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Diese Dissertation umfasst die Optimierung und anschließende Kombination einer monolithischen Immunfiltration mit Antikörper-Mikroarrays zur schnellen Quantifizierung von Mikroorganismen (S. aureus-Bakterien und B. cereus-Sporen) in Milch. Durch schrittweise Modifizierung der Oberflächen monolithischer Säulen wurden Antikörper gegen die Mikroorganismen immobilisiert. Die monolithische Immunfiltration ermöglichte es, Mikroorganismen selektiv aufzukonzentrieren und gleichzeitig die Milchmatrix abzutrennen. Des Weiteren wurden Antikörper-Mikroarrays im Sandwich-Immunoassay-Format auf der automatischen Chemilumineszenz-Analyseplattform (MCR3) mit Temperierung erarbeitet. Dadurch konnte der Schnellnachweis innerhalb weniger Minuten erfolgen. Die Signale wurden durch die vorangegangene monolithische Immunfiltration deutlich erhöht., This dissertation covers optimization and subsequent combination of monolithic immunofiltration with antibody microarrays for fast quantification of microorganisms (S. aureus bacteria and B. cereus spores) in milk. With an incremental modification of the monolithic columns’ surfaces antibodies were immobilized against the microorganisms. The monolithic immunofiltration allowed for selectively concentrating the microorganisms and simultaneously separating the milk matrix. Additionally antibody microarrays were developed in a sandwich immunoassay format on the automated chemiluminescence platform for analysis (MCR3) with temperature sensor. Thereby a quick reference could take place within a few minutes. The signals were considerably increased due to the preceding monolithic immunofiltration.

50 % of all human cancers arise from the deregulation of the wt—p53 pathway, mostly through the activity of the p53 inhibitors MDM2 and MDMX. Hundreds of compounds that disrupt the p53-MDM2 and p53-MDMX interaction were analyzed by FP- and NMR-assays to determine their affinity. X-ray crystallography of the best binding compounds for MDM2 gave insights to the binding mode of these antagonists revealing also a novel 4-point-pharmacophore binding mode. Extensive fluorination scanning of one of the high affinity binding compounds confirms the importance of fluorine in drug research, improving the drug potency. All the results presented in this thesis are of remarkable importance in drug development., 50% aller humaner Krebsarten entstehen durch die Deregulation des wt-p53 Stoffwechsels hauptsächlich durch die Aktivität der p53 Inhibitoren MDM2 und MDMX. Hunderte chemischer Verbindungen, die die p53-MDM2 bzw. p53-MDMX Interaktion spalten, wurden mittels FP- und NMR-Methoden analysiert, um deren Affinität zu ermitteln. Röntgenkristallografische Untersuchungen der am besten bindenden chemischen Verbindungen ermöglichten einen Einblick in die Bindungsweise dieser Antagonisten, wodurch auch ein neues „4-point-pharmacophore“ Modell enthüllt wurde. Eine umfassende Fluor-Untersuchung von einer der hoch affinen chemischen Verbindungen bestätigt durch die verbesserte Arzneimittelwirksamkeit die Bedeutung von Fluor in der Arzneimittelforschung. Alle in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse sind von beachtlicher Bedeutung in der Arzneimittelentwicklung.

Das Coxsackievirus B3 gilt als einer der Hauptverursacher viraler Herzerkrankungen. Spezifische Maßnahmen zur Prävention oder Therapie dieser teils lebensbedrohlichen Erkrankungen sind derzeit nicht verfügbar. Als natürlicher Verteidigungsmechanismus der Zelle gegen Virusinfektionen stellt die RNA-Interferenz einen vielversprechenden therapeutischen Ansatzpunkt zur Bekämpfung coxsackieviraler Infektionskrankheiten dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das anti-coxsackievirale Potential der RNA-Interferenz sowie deren Probleme systematisch in vitro und in vivo evaluiert und für eine klinische Anwendung hinsichtlich Effektivität, Stabilität und einem erfolgreichen Resistenzmanagement optimiert., Coxsackievirus B3 is considered one of the main etiological agents for the pathogenesis of viral heart disease. To date no effective vaccines or specific antiviral treatment modalities are available to prevent or treat these sometimes life-threatening diseases. The discovery of the endogenous RNA interference pathway as an innate defence mechanism conferring intracellular immunity against viral infections has opened exciting possibilities to exploit it therapeutically in the fight against coxsackieviral diseases. The aim of the present thesis was to evaluate the anti-coxsackieviral potential of RNA interference and its limitations systematically in vitro and in vivo and to optimize it for clinical translation concerning efficacy, stability, and strong resistance to viral escape.

Die Rolle des Signalweges der Transaktivierung des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR), ausgelöst durch Liganden G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, wie insbesondere Neurotransmitter, wurde in Tumorzellinien mechanistisch und auf seine pathophysiologische Relevanz hin untersucht. Die EGFR Transaktivierung wurde als zentraler Signalschritt der von Neuropeptiden ausgelösten, zellulären Antworten eingehend auf molekularer Ebene charakterisiert. Weiterhin wurde eine Beteiligung des EGFR Signalwegs an der von Neurotransmittern induzierten Migration und Invasion verschiedener Karzinomzellen nachgewiesen. Diese bisher unklare Verbindung von Neurobiologie und Onkologie kann zum besseren Verständnis der Krebsentwicklung einen wichtigen Beitrag leisten., The role of the epidermal growth factor receptor (EGFR) transactivation by G protein-coupled receptor ligands, in particular neurotransmitters, was studied in tumour cell lines to reveal the underlying molecular mechanisms as well as pathophysiological relevance. EGFR transactivation was characterised as a critical step in neuropeptide-induced mitogenic cellular signalling. Furthermore, EGFR signal transduction was shown to be involved in neuropeptide ligand-induced migratory and invasive behaviour in various carcinoma cells. These links between neurobiology and oncology have not recognised previously and could contribute to a better understanding of cancer development.

Die Rolle des Signalweges der Transaktivierung des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR), ausgelöst durch Liganden G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, wie insbesondere Neurotransmitter, wurde in Tumorzellinien mechanistisch und auf seine pathophysiologische Relevanz hin untersucht. Die EGFR Transaktivierung wurde als zentraler Signalschritt der von Neuropeptiden ausgelösten, zellulären Antworten eingehend auf molekularer Ebene charakterisiert. Weiterhin wurde eine Beteiligung des EGFR Signalwegs an der von Neurotransmittern induzierten Migration und Invasion verschiedener Karzinomzellen nachgewiesen. Diese bisher unklare Verbindung von Neurobiologie und Onkologie kann zum besseren Verständnis der Krebsentwicklung einen wichtigen Beitrag leisten., The role of the epidermal growth factor receptor (EGFR) transactivation by G protein-coupled receptor ligands, in particular neurotransmitters, was studied in tumour cell lines to reveal the underlying molecular mechanisms as well as pathophysiological relevance. EGFR transactivation was characterised as a critical step in neuropeptide-induced mitogenic cellular signalling. Furthermore, EGFR signal transduction was shown to be involved in neuropeptide ligand-induced migratory and invasive behaviour in various carcinoma cells. These links between neurobiology and oncology have not recognised previously and could contribute to a better understanding of cancer development.

50 % of all human cancers arise from the deregulation of the wt—p53 pathway, mostly through the activity of the p53 inhibitors MDM2 and MDMX. Hundreds of compounds that disrupt the p53-MDM2 and p53-MDMX interaction were analyzed by FP- and NMR-assays to determine their affinity. X-ray crystallography of the best binding compounds for MDM2 gave insights to the binding mode of these antagonists revealing also a novel 4-point-pharmacophore binding mode. Extensive fluorination scanning of one of the high affinity binding compounds confirms the importance of fluorine in drug research, improving the drug potency. All the results presented in this thesis are of remarkable importance in drug development., 50% aller humaner Krebsarten entstehen durch die Deregulation des wt-p53 Stoffwechsels hauptsächlich durch die Aktivität der p53 Inhibitoren MDM2 und MDMX. Hunderte chemischer Verbindungen, die die p53-MDM2 bzw. p53-MDMX Interaktion spalten, wurden mittels FP- und NMR-Methoden analysiert, um deren Affinität zu ermitteln. Röntgenkristallografische Untersuchungen der am besten bindenden chemischen Verbindungen ermöglichten einen Einblick in die Bindungsweise dieser Antagonisten, wodurch auch ein neues „4-point-pharmacophore“ Modell enthüllt wurde. Eine umfassende Fluor-Untersuchung von einer der hoch affinen chemischen Verbindungen bestätigt durch die verbesserte Arzneimittelwirksamkeit die Bedeutung von Fluor in der Arzneimittelforschung. Alle in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse sind von beachtlicher Bedeutung in der Arzneimittelentwicklung.

Das Coxsackievirus B3 gilt als einer der Hauptverursacher viraler Herzerkrankungen. Spezifische Maßnahmen zur Prävention oder Therapie dieser teils lebensbedrohlichen Erkrankungen sind derzeit nicht verfügbar. Als natürlicher Verteidigungsmechanismus der Zelle gegen Virusinfektionen stellt die RNA-Interferenz einen vielversprechenden therapeutischen Ansatzpunkt zur Bekämpfung coxsackieviraler Infektionskrankheiten dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das anti-coxsackievirale Potential der RNA-Interferenz sowie deren Probleme systematisch in vitro und in vivo evaluiert und für eine klinische Anwendung hinsichtlich Effektivität, Stabilität und einem erfolgreichen Resistenzmanagement optimiert., Coxsackievirus B3 is considered one of the main etiological agents for the pathogenesis of viral heart disease. To date no effective vaccines or specific antiviral treatment modalities are available to prevent or treat these sometimes life-threatening diseases. The discovery of the endogenous RNA interference pathway as an innate defence mechanism conferring intracellular immunity against viral infections has opened exciting possibilities to exploit it therapeutically in the fight against coxsackieviral diseases. The aim of the present thesis was to evaluate the anti-coxsackieviral potential of RNA interference and its limitations systematically in vitro and in vivo and to optimize it for clinical translation concerning efficacy, stability, and strong resistance to viral escape.

Chlamydien sind obligat intrazelluläre Bakterien, die beim Menschen verschiedene Krankheiten auslösen können. Allen chlamydialen Spezies gemein sind ein parasitärer, biphasischer Entwicklungszyklus und die Replikation in einer membranumschlossenen Vakuole. In dieser Arbeit sollte die Bedeutung der sezernierten chlamydialen Serinprotease CPAF geklärt werden. Dabei konnte über den Einsatz neuer, CPAF-spezifischer Inhibitoren gezeigt werden, dass die Funktion von CPAF essentiell für das Fortschreiten chlamydialer Infektionen ist. Weiterhin scheint CPAF über die Spaltung von p65/RelA in inflammatorische Signalwege einzugreifen. Dies könnte ein Überleben der Bakterien in ihren Wirten erleichtern., Chlamydiae are obligate intracellular bacteria, which cause a variety of diseases in humans. All chlamydial species share an obligate intracellular, biphasic and parasitic developmental cycle. Inside its hosts Chlamydia resides and replicates within a membranous vacuole in the cytoplasm. The focus of this work was the relevance of the secreted chlamydial serine protease CPAF during chlamydial infections. Identification and use of two novel CPAF inhibitors revealed an essential function of CPAF for the chlamydial developmental cycle. Furthermore CPAF seems to impede inflammatory signaling by cleavage of the NF-κB protein p65/RelA, possibly counteracting cellular defense and facilitating bacterial survival.

In humanpathogenen Mikroorganismen katalysiert das Enzym IspH einen zentralen Schritt der Terpen-Biosynthese. Da es im Menschen nicht vorkommt, stellt es einen geeigneten Angriffspunkt für Prävention und Therapie von Infektionskrankheiten dar. In dieser Arbeit wurden E. coli IspH und drei Mutantenproteine biochemisch, funktionell und strukturell charakterisiert. In Kombination mit der Untersuchung zweier Substratanaloga lieferten diese Ergebnisse einen Einblick in den molekularen Mechanismus der IspH-Reaktion. Darüber hinaus wurden zwölf Inhibitoren im Komplex mit IspH kristallisiert. Die Strukturanalyse zeigte, dass IspH über seine natürliche Reduktaseaktivität hinaus auch Hydratisierungen von Alkinen katalysiert., In pathogenic microorganisms the enzyme IspH catalyzes a central step in the terpene biosynthesis. Due to its absence in humans, it represents a potent target for prevention and therapy of infectious diseases. In this work, E. coli IspH and three mutant proteins were biochemically, functionally and structurally characterized. In combination with the investigation of two substrate analogs, these results provide an insight in the molecular mechanism of the IspH reaction. Moreover, twelve inhibitors were crystallized in complex with IspH. The structure analysis shows that in addition to its reductase activity, IspH catalyzes the hydration of alkynes.

Ziel der Dissertation war es, schnelle immunanalytische Verfahren zur Detektion von Mykotoxinen in Getreide und von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAKs) in Trinkwasser zu entwickeln. Bei der qualitativen und quantitativen Bestimmung von Mykotoxinen stand die Methodenentwicklung im Vordergrund. Hierzu wurde ein Chemilumineszenz-Mikroarray für die Detektion von Aflatoxinen und Ochratoxin A in Getreide hergestellt und erfolgreich validiert. Bei der Detektion von PAKs in Trinkwasser lag der Schwerpunkt auf der Entwicklung neuer affiner Antikörper. Neben hoch affinen monoklonalen Antikörpern wurden erstmals rekombinante Antikörper (single chain variable fragments) gegen PAKs entwickelt., The overall goal of this thesis was the development of fast immunological methods for the detection of mycotoxins in crops and of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in water intended for human consumption. The main focus of the qualitative and quantitative determination of mycotoxins was on the development of a new detection method. Therefore a chemiluminescence microarray for the detection of aflatoxins and ochratoxin A in crops was successfully produced and validated. For the detection of PAHs in drinking water the emphasis was on the development of new affine antibodies. In addition to highly affine monoclonal antibodies, new recombinant antibodies (single chain variable fragments) were developed for the first time.

Epigenetische Alterationen, die DNA-Methylierung und Histonmodifikationen betreffen, sind eng mit der humanen Karzinogenese verbunden. Sie verändern die Chromatinstruktur und Transkription und können den Effekt DNA-schädigender Chemotherapeutika beeinflussen. In dieser Arbeit wurde die prognostische und prädiktive Bedeutung der Expression epigenetischer Effektorproteine wie DNA-Methyltransferasen (DNMTs), Histondeacetylasen (HDACs) und Polycombproteine für neoadjuvant chemotherapierte Magenkarzinome analysiert, wobei DNMT1 als vielversprechender Marker identifiziert wurde. In vitro Modelle zeigten einen funktionellen Zusammenhang der DNMT1-Expression und der Chemosensitivität, außerdem ergaben sich Hinweise auf eine Anwendbarkeit epigenetischer Inhibitoren als alternative Therapeutika. DNMT1 erwies sich somit als prädiktiver und prognostischer Biomarker sowie als eine potentielle Zielstruktur für die Behandlung von Magenkarzinomen., Epigenetic alterations which affect DNA methylation and the modification of histones are strongly linked to human carcinogenesis. They change the chromatin structure and transcription and may influence the effect of DNA-damaging agents. In this work the prognostic and predictive significance of the expression of epigenetically relevant proteins such as DNA methyltransferases (DNMTs), histone deacetylases (HDACs) and polycomb proteins for gastric cancer patients treated by neoadjuvant chemotherapy was analyzed, whereby DNMT1 was identified as a promising marker. In vitro models revealed a functional relationship between DNMT1 expression and chemosensitivity and provided evidence for the applicability of epigenetic inhibitors as alternative therapeutics. Hence DNMT1 was shown to be a predictive and prognostic biomarker as well as a potential therapeutic target for the treatment of gastric cancer.

This thesis is a collection of three different projects to characterize the biochemical and structural features of proteins important in cancer development. A new hypothesis about the interaction of shugoshin and Mad2 and their role in mitosis is supported by NMR and ITC binding studies Shugoshin binds Mad2 at the binding site of the so called safty belt. To determine the structural basis of the binding mechanisms of a new small molecule inhibitor for CDK2, crystallization of the complex was attempted. This interaction was chosen to prove a novel NMR-based drug screening method. Protein binding is monitored via a simple 1D proton NMR signal of tryptophan and permits rapid screening of potential ligands. The method also provides quantitative characterization of the antagonist-protein interactions in the form of KDs. As a prerequisite for X-ray crystallography and NMR spectroscopy an expression system for the IGF-1 Receptor was established., In dieser Dissertation werden drei verschiedener Proteine biochemisch und strukturbiologisch untersucht, die in der Krebsentstehung eine Rolle spielen. Eine neue Hypothese zur Interaktion von Shugoshin und Mad2 und ihrer Rolle bei der Mitose wird durch NMR- und ITC- Bindungsstudien unterstützt. Shugoshin bindet an Mad2 in der Bindungsstelle des sogenannten safty belt. Um die strukturelle Grundlage der Bindung eines neuen Inhibitors von CDK2 aufzuklären wurde versucht diesen Komplex zu kristallisieren. Zusätzlich wurde diese Interaktion verwendet um eine neue NMR Screeing-Methode zu verifizieren. Hierbei werden Bindungsstudien an Proteinen mit einfachen 1D NMR Spektren durchgeführt und Signale des Tryptophan beobachtet. Dabei sind auch quantitative Aussagen über den KD der Antagonist-Protein Interaktion möglich. Als Vorarbeit für röntgenkristallographische und NMR-spektroskopische Untersuchungen wurde ein Expressionssystem für den IGF-1 Rezeptor etabliert.

A series of different Re(VII) and Mo(VI) catalysts have been investigated towards their activity in the epoxidation of several olefins. The main focus was the performance under biphasic conditions by using different room-temperature ionic liquids. The catalyst activities and stabilities were compared to the homogeneous phase catalysis in conventional organic solvents. It was found that the turnover frequencies are in all cases considerably higher when using ILs than under solvent free conditions or homogeneous performance respectively. A second advantage of the performance in ILs is the possibility to reuse the catalyst. After the reaction, a phase separation ionic liquid/product takes place and the product can be easily removed quantitatively via cannulation and the catalytic system can be reused for further cycles without a significant loss of activity., Eine Reihe verschiedener Re(VII) und Mo(VI) Katalysatoren wurden auf ihre Aktivität in der Epoxidierung diverser Olefine untersucht. Der Schwerpunkt lag hierbei auf dem Einsatz von ionischen Flüssigkeiten, die es ermöglichen eine Zweiphasenkatalyse durchzuführen. Sowohl die Aktivität als auch die Stabilität der eingesetzten Katalysatoren wurden mit der homogenkatalytischen Durchführung in konventionellen organischen Lösungsmitteln verglichen. Es konnte festgestellt werden, dass die Aktivitäten beim Einsatz von ionischen Flüssigkeiten stets beträchtlich höher waren als bei der homogenen Durchführung. Ein weiterer Vorteil beim Einsatz ionischer Flüssigkeiten liegt in der Rezyklisierbarkeit. Nach der Reaktion liegt ein Zweiphasengemisch vor und das Produkt kann von der Katalysatorphase abgetrennt und für weitere Zyklen ohne signifikanten Aktivitätsverlust wiederverwendet werden.

The foldon domain can form native-like trimers, which show both high stability and fast association kinetics. Association is initiated after rapid formation of a monomeric intermediate. A hydrophobic cluster stabilizes this monomeric state. The effect of mutations of each amino acid in the hydrophobic cluster are probed by fluorescence spectra, the free folding enthalpy, unfolding and refolding kinetics, and the crystal structure of the native state. From the experimental results it becomes clear that the fast association of foldon is guided by a fast equilibrium between the unfolded and the monomeric intermediate state., Die Foldondomäne kann native Strukturen bilden und weist dabei eine hohe Stabilität und schnelle Assoziationskinetiken auf. Die Assoziation startet nach der schnellen Bildung eines monomeren Intermediates. Eine hydrophobe Gruppe stabilisiert diese Struktur. Der Einfluss von Mutationen jeder Aminosäure werden durch Fluoreszenzspektren, die freie Faltungsenthalpie, Entfaltung- und Rückfaltungskinetiken sowie die Kristallstrukturen bestimmt. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Assoziation von Foldon durch ein schnelles Gleichgewicht zwischen dem ungefalteten und dem intermediären Zustand bestimmt wird.

In the first part of the thesis triplet-triplet energy transfer was used to study the effect of solvent viscosity and temperature on end-to-end loop formation in unfolded polypeptide chains to characterize rate-limiting steps for loop formation. The results showed, that loop formation in long flexible model polypeptides is diffusion-controlled, while additional energy barriers are present in short chains and natural protein sequences. In the second part the effect of electrostatic interactions on the assembly of a trimeric protein was studied and the maximum rate constant for formation of the site-specific protein-protein interaction was determined using triplet-triplet energy transfer. One out of ten random contacts leads to a site-specific contact, while one out of 300 site-specific contacts leads to a stable interaction., Im ersten Teil der Arbeit wurde mittels Triplett-Triplett Energie Transfer der Effekt von Viskosität und Temperatur auf die End-zu-End Kontaktbildung in ungefalteten Polypeptidketten untersucht um die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte zu charakterisieren. Es zeigte sich, dass Kontaktbildung in langen flexiblen Modellpeptiden diffusionskontrolliert ist, während in kurzen Ketten und natürlichen Proteinsequenzen zusätzliche Energiebarrieren vorhanden sind. Im zweiten Teil wurde der Effekt von elektrostatischen Wechselwirkungen auf die Assemblierung eines trimeren Proteins untersucht und mittels Triplett-Triplett Energietransfer die maximale Geschwindigkeitskonstante für die ortsspezifische Protein-Protein Interaktion bestimmt. Einer von zehn zufälligen Kontakten führt zu einem ortsspezifischen Kontakt, während jeder 300. ortsspezifische Kontakt zu einer stabilen Wechselwirkung führt.

This thesis investigated how stress signals are transferred to the autophagy-machinery. The focus of our work was the protein kinase ULK1, the homolog of the Atg1-protein, a key initiator of autophagy in yeast. We showed that ULK1 interacts with the central cellular energy sensor AMPK and that ULK1 is a novel AMPK-substrate. Unprecedented in the literature, we determined amino acid residues in ULK1 that are specifically phosphorylated under stress conditions, and for three of these residues, we demonstrated phosphorylation by AMPK. Taken together, our results provide multiple entry points into further studies on the regulation of autophagy by ULK1., Ausgehend von der Proteinkinase ULK1, dem Homologen eines Schlüsselinitiators von Autophagie in Hefe, Atg1, wurde die grundsätzliche Frage untersucht, wie Stresssignale auf die Autophagiemaschinerie übertragen werden. Es wurde gezeigt, dass ULK1 mit dem zentralen zellulären Energiesensor AMPK interagiert und dass es sich bei ULK1 um ein neuartiges AMPK-Substrat handelt. Erstmals wurden Aminosäurereste in ULK1 bestimmt, die spezifisch unter Stressbedingungen phosphoryliert werden und die Phosphorylierung von drei dieser Aminosäurereste wurde eindeutig AMPK zugeordnet. Insgesamt eröffnen die vorgestellten Ergebnisse zahlreiche Ansatzpunkte für weitergehende Studien zur Regulation von Autophagie durch ULK1.

This thesis investigated how stress signals are transferred to the autophagy-machinery. The focus of our work was the protein kinase ULK1, the homolog of the Atg1-protein, a key initiator of autophagy in yeast. We showed that ULK1 interacts with the central cellular energy sensor AMPK and that ULK1 is a novel AMPK-substrate. Unprecedented in the literature, we determined amino acid residues in ULK1 that are specifically phosphorylated under stress conditions, and for three of these residues, we demonstrated phosphorylation by AMPK. Taken together, our results provide multiple entry points into further studies on the regulation of autophagy by ULK1., Ausgehend von der Proteinkinase ULK1, dem Homologen eines Schlüsselinitiators von Autophagie in Hefe, Atg1, wurde die grundsätzliche Frage untersucht, wie Stresssignale auf die Autophagiemaschinerie übertragen werden. Es wurde gezeigt, dass ULK1 mit dem zentralen zellulären Energiesensor AMPK interagiert und dass es sich bei ULK1 um ein neuartiges AMPK-Substrat handelt. Erstmals wurden Aminosäurereste in ULK1 bestimmt, die spezifisch unter Stressbedingungen phosphoryliert werden und die Phosphorylierung von drei dieser Aminosäurereste wurde eindeutig AMPK zugeordnet. Insgesamt eröffnen die vorgestellten Ergebnisse zahlreiche Ansatzpunkte für weitergehende Studien zur Regulation von Autophagie durch ULK1.

The foldon domain can form native-like trimers, which show both high stability and fast association kinetics. Association is initiated after rapid formation of a monomeric intermediate. A hydrophobic cluster stabilizes this monomeric state. The effect of mutations of each amino acid in the hydrophobic cluster are probed by fluorescence spectra, the free folding enthalpy, unfolding and refolding kinetics, and the crystal structure of the native state. From the experimental results it becomes clear that the fast association of foldon is guided by a fast equilibrium between the unfolded and the monomeric intermediate state., Die Foldondomäne kann native Strukturen bilden und weist dabei eine hohe Stabilität und schnelle Assoziationskinetiken auf. Die Assoziation startet nach der schnellen Bildung eines monomeren Intermediates. Eine hydrophobe Gruppe stabilisiert diese Struktur. Der Einfluss von Mutationen jeder Aminosäure werden durch Fluoreszenzspektren, die freie Faltungsenthalpie, Entfaltung- und Rückfaltungskinetiken sowie die Kristallstrukturen bestimmt. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Assoziation von Foldon durch ein schnelles Gleichgewicht zwischen dem ungefalteten und dem intermediären Zustand bestimmt wird.

A series of different Re(VII) and Mo(VI) catalysts have been investigated towards their activity in the epoxidation of several olefins. The main focus was the performance under biphasic conditions by using different room-temperature ionic liquids. The catalyst activities and stabilities were compared to the homogeneous phase catalysis in conventional organic solvents. It was found that the turnover frequencies are in all cases considerably higher when using ILs than under solvent free conditions or homogeneous performance respectively. A second advantage of the performance in ILs is the possibility to reuse the catalyst. After the reaction, a phase separation ionic liquid/product takes place and the product can be easily removed quantitatively via cannulation and the catalytic system can be reused for further cycles without a significant loss of activity., Eine Reihe verschiedener Re(VII) und Mo(VI) Katalysatoren wurden auf ihre Aktivität in der Epoxidierung diverser Olefine untersucht. Der Schwerpunkt lag hierbei auf dem Einsatz von ionischen Flüssigkeiten, die es ermöglichen eine Zweiphasenkatalyse durchzuführen. Sowohl die Aktivität als auch die Stabilität der eingesetzten Katalysatoren wurden mit der homogenkatalytischen Durchführung in konventionellen organischen Lösungsmitteln verglichen. Es konnte festgestellt werden, dass die Aktivitäten beim Einsatz von ionischen Flüssigkeiten stets beträchtlich höher waren als bei der homogenen Durchführung. Ein weiterer Vorteil beim Einsatz ionischer Flüssigkeiten liegt in der Rezyklisierbarkeit. Nach der Reaktion liegt ein Zweiphasengemisch vor und das Produkt kann von der Katalysatorphase abgetrennt und für weitere Zyklen ohne signifikanten Aktivitätsverlust wiederverwendet werden.

In the first part of the thesis triplet-triplet energy transfer was used to study the effect of solvent viscosity and temperature on end-to-end loop formation in unfolded polypeptide chains to characterize rate-limiting steps for loop formation. The results showed, that loop formation in long flexible model polypeptides is diffusion-controlled, while additional energy barriers are present in short chains and natural protein sequences. In the second part the effect of electrostatic interactions on the assembly of a trimeric protein was studied and the maximum rate constant for formation of the site-specific protein-protein interaction was determined using triplet-triplet energy transfer. One out of ten random contacts leads to a site-specific contact, while one out of 300 site-specific contacts leads to a stable interaction., Im ersten Teil der Arbeit wurde mittels Triplett-Triplett Energie Transfer der Effekt von Viskosität und Temperatur auf die End-zu-End Kontaktbildung in ungefalteten Polypeptidketten untersucht um die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte zu charakterisieren. Es zeigte sich, dass Kontaktbildung in langen flexiblen Modellpeptiden diffusionskontrolliert ist, während in kurzen Ketten und natürlichen Proteinsequenzen zusätzliche Energiebarrieren vorhanden sind. Im zweiten Teil wurde der Effekt von elektrostatischen Wechselwirkungen auf die Assemblierung eines trimeren Proteins untersucht und mittels Triplett-Triplett Energietransfer die maximale Geschwindigkeitskonstante für die ortsspezifische Protein-Protein Interaktion bestimmt. Einer von zehn zufälligen Kontakten führt zu einem ortsspezifischen Kontakt, während jeder 300. ortsspezifische Kontakt zu einer stabilen Wechselwirkung führt.

Smif wurde als Interaktionspartner von Smad4 identifiziert. Erste funktionelle Analysen ergaben eine Funktion von Smif als Transkriptionsaktivator im TGFβ-Signalweg. Zur Untersuchung der physiologischen Funktionen von Smif wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Smif-defizienter Mausstamm erfolgreich generiert und analysiert. Smif-defiziente Mäuse zeichnen sich durch einen ausgeprägten Autoimmunphänotyp aus, der mit einer verkürzten Lebensspanne, inflammatorischen Infiltraten in verschiedenen Organen und einer Immunkomplex-induzierten Glomerulonephritis assoziiert ist. T-Zellen konnten als Auslöser der Erkrankung identifiziert werden. Auf molekularer Ebene kann in Smif-defizienten Zellen die Transkription verschiedener Gene nicht mehr TGFβ-abhängig reguliert werden., Smif was originally identified as an interaction partner of Smad4. Functional analysis of Smif revealed a stimulatory effect in regulating TGFβ-dependent genes. To investigate the role of Smif in mammals, we generated a Smif knockout mouse. Smif-deficient mice were viable but exhibit a shortened life span. Overall pathological analysis of diseased mice revealed extensive lymphocytic infiltrates in multiple organs. Moreover, Smif-deficiency caused immune complex induced glomerulonephritis. Interestingly, we identified T and not B cells as the important target in Smif-deficient mice. On molecular level, transcription of TGFβ-responsive genes was greatly reduced in Smif-deficient cells.

Gene expression is a highly regulated process in our eukaryotic cells. To accomplish tight and dynamic control, regulatory functions affect protein production at various stages. The structural and biochemical work presented in this doctoral thesis, focuses on proteins involved in pre-mRNA splicing, one of the key steps in mRNA maturation, as well as on proteins engaged in chromatin remodeling. Notably, post-translational modifications, such methylation of arginine or lysine residues, have been shown to play critical roles for these processes. Chapter 1 and 2 serves as an introduction to regulation of gene expression and to structural biology, respectively. The aim is to give an overview of the current knowledge of the fundamental regulatory processes on the way from genes to proteins. The intention is to stress molecular aspects, and to point out how different pathways are intricately interconnected. Structural biology consists of rather different and complementary techniques. Here, mainly basic aspects of nuclear magnetic resonance (NMR), and its use to study the structure, dynamics and interactions of biomolecules, are covered. Chapter 3 describes the three-dimensional structure of the so-called TSN domain of Tudor-SN, comprising an extended Tudor domain fold. The structure was determined by X-ray crystallography. NMR 15N relaxation data and residual dipolar coupling measurements show that TSN adopts a compact fold, and that the two subdomains tumble together in solution, consistent with the crystal structure. Using NMR titrations, the TSN domain was found to bind peptides containing symmetrically dimethylated arginines (sDMA). The interaction involves an aromatic cage of the Tudor domain. Dimethylarginine-modified proteins have important functions in various cellular pathways, including the spliceosome. My results suggest how Tudor-SN might interact with the spliceosome, where it has been reported to enhance assembly and splicing efficiency. Chapter 4 reports the, Die Expression des genetischen Codes ist ein hoch regulierter Prozess in eukaryontischen Zellen. Die entsprechenden Aspekte der Proteinexpression in der Zelle unterliegen einer strengen und dynamischen Regulation. Die vorliegende Dissertation beschreibt strukturelle und biochemische Untersuchungen von Proteinen, die eine Rolle spielen für das RNA Spleißen, einem Schlüsselschritt der Reifung der Boten RNA, sowie für die Remodellierung des Chromatins spielen. Kapitel 1 und 2 geben eine Einführung in die verschiedenen Aspekte der Regulation der Genexpression sowie die strukturbiologische Verfahren. Ziel ist es, einen Überblick über grundlegende regulatorische Prozesse vom Gen zum Protein zu geben. Dabei liegt die Betonung darauf, molekulare Aspekte zu skizzieren und aufzuzeigen, wie die verschiedenen Signalwege eng miteinander verflochten sind. Strukturbiologie umfasst recht unterschiedliche aber komplementäre Methoden. Hier werden vor allem grundlegende Aspekte der Kernspinresonanz („nuclear magnetic resonance“, NMR) Spektroskopie besprochen, sowie ihr Potential für die Untersuchung der Struktur, Dynamik und Wechselwirkungen von biologischen Makromolekülen aufgezeigt. Kapitel 3 beschreibt die drei-dimensional Struktur der sogenannten TSN Domäne des Tudor-SN Proteins, die ein erweitertes Tudor Domänen Faltungsmotiv darstellt. Die Struktur wurde mittels Röntgenstrukturanalyse bestimmt. NMR 15N Relaxationsmessungen und dipolare Restkopplungen („residual dipolar couplings“, RDCs) zeigen, das TSN eine kompakte Struktur einnimmt und dass die beiden Untereinheiten sich in Lösung gemeinsam reorientieren, konsistent mit der Kristallstruktur. Mittels NMR Titrationen konnte gezeigt werden, dass die TSN Domäne Peptide mit symmetrisch dimethylierten Argininen (sDMA) bindet. Die Erkennung wird durch einen aromatischen Käfig der Tudor Domäne vermittelt. Dimethylarginin-modifizierte Proteine sind von großer Bedeutung für verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich des Spleißosoms

Klinisches Archivmaterial stellt eine umfangreiche und wertvolle Quelle an Gewebeproben für Forschung und Diagnose dar. Aufgrund früherer Studien wurde angenommen, dass aus Formalin fixierten und Paraffin eingebetteten Proben keine intakten Proteine isoliert werden können. In der vorliegenden Arbeit konnte eine Methode etabliert werden, mit der nicht degradierte Proteine effizient extrahiert werden können. Die Proteindetektion erfolgte durch etablierte molekularbiologische Verfahren wie Western- und Dot-Blots. Fixierte und nicht fixierte Lysate zeigten sich weitestgehend vergleichbar. Weiterhin konnte die Methode auf die Hochdurchsatzanwendung mit Reverse Phase Protein Microarrays adaptiert werden. Sie eignet sich daher auch für den Einsatz in der klinischen Diagnostik, zur personalisierten, exakten Quantifizierung von Biomarkern aus entnommenen Gewebeproben und ergänzt sinnvoll die histopathologische Bewertung von Gewebeschnitten., Clinical archive material represents a substantial and valuable source of tissue samples for research and diagnostic approaches. Based on earlier studies the extraction of intact proteins was considered not possible. In the present theses a method was established for efficient extraction of full length proteins from formalin fixed and paraffin embedded tissues. The protein detection was done by established molecular biologic techniques like western blotting and dot blots. Fixed and non fixed samples showed almost identical results. In a next step the method was adapted to a high throughput application on reverse phase protein arrays. All together the developed method is applicable for clinical routine diagnostic, for a personalized exact quantitation of biomarker from tissue biopsy and therefore reasonable complements histopathological evaluations of patient tissue sections.

Die chronische myeloische Leukämie (CML) ist durch die Expression des Fusionsproteins BCR-ABL charakterisiert. BCR-ABL aktiviert eine Vielzahl verschiedener Signalkaskaden in der malignen Zelle und induziert hierdurch Proliferation, Transformation und Antiapoptose. Die Identifikation kritischer Mediatorproteine innerhalb dieser Signalvermittlung ist wesentlich für die Entwicklung neuer Therapieansätze. In dieser Arbeit wurde ein retrovirales Vektorsystem entwickelt, das die Expression des Onkogens und eine synchrone shRNA-vermittelte Suppression des zu untersuchenden Zielproteins ermöglicht. Mithilfe dieser Methode wurde die Bedeutung von Raf-1, Grb10 und p53 für die BCR-ABL-abhängige Tumorgenese in vitro und in vivo in Knochenmarktransplantationsexperimenten untersucht., Chronic myeloid leukemia (CML) is characterized by the expression of the fusion protein BCR-ABL. BCR-ABL activates a broad range of signaling cascades mediating proliferation, transformation and anti-apoptosis of the malignant cell. The identification of crucial mediator proteins within these cascades is of vital importance for the development of new anti leukemic therapies. In this work a retroviral vector system for dual expression of the oncogene and a target-specific shRNA at the same time has been developed. Using this system, the roles of Raf-1, Grb10 and p53 for the BCR-ABL dependent tumorigenesis in vitro and in vivo in bone marrow transplantation experiments was unraveled.

The apoptosis resistance of tumor cells is a universal feature of tumor development and of treatment resistance to chemotherapeutic drugs. The reasons for the treatment resistance are uncertain in many tumors, but altered expression of apoptosis-regulating Bcl-2 proteins could be involved. Here, the apoptotic signaling pathway was analyzed in cell lines of human renal cell carcinoma (RCC). Inhibition of anti-apoptotic Bcl-2 proteins demonstrated a strong sensitization of resistant cell lines to chemotherapeutic drugs. The induction of pro-apoptotic Noxa during treatment with drugs was required for the inactivation of anti-apoptotic proteins Mcl-1 and A1. Thus, a molecular aspect of apoptosis resistance in RCC was described and a therapeutic approach by inhibiton of Bcl-2 proteins could be shown., Die Apoptoseresistenz in Tumorzellen ist ein universelles Merkmal der Tumorentwicklung und der Behandlungsresistenz gegen chemotherapeutische Agenzien. Die Gründe für die hohe Widerstandsfähigkeit sind in vielen Tumoren unbekannt, aber eine veränderte Expression der Apoptose-regulierenden Bcl-2 Proteine könnte beteiligt sein. Hier wurde in Zelllinien des humanen Nierenzellkarzinoms (NZK) der Apoptose-Signalweg biochemisch analysiert und nach Apoptose-induzierenden Mechanismen gesucht. Dabei konnten resistente Zelllinien durch pharmakologische Hemmung der anti-apoptotischen Bcl-2 Proteine auf Chemotherapeutika sensibilisiert werden. Der beobachtete Synergismus konnte zudem auf eine Noxa-vermittelte Inaktivierung der anti-apoptotischen Proteine Mcl-1 und A1 zurückgeführt werden. Somit wurde im NZK ein molekularer Aspekt der Apoptoseresistenz beschrieben und ein therapeutischer Zugang durch Inhibition der Bcl-2 Proteine aufgezeigt.

Cks1 is an adaptor protein that is essential for binding of threonine-187 phosphorylated p27Kip1 to the ubiquitin ligase complex SCFSkp2. In this dissertation functions of Cks1 independent of p27Kip1 degradation were analyzed. To this end p27Kip1-/-;Cks1-/- mice were generated and the phenotype was analyzed and compared to that of p27Kip1-/- mice in vivo and in vitro. Loss of Cks1 induces a diminished proliferation independent of SCFSkp2 and a p27Kip1-dependent arrest of cells in G2/M. The tumor suppressor function of p27Kip1 was not affected by additional loss of Cks1., Cks1 ist ein Adapterprotein, das für die Bindung von Threonin187-phosphoryliertem p27Kip1 an den Ubiquitin-Ligase-Komplex SCFSkp2 essentiell ist. Im Rahmen dieser Dissertation sollten Funktionen von Cks1 unabhängig vom Abbau von p27Kip1 identifiziert werden. Dafür wurden p27Kip1-/-;Cks1-/- Mäuse generiert und deren Phänotyp in vivo und in vitro untersucht und mit dem des p27Kip1-/- verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass Cks1-Verlust unabhängig vom p27Kip1 Genotyp zu einer signifikant verminderten Proliferation führt. Cks1 ist, unabhägig von SCFSkp2, essentiell für den geregelten G1/S Übergang und wirkt p27Kip1-abhängig am G2/M Übergang. Die Tumorsuppressorfunktion von p27Kip1 wird durch den zusätzlichen Verlust von Cks1 nicht beeinträchtig.

Die chronische myeloische Leukämie (CML) ist durch die Expression des Fusionsproteins BCR-ABL charakterisiert. BCR-ABL aktiviert eine Vielzahl verschiedener Signalkaskaden in der malignen Zelle und induziert hierdurch Proliferation, Transformation und Antiapoptose. Die Identifikation kritischer Mediatorproteine innerhalb dieser Signalvermittlung ist wesentlich für die Entwicklung neuer Therapieansätze. In dieser Arbeit wurde ein retrovirales Vektorsystem entwickelt, das die Expression des Onkogens und eine synchrone shRNA-vermittelte Suppression des zu untersuchenden Zielproteins ermöglicht. Mithilfe dieser Methode wurde die Bedeutung von Raf-1, Grb10 und p53 für die BCR-ABL-abhängige Tumorgenese in vitro und in vivo in Knochenmarktransplantationsexperimenten untersucht., Chronic myeloid leukemia (CML) is characterized by the expression of the fusion protein BCR-ABL. BCR-ABL activates a broad range of signaling cascades mediating proliferation, transformation and anti-apoptosis of the malignant cell. The identification of crucial mediator proteins within these cascades is of vital importance for the development of new anti leukemic therapies. In this work a retroviral vector system for dual expression of the oncogene and a target-specific shRNA at the same time has been developed. Using this system, the roles of Raf-1, Grb10 and p53 for the BCR-ABL dependent tumorigenesis in vitro and in vivo in bone marrow transplantation experiments was unraveled.

Klinisches Archivmaterial stellt eine umfangreiche und wertvolle Quelle an Gewebeproben für Forschung und Diagnose dar. Aufgrund früherer Studien wurde angenommen, dass aus Formalin fixierten und Paraffin eingebetteten Proben keine intakten Proteine isoliert werden können. In der vorliegenden Arbeit konnte eine Methode etabliert werden, mit der nicht degradierte Proteine effizient extrahiert werden können. Die Proteindetektion erfolgte durch etablierte molekularbiologische Verfahren wie Western- und Dot-Blots. Fixierte und nicht fixierte Lysate zeigten sich weitestgehend vergleichbar. Weiterhin konnte die Methode auf die Hochdurchsatzanwendung mit Reverse Phase Protein Microarrays adaptiert werden. Sie eignet sich daher auch für den Einsatz in der klinischen Diagnostik, zur personalisierten, exakten Quantifizierung von Biomarkern aus entnommenen Gewebeproben und ergänzt sinnvoll die histopathologische Bewertung von Gewebeschnitten., Clinical archive material represents a substantial and valuable source of tissue samples for research and diagnostic approaches. Based on earlier studies the extraction of intact proteins was considered not possible. In the present theses a method was established for efficient extraction of full length proteins from formalin fixed and paraffin embedded tissues. The protein detection was done by established molecular biologic techniques like western blotting and dot blots. Fixed and non fixed samples showed almost identical results. In a next step the method was adapted to a high throughput application on reverse phase protein arrays. All together the developed method is applicable for clinical routine diagnostic, for a personalized exact quantitation of biomarker from tissue biopsy and therefore reasonable complements histopathological evaluations of patient tissue sections.

Gene expression is a highly regulated process in our eukaryotic cells. To accomplish tight and dynamic control, regulatory functions affect protein production at various stages. The structural and biochemical work presented in this doctoral thesis, focuses on proteins involved in pre-mRNA splicing, one of the key steps in mRNA maturation, as well as on proteins engaged in chromatin remodeling. Notably, post-translational modifications, such methylation of arginine or lysine residues, have been shown to play critical roles for these processes. Chapter 1 and 2 serves as an introduction to regulation of gene expression and to structural biology, respectively. The aim is to give an overview of the current knowledge of the fundamental regulatory processes on the way from genes to proteins. The intention is to stress molecular aspects, and to point out how different pathways are intricately interconnected. Structural biology consists of rather different and complementary techniques. Here, mainly basic aspects of nuclear magnetic resonance (NMR), and its use to study the structure, dynamics and interactions of biomolecules, are covered. Chapter 3 describes the three-dimensional structure of the so-called TSN domain of Tudor-SN, comprising an extended Tudor domain fold. The structure was determined by X-ray crystallography. NMR 15N relaxation data and residual dipolar coupling measurements show that TSN adopts a compact fold, and that the two subdomains tumble together in solution, consistent with the crystal structure. Using NMR titrations, the TSN domain was found to bind peptides containing symmetrically dimethylated arginines (sDMA). The interaction involves an aromatic cage of the Tudor domain. Dimethylarginine-modified proteins have important functions in various cellular pathways, including the spliceosome. My results suggest how Tudor-SN might interact with the spliceosome, where it has been reported to enhance assembly and splicing efficiency. Chapter 4 reports the, Die Expression des genetischen Codes ist ein hoch regulierter Prozess in eukaryontischen Zellen. Die entsprechenden Aspekte der Proteinexpression in der Zelle unterliegen einer strengen und dynamischen Regulation. Die vorliegende Dissertation beschreibt strukturelle und biochemische Untersuchungen von Proteinen, die eine Rolle spielen für das RNA Spleißen, einem Schlüsselschritt der Reifung der Boten RNA, sowie für die Remodellierung des Chromatins spielen. Kapitel 1 und 2 geben eine Einführung in die verschiedenen Aspekte der Regulation der Genexpression sowie die strukturbiologische Verfahren. Ziel ist es, einen Überblick über grundlegende regulatorische Prozesse vom Gen zum Protein zu geben. Dabei liegt die Betonung darauf, molekulare Aspekte zu skizzieren und aufzuzeigen, wie die verschiedenen Signalwege eng miteinander verflochten sind. Strukturbiologie umfasst recht unterschiedliche aber komplementäre Methoden. Hier werden vor allem grundlegende Aspekte der Kernspinresonanz („nuclear magnetic resonance“, NMR) Spektroskopie besprochen, sowie ihr Potential für die Untersuchung der Struktur, Dynamik und Wechselwirkungen von biologischen Makromolekülen aufgezeigt. Kapitel 3 beschreibt die drei-dimensional Struktur der sogenannten TSN Domäne des Tudor-SN Proteins, die ein erweitertes Tudor Domänen Faltungsmotiv darstellt. Die Struktur wurde mittels Röntgenstrukturanalyse bestimmt. NMR 15N Relaxationsmessungen und dipolare Restkopplungen („residual dipolar couplings“, RDCs) zeigen, das TSN eine kompakte Struktur einnimmt und dass die beiden Untereinheiten sich in Lösung gemeinsam reorientieren, konsistent mit der Kristallstruktur. Mittels NMR Titrationen konnte gezeigt werden, dass die TSN Domäne Peptide mit symmetrisch dimethylierten Argininen (sDMA) bindet. Die Erkennung wird durch einen aromatischen Käfig der Tudor Domäne vermittelt. Dimethylarginin-modifizierte Proteine sind von großer Bedeutung für verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich des Spleißosoms

The apoptosis resistance of tumor cells is a universal feature of tumor development and of treatment resistance to chemotherapeutic drugs. The reasons for the treatment resistance are uncertain in many tumors, but altered expression of apoptosis-regulating Bcl-2 proteins could be involved. Here, the apoptotic signaling pathway was analyzed in cell lines of human renal cell carcinoma (RCC). Inhibition of anti-apoptotic Bcl-2 proteins demonstrated a strong sensitization of resistant cell lines to chemotherapeutic drugs. The induction of pro-apoptotic Noxa during treatment with drugs was required for the inactivation of anti-apoptotic proteins Mcl-1 and A1. Thus, a molecular aspect of apoptosis resistance in RCC was described and a therapeutic approach by inhibiton of Bcl-2 proteins could be shown., Die Apoptoseresistenz in Tumorzellen ist ein universelles Merkmal der Tumorentwicklung und der Behandlungsresistenz gegen chemotherapeutische Agenzien. Die Gründe für die hohe Widerstandsfähigkeit sind in vielen Tumoren unbekannt, aber eine veränderte Expression der Apoptose-regulierenden Bcl-2 Proteine könnte beteiligt sein. Hier wurde in Zelllinien des humanen Nierenzellkarzinoms (NZK) der Apoptose-Signalweg biochemisch analysiert und nach Apoptose-induzierenden Mechanismen gesucht. Dabei konnten resistente Zelllinien durch pharmakologische Hemmung der anti-apoptotischen Bcl-2 Proteine auf Chemotherapeutika sensibilisiert werden. Der beobachtete Synergismus konnte zudem auf eine Noxa-vermittelte Inaktivierung der anti-apoptotischen Proteine Mcl-1 und A1 zurückgeführt werden. Somit wurde im NZK ein molekularer Aspekt der Apoptoseresistenz beschrieben und ein therapeutischer Zugang durch Inhibition der Bcl-2 Proteine aufgezeigt.

We coexpressed and copurified recombinant yeast class II HDAC complex from bacteria as a functionally active and trichostatin-A (TSA)-sensitive heterotetrameric Hda1 complex. We characterized the interaction of the HDAC complex with either single-stranded or double-stranded DNA and identified the N-terminal halves of scHda2p and scHda3p as binding modules. A high resolution structure of the scHda3p DNA-binding domain (DBD3) by X-ray crystallography is presented. We have succeeded in solving the crystal structure of Sap5 in complex with pepstatin-A at 2.5Å resolution. This facilitates comparison of structural details as well as inhibitor binding modes among the different subgroup members Sap4-6., Nach gemeinsamer bakterieller Expression und Reinigung wurde ein funktionell aktiver und Trichostatin-A (TSA)-sensitiver heterotrimerer Hda1 Komplex erhalten. Eine Charakterisierung der Interaktion des HDAC Komplexes mit sowohl einzelsträngiger als auch doppelsträngiger DNA identifizierte die N-terminalen Hälften von scHda2p und scHda3p als Bindemoleküle. Durch Röntgenstrahlkristallographie wurde eine hochauflösende Struktur der scHda3p DNA-Bindedomain (DBD3) aufgeklärt. In der hier beschriebenen Studie wurde die Kristallstruktur von Sap5 im Komplex mit Pepstatin-A mit einer Auflösung von 2.5Å erfolgreich aufgeklärt. Dies ermöglicht einen Vergleich sowohl der strukturellen Details als auch des Mechanismus der Inhibitorbindung unter den verschiedenen Mitgliedern der Untergruppe Sap4-6.

A number of nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy techniques and molecular modeling approaches have been applied for treating several problems in bioorganic and medicinal chemistry. Whereas an experimental screening method was developed by using NMR spectroscopy, virtual screening allowed the identification of a ligand that binds with medium affinity to the co-chaperone Sti1. Molecular dynamics (MD) simulations were utilized to predict residual dipolar couplings (RDC) via a simple alignment model and to elucidate the 3D arrangement of a natural product by an RDC-only structure determination approach. NMR and MD were further applied to study the role of proline and -methylated amino acids in conformational design, to elucidate the structural stability of the integrin binder Cilengitide in different environments, and to analyze the relation between molecular flexibility of cyclic template peptides and their cellular absorption., Mehrere Methoden der Kernmagnetischen Resonanz-Spektroskopie (NMR) und der Molekularen Modellierung wurden verwendet, um verschiedene Fragestellungen der Bioorganischen und Medizinischen Chemie zu bearbeiten. Während eine experimentelle Screening-Technik entwickelt wurde, führte der Einsatz Computer-basierten Screenings zur Identifizierung eines Liganden mit mittlerer Affinität zum Co-Chaperon Sti1. Moleküldynamik-Simulationen (MD) wurden zur Vorhersage von Restdipolkopplungen (RDC) mit Hilfe eines einfachen Alignment-Models und zur RDC-gestützten Strukturaufklärung eines Naturstoffes benutzt. NMR und MD wurden zudem eingesetzt, um sowohl die Rolle von Prolin und N-methylierten Aminosäuren für das konformationelle Design und die strukturelle Stabilität des Integrin-Binders Cilengitide in verschiedenen chemischen Umgebungen zu entschlüsseln als auch um die Beziehung zwischen molekularer Flexibilität zyklischer Templat-Peptide und ihrer zellulären Aufnahme zu untersuchen.

Within this thesis, novel rhodium and iridium catalysts were designed and tested in asymmetric catalysis. Herefore, organometallic complexes comprising pendant linkers were conjugated to biologically active peptides. The resulting metalla affinity labels facilitate selective, directed and covalent attachment of the metal centers to the catalytically active protease amino acids. The resulting defined embedment of the organometallic catalysts into the enzyme’s active site results in effective transfer of the protein scaffold’s chiral information, which can be considered to be one of the catalyst’s ligands. With this modular system, enantiomeric excesses of up to 64% were obtained., Im Rahmen dieser Dissertation wurden neuartige Rhodium- und Iridium-Katalysatoren entwickelt und in der asymmetrischen Katalyse getestet. Hierzu wurden entsprechende organometallische Komplexe über funktionalisierbare Linker mit biologisch aktiven Peptiden konjugiert. Die so erhaltenen Metalla-Affinitätsmarker ermöglichen die selektive, gerichtete und kovalente Anbindung der Metallzentren an die katalytisch aktiven Aminosäuren von Proteasen. Die resultierende definierte Einbettung der Organometall-Katalysatoren in die Selektivitätstasche des Enzyms resultiert in effektiver Übertragung der chiralen Information der als Steuerligand fungierenden Proteinumgebung. Mit diesem modularen System konnten Enantiomerenüberschüsse von bis zu 64% erreicht werden.

For NMR analysis of interferences by small molecules with biologically important protein-protein interactions, a new method was developed, which is based on differences of 1/T2 relaxation rates of the interacting proteins. For this purpose, the proteins have to be 15N- or 13C-labelled and the protein complex should be larger than 40 kDa, with one protein component of a size smaller than 15 kDa. To assess the efficiency of this NMR procedure, the p53/Mdm2 interaction was selected as a model system. Among small molecules reported as antagonists for this complex, only one was found to act as an efficient antagonist. These results show that the new procedure represents an important implementation of SAR by NMR. The method was applied also in the analysis of inhibitors of CDK2, by comparing binding of ATP, chalcones and indole-3-carbinol. An interaction of chalcone with the ATP binding site of CDK2 could be described., Für die NMR-Interferenz-Analyse durch kleine Moleküle mit biologisch bedeutsamen Protein-Protein-Interaktionen ist eine neue Methode entwickelt worden, die auf Unterschieden bei den 1/T2 Relaxationsraten der sich gegenseitig beeinflussenden Proteine basiert. Zu diesem Zweck müssen die Proteine als 15N oder 13C markiert sein und der Protein-Komplex sollte größer als 40 kDa sein, wobei eine Protein-Komponente kleiner als 15 kDa sein sollte. Um die Effizienz dieser NMR-Methode zu bestätigen, ist die p53/Mdm2-Interaktion als Modellsystem ausgewählt worden. Unter den kleinen Molekülen, die für diesen Komplex als Antagonisten vorgeschlagen wurden, war lediglich ein Molekül als effizienter Antagonist tätig. Diese Ergebnisse zeigen, dass die neue Messmethode eine bedeutsame Implementierung von „SAR by NMR“ darstellt. Die Methode wurde auch bei der Analyse der CDK2-Inhibitoren angewandt, wobei ATP-Bindung, Chalcone und Indol-3-Carbinol verglichen wurden. Eine Interaktion von Chalcones mit der ATP-Bindungsstelle von CDK2 konnte festgestellt werden.

Based on the crystal structure of BACE1 and an inhibitor ligands were developed by structural based design, which contain for the first time phosphorus dipeptide isosteres as central mimetic. These inhibitors rank at present among others as most active ones. Moreover as new N-terminal replacement of the original peptidic structure scaffold mimetics based on 3,4-dihydro-1H-benzo[e][1,4]diazepine-2,5-dione were developed, which are suitable candidates for further research. In the second part of the work it was in principle shown that 31P-NMR spectroscopy represents a valuable tool in the screening of substance libraries. This is valid in particular for protease inhibitors, since numerous dipeptide isosteres contain phosphorus, in addition, naturally phosphorylated substrates and their analogs, as well as ATP analogs can serve as starting points for the development of suitable substance libraries., Basierend auf der Kristallstruktur von BACE1 und einem Inhibitor wurden mit Hilfe eines Struktur-basierenden Designs Liganden entwickelt, die unter anderem erstmals ein Phosphor Dipeptid-Isoster als zentrales Mimetikum enthalten. Diese Hemmstoffe zählen zu den derzeit Aktivsten. Des Weiteren wurden als neuer N-terminaler Ersatz der ursprünglichen peptidischen Struktur Gerüstmimetika basierend auf 3,4-dihydro-1H-benzo[e][1,4]diazepine-2,5-dione entwickelt, welche geeignete Kandidaten für weitere Forschungen darstellen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde grundsätzlich gezeigt, dass 31P-NMR Spektroskopie ein wertvolles Werkzeug im Screening von Substanzbibliotheken darstellt. Dies gilt insbesondere für Protease Inhibitoren, da zahlreiche Dipeptid-Isostere Phosphor enthalten, aber auch natürlich phosphorylierte Substrate und ihre Analoga, sowie ATP Analoga können als Ausgangspunkt zur Entwicklung geeigneter Substanzbibliotheken dienen.

Within this thesis, novel rhodium and iridium catalysts were designed and tested in asymmetric catalysis. Herefore, organometallic complexes comprising pendant linkers were conjugated to biologically active peptides. The resulting metalla affinity labels facilitate selective, directed and covalent attachment of the metal centers to the catalytically active protease amino acids. The resulting defined embedment of the organometallic catalysts into the enzyme’s active site results in effective transfer of the protein scaffold’s chiral information, which can be considered to be one of the catalyst’s ligands. With this modular system, enantiomeric excesses of up to 64% were obtained., Im Rahmen dieser Dissertation wurden neuartige Rhodium- und Iridium-Katalysatoren entwickelt und in der asymmetrischen Katalyse getestet. Hierzu wurden entsprechende organometallische Komplexe über funktionalisierbare Linker mit biologisch aktiven Peptiden konjugiert. Die so erhaltenen Metalla-Affinitätsmarker ermöglichen die selektive, gerichtete und kovalente Anbindung der Metallzentren an die katalytisch aktiven Aminosäuren von Proteasen. Die resultierende definierte Einbettung der Organometall-Katalysatoren in die Selektivitätstasche des Enzyms resultiert in effektiver Übertragung der chiralen Information der als Steuerligand fungierenden Proteinumgebung. Mit diesem modularen System konnten Enantiomerenüberschüsse von bis zu 64% erreicht werden.

A number of nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy techniques and molecular modeling approaches have been applied for treating several problems in bioorganic and medicinal chemistry. Whereas an experimental screening method was developed by using NMR spectroscopy, virtual screening allowed the identification of a ligand that binds with medium affinity to the co-chaperone Sti1. Molecular dynamics (MD) simulations were utilized to predict residual dipolar couplings (RDC) via a simple alignment model and to elucidate the 3D arrangement of a natural product by an RDC-only structure determination approach. NMR and MD were further applied to study the role of proline and -methylated amino acids in conformational design, to elucidate the structural stability of the integrin binder Cilengitide in different environments, and to analyze the relation between molecular flexibility of cyclic template peptides and their cellular absorption., Mehrere Methoden der Kernmagnetischen Resonanz-Spektroskopie (NMR) und der Molekularen Modellierung wurden verwendet, um verschiedene Fragestellungen der Bioorganischen und Medizinischen Chemie zu bearbeiten. Während eine experimentelle Screening-Technik entwickelt wurde, führte der Einsatz Computer-basierten Screenings zur Identifizierung eines Liganden mit mittlerer Affinität zum Co-Chaperon Sti1. Moleküldynamik-Simulationen (MD) wurden zur Vorhersage von Restdipolkopplungen (RDC) mit Hilfe eines einfachen Alignment-Models und zur RDC-gestützten Strukturaufklärung eines Naturstoffes benutzt. NMR und MD wurden zudem eingesetzt, um sowohl die Rolle von Prolin und N-methylierten Aminosäuren für das konformationelle Design und die strukturelle Stabilität des Integrin-Binders Cilengitide in verschiedenen chemischen Umgebungen zu entschlüsseln als auch um die Beziehung zwischen molekularer Flexibilität zyklischer Templat-Peptide und ihrer zellulären Aufnahme zu untersuchen.

Based on the crystal structure of BACE1 and an inhibitor ligands were developed by structural based design, which contain for the first time phosphorus dipeptide isosteres as central mimetic. These inhibitors rank at present among others as most active ones. Moreover as new N-terminal replacement of the original peptidic structure scaffold mimetics based on 3,4-dihydro-1H-benzo[e][1,4]diazepine-2,5-dione were developed, which are suitable candidates for further research. In the second part of the work it was in principle shown that 31P-NMR spectroscopy represents a valuable tool in the screening of substance libraries. This is valid in particular for protease inhibitors, since numerous dipeptide isosteres contain phosphorus, in addition, naturally phosphorylated substrates and their analogs, as well as ATP analogs can serve as starting points for the development of suitable substance libraries., Basierend auf der Kristallstruktur von BACE1 und einem Inhibitor wurden mit Hilfe eines Struktur-basierenden Designs Liganden entwickelt, die unter anderem erstmals ein Phosphor Dipeptid-Isoster als zentrales Mimetikum enthalten. Diese Hemmstoffe zählen zu den derzeit Aktivsten. Des Weiteren wurden als neuer N-terminaler Ersatz der ursprünglichen peptidischen Struktur Gerüstmimetika basierend auf 3,4-dihydro-1H-benzo[e][1,4]diazepine-2,5-dione entwickelt, welche geeignete Kandidaten für weitere Forschungen darstellen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde grundsätzlich gezeigt, dass 31P-NMR Spektroskopie ein wertvolles Werkzeug im Screening von Substanzbibliotheken darstellt. Dies gilt insbesondere für Protease Inhibitoren, da zahlreiche Dipeptid-Isostere Phosphor enthalten, aber auch natürlich phosphorylierte Substrate und ihre Analoga, sowie ATP Analoga können als Ausgangspunkt zur Entwicklung geeigneter Substanzbibliotheken dienen.

The apoptosis of phagocytes strongly affects course and termination of responses of the innate immune system during infection. This work identified phagocytosis and the intracellular degradation of bacteria as an important factor in the initiation of macrophage apoptosis. In the termination phase of the immune response, granulocyte apoptosis plays a critical role, and the involvement of the Bcl-2 proteins Bim, Puma, and A1 in cell death could be shown. It was further demonstrated that activated immune functions of neutrophils can only be shut off through apoptosis. Accordingly, in a murine model of pneumococcal meningitis, a block of apoptosis led to hyperinflammation and aggravated the course of the disease., Die Apoptose von Phagozyten nimmt großen Einfluß auf den Verlauf und die Beendigung der Antwort des angeborenen Immunsystems während Infektionen. Diese Arbeit identifizierte die Phagozytose und den intrazellulären Abbau von Bakterien als wichtigen Faktor in der Auslösung der Makrophagenapoptose. In der Abschlußphase der Immunantwort spielt die Apoptose von Granulozyten eine bedeutende Rolle, und eine Beteiligung der Bcl-2 Proteine Bim, Puma, sowie A1 am Zelltod wurde nachgewiesen. Des weiteren wurde gezeigt, daß sich aktivierte Immunfunktionen von Granulozyten nur durch Apoptose abschalten lassen. Eine Blockierung der Apoptose führte deshalb in einem Tiermodel der Pneumokokkenmeningitis zu Hyperinflammation und einer Verschlechterung des Krankheitsverlaufes.

The apoptosis of phagocytes strongly affects course and termination of responses of the innate immune system during infection. This work identified phagocytosis and the intracellular degradation of bacteria as an important factor in the initiation of macrophage apoptosis. In the termination phase of the immune response, granulocyte apoptosis plays a critical role, and the involvement of the Bcl-2 proteins Bim, Puma, and A1 in cell death could be shown. It was further demonstrated that activated immune functions of neutrophils can only be shut off through apoptosis. Accordingly, in a murine model of pneumococcal meningitis, a block of apoptosis led to hyperinflammation and aggravated the course of the disease., Die Apoptose von Phagozyten nimmt großen Einfluß auf den Verlauf und die Beendigung der Antwort des angeborenen Immunsystems während Infektionen. Diese Arbeit identifizierte die Phagozytose und den intrazellulären Abbau von Bakterien als wichtigen Faktor in der Auslösung der Makrophagenapoptose. In der Abschlußphase der Immunantwort spielt die Apoptose von Granulozyten eine bedeutende Rolle, und eine Beteiligung der Bcl-2 Proteine Bim, Puma, sowie A1 am Zelltod wurde nachgewiesen. Des weiteren wurde gezeigt, daß sich aktivierte Immunfunktionen von Granulozyten nur durch Apoptose abschalten lassen. Eine Blockierung der Apoptose führte deshalb in einem Tiermodel der Pneumokokkenmeningitis zu Hyperinflammation und einer Verschlechterung des Krankheitsverlaufes.

It has been known for a long time that plasma prekallikrein (PPK) is synthesized in hepatocytes and secreted into blood where it participates in various physiological processes. Recently the PPK gene was found to be transcribed and the protein synthesized also in various non-hepatic tissues. The results presented here demonstrate that in human tissues a multitude of transcript variants of the PPK gene is formed resulting from recruitment of alternative promoters and different initiation sites utilized by each promoter, and from alternative splicing. This finding argues for the need of a differentiated temporal and spatial control of the expression of the PPK gene, thus arguing for the concept that PPK is not only functional in blood, but it also plays important roles in various physiological processes at different developmental stages and in various tissues and cell types., Seit langem ist bekannt, dass Plasmapräkallikrein (PPK) in Hepatocyten gebildet und in das Blut sezerniert wird und dort an diversen physiologischen Vorgängen beteiligt ist. Kürzlich wurde gezeigt, dass auch in vielen nicht-hepatischen Geweben das PPK-Gen transkribiert und das Protein synthetisiert wird. Die hier dargestellten Untersuchungen ergaben, dass in humanen Geweben eine Vielfalt von Transkriptvarianten des PPK-Gens exprimiert wird, was bedingt ist durch die Rekrutierung alternativer Promotoren und unterschiedlicher Transkriptionsstartpunkte sowie durch alternatives Spleißen. Dies spricht für die Notwendigkeit einer zeitlich und räumlich differenziert regulierten Expression des PPK-Gens und somit für die Richtigkeit des Konzepts, dass PPK nicht nur im Blut eine Rolle spielt, sondern dass es bei diversen physiologischen Prozessen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien, Geweben und Zelltypen wichtige Funktionen erfüllt.