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The need for transplantable beta cells with a stable phenotype has given rise to several strategies including the expansion of existing pancreatic islets and/or growth of new ones. In vitro studies of beta cell proliferation on extracellular matrices plus growth factors have highlighted a possible cell expansion technique; however, the technique was accompanied with loss of insulin secretion. Herein we showed that human islet cell proliferation was marked by a decreased expression of specific differentiation markers, particularly insulin, insulin promoting factor-1 (IPF-1), and glucokinase. After a 6-day expansion period, we tried to reexpress the beta cell differentiation markers with compounds known for their differentiation and/or insulin-secreting properties. Sodium butyrate was a potent factor of IPF-1, insulin, and glucokinase gene reexpression; it also clearly induced secretion of gastrin, a known neogenic factor. Other compounds, namely TGF-β, calcitriol, GLP-1, and activin A, efficiently enhanced the glucose sensor machinery, particularly Glut-1 and glucokinase, thus triggering glucose responsiveness. Our results indicate that specific beta cell gene expression may be induced after expansion and dedifferentiation. This rekindles interest in human beta cell expansion. The possible stabilization of specialized genes needed by beta cells to fulfill their role as nutrient sensors and metabolic regulators may also be of interest to ensure graft maintenance and efficiency.

Whether excess glucose (glucotoxicity) and excess non-esterified fatty acids (lipotoxicity) act synergistically or separately to alter beta-cell function on Type 2 diabetes remains controversial. We examined the influence of non-esterified fatty acids, with or without concomitant increased glucose concentrations, on human islet function and on the expression of genes involved in lipid metabolism.Human islets isolated from non-diabetic and non-obese donors were cultured with 5.5, 16 or 30 mmol/l glucose, and when appropriate with 1 or 2 mmol/l non-esterified fatty acids. After 48 h, glucose-stimulated insulin secretion, insulin content, triglyceride content and expression of different genes were evaluated.Non-esterified fatty acids decreased glucose-stimulated insulin secretion, insulin content and increased triglyceride content of human isolated islets, independently from the deleterious effect of glucose. Increased glucose concentrations also decreased glucose-stimulated insulin secretion and insulin content, but had no influence on triglyceride content. Glucose-stimulated insulin secretion of islets appeared to be significantly correlated with their triglyceride content. Glucose and non-esterified fatty acids modified the gene expression of carnitine palmitoyltransferase-I, acetyl-CoA carboxylase, acyl-CoA oxidase and uncoupling protein 2.In our model of isolated human islets, increased glucose and non-esterified fatty acids separately reproduced the two major beta-cell alterations observed in vivo, i.e. loss of glucose-stimulated insulin secretion and reduction in islet insulin content. Our results also suggest that this deleterious effect was, at least in part, mediated by modifications in lipid metabolism gene expression.

The nuclear receptor hepatocyte nuclear factor (HNF) 4 alpha is involved in a transcriptional network and plays an important role in pancreatic beta-cells. Mutations in the HNF4 alpha gene are correlated with maturity-onset diabetes of the young 1. HNF4 alpha isoforms result from both alternative splicing and alternate usage of promoters P1 and P2. It has recently been reported that HNF4 alpha transcription is driven almost exclusively by the P2 promoter in pancreatic islets. We observed that transcripts from both P1 and P2 promoters were expressed in human pancreatic beta-cells and in the pancreatic beta-cell lines RIN m5F and HIT-T15. Expression of HNF4 alpha proteins originating from the P1 promoter was confirmed by immunodetection. Due to the presence of the activation function module AF-1, HNF4 alpha isoforms originating from the P1 promoter exhibit stronger transcriptional activities and recruit coactivators more efficiently than isoforms driven by the P2 promoter. Conversely, activities of isoforms produced by both promoters were similarly repressed by the corepressor small heterodimer partner. These behaviors were observed on the promoter of HNF1 alpha that is required for beta-cell function. Our results highlight that expression of P1 promoter-driven isoforms is important in the control of pancreatic beta-cell function.

Introduction En therapie cellulaire du diabete, le rapport benefices de l'optimisation glycemique/risques cardiovasculaires du traitement immuno-suppresseur reste mal connu. Notre but etait de determiner l'evolution des complications macroangiopathiques 5 ans apres greffe d'ilots. Patients et methodes 21 des 36 patients greffes suivis prospectivement a Lille, avaient au moins 5 ans de recul et ont ete inclus. Leurs caracteristiques initiales etaient les suivantes : diabete insulinoprive depuis 28±9 ans; âge : 43±7 ans; IMC : 24±2kg/m 2 ; 8/21 greffes renales 23±10 mois auparavant; immunosuppression : Edmonton. Ces 21 patients ont beneficie avant greffe puis annuellement d'un depistage systematique des complications macroangiopathiques. L'analyse a ete faite en intention de traiter. Trois « ilots-seuls » et 2 « ilots-apres-rein » avaient perdu leur fonction C-peptidique a 5 ans. Neuf patients etaient insulino-independants dont 8 avaient une HbA1c 6,5 % (38 % avec les 2 criteres). La moyenne d'HBA1c etait de 8,1±1,0 % avant vs. 7,1±1,0 % apres greffe (p Resultats Les moyennes de cholesterol total (1,86±0,37vs.1,76±0,36g/l), HDL (0,71±0,18vs.0,73±0,27g/l), LDL (0,98±0,32vs.0,88±0,30g/l), triglycerides (0,79±0,33vs.0,83±0,34g/l) et pression arterielle moyenne (124±17/72±7 vs. 127±13/72±8mmHg) ne differaient pas avant vs. apres greffe (patients traites par : statine : 28 % vs.65 %; 1 antihypertenseur : 38 % vs.75 %). Trois patients dont 2 « ilots-apres-rein » avaient des complications macroangiopathiques avant greffe (2 pontages femoraux dont 1 avec amputation, 1 stent coronarien). Le nombre d'evenements cardiovasculaires clinique pendant ces 5 ans etait nul. Avant vs. apres greffe, le depistage etait anormal dans : echodoppler carotidien : 37 % vs 52 % des cas; membres inferieurs : 36 % vs 85 % (22 vs 25 % hors mediacalcose simple), recherche d'ischemie : 14 % (avec coronarographie normale hormis 1 calcification) vs 19 % (dont 3 confirmees en coronarographie, stentees). Conclusion La greffe n'a induit aucun evenement cardiovasculaire aigu clinique chez ces 21 patients atteints d'un diabete ancien, dont 8 greffes renaux au prix du depistage systematique et du traitement des complications macroangiopathiques silencieuses.

Transplantation of islets of Langerhans is a potential cure for type 1 diabetes, but its success is hampered by destruction of the islets. The data presented herein suggest that the active metabolite of vitamin D3 [1,25-(OH)2D3] may promote islet cell survival by modulating the effects of inflammatory cytokines, which contribute to-cell demise. We investigated some of the mechanisms triggering the apoptotic machinery in rat insulinoma RINm5F cells and human islets treated with IL-1 plus interferon- plus TNF and assessed the effects of 1,25(OH)2D3 in these processes. Mitochondrial transmembrane permeability and apoptotic features, determined by percentage of sub-G1 cells, quantitation of DNA strand breaks, and Hoechst staining, were significantly increased by cytokines and reverted toward control values by 1,25-(OH)2D3 cotreatment. The cytoprotection of cells correlated with the abrogation of cytokine-induced nitric oxide production. The activation of nuclear factor-B plays a key role in the different pathways implicated in nitric oxide generation. We demonstrated for the first time, in both RINm5F cells and human islets, that 1,25-(OH)2D3 was able to induce and maintain high levels of A20, an antiapoptotic protein known to block nuclear factor-B activation. Our study showed a clear efficiency of 1,25-(OH)2D3 on the apoptotic machinery triggered by cytokines in-cells and suggests that 1,25-(OH)2D3 could help overcome a major obstacle encountered in the cellular therapy of diabetes, such as nonfunction in the immediate posttransplantation period. (Endocrinology 143: 4809 – 4819, 2002)

Introduction La progression du diabete de type 2 resulte des interactions entre facteurs environnementaux et predisposition genetique. Les etudes genetiques ont demontre la tres forte association des polymorphismes de TCF7L2 avec le diabete de type 2. Alors que l’expression de TCF7L2 est augmentee au niveau de l’ARNm dans des modeles de diabete ou chez les porteurs de l’allele a risque, son expression proteique est diminuee. Enfin, la diminution de l’expression de TCF7L2 par siRNA reduit la secretion d’insuline et accroit l’apoptose d’ilots isoles. Cette apparente contradiction pourrait s’expliquer par un desequilibre de l’expression de certains transcrits regulant des fonctions cellulaires distinctes. L’objectif de cette etude etait donc d’identifier les isoformes de TCF7L2 exprimees dans la cellule-beta et d’analyser leur fonction biologique. Materiels et methodes Les differents transcrits de TCF7L2 ont ete amplifies par PCR a partir d’ARN de cellules-beta humaines triees par FACS, sequences puis clones. Les differents clones ont ensuite ete surexprimes dans des ilots pancreatiques humains isoles et leurs roles sur la secretion d’insuline induite par le glucose et la survie cellulaire analyses. Resultats 9 transcrits alternatifs de TCF7L2 exprimes dans la cellule-beta ont ete identifies. Certains de ces transcrits ont des effets contraires sur la survie cellulaire, la secretion d’insuline et l’expression de genes cibles : alors que le clone #1 induit l’apoptose des cellules-beta et diminue la secretion d’insuline induite par le GLP-1, les clones #3 et #7 stimulent la secretion d’insuline et la proliferation cellulaire. Conclusion Nous avons identifie plusieurs transcrits de TCF7L2 exprimes dans la cellule-beta humaine, capables de reguler des fonctions cellulaires distinctes. La perte proteique de TCF7L2 observee dans les modeles de diabete de type 2 pourrait representer un desequilibre dans l’expression de transcrits specifiques regulant des fonctions cellulaires distinctes.

Le diabete de type 2 augmente significativement le risque d’adenocarcinome pancreatique canalaire (PDAC), comme souligne dans plusieurs etudes epidemiologiques. L’existence d’un lien entre la survenue de PDAC et l’utilisation des analogues du Glucagon-like peptide 1 (GLP-1) chez les patients diabetiques de type 2 est un sujet debattu. Une etude recente a montre que le traitement de souris avec mutation activatrice de K-Ras par exenatide pendant 12 semaines conduit a la proliferation du contingent epithelial pancreatique (cellules canalaires) s’accompagnant d’une reaction mucineuse suggerant une augmentation de l’expression de mucines impliquees dans ce cancer. Notre objectif est de determiner l’effet de l’Exenatide sur les cellules canalaires pancreatiques humaines a la fois in vitro (lignee HPDE) et ex vivo (xenogreffes chez la souris de tissus pancreatiques humains traites ou non par GLP-1) en nous focalisant sur sa capacite a induire la proliferation et a modifier le profil d’expression de mucines membranaires connues pour etre surexprimees (MUC1) ou neoexprimees (MUC4 et MUC16) dans le PDAC et ce a la fois au niveau ARNm (qPCR) et proteique (cytometrie en flux, immunohistochimie). Les resultats confirment que l’exenatide (10 nM) augmente significativement (p

Introduction Gluco et lipotoxicite induisent un stress oxydant et une activation des neutrophiles resultant d’un desequilibre entre pro-oxydant (malondialdehyde (MDA) issu de la peroxydation des acides gras libres (FFA)/ antioxydant (superoxyde dismutase : SOD) ; proteases/inhibiteur de proteases (alpha-1-antitrypsine (A1AT) et pouvoir anti-elastase (PAE). L’A1AT aurait un effet benefique en transplantation d’ilots (TI) (PNAS 2012). Neanmoins, aucune evaluation n’a ete effectuee en clinique humaine. Ce travail prospectif longitudinal decrit l’evolution des marqueurs oxydatifs avant et apres TI. Patients et methodes Dosage des concentrations sanguines de SOD, MDA, FFA, A1AT, PAE, statut anti-xydant total (TAS), immunosuppresseurs, marqueurs metaboliques et renaux et calcul du sscore (indice de fonction insulaire (0 : aucune a 8 : excellente fonction) avant et jusque 10 ans apres greffe, chez 31patients, dont 18 ilots seuls (ITA) et 13 ilots-apres-rein (IAK). Resultats A1AT et PAE different significativement en fonction du sscore, a la difference des autres marqueurs oxydatifs (groupes : 0 ; 1–2 ; 3–4 ; 5–6 ; 7–8) (p Conclusion Les anti-proteases sont les seuls marqueurs oxydatifs constamment influences par la fonction du greffon : un niveau eleve est associe a des marqueurs metaboliques favorables et la difference est sensible meme a des concentrations de C-peptide tres faibles. Le sirolimus inhibiteur du mTOR pourrait jouer un role specifique. Neanmoins, ces resultats ne permettent pas d’anticiper l’efficacite de l’apport exogene d’A1AT apres TI.

Introduction Le rapport benefice-risque a long terme de la greffe d’ilots reste encore indetermine. Cette etude decrit l’evolution de la neuropathie autonome et peripherique 5 ans apres greffe d’ilots avec le protocole d’Edmonton chez des patients diabetiques de type 1 (ClinicalTrial. gov : NCT00446264/01123187). Patients et methodes Vingt et un patients greffes consecutivement (13 ilots seuls, 8 ilots-apres-rein), ont beneficie d’evaluations biologiques, d’une mesure continue de la pression arterielle (MAPA) et de la glycemie (CGM), d’un electromyogramme des membres inferieurs et d’un testing neurovegetatif cardio-vasculaire (variation respiratoire R-R, ratio de Valsalva, variation de la frequence cardiaque et de la pression arterielle a l’orthostatisme) avant greffe et annuellement pendant 5 ans. Resultats Dix/21 patients etaient insulino-independants 5 ans apres greffe avec une HbA1c (mediane (IQR) a 6,0 (5,8–6,7) vs. 7,8 (6,9–8,3) % dans le groupe insulinodependant (p Conclusion La greffe d’ilots ameliore significativement les parametres sensitifs de conduction nerveuse. Comme demontre precedemment, la glycemie moyenne est le principal facteur influencant cette amelioration.

To the Editor: Cell therapy is emerging as a realistic treatment for type 1 diabetes, on the basis of the prolonged success of intraportal islet transplantation in selected patients.1 Key improvements include the development of alternative implantation sites and new tools for in vivo detection of transplanted cells. In the absence of reliable beta-cell markers, previous clinical attempts to visualize transplanted islets have relied on magnetic resonance imaging2 and positron-emission tomography.3 However, these techniques necessitate the in vitro manipulation of islets and are limited by the short half-life of available labeling agents. Glucagon-like peptide 1 (GLP-1)–receptor scanning has been successfully . . .

Aims/hypothesis. Vulnerability of pancreatic islets to oxygen free radicals and nitric oxide contributes to islet transplantation obstacles. This susceptibility can be linked to the low expression levels of antioxidant enzymes in islets. Our aim was to investigate the effect of overexpressing Cu/Zn superoxide dismutase in human islets through a simple procedure on the cytotoxic effects of two nitric oxide donors: 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) and S-Nitroso-N-acetyl-d,l-penicillamine (SNAP). Methods. Cultured human islets and INS-1 rat-derived insulin-secreting cells were transfected by an E1-deleted adenovirus carrying Cu/Zn SOD cDNA under the control of a cytomegalovirus (CMV) promoter (AdSOD). The viability of the cells was tested by the WST-1 assay (Roche, Indianapolis, Ind., USA). Results. The AdSOD procedure allowed SOD activity to increase by twofold to threefold for 2 to 8 days following transfection. Adenovirus-driven SOD overexpression was associated with a significant reduction of SIN-1-induced cytotoxicity on human islets (69.9 ± 10.5 % protection at 200 μmol/l and 40.5 ± 8.9 % protection at 400 μmol/l) and INS-1 cells (82.2 ± 8.8 % protection at 200 μmol/l and 31.1 ± 5.8 % protection at 400 μmol/l). Protection against increasing doses of SNAP was AdSOD dose-dependent. Transfected islets released significantly more insulin than control islets in glucose-theophyllin-stimulated conditions, without or following exposure to SNAP. Conclusions/interpretation. We thus established that adenoviral-induced overexpression of Cu/Zn SOD can be beneficial to human islet endocrine function and resistance to nitric oxide cytotoxicity. These data could be relevant for the development of new strategies aimed at preventing NO-induced beta-cell damage in an islet transplantation setting. [Diabetologia (2000) 43: 625–631]

Susceptibility of pancreatic islets to oxidant stress may affect islet viability and contribute to primary non function of allo- or xenogenic grafts. We investigated the influence of overexpression of catalase (CAT) on the viability of human, porcine and rat islets, as well as INS-1 beta-cell line. Islets were transfected with a replication-deficient adenovirus vector containing human CAT cDNA under the control of the adenovirus major late promoter (AdCAT) or a vector containing no foreign gene (AdNull) and used as a control. Oxidant stress was induced 48 h later by xanthine oxidase-hypoxanthine (XO 25 mU/ml, HX 0.5 mmol/l) or hydrogen peroxide (100 or 250 micromol/l). Islet cell viability was assessed 72 h after CAT transfer by 4-[3-(4-Idophenyl)-2-(4 nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,2,benzene disulphonate (WST-1) test. Baseline catalase activity was three to fourfold lower in porcine than in human islets. CAT activity was reproducibly increased 2.5- to 7-fold in AdCAT infected islets, at least for 13 days. Overall, AdCAT conferred on human and pig islets a protection of 26.1 +/- 6.1 and 21.2 +/- 9.8% on XOHX injury and 35.4 +/- 4.2 and 57.9 +/- 10.5% on H2O2 stress. Similarly, rat islet cells and INS-1 cells were protected on XOHX stress by 17.8 +/- 2.3 and 30.8 +/- 8.7%, respectively. AdNull had no effect. Basal and stimulated insulin secretion was preserved in AdCAT-transfected human islets despite a XOHX challenge. This study validates adenovirus-mediated catalase gene transfer as a realistic approach to reduce non specific inflammation effects on human or porcine islet grafts. Moreover the relevance of defense mechanisms, previously suggested in human islets, is here illustrated in porcine islets.

Pax4 and MafA (v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A) are two transcription factors crucial for normal functions of islet beta cells in the mouse. Intriguingly, recent studies indicate the existence of notable difference between human and rodent islet in terms of gene expression and functions. To better understand the biological role of human PAX4 and MAFA, we investigated their expression in normal and diseased human islets, using validated antibodies. PAX4 was detected in 43.0±5.0% and 39.1±4.0% of normal human alpha and beta cells respectively. We found that MAFA, detected in 88.3±6.3% insulin(+)cells as in the mouse, turned out to be also expressed in 61.2±6.4% of human glucagons(+) cells with less intensity than in insulin(+) cells, whereas MAFB expression was found not only in the majority of glucagon(+) cells (67.2±7.6%), but also in 53.6±10.5% of human insulin(+) cells. Interestingly, MAFA nuclear expression in both alpha and beta cells, and the percentage of alpha cells expressing PAX4 were found altered in a substantial proportion of patients with type 2 diabetes. Both MAFA and PAX4 display, therefore, a distinct expression pattern in human islet cells, suggesting more potential plasticity of human islets as compared with rodent islets.

In the article by Saisho et al. (1), the effect of obesity on β-cell mass and turnover was addressed by indirectly estimating β-cell mass from human pancreatic specimens after death related to disease or trauma. Although these results are consistent with the direct measurement of islet volume after isolation from abruptly deceased healthy organ donors, the correlation between β-cell mass and BMI remains weak ( r ≤ 0.5) (2,3). The authors admit that cross-sectional studies provide limited information on the mechanisms that potentially link obesity with this increased (50%) β-cell mass. Rather unexpectedly, for example, no measurable difference in β-cell …

Introduction L’allogreffe intraportale d’ilots permet la restauration d’une insulino-secretion. Les resultats sont cependant oberee par une intense activation de la coagulation et de l’inflammation, favorisant la destruction initiale des ilots. Celle-ci n’est pas maitrisee par l’heparine, mais reduite par l’antithrombine sur un modele animal. L’objectif de cette etude etait d’optimiser la fonction primaire du greffon, en utilisant l’antithrombine. Patients et methodes Sept patients, presentant un diabete insulinoprive instable ont ete inclus dans cet essai de phase 1 d’allogreffe intra-portale apres catheterisme chirurgical. Chaque patient devait recevoir 1 a 2 injections d’ilots sur 2 mois sous une immunosuppression de type Edmonton, associee a 150 U/Kg d’antithrombine III recombinante (Aclotine * ) les 2 heures precedant et suivant la greffe, afin de maintenir un taux d’antithrombine entre 250 % et 300 %. L’objectif etait d’obtenir un β score > 6 un mois apres la 2 e greffe, avec possibilite de 3 e greffe en cas d’echec, Resultats Cinq patients ont ete greffes. Deux thromboses portes partielles asymptomatiques, l’une lors de la 1re greffe empechant leur poursuite, l’autre a la 3 e greffe, ont justifie une anticoagulation prolongee. Un syndrome hemorragique a necessite la transfusion de 2 culots. Le β-score 1 mois apres la 2 e greffe n’etait > 6 chez aucun patient, justifiant une 3 e greffe, hormis chez celui ayant presente la thrombose initiale. Les 4 patients ayant recu 3 injections d’ilots sur une periode de 4 a 7 mois ont arrete l’insuline 1 a 4 mois apres la 3 e greffe et demeuraient insulino-independants avec HbA1c Conclusion Cet essai a ete interrompu au 5 e patient en raison d’une absence de superiorite de l’antithrombine comparee a l’heparine, avec 3 effets secondaires graves, heureusement resolutifs, sur 13 injections. Les 4 patients ayant recu 3 greffes restent insulino-independants.

Introduction Il existe de nombreuses donnees dans la litterature qui rendent compte de l’importance du selenium et des selenoproteines dans la pathogenie du diabete. Des travaux recents dans notre laboratoire ont montre qu’une nouvelle selenoproteine, la selenoproteine T (SelT), dont le role est inconnu, etait exprimee par des cellules neuroendocrines (PC12) apres stimulation par le PACAP. L’invalidation de la SelT dans ce modele cellulaire altere les mouvements calciques et la liberation hormonale. L’objectif du present travail consiste a tester l’hypothese d’un role de la SelT dans le pancreas endocrine Materiels et methodes Des etudes immunohistochimiques avec un anticorps dirige contre la SelT ont ete realisees sur des coupes de pancreas humains et murins, analysees en microscopie confocale. L’expression de la SelT a egalement ete determinee par PCR quantitative. Sur un modele de souris transgeniques invalidees pour la SelT, le statut glycemique a ete analyse par tests de charge en glucose, dosages plasmatiques d’insuline et tests de sensibilite a l’insuline. Resultats Les etudes immunohistochimiques sur coupes de pancreas humains et murins ont montre un marquage de la SelT specifiquement dans les ilots de Langerhans. L’analyse en microscopie confocale a montre que la SelT etait exprimee dans les cellules beta et delta mais non dans les cellules alpha. L’expression de la SelT a ete confirmee par la technique de qPCR dans les ilots murins et humains et lignee MIN6. Les animaux dont le gene de la SelT est invalide a l’etat homozygote ne sont pas viables. Un profil hyperglycemique au cours du test de tolerance au glucose a ete observe chez des souris heterozygotes, sans difference significative des concentrations plasmatiques d’insuline ni de la sensibilite a l’insuline. Conclusion La SelT est fortement exprimee dans l’ilot de Langerhans et son invalidation est associee a un profil hyperglycemique. Des etudes complementaires in vitro sont en cours afin d’etablir les mecanismes impliques.

Introduction La restauration d’une secretion endogene d’insuline est l’objectif de nombreux traitements innovants du diabete. Les essais cliniques d’allogreffe d’ilots offre une opportunite unique d’etudier le retentissement de cette nouvelle approche therapeutique sur l’equilibre glycemique des patients atteints de diabete de type 1. Materiels et methodes Etude longitudinale ancillaire menee chez 23 patients (11H/12F âges de 44 ± 8 ans, diabetiques depuis 28 ± 10 ans) ayant beneficie entre 2003 et 2007 d’une allogreffe d’ilots pour un diabete de type 1 severe (n = 14) et/ou precedee d’une greffe renale (n = 9). L’equilibre glycemique a ete evalue a l’aide du CGMS (Minimed) durant 72 h, avant la greffe, apres 6 mois, puis chaque annee durant 3 ans. La glycemie moyenne (GM, g/L), la deviation standard de la glycemie (DSG), et le pourcentage du temps passe en hyperglycemie > 1,8 g/L (TPhyper), ou en hypoglycemie Resultats Apres 3 ans, 18 patients gardaient un greffon fonctionnel (78 %) et 13 etaient insulino independants (57 %). Leur equilibre glycemique etait significativement ameliore : HbA1c passant de 8,1 ± 1,0 a 6,7 ± 1,1* %, GM de 1.6 ± 0.4 a 1.25 ± 0.3* g/L, DSG de 0.62 ± 0,22 g/L a 0.36 ± 0.3* g/L, TPhyper de 35 ± 22 a 12 ± 20* %, TPhypo de 4 ± 4 % a 0 ± 1 % (* p Conclusion La restauration d’une insulinosecretion endogene permet d’ameliorer durablement l’equilibre glycemique.

Introduction Les facteurs pronostiques de la TI ne sont pas tous identifies. La reactivation de l’auto-immunite peut participer a un echec. Le but de ce travail est d’evaluer l’effet du taux d’anticorps anti-pancreas pre- et post-transplantation sur le pronostic a 3 ans dans 2 cohortes de patients greffes soit d’ilots seuls (TIS), soit d’ilots apres rein (TIR). Patients et methodes 14 patients ont recu une TIS (âge : 43 ± 8 ans, poids : 70 ± 9 kg) et 11 une TIR (âge : 45 ± 6 ans, poids 64 ± 8 kg) selon le protocole d’Edmonton. Les concentrations plasmatiques de GAD, ICA et IA2 ont ete mesurees avant, hebdomadairement pendant 3 mois, puis 6, 12, 24 et 36 mois apres transplantation, et le typage HLA du receveur repertorie. Resultats Respectivement 1 et 3 ans apres TIS, les taux de succes (insulino-independance avec HbA1c ≤ 6,5 %) etaient de 71 % et 50 %, et apres TIR de 54 % et 36 %. Les patients presentant un taux pre-transplantation de GAD 20 UI/l pre-greffe. Dans les 3 mois suivant la greffe, seule l’ascension des GAD chez les TIR semblait exercer un effet defavorable sur le pronostic a 3 ans. En analyse univariee, tous patients confondus, l’augmentation des GAD (p = 0,06) et des ICA (p Conclusion Ces resultats suggerent un role deletere des concentrations elevees d’anti-GAD avant greffe, ou de leur ascension apres greffe devant conduire a adapter le traitement immunosuppresseur. Neanmoins il ne s’agit pas du seul facteur pronostique puisque les TIR sans anti-GAD eleves ont un devenir moins bon que les TIS.

Rationnel Exendine 4 possede une action antidiabetique en agissant d’une part sur les cellules insulino-secretrices (secretion, proliferation, apoptose) et d’autre part, sur la neogenese a partir des precurseurs canalaires. L’exentatide, est rapidement devenu un adjuvant aux protocoles de greffe d’ilots cliniques. L’administration pendant six mois reduit les besoins en insuline, augmente le « second phase insulin response » mais ces effets sont interompu apres l’arret de traitement. De plus, exentatide a nombreuse effet indirecte notamment un effet hyoglycemiant et anorexigene. Aucun preuve montre l’augmentation de la masse beta. But Etudier l’effet direct d’exendine 4 sur les ilots humains normaux greffes in vivo chez les souris immunodeficientes, normoglycemique en absence d’hyperglycemie et immunosuppresseurs Materiels et Methodes Les ilots pancreatiques humains isolees de n = 7 donneurs et transplante chez les souris Swiss nude nondiabetiques en presence ou absence d’un traitement de 10 ou 45 jours d’Exendine 4. Le suivi (poids, glycemie, c-peptide humain) s’est deroule sur 6 semaines. Resultats Les dosages sur le serum des souris controles ont permis de verifier l’absence de secretion de C-peptide humain serique par ses souris non greffees. Une etude preliminaire nous a permis de confirmer l’effet hypoglycemiant et anorexigene de 10 jours d’exendine 4 chez le receveur (n = 6 souris) et l’augmentation de masse d’ilots endogenes (surface total d’ilots et le diametre moyen) traite avec l’exendine 4 (vs controle). Par contre, l’administration d’exendine 4 a courte duree (10 jours) n’avait pas d’effet sur la c-peptide humain basale ni stimule par le glucose, secrete par les ilots humains (2 000 iilots) provenant de n = 4 donneurs, ni l’admiinistration a longue duree (45 jours) 1000, 500ilots (n = 3 donneurs) dans la duree de l’etude (6 semaines). Nous ne pouvons pas exclure un effet d’exendine sur la proliferation de cellules pancreatiques. Conclusion In vivo chez la souris immunodeficiente en absence d’hyperglycemie et immunosuppresseurs, l’exendine 4 n’induit pas d’augmentation de la fonction d’ilots humains normaux post transplantation.

Introduction La therapie cellulaire est proposee chez le DT1 instable ou greffe renal dans le cadre d’essais cliniques. Depuis l’essai princeps d’Edmonton comportant du sirolimus, du tacrolimus et du daclizumab, de nombreux protocoles d’immunosuppression ont ete proposes. Le role propre des inhibiteurs de mTOR reste discute. Le but de cette etude est d’evaluer l’effet des concentrations d’immunosuppresseurs sur les resultats de la greffe d’ilots. Patients et Methodes 14 patients ont recu une greffe d’ilots seuls (âge 43 ± 8 ans, poids : 70 ± 9 kg) et 11 une greffe d’ilots 22 ± 9 mois apres greffe de rein (âge 45 ± 6 ans, poids 64 ± 8 kg) selon le protocole d’Edmonton. Les concentrations plasmatiques de sirolimus, de tacrolimus, l’HbA1c, la glycemie et le C-peptide, le s score, et les anticorps anti-GAD, ICA et IA2 ont ete mesures. Resultats Respectivement 1 et 3 ans apres « Ilots seuls », les taux d’insulino-independance avec HbA1c 3 ans). Tous malades confondus, il existe une correlation significative 1) negative entre entre sirolimus et tacrolimus d’une part, HbA1c, glycemie a jeun et post prandiale d’autre part ; 2) positive entre sirolimus et tacrolimus d’une part et C-peptide a jeun, post-prandial et sscore d’autre part. Il n’y a pas de relation entre sirolimus ou tacrolimus et creatininemie, clearance en MDRD, GAD, ICA, IA2. La relation est a la limite de la signification entre sirolimus et μalbuminurie. Les concentrations de tacrolimus et de sirolimus, varient significativement en fonction du temps mais seules les concentrations de tacrolimus varient en fonction du type de greffe (plus basses ans le groupe ilots seuls). En analyse univariee, l’augmentation des GAD et des ICA est un facteur pronostique pejoratif, tandis que les concentrations de sirolimus ont un effet pronostique plutot favorable (p = 0,06), a la difference du tacrolimus, Discussion Ces constatations sont en accord avec un certain nombre de donnees obtenues sur des cellules beta en culture ou chez le gros animal montrant un effet insulino-secreteur et antiapoptotique du sirolimus a dose therapeutique. Conclusion Ces resultats arguent en faveur d’un role favorable propre du sirolimus sur le pronostic de la greffe d’ilots tandis que la double association n’a pas d’effet nettement deletere sur le plan renal.

Background In view of the importance of beta cells in glucose homeostasis and the profound repercussions of beta cell pathology on human health, the acquisition of tools to study pancreatic islet function is essential for the design of alternative novel therapies for diabetes. One promising approach toward this goal involves the modification of gene expression profile of beta cells. Results This study describes a new method of gene and siRNA delivery into human pancreatic islets by microporation technology. We demonstrated that mild islet distention with accutase greatly enhanced the transfection efficiency without compromising in vitro function (secretion, apoptosis and viability). As an example, the recently identified gene involved in type 2 diabetes, ZnT8, can be over-expressed or silenced by RNA interference using this technology. Microporation can also be used on rodent islets. Conclusions Taken together, our results demonstrate that microporation technology can be used to modify gene expression in whole rodent and human islets without altering their in vitro function and will be key to the elucidation of the factors responsible for proper islet function.

BackgroundIn-vitro expansion of functional beta cells from adult human islets is an attractive approach for generating an abundant source of cells for beta-cell replacement therapy of diabetes. Using genetic cell-lineage tracing we have recently shown that beta cells cultured from adult human islets undergo rapid dedifferentiation and proliferate for up to 16 population doublings. These cells have raised interest as potential candidates for redifferentiation into functional insulin-producing cells. Previous work has associated dedifferentiation of cultured epithelial cells with epithelial-mesenchymal transition (EMT), and suggested that EMT generates cells with stem cell properties. Here we investigated the occurrence of EMT in these cultures and assessed their stem cell potential.Methodology/principal findingsUsing cell-lineage tracing we provide direct evidence for occurrence of EMT in cells originating from beta cells in cultures of adult human islet cells. These cells express multiple mesenchymal markers, as well as markers associated with mesenchymal stem cells (MSC). However, we do not find evidence for the ability of such cells, nor of cells in these cultures derived from a non-beta-cell origin, to significantly differentiate into mesodermal cell types.Conclusions/significanceThese findings constitute the first demonstration based on genetic lineage-tracing of EMT in cultured adult primary human cells, and show that EMT does not induce multipotency in cells derived from human beta cells.

Resume Objectif Etudier l’influence de la fonction primaire du greffon (FPG) sur les resultats au long cours de la greffe d’ilots avec le protocole d’Edmonton. Patients et methodes Quatorze patients consecutifs atteints de diabete de type 1 severe ont ete inclus dans cette etude de phase 2 et ont recu 12,479 (11,072-15,755) islet equivalent/kg – mediane (Interquartile range) – en deux ou trois infusions sequentielles en 67 (44-95) jours. La FPG etait estimee un mois apres la derniere infusion a l’aide du s-score, un index valide (0 to 8) base sur les besoins en insuline, le C-peptide, la glycemie a jeun et l’HbA1c. Le critere de jugement principal etait la survie du greffon (insulino independance et HbA1c ≤ 6,5 %). Resultats Tous les patients ont pu interrompre l’insuline 12 (6-23) jours apres la derniere infusion. La FPG etait optimale (s-score ≥7) chez 9 patients et suboptimale (s-score ≤ 6) chez 5 patients. Aux dernieres nouvelles, 3,3 (2,8-4,0) ans apres la greffe, 8 patients (57 %) restaient insulino-independants avec une HbA1c ≤6,5 %, y compris 7 patients avec FPG optimale (78 %) et un seul avec FPG (20 %) (p = 0,01, Log rank test). La survie du greffon n’etait pas significativement influencee par les mismatchs HLA ni par la preexistence d’auto-anticorps. L’HbA1C, la moyenne et la deviation standard de la glycemie (CGMS), et la tolerance au glucose (HGPO) etaient significativement diminuees par rapport au valeurs pre-greffe et inferieures chez les patients avec FPG optimale par rapport aux patients avec FPG sub-optimale. Conclusion Une FPG optimale etait associee avec une survie du greffon prolongee et un meilleur controle metabolique apres une greffe d’ilots. Ce parametre precoce pourrait constituer un critere de jugement pertinent pour les futurs essais cliniques.

Introduction PCSK9 ( Proprotein Convertase Subtilisin Kexin type 9) est une pro-proteine convertase qui joue un role clef dans le metabolisme du cholesterol en diminuant l'expression hepatique du recepteur aux low density lipoprotein (LDLR). Des travaux recents ont suggere un lien entre l'homeostasie du cholesterol et la fonction β cellulaire. Le but de notre travail etait d'etudier l'expression pancreatique de PCSK9 et de determiner son role dans le controle de l'homeostasie glucidique. Materiels et methodes L'expression de PCSK9 a ete analysee ex vivo dans des ilots pancreatiques par Q-PCR et immunohistochimie. Des mesures de secretion d'insuline en reponse au glucose (GSIS) ont ete realisees sur des ilots de souris sauvages (WT) et invalidees pour PCSK9 (-/-), incubes ou non en presence de LDL. Des tests de tolerance au glucose et a l'insuline ainsi que l'effet d'un traitement par la streptozotocine ont ete analyses in vivo chez les souris WT et PCSK9-/-. Resultats L'ARNm de PCSK9 est exprime dans les ilots pancreatiques isoles chez l'homme et la souris. L'analyse immunohistochimique indique que PCSK9 est specifiquement exprime dans la cellule delta. L'absence de PCSK9 ne semble pas influencer la secretion de somatostatine ex vivo . Les ilots de souris PCSK9-/- ont une augmentation de 200 % du contenu en LDLR compare aux souris sauvages. L'incubation avec la proteine PCSK9 purifiee abolit l'expression du LDLR. La deficience en PCSK9 n'altere pas le GSIS a l'etat basal ou en presence de concentrations elevees de LDL. In vivo , les tests de tolerance a l'insuline et au glucose ne varient pas entre les souris sauvages et PCSK9 -/-. De meme, la deficience en PCSK9 ne modifie pas la reponse glycemique a un traitement par la streptozotocine. Conclusion Nous demontrons pour la premiere fois l'expression de PCSK9 dans la cellule delta des ilots du pancreas. Alors que PCSK9 est capable de reguler l'expression du LDLR dans l'ilot, sa deficience ne semble pas influencer la secretion d'insuline et l'homeostasie du glucose.

Introduction Le benefice de l’allogreffe d’ilots chez un patient diabetique de type 1 (DID1) doit etre mis en balance avec les effets secondaires du traitement immunosuppresseur. Le but de ce travail etait d’evaluer si la greffe d’ilots etait susceptible de stabiliser la neuropathie peripherique (NP) chez des patients DID1 greffes ou non d’un rein. Patients et methodes De 2002 a 2007, 24 patients DID 1 âges de 44 ± 7 ans, pesant 72 ± 9 kg ont recu 2 a 3 infusions d’ilots sur une periode de 3 mois (n = 20) a 6 mois (n = 4). Les 24 patients etaient divises en 2 groupes : 14 ayant recu une greffe d’ilots seuls (ITA) et 10 d’ilots apres rein (IAK) avec un delai moyen entre la greffe de rein et d’ilots de 22 ± 9 mois. Le protocole d’immunosupression comportait du daclizumab, du tacrolimus et du sirolimus. Un electromyogramme avec vitesses de conduction motrice et sensitive des 4 membres a ete effectue avant greffe d’ilots (et apres greffe de rein pour les IAK), puis annuellement chez les 21 patients ayant un recul > 1 an (14 ITA + 7 IAK), quel que soit le statut C-peptidique. A la date de la derniere evaluation, 18/21 patients avaient un C-peptide detectable, 10/21 recevaient de l’insuline, 14/21patients avaient une HbA1c Resultats Avant greffe, 6/14 patients ITA et 6/7 IAK avaient une NP et 8/14 ITA et 1/7 IAK une absence de NP. Un a 4 ans apres greffe, une amelioration de la NP etait observee chez 3/6 patients ITA et 3/6 IAK souffrant d’une NP avant greffe. Une stabilite etait notee chez les 6 autres patients presentant une NP (3 ITA et 3 IAK). Il n’y a pas eu de deterioration chez les 8 patients ITA et le patient IAK initialement indemmes de NP. Conclusion Nos resultats suggerent qu’un equilibre glycemique strict permet non seulement de prevenir, mais egalement de faire regresser la neuropathie averee. En effet 1. Une amelioration de la NP objectivee par l’electromyogramme est constatee chez 6/12 patients (50 %) prealablement atteints d’une NP un a 4 ans apres greffe d’ilots ; 2. la meme efficacite est observee chez les patients greffes d’ilots apres rein et d’ilots seuls ; 3. En depit de la neurotoxicite potentielle des immunosuppresseurs, aucune deterioration n’est constatee chez les patients n’ayant pas de neuropathie avant greffe.

Introduction La gluco- et la lipotoxicite induisent un stress oxydatif et augmentent les cytokines pro-inflammatoires, entrainant une activation des neutrophiles avec augmentation des proteases et apoptose des cellules β, quel que soit le type de diabete (Rother 2007). Parallelement, une perte de fonction progressive du greffon insulaire a ete constatee apres greffe d’ilots (Ryan, 2005). Le but de ce travail etait d’etudier prospectivement l’evolution des marqueurs oxydatifs chez des patients ayant recu une greffe d’ilots et de determiner si les resultats etaient correles au pronostic de la greffe. Patients et methodes Les concentrations sanguines des marqueurs oxydatifs (statut antioxidant total (SAT), superoxyde dismutase (SOD), acides gras libres (AGL), (des inhibiteurs des proteases (activite anti-elastase (AAE) et alpha-1-antitrypsine (A1AT)), de sirolimus et tacrolimus, d’anticorps anti-GAD et IA2, ainsi que les marqueurs metaboliques (HbA1c, glycemie a jeun, moyenne glycemique sur le CGMS) et la microalbuminurie ont ete mesures avant greffe puis trimestriellement pen-dant 1 an chez 14 patients diabetiques de type 1 recevant 1 greffe d’ilots seuls. Resultats La moyenne des AGL etait plus basse (p Conclusion En concordance avec des travaux recents in vitro ou chez l’animal [1], les resultats de cette etude prospective chez l’homme suggerent que les inhibiteurs des proteases augmentent apres greffe d’ilots en lien avec l’amelioration des marqueurs metaboliques. Les inhibiteurs des proteases pourraient ainsi exercer un effet favorable sur le pronostic de la greffe, ouvrant de nouvelles perspectives therapeutiques.

Allogeneic islet transplantation is a standard of care treatment for patients with labile type 1 diabetes in many countries around the world, including Japan, the United Kingdom, Australia, much of continental Europe, and parts of Canada. The United States is now endorsing islet cell treatment for type 1 diabetes, but the FDA has chosen to consider islets as a biologic that requires licensure, making the universal implementation of the procedure in the clinic very challenging and opening the manufacture of islet grafts to private companies. The commercialization of human tissues raises significant legal and ethical issues and ironically leads to a situation where treatments developed as a result of the scientific and economic efforts of academia over several decades become exploited exclusively by for-profit entities.

Studies implicating sodium-glucose cotransporter 2 (SGLT2) inhibitors in glucagon secretion by pancreatic α-cells reported controversial results. We hypothesized that interindividual heterogeneity in SGLT2 expression and regulation may affect glucagon secretion by human α-cells in response to SGLT2 inhibitors. An unbiased RNA-sequencing analysis of 207 donors revealed an unprecedented level of heterogeneity of SLC5A2 expression. To determine heterogeneity of SGLT2 expression at the protein level, the anti-SGLT2 antibody was first rigorously evaluated for specificity, followed by Western blot and immunofluorescence analysis on islets from 10 and 12 donors, respectively. The results revealed a high interdonor variability of SGLT2 protein expression. Quantitative analysis of 665 human islets showed a significant SGLT2 protein colocalization with glucagon but not with insulin or somatostatin. Moreover, glucagon secretion by islets from 31 donors at low glucose (1 mmol/L) was also heterogeneous and correlated with dapagliflozin-induced glucagon secretion at 6 mmol/L glucose. Intriguingly, islets from three donors did not secrete glucagon in response to either 1 mmol/L glucose or dapagliflozin, indicating a functional impairment of the islets of these donors to glucose sensing and SGLT2 inhibition. Collectively, these data suggest that heterogeneous expression of SGLT2 protein and variability in glucagon secretory responses contribute to interindividual differences in response to SGLT2 inhibitors., info:eu-repo/semantics/published

Background\ud Huntington's disease is a rare, severe, inherited neurodegenerative disease in which we assessed the safety and efficacy of grafting human fetal ganglionic eminence intrastriatally.\ud \ud Methods\ud Patients at the early stage of the disease were enrolled in the Multicentric Intracerebral Grafting in Huntington's Disease trial, a delayed‐start phase II randomized study. After a run‐in period of 12 months, patients were randomized at month 12 to either the treatment group (transplanted at month 13–month 14) or the control group and secondarily treated 20 months later (month 33–month 34). The primary outcome was total motor score compared between both groups 20 months postrandomization (month 32). Secondary outcomes included clinical, imaging, and electrophysiological findings and a comparison of pregraft and postgraft total motor score slopes during the entire study period (month 0–month 52) regardless of the time of transplant.\ud \ud Results\ud Of 54 randomized patients, 45 were transplanted; 26 immediately (treatment) and 19 delayed (control). Mean total motor score at month 32 did not differ between groups (treated controls difference in means adjusted for M12: +2.9 [95% confidence interval, −2.8 to 8.6]; P = 0.31). Its rate of decline after transplantation was similar to that before transplantation. A total of 27 severe adverse events were recorded in the randomized patients, 10 of which were related to the transplant procedure. Improvement of procedures during the trial significantly decreased the frequency of surgical events.We found antihuman leucocytes antigen antibodies in 40% of the patients.\ud \ud Conclusion\ud No clinical benefit was found in this trial. This may have been related to graft rejection. Ectopia and high track number negatively influence the graft outcome. Procedural adjustments substantially improved surgical safety. (ClinicalTrials.gov NCT00190450.) © 2020 International Parkinson and Movement Disorder Society

Introduction: The use of human islets of Langerhans is the gold standard for research, both for physiological research and for the development of new therapeutic molecules for the treatment of type 2 diabetes. The demand of human islets for research projects is constantly growing however, the availability is limited and different islet preparations show significant variability between human pancreata.Objectives: The main objective of this thesis was to propose an alternative to native human islets that can provide homogeneous and abundant pancreatic islets for research. To do this, we had two main objectives: 1) the production of controlled diameter pseudo-islets from human pancreata, and the evaluation of their function in vitro and in vivo compared to their native islet counterparts; 2) the optimization of the production of pancreatic endocrine cells from different pluripotent stem cell lines and evaluation of the impact of progerin on the differentiation and maturation of the cells produced. Pluripotent stem cells from healthy donors (H1, WiCell) and from patients affected with accelerated aging disease Progeria (HGPS, iStem).Material and Methods: The pseudo-islets were formed in clinical islet medium (CMRL 1066 human albumin, insulin) 7 days using the 5D Sphericalplate (Kulgelmeiers) and compared to the native islets D1 (day 1) and D7 (day 7) from the same donor.The differentiation of pluripotent stem cells (iPS DF19.9, H1 and iPS HGPS cells) was optimized using different protocols: the Rezania protocol, the SD Kit (StemCell Technologies) and the Nostro protocol. For in vitro maturation gene expression among different cell lines was evaluated by qPCR. Protein expression was assessed by immunofluorescence technique and Flow cytometry analysis (EGID).For in vivo maturation, after transplantation under the kidney capsule of immunodeficient mice, blood glucose and human c-peptide measurements were assessed as well as metabolic test such as IPGTT were performed.Results: The pseudo-islets (n=4) generated in clinical islet medium secreted significantly less insulin in vitro than the native islets at D1 but with no significant difference from the native islets at D7. In both groups at D7, a significant decrease in intracellular insulin was observed compared10to native islets at D1. In vivo, the native islets at D1 secrete significantly more human c-peptide than the native islets at D7, while the difference is not significant between the native islets at D1 and the pseudo-islets at D7. In addition, morphometric analysis of the grafts revealed that the pseudo-islets tend to have more glucagon positive cells than the other two groups.Optimization of the differentiation of pluripotent stem cells allowed us to obtain more than 95% endoderm for H1 cells and 80% for iPS HGPS cells. For both lines, we generated 95% of pancreatic progenitor cells. The comparison of maturation genes revealed that progerin lead to a slight increase of cell maturation in the iPS HGPS group compared to H1 cells. However, no differences in in vivo function was observed. Age-related markers (53BP1, IGF1r, p16 and yH2AX) which validated in a pancreas from an elderly donor and an insulinoma. We identified yH2AX after 6 months transplantation of H1-grafts in endocrine and non-endocrine cells, while the expression in iPS HGPS-grafts appeared in the majority of cells, which had various shape of nucleiConclusion: This work provided positive results in terms of functional pseudo-islets and stem cells derived pancreatic endocrine cells. However, they remain preliminary and further studies must be conducted to provide realistic alternatives to native human islets for research., Introduction : L'utilisation des îlots humains de Langerhans est la référence pour la recherche, tant physiologique que pour le développement de nouvelles molécules thérapeutiques pour le traitement du diabète de type 2. La demande d'îlots de Langerhans humains pour des projets de recherche est en constante augmentation, cependant, la disponibilité est limitée et les différentes préparations d'îlots de Langerhans révèlent une grande variabilité entre elles.Objectifs : L'objectif principal de cette thèse était de proposer une alternative aux îlots de Langerhans humains natifs qui permettrait d’obtenir des îlots pancréatiques homogènes et en quantité abondante pour les projets de recherche.Pour ce faire, nous avions deux objectifs principaux : 1) la production de pseudo-îlots de diamètre contrôlé à partir de pancréas humain, et l'évaluation de leur fonction in vitro et in vivo par rapport à leurs équivalents îlots natifs ; 2) l'optimisation de la production de cellules endocrines pancréatiques à partir de différentes lignées de cellules souches pluripotentes et l'évaluation des effets de la progérine sur la différenciation et la maturation des cellules produites. Les cellules souches pluripotentes utilisées provenaient de donneurs sains (H1, WiCell) et de patients atteints de Progeria (HGPS, iStem).Matériel et méthodes : Les pseudo-îlots ont été formés dans un milieu d'îlots clinique (CMRL 1066 albumine humaine, insuline) pendant 7 jours en utilisant les Sphericalplate 5D (Kulgelmeiers) et comparés aux îlots natifs J1 (jour 1) et J7 (jour 7) du même donneur.La différenciation des cellules souches pluripotentes (cellules iPS DF19.9, H1 et iPS HGPS) a été optimisée par différents protocoles : le protocole Rezania, le SD Kit (StemCell Technologies) et le protocole Nostro. L'expression des gènes de maturation in vitro entre différentes lignées cellulaires a été évaluée par qPCR. L'expression des protéines a été évaluée par immunofluorescence et par cytométrie en flux (plateforme EGID).Pour la maturation in vivo, après la transplantation sous la capsule rénale de souris immunodéficientes, des mesures de glycémie et de c-peptide humain ont été effectuées, ainsi que des tests métaboliques comme l'ipGTT.12Résultats : Les pseudo-îlots (n=4) générés ont sécrété significativement moins d'insuline in vitro que les îlots natifs à J1 mais sans différence significative avec les îlots natifs à J7. Dans les deux groupes à J7, on a observé une diminution significative de l'insuline intracellulaire comparativement aux îlots natifs à J1. In vivo, les îlots natifs à J1 sécrètent significativement plus de c-peptide humain que les îlots natifs à J7, alors que la différence n'est pas significative entre les îlots natifs à J1 et les pseudo-îlots à J7. De plus, l'analyse morphométrique des greffons a révélé que les pseudo-îlots ont tendance à avoir plus de cellules glucagon-positives que les deux autres groupes.L'optimisation de la différenciation des cellules souches pluripotentes a permis d'obtenir plus de 95% d'endoderme pour les cellules H1 et 80% pour les cellules iPS HGPS. Pour les deux lignées, nous avons généré 95 % de progéniteurs pancréatiques. La comparaison des gènes de maturation a révélé que la progérine conduisait à une légère augmentation de la maturation cellulaire dans le groupe iPS HGPS par rapport aux cellules H1. Des marqueurs liés à l'âge (53BP1, IGF1r et yH2AX) ont été validés dans un pancréas provenant d'un donneur âgé et un insulinome. Cependant, aucune différence de la fonctionnalité in vivo n’a été observée. Six mois post transplantation, nous avons identifié yH2AX dans des cellules endocrines et non endocrine des greffons H1 alors que dans les greffons HGPS, nous l’avons observé dans une plus vaste proportion de cellules présentant différentes formes de noyaux [...]

Bile acids (BAs) have evolved over the years from being considered as simple lipid solubilizers to metabolically active molecules. In addition to their function in dietary lipid absorption, they have also been shown to activate farnesoid X receptor (FXR) and TGR5 receptors to initiate signaling pathways and regulate metabolic gene transcription. TGR5 (encoded by the GPBAR1 gene), also known as G-protein-membrane-type receptor for bile acids (M-BAR) or G-protein-coupled bile acid receptor 1 (GPBAR1), was the first identified G-protein coupled receptor specific for bile acids. In normal individuals, the highest level of GPBAR1 mRNA expression was reported in the gallbladder, placenta and spleen, followed by moderate expression in other tissues including lungs, liver, stomach, small intestine and adipose tissue, with a relatively low level of expression in kidney, skeletal muscles and pancreas. In response to binding of BAs to the ligand-binding pocket of the TGR5 protein, the TGR5 receptor is internalized and the GαS subunit is released. This mechanism leads to activation of adenylate cyclase and an increase in cAMP production resulting in induction of the protein kinase A (PKA) pathway. Subsequently, PKA phosphorylates the cAMP-response element-binding protein (CREB) and enhances the transcription of its target genes in response to extracellular signals.To date, extensive work has been done to investigate the role of TGR5 in metabolism. In rodents, BA-activated TGR5 receptor stimulates energy expenditure in brown adipose tissue and skeletal muscle and prevents obesity and insulin resistance induced by a high fat diet. TGR5 is also implicated in intestinal L-cells secreted GLP-1, which plays an essential role in glucose homeostasis through the stimulation of glucose-dependent-insulin-secretion and inhibition of glucagon secretion, inhibition of gastric emptying and increasing satiety through neuroendocrine pathways. In terms of the immunological function of TGR5, it is now known that TGR5 is expressed in several immune cells such as monocytes, alveolar macrophages and Kupffer cells. The beneficial effects of TGR5 on macrophage-driven inflammation include reduced proinflammatory cytokine expression, thus protecting against atherosclerosis and liver steatosis. On the contrary, TGR5 activation has also been implicated in itch and analgesia, gastrointestinal-tract cell carcinogenesis, pancreatitis, and cholelithiasis, suggesting a potential role for TGR5 as a regulator of signal transduction pathways responsible for cell proliferation and apoptosis. BAs may also influence islet function via both direct and indirect mechanisms as recent studies have shown that Farnesoid X receptor (FXR) is expressed by pancreatic beta cells, and regulates insulin signaling in cultured cell lines. Kumar et al., [14] also reported that the TGR5 agonists INT-777 + oleanolic acid (OA) stimulated glucose-mediated insulin release via TGR5 activation, also in cultured cells. Still, little is known about the regulation of TGR5 expression or its involvement in pancreatic hormone secretion in response to physiological or pathological conditions such as T2D, as these studies have been performed mainly in cultured cell lines. In these contexts, the biological function of TGR5 remains enigmatic. The aim of the present study was first to establish the specific expression of TGR5 in human pancreatic islet cell subtypes. Then, a cross-sectional cohort of human islets isolated from individuals with various degrees of insulin resistance was exploited to determine if TGR5 expression and function was modified in T2D. Finally to determine if targeting TGR5 is clinically relevant, human islets were treated in-vitro with a specific agonist of TGR5 or with siRNA directed against TGR5 and hormone secretion assessed to establish whether TGR5 activation or inhibition modulate pancreatic hormone secretion., Le rôle des acides biliaires a évolué ces dernières années passant de simples molécules solubilisatrices des lipides à des composés à activité métabolique. En plus de leur fonction dans l’absorption des lipides post-repas, ils ont été montrés comme stimulant de nombreuses voies de signalisation modulant l’expression de gènes clefs du métabolisme et de nombreux mécanismes physiologiques via l’activation de récepteurs spécifiques tels que les récepteurs « Farnesoid X receptor » (FXR) et le récepteur membranaire couplé à une protéine G, TGR5. La protéine TGR5 codée par le gène GPBAR1, aussi connue sous le nom de « G-protein-membrane-type receptor for bile acids » (M-BAR) est le premier récepteur couplé à une protéine G spécifique aux acides biliaires ayant été mis en évidence. Cette protéine est exprimée dans de nombreux tissus clefs du métabolisme énergétique tels que les cellules L intestinales, le tissu adipeux, les reins, le muscle squelettique et le pancréas. En réponse à la fixation des acides biliaires au récepteur TGR5, celui-ci va être internalisé et sa sous-unité GαS va être libérée. Ce mécanisme va ensuite activer l’adénylate cyclase et augmenter la production d’AMPc à l’origine de l’activation des voies de signalisations liées à la protéine kinase A (PKA). Une fois activée, la PKA va induire la phosphorylation des protéines « cAMP-response element-binding » (CREB) et permettre la modulation de l’expression de gènes cibles.Ces dernières années de nombreux travaux ont eu pour but d’étudier le rôle du récepteur TGR5 dans le métabolisme. Chez la souris, l’activation du récepteur TGR5 stimule la dépense énergétique dans le tissu adipeux brun et dans le muscle squelettique et prévient le développement de l’obésité et de l’insulino-résistance induites par un régime riche en graisses. Le récepteur TGR5 est également impliqué au niveau des cellules L intestinales sécrétrices du GLP-1. Il y joue un rôle essentiel dans l’homéostasie glucidique via la régulation de l’activité pancréatique, des sécrétions de l’insuline et du glucagon, de l’inhibition de la vidange gastrique ou encore de la modulation des messages de satiété via des voies neuroendocrines. TGR5 présente également des fonctions immunologiques avec une expression connue dans les cellules de l’immunité telles que les monocytes, les macrophages alvéolaires ou encore les cellules de Kupffer. TGR5 a également été mis en évidence comme régulateur des mécanismes d’inflammations via les macrophages avec une diminution de l’expression des cytokines pro-inflammatoires. A l’opposé, l’activation de TGR5 serait impliquée dans de nombreux processus pathologiques tels que, le développement de carcinomes gastro-intestinaux, les pancréatites, la lithiase biliaire, suggérant un rôle potentiel du récepteur TGR5 dans la régulation de voies de signalisation responsables de la prolifération et de la mort cellulaire [...]

Bile acids (BAs) have evolved over the years from being considered as simple lipid solubilizers to metabolically active molecules. In addition to their function in dietary lipid absorption, they have also been shown to activate farnesoid X receptor (FXR) and TGR5 receptors to initiate signaling pathways and regulate metabolic gene transcription. TGR5 (encoded by the GPBAR1 gene), also known as G-protein-membrane-type receptor for bile acids (M-BAR) or G-protein-coupled bile acid receptor 1 (GPBAR1), was the first identified G-protein coupled receptor specific for bile acids. In normal individuals, the highest level of GPBAR1 mRNA expression was reported in the gallbladder, placenta and spleen, followed by moderate expression in other tissues including lungs, liver, stomach, small intestine and adipose tissue, with a relatively low level of expression in kidney, skeletal muscles and pancreas. In response to binding of BAs to the ligand-binding pocket of the TGR5 protein, the TGR5 receptor is internalized and the GαS subunit is released. This mechanism leads to activation of adenylate cyclase and an increase in cAMP production resulting in induction of the protein kinase A (PKA) pathway. Subsequently, PKA phosphorylates the cAMP-response element-binding protein (CREB) and enhances the transcription of its target genes in response to extracellular signals.To date, extensive work has been done to investigate the role of TGR5 in metabolism. In rodents, BA-activated TGR5 receptor stimulates energy expenditure in brown adipose tissue and skeletal muscle and prevents obesity and insulin resistance induced by a high fat diet. TGR5 is also implicated in intestinal L-cells secreted GLP-1, which plays an essential role in glucose homeostasis through the stimulation of glucose-dependent-insulin-secretion and inhibition of glucagon secretion, inhibition of gastric emptying and increasing satiety through neuroendocrine pathways. In terms of the immunological function of TGR5, it is now known that TGR5 is expressed in several immune cells such as monocytes, alveolar macrophages and Kupffer cells. The beneficial effects of TGR5 on macrophage-driven inflammation include reduced proinflammatory cytokine expression, thus protecting against atherosclerosis and liver steatosis. On the contrary, TGR5 activation has also been implicated in itch and analgesia, gastrointestinal-tract cell carcinogenesis, pancreatitis, and cholelithiasis, suggesting a potential role for TGR5 as a regulator of signal transduction pathways responsible for cell proliferation and apoptosis. BAs may also influence islet function via both direct and indirect mechanisms as recent studies have shown that Farnesoid X receptor (FXR) is expressed by pancreatic beta cells, and regulates insulin signaling in cultured cell lines. Kumar et al., [14] also reported that the TGR5 agonists INT-777 + oleanolic acid (OA) stimulated glucose-mediated insulin release via TGR5 activation, also in cultured cells. Still, little is known about the regulation of TGR5 expression or its involvement in pancreatic hormone secretion in response to physiological or pathological conditions such as T2D, as these studies have been performed mainly in cultured cell lines. In these contexts, the biological function of TGR5 remains enigmatic. The aim of the present study was first to establish the specific expression of TGR5 in human pancreatic islet cell subtypes. Then, a cross-sectional cohort of human islets isolated from individuals with various degrees of insulin resistance was exploited to determine if TGR5 expression and function was modified in T2D. Finally to determine if targeting TGR5 is clinically relevant, human islets were treated in-vitro with a specific agonist of TGR5 or with siRNA directed against TGR5 and hormone secretion assessed to establish whether TGR5 activation or inhibition modulate pancreatic hormone secretion., Le rôle des acides biliaires a évolué ces dernières années passant de simples molécules solubilisatrices des lipides à des composés à activité métabolique. En plus de leur fonction dans l’absorption des lipides post-repas, ils ont été montrés comme stimulant de nombreuses voies de signalisation modulant l’expression de gènes clefs du métabolisme et de nombreux mécanismes physiologiques via l’activation de récepteurs spécifiques tels que les récepteurs « Farnesoid X receptor » (FXR) et le récepteur membranaire couplé à une protéine G, TGR5. La protéine TGR5 codée par le gène GPBAR1, aussi connue sous le nom de « G-protein-membrane-type receptor for bile acids » (M-BAR) est le premier récepteur couplé à une protéine G spécifique aux acides biliaires ayant été mis en évidence. Cette protéine est exprimée dans de nombreux tissus clefs du métabolisme énergétique tels que les cellules L intestinales, le tissu adipeux, les reins, le muscle squelettique et le pancréas. En réponse à la fixation des acides biliaires au récepteur TGR5, celui-ci va être internalisé et sa sous-unité GαS va être libérée. Ce mécanisme va ensuite activer l’adénylate cyclase et augmenter la production d’AMPc à l’origine de l’activation des voies de signalisations liées à la protéine kinase A (PKA). Une fois activée, la PKA va induire la phosphorylation des protéines « cAMP-response element-binding » (CREB) et permettre la modulation de l’expression de gènes cibles.Ces dernières années de nombreux travaux ont eu pour but d’étudier le rôle du récepteur TGR5 dans le métabolisme. Chez la souris, l’activation du récepteur TGR5 stimule la dépense énergétique dans le tissu adipeux brun et dans le muscle squelettique et prévient le développement de l’obésité et de l’insulino-résistance induites par un régime riche en graisses. Le récepteur TGR5 est également impliqué au niveau des cellules L intestinales sécrétrices du GLP-1. Il y joue un rôle essentiel dans l’homéostasie glucidique via la régulation de l’activité pancréatique, des sécrétions de l’insuline et du glucagon, de l’inhibition de la vidange gastrique ou encore de la modulation des messages de satiété via des voies neuroendocrines. TGR5 présente également des fonctions immunologiques avec une expression connue dans les cellules de l’immunité telles que les monocytes, les macrophages alvéolaires ou encore les cellules de Kupffer. TGR5 a également été mis en évidence comme régulateur des mécanismes d’inflammations via les macrophages avec une diminution de l’expression des cytokines pro-inflammatoires. A l’opposé, l’activation de TGR5 serait impliquée dans de nombreux processus pathologiques tels que, le développement de carcinomes gastro-intestinaux, les pancréatites, la lithiase biliaire, suggérant un rôle potentiel du récepteur TGR5 dans la régulation de voies de signalisation responsables de la prolifération et de la mort cellulaire [...]

Under normal healthy conditions, organisms maintain a dynamic endocrinecell mass throughout life. Pancreatic beta cell mass are able to maintain plasma glucose levels increasing insulin secretion in conditions as obesity.Beta cell inability to compensate in insulin demand provokes hyperglycemia and Type 2 Diabetes. Clinically, most obese individuals do not develop diabetes because islets compensate for insulin resistance. Direct evidence that human islet mass adapts longitudinally to obesity in vivo was lacking and, moreover, little information was available on the mechanismsand cell type(s) involved.Current evidence for increased beta cell mass in obese humans (vs lean) is based entirely on postmortem histology.Aim: In this thesis, firstly (Part 1) we performed a descriptive cross sectional study by evaluating the pancreatic islet morphology and alpha and beta cell distribution from our archived human pancreatic sections of obese and normal subjects. Secondly, (Part 2) we explored the longitudinal adaptation of human islets to an obesogenic environment and showed direct evidence that non-diabetic human islets adapt bothendocrine and beta cell mass, function and gene expression to obesity in vivo. Thirdly (Part 3) we performed lineage tracing to determine which cell type alpha or beta give rise to the increase islet mass in obesity. Finally (Part 4) in this diet induced obesity model we developed, we looked at the differential gene expression with Illumina gene chips in a kinetic study on human islets which were laser capture microdissected at 6, 8 and 10 weeks on control or high fat diet.Methods: Archived human pancreatic sections were immunostained for endocrine, beta, alpha, fat. In the obese/immunodeficient mouse model, non-diabetic Rag2–/– mice were transplanted under kidney capsule with human islets from human brain-deceased donors (non-diabetics donors and donors with overt metabolic dysfunction). Animals were fed for 12 weeks with a control or high-fat diet (HFD), and followed for weight, serum triacylglycerol, fasting blood glucose and human C-peptide. After the mice were killed, human grafts and the endogenous pancreas were analyzed for endocrine volume, distribution of beta and alpha cells, and mechanisms of regeneration.Results: The cross-sectional study, performed on archived human paraffin embedded sections of normal weight, overweight, or obese subjects showed that obese donors were characterized by an increased total endocrine mass, bigger individual islet size, increased intrapancreatic fat, increased β to  cell ratio and decreased :β cell ratio in islets. In the longitudinal study, concomitant with the increased weight gain, doubling of abdominal fat, increased serum triacylglycerol and reduced insulin sensitivity in 12 week HFD animals we reported that human islet grafts showed functional compensation, measured as a more than doubling of fasting human C-peptide in mouse serum, and histological adaptation of islet endocrine mass including increased beta cells. Further analysis of the human grafts revealed proliferation and neogenesis as the responsible mechanisms for the doubling of the human endocrine mass.Discussion: This novel model allows, for the first time, longitudinal studies of human islet adaptation to an obese murine environment and may be instrumental in deciphering pathways involved in human beta cell expansion, as well as in helping to identify factors predisposing human beta cells to undergo decompensation.; Dans les conditions normales, les organismes maintiennent une masse cellulaire endocrine stable tout au long de leur vie. En cas d’obésité, la masse de cellules b pancréatiques est capable de maintenir des taux de glucose plasmatique en augmentant la sécrétion en insuline. L’incapacité de ces cellules à fournir de l’insuline entraîne alors l’apparition d’une hyperglycémie et d’un diabète de type II. Cliniquement, la majorité des individus obèses ne développent pas de diabète car les îlots pallient à cette résistance à l’insuline. La preuve de l’adaptation de la masse d’îlots humains à l’obésité, in vivo, n’a pas été clairement décrite et, de plus, peu d’informations existent sur les mécanismes et les types cellulaires impliqués. Actuellement, la mise en évidence de l’augmentation de la masse des cellules b chez les humains obèses repose uniquement sur des études histologiques.But : Au cours de cette thèse, nous avons cherché, dans un premier temps (partie 1), à évaluer la morphologie des îlots pancréatiques et la distribution des cellules a et b chez des donneurs en état de mort cérébrale normaux, en surpoids et obèses. Dans un second temps (partie 2), nous avons étudié l’adaptation au cours du temps des îlots humains à un environnement obésogène. Nous avons montré ainsi que les îlots humains non diabétiques s’adaptent in vivo à l’obésité en modifiant la masse de cellules b, leur fonction et leur expression génique. En suite (partie 3), on a identifié le mécanisme de transdifférenciation des cellules alpha et beta en utilisant la méthode de lineage tracing. Finalement (partie 4), on a déterminé la différence sur l’expression de gène des ilots humains greffé chez les souris sous régime control ou régime riche en graisse en utilisant les puces d’ARN (Illumina).Methodes et Resultats: Des coupes de pancréas humains inclues en paraffines ont été analysées. Les donneurs obèses étaient caractérisés par une augmentation de la masse endocrine totale, de la taille des îlots, de la graisse intra-pancréatique et du ratio b:a dans les îlots, mais avec une diminution du ratio a:b dans les îlots. Au cours de l’étude longitudinale, des souris Rag2-/- non diabétiques ont été greffées sous la capsule rénale avec des îlots humains issus de donneurs en état de mort cérébrale (donneurs non diabétiques ou donneurs avec un dysfonctionnement métabolique déclaré). Les animaux ont été nourris pendant 2 semaines avec soit un régime contrôle soit un régime riche en graisse (high fat diet HFD). Un suivi du poids, du taux des triglycérides, de la glycémie et du C-peptide a été mis en place. Après sacrifice des souris, les greffons et les pancréas endogènes ont été analysés pour le volume endocrine, la distribution des cellules b et a et les mécanismes de régénération des cellules pancréatiques. Après 12 semaines sous régime gras, les souris montraient toutes les caractéristiques typiques de l’obésité, à savoir, une augmentation du poids, un doublement de la graisse abdominale, des triglycérides, de la glycémie et une sensibilité à l’insuline réduite. De plus, l’apparition sur ces animaux d’un doublement rapide de la quantité de C-peptide humain dans le sérum murin nous indique la mise en place d’une compensation fonctionnelle. Une analyse histologique des greffons a permis de mettre en évidence une adaptation de la masse endocrine des îlots avec une augmentation des cellules b. D’autres analyses ont identifié la prolifération et la néogénèse comme les mécanismes responsables de ce doublement de la masse endocrine humaine.Discussion: Ce nouveau modèle animal permet d’étudier, in vivo sur une longue période, l’adaptation des îlots humains à un environnement obésogène murin. Il peut être utilisé comme un outil dans le décryptage des voies de signalisation impliquées dans l’expansion des cellules b humaines et permettre également l’identification des facteurs prédisposant ces cellules à subir une décompensation.