Mismatch Repair and Replication Errors at Single Cell Resolution

Ensuring the integrity of the genome during DNA replication is central in preserving the normal functions of cells and avoiding malignancy or cell death. The frontline protection against replication errors is the DNA mismatch repair (MMR) system, which repairs base-base mismatches and small insertion-deletion loops, thus preventing them from becoming permanent mutations. MMR-deficiency predisposes cells to accumulation of replication errors, and the most well-known signature of MMR-deficiency is microsatellite instability (MSI). Microsatellites are short, repetitive sequences that are especially vulnerable for insertion-deletion mutations. However, not all genomic regions enjoy equal MMR-protection against replication errors. DNA mismatch repair system has been shown to interact with the histone modification H3K36me3 and decrease the mutational burden in these regions. H3K36me3 is especially enriched in the 3′ exons of transcribed genes. However, in vivo studies of the relationship between H3K36me3-mediated MMR and local replication error burden are still lacking. To investigate this, we employed a highly sensitive single-cell whole exome sequencing to dissect the mutational landscape in Mlh1+/+ (MMR-proficient) and Mlh1-/- (MMR-deficient) macroscopically normal, non-malignant murine T cells. We found small deletions to be the best reporter of replication errors. We provide evidence that in transcribed genes, 3′ exons are naturally more prone to replication errors and that these exons are protected by the H3K36me3-mediated MMR recruitment. The data presented here shows differential, local MMR-recruitment and, consequently, differential MMR-repair activity within genes. Further, we expanded this to investigate how the global amount of MMR, meaning the copy number of functional Mlh1-gene, affects the genomic stability at microsatellite sequences in mouse small intestine and spleen, utilizing single-molecule PCR. We measured the microsatellite instability and Mlh1 expression in Mlh1+/+, Mlh1+/- and Mlh1+/+ murine small intestine and spleen. Indeed, we found that MSI rates do correlate with MLH1 protein expression. However, opposite trends were found between microsatellite expansions and contractions; microsatellite contractions inversely correlated with MLH1 expression, while expansions showed no correlation or even a weak positive correlation with MLH1 expression. Given the clues from differential dynamics of insertions and deletions, we utilized data obtained from single-cell exome sequencing of T cells and single-molecule PCR analysis of small intestine from Mlh1+/+ and Mlh1-/- mice to further explore the different characteristics and dynamics of microsatellite instability in vivo. We found that small deletions accumulate especially to A/T mononucleotide repeats of length 10 to 14 nucleotides long. Interestingly, insertions appeared to accumulate to short, less than 11 nucleotides long repeats in similar frequencies regardless of the nucleotide composition and showed no genotype dependent difference. In addition, mononucleotide repeat expansions appear to accumulate to genes that are replicated during early S phase, while deletions at mononucleotide repeats were found in genes that are on average, replicated later in S phase. Taken together, the findings presented here provide further evidence of differential dynamics of insertions and deletions at mononucleotide repeats in addition to the differential correlation of these mutation types with the expression of Mlh1 gene. Lastly, I explored the possible mutational target genes and their characteristics in MMR-deficient T cells prior neoplasia. Genes affected with mutations in Mlh1-/- samples were almost exclusively devoid of mutations in Mlh1+/+ samples, suggesting that these genes are protected against replication errors by MMR-mediated repair. Huwe1 and Mcm7 emerged as potential early mutational target genes in T cells prior neoplasia. Taken together, this thesis presents studies on de novo replication errors and DNA mismatch repair in vivo at single DNA molecule resolution. We show evidence that the amount of available MMR proteins influences the replication error repair not only locally within genes, but also on a global level. In addition, we explore the differences and similarities in microsatellite insertion and deletion dynamics to dissect the repeat instability signatures in MMR-deficiency. Lastly, this thesis presents possible mutational target genes and their characteristics in MMR-deficient T cells prior neoplasia. Perimän stabiilisuuden säilyttäminen solun jakautumisen aikana on tärkeää solun normaalin toiminnan kannalta. Korjaamattomat DNA:n kahdentumisen aikana syntyneet virheet jäävät perimään mutaatioina, jotka pahimmassa tapauksessa voivat johtaa syövän syntymiseen. Soluilla on kuitenkin useita mekanismeja, jotka korjaavat ja suojaavat sen perimää mutaatioiden syntymistä vastaan, ja yksi näistä on MMR (mismatch repair) -systeemi. Häiriöt tässä korjausmekanismissa altistavat solut mutaatioiden kertymiselle, erityisesti lyhyisiin toistojaksoihin, joita kutsutaan mikrosatelliiteiksi. MLH1-proteiini on yksi MMR-mekanismin komponenteista, ja ilman sitä koko MMR-systeemi on toimimaton. H3K36me3-modifikaatio histoniproteiinissa, jonka ympärille DNA on kiertynyt, on osoitettu rekrytoivan MMR-koneiston näille perimän alueille. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli tutkia, miten paikallinen, geenitasolla oleva MMR-mekanismin määrä, sekä Mlh1-geenin kopioluku perimässä ja sen ilmentäminen vaikuttavat perimän stabiilisuuteen hiiren kudoksissa. Tämän lisäksi tutkimuksen tarkoitus oli kartoittaa ja analysoida erilaisia MMR-puutoksen aiheuttamia mutaatioita. Tätä varten hyödynsimme yksisolu eksomisekvensointia, sekä yhden DNA-molekyylin PCR analyysia. Ensimmäisessä osatyössä kartoitimme DNA:n kahdentumisen aikana syntyneiden virheiden sijaintia eri geeneissä hiiren T-soluissa yksisolu eksomisekvensointia hyödyntäen. Tutkimus paljasti, että korkean ekspression geenit ja erityisesti niiden loppupäät ovat alttiita näille virheille, ja niiden korjausaktiivisuus MMR-koneistolla on korkeampi H3K36me3-histonimodifikaatiosta johtuvasta MMR-systeemin rekrytoinnista. Toisessa osatyössä tutkimme mikrosatelliittien stabiilisuutta hiiren T-soluissa. Tutkimuksessa havaitsimme, että pienet emäsparien deleetiot kertyivät eri pituisiin ja eri emäspareista koostuviin toistojaksoihin kuin pienet insertiot. Löysimme myös viitteitä DNA:n kahdentumisen ajoituksen vaikutuksesta näiden pienten deleetioiden ja insertioiden syntymiseen. Ensimmäisen ja toisen osatyön tulokset paljastivat Mcm7- ja Huwe1-geenien olevan erityisen alttiita kahdentumisen aikana syntyville virheille, ja että näitä geenejä suojellaan H3K36me3-välitteisen MMR-systeemin avulla. Nämä geenit ovat tärkeitä T-solujen normaalin kehityksen kannalta. Kolmannessa osatyössä tutkimme, miten Mlh1-geenin kopioluku ja geenin ekspressio vaikuttavat kahden mikrosatelliitin stabiilisuuteen hiiren ohutsuolessa ja pernassa. Havaitsimme pienten deleetioiden määrän mikrosatelliiteissa kasvavan, kun Mlh1-geenin ekspressio väheni, kun taas pienten insertioiden määrä kasvoi Mlh1-geenin ekspression kasvaessa.