model for the oncogenic activation of RET. Finally, I established a membrane protein production pipeline for full-length RET that will enable future structural studies in a more biologically native system. RET-tyrosiinikinaasireseptori on monipuolinen reseptori, joka vastaa useaan signaalimerkkiin. RET-signalointi on keskeinen tekijä solujen jakautumisen, erilaistumisen ja ylläpidon ohjaamisessa. Sen toimintaa lisäävät tai vähentävät säätelyn häiriöt vaikuttavat erilaisten ihmisen sairauksien, kuten Hirschsprungin taudin ja kilpirauhas- ja keuhkosyövän, ilmentymiseen. Mutaatiot RET:in kysteiinipitoisella osuudella (CRD) johtavat reseptorin jatkuvaan aktivaatioon reseptorin dimerisoiduttua molekyylien välisen disulfidisidoksen kautta. Kuitenkin, johtuen RET:in ja sen ligandien toiminnallisten ja rakenteellisten tutkimuksen vähyydestä, RET-aktivaation molekyylitason mekanismit normaaleissa ja patologisissa tilanteissa ovat epäselviä. Tässä väitöskirjassa käytetään sekä biokemiallisia että biofysikaalisia työkaluja RET:n aktivaation selvittämiseksi, pääpainon ollessa sekä (1) RET:n solun ulkopuolisen (ECD) kompleksin muodostumisen ephrin As (efn-As) ja kasvu- ja erilaistumistekijä 15 (GDF15)/hermotukikudossolusta johdetun alphan kaltaisen neurotrooppisen tekijän reseptorin (GFRAL) kanssa, että (2) onkogeenisen C634R-mutaation, josta johtuu valtaosa useista sisäerityksen tyypin 2A (MEN2A) -neoplasiatapauksista, tutkimisessa ja myöskin (3) täyden pituuden RET:in liukoistamisessa ja puhdistamisessa. Jotta RET:n ja efnA:n välistä sitoutumista voitaisiin tutkia, osoitin ensin, että hyönteissoluissa tuotettu seeprakalan RETECD (zRETECD) ja efn-A5 (zefn-A5) ovat funktionaalisia. Koska havaitsin, että toisin kuin aikaisemmin julkaistuissa solukokeissa, zRETECD ei interaktoi suoraan zenf-As:n kanssa, arvelin, että näiden proteiinien interaktioon tarvitaan kolmas proteiini efnAs:n käänteissignaloinnin aikaansaamiseksi. Toisin kuin zRETECD:n kohdalla, huomasin, että hyönteisoluissa tuotettu ihmisen RETECD (hRETECD) ei ole funktionaalista; tästä syystä pystytin nisäkäsolutuottosysteemin funktionaalisen hRETECD:n tuottamiseksi ja osoitin sen paremmuuden pääasiassa väärin laskotunutta hRET:iä tuottavaan hyöntesolutuottosysteemiin nähden. Koostin rekombinattiproteiineista hRETECD/hGDF15/hGFRALECD - kompleksin ja sain kuvattua tästä 8-Å:n tarkuudella kryo-EM kartan, joka paljasti perhosmaisen, kolmiosaisen kompleksin. hRETECD(C634R)-mutantin tuotossa lisäsin proteiinin C-terminukseen FC-hännän joka ohjasi muutoin monomeerisen mutanttiproteiinin dimerisaatiota. Tutkin aikaansaamani dimeerisen apo-hRETECD(C634R):n ja GDF15/GFRALECD:n muodostamaa kompleksia rakennebiologisilla menetelmillä. hRETECD(WT)/hGDF15/hGFRALECD kompleksin kryo-EM rakenteen ja apo-hRETECD(C634R) dimeerin sekä hRETECD(C634R)/hGDF15/hGFRALECD-mutanttikompleksin negatiivivärjäys-EM:stä saatujen karttojen vertailu paljasti huomattavia konformationaalisia eroja, joiden avulla pystyin luomaan rakenteellisen mallin RET:n onkogeeniselle aktivaatiolle. Lopuksi, pystytin kokopitkän hRET:n tuottamiseen käytettävän kalvoproteiinintuottoprosessin, joka mahdollistaa RET:n rakenteellisen tutkimisen luonnollisemmassa yhteydessä.