Copy number variants in genes causing neuromuscular disorders

The aim of this thesis project was to improve the methods of molecular genetic mutation analysis in neuromuscular disorders, mainly focusing on challenging repetitive intragenic regions and making these methods more accessible. The large skeletal muscle genes nebulin and titin contain large repetitive, i.e., segmental duplication regions. These regions cause hurdles for standard copy number variation detection methods and are therefore often omitted from analysis. The segmental duplication region of nebulin has been previously shown to harbor pathogenic copy number variants; when the number of duplicated blocks deviates by two or more blocks per allele from the normal number, the alteration is considered a pathogenic recessive mutation. We developed a custom comparative genomic hybridization array for the detection of copy number variants in neuromuscular disorder-causing genes. The array covers all 11 known nemaline myopathy genes and 176 additional known and potential neuromuscular disorder genes. The genes are divided by coverage into three groups, all of which allow copy number variant detection at the exon level. Using the array, we detected the largest nebulin deletion (loss of genetic material) hitherto in a patient presenting with an asymmetric distal myopathy. We were also able to determine that the deletion was present in the patient in a mosaic state, which may contribute to the asymmetric phenotype of the patient. The deletion is the first causative dominant de novo deletion described in nebulin. We have previously used the comparative genomic hybridization array for routine screening of samples from patients in whom a copy number variant in the nebulin segmental duplication region is suspected to be a causative mutation. Moreover, the array detected previously unrecorded recurrent copy number variation in the segmental duplication region of titin. The array, however, is both relatively costly and laborious to run and yields far more data than necessary. In addition, the repetitive nature of the titin segmental duplication region does not allow for exact copy number determination by the comparative genomic hybridization array alone. We, therefore, set out to develop custom droplet digital PCR assays for routine screening of the nebulin segmental duplication region and assays to verify the copy number variation of the titin segmental duplication region. Using the droplet digital PCR assays targeting the nebulin segmental duplication region, we were able to determine the copy number of the region adequately. The droplet digital PCR assays targeting the titin segmental duplication region confirmed that the region is subject to copy number variation, revealing a novel putative pathogenic or modifying mechanism in the gene. Målet med detta doktorsavhandlingsarbete var att förbättra de molekylärgenetiska metoderna för mutationsanalys vid neuromuskulära sjukdomar med speciellt fokus på repetitiva regioner inom gener, och att göra dessa metoder lättare tillgängliga. De stora skelettmuskelgenerna nebulin och titin innehåller stora segmentella duplikationsregioner. Dessa regioner utmanar standardmetoderna inom analysen av förändringar i antalet segmentkopior, och lämnas därför ofta bort vid analyser. Den segmentala duplikationsregionen i nebulin har tidigare visats vara föremål för sjukdomsorsakande varianter i antalet segmentkopior; när antalet duplicerade block avviker med två eller fler stycken per allel från det normala antalet, anses förändringen vara en recessiv sjukdomsorsakande mutation. Vi utvecklade en komparativ genomisk hybridisations-mikromatris för att påvisa förändringar i antalet kopior av gener för neuromuskulära sjukdomar. Mikromatrisen täcker alla 11 kända nemalinmyopatiorsakande gener, tillsammans med 176 andra kända eller möjliga gener för neuromuskulära sjukdomar, populärt kallade muskelsjukdomar. Generna är indelade i tre grupper på basis av täckning, varav alla möjliggör bestämning av förändringar i antalet kopior på exonnivå. Med hjälp av mikromatrisen kunde vi hitta den största nebulindeletionen (det största bortfallet av genetiskt material) hittills i en patient med en asymmetrisk distal myopati. Vi kunde också se att deletionen var närvarande i mosaiktillstånd, vilket kan bidra till den asymmetriska muskelsvagheten hos patienten. Deletionen uppstod som en nymutation och är den första sjukdomsorsakande dominanta de novo deletion som beskrivits i nebulingenen. Vi har tidigare använt mikromatrisen för rutinanalys av prover från patienter hos vilka en förändring i antalet nebulinsegmentkopior har misstänkts vara sjukdomsorsakande. Ytterligare upptäckte vi med hjälp av mikromatrisen tidigare okänd kopieantalsvariation i titinets segmentala duplikationsområdet. Mikromatrisen är dock både såväl förhållandevis dyrt som arbetsdrygt, och producerar mycket mer data än vad som är nödvändigt. Dessutom tillåter inte den repetitiva naturen av titinets segmentala duplikationsregion inte exakt bestämning av antalet kopior med hjälp av endast mikromatrisen. Därmed satsade vi på att utveckla målspecifika droplet-digital-PCR-primers och hydrolysprober för rutinsållning och kopieantalsbestämning av nebulinets segmentala duplikationsregion, och primers och hydrolysprober i ett försök att verifiera variationen i antalet segmentkopior i titinets segmentala duplikationsregion. Droplet-digital-PCR primer-hydrolysprobparen för nebulinets segmentala duplikationsområde kunde adekvat bestämma antalet kopior i regionen. Droplet-digital-PCR-primer-hydrolysprobparen för titinets segmentala duplikationsområdet bekräftade förekomsten av förändringar i antalet kopior i området, och avslöjade därmed en möjlig ny sjukdomsorsakande eller modifierande mekanism hos genen.