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Objetivo: Vírus RNA, como influenza e vírus sincicial respiratório (VSR), são causas comuns de infecções de vias aéreas inferiores. Testes rápidos (à base de antígeno por técnica imunocromatográfica e molecular - TRI e TRM, respectivamente) com boa acurácia diagnóstica impactam diretamente na qualidade do atendimento ao paciente e nos custos de internação. Este estudo tem como objetivo avaliar a implementação da PCR point of care em comparação com testes rápidos baseados em antígenos para influenza e VSR no pronto-socorro. Métodos: Estudo transversal prospectivo em pronto-socorro (PS) de agosto a setembro de 2019, onde todos os pacientes com doença gripal passaram por TRI e TRM. Os pacientes foram divididos em um modelo de quatro cenários clínicos para avaliar custo e tempo de isolamento no pronto-socorro. Resultados: 424 pacientes foram incluídos no estudo. O TRI apresentou sensibilidade de apenas 40% em relação ao TRM (especificidade de 100%; VPP 100%; VPN 68,7%), fazendo com que 103 pacientes deixassem o isolamento precocemente, elevando o risco biológico no PS. Os resultados rápidos do TRM levaram os pacientes negativos a deixar o isolamento mais cedo (262:10 menos horas de isolamento), permitindo redução de custos de US$ 1.921,20. No entanto, o TRM teve um custo maior que o TRI em todos os cenários clínicos com um aumento de US$ 12.788,90 (69,9% do custo relacionado a exames e precauções de isolamento). Conclusão: O TRI foi um teste mais acessível, mas não pode ser usado para excluir doenças e foi associado a maior risco biológico para o ambiente hospitalar. O TRM teve melhor desempenho diagnóstico com resultados mais rápidos, permitindo menor tempo de isolamento por paciente testado. [resumo fornecido pelo autor] Objective: RNA viruses, such as influenza and respiratory syncytial virus (RSV), are common causes of lower airway infections. Rapid tests (antigen-based by immunochromatographic and molecular technique - RIT and RMT, respectively) with good diagnostic accuracy directly impacts the quality of patient care and hospitalization costs. This study aims to evaluate the implementation of point of care PCR compared to rapid antigen-based tests for influenza and RSV in the emergency department. Methods: Prospective cross section study in an Emergency Room (ER) from August to September 2019, where all patients with influenza like illness went through RIT and RMT. The patients were divided in a model of four clinical scenarios to evaluate cost and isolation time in the ER. Results: 424 patients were included in the study. RIT showed sensitivity of only 40% compared with RMT (100% specificity; PPV 100%; NPV 68,7%), causing 103 patients to mistakenly leave respiratory isolation, raising biological risk in the ER. Fast results from RMT led negative patients to leave isolation early (262:10 less hours of isolation), allowing cost reduction of USD 1.921,20. Nonetheless, RMT had higher cost than RIT in all clinical scenarios with an increase of USD 12.788,90 (69,9% of cost related to tests and isolation precautions). Conclusion: RIT was a more affordable test but can't be used to exclude disease and was associated with higher biological risk to the hospital setting. RMT had better diagnostic performance with faster results, allowing for less isolation time per patient tested. [resumo fornecido pelo autor]

Objective Steroid measurement is a challenge in pediatric endocrinology. Currently, liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) is considered a gold standard for this purpose. The aim of this study was to compare both LC-MS/MS and immunoassay (IA) for androgens before and after human recombinant chorionic gonadotropin (rhCG) stimulus in children with 46,XY disorders of sex development (DSD). Methods Nineteen patients with 46,XY DSD were evaluated; all of them were prepubertal and non-gonadectomized. Testosterone, dihydrotestosterone (DHT), DHEA and androstenedione were measured by IA and LC-MS/MS before and 7 days after rhCG injection. The correlation between IA and LC-MS/MS was analyzed by the intraclass correlation coefficient (ICC) and Spearman’s rank correlation coefficient (SCC). For concordance analysis the Passing and Bablok (PB) regression and the Bland and Altman (BA) method were used. Results Testosterone showed excellent correlation (ICC = 0.960 and SCC = 0.964); DHT showed insignificant and moderate correlations as indicated by ICC (0.222) and SCC (0.631), respectively; DHEA showed moderate correlation (ICC = 0.585 and SCC = 0.716); and androstenedione had poor and moderate correlations in ICC (0.363) and SCC (0.735), respectively. Using the PB method, all hormones showed a linear correlation, but proportional and systematic concordance errors were detected for androstenedione, systematic errors for testosterone and no errors for DHEA and DHT. By the BA method, there was a trend of IA to overestimate testosterone and androstenedione and underestimate DHEA and DHT when compared to LC-MS/MS. Conclusion Traditional IA should be replaced by LC-MS/MS for the androgens measurement in prepubertal children whenever is possible.

During the last 4 decades, registration of patients with primary immunodeficiencies (PID) has played an essential role in different aspects of these diseases worldwide including epidemiological indexes, policymaking, quality controls of care/life, facilitation of genetic studies and clinical trials as well as improving our understanding about the natural history of the disease and the immune system function. However, due to the limitation of sustainable resources supporting these registries, inconsistency in diagnostic criteria and lack of molecular diagnosis as well as difficulties in the documentation and designing any universal platform, the global perspective of these diseases remains unclear.Published and unpublished studies from January 1981 to June 2020 were systematically reviewed on PubMed, Web of Science and Scopus. Additionally, the reference list of all studies was hand-searched for additional studies. This effort identified a total of 104614 registered patients and suggests identification of at least 10590 additional PID patients, mainly from countries located in Asia and Africa. Molecular defects in genes known to cause PID were identified and reported in 13852 (13.2% of all registered) patients.Although these data suggest some progress in the identification and documentation of PID patients worldwide, achieving the basic requirement for the global PID burden estimation and registration of undiagnosed patients will require more reinforcement of the progress, involving both improved diagnostic facilities and neonatal screening.

Os potenciais riscos associados à exposição às microcistinas (MCs) requerem o desenvolvimento de pesquisas voltadas para métodos de análise visando ao monitoramento eficiente e rápido de águas. O trabalho avaliou a aplicação dos imunoensaios ELISA desenvolvido em laboratório (LABicELISA) e o comercial (kit ELISA) para detecção de MCs em águas (n=22). O LABicELISA demonstrou ser mais sensível que o kit ELISA, apresentando limite de quantificação de 0,05 e 0,12 µg.L-1, respectivamente. Os resultados demonstraram que ambos os imunoensaios foram eficientes para detecção e análise de MCs em diferentes tipos de água (sintéticas, de mananciais destinados ao abastecimento e de reservatórios), com coeficiente de correlação de 0,997 e forte correlação na exatidão e precisão. O emprego do LABicELISA proporcionou análise com custo aproximado e reduzido de 100 vezes em relação ao do kit ELISA, podendo assim, aplicar em larga escala de abrangência para monitoramento de mananciais superficiais no país.

Point-of-care serological tests for SARS-CoV-2 have been used for COVID-19 diagnosis. However, their accuracy over time regarding the onset of symptoms is not fully understood. We aimed to assess the accuracy of a point-of-care lateral flow immunoassay (LFI). Subjects, aged over 18 years, presenting clinical symptoms suggestive of acute SARS-CoV-2 infection were tested once by both nasopharyngeal and oropharyngeal RT-PCR and LFI. The accuracy of LFI was assessed in periodic intervals of three days in relation to the onset of symptoms. The optimal cut-off point was defined as the number of days required to achieve the best sensitivity and specificity. This cut-off point was also used to compare LFI accuracy according to participants’ status: outpatient or hospitalized. In total, 959 patients were included, 379 (39.52%) tested positive for SARS-CoV-2 with RT-PCR, and 272 (28.36%) tested positive with LFI. LFI best performance was achieved after 10 days of the onset of symptoms, with sensitivity and specificity of 84.9% (95%CI: 79.8-89.1) and 94.4% (95%CI: 91.0-96.8), respectively. Although the specificity was similar (94.6% vs. 88.9%, p = 0.051), the sensitivity was higher in hospitalized patients than in outpatients (91.7% vs. 82.1%, p = 0.032) after 10 days of the onset of symptoms. Best sensitivity of point-of-care LFI was found 10 days after the onset of symptoms which may limit its use in acute care. Specificity remained high regardless of the number of days since the onset of symptoms. Os testes sorológicos no local de atendimento (point-of-care) para a infecção pelo SARS-CoV-2 têm sidos utilizados para o diagnóstico da COVID-19. Entretanto, não está plenamente elucidada a acurácia dos testes ao longo do tempo em relação ao início dos sintomas. Nosso objetivo foi de avaliar a acurácia, no local de atendimento, do imunoensaio de fluxo lateral (LFI). Pacientes com ≥ 18 anos de idade que apresentavam sintomas clínicos sugestivos de infecção aguda pelo SARS-CoV-2 foram testados uma vez com RT-PCR da nasofaringe e orofaringe, além do LFI. A acurácia do LFI foi avaliada com intervalos periódicos de 3 dias a partir do início dos sintomas. O ponto de corte ótimo foi definido como o número necessário de dias para atingir a melhor sensibilidade e especificidade. Esse ponto foi utilizado também para comparar a acurácia do LFI de acordo com a situação do paciente (ambulatorial ou hospitalizado). Foram incluídos 959 pacientes, dos quais 379 (39,52%) testaram positivos para SARS-CoV-2 pelo RT-PCR e 272 (28,36%) pelo LFI. Foi atingido o melhor desempenho para o LFI com 10 dias a partir do início dos sintomas, com sensibilidade e especificidade de 84,9% (IC95%: 79,8-89,1) e 94,4% (IC95%: 91,0-96,8), respectivamente. Embora a especificidade não tenha sido diferente entre os grupos de pacientes (94,6% vs. 88,9%, p = 0,051), a sensibilidade foi mais alta nos pacientes hospitalizados que nos ambulatoriais (91,7% vs. 82,1%, p = 0,032) no dia 10 depois do início dos sintomas. A melhor sensibilidade do LFI no local de atendimento ocorre 10 dias depois do início dos sintomas, o que pode limitar seu uso no atendimento agudo. A especificidade permanece alta, independentemente do número de dias desde o início dos sintomas. Los puestos de atención para pruebas serológicas del SARS-CoV-2 han sido usado para la diagnosis de la COVID-19. No obstante, su precisión a lo largo del tiempo, en lo que respecta a la aparición de los síntomas, no se ha comprendido completamente. Nuestro objetivo fue evaluar la precisión de un puesto de atención de inmunoanálisis de flujo lateral (LFI). Se hizo pruebas a individuos ≥ 18 años, presentando síntomas clínicos compatibles con una infección aguda de SARS-CoV-2, tanto vía nasofaríngea y orofaríngea RT-PCR, como LFI. La precisión de LFI fue evaluada en intervalos periódicos de 3 días con respecto a la aparición de los síntomas. El punto óptimo de corte se definió como el número de días requerido para alcanzar la mejor sensibilidad y especificidad. Este punto también se usó para comparar la precisión del LFI, según el estatus de los participantes: ambulatorios u hospitalizados. Se incluyeron a 959 pacientes, 379 (39,52%) dieron positivo en las pruebas de SARS-CoV-2 RT-PCR, y 272 (28,36%) fueron positivos en los LFI. Se alcanzó el mejor rendimiento de los LFI tras 10 días de la aparición de los síntomas, con una sensibilidad y especificidad de un 84,9% (IC95%: 79,8-89,1) y 94,4% (IC95%: 91,0-96,8), respectivamente. A pesar de que la especificidad no fue diferente (94,6% vs. 88,9%, p = 0,051), la sensibilidad fue mayor en pacientes hospitalizados que en los ambulatorios (91,7% vs. 82,1%, p = 0,032) tras 10 días desde la aparición de los síntomas. La mejor sensibilidad LFI del puesto de cuidado se produce tras 10 días de la aparición de los síntomas, lo que quizás limite su uso en el cuidado de urgencias. La especificidad permanece alta independientemente del número de días desde la aparición de los síntomas.

Introduction: Due to urgency and demand of a response to the Covid-19 pandemic, numerous Sars-CoV-2 immunoassays have been rapidly developed. Objective: This study aimed at assessing the performance of rapid Sars-CoV-2 antibody test in comparison to high-throughput serological assays. Methods: A total of 86 serum samples were evaluated in the three assays: a lateral flow immunoassay - Wondfo Sars-CoV-2 Antibody Test (WRT) - and two chemiluminescence immunoassays: Elecsys Anti-Sars-CoV-2 (ECLIA), and Sars-CoV-2 IgG (CMIA-IgG). Results: The estimated diagnostic sensitivities of serological tests in the evaluation of serum samples from the epidemiological survey were: WRT 59% [95% confidence interval (CI) 43.4%-72.9%], ECLIA 66.7% (51%-79.4%), and CMIA-IgG 61.5% (47.1%-73%). Meanwhile, the estimated diagnostic specificity was for WRT 78.7% (95% CI 65.1%-88%), ECLIA 72.3% (58.2%-83.1%), and CMIA-IgG 76.6% (74%-95.5%). The sensitivity and specificity values were lower than manufacturers’ claimed. Although 16.2% (14/86) of serological results were discordant among the three Sars-CoV-2 serological assays, the degree of agreement by the kappa index was adequate: WRT/CMIA-IgG [0.757 (95% CI 0.615-0.899)], WRT/ECLIA [0.715 (0.565-0.864)], and ECLIA/CMIA-IgG [0.858 (0.748-0.968)]. Conclusion: The serological testing may be a useful diagnostic tool, which reinforces its careful evaluation, and, as well as the correct time to use it. RESUMEN Introducción: Debido a la urgencia y la demanda de una respuesta a la pandemia de Covid-19, se han desarrollado rápidamente numerosos inmunoensayos del Sars-CoV-2. Objetivo: Este estudio tuvo como objetivo evaluar el rendimiento de la prueba rápida de anticuerpos contra el Sars-CoV-2 en comparación con los ensayos serológicos de alto rendimiento. Métodos: Se evaluaron un total de 86 muestras de suero en los tres ensayos: un inmunoensayo de flujo lateral - Wondfo Sars-CoV-2 Antibody Test (TRW) - y dos inmunoensayos de quimioluminiscencia: Elecsys Anti-Sars-CoV-2 (ECLIA) y Sars-CoV-2 IgG (CMIA-IgG). Resultados: Las sensibilidades diagnósticas estimadas de las pruebas serológicas en la evaluación de muestras de suero de la encuesta epidemiológica fueron: WRT 59% [intervalo de confianza (IC) del 95%: 43,4%-72,9%], ECLIA 66,7% (51%-79,4%) y CMIA-IgG 61,5% (47,1%-73%). Mientras tanto, la especificidad diagnóstica estimada fue para WRT 78,7% (95% CI 65,1%-88%), ECLIA 72,3% (58,2%-83,1%) y CMIA-IgG 76,6% (74%-95,5%). Los valores de sensibilidad y especificidad fueron más bajos que los declarados por los fabricantes. Aunque el 16,2% (14/86) de los resultados fueron discordantes entre los tres ensayos serológicos del Sars-CoV-2, el grado de concordancia del índice kappa fue adecuado: WRT/CMIA-IgG [0,757 (IC del 95%: 0,615-0,899)], WRT/ECLIA [0,715 (0,565-0,864)] y ECLIA/CMIA-IgG [0,858 (0,748-0,968)]. Conclusión: La prueba serológica puede ser una herramienta diagnóstica útil, lo que refuerza su evaluación cuidadosa, así como el momento adecuado para usarla. RESUMO Introdução: Em função da urgência e demanda de uma resposta à pandemia do novo coronavírus (Covid-19), vários testes de detecção de anticorpos para a síndrome respiratória aguda grave do coronavírus 2 (Sars-CoV-2) têm sido desenvolvidos. Objetivo: Este estudo teve como objetivo avaliar o desempenho do teste rápido utilizado em um inquérito epidemiológico para Sars-CoV-2 em comparação com outros ensaios sorológicos. Métodos: Foram avaliadas 86 amostras de soro em três ensaios sorológicos: um imunoensaio de fluxo lateral - Wondfo Sars-CoV-2 Antibody Test (TRW) - e dois imunoensaios de quimioluminescência: Elecsys anti-Sars-CoV-2 (ECLIA) e Sars-CoV-2 IgG (CMIA-IgG). Resultados: As sensibilidades diagnósticas estimadas dos testes sorológicos na avaliação dessas amostras foram: TRW 59% [95% intervalo de confiança (IC) 43,4%-72,9%], ECLIA 66,7% (51%-79,4%) e CMIA-IgG 61,5% (47,1%-73%). Enquanto isso, a especificidade diagnóstica estimada para TRW foi 78,7% (95% CI 65,1%-88%), ECLIA 72,3% (58,2%-83,1%) e CMIA-IgG 76,6% (74%-95,5%). Os valores de sensibilidade e especificidade foram inferiores aos afirmados pelos fabricantes. Embora 16,2% (14/86) dos resultados tenham sido discordantes entre os três ensaios serológicos para Sars-CoV-2, o grau de concordância pelo índice Kappa foi adequado: TRW/CMIA-IgG [0,757 (95% IC 0,615-0,899)], TRW/ECLIA [0,715 (0,565-0,864)] e ECLIA/CMIA-IgG [0,858 (0,748-0,968)]. Conclusão: O teste sorológico pode ser uma ferramenta diagnóstica útil, o que reforça sua avaliação criteriosa, bem como o momento correto de sua utilização.

Orientadores: Maria Helena Andrade Santana, Ricardo de Lima Zollner Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Quimica Resumo: A pesquisa no campo de doenças auto-imunes vem despertando grande interesse, pelas dificuldades de diagnóstico preciso e necessidade de melhor conhecimento das suas causas e mecanismos. O ensaio ELlSA (Enzyme-linked immunosorbent assay) é o mais utilizado para a detecção de auto-anticorpos. Nesse método, os problemas apresentados estão baseados na variabilidade dos kits disponíveis e na natureza multi-etapas envolvida na detecção dos auto-anticorpos. Visando contornar esses problemas, neste trabalho, foi desenvolvido um método de detecção de auto-anticorpos, quantitativo e qualitativo, em única etapa, baseado no reconhecimento molecular e desenvolvimento do sinal colorimétrico, usando lipossomas polimerizados. Na preparação dos lipossomas monoméricos foi usada cardiolipina como ligante específico e ácido 10,12-tricosadiinóico como lipídio estrutural. Os lipossomas polimerizados sob irradiação UV, absorveram a luz no comprimento de onda referente ao azul635nm, púrpura540nm e rosa480nm. A adsorção de auto-anticorpos na superfície dos lipossomas e o desenvolvimento do sinal colorimétrico foram estudados com soros de referência, de indivíduo sadio e auto-imunes. Os resultados experimentais mostraram que a preparação dos lipossomas polimerizados foi reprodutível. A adsorção de auto-anticorpos na superfície. desses lipossomas produziu resposta colori métrica, com alta sensibilidade de mudança de cor do "azul" ou "púrpura" para "rosa", detectável em única etapa. A especificidade do sistema foi 7 vezes maior com soro de referência que com IgG. A utilização de soros auto­imune e sadio reduziu a especificidade do sistema, devido às interferências dos outros componentes do soro. Esses resultados mostraram a potencial idade dos lipossomas polimerizados para a detecção de auto-anticorpos, pela reprodutibilidade do sistema e desenvolvimento de sinal em única etapa Abstract: The research in the field of autoimmune diseases has been increased in the last years, due to the difficulties on the precise diagnostic, and the knowledgement of its causes and mechanisms. ELlSA (Enzyme -linked immunosorbent assay), commercially available, is the most used method for detection of autoantibodies. The problems presented in its procedure are based on the variability of the commercial kits and on the multi-steps included on the autoantibodies detection. Aiming to circumvent these problems, a alternative method for detection of autoantibodies using polymerized liposomes was developed in this work. The main advantage of this approach is the reprodutibility of the liposomes and the molecular recognition and development of colorimetric signal in only one step. Monomeric liposomes were prepared using cardiolipin a na affinity ligand and 10,12­tricosadiynoic acid as structural lipid. The polymerization was performed by UV irradiation in the blue, purple and pink phase. The adsorption of antibodies and the development of the colorimetric signal was studied using reference, normal and autoimmune sera. The experimental results showed that the polymerized were reprodutibles and stable during 5 months. The adsorption of autoantibodies on the surface of polymerized liposomes produced a colorimetric response trom the blue or purple to pink phase. The sensibility of the system was high, and the specificity was 60% compared the responses with reference serum and non specific immunoglobulin G. When real sera was used, the specificity of decreased due to interferences of the other components of the serum. The results show the potentiality of polymerized liposomes for detection of antibodies, due to reprodutibility of liposomes preparation and development of a colorimetric signal in only one ste Mestrado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Mestre em Engenharia Química

Orientador: Stephen Hyslo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O envenenamento humano por lagartas de mariposas saturnídeas L. obliqua, leva a distúrbios hemostáticos, sendo o óbito, em geral, decorrente de insuficiência renal aguda ou de hemorragia maciça em órgãos nobres. Pouco se sabe sobre a composição bioquímica e imunológica do veneno destas lagartas. Esta dissertação descreve um estudo imunológico do veneno desta espécie, incluindo o desenvolvimento de um "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay" (ELISA) para detecção do veneno de L. obliqua. As imunoreatividades do extrato de cerdas, hemolinfa e saliva de L. obliqua frente ao soro anti-Lonomia foram comparadas por imunodifusão de Ouchterlony, imunoeletroforese e imunoblot após SDS-PAGE. A reatividade do antiveneno com outros venenos animais também foi investigada. Na imunodifusão, o extrato de cerdas e hemolinfa mostraram várias linhas de imunoprecipitação, algumas das quais com completa identidade. A hemolinfa de L. achelous também reagiu com o antiveneno, mas em menor extensão, e mostrou algumas linhas de identidade parcial com a hemolinfa de L. obliqua. Com exceção do extrato de cerdas e hemolinfa da lagarta da mariposa saturnidea A. rectilínea, que mostrou fracas linhas de imunoprecipitação de não-identídade com o extrato de cerdas e hemolinfa de L. obliqua, não houve reação entre o soro mti-Lonomia e outros venenos animais testados. A imunoeletroforese essencialmente confirmou a imunoreatividade observada na imunodifusão. O Imunoblot mostrou que o perfil do extrato de cerdas foi semelhante ao da hemolinfa, particularmente na região de 45-205 kDa. O extrato de cerdas de A. rectilínea e as hemolinfas de A. rectilínea e L. achelous mostraram várias bandas semelhantes àquelas vistas com cerdas e hemolinfa de L. obliqua. Não houve reatividade com as salivas de A. rectilínea e L. obliqua nestes ensaios. Houve uma reatividade muito fraca (não específica) com os venenos de P. nigriventer e T. serrulatus, mas não ocorreu reatividade com venenos de serpentes. Para o ELISA, placas multi-poço foram sensibilizadas com soro anti-L. Obliqua (1:1000) "ovemight", lavadas e incubadas com extrato de cerdas, hemolinfa, saliva ou outros venenos animais. Após lavagem e incubação com IgG purificada por afinidade e conjugada à peroxidase (1:800), o substrato (oenilenodiamina) foi adicionado e a absorbância lida a 492 nm, após 30 min. Em alguns experimentos, o extrato de cerdas, hemolinfa e saliva de L. obliqua foram fracionados por gel filtração em Superdex 75,equilibrada com tampão Tris-HCl 0,1 M5 pH 7,8 e a imunoreatividade das frações foi testada pelo ELISA. A detecção limite para o extrato de cerdas no ELISA foi 0,5 - 1,0 ng/poço (5-10 µg/ml) com resposta máxima com >2 µg/poço (20 µg/ml). O coeficiente de variação íntra- ensaio foi 2 µg/well (20 µg/ml). The intra-assay coefficient of variation was

Made available in DSpace on 2022-04-28T19:43:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2021-07-01 Universidade Federal do Paraná Institute of Biotechnology and Bioengineering, Isfahan University of Technology Purdue University Homeless persons have been considered as one of the most susceptible populations to sexually transmitted infections. In Brazil, these population experienced an increase of 140% from 2012 to 2020. Accordingly, the present study aimed to assess the seroprevalence of anti-Treponema pallidum, anti-HCV, anti-HIV antibodies, and the risk factors associated with homeless persons in a daytime attendance shelter of São Paulo city during the syphilis epidemic in Brazil. Blood samples of 116 volunteers and epidemiological data were conveniently collected in the shelter from June through August 2018. Detection of syphilis, HCV, and HIV antibodies was performed by chemiluminescent microparticle immunoassay (CMIA). CMIA-reagent samples for anti-T. pallidum antibodies were confirmed by Venereal Disease Research Laboratory (VDRL) non-treponemal test. VDRL non-reagent samples were confirmed by treponemal rapid immunochromatographic test. A rapid immunoblot assay confirmed seropositivity to HIV. Overall, anti-T. pallidum antibodies were observed in 29/116 (25.0%), anti-HCV antibodies in 4/116 (3.4%), and anti-HIV antibodies in 2/116 (1.7%) individuals, both co-infected with anti-T. pallidum antibodies. Associated risk factors for syphilis in homeless persons were being born or previously living in another city (p = 0.043) and becoming homeless due to family conflicts (p = 0.035). Besides homeless vulnerability, worldwide shortage of benzathine penicillin supply and increasing of syphilis testing access through rapid testing in primary health care services may have also impacted disease spreading at the time. The prevalence of syphilis found herein is the highest worldwide to date in this population. Federal University of Paraná Department of Veterinary Medicine College of Veterinary Science Federal University of Paraná Clinics Hospital Clinical Analysis Laboratory Unit Federal University of Paraná Department of Cellular and Molecular Biology College of Cellular and Molecular Biology State University of Ponta Grossa Department of Nursing and Public Health São Paulo State University Institute of Biotechnology, Botucatu University of São Paulo Department of Medical Microbiology Purdue University Department of Comparative Pathobiology Federal University of Paraná Department of Veterinary Medicine Brazil São Paulo State University Institute of Biotechnology, Botucatu

Background: Current guidelines recommend assessment of 25-vitamin D status in patients with chronic kidney disease (CKD). Although significant differences among assays have been described, the impact of CKD on this variability has never been tested. Methods: We tested the variability between two 25-vitamin D assays in patients with CKD (eGFR < 60 mL/min/1.73m2) who had consecutive 25-vitamin D measurements in 2015 (Assay 1 - Diasorin LIASON 25 TOTAL - D assay®) and 2016 (Assay 2 - Beckman Coulter Unicel Xl 800®). The cohort consisted of 791 adult patients (122 with normal renal function and 669 with CKD - 33, 30, and 37% in stages 3, 4, and 5 on dialysis, respectively). Results: Levels of 25-vitamin D were lower and the prevalence of hypovitaminosis D using assay 1 was higher than using assay 2 in patients with CKD, regardless of similar levels of calcium, phosphate, and parathyroid hormone. As kidney function decreased, the percentage of disagreement between the assays increased. Conclusion: There is a noteworthy variability between assays in patients with CKD such that the diagnosis of hypovitaminosis D is modified. The mechanism behind this result is still unclear and might be due to a possible interference in the analytical process. However, the clinical significance is unquestionable, as the supplementation of vitamin D can be erroneously prescribed to these patients.

O objetivo do estudo foi produzir anticorpos policlonais para vírus bovino e testar a reatividade em imunoensaios como imunofluorescência, imunoperoxidase e slot blot. Como imunógeno utilizou-se cepas e/ou isolados dos herpesvírus bovino tipo 1, 2 e 5 (BoHV-1, BoHV-2 e BoHV-5), vírus da diarreia viral bovina (BVDV), vírus respiratório sincicial bovino (BRSV), vírus da língua azul (BTV) e vírus vaccina (VACV) amplificados em cultivo celular. Os coelhos foram imunizados em intervalos regulares e o soro hiperimune produzido foi utilizado como anticorpo primário nos imunoensaios. A diluição de trabalho para cada antissoro foi determinada por diluição seriada limitante e variaram entre 1:800 e 1:51.200. As maiores diluições foram observadas para imunoperoxidase, quando comparadas com a imunofluorescência e slot blot. Diluições menores que 1:800 foram associadas com aumento de reações inespecíficas. Os antissoros anti-BoHV-1, -BoHV-5, -BVDV e -BRSV reagiram frente a isolados heterólogos em ensaios de imunofluorescência e imunoperoxidase. Conclui-se que os antissoros produzidos possuem elevadas concentrações de anticorpos específicos para os vírus e é uma alternativa para a utilização em imunoensaios. Palavras-chave: antissoro, detecção viral, imunoensaio, diagnóstico.

A local renin-angiotensin system (RAS) has been postulated in the pineal gland. In addition to angiotensin II (Ang II), other active metabolites have been described. In this study, we aimed to investigate a role for Ang IV in melatonin synthesis and the presence of its proposed (IRAP)/AT4 receptor (insulin-regulated aminopeptidase) in the pineal gland. The effect of Ang IV on melatonin synthesis was investigated in vitro using isolated pinealocytes. IRAP protein expression and activity were evaluated by Western blot and fluorimetry using Leu-4Me-β-naphthylamide as a substrate. Melatonin was analyzed by HPLC, calcium content by confocal microscopy and cAMP by immunoassay. Ang IV significantly augmented the NE-induced melatonin synthesis to a similar degree as that achieved by Ang II. This Ang IV effect in pinealocytes appears to be mediated by an increase in the intracellular calcium content but not by cAMP. The (IRAP)/AT4 expression and activity were identified in the pineal gland, which were significantly higher in membrane fractions than in soluble fractions. Ang IV significantly reduced IRAP activity in the pineal membrane fractions. The main findings of the present study are as follows: (1) Ang IV potentiates NE-stimulated melatonin production in pinealocytes, (2) the (IRAP)/AT4 receptor is present in the rat pineal gland, and (3) Ang IV inhibits IRAP activity and increases pinealocytes [Ca2+]i. We conclude that Ang IV is an important component of RAS and modulates melatonin synthesis in the rat pineal gland.

Introduction: Early diagnosis is an important tool for strategies to fight human immunodeficiency virus (HIV) infection. Objective: The main objective of this study is to evaluate the comparability of the results of rapid tests (RT) used for the HIV diagnosis in relation to conventional molecular and serological tests in blood samples from a population of men who have sex with men (MSM), from 12 Brazilian capitals. Material and methods: 591 HIV-1 reactive test samples from 4176 MSM participants were submitted to Instituto Adolfo Lutz (IAL) for evaluation by conventional laboratory tests. From these samples with at least one RT reagent, 522 samples were analyzed, and in 493 (94.4%) the HIV positivity was confirmed, with 33% HIV-1 viral load above 5,000 copies/mL and 67% by the serological tests. A total of 336 (10%) samples with a non-reactive RT result were evaluated by standard serology, four (1.2%) tested positive for HIV. Results and conclusion: The results showed a high percentage of samples with confirmed HIV positivity in the conventional laboratory tests, as well as some non-reactive results that were confirmed positive, indicating some limitations of the RT single-step method. Therefore, the serological tests had a fundamental role in clarifying the diagnosis. RESUMO Introdução: O diagnóstico precoce é um importante instrumento para estratégias de combate à infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Objetivo: O objetivo principal deste trabalho foi avaliar a comparabilidade do resultado de testes rápidos (TR) utilizados para o diagnóstico de HIV em relação a testes moleculares e sorológicos convencionais em amostras de sangue de população de homens que fazem sexo com homens (HSH) de 12 capitais brasileiras. Material e métodos: Foram encaminhadas ao Instituto Adolfo Lutz (IAL), 591 amostras com resultado reagente no TR HIV dos 4176 HSH participantes para serem avaliadas pelos testes laboratoriais convencionais. Dessas amostras com pelo menos um TR reagente, 522 amostras foram analisadas e em 493 (94,4%) confirmou-se a positividade para HIV, sendo 33% pela carga viral HIV-1 acima de 5.000 cópias/ml e 67% pelos testes sorológicos. Foram avaliadas pela sorologia convencional, 336 (10%) amostras com resultado de TR não reagente; quatro (1,2%) apresentaram-se reagentes para HIV. Resultados e conclusão: Os resultados mostraram elevado percentual de amostras com a positividade confirmada para HIV nos testes laboratoriais convencionais, bem como alguns resultados negativos que se confirmaram positivos, mostrando algumas limitações do método único do TR, destacando-se aos exames sorológicos papel fundamental à elucidação do diagnóstico.

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Introduction: Many factors can impact the performance of diagnostic assays for the human immunodeficiency virus (HIV) infection, affecting the results of population surveys. Objective: The objective of this study was to evaluate the performance of point-of-care rapid tests (RT) used for HIV diagnosis as compared to conventional tests in blood samples from a population of transvestites and transsexual women. Methods: A total of 1,385 samples with HIV RT results were submitted to Instituto Adolfo Lutz for evaluation by conventional laboratory tests. Results: HIV positivity was confirmed by conventional laboratory tests in 100% of the 240 (17.3%) samples with reactive RT. However, 1,145 (82.7%) samples with non-reactive RT results were evaluated; three (0.3%) tested positive and one (0.1%), indeterminate for HIV. Although a proportion of discordant results were found, the point-of-care RTs showed a high confirmation rate when compared to the serological tests. Conclusion: The data of this study corroborate the importance of adopting effective management tools to ensure quality of HIV infection diagnosis. RESUMEN Introducción: Muchos factores pueden impactar en el desempeño pruebas para diagnóstico de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), comprometiendo los resultados de investigaciones poblacionales. Objetivo: El objetivo de este estudio fue evaluar el desempeño de pruebas rápidas (PR) en el punto de atención utilizadas para diagnosticar el VIH en relación con las pruebas convencionales en muestras de sangre de la población de travestis y mujeres transexuales en la ciudad de São Paulo, São Paulo, Brasil. Métodos: Un total de 1.385 muestras con resultados de PR de VIH se remitieron al Instituto Adolfo Lutz (IAL), para ser evaluadas por pruebas de laboratorio convencionales. Resultados: De las 240 (17,3%) muestras que presentaron resultado reactivo en las PR, positividad para VIH se confirmó en el 100% por pruebas de laboratorio convencionales. Sin embargo, de las 1.145 (82,7%) muestras evaluadas con resultado de PR non reactivo, tres (0,3%) se presentaron reactivas y una (0,1%), indeterminada para VIH. Aunque un porcentaje de resultados falsos negativos en las PR ha sido encontrado, las pruebas realizadas en el punto de atención poseen alta tasa de confirmación cuando comparadas con las pruebas serológicas. Conclusión: Los datos de este estudio resaltan la importancia de adoptar herramientas de gestión eficaces para garantizar la calidad del diagnóstico de la infección por VIH. RESUMO Introdução: Muitos fatores podem impactar no desempenho dos testes para diagnóstico da infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), comprometendo os resultados de pesquisas populacionais. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho dos testes rápidos (TR) - point-of-care - utilizados para o diagnóstico do HIV em relação aos ensaios convencionais em amostras de sangue da população de travestis e mulheres transexuais da cidade de São Paulo, São Paulo, Brasil. Métodos: Ao Instituto Adolfo Lutz (IAL), 1.385 amostras com os resultados dos TR do HIV foram encaminhadas para serem avaliadas por testes laboratoriais convencionais. Resultados: Das 240 (17,3%) amostras que apresentaram resultado reagente nos TR, a positividade para HIV foi confirmada em 100% por testes laboratoriais convencionais. Entretanto, das 1.145 (82,7%) amostras com resultado de TR não reagente avaliadas, três (0,3%) apresentaram-se reagentes e uma (0,1%), indeterminada para HIV. Embora uma porcentagem de resultados falso-negativos nos TR tenha sido encontrada, os testes realizados em campo possuem alta taxa de confirmação quando comparados com os testes sorológicos. Conclusão: Os dados deste estudo ressaltam a importância da adoção de ferramentas de gestão eficazes para assegurar a qualidade do diagnóstico da infecção por HIV.

The aim of this study was to estimate the prevalence of use of licit and illicit drugs and verify the behavioral profile among truck drivers. A total of 697 truck drivers were interviewed at a gas station on BR-153, between from February 2014 to February 2015. The questionnaire ASSIST was applied to screening the use of alcoholic beverages, tobacco and illicit drugs. Sociodemographic information and professional were also collected. Urine samples were screened for licit and illicit drugs. All of truckers were male, median age of 42 years, most of them married and low scholarity. 47% related moderate or high consumption of alcohol and tobacco and need a brief intervention. 21% use of cocaine, cannabinoids, amphetamine, hypnotics/sedatives, opioids, inhalants and need specialist treatment. From the 697 participants, 94% provided urine samples. 10,5% were positive for drugs. 5,2% were positive for cocaine, 2,6% for cannabinoids, 2,0% for amphetamine, 0,4% for benzodiazepines, 0,3% positive for methamphetamines and 1,4% for combined use of two drugs. Young and single truckers use tobacco, cannabis and amphetamines and need to receive brief intervention for these drugs. Truck drivers in the northern region of low education, require specialized treatment for tobacco. Truck drivers make high use of tobacco, alcohol, cocaine and other ilicit drugs. Measures are needed to improve quality of life to the drivers, as well as to prevent and treat individuals who use licit and illicit drugs in order to reduce engagement with traffic accidents. Se estimó la prevalencia del uso de drogas lícitas e ilícitas y verificar el perfil de comportamiento de los camioneros. Se entrevistó a 697 camioneros en una gasolinera de la BR-153, de febrero 2014 a febrero 2015. Se aplicó el cuestionario ASSIST para rastrear el consumo de bebidas alcohólicas, tabaco y drogas ilícitas. También se recogió información sociodemográfica y profesional. Se analizaron muestras de orina para detectar drogas lícitas e ilícitas. Los conductores de camiones eran hombres, con una edad media de 42 años, la mayoría de los cuales estaban casados y tenían un nivel educativo bajo. El 47% informó un consumo moderado o alto de alcohol y tabaco y necesitaría una breve intervención y 21% consumía cocaína, cannabinoides, anfetaminas, hipnóticos/sedantes, opioides, inhalantes y necesitan tratamiento especializado. De los 697 participantes, el 94% proporcionó muestras de orina. El 10,5% fueron positivos a fármacos; 5,2% fueron positivos para cocaína, 2,6% para cannabinoides, 2,0% para anfetaminas, 0,4% para benzodiazepinas, 0,3% para metanfetaminas y 1,4% para el uso combinado de drogas. Los conductores de camiones jóvenes y solteros consumían tabaco, marihuana y anfetaminas y necesitaban recibir una breve intervención. Para los camioneros de la región Norte, con bajo nivel educativo, era necesario un tratamiento especializado para el tabaquismo. Los camioneros consumen mucho tabaco, alcohol, cocaína y otras drogas. Se necesitan medidas para mejorar la calidad de vida de los conductores, así como para prevenir y tratar a los usuarios de drogas, con el fin de reducir la participación en accidentes de tráfico. O objetivo deste estudo foi estimar a prevalência do uso de drogas lícitas e ilícitas e verificar o perfil comportamental de caminhoneiros. Foram entrevistados 697 motoristas de caminhões em um posto de gasolina da BR-153, de fevereiro de 2014 a fevereiro de 2015. O questionário ASSIST foi aplicado para rastreamento do uso de bebidas alcoólicas, tabaco e drogas ilícitas. Informações sociodemográficas e profissionais também foram coletadas. Amostras de urina foram testadas para drogas lícitas e ilícitas. Todos os caminhoneiros eram do sexo masculino, idade mediana de 42 anos, a maioria casados e com baixa escolaridade. 47% relataram consumo moderado ou alto de álcool e tabaco e precisariam de uma intervenção breve. 21% consumiam cocaína, canabinoides, anfetaminas, hipnóticos/sedativos, opioides, inalantes e necessitam de tratamento especializado. Dos 697 participantes, 94% forneceram amostras de urina. 10,5% foram positivos para drogas. 5,2% foram positivos para cocaína, 2,6% para canabinoides, 2,0% para anfetaminas, 0,4% para benzodiazepínicos, 0,3% para metanfetaminas e 1,4% para uso combinado de duas drogas. Caminhoneiros jovens e solteiros usavam tabaco, maconha e anfetaminas e precisavam receber intervenção breve para essas drogas. Aos caminhoneiros da região Norte, com baixa escolaridade, o tratamento especializado para o tabagismo era necessário. Os caminhoneiros fazem alto uso de tabaco, álcool, cocaína e outras drogas ilícitas. São necessárias medidas para melhorar a qualidade de vida dos motoristas, bem como prevenir e tratar os usuários de drogas lícitas e ilícitas, a fim de reduzir o envolvimento em acidentes de trânsito.

Ao longo dos últimos 35 anos, grandes progressos foram alcançados em termos de prevenção, diagnóstico e tratamento de infeção VIH, com redução da incidência de infeção em Portugal, na última década. Ainda assim, continua a existir uma taxa elevada de doentes com diagnóstico tardio, com consequências individuais e populacionais. Este artigo tem como objetivos: apresentar um ponto de situação da infeção VIH em Portugal, rever brevemente a evolução natural da infeção e explicitar o mais recente algoritmo de diagnóstico de infeção VIH, revisto em 2014, reforçando a necessidade de manter um elevado nível de suspeição clínica para o diagnóstico precoce de infeção.

Os biomarcadores são uma característica biológica quantificável experimentalmente que permite a avaliação de estados de doença. Os métodos atualmente disponíveis são morosos ou pouco sensíveis, pelo que a bionanotecnologia tem espaço para crescer no desenvolvimento de ferramentas para diagnóstico e deteção. O trabalho desenvolvido e apresentado nesta dissertação teve como objetivo principal o desenvolvimento de bionanoconjugados entre nanopartículas de ouro e anticorpo com vista à criação de um ensaio de imunodeteção por espetroscopia de Raman aumentada pela superfície (SERS) tipo sandwich. O ensaio de imunodeteção tipo sandwich é composto por anticorpos imobilizados numa superfície de, por exemplo, vidro e por sondas de Raman compostas por anticorpos conjugados às nanopartículas com uma molécula ativa em Raman. De forma a atingir os objetivos propostos, foram sintetizadas nanopartículas de ouroesféricas e seguidamente funcionalizadas com 4-MBA (ácido 4-mercaptobenzóico), uma conhecida molécula-repórter de Raman. Esta molécula-repórter possui, numa das extremidades, um grupo tiol (-SH) que se liga fortemente à superfície da nanopartícula e na extremidade oposta possui um grupo carboxílico (-COOH), que por sua vez permite a interação com biomoléculas. Esta é uma interação intrinsecamente fraca pelo que foi promovida uma ligação covalente entre o anticorpo e o grupo carboxílico presente no 4-MBA. com o uso de um agente de reticulação. Para tal, usaram-se agentes reticulantes e foram obtidos bionanoconjugados reprodutíveis e estáveis. O anticorpo usado foi de peroxidase de rábano (Anti-HRP), o que permitiu a determinação da atividade enzimática da peroxidase de rábano (HRP), o antigénio respetivo que se liga aos anticorpos dos bionanoconjugados, confirmando a presença dos anticorpos na superfície da nanopartícula. Os bionanoconjugados finais foram analisados por Raman tendo em conta o sinal da molécula-repórter. Para além do desenvolvimento dos bionanoconjugados, foi iniciado o desenvolvimento da imobilização de anticorpos na superfície. Foi modificada uma superfície de vidro com APTES com o objetivo de obter uma monocamada de silano, pretendendo-se conjugar posteriormente com anticorpo através de uma molécula de glutaraldeído. É necessário continuar a desenvolver o processo de modificação de superfície, explorando diferentes alternativas para a imobilização de anticorpos à superfície de vidro para a conclusão do ensaio de imunodeteção. O principal objetivo foi atingido, tendo sido obtidos bionanoconjugados com actividade enzimática, o que demonstra a ligação do anticorpo, e com sinal em Raman, o que demonstra que é possível serem detetados usando esta técnica espetroscópica. A obtenção destes bionanoconjugados abre a possibilidade à utilização dos mesmos em biossensores em testes rápidos de diagnóstico.

Background: Current guidelines recommend assessment of 25-vitamin D status in patients with chronic kidney disease (CKD). Although significant differences among assays have been described, the impact of CKD on this variability has never been tested. Methods: We tested the variability between two 25-vitamin D assays in patients with CKD (eGFR < 60 mL/min/1.73m2) who had consecutive 25-vitamin D measurements in 2015 (Assay 1 - Diasorin LIASON 25 TOTAL - D assay®) and 2016 (Assay 2 - Beckman Coulter Unicel Xl 800®). The cohort consisted of 791 adult patients (122 with normal renal function and 669 with CKD - 33, 30, and 37% in stages 3, 4, and 5 on dialysis, respectively). Results: Levels of 25-vitamin D were lower and the prevalence of hypovitaminosis D using assay 1 was higher than using assay 2 in patients with CKD, regardless of similar levels of calcium, phosphate, and parathyroid hormone. As kidney function decreased, the percentage of disagreement between the assays increased. Conclusion: There is a noteworthy variability between assays in patients with CKD such that the diagnosis of hypovitaminosis D is modified. The mechanism behind this result is still unclear and might be due to a possible interference in the analytical process. However, the clinical significance is unquestionable, as the supplementation of vitamin D can be erroneously prescribed to these patients. Resumo Antecedentes: As diretrizes atuais recomendam a avaliação do estado da 25-hidroxivitamina D em pacientes com doença renal crônica (DRC). Embora significativas diferenças entre os ensaios tenham sido descritas, o impacto da nesta variabilidade DRC nunca foi testado. Métodos: Testamos a variabilidade entre dois ensaios de 25-hidroxivitamina D em pacientes com DRC (TFGe < 60 mL/min/1,73 m2) que realizaram medidas consecutivas de 25-hidroxivitamina D em 2015 (Ensaio 1 - Diasorin LIASON 25 TOTAL - D assay® ) e 2016 (Ensaio 2 - Beckman Coulter Unicel Xl 800®). A coorte consistiu de 791 pacientes adultos (122 com função renal normal e 669 com DRC - 33, 30 e 37% nos estágios 3, 4 e 5 em diálise, respectivamente). Resultados: Os níveis de 25-hidroxivitamina D foram menores e a prevalência de hipovitaminose D foi maior utilizando o ensaio 1 do que com o ensaio 2 em pacientes com DRC, independentemente dos níveis similares de cálcio, fosfato e paratormônio. Quando a função renal diminuiu, a porcentagem de discordância entre os ensaios aumentou. Conclusão: Existe uma notável variabilidade entre os ensaios em pacientes com DRC, de modo a modificar o diagnóstico de hipovitaminose D. O mecanismo por trás desse resultado ainda não está claro e pode ser devido a uma possível interferência no processo analítico. Entretanto, o significado clínico é inquestionável, pois a suplementação de vitamina D pode ser erroneamente prescrita a esses pacientes.

La neurocisticercosis (NCC) es la localización en el sistema nervioso central (SNC) humano de la parasitosis provocada por el estadio larvario de la Taenia solium, el cisticerco, que prevalece en áreas urbanas y rurales y constituye un problema de salud pública. El diagnóstico puede efectuarse por exploración imagenológica del SNC con resonancia magnética o tomografía axial computarizada, no siempre disponible, y por pruebas de inmunoensayo (EIA) en sangre, que aportan al diagnóstico rapidez, bajo costo y transferibilidad. Para evaluar su capacidad diagnóstica y validar la precisión de la técnica de ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), en la detección de anticuerpos anti-cisticercos en sueros humanos, se diseñó una seroteca en forma aleatoria y en doble ciego, y se realizó el ELISA con las muestras, utilizando placas sensibilizadas con antígenos obtenidos del fluido vesicular de cisticercos de T. solium. Para la validación se realizaron 20 ensayos empleando controles positivos y negativos, por cuadruplicado en diferentes días, y realizados por más de un operador; el punto de corte para este método fue una densidad óptica de 0,325. La precisión intralaboratorio para el control débil (media=0,532±0,09) fue de %CV=17,51±0,09, y un valor de repetibilidad de %CV=7,04±0,04, cifras que se encuentran dentro de los límites esperados para el método. Con estos resultados se puede concluir que la precisión del ELISA para el serodiagnóstico de NCC se encuentra validada. El ensayo validado proporcionó resultados coherentes y repetidos que permitieron discriminar entre dos resultados dicotómicos y establecer con exactitud la condición de una posible infección, con un nivel de certidumbre estadística predeterminado. Neurocysticercosis (NCC) is the location in the human central nervous system (CNS) of the parasitosis caused by the larval stage of Taenia solium, the cysticercus which prevails in urban and rural areas, constituting a public health problem. Diagnosis can be made by CNS imaging with magnetic resonance or computerized axial tomography, not always available, and by blood immunoassay (EIA) tests, which provide rapidity, low cost and transferability. In order to evaluate its diagnostic capacity and validate the ELISA (Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay) technique in the detection of anti-cysticercus antibodies in human sera, a collection of sera was designed in a randomized and double-blind manner, and the ELISA was performed with the samples, using plates sensitized with antigens obtained from the vesicular fluid of T. solium cysticerci. Twenty trials were conducted, using positive and negative controls, in quadruplicate, on different days, and performed by more than one operator; the cutoff for this method was an optical density of 0.325. The intralaboratory precision for the weak control (mean=0.532±0.09) was %CV=17.51±0.09, and a repeatability value of %CV=7.04±0.04, figures that are within the expected limits for the method, It can be concludedthat the accuracy of the ELISA for serodiagnosis of NCC is validated. The validated test provided consistent and repeated results, which made it possible to discriminate between two dichotomous outcomes, and to establish with accuracy the condition of a possible infection, with a predetermined level of statistical certainty. A neurocisticercose (NCC) é o local no sistema nervoso central (SNC) humano de parasitose causada pelo estágio larval da Taenia solium, o cisticerco, prevalecente em áreas urbanas e rurais, constituindo um problema de saúde pública. O diagnóstico pode ser feito por varredura imagenológica do SNC com ressonância magnética ou tomografia axial computadorizada, nem sempre disponível, e por testes de imunoensaio (EIA) em sangue, que fornecem ao diagnóstico rapidez, baixo custo e portabilidade. Para avaliar a sua capacidade de diagnóstico e validar a precisão da técnica de ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas), na detecção de anticorpos anti-cisticercos em soros humanos, um serrarium foi projetado em forma aleatória e em duplo cego, e foi realizado com as amostras o ELISA, utilizando placas sensibilizadas com antígenos derivados do fluido vesicular de cisticercos de T. solium. 20 testes para validação foram realizados, utilizando controles positivos e negativos, em quadruplicado, em dias diferentes, e realizados por mais de um operador; o ponto de corte para este método era uma densidade óptica de 0,325. A precisão intralaboratorial para o controle fraco (média=0,532±0,09) foi de CV%=17,51±0,09, e um valor de repetibilidade de CV%=7,04±0,04, valores que estão dentro dos limites esperados para o método, podendo concluir com esses resultados que a precisão do ELISA para diagnóstico sorológico de NCC é validado. O ensaio validado forneceu resultados consistentes e repetidos, o que permitiu discriminar entre dois resultados dicotômicos e identificar com exatidão a condição de possível infecção com um nível de certeza pré-determinado estatisticamente.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) This work describes the development of electrochemical immunoassays using electrode disposable devices made from low cost materials as an alternative for detection of the biomarkers p16, GSTP1, PSA and CYFRA-21-1 for prostate cancer diagnosis. In the immunoassays developed, magnetic micro/nanoparticles were used in order to provide the capture and separation of the biomarker and the amplification of the analytical signal allowing to reach high selectivity and low limits of detection. For this propose, disposable microfluidic cell was developed and constructed containing 8 carbon-based working electrodes, an Ag|AgCl electrode as a pseudo reference electrode and a carbon electrode as an auxiliary electrode. Three different immunoassays were developed. The first work consisted in the development of an electrochemical immunoassay for the detection of the p16 biomarker. Immunoassays were performed after optimization of the parameters, such as incubation time and flow rate used in the microfluidic system. The calibration curve was prepared in calf serum with p16 concentration in the range of 1.38 to 27.7 fg mL-1. The device presented detection limit (LoD) of 0.04 fgmL-1 and sensitivity of 11.6 nA (fg/mL)-1. The second method consisted of the simultaneous detection of PSA and GSTP1 biomarkers. Peak currents obtained showed a linear response between 0.7 - 27.8 fg mL-1 for GSTP1 and 0.28-277 fg mL-1 for PSA. The sensitivities reached for GSTP1 and PSA were 22.4 nA (fg/mL)-1 for both biomarkers and the LoDs were of 0.15 fg mL-1 for GSTP1 and 0.16 fg mL-1 for the PSA. Finally, the third immunoassay consisted of the application of synthetic nanoparticles (MNPs) of Co0.25Zn0.75Fe2O4 (CoZnFeONPs) and Fe3O4 (FeONPs) used to mimic the enzyme peroxidase. The use of modified carbon work with graphene oxide (GO) and MNPs allowed the electrochemical detection of CYFRA-21-1 with LoDs of 0.30 fg mL-1 and 0.19 fg mL-1 for FeONPs and CoZnFeONPs, respectively. Finally, it was possible to test the immunosensor in serum of patients provided by the Hospital de Amor from Barretos city obtaining concordant results with ELISA method, which showed that the device is a promising choice for diagnosis of prostate cancer in relation to traditional methods as ECL and ELISA. Este trabalho descreve o desenvolvimento de imunoensaios eletroquímicos utilizando dispositivos descartáveis à base de eletrodos fabricados com materiais de baixo custo como alternativa para detecção dos biomarcadores p16, GSTP1, PSA e CYFRA-21-1 voltados para o diagnóstico de câncer de próstata. Nos imunoensaios desenvolvidos foram utilizados micro/nanopartículas magnéticas as quais proporcionaram a captura e separação dos biomarcadores e amplificação do sinal analítico, permitindo atingir alta seletividade e baixos limites de detecção. Para isso, uma célula microfluídica descartável foi desenvolvida contendo 8 eletrodos de trabalho à base de carbono, um eletrodo de Ag|AgCl como pseudo eletrodo de referência e um eletrodo de carbono como eletrodo auxiliar. Três diferentes imunoensaios foram desenvolvidos. O primeiro trabalho consistiu no desenvolvimento de um imunoensaio eletroquímico para a detecção do biomarcador p16. As imunoanálises foram realizadas após a otimização dos parâmetros, como tempo de incubação e vazão do fluxo utilizada no sistema microfluídico. A curva de calibração foi construída com solução padrão dos biomarcadores preparadas em soro de bezerro com concentração de p16 no intervalo de 1,38 a 27,7 fg mL-1. O dispositivo apresentou limite de detecção (LoD) de 0,04 fgmL-1, sensibilidade de 11,6 nA(fg/mL)-1 e coeficiente de correlação de 0,995. O segundo método consistiu na detecção simultânea dos biomarcadores PSA e GSTP1. As correntes de pico obtidas apresentaram resposta linear entre 0,7 - 27,8 fg mL-1 para GSTP1 e 0,28 - 277 fg mL-1 para o PSA. As sensibilidades alcançadas para GSTP1 e PSA foram de 22,4 nA(fg/mL)-1 para ambos biomarcadores e os LoDs foram de 0,15 fg mL-1 para o GSTP1 e 0,16 fg mL-1 para o PSA. Por fim, o terceiro imunoensaio consistiu na aplicação de nanopartículas magnéticas sintetizadas (MNPs) de Co0.25Zn0.75Fe2O4 (CoZnFeONPs) e de Fe3O4 (FeONPs) que foram utilizadas para mimetizar a enzima peroxidase. O uso de eletrodos de trabalho de carbono modificado com óxido de grafeno (GO) e MNPs permitiram a detecção eletroquímica de CYFRA-21-1 com LoDs de 0,30 fg mL-1 e 0,19 fg mL-1, para FeONPs e CoZnFeONPs, respectivamente. Por fim, foi possível testar os imunossensores frente a soro de pacientes fornecidos pelo Hospital de Amor de Barretos/SP obtendo respostas concordantes com o método ELISA, evidenciando que o dispositivo é uma escolha promissora para uso no diagnóstico de câncer de próstata frente aos métodos tradicionais ECL e ELISA. CAPES: Código de Financiamento 001

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 Submitted by Cristina Manessiez (camanessiez@fc.ul.pt) on 2020-01-25T16:03:48Z No. of bitstreams: 1 ulfc125686_tm_Ana_Sofia_Silvestre.pdf: 224853 bytes, checksum: c8123dd11cf495042de1472b6a4a79fb (MD5) Made available in DSpace on 2020-01-25T16:03:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc125686_tm_Ana_Sofia_Silvestre.pdf: 224853 bytes, checksum: c8123dd11cf495042de1472b6a4a79fb (MD5) Previous issue date: 2019

La determinación del nivel de anticuerpos por medio de ensayos ELISA exige construir una curva de calibración según el modelo logístico de 4 parámetros (4PL); no obstante, es común que el bioquímico realice estimaciones y ajuste los datos de calibración con modelos alternativos. Se buscó determinar para un ensayo ELISA semicuantitativo el modelo que mejor ajusta los datos de calibración y cuál de los modelos alternativos explorados genera menor error relativo porcentual (ERP) al predecir las concentraciones de los calibradores. Para esto se empleó un ELISA indirecto y se ajustaron las densidades ópticas (DO) de los calibradores según los modelos i) exponencial ii) Boltzmann iii) Boltzmann semi log iv) Deming v) regresión lineal vi) 4PL vii) cuadrático. Se encontró que el mejor ajuste lo proveen los modelos v) (R2=0,9914), i) (R2=0,9652) y iii) (R2=0,9650). Sin embargo, los modelos i) y iii) tienen mejor desempeño en el procedimiento de ajuste inverso: el ERP se mantuvo ≤20% en el rango cubierto por los 6 calibradores (0-100 UI/mL). Los modelos lineales iv) y v) presentaron ERP elevados en el rango testeado. En resumen, el ajuste exponencial i) y el ajuste de Boltzmann iii), combinan valores de R2 y ERP comparables al modelo 4PL, por lo cual es inapropiado cualquier tipo de ajuste lineal. Determination of the levels of specific antibodies by semiquantitative ELISAs requires the construction of a 4 parameter logistic regression (4PL) calibration curve. However, alternative models are often employed to adjust and estimate calibration data. The aims of this work were to determine the model that best adjusts calibration data, and which alternative model generates a lower relative percentage error (RPE) in the prediction of calibrator concentrations. An IgA anti-gliadin ELISA was used. The optical density values (OD) of calibrators were adjusted with the following mathematical models: i) Exponential, ii) Boltzmann, iii) Boltzmann semilog, iv) Deming, v) Linear regression, vi) 4PL, and vii) Quadratic. Results indicated that the best adjustment is given by models v) (R2=0.9914), i) (R2=0.9652) and iii) (R2=0.9650). However, models i) and iii) performed better in the reciprocal adjustment procedure: RPE values were ≤20% for all the calibrator levels analyzed (0-100 IU/mL). The linear models iv) and v) had high RPE values. To sum up, the exponential (i) and Boltzmann (iii) adjustments present R2 and RPE values similar to those of the 4PL, the use of any linear adjustment being inappropriate. A determinação do nível de anticorpos por meio de ELISA requer a construção de uma curva de calibração de acordo com o modelo logístico de 4 parâmetros (4PL); no entanto, é comum o bioquímico fazer estimativas e ajustar os dados de calibração com modelos alternativos. Procurou-se determinar para um ensaio ELISA de modelo semiquantitativo o modelo que melhor se ajusta os dados de calibração e qual dos modelos alternativos explorados gera menor erro relativo percentual (ERP) ao prever as concentrações dos calibradores. Para isso, um ELISA indireto foi utilizado e se ajustaram as densidades ópticas (DO) dos calibradores segundo os modelos i) exponencial ii) Boltzmann iii) Boltzmann semi log iv) Deming v) regressão lineal iv) 4PL vii) quadrático. Verificou-se que o melhor ajuste é fornecido pelos modelos v) (R2= 0,9914), vi) (R2= 0,9652) e iii) (R2= 0,9650). No entanto, os modelos i) e iii) têm melhor desempenho no procedimento de ajuste inverso: o ERP permaneceu ≤20% na faixa coberta pelos 6 calibradores (0-100 UI/mL). Os modelos lineares iv) e v) apresentaram alto ERP na faixa testada. Em resumo, o ajuste exponencial i) e o ajuste de Boltzmann iii) combinam valores de R2 e ERP comparáveis ao modelo de 4PL, sendo inadequado qualquer tipo de ajuste linear.

A leucose enzoótica bovina (LEB) é uma doença linfoproliferativa infecciosa dos bovinos causada pelo vírus da leucemia bovina (BLV), um membro da família Retroviridae, gênero deltaretrovirus. A LEB é caracterizada por linfocitose persistente e linfossarcoma e tem um impacto econômico expressivo devido a perdas na exportação, tratamento de infecção secundária, redução na produção de laticínios e também devido ao manejo especial necessário. Não obstante, o DNA proviral e as proteínas estruturais do vírus foram encontradas em tecidos humanos, especialmente aqueles associados ao câncer de mama, sugerindo que este vírus pode ser transmitido naturalmente aos seres humanos. A principal forma de detecção da LEB é através do diagnóstico laboratorial, já que muitos animais infectados não apresentam sinais clínicos e os achados clínicos não são conclusivos. O diagnóstico de LEB pode ser feito por métodos moleculares e pela detecção de anticorpos específicos em amostras de soro ou leite. O animal infectado desenvolve uma resposta imune humoral contra proteínas virais, principalmente contra a gp51 (proteína de envelope), e sua identificação é crucial para a vigilância epidemiológica, certificação de áreas livres de doenças e estudos de prevalência. Este trabalho de conclusão de curso compõe-se de um capítulo de revisão de literatura e um capítulo descrevendo o desenvolvimento e padronização de um ELISA indireto usando um peptídeo sintético predito in silico como antígeno. O capítulo de revisão tem como objetivo descrever a biologia, epidemiologia, patogênese, sinais clínicos e diagnósticos para o BLV, assim como a importância da infecção na resposta imune dos animais, e apresentar os mais recentes estudos sobre a possível infecção dos humanos pelo BLV. O segundo capítulo compreende a predição in silico, a síntese química do peptídeo linear KIPDPPQPDFPQL, denominado pgp51 e posterior padronização do ELISA. O ELISA pgp51 foi eficiente para segregar amostras de soro positivas e negativas, indicando que ele tem um grande potencial para ser usado no diagnóstico sorológico de LEB. Posteriormente, o ELISA-i, recém padronizado, foi comparado a testes diagnósticos disponíveis comercialmente. O ELISA indireto utilizando peptídeo sintético pgp51 após predição de epítopos in silico obteve resultados comparáveis aos testes diagnósticos utilizados atualmente podendo também ser usado como teste diagnóstico para LEB para estudos de prevalência da doença no Brasil. Além disso, foi possível observar divergência nos resultados obtidos entre os testes comerciais disponíveis para o diagnóstico do BLV, o que leva a reconsiderações no sistema de diagnóstico usado atualmente. Enzootic bovine leukosis (EBL) is an infectious lymphoproliferative disease of cattle caused by bovine leukemia virus (BLV), a member of the Retroviridae family, genus Deltaretrovirus. The EBL is characterized by persistent lymphocytosis and the presence of lymphosarcoma. It has anexpressive economic impact due to export losses, treatment of secondary infection; decrease of dairy production and also due to a differential handling required. Nevertheless, proviral DNA and structural virus proteins have been found in human tissues, especially those associated with breast cancer, suggesting that BLV could be transmitted naturally to humans. The main form for EBL diagnosis is by laboratory methods, once infected animals show no clinical signs or they are usually inconclusive. The diagnosis of EBL can be performed by molecular techniques and by the detection of specific antibodies in serum or milk samples. The infected animal develops a humoral immune response to viral proteins, primarily to gp51 (an envelope protein), and its identification is crucial for epidemiological surveillance, certification of disease-free areas, and prevalence studies. This work consists of a literature review chapter and of another chapter describing the development and standardization of an indirect ELISA using a synthetic peptide predicted in silico as antigen. The review chapter aims to describe the biology, epidemiology, pathogenesis, clinical signs and diagnoses for BLV, as well as the importance of this infection in the immune response of the animals, and present the latest evidencies on the possible human infection by BLV. The second chapter comprises the in silico prediction, the chemical synthesis of the linear peptide KIPDPPQPDFPQL, described as pgp51, and the subsequent standardization of the ELISA. The pgp51 ELISA was efficient to segregate positive and negative serum samples, indicating that it has a great potential to be used in the serological diagnosis of EBL. Afterward, the newly standardized ELISA-i was compared to commercialized available diagnostic tests. The indirect ELISA using synthetic peptide pgp51 after prediction of in silico epitopes obtained results comparable to the currently used diagnostic tests and thus it also can be used as diagnostic test for EBL in studies of prevalence in Brazil. In addition, the commercial tests showed divergence in the results for the diagnosis of BLV, which explicit need to reconsideration in the diagnostic system used currently.

A macroprolactina é um interferente comum nas dosagens de prolactina por imunoensaios. A identificação da macroprolactinemia pode prevenir erros diagnósticos e condutas inadequadas em pacientes. A pesquisa de macroprolactina após precipitação com o polietileno glicol (PEG) é o método mais utilizado na prática dos laboratórios clínicos. O objetivo geral deste estudo foi avaliar a implantação da pesquisa de macroprolactina em amostras hiperprolactinêmicas, com a interpretação dos resultados baseada na comparação da concentração de prolactina monomérica pós-PEG com um intervalo de referência apropriado no Serviço de Medicina Laboratorial (SML) do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais (HC/UFMG). Os objetivos específicos foram validar o reagente comercial para a dosagem de prolactina no sistema analítico Architect® (Abbott); validar os intervalos de referência para prolactina monomérica pós-PEG; comparar os dois critérios de interpretação da pesquisa de macroprolactina pós-PEG, comparar os resultados de algumas amostras com a cromatografia em coluna de gel filtração (GFC) e avaliar a prevalência de macroprolactinemia na população do estudo. Foi realizada a validação do reagente comercial para dosagem de prolactina com estudos de precisão, linearidade e exatidão. Para verificação dos intervalos de referência de prolactina monomérica pós-PEG, foram utilizadas amostras de 40 pessoas saudáveis. A pesquisa de macroprolactina pela precipitação com PEG foi realizada em 112 amostras hiperprolactinêmicas, 96 mulheres (18-80 anos, mediana 38 anos) e 16 homens, (2165, 45). Um grupo de 25 amostras foi encaminhada para a GFC. Foi feita uma comparação entre duas abordagens de interpretação dos resultados da pesquisa de macroprolactina e foi calculada a prevalência de macroprolactinemia nas amostras hiperprolactinêmicas estudadas. As validações do reagente para prolactina e dos intervalos de referência foram adequadas às especificações da qualidade previamente estabelecidas. A interpretação dos resultados pela comparação da concentração de prolactina monomérica pós-PEG com um intervalo de referência apropriado apresentou maior especificidade do que o critério convencional de porcentagem de recuperação de prolactina pós-PEG, identificando amostras com excesso simultâneo de macroprolactina e de prolactina monomérica bioativa e reduzindo o número de resultados indeterminados. Houve concordância em 24 resultados da GFC com os encontrados neste estudo. A prevalência de macroprolactinemia encontrada foi de 19%. Recomenda-se a implantação da pesquisa de macroprolactina pela precipitação com o PEG no SML do HC/UFMG, como teste de triagem para as amostras hiperprolactinêmicas. A interpretação do teste pela comparação da concentração de prolactina monomérica pós-PEG, com um intervalo de referência adequado deve ser adotada. Macroprolactin interference is a common problem in the interpretation of immunoassays for prolactin. Identifying macroprolactinemia can prevent errors in diagnosis and subsequent delivery of treatment to patients. The search for macroprolactin after polyethylene glycol (PEG) precipitation is the most commonly used method in clinical laboratories. This study aimed to evaluate the implementation of macroprolactin assessment in hyperprolactinemic samples, with the interpretation of the results based on comparisons between the concentration of post-PEG monomeric prolactin with an appropriate reference range from the Serviço de Medicina Laboratorial (SML) of the Hospital das Clinicas, Universidade Federal de Minas Gerais (HC/UFMG). Study objectives included validation of the commercial reagent for prolactin measurement in the analytical system Architect® (Abbott); checking of reference intervals for post-PEG monomeric prolactin; comparison of the two criteria of interpretation for post-PEG macroprolactin assessment, comparing the results to some samples processed by Gel filtration chromatography (GFC); and to assess the prevalence of macroprolactinemia in the study population. Validation of the commercial reagent for the prolactin assay was performed using tests of precision, linearity and accuracy. To check the post-PEG monomeric prolactin reference ranges, we used samples from 40 healthy people. The macroprolactin assessment by PEG precipitation was performed on 112 hyperprolactinemic samples, 96 women (18-80 years old, mean 38) and 16 men (21-65, 45). We compared both interpretations of the results from the macroprolactin test. A subset of 25 samples was sent to the GFC and compared with results from the PEG precipitation assessment. The validations of the commercial reagent for prolactin and of the reference range for prolactin post PEG were in agreement with the predetermined specifications of quality. Comparison of the post-PEG monomeric prolactin concentration with an appropriate reference range showed greater specificity than the conventional criterion percentage of postPEG prolactin recovery by identifying samples with both excess macroprolactin and monomeric bioactive prolactin and reducing the rate of indeterminate outcomes. Furthermore, most of the results of samples sent to the GFC were in concordance with the results found in this study. The prevalence of macroprolactinemia found was 19%. Based on these results, we recommend the implementation of the macroprolactin assessment with PEG precipitation test at the SML of HC/UFMG, for all hyperprolactinemic samples. Further, the interpretation of the test by comparing post-PEG monomeric prolactin concentration with a suitable reference range should be adopted as it outperformed existing criteria.

Submitted by MARCOS ANTONIO MAIOLI null (maioli_marcos@hotmail.com) on 2016-02-17T13:03:36Z No. of bitstreams: 1 Tese Maioli, M.A..pdf: 2279252 bytes, checksum: 484c7c928f7a1a221c494bcff9e436b0 (MD5) Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-02-17T16:54:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 maioli_ma_dr_araca.pdf: 2279252 bytes, checksum: 484c7c928f7a1a221c494bcff9e436b0 (MD5) Made available in DSpace on 2016-02-17T16:54:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 maioli_ma_dr_araca.pdf: 2279252 bytes, checksum: 484c7c928f7a1a221c494bcff9e436b0 (MD5) Previous issue date: 2016-02-01 Outra Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Esse estudo teve como objetivo a padronização de um ensaio imunoenzimático (ELISA) para a determinação das concentrações plasmáticas de IGF-I total, utilizando o sistema de amplificação biotina-estreptavidina peroxidase em um ensaio competitivo. O IGF-I foi extraído da IGFBP, utilizando o tampão glicina acidificado seguido de neutralização do pH com hidróxido de sódio. As microplacas foram sensibilizadas com anti IgG de coelho, e as dosagens realizadas utilizando duas abordagens, um método sem competição (incubação prévia das amostras com o anticorpo anti-h-IGF-I) e outro com competição (adição simultânea de IGF-I biotilinado e amostra). Os melhores resultados foram obtidos utilizando o método competitivo, com a sensibilização da placa com 0,25 μg/poço de IgG anti-coelho, o anticorpo específico na diluição 1:250.000 e 0,06 ng/poço de IGF-I biotinilado. O ensaio in house apresentou, um limite inferior de detecção de 50 ng/mL, uma correlação de 0.945 entre doses quando comparado à uma metodologia comercial. Além disso, após 33 ensaios (1114 amostras) a metodologia apresentou uma boa precisão, com coeficientes de variação inter-ensaio de 12,94% (345,8 ng/mL) para os controles alto e 20,71% (131,6 ng/mL) para o baixo. Dessa forma, conclui-se que a metodologia imunoenzimática para quantificação de IGF-I total utilizando o sistema de amplificação biotina-estreptavidina peroxidase em um ensaio competitivo está estabelecida e apresenta-se como uma ferramenta útil para estudos que visem o monitoramento das concentrações de IGF-I. This study aimed to standardize an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to determine plasma concentrations of total IGF-I using the amplification biotin-streptavidin peroxidase system in a competitive assay. The IGF-I was extracted from IGFBPs using the acidified glycine buffer followed by the pH neutralization with sodium hydroxide. The microplates were coated with anti-rabbit IgG, thereafter the measurements were carried out using two approaches, one without competition (prior incubation of samples with the anti-hIGF-I antibody) and another with competition (simultaneous addition of IGF-I and biotinylated sample). The best results were obtained using the competitive method, with the following combination of reagents: microplates were coated with 0.25 µg/well of anti-rabbit IgG, the specific antibody at a dilution of 1:250.000 and 0.06 ng/well of biotinylated IGF-I. The in house methodology showed sensitivity of detection limit of 50 ng/ml, a correlation between doses of 0.945 when compared to a commercial method. In addition, after 33 assays (quantification of 1114 samples) the proposed methodology presented a good precision, with interassay variation coefficients of 12.94% and 20.71% for the high and low controls, respectively. Finally, we concluded that ELISA method for the quantification of total IGF-I using the system biotin-streptavidin-peroxidase amplification in a competitive assay is established and is presented as a useful tool for studies aimed at monitoring the IGF-I concentrations. FAPESP: 2014/09135-9 BEPE: 2015/08021-2

Os esteróides sexuais são produzidos a partir do colesterol e sintetizados nas gônadas, placenta e suprarrenais. Eles dão origem aos caracteres sexuais e tem efeitos sobre os órgãos genitais femininos e masculinos. Sendo estes respectivamente o estrogênio e progesterona na mulher e a testosterona no homem. A dosagem destes hormônios é feita através de métodos laboratoriais, como as técnicas de imunoensaio, que tem como principal finalidade avaliar se os níveis deste no sangue estão em uma faixa normal. Porém alguns estudiosos afirmam que essa dosagem sérica de esteroides sexuais não é eficiente. Para a construção dessa revisão bibliográfica, foi feita uma pesquisa com base nos bancos de dados PudMed, BVSalud e Scielo no intuito de analisar as discussões sob o ponto de vista de vários autores sobre a dosagem sérica de esteróides sexuais, com o objetivo de salientar nossas indagações. Sex steroids are produced and synthesized from cholesterol in the gonads, placenta, and adrenal. They give rise to sexual characters and has effects on the male and female genitals. These being respectively estrogen and progesterone in women and testosterone in men. The dosage of these hormones is made by laboratory methods, such as immunoassay techniques, with the main purpose of this review if the blood levels are in the normal range. But some scholars argue that this serum sex steroids is not effective. For the construction of this literature review, research was based on databases PudMed, BVSalud and Scielo in order to analyze the discussions from the point of view of various authors on serum sex steroids, in order to emphasize our inquiries.

A detecção de toxinas microbianas no controle de qualidade em sistema agroalimentar depende de métodos analíticos eficientes, vinculados a procedimentos inócuos ao ecossistema. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia em camada delgada (CCD) e “enzyme linked immunosorbent assay†(ELISA) destacam-se entre os métodos de análise de toxinas biológicas, com ênfase a micotoxinas, onde ocratoxina A (OTA) desempenha papel importante no mercado globalizado. A CLAE apresenta alta eficiência, porém o custo restringe a implantação na rotina laboratorial. Métodos imunoquímicos (ELISA e cromatografia por imunoafinidade) constituem alternativa promissora para detecção de toxinas, acoplando a especificidade biológica à confiabilidade dos procedimentos químicos. Todavia, a dependência atual da importação de reagentes imunológicos eleva o custo de aplicação no controle de qualidade em alimentos, devendo-se estimular a produção de reagentes, onde a qualidade de anticorpos específicos é fator decisivo nos ensaios. Visando despertar o interesse nesta área de produção, a revisão discerne sobre atualidade em metodologia imunoquímica e importância de sua implementação, seguido de avanços ocorridos no monitoramento de micotoxinas em produtos agrícolas, com ênfase a OTA.

A detecção de toxinas microbianas no controle de qualidade em sistema agroalimentar depende de métodos analíticos eficientes, vinculados a procedimentos inócuos ao ecossistema. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia em camada delgada (CCD) e “enzyme linked immunosorbent assay” (ELISA) destacam-se entre os métodos de análise de toxinas biológicas, com ênfase a micotoxinas, onde ocratoxina A (OTA) desempenha papel importante no mercado globalizado. A CLAE apresenta alta eficiência, porém o custo restringe a implantação na rotina laboratorial. Métodos imunoquímicos (ELISA e cromatografia por imunoafinidade) constituem alternativa promissora para detecção de toxinas, acoplando a especificidade biológica à confiabilidade dos procedimentos químicos. Todavia, a dependência atual da importação de reagentes imunológicos eleva o custo de aplicação no controle de qualidade em alimentos, devendo-se estimular a produção de reagentes, onde a qualidade de anticorpos específicos é fator decisivo nos ensaios. Visando despertar o interesse nesta área de produção, a revisão discerne sobre atualidade em metodologia imunoquímica e importância de sua implementação, seguido de avanços ocorridos no monitoramento de micotoxinas em produtos agrícolas, com ênfase a OTA.

Tem-se observado um aumento na prevalência de hipovitaminose D desde a adoção de valores de referência baseados em medidas funcionais, como a concentração sérica de 25-hidroxivitamina D (25OHD) capaz de suprimir a secreção de paratormônio (PTH). Embora esta abordagem não tenha levado à obtenção de um limiar definitivo, o ponto de corte de 30 ng/mL tem sido amplamente empregado. O objetivo deste trabalho foi analisar a relação entre resultados de 25OHD e PTH dosados simultaneamente, para avaliar a adequabilidade da utilização de pontos de corte universais para vitamina D. Investigou-se a influência da idade, da função renal, dos níveis séricos de cálcio iônico e de dois diferentes imunoensaios para dosagem de 25OHD (Architect® e LIAISON®) nesta relação. Foram obtidos 23.259 resultados emparelhados de 25OHD e PTH, dosados entre janeiro e dezembro de 2012, no laboratório Hermes Pardini. Não foi observado um platô de supressão do PTH na relação entre os dois analitos. As medianas de PTH para uma mesma concentração de 25OHD foram consistentemente mais altas com o avançar da idade e na subpopulação com alterações da função renal e/ou dos níveis séricos de cálcio iônico. A utilização de dois imunoensaios distintos para dosagem de 25OHD não alterou sua relação com o PTH. Concluindo, os valores de referência universais atualmente adotados não são adequados para avaliação dos níveis séricos de vitamina D. Idade, função renal e níveis de cálcio iônico da população estudada deveriam ser considerados na determinação funcional de suas concentrações ótimas e na interpretação dos resultados. It has been noticed an increase in the prevalence of hypovitaminosis D since the introduction of reference values based on functional measurements, such as 25-hydroxyvitamin D (25OHD) levels that maximally suppress parathyroid hormone (PTH) secretion. Although this approach has not led to a definitive threshold, 30 ng/mL has been widely adopted as the cutoff value for defining optimal vitamin D status. The objective of this study was to analyze the relationship between 25OHD and PTH simultaneously measured, in order to assess the appropriateness of single universal thresholds for vitamin D. The influence of age, renal function and ionized calcium levels on this relationship was evaluated, as well as the impact of using two different assays for 25OHD testing (Architect® and LIAISON®). This was a cross-sectional analysis of 23,259 paired serum PTH and 25OHD levels, measured from January to December 2012. There was no evidence of a plateau relationship between these two analytes. For similar 25OHD concentrations, PTH medians were consistently higher with advancing age and in the subpopulation with impaired renal function and/or abnormal ionized calcium levels. Using different immunoassays for 25OHD testing had no significant impact on its relationship with PTH. In conclusion, single universal reference values are not suitable for assessing vitamin D status. Age, renal function and ionized calcium levels of the studied population should be taken into account in the definition of vitamin D optimal concentrations and in the interpretation of 25OHD results.

The HLA systems (Human Leukocyte Antigen) have a prominent role among the biological systems involved in the rejection process. In this study, we evaluated the HLA class I (HLAA,-B and-C) and class II (HLA-DRB1, -DQA1 and -DQB1) allele frequencies and humoral immune response to HLA antigens in chronic renal patients, renal transplant candidates, from Northern/Northwestern of Parana State. HLA typing was performed by the method of polymerase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSO) associated with Luminex technology, using genomic DNA extracted from peripheral blood leukocytes. The evaluation of the presence of anti-HLA antibodies against a panel of HLA antigens (Panel-Reactive Antibodies - PRA) was performed by complement dependent cytotoxicity (CDC), CDC with the addition of anti-human globulin (CDC-AHG), CDC with the addition of dithiothreitol (CDC-DTT) and solid-phase immunoassay associated with Luminex technology (SPI; LS1PRA kit, One Lambda, Inc.), using serum samples. Determination the specificities of anti-HLA antibodies were performed by kits LS1PRA and LS2PRA (SPI; One Lambda, Inc.). The performance of CDC, CDC-AHG, CDC-DTT and SPI methods for detection of anti-HLA antibodies class I was analyzed in 70 serum samples from chronic renal patients. Mean PRA detected by SPI (37.5 ± 34.2%) was higher than the values detected by the other methods. Comparative analyses revealed significant difference between CDC and CDC-AHG (P

FACEPE A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma infecção causada por várias espécies de protozoários pertencentes à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e ao gênero Leishmania, tendo L. (Viannia) braziliensis como agente etiológico de maior incidência no Brasil. A LTA é uma doença endêmica no país e que ainda apresenta dificuldades de diagnóstico laboratorial. Os pontos quânticos (PQ) são nanocristais fluorescentes de materiais semicondutores que recentemente vêm sendo empregados como fluoróforos no desenvolvimento de novos métodos imunoquímicos como alternativa diagnóstica, visando inovar e otimizar as técnicas atuais. O presente estudo demonstrou a viabilidade dos PQ como insumos fluoróforos em ensaios sorológicos para diagnóstico da LTA. PQ fluorescentes de Telureto de Cádmio (~3 nm) estabilizados com ácido mercaptosuccínico (AMS) foram preparados em meio coloidal e acoplados covalentemente à anti-imunoglobulinas G, via carbodiimida. Foi desenvolvida uma técnica de análise semiquantitativa para o monitoramento da bioconjugação baseada em leitura de fluorescência em microplacas negras. Os bioconjugados obtidos (PQ-Anti-IgG humana) foram submetidos à avaliação de desempenho para a pesquisa de anticorpos humanos anti-L. (Viania) braziliensis. pelas técnicas de citometria de fluxo, imunofluorescência indireta (IFI) e por ensaio imunofluorescente de adsorção baseado em pontos quânticos (PQ-FLISA). Empregou-se as formas promastigotas da cepa de referência (MHOM/BR/75/M2903) de Leishmania (V.) braziliensis na IFI e citometria de fluxo, enquanto que no PQ-FLISA utilizou-se o antígeno solúvel bruto de L. (V.) braziliensis. Os experimentos realizados por meio das técnicas de citometria de fluxo, IFI e PQ-FLISA em imunodiagnóstico para LTA demonstraram a afinidade dos conjugados obtidos de CdTe/AMS-Anti-IgG em se ligar a imunoglobulinas G, fornecendo resposta diferencial entre controles e amostras analisadas demonstrando a capacidade destes materiais como novos insumos em imunodiagnósticos. The American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) is an infection caused by various species of protozoa belonging to the Kinetoplastida order, family Trypanosomatidae of the Leishmania genre. The L. (V.) braziliensis genus is the most prevalent ethiologic agent of ATL in Brazil. ATL is endemic in the countrie and still presents difficulties in its laboratorial diagnosis. Quantum dots (QDs) are fluorescent semiconductor nanocrystals that have been applied as markers in the development of new immunochemical methods as diagnostic alternative protocols, aiming to innovate and optimize as current techniques. The present study demonstrated the feasibility of QDs as new fluoroimmunoassay active material for the serological diagnostic of ATL. Fluorescent CdTe QDs (~3 nm) stabilized with mercaptosuccinic acid (MSA) were prepared in aqueous colloidal media and coupled covalently to antiimmunoglobulin G by carbodiimide. A semiquantitative technique using a fluorescence plate reader was developed to monitor the bioconjugation procedure. The human QD-anti-IgG bioconjugates were tested for the detection of human antibodies against L (Viania) braziliensis, applying flow cytometry, indirect immunofluorescence (IIF) and adsorption fluoroimmunoassay (QD-FLISA). The promastigote forms of the reference strain (MHOM / BR / 75 / M2903) of Leishmania (V.) braziliensis were used in IFI and flow cytometry, whereas in the QD-FLISA the crude soluble antigen of L. (V.) braziliensis was used. The analysis of all the data demonstrated the capacity of the CdTe/MSA-Anti-IgG bioconjugates to bind to immunoglobulin G and succesfully detect the LTA positive serum compared to the controls. The results showed that these materials may be applied as new tools in the diagnosis of LTA.

CAPES O vírus do dengue (DENV) pertence ao gênero Flavivirus, família Flaviviridae, possuindo RNA genômico de fita simples e apresentando quatro sorotipos antigenicamente relacionados (DENV 1-4). A identificação precoce dos casos de dengue é de vital importância para a tomada de decisões e implementação de medidas de maneira oportuna. No entanto, os métodos de eleição para o diagnóstico das infecções pelos DENV (ensaios imunoenzimáticos de captura de anticorpos das classes IgM e IgG) apesar de possibilitarem a análise rápida e reprodutível, apresentam a limitação da não detecção da enfermidade em sua fase inicial. Tendo por finalidade suplantar essa dificuldade, a obtenção de insumos que possam ser empregados em fluoroimunoensaios de detecção da proteína viral solúvel NS1, apresenta acentuada relevância. Pontos quânticos (PQs) fluorescentes de CdTe foram preparados em água com os estabilizantes, cisteamina (CTM) e ácido mercaptosuccínico (MSA). Os PQs obtidos exibiram elevada fluorescência e estabilidade coloidal, realizando-se a caracterização óptica (emissão/excitação/absorção) e estrutural (DRX/MET). Anticorpos monoclonais anti-NS1 DENV (Mab-anti NS1) específicos para os quatro sorotipos do DENV foram acoplados covalentemente aos PQs, via agentes de acoplamento. Microplacas negras de poliestireno foram previamente sensibilizadas com a proteína viral NS1 nativa, e os bioconjugados obtidos (PQs-Mab anti-NS1) foram utilizados em fluoroimunoensaios de detecção da proteína viral. Os bioconjugados de CdTe/MSA-anti-NS1 DENV para os quatro sorotipos apresentaram resultados promissores nos ensaios de detecção da proteína viral NS1, destacando-se o bioconjugado constituído pelo anticorpo monoclonal anti-NS1 DENV-2. Os bioconjugados foram empregados em ensaios de marcação de células fixadas e não fixadas clone C6/36 infectadas com DENV2, obtendo-se resultados satisfatórios para as células não fixadas. The dengue virus (DENV) belongs to the Flavivirus gender, Flaviviridae family possessing a single-stranded RNA genome and 4 antigenic related serotypes (DENV1 – 4). The early dengue diagnosis is vital for the efficient medical intervention. The existing diagnostic methods for the DENV infections (immunoenzymatic antibody capture based methods of the IgM and IgG classes) although precise and fast still present limitations related to the diagnosis at early stages of the patology. Aiming the development of new diagnostic products for the immunodetection of the NS1 soluble viral protein is still of great importance. Fluorescent CdTe quantum dots (QDs) were prepared in aqueous medium applying mercaptosuccinic acid (MSA) and cysteamine (CTM) as stabilizing agents and used to produce an immunodiagnostic tool for the DENV detection. The QDs showed high fluorescent yield and great colloidal stability and were characterized by X-ray diffractometry, Electronic transmission microscopy, zeta potential and spectroscopic measurements. Monoclonal anti-NS1 DENV (Mab-anti NS1) antibodies specific for the 4 serotypes were covalently attached to the QDs via coupling agents. Black polystyrene microplates were sensibilized with the viral NS1 native protein and the (QDs-Mab anti-NS1) bioconjugates were applied in immunoassays aiming the detection of the viral protein. The CdTe/MSA-anti-NS1 DENV bioconjugates applied for the four serotypes showed promising results in the detection assays of the viral NS1 protein, being the most efficient the bioconjugate that used the monoclonal anti-NS1 DENV-2. The bioconjugates were used in the staining of fixed and live cells of the clone C6/36 infected with DENV2. The results were satisfactory for the live cells.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-12Bitstream added on 2015-04-09T12:47:39Z : No. of bitstreams: 1 000815970.pdf: 611466 bytes, checksum: 271b827fb3d2f7f3486a8357d3947ec5 (MD5) Macacos-da-noite são tidos como excelentes modelos experimentais, que podem contribuir com o desenvolvimento de biotécnicas da reprodução em primatas. O monitoramento do ciclo é um procedimento básico, porém complexo em animais selvagens. Tem-se desenvolvido métodos não invasivos para avaliar o perfil hormonal reprodutivo desses animais expandindo o conhecimento sobre a fisiologia reprodutiva de primatas em cativeiro e vida livre. O presente estudo visa monitorar a atividade folicular e as concentrações fecais de metabólitos de progesterona para ampliar os conhecimentos sobre a fisiologia reprodutiva dessa espécie. Foram utilizadas 12 fêmeas adultas, pertencentes à colônia de reprodução de macacos-da-noite do CENP. O estudo foi realizado a partir do exame ultrassonográfico do ovário e colheita de fezes para monitoramento dos níveis de metabólitos de progesterona dos animais por enzimaimunoensaio. Por meio da dosagem de metabólitos de progesterona foi possível apenas sgerir o ciclo da espécie para o período estudado. Porém, os níveis basais (2,1 ± 0,8 ng/g de fezes secas), a médio do pico (36,6 ± 8,6 ng/g fezes secas), os níveis médios (4,7 ± 1,8 ng/g de fezes secas) e os valores mínimo (0,4 ng/g de fezes secas) e máximo (49,9 ng/g de fezes secas) de metabólitos de progesterona foram determinados para espécie em cativeiro sob estas condições. A determinação do pico e concentrações basais de metabólitos de progesterona, conjuntamente a avaliação ultrassonográfica são ferramentas não invasivas e factíveis na avaliação do ciclo estral de macacos-da-noite Owl Monkeys are considered excellent experimental models and can contribute to the development of biotechnologies of reproduction in primates. Monitoring the reproductive cycle is a basic procedure, however complex in wild animals. Noninvasive methods has been developed to assess the reproductive hormonal profile of these animals expanding knowledge on reproductive physiology of primates in captivity and the wild. This study aims to monitor follicular activity and fecal progesterone levels to increase knowledge about reproductive physiology of this species. 12 adult females belonging to the breeding colony of owl monkeys of CENP were used. The study was performed using the ultrasound examination of the ovaries and feces collection for monitoring the levels of metabolites of progesterone by enzymeimuneassay. By progesterone assay we may suggest the cycle of the species for the period studied. However, the baseline levels (2.1 ± 0.8 ng/g), mean peak (36.6 ± 8.6 ng/g), mean levels (4.7 ± 1.8 ng/g) and the minimum (0.4 ng/g) and maximum (49.9 ng/g) metabolites of progesterone were determined for the specie in captivity. The determination of the peak and basal levels of progesterone together to the sonographic evaluation are noninvasive and feasible in the evaluation of the estrous cycle in owl monkeys