Search

Growing populations of the piscivorous top predators the grey seal (Halichoerus grypus) and the great cormorant (Phalacrocorax ssp) in the Baltic Sea have created predator-fishery conflicts. Responsible mitigation measures require that correct and adequate information on the predator foraging habits is available. Adipose tissue fatty acid (FA) profiling is an established method for such dietary and food web studies since the FAs are transferred from the prey to predator tissues in a predictable way. However, sampling procedures and the way of using the FA profiles need to be optimized for each predator phyla to create globally applicable and reliable procedures for the diet assessment. One prerequisite is to build a reference library of the FA compositions of the available prey selection (fishes in the Baltic Sea), and the predator tissue metabolism and other factors affecting the tissue FA profiles need to be studied in order to avoid misinterpretation of results. We analysed tissue FA profiles of fishes, grey seals and great cormorants from the Baltic Sea area by gas chromatography, and used multivariate Principal Component Analysis (PCA) along with Soft Independent Modelling of Class Analogy (SIMCA) to analyse the multivariate data. Pinniped blubber FA profile differs vertically through the blubber column from skin to muscle, which raises a question whether sampling depth causes discrepancy in the results. We found that the vertical FA stratification patterns show constant trends, but also large individual differences. All studied adult grey seal males (n = 30) had enrichment of monounsaturated FAs (MUFAs) in their outer blubber, whereas polyunsaturated FAs (PUFAs) did not show similar strong stratification pattern along the blubber column as the MUFAs did. The degree of vertical FA stratification did not depend on blubber thickness and was slightly age-dependent only for two FAs, 16:0 and 16:1n-7. In the absence of an effect caused by other factors such as sex, blubber thickness, capture area and water temperature, we found that the driver of the vertical stratification of MUFAs was the mismatch between the individually varying FA composition of the inner blubber, regarded as the main incorporation site of dietary FAs, and the outer blubber FA composition, endogenously enriched in MUFAs. This highlights the importance of choosing sampling protocols in which the outer blubber layer is omitted from the analysis, and preferably only the innermost blubber, which carries the most recent dietary information, is included to gain valid information of the diets of the seals. To evaluate the pros and cons of the FA profiling in comparison to other available methods, we analysed the blubber of 108 grey seal individuals collected from the Finnish and Swedish coast of the Baltic sea, and compared dietary information obtained by blubber FA analysis to the information from gut content hard part or DNA analyses, and tissue stable isotope (SI) ratios. We found that in a large data set, PCA of blubber FA profiles did not manage to clearly detect any dietary groups, which was likely due to the large individual variation in the foraging habits of the seal individuals. In smaller scale, however, blubber FA profiles distinguished groups of individuals with accurately known collection site and which likely had used the same type of prey for a longer period of time. This information is valuable since these individuals likely cause the largest economical losses in the form of loss of catch and destroyed fishing gear, which in turn is the culprit to the risen seal-fishery conflict in the Baltic Sea. The population of the avian top predator of the Baltic Sea, i.e. the great cormorant (including two subspecies Phalacrocorax carbo sinensis and Phalacrocorax carbo carbo), has also grown and caused local conflicts with fisheries. In the absence of studies of chemical tissue markers of the great cormorants of the Baltic Sea area, we analysed the subcutaneous knee adipose tissue of 77 cormorant individuals and found that the adipose tissue FA composition of the studied birds differed both spatially and temporally. Thus, the FA profiling is even more sensitive to indicate dietary differences in sea birds than in pinnipeds, presumably due to the high metabolic rate and short turnover time of the adipose tissue lipids and FAs. In addition to the spatial differences observed, which were likely due to locally differing diets, we also observed high relative amounts of ocean FA marker 22:1n-11 in the adipose tissue of the cormorants collected in Sundsvall in June 2017, which likely had got their 22:1n-11 from hatchery-reared salmonids fed ocean fish flour and oils. Since levels of certain FAs or their ratios are characteristic of specific dietary sources and since dietary FAs are assimilated in predator tissues in a predictable way, FA profiling is a useful tool for dietary studies both on individual and population level. To describe the variability of prey sources at population level, we calculated the relative standard deviations (RSD, i.e. SD/Mean) for the FA variables (the mean value of which exceeded 0.2 mol%, and thus excluded methodological variation) in the adult cormorant and adult seal individuals. The FA variables with the highest RSD values were the most useful markers of individual dietary differences in the population. We propose that the RSDs for FA variables could be used to create an “opportunistic feeding index”, providing information on the variability of prey of the studied population. The works that this thesis is based on show, that standardized sampling protocols that take into account tissue metabolism significantly, increase the power of FA profiling in indicating individual diets of aquatic top predators, and allow creating indices to describe population level dietary opportunism. The improved dietary information can be applied for monitoring the diets of aquatic top predators and for ecosystem-based management. Östersjön har under de senaste årtiondena genomgått stora förändringar som orsakats av många faktorer såsom övergödning, toxinbelastning och klimatföränding. Även ekonomiskt betydelsefulla fiskbestånd har minskat på grund av överfiskeri. Till de största förändringarna i Östersjön under 2000-talet tillhör även en ökning i populationerna av gråsäl (Halichoerus grypus) och storskarv (Phalacrocorax sp.), vilka i dagens läge uppskattas ligga på en nivå av 30 000 individer respektive 160 000 häckande par. Båda arterna befinner sig högst i näringskedjan, och båda arternas föda utgörs huvudsakligen av fisk. Detta har skapat en konflikt mellan yrkesfiskare och dessa predatorer, och har således väckt ett behov av förlikningsåtgärder, vilka i sin tur åberopar noggrann information om dessa predatorers födovanor. Analysering av fettvävnadens fettsyrekomposition är en etablerad metod för att undersöka födovanor och näringskedjor emedan fettsyror överförs från bytet till predatorns vävnader i stort sett som omodifierade av ämnesomsättliga mekanismer. Oavsett att metoden redan är känd, behövs den optimeras för att även vara globalt tillämpbar och pålitlig i undersökningar av akvatiska näringsnätverk. En förutsättning för att kunna genomföra dylika undersökningar är en tillgänglighet till referensinformation om bytesurvalet och dess fettsyrekompositon i Östersjön. I detta avhandlingsarbete undersöktes vävnader av fiskar, gråsäl och storskarv från Östersjön. Vävnadernas fettsyrekomposition analyserades med gaskromatografi varefter flervariabelanalys tillämpades på data. Avhandlingsarbetet består av tre delforskningar. I den första delforskningen undersöktes späcklagret av 30 vuxna gråsälhannar för att kunna utveckla känsligheten av fettsyreanalys i dietforskning. Sälspäck har en fettsyrekomposition som förändras vertikalt från det yttersta lagret närmast huden, till det innersta lagret närmast musklerna. Således formar djupet från vilket det analyserade vävnadsprovet tas, en variabel som bör standardiseras för att metoden skall kunna tillämpas allmänt. Samtliga undersökta gråsälar visade sig ha rikligt med enkelomättade fettsyror (fettsyror med en dubbelbindning) i det yttersta lagret av späcket, och rikligt med fleromättade fettsyror (fettsyror med flera dubbelbindningar) i de djupare lagren av späcket. Förekomsten av enkelomättade fettsyror varierade vertikalt kraftigt, medan förekomsten fleromättade fettsyror är liknande genom hela späcklagret. Den vertikala förändringen i de enkelomättade var inte beroende av faktorer som späcktjocklek, vattentemperatur eller fångstområde, och var endast lätt beroende av ålder. Som återstående bakomliggande orsak för den vertikala förändringen en olikhet mellan den individuellt varierande fettsyrekompositionen i de djupare lagren och den mera stabila fettsyrekompositionen i det yttre lagret. Fettsyrekompositionen i de djupare lagren anses variera enligt fettsyrekompositionen i det intagna bytet, medan fettsyrekompositionen med den höga förekomsten enkelomättade fettsyror i det yttre lagret anses vara reglerat av faktorer oberoende av diet. Samtidigt utsätts det yttre lagret för stora temperaturförändringar, vilken ställer särskilda krav på vävnaden och dess kemiska egenskaper. Således, för att få pålitlig information om gråsälens födointag, vore det fördelaktigt att utelämna det yttre späcklagret från vävnadsanalysen, eftersom det inte påverkas av individens födovanor och bytets fettsyrekomposition. För att testa användbarheten av fettsyreanalys i undersökning av födoanvändning analyserades späcket av 108 gråsälsindivider från Östersjön i det andra delarbetet. Det konstaterades att metoden lämpar sig för att klargöra födovanorna på individuell nivå. Späcklagret fungerar hos gråsälen som ett långtidsenergiförråd, vilket medför att kemisk information om individens födovanor lagras från en längre tidsperiod (veckor-månader) i späcket. I det andra delarbetet kunde det påvisas, att beteendemönster såsom migration mellan svenska och finska kusten, kan observeras i fettsyrekompositionen av migrerade individers späck då man har jämförbar information om fettsyrekompositionen av bytesfiskar från olika områden av Östersjön till förfogande. Förövrigt är dylik information på individnivå nyttig vid identifiering av enskilda individer som orsakar fångstförlust och ekonomisk skada för yrkesfiskare. I det tredje delarbetet analyserades fettsyrekompositionen av underhudsfett hos 77 storskarvindivider från Östersjöområdet. Den ökade storskarvspopulationen består av individer tillhörande två underater (Phalacrocorax carbo sinensis och Phalacrocorax carbo carbo), och som följd av de uppkomna konflikterna mellan storskarv och yrkesfiskare, är behovet för ny information om dess födoanvändning i Östersjöns olika delar av stor betydelse. Det kunde på basis av vävnadsanalyserna konstateras att storskarvar utnyttjar olika bytesfiskar i olika delar av Östersjön under olika tidpunkter av säsongen. Metoden där man utnyttjar fettsyreanalys av fettvävnad visade sin användbarhet och känslighet då den lyckades utmärka enskilda individer som uppenbarligen använt sig av fiskyngel som nyligen frisläppts från en fiskuppfödning. I detta avhandlingsarbete fastställdes det att fettsyreanalys där standardiserade parametrar för provtagning av fettvävnad används, och där det finns tillgång till jämförelsedata av bytesfiskar, är en pålitlig metod i undersökning av predatorers bytesval i ett akvatiskt ekosystem.

Our health is protected by the immune system, which maintains a carefully regulated balance between inflammation and immune suppression. To mediate homeostasis and inflammation, leukocytes continuously patrol the body and therefore operate in a dynamic mechanical landscape. Mechanical information is transduced into the cell via different proteins, including adhesion receptors called β2-integrins. These receptors mediate essential leukocyte processes, including phagocytosis, immune cell trafficking, adhesion under shear flow conditions of the blood stream and immunological synapse formation between antigen presenting cells and T-cells. However, β2-integrins can also restrict inflammatory processes, such as macrophage Toll-like receptor signalling and cytokine expression, as well as dendritic cell maturation and migration. The precise signalling pathways involved in β2-integrin-mediated leukocyte regulation are not yet fully unravelled. β2-integrin activity is regulated via conformational changes. β2-integrin conformational changes are mediated by interactions with cytoplasmic proteins, such as talin, filamin A and kindlin-3. Talin, filamin A and kindlin-3 are sensitive to mechanical forces and respond by changing their conformation. However, the precise roles of these two proteins in regulating β2-integrin mediated immune processes, especially in response to force, have not yet been fully investigated. The aim of this doctoral thesis was to study molecular mechanisms involved in β2-integrin-mediated leukocyte mechanotransduction and immune responses. We investigated the role of filamin A in β2-integrin-mediated primary neutrophil and T-cell adhesive functions using conditional filamin A knockout mice. In neutrophils, filamin A restricts β2-integrin mediated cell spreading and static adhesion. Furthermore, filamin A was found to inhibit neutrophil oxidative burst, but it was required for proper formation of neutrophil extracellular traps. In T-cells, filamin A restricts F-actin content in cells spreading on integrin ligands. Interestingly, filamin A plays a different role in T-cell adhesion than in neutrophils, as it is required for optimal adhesion under shear flow conditions, and for the generation of integrin-mediated traction forces. Furthermore, filamin A is necessary for T-cell homing in vivo and for T-cell trafficking to sites of inflammation. Together the studies therefore revealed a dual role for the mechanosensitive integrin-binding protein filamin A in regulating leukocyte adhesive processes. In dendritic cells, β2-integrins have previously been shown to regulate gene expression, and to restrict cell maturation, migration and dendritic cell-mediated T-cell activation. Here, we used a β2-integrin TTT/AAA knock-in (KI) mouse model, where the β2-integrins/kindlin-3 interaction has been disrupted, which leads to expressed but dysfunctional integrins. The aim of these studies was to identify integrin-mediated signalling pathways regulating the mature dendritic cell phenotype. In our studies, we found that the mechanoresponsive MRTF-A/SRF pathway is downstream of β2-integrins in dendritic cells. Furthermore, this pathway regulates cytoskeletal gene expression, which governs the ability of dendritic cells to adhere and to generate traction forces, but not dendritic cell 3D migration. We subsequently identified novel mechanotransductional mechanisms involved in integrin-mediated dendritic cell programming and function. We discovered a β2-integrin/actin/lamin link in dendritic cells that regulates global histone methylation in these cells, as well as chromatin accessibility and gene expression. Interestingly, targeting this mechanical link leads to a similar mature dendritic cell phenotype as that caused by abolishing β2-integrin function, and can be used to induce better dendritic cell-mediated tumour rejection in vivo. Taken together, these studies outline several β2-integrin mediated leukocyte mechanotransduction pathways, which we demonstrate are relevant for immune system function in vivo. The results highlight the importance of considering and studying how mechanical forces and information impact immune system function. This is especially important in diseases such as cancer and during aging where the mechanical properties of tissues change over time. Vårt immunsystem består av immunceller som finns i kroppens olika vävnader. Immunsystemet övervakar kroppen och kontrollerar om främmande mikroorganismer tar sig in i kroppen, samt eliminerar dessa. Forskare har hittat många signaler från andra celler och mikroorganismer som reglerar våra immuncellers funktioner. Men vi vet för tillfället inte så mycket om hur vävnaderna där immuncellerna befinner sig, reglerar immuncellernas funktioner. Vår kropp består av många olika sorters vävnader, såsom hud, muskler, blodkärl och ben. Dessa vävnader skiljer sig i fråga om sina mekaniska egenskaper och därmed de mekaniska signaler de förmedlar till immuncellerna i vävnaderna. Till exempel är ben hårdare än muskler, och muskler är hårdare än fett. Blod som pumpas i blodkärlen förmedlar i sin tur en annan sorts mekanisk signal till immunceller, i form av flödeskrafter. Dessa typer av mekanisk information är mycket viktiga för immunceller, som rör sig genom olika vävnader vid en immunrespons. Vid en bakterieinfektion är immunceller som kallas neutrofiler viktiga i början för att kontrollera infektionen. Neutrofiler rekryteras in den infekterade vävnaden från blodet. Immunceller som kallas dendritceller bär information om invaderande patogener från infektionsstället till lymfknutorna. Det här aktiverar T celler i lymfknutorna. Denna process tar 1-2 veckor och under den här tiden är andra immunceller viktiga för att kontrollera infektionen. T celler rör sig sedan från lymfknutorna till infektionsstället via blodströmmen för att bekämpa de invaderande patogenerna. Neutrofiler och T celler tar sig ut från blodströmmen genom att ”ta tag i” proteiner som beklär blodkärlens väggar vid infektionsstället. Denna process kallas adhesion (vidhäftning) och cellerna fäster sig genom att använda sina egna ytproteiner som kallas integriner. Integrinerna sträcker sig från cellens insida till dess utsida. Detta möjliggör att integrinerna kan förmedla mekanisk information från cellens utsida till dess insida och möjliggör att cellen kan reagera på mekanisk information. Vi har nu studerat hur T cellernas och neutrofilernas mekaniska funktioner påverkas av ett protein som kallas Filamin A, som sammanlänkar integrinerna med andra strukturella komponenter inne i cellen. Vi testade hur T celler och neutrofiler som saknar Filamin A proteinet kan fästa sig vid integrinernas ligander (bindningspartners) både i flödesförhållanden och i statiska förhållanden. Dessa experiment visade att Filamin A dämpar neutrofilernas adhesion under statiska förhållanden, men att neutrofilerna behöver Filamin A för att effektivt döda bakterier. I kontrast till situationen i neutrofiler, så behöver T cellerna Filamin A för optimal adhesion i flödesförhållanden och därför också för att ta sig ut ur blodkärlen och in i vävnaderna hos möss. Eftersom dendritceller befinner sig i vävnader, rör de sig inte runt i kroppen via blodkärlen, utan de rör sig istället genom vävnader och lymfkärl. Vid en immunrespons ändrar dendritcellerna sitt beteende från att vara relativt stationära, adhesiva celler som upptar proteiner från sin omgivning, till ett migrationsbeteende, varvid de rör sig till lymfkuntorna dit de upptagna proteinerna transporteras. Man vet inte hur dendritcellerna kan växla mellan dess två typer av beteenden och vilka molekyler inne i cellerna som medverkar i denna process. Eftersom integriner släcks av och/eller minskar när denna förändring i beteende sker, släckte vi av integrinerna permanent i dendritceller och följde med hur cellerna förändrades när integrinerna inte längre fungerar. Vi fann att en signaleringsrutt i dendritcellerna, MRTFA/SRF rutten, stängdes av som ett resultat, och att denna rutt reglerar dendritcellernas förmåga till adhesion. Däremot reglerar denna rutt inte cellens kapacitet till migration. Istället fann vi att vi kan starta migrationsprogrammet i dendritceller genom att upplösa en mekanisk länk mellan integrinet och cellkärnan. När denna länk störs, leder det till att kromatinet öppnar sig, och till förändringar i gentranskription. När länken upplöstes, blev dendritcellerna bättre på att aktivera T celler. I slutändan ledde detta till att dendritcellerna blev bättre på att aktivera immunresponsen mot tumörer i möss. I våra studier har vi sett att proteinet Filamin A, som länkar samman integrinerna med cellens inre strukturer, är viktigt för många av immuncellernas mekaniska och immunologiska funktioner, i både T celler och neutrofiler. Vi har också visat, att när dendritceller fäster sig vid sin omgivning, aktiveras en integrin-beroende signaleringsrutt som förstärker dendritcellernas adhesiva beteendeprogram. När man istället upplöser en mekanisk länk mellan integrinet och cellkärnan, startar man cellens migrationsprogram. Denna mekanism kan man manipulera, vilket leder till bättre immunförmedlad tumöravstötning hos möss. Våra studier har därför lett till en ökad förståelse för hur mekanisk information överförs inne i immunceller, vilka proteiner, signaleringsrutter och molekylära mekanismer som medverkar i dessa processer, och vilka av immuncellernas funktioner regleras av dess mekanismer. Julkaistu painettuna: Helsinki: Painosalama, 2020. Dissertationes Scholae Doctoralis Ad Sanitatem Investigandam Universitatis Helsinkiensis, 2342-3161

Cellular compartment organization, signaling transduction, and regulatory processes are governed by protein-protein interactions (PPIs). The affinity purification coupled mass spectrometry (AP-MS) and proximity-labeling methods such as BioID have been wildly applied to understand protein interaction networks. AP-MS methods are suited to identify and quantify protein interaction and protein complex stoichiometries, while the BioID method provides information regarding transient or close-proximity interactions. Both AP-MS and BioID can identify distinct interactions, and complementary provides a more comprehensive view of a protein's interactome. In this study, we developed an integrated approach utilizing 'multiple approaches combined' (MAC)-tag that utilizes both AP-MS and BioID in a single construct to parallel explore the protein interactive. First, we systematically applied the MAC-tag approach to 18 bona fide localization markers to generate a molecular context database for every cellular compartment. Using this molecular context as the reference, alignment interaction profile of other proteins of interest (POIs) on it can reveal the subcellular localization of the POIs. We named this reference database, mass spectrometry (MS)-microscopy. Similarly, we applied the MAC-tag approach on three sub-organelle localization markers of mitochondria to set up a sub-organelle molecular context proteome map. Using this sub-organelle reference proteome map, we could detect sub-mitochondrial localization of POIs by MS-microscopy system. Furthermore, by comparing interaction data from several MAC-tagged mitochondrial proteins, we could define the unique interactors of GrpE-like proteins (GRPEL1 and GRPEL2) to investigate their specific roles in mammalian mitochondria. Next, we utilized the MAC-tag approach to map the interactome of the mammalian Hedgehog signaling. We monitored the dynamic PPI network surrounding the core components in the absence and presence of Hh ligand. Our comparative PPI analysis showed that the interaction network recapitulates many known ciliary proteins, asserting the essential role of primary cilia in Hh signaling. Meanwhile, we characterized the interaction network at the level of cilium progression by monitoring the PPIs under cilia absence, ciliogenesis, and cilia absorption conditions. The significant overlap of the interaction between three states indicated that proteins could regulate the Hh signaling outside the primary cilia. Additionally, we expanded the coverage of MS-microscopy to the primary cilium, a transient organelle of the cell. Although what we present is just a glimpse of the Hh interaction network under ligand stimulation or specific growth conditions, these PPIs will extend our knowledge on the mammalian Hh signaling and help us to development of novel therapeutic strategies to inhibit abnormal Hh signaling in cancer. Collectively, the presented thesis introduces the MAC-tag approach that can be used for mapping local protein interactome, predicting subcellular localization of POIs, and reconstructing the interaction network of the signaling pathway. Soluosastojen organisaatiota, signalointitransduktiota ja säätelyprosesseja säätelevät proteiini-proteiini-vuorovaikutukset (PPI). Affiniteettipuhdistukseen kytkettyä massaspektrometriaa (AP-MS) ja läheisyysmerkintämenetelmiä, kuten BioID, on käytetty villisti ymmärtämään proteiini-vuorovaikutusverkkoja. AP-MS-menetelmät soveltuvat proteiinien vuorovaikutuksen ja proteiinikompleksisten stoikiometrioiden tunnistamiseen ja kvantifiointiin, kun taas BioID-menetelmä tarjoaa tietoa ohimenevistä tai läheisistä vuorovaikutuksista. Sekä AP-MS että BioID voivat tunnistaa erilliset vuorovaikutukset, ja komplementaariset tarjoavat kattavamman kuvan proteiinin interaktomista. Tässä tutkimuksessa kehitimme integroidun lähestymistavan, jossa hyödynnetään ”MAC-tagia” (useita lähestymistapoja yhdistettynä), jossa hyödynnetään sekä AP-MS: tä että BioID: tä yhdessä rakenteessa tutkiakseen rinnakkain proteiini-interaktomia. Ensinnäkin sovelsimme systemaattisesti MAC-tag-lähestymistapaa 18 vilpittömässä mielessä tapahtuviin lokalisointimarkkereihin molekyylikontekstitietokannan generoimiseksi jokaiselle soluosastoon. Käytettäessä tätä molekyylikontekstia referenssinä, muiden kiinnostavien proteiinien (POI: t) kohdistusvuorovaikutusprofiili voi paljastaa POI: ien sub-sellulaarisen lokalisaation. Nimeimme tämän referenssitietokannan, massaspektrometria (MS) -mikroskopia. Samoin sovelimme MAC-tag-lähestymistapaa mitokondrioiden kolmeen alaorganellin lokalisaatiomarkkeriin sub-organelle-molekyylin kontekstiproteomikartan perustamiseksi. Tätä sub-organelle-referenssiproteomikarttaa käyttämällä voimme havaita POI-kohteiden sub-mitokondriaalisen sijainnin MS-mikroskopiajärjestelmällä. Lisäksi vertaamalla useiden MAC-leimattujen mitokondriaalisten proteiinien vuorovaikutustietoja voimme määritellä GrpE: n kaltaisten proteiinien (GRPEL1 ja GRPEL2) ainutlaatuiset interaktorit tutkia niiden spesifisiä tehtäviä nisäkkäiden mitokondrioissa. Seuraavaksi käytimme MAC-tag-lähestymistapaa nisäkkäiden Hedgehog-signaloinnin interaktomin kartoittamiseen. Tarkkailemme ydinkomponentteja ympäröivää dynaamista PPI-verkkoa Hh-ligandin puuttuessa ja läsnä ollessa. Vertaileva PPI-analyysimme osoitti, että vuorovaikutusverkko yhdistää uudelleen useita tunnettuja siriaariproteiineja ja vakuuttaa primaaristen silikoiden oleellisen roolin Hh-signaloinnissa. Sillä välin luonnehdimme vuorovaikutusverkkoa ciliumin etenemisen tasolla seuraamalla PPI: itä silikoiden poissa ollessa, siliogeneesissä ja silikoiden imeytymisolosuhteissa. Kolmen valtion välisen vuorovaikutuksen merkittävä päällekkäisyys osoitti, että proteiinit voisivat säädellä Hh-signalointia primaarisen silikan ulkopuolella. Lisäksi laajensimme MS-mikroskopian kattavuuden primaariseen ciliumiin, solun ohimenevään organelliin. Vaikka se, mitä esittelemme, on vain välähdys Hh-vuorovaikutusverkosta ligandistimulaation tai erityisten kasvuolosuhteiden aikana, nämä PPI: t laajentavat tietämystämme nisäkkäiden Hh-signaloinnista ja auttavat meitä kehittämään uusia terapeuttisia strategioita estämään epänormaalia Hh-signalointia syöpään. Esitetyssä tutkielmassa esitellään kollektiivisesti MAC-tag-lähestymistapa, jota voidaan käyttää paikallisen proteiinivuorovaikutuksen kartoittamiseen, POI: ien sub-sellulaarisen lokalisoinnin ennustamiseen ja signalointipolun vuorovaikutusverkon rekonstruointiin.

Lynch syndrome is the most prevalent cancer predisposition syndrome that causes significantly increased lifetime risk of cancer in multiple organs such as colorectum, endometrium and ovarium. The predisposition is caused by germline mutations in DNA mismatch repair (MRR) genes MLH1, MSH2, MSH6, and PMS2. Lynch-like syndrome colorectal tumors, like Lynch syndrome tumors, are MMR-deficient. Nevertheless, Lynch-like syndrome tumors do not bear germline mutations in MMR genes nor methylation of the promoter regions of MMR genes that would explain the deficiency. Instead, MMR deficiency in majority of Lynch-like syndrome tumors is caused by two somatic mutations in the MMR genes. Dysfunctional MMR protein complex enables accumulation of mutations in the genome (mutator phenotype) and, eventually, microsatellite instability and cancer. The reasons behind organ selectivity in MMR-deficient tumors are unknown, and whether breast cancer is part of the Lynch syndrome spectrum is under debate. The germline mutations in MMR genes are well studied, but molecular characteristics of Lynch syndrome tumors remain to be studied further. Lynch-like syndrome tumors remain less well characterized: besides the double somatic MMR mutations as a cause of MMR deficiency, their molecular and clinicopathological features as well as their incidence in the population remain poorly known. Currently, the only possibility to diagnose Lynch-like syndrome is by ruling out the possibility of germline mutations in MMR genes (Lynch syndrome) or methylation of the promoter regions of MMR genes. Synchronous ovarian and endometrial carcinomas are common in Lynch syndrome; whether they are of same origin (metastatic cancer) or two independently developed primary cancers remains to be resolved. We aimed to characterize the epigenetic and somatic mutation profiles in Lynch syndrome representing colorectal, ovarian, endometrial and breast carcinomas, and to identify new unique features that could be used in evaluating cancer risk, diagnosis and targeted treatment. We used targeted high-throughput sequencing of 578 known cancer genes to investigate the somatic mutation profiles, and methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification to study the epigenetic profiles of the tumors. Non-synonymous somatic mutations were detected from sequencing data of the paired tumor and normal tissues to determine mutation signatures and identify potential driver genes. The data was also compared statistically between tumors of different origin, epigenetic status, and between breast carcinomas from Lynch syndrome mutation carriers and their known non-carrier family members. We observed that Lynch- and Lynch-like syndrome tumors have unique somatic mutation and methylation profiles. We were able to link the methylator phenotype to high somatic mutation rates, and Lynch-like colorectal tumors to hypermethylated CpG island methylator phenotype (CIMP), which are novel findings. Our discovery of high mutation burden in genes associated with epigenetic regulation provides a new link between genetic and epigenetic factors in tumorigenesis. Genetic and epigenetic characterization of synchronous ovarian and endometrial carcinomas indicated shared origin, in analogy to sporadic cases. Molecular characteristics and especially mutational signatures of breast tumors of Lynch syndrome mutation carriers indicated that breast carcinoma is likely to be part of the Lynch syndrome tumor spectrum. These findings bear potential clinical relevance since the molecular tumor profiles may be used in diagnosis and may guide tailored management of the patients. Many of the mutated genes are part of signaling routes to which targeted molecules either exist or can be developed. Lynchin syndrooma on yleisin syövälle altistava perinnöllinen syndrooma, joka lisää muun muassa suolisto-, kohtu- ja munasarjasyövän riskiä. Alttiuden aiheuttavat perinnölliset mutaatiot DNA:n emäspariutumisvirheitä korjaavissa (engl. DNA mismatch repair, MMR) geeneissä MLH1, MSH2, MSH6, and PMS2. MMR-proteiineista koostuvan koneiston puutteellinen toiminta johtaa mutaatioiden kertymiseen genomiin ja lopulta mikrosatelliitti-epätasapainoon ja syövän syntyyn. Lynchin kaltaisen (engl. Lynch-like) syndrooman suolistokasvainten MMR-proteiinien puutos ei selity ituratamutaatioilla tai MMR-geenien promoottorialueiden hypermetylaatiolla. Tiedetään, että valtaosassa tapauksista Lynch-like -kasvainten MMR-geenien normaali toiminta on hiljentynyt kahden somaattisen eli hankitun mutaation seurauksena. Kudosspesifisyyden syitä syövissä, joissa MMR-koneiston toiminta on puutteellista, ei vielä tunneta. Rintasyövän kuulumisesta Lynchin syndrooman syöpäspektriin on ristiriitaisia tutkimustuloksia, ja synkronisten munasarja- ja kohdunrungonsyövän alkuperästä (metastasoitunut kasvain vai itsenäisesti kehittyneet primaarikasvaimet) ei löydy julkaistua tutkimustietoa. MMR-geenien perinnölliset mutaatiot tunnetaan jo melko hyvin, mutta Lynchin syndrooman kasvainten muista molekulaarisista ominaisuuksista tarvitaan vielä lisää tutkimustietoa. Lynch-like -kasvaimista on niukemmin tutkimustietoa: kahden somaattisen MMR-mutaation lisäksi niiden molekulaarisista ja kliinispatologisista ominaisuuksista sekä kyseisen tautimuodon esiintyvyydestä populaatiotasolla tiedetään hyvin vähän. Toistaiseksi Lynch-like -syndrooma on mahdollista diagnosoida vain poissulkemalla Lynchin syndrooma ja MMR-geenien hypermetylaatio. Tavoitteenamme oli kartoittaa Lynchin ja Lynch-like -syndroomaan kuuluvien suolisto-, munasarja-, kohdunrungon ja rintasyöpien somaattisia ja epigeneettisiä muutoksia. Näiden piirteiden tunnistaminen eri syöpätyypeissä mahdollistaisi syövän riskin arvioinnin, tarkemman diagnosoinnin sekä kohdennetun hoidon kehittämisen. Tutkimme somaattisia mutaatioita sekvensoimalla kasvainten DNA:ta paneelilla, joka kattaa 578 tunnettua syöpägeeniä, sekä niiden metylaatioprofiilia ns. MS-MLPA (eng. methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification) -tekniikan avulla. Tunnistimme ei-synonyymiset mutaatiot parittaisesta kasvain- ja normaalikudosten sekvenssidatasta määrittääksemme mutaatioprofiilit sekä syövänkehityksen ajurigeenit (engl. driver genes). Tilastolliset vertailut tehtiin eri kudosten ja metylaatiostatusten kesken. Lisäksi Lynchin syndrooman mutaationkantajilta peräisin olevia rintasyöpiä verrattiin rintasyöpiin sukulaisilta, jotka eivät olleet perineet sukunsa alttiusmutaatiota. Havaitsimme, että Lynchin ja Lynch-like syndroomien syövillä on niille luonteenomaiset epigeneettiset ja somaattiset mutaatioprofiilit. Uusina löydöksinä osoitimme yhteyden yleistyneen hypermetylaatio- ja mutaatiotaipumuksen välillä, sekä yhteyden Lynch-like -kasvainten ja hypermetyloituneen fenotyypin välillä. Epigeneettiseen säätelyyn osallistuvien geenien sekä DNA:n korjausgeenien lisääntynyt mutaatioherkkyys liittää geneettiset ja epigeneettiset tekijät uudella tavalla toisiinsa syövänkehityksessä. Se, että synkroniset munasarjan ja kohdunrungon kasvaimet olivat geneettisesti ja epigeneettisesti yhteneväisiä, osoittaa, että kasvaimet ovat samaa alkuperää, eli edustavat metastasoitunutta kasvainta, kuten vastaavissa sporadisissa syövissä on aiemmin osoitettu. Lynchin syndrooman kantajien ja ei-kantajien rintasyöpien molekulaariset tutkimukset ja erityisesti mutaatioprofiilit toivat viitteitä siitä, että rintasyöpä kuuluu Lynchin syndrooman kasvainspektriin. Tutkimus tuo tärkeää uutta tietoa Lynchin ja Lynch-like syndrooman syöpien syntymekanismeista sekä ominaispiirteistä, joita on mahdollista hyödyntää syövän diagnosoinnissa sekä kohdennettua hoitoa suunniteltaessa. Monet mutatoituneista geeneistä kuuluvat säätelyreitteihin, joihin on joko olemassa tai kehitettävissä kohdennettuja lääkemolekyylejä.

The basic unit of all life forms is a cell, and all multicellular organisms are the result of programmed cell divisions of a single fertilised oocyte. This intricately controlled process, where a cell duplicates its DNA, grows and divides into two daughter cells, is called the cell cycle. Maintaining the appropriate control of the cycle is critical for the homeostasis of an organism. When the control fails, it may result in uncontrolled cell proliferation, one of the hallmarks of cancer. Cell cycle can be promoted or inhibited by signalling pathways induced by intra- or extracellular cues. Signals such as growth factors and hormones can bind cell surface or nuclear receptors causing signalling events and/or gene transcription resulting in positive or negative cell cycle regulation. External environment such as nutrient availability, or changes in energy metabolism can also signal to the cell cycle machinery, preventing cell division under high energy expenditure or external stress conditions. Central proteins in cell cycle regulation are the Cyclin-dependent-kinases, CDKs, and their cyclin partners. They phosphorylate other proteins causing changes in their activity or abundance, eventually leading to events required for cell duplication, such as DNA synthesis and chromosome segregation. CDK activity is in turn regulated by phosphorylation and cyclin abundance as well as the presence and binding of CDK-inhibitor proteins such as p27Kip1. P27Kip1 belongs to the Ink4-family of inhibitors, and can also function as an assembly factor for some CDK-cyclin complexes. We identified a form of p27Kip1, which was not bound to CDKs (p27NCDK) but was increased under growth restricting conditions such as TGF-β growth inhibition or serum starvation. On the other hand, inhibition of growth promoting pathways such as the PI3K-pathway was also found to increase the levels of p27NCDK. We also discovered that cellular stress induces the levels of p27NCDK, and appears to do so mainly via the AMP-activated protein kinase AMPK. AMPK is a kinase that is activated under energy stress conditions, like strenuous exercise. In this work we also investigated the crosstalk of these pathways and found points of convergence including p27NCDK and TGF-β pathway protein Ski. Ski negatively regulates TGF-β signalling pathway by binding the TGF-β signalling molecules. Ski is rapidly degraded upon TGF-β stimulation thereby allowing the signal to pass. We discovered that the PI3K-pathway intersects with TGF-β pathway as the PI3K-pathway kinase Akt phosphorylates Ski, thereby destabilising it. Destabilisation of Ski leads to an induction of a TGF-β target gene Smad7. Given that Smad7 is another negative regulator of TGF-β signalling, several genes such as the CDK-inhibitor p15 are downregulated. Concomitant activation of Akt and TGF-β therefore reduced induction of p15 and relaxed cell cycle controls. In addition the effects of external stress on cell cycle were investigated in a human prostate epithelial cells. Surprisingly, these cells did not undergo cell cycle arrest in response to ionising radiation. These cells were noted to have low or undetectable levels of Wee1 kinase, which normally exerts an inhibitory phosphorylation on CDK2 and CDK1 in response to external stress. Due to lack of inhibition, CDK2 activity remained high even after high doses of radiation. In this work we identified different points of cross talk between cell cycle promoting and inhibiting signalling pathways. These findings have significance in cancer and cancer treatment, which is often based on inhibiting the hyper activation of cell cycle promoting pathways by using hormones, radiation or small molecule compounds. Solu on elollisten olioiden perusyksikkö, ja solujen jakautuminen ja uudistuminen eliöiden ja lisääntymisen perusta. Prosessia, jossa solu monistaa itsensä muodostaen kaksi tytärsolua, kutsutaan solusykliksi, ja sen säätely on yksi organismin homeostaasin eli tasapainotilan kulmakiviä. Säätelyn pettäessä seurauksena voi olla hallitsematon solujakautuminen, mikä on syövän keskeisiä tunnusmerkkejä. Solusykliä edistävät CDK-proteiinit, jotka yhdessä sykliini-partneriensa kanssa aktivoivat syklin keskeisiä proteiineja. CDK-sykliinikompleksien aktiivisuutta hillitsevät CDK-inhibiittoriproteiinit, mukaan lukien p27Kip1. Solusyklin säätely on tärkeää myös ympäristöön sopeutumisen kannalta. Useimmat elimistön solut ovat lepotilassa, mutta käynnistävät solusyklin ulkoisen viestin kuten hormoni- tai kasvutekijäsignaalin saapuessa. Sitoutuessaan solussa oleviin reseptoreihin, nämä molekyylit aktivoivat solusykliä sääteleviä signalointireittejä. Kasvua haittaavat olosuhteet, esimerkiksi energiavaje tai ulkoinen stressi, puolestaan hidastavat tai estävät solujakautumista. Tässä väitöskirjassa on tutkittu mm. TGF-β, PI3K-, ja AMPK–solusignalointireittien vaikutusta solusykliin. Tutkimuksessa keskityttiin CDK-inhibiittoriproteiini p27Kip1:n muotoon, jonka havaittiin lisääntyvän erilaisten kasvua hidastavien ja solustressiä aiheuttavien signaaleiden kuten TGF-β:n ja AMPK:n aktivaation seurauksena. Kasvua edistävien, kuten PI3-kinaasireitin, vaikutuksen havaittiin olevan päinvastainen. PI3-kinaasireitin todettiin myös risteävän TGF-β -reitin kanssa Ski-proteiinin fosforylaation kautta. Lisäksi selvitettiin ulkoisen stressin vaikutusta solusykliin, jossa mallina käytettiin eturauhasen pintaepiteelisoluja. Käytetty eturauhasmalli osoitti, että solutyypissä ei ionisoivan säteilyn jälkeen tavata useissa muissa solutyypeissä kuvattua solusykliarestia. Soluissa todettiin matalat Wee1-kinaasin tasot, mikä mahdollisti CDK-proteiniin aktiivisuuden myös DNA-vauriovasteen jälkeen ja mahdollisti solusyklin myös tässä tilanteessa. Työssä tunnistettiin erilaisia risteämiskohtia solujakautumista edistävien ja estävien signaalireittien välillä. Näillä löydöillä voi olla merkitystä myös syövässä ja sen hoidossa, kun jakautumista edistävien reittien yliaktiivisuutta pyritään hillitsemään esimerkiksi hormonien, säteilyn tai pienimolekyylisten yhdisteiden avulla.

Neurologic and neuropsychiatric conditions are a major welfare issue, affecting millions of people worldwide. Neurologic diseases and behavioural problems are also diagnosed in dogs. These disorders are known to have a strong genetic component, but the largely complex genetic background behind brain disorders such as epilepsy and anxiety remains elusive. In this thesis work the genetic background of a novel epilepsy syndrome and three anxiety- related phenotypes were studied in dogs. The studies provided a causative variant for the canine epilepsy in a novel epilepsy gene and identified three loci for canine fear and anxiety, revealing parallels to the genetic background of human neuropsychiatric disorders. A novel epilepsy characterised by myoclonic seizures and a juvenile age of onset was described in Rhodesian Ridgeback dogs. Genetic analyses revealed a four base pair deletion mutation in a DIRAS1 gene, which encodes a poorly characterized neuronal GTPase protein with a suggested role in cholinergic neurotransmission. DIRAS1 is a novel candidate gene for human myoclonic epilepsies and the genetic test developed based on the results is now actively used in veterinary diagnostics and dog breeding. Anxiety and fearfulness were studied in two breeds, German Shepherds and Great Danes, using a behavioural survey and behavioural testing. Genome-wide association analyses of a cohort of over 300 fearful and non- fearful German Shepherd dogs with behavioural scores for noise sensitivity and fear revealed a noise sensitivity locus on chromosome 20 and fear locus on chromosome 7. The noise sensitivity locus included several relevant candidate genes, such as the oxytocin receptor gene OXTR that has been linked to anxiety and social behaviour in humans and dogs, and the glutamate receptor gene GRM7, that has been linked both to anxiety and age-related hearing. The fear locus was largely syntenic to a human locus 18p11.2 that has been linked to human schizophrenia and bipolar disorder, suggesting shared genetic factors behind canine fearfulness and human psychiatric disorders. A similar approach in Great Danes studying fear towards strangers, with the level of socialisation as a cofactor, revealed a novel locus on chromosome 11 including candidate genes such as a mitogen-activated protein-coding gene MAPK9, that has been linked to anxiety and behaviour. In summary, this study has described a novel epilepsy in dogs and revealed new candidate genes and loci for canine epilepsy and anxiety. The results bring new insight into the molecular background of canine brain disorders, establish a novel large animal model of human psychiatric conditions and provide new diagnostic tools for veterinary medicine and canine breeding programs. Neurologiset ja neuropsykiatriset sairaudet ovat yleisiä ja koskettavat miljoonia ihmisiä maailmanlaajuisesti. Neurologisia sairauksia sekä käytöshäiriöitä tavataan ja diagnosoidaan myös muissa lajeissa, kuten koirissa. Nämä sairaudet ovat usein monimutkaisesti periytyviä, mikä on haastanut esimerkiksi epilepsian ja ahdistuneisuushäiriöiden geneettisen taustan tutkimista. Tässä väitöskirjatyössä perehdyttiin koirilla ennestään tuntemattoman epilepsian sekä kolmen pelkoon ja ahdistuneisuuteen liittyvän käyttäytymispiirteen tai häiriön geneettisen taustan selvittämiseen. Tutkimuksessa tunnistettiin kokonaan uusi epilepsiageeni ja sairauden aiheuttava mutaatio. Lisäksi työssä paikannettiin kolme ahdistuneisuuteen ja pelkoon liittyvää geneettistä aluetta eli lokusta, jotka paljastivat yhteneväisyyksiä koirien ja ihmisten ahdistuneisuuden ja pelon sekä ihmisten neuropsykiatristen sairauksien välillä. Rhodesiankoira-rodussa havaittiin esiintyvän aiemmin tuntematonta epilepsiaa, jonka tyypillisiin oireisiin kuuluivat nuorilla koirilla puhkeavat myokloniset eli lihasnykäykselliset epilepsiakohtaukset. Geneettiset tutkimukset paljastivat neljän emäsparin pituisen deleetion eli häviämän huonosti tunnettua GTPaasi-proteiinia koodaavassa DIRAS1-geenissä, jonka oli havaittu liittyvän esimerkiksi hermonvälittäjäaine asetyylikoliinin toimintaan. DIRAS1 on aiemmin tuntematon kandidaattigeeni myös ihmisten epilepsioille. Löydön avulla koiria varten voitiin kehittää geenitesti, jota käytetään sairauden diagnosoimisessa sekä apuna jalostuksessa. Ahdistuneisuuden ja pelon geneettistä taustaa tutkittiin kahdessa rodussa, saksanpaimenkoirissa sekä tanskandogeissa kyselytutkimuksen ja käyttäytymistestien avulla. Genominlaajuiset assosiaatiotutkimukset liittivät saksanpaimenkoirien ääniarkuuden ja pelokkuuden kromosomeihin 20 ja 7. Ääniarkuus-lokus sisälsi useita ahdistuneisuuteen sekä kuuloaistiin aiemmin liitettyjä geenejä, kuten oksitosiinireseptoria koodaava OXTR ja glutamaattireseptoria koodaava GRM7. Pelokkuuteen liitetty lokus taas on lähes kokonaan synteninen ihmisen 18p11.2-lokuksen kanssa, joka on useissa tutkimuksissa liitetty ihmisten skitsofreniaan ja kaksisuuntaiseen mielialahäiriöön. Löytö viittaa siihen, että koirien pelon ja ihmisten psykiatristen sairauksien taustalla on yhteisiä geneettisiä tekijöitä. Vastaava lähestymistapa liitti tanskandoggien ihmisarkuuden kromosomiin 11, joka sisälsi esimerkiksi ahdistuneisuuteen liitetyn map-kinaasia koodaavan ehdokasgeenin MAPK9. Tässä väitöskirjatutkimuksessa kuvailtiin aiemmin tuntematon epilepsia koirissa, tunnistettiin uusi epilepsiageeni ja löydettiin kolme uutta pelkoon liittyvää geenialuetta. Tulokset voivat jatkossa auttaa ymmärtämään paremmin kyseisten aivosairauksien taustaa ja hoitoa läpi lajien.

Rational approaches to the traditional drug discovery process rely on high-throughput and lowthroughput bioactivity or phenotypic screening studies. Such profiling strategies have been the foremost step utilized when identifying or curating lead molecules, and more recently, when evaluating compound repositioning/repurposing opportunities. Although promising, such systematic approaches are inherently limited by their cost and labor constraints, and the necessity of specific screening equipment’s renders them outside the scope of many academic laboratories. Further, elucidation of any novel associations through such experimental techniques require exhaustive searches of compound libraries. Hence, many positive drug indications revealed, though rational, are often by the virtue of serendipity. The accumulation and standardization of existing compound profiling datasets has paved the way to the field of chemoinformatics. Wherein, data-driven computational approaches are employed as a pragmatic solution to challenge the inherent notion of serendipity in screening studies. Such in silico models serve as an efficient and cost-effective augmentation to the experimental screening approaches, circumventing the intrinsic limitations of current drug discovery methods. This study therefore was motivated towards identifying niches and limitations prevalent in the current pharmacological paradigm, where an effective computational framework could be utilized to complement and expedite the conventional drug discovery process. The various computational approaches proposed in this article-based thesis include exploratory web-tools, new data resources, and prediction models, that are introduced as supplements to extend the current computer-aided drug discovery process (CADD). Firstly, I developed a web-application, termed C-SPADE, a novel compound-centric chemoinformatic tool that facilitates interactive analysis and visualization of compound screening experiments using Compound-SPecific bioActivity DEndrograms. The tool employs compound-compound similarity metrics to estimate the diversity amidst compounds profiled in the screening panel and intuitively represents the chemical similarity space and the observed bioactivity values. The web-tool provides users an exploratory framework to perform pharmacological analysis and investigate novel compound associations employing diverse compound similarity clusters. Secondly, to address the heterogeneous and non-standardized bioactivity data in existing data resources, a comprehensive open-data platform, called Drug Target Commons (DTC), was developed. DTC feature tools for data annotation, standardization, curation to address intra-resource heterogeneity and provide users a one-stop resource for drug discovery and in silico model development endeavours. User-specific applications of both the above-mentioned resources have been demonstrated through several case studies and experimental validations. In addition to the tools and databases, I have also designed and implemented diverse machine learning models primarily to predict potent compound-kinase interactions and to fill the current experimental gaps in large-scale activity profiling studies. Firstly, through collaborative efforts, we employed the Kronecker kernel-based regularized least square regression (KronRLS) algorithm under different crossvalidation settings to predict both the uncharacterised binding measures in large-scale profiling studies and novel compound-target associations. As a case study, the off-target profile of an investigational VEGF receptor inhibitor tivozanib was predicted and experimentally validated. Secondly, I designed and implemented an efficient statistical model utilizing an ensemble SVM classifier to prioritize potent compound-kinase association for biochemical testing. The developed computational framework was termed Virtual Kinome Profiler (VKP) and was efficiently used in compound repositioning and lead identification studies, wherein 19 novel kinase-compound interactions spanning across different kinases were predicted and experimentally validated. Apart from elucidating the chemogenomic similarities prevalent among distinct kinase proteins, VKP with a positive prediction value (PPV) of 84% was shown to reduce the time and cost constraints related to traditional experimental screening process. Most of the computational frameworks proposed in this thesis are designed and deployed with an accompanying web-based graphic user interface (GUI). This in turn aids in the translatability of the platforms, overcoming the current prerequisites required when utilizing CADD models, including prior expertise in data analysis and scripting languages. These studies together exemplify new applications of computational models in diverse areas of the drug discovery process, subsequently making invaluable augmentations to a chemical biologist’s toolbox.

The Arabidopsis root meristem consists of concentrically arranged tissues that surround the central vasculature. While the outer cell layers, the epidermis and ground tissue (GT), contribute to the radial symmetry of the entire root, the internal vasculature displays bilateral symmetry. These spatial patterns are established by the activity of stem cells located at defined positions within the stem cell niche. Daughter cells undergo cell expansion and differentiation to form shootward files along the longitudinal axis of the root. In the first part of this thesis, I describe GT specification and maturation. GT comprises the endodermis and cortex, and their lineages bifurcate following the asymmetric cell division (ACD) of the cortex-endodermis initial. The ACD requires the function of SHORT-ROOT (SHR) and its downstream regulator SCARECROW (SCR), which both belong to the GRAS transcription factor (TF) family. GA in the endodermis modulates the timing of GT maturation by promoting a second periclinal cell division which gives rise to an additional cortical layer between the endodermis and cortex. This additional cortex layer is named the middle cortex, and this process also requires SHR/SCR activity. Here, we have genetically and molecularly demonstrated that another GRAS member, SCARECROW-LIKE 3 (SCL3), is a direct downstream target of SHR/SCR, and its expression is also under the direct control of REPRESSOR OF ga1-3 (RGA), one of the DELLA proteins that are Gibberellin (GA) signaling inhibitors. SCL3 is expressed exclusively in the endodermis, where it integrates the SHR/SCR-mediated developmental signal and the GA-mediated hormonal signal to fine-tune the timing of middle cortex formation. The second part of my thesis investigates phloem sieve element (SE) development. SEs form a conductive tissue in the phloem that mediates the long-distance transport of sucrose. In Arabidopsis roots, protophloem SEs (PSE) comprise 20-25 cells from the stem cell to the enucleating cell. This cell file can serve as a model system to study tissue morphogenesis at single-cell resolution. Using confocal time lapse imaging technology, we monitored single-cell behaviors along the PSE lineage and defined five discernible stages: quiescent (stem cell), active division (transit amplifying cells), transition, differentiation and nuclear degradation (enucleation). We then focused on PSE differentiation, which involves dynamic cellular rearrangement ending with enucleation. We discovered a regulatory cascade in which ALTERED PHLOEM DEVELOPMENT (APL) and two closely related NAC-domain containing TFs – NAC45 and NAC86 – play major roles. We also identified NAC45/86-DEPENDENT EXONUCLEASE-DOMAIN PROTEINs (NENs) that is involved in nuclear degradation downstream of the APL-NAC pathway. In order to comprehensively understand PSE development, we carried out phloem-specific transcriptome profiling by performing fluorescence activated cell sorting of various phloem reporter lines followed by RNA-seq. By analyzing the transcriptome data, we identified 925 phloem-abundant genes. We focused on a cluster of genes which initiate their expression early in the protophloem sieve element (PSE) lineage. Interestingly, this cluster includes six DOF transcription factor family members. Knocking out all six genes resulted in a very narrow vasculature and impaired phloem transport, indicating that these DOFs are required for phloem differentiation as well as specification. We also determined that these DOFs promote PSE differentiation by directly activating the APL pathway. As part of the root meristem, the PSE must differentiate in coordination with the surrounding tissues. In fact, defects in vascular tissue development often lead to systemic growth inhibition and even seedling lethality in extreme cases. In the final part of this thesis, I demonstrate that the global root meristem regulator PLETHORA (PLT) overrides DOF function in the early stages of phloem development by suppressing the expression of APL, thereby preventing premature PSE differentiation. Lituruohon (Arabidopsis) juurenkärjen kasvuvyöhyke koostuu samankeskisesti järjestäytyneistä solukerroksista, jotka ympäröivät johtosolukon sisältävää keskuslieriötä. Pääjuuren pinnassa oleva solukerros sekä sen alainen kuorisolukko ovat säteittäin symmetriset, kun taas keskuslieriö on peilikuvamaisesti eli bilateraalisesti symmetrinen. Nämä kolmiulotteiset rakenteet muodostuvat juuren kärkikasvusolukossa sijaitsevien kantasolujen jakaantumisen, laajenemisen ja erilaistumisen seurauksena. Väitöstyöni ensimmäisessä osassa tutkin lituruohon kuorisolukon syntyä ja kehitystä. Varhaisessa vaiheessa kuorisolukko muodostuu kahdesta solukerroksesta, ulompi ns. cortex ja sisempi endodermi, joiden kehitys haarautuu yhteisen kantasolun epäsymmetrisen jakautumisen jälkeen. Kyseiseen solunjakautumiseen tarvitaan GRAS geeniperheeseen kuuluvat transkriptiotekijät SHORT-ROOT (SHR) ja SCARECROW (SCR). Myöhemmin SHR/SCR, yhdessä endodermistä käsin vaikuttavan kasvihormoni gibberelliinin kanssa, on keskeinen tekijä toisen, pinnansuuntaisen solunjakautumisen ajoittumisessa cortexin ja endodermin välille. Tämän solunjakautumisen myötä muodostuvaa keskimmäistä kuorisolukon kerrosta kutsutaan nimellä middle cortex. Väitöstyöni osoitti että GRAS geeniperheeseen kuuluva SCARECROW-LIKE 3 (SCL3) on myös tärkeä middle cortex solukerroksen oikea-aikaisessa muodostumisessa, kanavoiden suoraan sekä yllämainittuja transkriptiotekijöitä että hormonaalista säätelyä. Todistimme geneettisin ja molekyylibiologisin menetelmin että SCL3 aktivoituu endodermissä sekä SHR/SCR että gibberelliinin signaalivälitystä estävän proteiinin REPRESSOR OF GA1-3 (RGA) suoranaisesta vaikutuksesta. Väitöstyöni toinen osio käsittelee nilan siiviläputkien kehitystä, jota tarvitaan sokerien pitkänmatkan kuljettamiseen kasvissa. Siiviläputkien esiasteet, ns. protonila siiviläelementit (PSE) muodostavat lituruohon juurenkärjessä morfologisesti määritettynä 20-25 solun mittaisen jonon, laskien kärjimmäisenä sijaitsevasta kantasolusta aina siihen soluun jonka tuma hajoaa erilaistumisprosessin edistyessä. Olemme tutkineet siiviläputkien esiasteita yksittäisen solun tarkkuudella, kuvaten solujonoja konfokaalimikroskoopin avulla elävissä kasveissa ajan funktiona. Määritimme viisi kehitysvaihetta jotka edeltävät toiminnallisen siiviläputken muodostumista: harvoin jakautuva kantasolu, pinnanvastaiseen suuntaan jakautuvat solut, siirtymävaihe, erilaistuminen jolloin soluelimet uudelleenjärjestyvät, ja lopulta tuman hajoaminen. Löysimme myös erilaistumisvaiheelle tärkeän säätelyreitin, joka perustuu ALTERED PHLOEM DEVELOPMENT (APL) sekä kahden muun NAC transkriptiotekijän, NAC45 ja NAC86, toimintaan. Lisäksi tunnistimme ryhmän proteiineja (NAC45/86-DEPENDENT EXONUCLEASE-DOMAIN PROTEIN, NEN), jotka ovat osallisena siiviläputken erilaistumisvaiheen huipentamassa tuman hajoamisessa. Seuraavaksi hyödynsimme lajittelevaa virtaussytometriaa, jonka avulla erottelimme fluoresoivalla leimalla merkityt, tietyissä PSE kehitysvaiheissa ilmenevät solut toisistaan, ja analysoimme laajamittaisesti geenien ilmenemistä kyseisissä soluissa. Määritimme 925 geeniä jotka ilmenivät erityisesti nilassa. Keskityimme erittäin varhaisessa kehitysvaiheessa ilmeneviin geeneihin, joiden joukosta poimimme kuudesta DOF transkriptiotekijästä koostuvan ryhmän. Kaikkien kuuden DOF geenin toiminnan estäminen kasvissa yhtäaikaisesti johti johtosolukon huomattavaan kapenemiseen ja nilan toiminnan heikentymiseen, mistä päätellen kyseiset geenit ovat välttämättömiä nilan erilaistumisen ja synnyn kannalta. Havaitsimme myös että nämä DOF transkriptiotekijät edesauttavat siiviläputkien esiasteiden erilaistumista suoraan aktivoimalla APL säätelyreittiä. Juurenkärjen kasvuvyöhykkeen keskeisenä osana nilan siiviläputkien erilaistumisen on tapahduttava koordinoidusti ulompien solukerrosta kanssa. Häiriöt johtosolukon kehittymisessä aiheuttavat usein laajamittaisen kasvun estymisen ja jopa kasvin kuoleman. Väitöstyöni viimeisessä osassa havainnollistan, että kasvuvyöhykkeessä kauttaaltaan vaikuttava, entuudestaan tunnettu transkriptiotekijä PLETHORA (PLT) syrjäyttää DOF toiminnan vaimentamalla APL geenin ilmenemistä, ja siten estää siiviläputkien ennenaikaista erilaistumista juuren kärjessä.

Cornea is the outermost surface of the eye that refracts light to the lens and protects the sensitive ocular machinery. The cornea is divided to three cellular compartments; epithelium, stroma and endothelium. Our work focuses on the corneal epithelium, which is located closest to the tear film and, together with the film, forms a physiological barrier to pathogens and small particles from the environment. We followed the maturation of the mouse corneal epithelium from birth to adulthood and discovered a novel marker, Krt19, in this process. Krt19 expression gradually restricted from the central cornea to the limbus, concomitantly with eyelid opening and epithelial stratification, which are the hallmarks of postnatal maturation of the murine cornea. Corneal epithelium is renewed continuously throughout life by stem cells. Previous studies demonstrated that the limbus, located in the periphery of the cornea, houses the corneal stem cells. Immediate progeny of the stem cells, the progenitor cells, localize to the limbus, peripheral, and central cornea. We identified the gene Bmi1 in the corneal, epithelial progenitor cells. By lineage tracing of the Bmi1+ cells, we followed renewal dynamics in the central cornea and estimated the turnover of the epithelium to be 2-8 weeks in adult mice. However, we noticed a decrease in renewal rate with older animals. This is in line with evidence from renewal studies of the limbal stem cells, suggesting a general decrease of corneal epithelial renewal upon aging. We optimized a method to perform in vivo epithelial abrasion injury on mouse cornea. The development of this assay was instrumental for the experiments that followed. Using the abrasion model, we showed that the Bmi1+, central, corneal progenitor cells do not contribute to wound healing. Instead, the wound closed by rearrangement and migration of the remaining epithelial cells. We extended our analysis of the corneal barrier to encompass an accessory organ of the eye, the lacrimal gland (LG, tear gland). LG produces and secretes the aqueous part of the tear film, which is the largest portion of the film. The tear film provides another layer of protection to the ocular surface, because it contains anti-inflammatory and antimicrobial components as well as assists eyelid movements. We studied the role of Ectodysplasin-A (Eda) gene in the LG. Eda is critical in the development of ectodermal appendages, however LG development was not affected by the loss-of-function mutation in Eda. Instead, lack of EDA resulted in modulation of LG secretion and the development of a dry eye disease (DED). Furthermore, we discovered that Eda signalling activity was inhibited in response to corneal injury and suggest that this is necessary for the production of reflex tears that are released in ocular insult. In this assay, we shed light on the cooperation between cornea and the LG in homeostasis and injury. Our work is part of the research that aims to understand maturation and homeostatic maintenance of the anterior segment of the eye, cornea and the LG. This work provides new information regarding the development of Eda-linked DED. This is of importance, because the DED affects a large part of the population. Furthermore, we call for further studies on the mechanisms of how these two tissues communicate, as they are intricately linked and dependent of each other. Silmän pintaa peittää sarveiskalvo, joka sekä taittaa silmään tulevaa valoa, että toimii suojana silmän herkälle näköaistinkoneistolle. Sarveiskalvossa on kolme solukerrosta; epiteeli, strooma ja endoteeli. Näistä uloin on epiteelisolujen kerros. Epiteelisolut pysyvät kosteina ja terveinä kyynelnesteen ansiosta. Yhdessä epiteeli ja sen päällä lepäävä kyynelneste mahdollistavat silmäluomien liikkeet, estävät taudinaiheuttajien pääsyn silmään ja muodostavat fysikaalisen suojan silmän pinnalle. Niin ihmisillä kuin hiirilläkin kantasolut tuottavat uusia epiteelisoluja koko elämän ajan. Sarveiskalvon kantasolut sijaitsevat kalvon reunoilla, limbuksessa. Kantasolut tuottavat ensin monistajasoluja, jotka jakautuvat aktiivisesti ennen kuin niistä syntyy erilaistuneita epiteelisoluja. Havaitsin, että monistajasoluissa ilmenee Bmi1-geeni ja seurasin geenin avulla monistajasolujen jakautumista ja elinkaarta sarveiskalvolla. Sain selville, että Bmi1+ monistajasolut ylläpitävät epiteeliä 2-8 viikon ajan, jonka jälkeen solut pyyhkiytyvät kuolleina kyynelnesteeseen ja poistuvat silmän pinnalta. Osana tätä tutkimusta jatkojalostin menetelmää, jolla voidaan tehdä hiiren silmän pinnalle haava. Haava muistuttaa yleistä pintanaarmua, jonka voi saada esimerkiksi raapaisemalla silmää kevyesti. Tein hiiren epiteeliin pintahaavan ja seurasin Bmi1+ solujen jakautumista haavan paranemisen aikana. Bmi1+ solut jatkoivat jakautumista normaalisti ja eivät osallistuneet epiteelin sulkeutumiseen haavan jälkeen. Laajensin tutkimustani sarveiskalvosta myös silmän apuelimen, kyynelrauhasen, toimintaan. Kyynelrauhanen tuottaa kyynelnesteen hydrofiilisen osan ja erittää siihen anti-inflammatorisia ja antimikrobiaalisia tekijöitä. Tutkin Ektodysplasiini-A (Eda) -geenin roolia kyynelrauhasen kehityksessä ja silmän tasapainotilan ylläpidossa. Eda-geenin puutos muutti rauhasen toimintaa niin, että tutkimushiiret alkoivat kärsiä silmäoireista, erityisesti kuivasilmäisyydestä. Tämä tutkimus tuo uutta tietoa sarveiskalvon tasapainon ylläpidosta sekä terveessä että paranevassa silmässä. Lisäksi se avaa näkökulman siihen, miten sarveiskalvon ja sen apuelimen, kyynelrauhasen, yhteistyö vaikuttaa silmän terveyteen.

Around 30 years ago, the discovery of modular protein domains began to change the scientific world’s view on cell signalling. The multitude of ground-breaking discoveries in this field over the past three decades increased fundamentally the understanding of cellular signal transduction and how proteins transmit extra- and intracellular signals in this context. The SH3 domain was one of the first described modular protein domains and was soon found to be involved in numerous important cellular functions and signalling cascades. Moreover, SH3 domain-mediated interactions were also found to be hijacked by pathogens, especially viruses, which developed highly specific proteins mimicking cellular SH3 domain ligands. This molecular mimicry allows the virus to interfere, manipulate and exploit host cellular signalling for its own benefits and survival. The vital elements of this doctoral thesis are the identification and characterization of so far unknown, high-affinity SH3 domain-mediated interactions and in the context of pathogenic SH3 domain ligand origin, also the elucidation of functional consequences for the host cell. The first part describes a large-scale screening approach uncovering high-affinity interactions between human SH3 domains and potential native target proteins. The identified robust SH3-mediated interactions are novel and thereby provide a valuable resource for future research. The second part extends the focus to SH3-mediated interactions between viruses and their host cells. These interactions are of exceptional impact since they enable the virus to manipulate or hijack the host’s immune defence system and thereby promote viral survival and propagation. Two examples of viral proteins binding via an SH3-mediated interaction to host cell factors are presented in this thesis: - the interaction of influenza A virus (IAV) NS1 protein with host cell Crk-adaptor proteins in context of reorganizing the Crk(L)-PI3 kinase signalling complex and – the interaction between molluscum contagiosum virus (MCV) MC159 protein and host cell SH3 binding protein 4 (SH3BP4). The study addressing the reorganization of the Crk(L)-PI3 kinase signalling complex by NS1, focuses on structural and biochemical aspects of a newly discovered trimeric protein complex and the related functional changes in downstream signalling, such as Akt activation. The work presented on MC159 identifies host cell SH3BP4 as a new target protein of MCV and shows that the SH3-mediated interaction between MC159 and SH3BP4 is essential for suppression of cellular autophagy by MC159. 90-luvun alussa tehdyt havainnot solujen käyttäytymistä ohjaavien proteiinien modulaarisesta rakenteesta mullistivat käsityksemme proteiinien välisten vuorovaikutusten määräytymisestä ja niiden toiminnasta solujen viestiliikenteen välittäjinä. SH3 domeeni oli yksi ensimmäisiä tällaisia muutoin hyvinkin erilaisista proteiineista tunnistettuja homologia-alueita, joiden havaittiin toimivan modulaarisina proteiini-interaktiorakenteina. SH3 domeenit ohjaavat monia keskeisiä solutoimintoja ja toimivat sitoutumalla yleensä toisiaan muistuttaviin, lyhyehköihin, proliini-rikkaisiin kohtiin ligandiproteiineissaan. Virukset ja muut taudinaiheuttajat ovat evoluution kuluessa muodostaneet itselleen tällaisia SH3 domeenien sitoutumiskohtia, joiden avulla ne voivat kaapata solun toimintoja ohjaavia proteiinivuorovaikutusten verkostoja käyttöönsä omaa replikaatiotaan edistääkseen. Tässä väitöskirjatutkimuksessa on selvitetty SH3 domeenien ja niiden proliinirikkaiden ligandien välisten vuorovaikutusten spesifisyyden ja sitoutumisvoiman määräytymistä, ja pyritty löytämään soluproteiinien välisiä komplekseja, joissa SH3 domeenien rooli on erityisen keskeinen. Toinen tämän väitöskirjatutkimuksen keskeinen tavoite on ollut pyrkiä tarkemmin ymmärtämään virusproteiinien välittämien vahvojen SH3 vuorovaikutusten seurauksena syntyviä toiminnallisia muutoksia solujen käyttäytymisessä. Väitöskirjan ensimmäinen osatyö kuvaa laajamittaisen molekulaarisen seulontatutkimuksen, jossa on pyritty kattavasti löytämään soluproteiinien välisiä SH3 domeenien välittämiä merkittäviä vuorovaikutuksia. Tutkimuksessa löydettiin suuri joukko SH3 domeeni/kohdeproteiinipareja, joiden sitoutuminen toisiinsa oli poikkeuksellisen voimakasta ja selektiivistä. Näiden vuorovaikutusten voi siten olettaa olevan solujen toiminnalle tärkeitä sekä jatkotutkimusten kannalta mielenkiintoisia. Väitöskirjan kaksi muuta osatyötä käsittelevät kahden ihmisviruksen SH3-välitteisiä strategioita isäntäsolunsa toimintojen manipuloimiseksi. Nämä tutkimukset keskittyvät influenssa A viruksen (IAV) NS1 proteiinin (osatyö II) sekä molluscum contagiosum (MCV) eli ontelosyyläviruksen MC159 proteiinin (osatyö III) SH3 vuorovaikutuksiin soluissa. NS1 proteiinin havaittiin vaikuttavan IAV:n kannalta tärkeän Akt proteiinikinaasireitin aktiivisuuteen ohjaamalla solun Crk-säätelijäproteiinin SH3-välitteisten multiproteiinikompleksien järjestäytymistä uudella tavalla. MC159 proteiinin puolestaan havaittiin sitoutuvan voimakkaasti toiseen, vielä melko huonosti tunnettuun isäntäsolun säätelijäproteiinin (SH3BP4), ja näin estävän solurakenteiden kierrätystä välittävää prosessia (autofagiaa), jonka tiedetään olevan tärkeä myös antiviraalisen immuunipuolustuksen toiminnalle.

Autophagy is an evolutionarily conserved pathway used by cells to degrade cargoes that are larger than individual proteins in lysosomes. It maintains cellular homeostasis and degrades aggregate-prone proteins and/or whole organelles. Impaired autophagy plays a crucial role in human diseases like neurodegeneration, cancer and infections. During autophagy, a double-membrane structure, named phagophore, forms around the cytoplasmic cargo. The phagophore grows until it forms a double-membrane vesicle called the autophagosome. The autophagosome fuses with a lysosome to gain degradative properties, forming a structure named autolysosome. Within the autolysosome, the cargo is degraded, and the resulting building blocks are recycled back to the cytoplasm for energy production or biosynthetic reactions. Many aspects of the molecular mechanisms regulating autophagosome biogenesis in starvation-induced and selective autophagy are still unresolved. Moreover, the origin of the phagophore still holds many questions. We studied the role of the protein TRIM17 in selective autophagy. We found that TRIM17 inhibits selective autophagy of various targets while targeting midbodies for autophagic degradation. The protein Mcl-1 regulates autophagy-inducing or -inhibiting functions of TRIM17. The formation of the TRIM17-Beclin 1-Mcl-1 complex inhibits selective autophagy. TRIM17-dependent autophagic degradation of midbodies is induced upon dissociation of Mcl-1 from the Beclin 1-TRIM17 complex. We next revealed that Lagotto Romagnolo dogs carrying an ATG4D missense mutation exhibit altered basal autophagy and abnormal cytoplasmic vacuolization. Our study also confirmed normal lysosomal degradation in affected dogs, excluding a link between the ATG4D mutation and lysosomal storage diseases. Lastly, we showed that upon starvation, Beclin 1 targeted to the endoplasmic reticulum (ER) partially rescued autophagosome formation in cells lacking the ULK1 and ULK2 kinases. The autophagy flux was impaired in these cells and this defect was not rescued by expression of Beclin 1 targeted to the ER. These results suggest a regulatory role for the ULK kinases in autophagosome maturation in addition to autophagosome biogenesis. Moreover, our study demonstrated that the ULK1 and UK2 kinases might play a role in regulating Beclin 1 enrichment in the ER under nutrient-rich conditions. Autofagia on evoluutiossa säilynyt hajotusreitti, jonka avulla solut hajottavat yksittäisiä proteiineja suurempia kohteita. Autofagia ylläpitää solujen homeostaasia ja hajottaa paakkuuntuvia proteiineja ja kokonaisia soluelimiä. Huonosti toimiva autofagia on osallisena useissa sairauksissa mukaan lukien hermoston rappeumataudit, syöpä ja infektiot. Autofagiassa soluliman hajotettavan kohteen ympärille muodostuu kaksoiskalvo, jota kutsutaan nimellä fagofori. Fagofori kasvaa ja muodostaa kaksoiskalvon ympäröimän rakkulan eli autofagosomin. Autofagosomi yhtyy lysosomiin, jolloin muodostuu autolysosomi. Lysosomi tuo mukanaan hajottavat entsyymit. Solulimasta peräisin oleva materiaali hajotetaan autolysosomissa ja hajotuksessa vapautuvat molekyylit kierrätetään takaisin solulimaan, jolloin solu voi käyttää ne energian tuotantoon ja biosynteettisiin reaktioihin. Monet autofagosomien biogeneesin molekulaariset mekanismit sekä ravinteiden puutteen indusoimassa että selektiivisessä autofagiassa ovat vielä tuntemattomia. Myös fagoforin alkuperä on selvittämättä. Me tutkimme TRIM17-proteiinin roolia selektiivisessä autofagiassa. Havaitsimme, että TRIM17 inhiboi useiden rakenteiden selektiivistä autofagiaa, mutta sen sijaan kohdentaa midbody-rakenteet hajotukseen. Mcl-1-proteiini säätelee TRIM17-proteiinin autofagiaa indusoivia ja inhiboivia toimintoja. TRIM17-Beclin 1-Mcl-1 –kompleksi inhiboi selektiivistä autofagiaa. TRIM17-riippuva midbody-rakenteiden autofagia indusoituu, kun Mcl-1 irtoaa kompleksista. Seuraavaksi havaitsimme, että Lagotto Romagnolo –rodun koirissa todettu missense-mutaatio ATG4D-geenissä häiritsee perustilan autofagian toimintaa ja johtaa vakuolien kertymiseen useisiin solutyyppeihin. Tutkimuksemme osoitti, että lysosomaalinen hajotus toimii normaalisti mutaatiosta huolimatta, joten kyseessä ei ole lysosomaalinen kertymäsairaus. Lopuksi osoitimme, että ravintoaineiden puutteen aikana solulimakalvostoon kohdennettu Bekliini 1-proteiini pystyy tukemaan autofagosomien muodostumista soluissa, joilta puuttuvat ULK1 ja ULK2 kinaasit. Autofaginen hajotureitti ei näissä soluissa toimi, eikä kohdennettu Bekliini 1 pystynyt korjaamaan autofagiareittiä hajotusvaiheeseen saakka. Tulos viittaa siihen, että autofagosomien biogeneesin lisäksi ULK-kinaaseilla on rooli myös autofagosomien kypsymisessä. Tuloksemme osoittivat myös, että ravinnerikkaissa olosuhteissa ULK1 ja ULK2 –kinaaseilla voi olla rooli Bekliini 1:n rikastamisessa solulimakalvostoon.

The genetic background of three canine hereditary eye diseases, namely microphthalmia, open-angle glaucoma and progressive retinal atrophy, were addressed in this thesis. Currently, no standardized curative treatment options are available for these diseases. Gene defects behind each of them were identified using modern genome-wide approaches followed by functional validations. In study I, the genetic analyses revealed that a 3-bp deletion in the RBP4 gene is associated with microphthalmia in Irish Soft-Coated Wheaten Terriers. Simultaneously, a new mode of maternal inheritance was discovered as the disease manifests only if both the dam and the offspring were homozygous for the variant. During gestation, RBP4 transfers vitamin A from maternal liver stores to the developing puppy. The defective protein is not secreted into serum, causing vitamin A deficiency, a known risk factor for microphthalmia. In study II, a recessive missense variant in ADAMTS10 was associated with open-angle glaucoma in Norwegian Elkhounds. The disease was found to be bilateral, unresponsive to medical treatment and led to irreversible blindness by the age of six years. In study III, a recessive variant in a putative silencer region fully segregated with progressive retinal atrophy in Miniature Schnauzers. The breed was also found to suffer from another genetic form of the disease, for which a tentative locus was identified. The results of this study have led to novel scientific insights and practical applications and have translational implication to human medicine with similar conditions and gene associations. Three gene tests have been developed to aid veterinary diagnostics and breeding programs. The new mode of maternal inheritance discovered in study I could be a more common phenomenon in developmental disorders across species and should be taken into consideration in all genetic studies. Perinnöllisiä silmäsairauksia aiheuttavia geenivirheitä on rikastunut moniin koirarotuihin voimakkaan jalostuksen seurauksena. Sairautta aiheuttavien geenivirheiden löytäminen mahdollistaa geenitestien kehittämisen jalostuksen ja diagnostiikan avuksi. Lisäksi tuloksia voidaan hyödyntää lääketieteessä, sillä ihmisillä ja koirilla esiintyy samoja silmäsairauksia. Tässä väitöstutkimuksessa selvitettiin kolmen perinnöllisen, koirilla spontaanisti ilmenevän silmäsairauden geneettisiä aiheuttajia. Ensimmäisessä osatyössä paikannettiin vehnäterriereillä ilmenevän silmän alikehittyneisyyden eli mikroftalmian todennäköiseksi syyksi virhe RBP4-geenissä. Samalla löytyi uudenlainen äidistä riippuvainen periytymistapa, sillä sairaus ilmeni vain, jos sekä emä että pentu olivat geenivirheen suhteen samaperintäisiä. RBP4 kuljettaa tiineyden aikana A-vitamiinia emältä pennulle, mutta geenivirheen vuoksi proteiinia ei pystytä tuottamaan ja pentu kärsii A-vitamiinin puutteesta. A-vitamiini on tärkeä useiden elinten normaalille kehittymiselle, ja silmä on sen puutokselle herkin. Toisessa osatyössä tutkittiin harmailla norjanhirvikoirilla ilmenevää avokulmaglaukoomaa. Taudin edetessä silmänsisäinen paine kohoaa ja koirat sokeutuvat pysyvästi noin kuusivuotiaina. Geneettiset analyysit paikansivat sairautta aiheuttavan geenivirheen ADAMTS10-geeniin. ADAMTS10 on aiemmin liitetty ihmisillä ilmenevään Weill-Marchesanin syndroomaan, jonka yhtenä oireena on glaukooma. Kolmannessa osatyössä tutkittiin kääpiösnautsereilla ilmenevää etenevää verkkokalvorappeumaa. Nuorilla aikuisilla sokeuteen johtavan muodon todennäköiseksi aiheuttajaksi paljastui geenin säätelyalueen muutos, jollaista ei ole aiemmin liitetty verkkokalvorappeumaan millään lajilla. Rodussa ilmenee toistakin muotoa taudista, jonka aiheuttaja paikantui alustavasti X-kromosomiin.

The diversity of G protein-coupled receptors is a fundamental element in this thesis. GPCRs are the largest family of membrane proteins, with about 800 in humans. While the human GPCR repertoire is well described, in other species, especially in non-mammals, GPCRs are not tracked to the individual subtype level in large-scale genomic studies. The diversity of GPCRs in non-human vertebrates was studied in the first publication. The study classified 142 rhodopsin-like non-olfactory GPCRs without human orthologue, 69 of which were reported for the first time. The study also points out inconsistencies in the GPCR nomenclature system and reveals a pool of yet-to-be studied receptors. Understanding the repertoire of GPCRs in non-human species might also be useful for many areas of science, such as pharmacology, ecotoxicology and evolutionary biology. For more insight into the orexin system, two small-molecule orexin receptor agonists were pharmacologically characterised in the second and third publications. Nag26 was confirmed to be a potent and almost full agonist of orexin receptors, but the selectivity for orexin receptor type-2 was not as strong as reported (20-fold against 70-fold). Yan7874 was also confirmed to be an orexin receptor agonist, but only partial and weak with high off-target activity. Neither of these compounds is likely to be suitable for further drug development as such. These studies also display the challenge in the development of small-molecule agonists for peptide-bound GPCRs. Finally, Ciona intestinalis putative orexin receptor was studied, and its functionality was verified in recombinant cells. Homology models of C. intestinalis orexin receptor revealed a highly similar binding cavity as in the human OX2 orexin receptor. Thus, the functionality of the receptor was studied in Ca2+ elevation assay, and the receptor was verified to be functional and binding to human orexin peptides. Further database mining resulted in the identification of putative C. intestinalis prepro-orexin and orexin peptide that was shown to bind to a plasma membrane of C. intestinalis orexin receptor-expressing cells. Solving the function of the orexin system in distinct species such as C. intestinalis might be interesting from an evolutionary point of view but also essential in extending the knowledge of the orexin system in humans. This thesis was conducted collaboratively with the Division of Pharmaceutical Chemistry and Technology, Faculty of Pharmacy and Department of Veterinary Biosciences, Faculty of Veterinary Medicine, at the University of Helsinki. G-proteiinikytkentäisten reseptorien moninaisuus on keskiössä tässä väitöskirjatyössä. G-proteiinikytkentäiset reseptorit ovat suurin yhtenäinen kalvoreseptorien ryhmä, ja ihmisellä on noin 800 G-proteiinikytkentäistä reseptoria. Toisin kuin ihmisen reseptorien kohdalla, muiden lajien edustajien (varsinkin nisäkkäiden ulkopuolelta) reseptorijoukkoa on harvoin jäljitetty alatyyppitasolle asti laajoissa genomitutkimuksissa. Tämän väitöskirjatyön ensimmäinen julkaisu perehtyy G-proteiinikytkentäisten reseptorien moninaisuuteen selkärankaisilla lajeilla. Tutkimus luokittelee 142 rodopsiini-reseptorien ryhmään kuuluvaa G-proteiinikytkentäistä reseptoria ilman humaania ortologia. Näistä reseptoreista 69 esitetään tässä työssä ensimmäistä kertaa. Lisäksi tutkimus osoittaa reseptorien epäjohdonmukaisuuksia nimeämissysteemissä, sekä esittelee vielä tutkimattomia reseptoreja. Laajempi ymmärrys eri lajien reseptorirepertuaarista voi olla hyödyllinen monilla tieteenaloilla, kuten farmakologiassa, ekotoksikologiassa ja evoluutiobiologissa. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin myös ihmisen G-proteiinikytkentäisiä reseptoreja. Kahden pienmolekyylioreksiinireseptoriagonistin ominaisuudet luokiteltiin farmakologisesti tämän väitöskirjan toisessa ja kolmannessa julkaisussa. Tutkimus vahvisti pienmolekyyli Nag26:n olevan potentti, lähes täysagonisti ja selektiivinen tyypin-2 oreksiinireseptorille, joskaan ei yhtä voimakkaasti selektiivinen kuin aikaisemmin on raportoitu. Pienmolekyyli Yan7874:n vahvistettiin olevan myös oreksiinireseptoriagonisti, mutta vain osittainen ja heikko. Lisäksi, Yan7874 indusoi soluissa epäspesifisiä vaikutuksia. On siis epätodennäköistä, että kumpikaan näistä yhdisteistä tarjoaisi sellaisenaan potentiaalia pidemmälle lääkekehitykselle. Nämä tutkimukset osoittavat osaltaan pienmolekyyliagonistien kehityksen haasteita peptideihin sitoutuviin G-proteiinikytkentäistiin reseptoreihin. Lopuksi, tässä työssä tutkittiin selkärangattoman Ciona intestinalis –lajin putatiivista oreksiinireseptoria, ja sen toiminnallisuus vahvistettiin ilmentämällä sitä rekombinanteissa soluissa. Homologiamallien perusteella reseptorin sitoutumistaskun osoitettiin muistuttavan ihmisen tyyppi-2 oreksiinireseptorin sitoutumistaskua. Oreksiinireseptorin toimivuus vahvistettiin reseptori-riippuvaisella solunsisäisen kalsiumin mobilisaatiolla, ja sitovan humaaneja oreksiinipeptidejä. Lisäksi tietokantalouhinta johti putatiivisen C. intestinalis oreksiini-prekursorin ja oreksiinipeptidin tunnistamiseen. Tässä väitöskirjatyössä tunnistettiin ensimmäistä kertaa C. intestinalis –lajin oreksiini-prekursori ja osoitettiin, että putatiivinen oreksiinipeptidi sitoutuu C. intestinalis oreksiinireseptoria expressoivien solujen solukalvolle. Oreksiinisysteemin toiminnallisuus evolutiivisesti etäisillä lajeilla, kuten C. intestinalis –lajilla, on mielenkiintoinen tutkimuskohde evoluutiobiologian kannalta. Lisäksi se voi tarjota tietoa kokonaisvaltaiseen oreksiinisysteemin ymmärtämiseen myös ihmisillä. Tämä väitöskirja on toteutettu yhteistyössä Helsingin Yliopiston Farmaseuttisen Kemian ja Teknologian osaston (Farmasian Tiedekunta) ja Eläinlääketieteellisten Biotieteiden osaston (Eläinlääketieteellinen Tiedekunta) kanssa.

The nemaline myopathies (NM) are a group of genetic muscle disorders, ranging in severity from severe, early lethal forms to milder muscle disorders with onset in childhood, sometimes presenting in adulthood. Nemaline myopathies present with usually non-progressive or slowly progressive generalised muscle weakness and are pathologically characterised by the presence of cytoplasmic inclusions called nemaline bodies or rods. So far, mutations in twelve genes have been identified underlying the disorder. This Thesis aimed at elucidating the expression of the nebulin gene (NEB) and the function of the protein, in order to gain insight into the pathogenetic mechanisms leading to NM. Approximately half of NM cases are caused by mutations in NEB, and the vast majority of these are inherited recessively. NEB consists of 183 exons, giving rise to transcripts up to 26 kb in length. Nebulin is an enormous protein, with important roles in maintaining the structure and function of skeletal muscle. It is localised in the thin filament of the muscle sarcomere, and one nebulin protein spans the entire length of the filament. Nebulin structure is highly modular, consisting of actin-binding simple repeats, and super repeats formed by seven simple repeats. In NEB, more than 240 different pathogenic variants have been published, causing myopathies with no cure currently available. Furthermore, most NEB-NM patients have a compound heterozygous genotype, with two private mutations anywhere along the gene, which further hampers the discovery of any genotype-phenotype correlations. Many of the NEB exons are alternatively spliced. In this study, we investigated NEB expression at the RNA level, in 21 different skeletal muscles and in brain. We demonstrated co-expression of several different nebulin isoforms in all the muscles studied, but no isoforms specific for certain muscles were identified. The results also indicated that all 183 NEB exons are expressed in adult brain, and that the expression levels were comparable with expression in skeletal muscle. Further studies are warranted to elucidate the expression in brain. We however, went on to further investigate the expression and function of NEB in skeletal muscle. Exons 143 and 144 are mutually exclusive, encoding the super repeats S21a and S21b, respectively. The amino acid sequences of the alternative region differ in both charge and hydrophobicity. We developed specific antibodies for these two isoforms, enabling studies of their expression at the protein level. Our results showed differences in the usage of these isoforms between various myofibres, and during muscle development. S21b was the only isoform present in early myotubes, whereas regulated expression of S21a appeared later, mainly in fast myofibres. These results form a basis for studying the functional differences between the isoforms, and add to the basic knowledge of normal muscle function. The size of nebulin complicates studies at the protein level as well as genetic studies. As the super-repeat region encompasses nearly the entire protein, we constructed a panel of 26 mini-genes, corresponding to all the different nebulin super repeats, to enable protein interaction studies. The studies covering the entire nebulin super-repeat region revealed differences in actin binding between the seemingly similar super repeats, depending on their location in the protein. Actin binding was significantly stronger towards the end of the protein, while the entire central region bound actin weakly. This finding constitutes an important step in understanding nebulin function, and may facilitate the interpretation of the effects of various NEB mutations, depending on their location along the protein. Furthermore, the super-repeat panel can be utilised for studying mutational effects functionally at the protein level. To shed light on the pathogenetic mechanisms underlying NM, and to enable the study of nebulin function in normal and defective muscle, we developed the first murine model of NM with compound heterozygous Neb mutations. The aim was to produce a model recapitulating the most common form of NM, i.e. the typical congenital form. By studying the new compound heterozygous model, and the parental lines, we have gained valuable insight into the effects of Neb mutations on muscle function. The mouse models will be useful in deciphering the pathogenetic mechanisms of NEB-NM, and will be suitable for the assessment of potential therapeutic approaches. The results of this Thesis shed light on the expression and function of nebulin in health and disease. This brings us closer to understanding the pathogenetic mechanisms of NM, and how the disorder evolves, which in turn will enable providing more accurate diagnosis and prognosis for NM patients. Understanding the pathogenetic mechanisms underlying NM is also a prerequisite for developing effective therapies for NM in the future. Myopatiat ovat lihassairauksia, joiden yhdistävänä tekijänä on tahdonalaisten lihasten heikkous. Vaikka yksittäiset myopatiat saattavat olla hyvinkin harvinaisia, niiden yhteenlaskettu esiintyvyys on korkea. Nemaliinimyopatia on yksi yleisimmistä synnynnäisistä myopatioista, jota kuvaa etenemätön tai hitaasti etenevä lihasheikkous ja tyypilliset ns. nemaliinikappaleet lihassyissä. Sen taustalta on tähän mennessä löydetty mutaatioita ainakin kahdessatoista eri geenissä. Kaikki nämä ns. nemaliinimyopatiageenit määrittelevät lihaksen tärkeitä rakenne- tai säätelyproteiineja. Taudin vaikeusaste vaihtelee lievemmästä lihasheikkoudesta vakavaan, aikaisessa vaiheessa kuolemaan johtavaan muotoon. Parannus- tai täsmähoitokeinoa nemaliinimyopatialle ei ole olemassa. Yli 50% nemaliinimyopatiatapauksista johtuu nebuliinigeenin mutaatioista. Tästä tiedosta huolimatta nebuliinimutaatioiden aiheuttaman taudin syntymekanismeja ei juurikaan vielä tunneta. Nebuliini on yksi suurimmista tunnetuista proteiineista, joten sen tutkiminen on erittäin haastavaa. Nebuliinin uskotaan mm. osallistuvan lihassupistuksen tärkeimpien rakenteellisten komponenttien, ohuen ja paksun filamentin (aktiinin ja myosiinin) interaktion säätelyyn ja aktiinifilamentin tukemiseen, mikä on edellytys lihaksen normaalille toiminnalle. Väitöskirjatutkimuksessa pyrittiin selvittämään nebuliinin roolia terveessä ja sairaassa lihaksessa. Useita erilaisia molekyyligeneettisiä menetelmiä käyttäen nebuliinin lukuisien isomuotojen esiintymistä eri luustolihaksissa tutkittiin RNA- ja proteiinitasolla. Lisäksi nebuliini-aktiini-interaktioita tutkittiin proteiinitasolla käyttämällä tähän tarpeeseen kehitettyä lähes koko proteiinin kattavaa, nebuliinifragmenteista koostuvaa minigeenipaneelia. Väitöskirjassa kuvataan myös uuden nemaliinimyopatiaa edustavan hiirimallin kehittäminen ja karakterisoiminen. Tautimallin tavoitteena oli mahdollistaa nebuliinimutaatioiden vaikutusten arvioiminen ja tautimekanismien tutkiminen potilasmutaatioita edustavassa myopatialihaksessa. Tautimallia voidaan myös tulevaisuudessa käyttää alustana uusimpien terapioiden testaamisessa. Väitöskirjatutkimuksen tulokset tuovat lisätietoa nebuliinin esiintymisestä ja toiminnasta sekä terveessä että sairaassa luustolihaksessa ja kartuttavat lihaksen molekyylibiologian perustuntemusta. Tämän tiedon avulla voimme oppia ymmärtämään nemaliinimyopatian syntymekanismeja ja taudin kulkua. Taudin syntymekanismien ymmärtäminen on myös edellytys toimivan hoidon kehittämiselle tulevaisuudessa.

Toxicology is the scientific pursuit of identifying and classifying the toxic effect of a substance, as well as exploration and understanding of the adverse effects due to toxic exposure. The modern toxicological efforts have been driven by the human industrial exploits in the production of engineered substances with advanced interdisciplinary scientific collaborations. These engineered substances must be carefully tested to ensure public safety. This task is now more challenging than ever with the employment of new classes of chemical compounds, such as the engineered nanomaterials. Toxicological paradigms have been redefined over the decades to be more agile, versatile, and sensitive. On the other hand, the design of toxicological studies has become more complex, and the interpretation of the results is more challenging. Toxicogenomics offers a wealth of data to estimate the gene regulation by inspection of the alterations of many biomolecules (such as DNA, RNA, proteins, and metabolites). The response of functional genes can be used to infer the toxic effects on the biological system resulting in acute or chronic adverse effects. However, the dense data from toxicogenomics studies is difficult to analyze, and the results are difficult to interpret. Toxicogenomic evidence is still not completely integrated into the regulatory framework due to these drawbacks. Nanomaterial properties such as particle size, shape, and structure increase complexity and unique challenges to Nanotoxicology. This thesis presents the efforts in the standardization of toxicogenomics data by showcasing the potential of omics in nanotoxicology and providing easy to use tools for the analysis, and interpretation of omics data. This work explores two main themes: i) omics experimentation in nanotoxicology and investigation of nanomaterial effect by analysis of the omics data, and ii) the development of analysis pipelines as easy to use tools that bring advanced analytical methods to general users. In this work, I explored a potential solution that can ensure effective interpretability and reproducibility of omics data and related experimentation such that an independent researcher can interpret it thoroughly. DNA microarray technology is a well-established research tool to estimate the dynamics of biological molecules with high throughput. The analysis of data from these assays presents many challenges as the study designs are quite complex. I explored the challenges of omics data processing and provided bioinformatics solutions to standardize this process. The responses of individual molecules to a given exposure is only partially informative and more sophisticated models, disentangling the complex networks of dynamic molecular interactions, need to be explored. An analytical solution is presented in this thesis to tackle down the challenge of producing robust interpretations of molecular dynamics in biological systems. It allows exploring the substructures in molecular networks underlying mechanisms of molecular adaptation to exposures. I also present here a multi-omics approach to defining the mechanism of action for human cell lines exposed to nanomaterials. All the methodologies developed in this project for omics data processing and network analysis are implemented as software solutions that are designed to be easily accessible also by users with no expertise in bioinformatics. Our strategies are also developed in an effort to standardize omics data processing and analysis and to promote the use of omics-based evidence in chemical risk assessment. Toxicology is the scientific pursuit of identifying and classifying the toxic effect of a substance, as well as exploration and understanding of the adverse effects due to toxic exposure. The modern toxicological efforts have been driven by the human industrial exploits in the production of engineered substances with advanced interdisciplinary scientific collaborations. These engineered substances must be carefully tested to ensure public safety. This task is now more challenging than ever with the employment of new classes of chemical compounds, such as the engineered nanomaterials. Toxicological paradigms have been redefined over the decades to be more agile, versatile, and sensitive. On the other hand, the design of toxicological studies has become more complex, and the interpretation of the results is more challenging. Toxicogenomics offers a wealth of data to estimate the gene regulation by inspection of the alterations of many biomolecules (such as DNA, RNA, proteins, and metabolites). The response of functional genes can be used to infer the toxic effects on the biological system resulting in acute or chronic adverse effects. However, the dense data from toxicogenomics studies is difficult to analyze, and the results are difficult to interpret. Toxicogenomic evidence is still not completely integrated into the regulatory framework due to these drawbacks. Nanomaterial properties such as particle size, shape, and structure increase complexity and unique challenges to Nanotoxicology. This thesis presents the efforts in the standardization of toxicogenomics data by showcasing the potential of omics in nanotoxicology and providing easy to use tools for the analysis, and interpretation of omics data. This work explores two main themes: i) omics experimentation in nanotoxicology and investigation of nanomaterial effect by analysis of the omics data, and ii) the development of analysis pipelines as easy to use tools that bring advanced analytical methods to general users. In this work, I explored a potential solution that can ensure effective interpretability and reproducibility of omics data and related experimentation such that an independent researcher can interpret it thoroughly. DNA microarray technology is a well-established research tool to estimate the dynamics of biological molecules with high throughput. The analysis of data from these assays presents many challenges as the study designs are quite complex. I explored the challenges of omics data processing and provided bioinformatics solutions to standardize this process. The responses of individual molecules to a given exposure is only partially informative and more sophisticated models, disentangling the complex networks of dynamic molecular interactions, need to be explored. An analytical solution is presented in this thesis to tackle down the challenge of producing robust interpretations of molecular dynamics in biological systems. It allows exploring the substructures in molecular networks underlying mechanisms of molecular adaptation to exposures. I also present here a multi-omics approach to defining the mechanism of action for human cell lines exposed to nanomaterials. All the methodologies developed in this project for omics data processing and network analysis are implemented as software solutions that are designed to be easily accessible also by users with no expertise in bioinformatics. Our strategies are also developed in an effort to standardize omics data processing and analysis and to promote the use of omics-based evidence in chemical risk assessment.

Viruses are obligate parasites infecting the cells from all the three domains of life: Bacteria, Archaea and Eukarya. Ribonucleic acid (RNA) viruses contain ribonucleic acid as their genomic element instead of deoxyribonucleic acid (DNA). There are three main types of RNA viruses: positive-sense single-stranded [(+)ssRNA], negative-sense single-stranded [(-)ssRNA] and double-stranded RNA (dsRNA) viruses. This Thesis is focused on revealing molecular details of replication and assembly of two dsRNA viruses: Pseudomonas phage phi6 (phi6) and human picobirnavirus (hPBV). Double-stranded RNA viruses need to carry an RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) inside their virion to the host in order to be able to replicate their genome. We characterized the hPBV RdRp enzymatically and structurally and revealed the similarities of this RdRp to the other known small dsRNA virus RdRps like phi6 RdRp, which has been extensively studied. We showed that hPBV RdRp has a canonical cupped right-hand polymerase structure, it can replicate and transcribe homologous and heterologous template RNA in the absence of capsid proteins and it also possesses terminal nucleotidyl transferase activity. This is only the second dsRNA virus RdRp reported with this activity. The assembly of these two viruses is relatively different due to the differences in their structures. Phi6 has three layers and a lipid-protein envelope as its outermost layer whereas hPBV does not have any lipids in its structure and is composed of only one layer of capsid proteins surrounding the dsRNA genome. The assembly of the inner protein layers of phi6 is very well-known whereas as the envelope formation and the assembly of hPBV capsid layer is largely uncharacterized. Our results suggest that hPBV might use a co-assembly of its capsid proteins and genomic RNA precursors as its assembly strategy. The envelope assembly of phi6 was studied expressing phi6 membrane proteins in Escherichia coli bacteria. Our results revealed that only one small membrane protein P9 can induce phi6-specific vesicle formation in E. coli cells. Also, heterologous green fluorescent protein can be added to the vesicles by co-expressing non-structural P12 protein. This study reveals interesting molecular details about the genome replication and assembly of hPBV, a relatively unknown opportunistic human pathogen, and the envelopment process of phi6. These results are biologically interesting and may have also biotechnological applications in the future. Virukset ovat solujen loisia. Ne voivat infektoida kaikkia maailman soluja: bakteeri-, arkeoni- ja eukaryoottisoluja. Virusten perimäaines voi koostua joko deoksiribonukleiinihaposta (DNA) tai ribonukleiinihaposta (RNA). RNA-viruksia on kolmea eri tyyppiä: positiivis- ja negatiivisjuosteisia sekä kaksijuosteisia RNA-viruksia (dsRNA-viruksia). Tässä väitöskirjassa on tutkittu kahden kaksijuosteisen RNA-viruksen, ihmisen pikobirnaviruksen sekä phi6-bakteriofagin, monistumisen ja rakentumisen molekulaarisia yksityiskohtia. Kaksijuosteisten RNA-virusten on kuljetettava RNA:sta riippuvainen RNA-polymeraasi (RdRp) sisällään isäntäsoluun voidakseen monistaa perimäainestaan. Me tutkimme ihmisen pikobirnaviruksen RdRp:n rakennetta ja entsymaattista aktiivisuutta ja löysimme samankaltaisuuksia muiden pienten dsRNA-virusten polymeraasien kanssa. Ihmisen pikobirnaviruksen polymeraasilla on viruspolymeraaseille tyypillinen oikeakätinen rakenne ja se pystyy replikoimaan ja transkriboimaan sekä omaa että vierasta RNA:ta ilman muiden virusproteiinien avustusta. Lisäksi polymeraasilla havaittiin terminaalinen nukleotidyylitransferaasiaktiivisuus. Vaikka ihmisen pikobirnaviruksen ja phi6-bakteriofagin polymeraasit ovat hyvin samankaltaisia, näiden virusten rakenne ja rakentuminen poikkeavat melkoisesti toisistaan. Phi6-bakteriofagi koostuu kolmesta kerroksesta, joista uloimpana on lipidi-proteiinivaippa. Kaksi sisintä kerrosta ovat muodostuneet proteiineista. Ihmisen pikobirnaviruksella ei ole ollenkaan lipidejä rakenteessaan, vaan se koostuu ainoastaan yhdestä proteiinikerroksesta, joka ympäröi perimäainesta. Phi6-viruksen sisäosien rakentuminen tunnetaan todella hyvin, mutta lipidi-vaipan rakentuminen ja ihmisen pikobirnaviruksen rakentuminen ovat huonosti tunnettuja. Tutkimuksemme tulokset antoivat tukea sille, että ihmisen pikobirnavirus rakentuu proteiineista ja perimäaineksesta samanaikaisesti. Lisäksi saimme selville, että vain yksi phi6-bakteriofagin kalvoproteiineista, P9, tarvitaan phi6-spesifisten vesikkelien muodostumiseen kolibakteerissa. Vesikkeleihin pystyttiin liittämään vierasperäinen proteiini tuottamalla myös viruksen ei-rakenteellista P12-proteiinia. Nämä molekulaariset yksityiskohdat kaksijuosteisista RNA-viruksista ovat biologisesti mielenkiintoisia, mutta voivat myös johtaa hyödyllisiin sovelluksiin bioteknologiassa.

In nature, animals often live in an environment with unpredictable food availability and abundance. In response to these changes in nutrient landscape, animals coordinate growth rate and metabolism. A key signaling pathway mediating the nutrient-dependent responses is the insulin/insulin-like growth factor signaling (IIS). IIS controls growth and metabolism through regulating a large number of target genes. Thus, to understand the mechanisms by which nutrient-dependent control of physiology occurs, it is important to address the transcriptional regulation involved in IIS. However, our understanding of the transcriptional regulators involved in IIS, as well as their mechanism of action, remains incomplete. Drosophila is a powerful model organism to analyze gene regulatory mechanisms involved in IIS, due to its genetic toolkit and high conservation of the IIS pathway. Drosophila has eight insulin-like peptides (dILPs), which are homologous to mammalian insulin and insulin-like growth factors (IGFs). Binding of dILPs to their receptors induces IIS and activates downstream PI3K/AKT, MAPK/ERK and TOR pathways, which control the expression of a large group of genes, regulating metabolic homeostasis and tissue growth. In this study, we systematically explored the transcriptional regulators involved in the regulation upstream and downstream of IIS. We identified ten candidates that regulate dILP transcription, and nine that mediate gene expression downstream of IIS. Among the IIS downstream regulators, we identified a chromatin-binding protein, PWP1. The activation of PWP1 is controlled by nutrition levels through the TORC1 pathway. PWP1 associates with RNA Pol I, and enriches in rDNA and 5S rRNA gene regions to maintain the chromatin in a transcription-competent state to promote the expression of rRNAs. Besides, we showed that the expression level of PWP1 in human head and neck squamous cell carcinoma tumors associates strongly with patient prognosis, suggesting its important role in tumorigenesis. Among the regulators of dILP transcription, we found a novel transcription factor that promotes dILP6 expression, and it is likely a new component of the starvation-responsive gene regulatory network. In addition, we explored the Hyd-mediated regulation of transcription factor Myc, and the role of this regulation in tissue growth control and cancer. In conclusion, our studies identified important but poorly studied regulators of IIS, and further revealed novel mechanisms of how IIS is involved in metabolism and growth regulation. These findings not only establish the groundwork for the molecular basis of IIS function, but also provide opportunities for the therapeutic treatment of IIS-related diseases in humans. For instance, we observed that PWP1 is a potential therapeutic target and a useful marker for grading cancer aggressiveness. Hence, our findings opened a new research avenue for further studies of PWP1 in tumorigenesis and cancer therapy, providing the opportunity to help prognosis and treatment, and ultimately improve the quality of life of cancer patients. Luonnossa eläinten ravinnonsaanti vaihtelee ja eläimen aineenvaihdunnan ja kasvun onkin sopeuduttava muuttuviin ravitsemustilanteisiin. Insuliini ja insuliinin kaltainen kasvutekijä ovat keskeisiä ravinnosta riippuvia aineenvaihdunnan ja kasvun säätelijöitä. Niiden aktivoimat viestintäreitit säätelevät suurta geenien joukkoa. Jotta pystyisimme ymmärtämään, miten ravinto vaikuttaa eläimen fysiologiaan, meidän on ymmärrettävä paremmin näitä geenitason säätelymekanismeja. Banaanikärpänen Drosophila melanogaster on keskeinen geenitutkimuksen malliorganismi. Se soveltuu hyvin ravintoviestinnän tutkimiseen, koska se mahdollistaa kontrolloidut geneettiset koejärjestelyt ja koska ravintoviestinnässä toimivat geenit ovat evoluutiossa säilyneitä, eli ne toimivat eri eläinlajeilla samankaltaisilla tavoilla. Drosophilalla on kahdeksan insuliininkaltaista peptidiä (insulin-like peptide, ILP), jotka toiminnallisesti vastaavat nisäkkäiden insuliinia ja insuliinin kaltaista kasvutekijää. ILP:n sitoutuminen reseptoriinsa johtaa useiden soluviestintäreittien (mm. PI3K/AKT, MAPK/ERK ja TOR kinaasit) aktivoitumiseen, jotka puolestaan säätelevät geeniluentaa, vielä osittain tuntemattomilla mekanismeilla. Tässä työssä etsittiin systemaattisesti uusia insuliiniviestinnässä toimivia geenisäätelijöitä. Työni keskittyi sekä ILP-geenien säätelijöihin että insuliiniviestinnän alavirran säätelijöihin. Löysimme yhteensä kymmenen uutta kandidaattia ILP-geenien säätelijöiksi ja yhdeksän insuliiniviestinnän alavirran säätelijää. Yksi löytämistämme säätelijöitä oli kromatiiniin sitoutuva proteiini PWP1. Havaitsimme että PWP1:n aktiivisuutta säädellään ravintoriippuvaisesti TOR-kinaasin välityksellä. Osoitimme että PWP1 sitoutuu RNA polymeraasi I:een, jonka tehtävä solussa on tuottaa ribosomaalista RNA:ta, ja aktivoi RNA polymeraasi I:n toimintaa. PWP1 ilmentyminen on huomattavasti lisääntynyt pään ja kaulan alueen syövissä ja PWP1 ilmentymisen taso oli yhteydessä syövän aggressiivisuuteen. ILP geenien säätelijöistä keskityimme jatkokokeissa uuteen ILP6-geenin säätelijään, joka osoittautui keskeiseksi ravinnon puutteen aiheuttaman geenisäätelyvasteen välittäjäksi. Lisäksi tutkimme keskeisen solun kasvun aktivoijan, transkriptiotekijä Myc:n, uutta säätelijää ja sen roolia kudoshomeostaasissa ja syövässä. Yhteenvetona, tässä väitöstyössä löydettiin useita uusia kasvun ja aineenvaihdunnan säätelijöitä, sekä selvitettiin niiden molekyylitason toimintamekanismeja. Nämä löydökset tuovat uutta ymmärrystä näiden keskeisten biologisten prosessien säätelyyn ja avaavat uusia mahdollisuuksia ihmisten sairauksien hoitoon.

The endoplasmic reticulum (ER) is the largest membrane bound organelle in a cell and has multiple responsibilities. Execution of the various duties performed by the ER requires it to be shaped in a rather complex and intricate manner. ER’s two major structural motives, namely sheets and tubules, play very complex yet not fully understood role in giving ER its overall structure and function. The ratio of sheet and tubule conformations differ significantly within cell types and during cell cycle. Such a balance is possible only with a well-functioning set of factors that constantly communicate with each other throughout a cell cycle. These factors are specifically responsible for either shaping the ER sheets or tubules in addition to factors that keep the dynamic nature of the ER sound. During mitosis, ER undergoes a major transformation in its structure, where the sheet-tubule ratio shifts more towards tubules. Specific factors keep this process sound by acting actively during the stage of mitosis for proper cell division to occur. Although research on such factors are still on-going, many in-depth details on such factors (e.g. their precise localization) and their mechanism of action plus novel factors for ER shaping still needs to be resolved using techniques involving high end light and electron microscopy. In addition, a constant battle in data analysis for answering key questions also persists. Development of tools to study and analyse data on the lines of image analysis and processing is an unmet need that needs simultaneous attention. The research in this thesis focuses on three family of proteins that we uncover as responsible candidates in shaping the ER. To aid the study, this thesis also discusses the development of a software platform for analysis of microscopic data generated during this study. In this research, Reticulon family of proteins (RTN) were characterised using high-end microscopic techniques. We showed RTN4A and RTN4B to localize to ER tubules and sheet edges using pre-embedding immuno electron microscopy (immuno-EM) and electron tomography. Using qPCR, RTN4A and RTN4B were observed to be the most expressed isoforms in neurons and epithelial cells respectively. FAM134C, a poorly characterised protein was identified as one of the RTN4B interacting proteins. FAM134C localised to the ER where it specifically resided at high curvature ER (sheet edges and tubules) similar to RTN4B. FAM134C, similar to the RTN4B also had the capability to promote ER tubules upon overexpression. In addition, another family of proteins belonging to receptor expression enhancing protein (REEP), namely REEP3 and REEP4 were studied for shaping ER during mitotic stage of cell cycle. REEP3 and REEP4 collectively were observed both in tubulating peripheral ER during mitosis and clearing tubular ER from the chromatin for a normal mitosis to take place. Collectively, this work elaborates on proteins belonging to three classes that shape and position the ER specifically either in interphase or during stages of cell division. Our findings also throws light on the role of different domains in each of these proteins such as the reticulon homology domain (RHD) that was observed to be present in all these proteins under study. The RHD previously known for inserting partially and unsymmetrically in the outer leaflet of the ER gives a strong indication for proteins like RTN4B and FAM134C to localize to ER thus tubulating ER upon overexpression conditions. We uncovered the RHD’s crucial role in ER shaping and positioning in REEP3/4 during mitosis. Endoplasma- eli solulimakalvosto (engl. endoplasmic reticulum, ER) on solun suurin kalvon rajoittama organelli, ja sillä on useita tehtäviä. Pystyäkseen suoriutumaan eri tehtävistään ER:n rakenne on monimuotoinen ja alati muuntautuva. ER:n päärakenteet, laatat ja tubulukset, muodostavat monimutkaisen verkoston, eikä niiden kaikkia toimintoja täysin vielä tunneta. Laattojen ja tubulusten määrällinen suhde on erilainen eri solutyypeissä ja solusyklin vaiheissa. ER:n toimivan tasapainon saavuttamiseksi tarvitaan useita tekijöitä, jotka ovat vuorovaikutuksessa keskenään koko solusyklin ajan. Osa näistä tekijöistä osallistuu ER:n rakenteen muokkaamiseen ja osa on vastuussa ER:n dynaamisesta luonteesta. Solunjakautumisen aikana ER:n rakenne muuttuu, ja tubulaarisia rakenteita muodostuu suhteellisesti enemmän. Eri tekijät toimivat aktiivisesti solunjakautumisen eri vaiheissa mahdollistaen näin solujen jakautumisen. Nämä tekijät ovat edelleen tutkimuksen kohteena, ja yksityiskohtien esim. tarkan paikantumisen ja toimintamekanismin selvittämiseksi sekä vielä tuntemattomien, ER:n rakenteeseen vaikuttavien tekijöiden löytämiseksi, on käytettävä kehittyneitä tekniikoita kuten valo- ja elektronimikroskopiaa. Myös tietoaineiston analysoinnin täytyy edelleen kehittyä pystyäksemme vastaamaan tärkeisiin kysymyksiin, ja sen vuoksi sekä kuvankäsittelyyn että kuvien analysointiin tarvittavien ohjelmien kehittämiseen on kiinnitettävä erityistä huomiota. Tässä väitöskirjatutkimuksessa tutkittiin kolmea proteiiniperhettä, joiden osoitettiin vaikuttavan ER:n rakenteeseen. Tutkimuksen aikana otettujen mikroskooppikuvien analysointi oli tämän tutkimuksen kannalta oleellista ja tästä johtuen työssä käsitellään myös kuvankäsittelyohjelmiston kehittämistä. Tässä väitöskirjatutkimuksessa karakterisoitiin Reticulon-proteiineja (RTN) uusilla, kehittyneillä mikroskooppisilla tekniikoilla. Immuunielektronimikroskopialla ja elektronitomografialla osoitettiin RTN4A:n ja RTN4B:n paikallistuvan ER:n tubuluksiin ja laattojen reunoille. Kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla pystyttiin osoittamaan, että RTN4A on eniten ilmennetty muunnos hermosoluissa ja RTN4B vastaavasti pintakudossoluissa. Vähän tutkittu proteiini, FAM134C, tunnistettiin yhdeksi RTN4B:n kanssa vuorovaikutuksessa olevista proteiineista ja se paikallistettiin samankaltaisiin ER:n rakenteisiin kuin RTN4B (laattojen reunat ja tubulukset). FAM134C:n ja RTN4B:n ylituotto aikaansai tubulaaristen rakenteiden muodostamista. Lisäksi, ER:n rakenneproteiiniryhmän REEP (engl. receptor expression enhancing protein) proteiinien REEP3 ja REEP4 vaikutusta ER:n rakenteeseen tutkittiin solunjakautumisvaiheen aikana. Solunjakautumisvaiheessa REEP3 ja REEP4 paikallistettiin tubulaariseen, perifeeraaliseen ER:ään. Nämä proteiinit tarvittiin myös tubulaarisen ER:n irrottamiseksi kromatiinista normaalin solunjakautumisen aikaansaamiseksi. Tämä tutkimus syventää tietoja kolmen ER:ä muokkaavan proteiiniperheen proteiineista ja niiden paikallistumisesta ja vaikutuksista ER:n rakenteeseen niin kasvuvaiheessa kuin solunjakautumisen eri vaiheissa. Tulokset antavat myös lisätietoa eri domeenien rooleista näissä proteiineissa, esim. retikulonihomologia-domeenista (RHD), jonka löydettiin kaikista näistä proteiineista. RHD:n tiedetään olevan osittain kaksoiskalvorakenteen sisällä ja siten aiheuttavan kalvojen kaarevoitumista: tämä havaittiin myös ER:n tubuloitumisena ylituotettaessa RTN4B:tä tai FAM134C:tä. Tutkimuksen mukaan RHD:lla oli ratkaiseva rooli ER:n REEP 3/4 rakenneproteiinien toiminnassa solunjakautumisen aikana.

The vascular system of plants functions as a transportation route for water, nutrients and signaling molecules while also forming a support structure and generating most of the radial growth by increasing the number of cell files through periclinal cell divisions. These features have transformed life on Earth by enabling plants to colonize land and grow larger. In mature plants, the conductive tissues xylem and phloem are produced from stem cells in the vascular cambium, which develops from the procambium formed during early development. The vascular cylinder of the Arabidopsis root comprises a central xylem axis with a peripheral phloem pole on either side and procambial cells located between the xylem and phloem. Formation of the vascular pattern requires high auxin and cytokinin signaling domains in the xylem and phloem/procambium positions, respectively. However, the gene regulatory network acting downstream of these hormonal cues has remained unknown. I investigated procambium patterning in the Arabidopsis root. Our research group discovered that radial growth is activated in the peripheral phloem domain by six mobile DOF transcription factors that we named PHLOEM EARLY DOF (PEAR) proteins, consisting of PEAR1, PEAR2, and their four homologues. PEAR proteins form an inverse concentration gradient to the HD-ZIP III transcription factors, which inhibit periclinal cell divisions in the central domain partially by inhibiting the movement of PEAR proteins. HD-ZIP III expression is promoted by auxin in the xylem axis and inhibited by endodermis-derived mobile microRNA165/166 in the periphery. The PEAR and HD-ZIP III genes form a feedback loop in which the PEAR proteins promote HD-ZIP III transcription while the HD-ZIP IIIs inhibit PEAR transcription and protein movement. The PEAR-HD-ZIP III regulatory module decodes hormonal and microRNA signals to result in the formation of a highly active peripheral zone and a more quiescent central zone during procambium development. We also determined that a member of the DOF family, DOF2.1, acts downstream of TARGET OF MONOPTEROS 5/LONESOME HIGHWAY-dependent cytokinin biosynthesis to regulate periclinal cell divisions in the outer procambial cells in contact with the xylem axis. Together, PEAR and DOF2.1 proteins control all of the periclinal divisions in the procambium through their activity in partially distinct domains. We also identified SUPPRESSOR OF MAX2 1-LIKE 3 (SMXL3), a member of SMXL subclade 2 which is expressed in the early phloem and procambium cells, as a putative direct target of PEAR2 that is sufficient to promote periclinal divisions. Characterization of SMXL subclade 2 identified SMXL3, 4 and 5 as essential regulators of phloem formation that act very early in development and thus are required for all aspects of phloem development. Phloem specification requires periclinal divisions in the procambium. SMXL3, 4 and 5 act in both the periclinal divisions and phloem specification in a partially redundant manner. Furthermore, analysis of regulators downstream of the PEARs revealed that they not only promote cell proliferation but also specify the identity of the surrounding cells non-cell autonomously, including procambial and phloem pole pericycle identity. Our work highlights the importance of cell-to-cell communication in plant development. The interaction of mobile hormones, transcription factors and microRNAs originating from different tissues is required to coordinate developmental processes in the vascular cylinder. We have assembled the most complete understanding to date of the regulatory network coordinating procambial development and have identified the protophloem sieve elements as the organizers of radial growth during the early stages of vascular development in the Arabidopsis root. These findings can potentially be used to increase yields in forestry and agriculture. Kasvien johtosolukko kuljettaa vettä, ravinteita ja viestimolekyylejä, sekä toimii tukirakenteena, joka tuottaa suurimman osan kasvin paksuuskasvusta solun pitkittäisen akselin suuntaistesti tapahtuvien ns. periklinaalisten solunjakautumisten avulla. Näiden ominaisuuksien ansiosta kasvit pystyivät siirtymään maalle ja kasvamaan kooltaan suuremmiksi, minkä seurauksena elämä maanpäällä muuttui täysin. Täysikasvuisilla kasveilla johtosolukon puu- ja nilasolut kehittyvät kantasoluja sisältävästä jällestä, jota edeltää varhaisen kasvuvaiheen esijälsi. Arabidopsis thalianan eli lituruohon keskuslieriössä puu- eli ksyleemisolut muodostavat akselin keskelle, nilasolut ovat molempien puolien reunoilla ja esijällen solut sijaitsevat näiden välissä. Korkea auksiinipitoisuus ksyleemissä ja korkea sytokiniinipitoisuus nilassa ja esijällessä tarvitaan johtosolukon normaaliin kehitykseen. Näiden hormonaalisten viestien ohjaama geeninsäätelyverkosto on ollut kuitenkin tuntematon. Tutkin esijällen muodostumista lituruohon juuressa. Tutkimusryhmämme havaitsi paksuuskasvun aktivoituvan keskuslieriön reunoilla olevissa varhaisen vaiheen nilan siiviläsoluissa ja tietyissä niitä ympäröivissä soluissa. Määritimme että näiden solujen jakautumisesta on vastuussa kuuden liikkuvan DOF-transkriptiotekijän perhe, jolle me annoimme nimeksi PHLOEM EARLY DOF (PEAR). Nämä koostuvat PEAR1 ja PEAR2 proteiineista ja niiden neljästä homologista. PEAR proteiinit muodostavat vastakkaisen pitoisuusgradientin ennestään tunnettujen HZ-ZIP III transkriptiotekijöiden kanssa. HD-ZIP III proteiinit estävät periklinaalisia solunjakautumisia keskuslieriön keskiosassa osittain estämällä PEAR proteiinien liikkumista. Auksiini edistää HD-ZIP III:n ilmenemistä keskuslieriön keskellä sijaitsevissa ksyleemisoluissa, kun taas keskuslieriön ulkopuolelta liikkuva mikroRNA165/166 heikentää HD-ZIP III:n ilmenemistä sen reunoilla. PEAR ja HD-ZIP III muodostavat takaisinkytkentämekanismin: PEAR lisää HD-ZIP III:n ilmenemistä, kun taas HD-ZIP III estää PEAR geenien ilmenemistä ja PEAR proteiinin liikkumista. PEAR-HDZIP III säätelymoduuli tulkitsee hormonaalisia ja mikroRNA signaaleja minkä seurauksena esijälteen muodostuvat aktiivisesti jakautuva reuna-alue ja hiljainen keskialue. Osoitimme myös, että TARGET OF MONOPTEROS 5/LONESOME HIGHWAY transkriptiotekijäparin aktivoima sytokiniinin biosynteesi aktivoi DOF perheeseen kuuluvan DOF2.1 geenin ilmenemistä. DOF2.1 säätelee periklinaalisia solujakautumisia ksyleemin viereisissä reuna- alueen esijälsisoluissa. Osittain eri alueilla toimivat PEAR ja DOF2.1 proteiinit säätelevät kaikkia esijällen periklinaalisia solunjakautumisia. Tutkimuksessamme havaitsimme, että PEAR2 aktivoi SUPPRESSOR OF MAX2 1-LIKE (SMXL) proteiinien toiseen alaluokkaan kuuluvan SMXL3 geenin ilmenemistä. SMXL3 toimii varhaisen vaiheen nilan ja esijällen soluissa ja on riittävä aktivoimaan periklinaalisia solunjakautumisia. SMXL proteiinien toisen alaluokan jäsenet SMXL3, 4 ja 5 säätelevät lisäksi nilan kehitystä. Ne toimivat jo kehityksen varhaisessa vaiheessa ja täten ovat tarpeellisia kaikkiin nilan kehitysvaiheisiin. Esijällen periklinaaliset solunjakautumiset ovat tärkeä osa nilan kehitystä. Tutkimuksemme osoittaa, että SMXL3, 4 ja 5 toimivat sekä solunjakautumisten että erilaistumisen säätelyssä osittain päällekkäisesti. PEAR proteiinien säätelykohteiden analyysi myös paljasti, että PEAR proteiinit toimivat sekä solunjakautumisten säätelyssä että ympäröivien solujen, kuten esijällen ja nilan viereisten perisyklisolujen, identiteetin määrittämisessä liikkumalla solusta toiseen. Tuloksemme korostavat solujenvälisen viestinnän tärkeyttä: eri solukoista peräisin olevien liikkuvien kasvihormonien, säätelytekijöiden ja mikroRNA-molekyylien vuorovaikutus tarvitaan ohjaamaan kehitystä. Työmme luo tähän mennessä kattavimman ymmärtämyksen säätelyverkostoista, jotka ohjaavat esijällen kehitystä ja osoittaa varhaisen vaiheen nilan siiviläsolujen järjestävän paksuuskasvun aktivoinnin lituruohon juuren johtosolukon varhaisessa kehityksessä. Näitä löydöksiä voidaan mahdollisesti hyödyntää maa- ja metsätaloudessa lisäämään tuotantoa.

The objective of this thesis was to facilitate molecular detection and treatment of acute myeloid leukemia (AML) patients with recurrent t(5;11)(q35;p15.4) translocation, which joins nucleoporin 98 (NUP98) and nuclear receptor binding SET-domain protein 1 (NSD1) genes together. These patients suffer from a malignant disease with highly unfavorable prognosis and no evidence regarding efficient therapeutic options. In study I, we investigated NUP98-NSD1 transcript variants from AML patients with t(5;11) to facilitate its molecular detection from newly diagnosed AML patients and post-treatment samples. We focused on this topic since, comparably to many AML-defining translocations, the detection of t(5;11) relies on accurate molecular screening methods. This translocation cannot be captured using conventional cytogenetic methods (G-banding) due to its subtelomeric localization and small size. Moreover, potential for alternative fusion transcripts may complicate detection and quantification of NUP98-NSD1. In this study, we discovered three chimeric NUP98-NSD1 transcripts from an index patient, which were later validated from two additional patients. The transcripts harbored two alternative fusion junctions joining NUP98 exon 11 as well as exon 12 to NSD1 exon 6, alternative 5’ donor site of NUP98 exon 7, and skipping of NSD1 exon 7. Intriguingly, residual levels of the previously unknown fusion gene between NUP98 exon 11 and NSD1 exon 6 was found to increase in two patients during disease progression. In study II, our aim was to identify novel, more efficient, and less toxic small-molecule inhibitors for the treatment of NUP98-NSD1+ AML using high-throughput drug sensitivity and resistance testing together with RNA sequencing. By screening over 300 anti-cancer drugs on patient cells and experimentally generated mouse cell models, we found that multikinase inhibitor dasatinib and pan-BCL-2 inhibitor navitoclax effectively and specifically target BM MNCs expressing NUP98-NSD1 and FLT3-ITD. In combinatorial drug screens, strong synergistic interactions were found between dasatinib and navitoclax. Gene expression analysis revealed up-regulation of genes encoding for targets of dasatinib and navitoclax, LCK, FGR, and BCL2A1. Furthermore, we discovered that NUP98-NSD1+/FLT3-ITD+ BM MNCs are highly resistant to topoisomerase II inhibitors such as mitoxantrone. It remains to be investigated whether replacing topoisomerase II inhibitors with dasatinib and navitoclax in AML induction therapy could lead to improvements in long-term survival in patients with NUP98-NSD1 and concomitant FLT3-ITD. Akuutti myelooinen leukemia (AML) on veritauti, joka aiheutuu erilaistumattomien myeloidilinjan kantasolujen hallitsemattomasta jakaantumisesta luuytimessä. Potilaiden hoitovasteissa ja kliinisessä taudinkuvassa on suurta vaihtelua johtuen geneettisestä heterogeenisyydestä. Taudin taustalla on useita geenimuutoksia, joita voidaan hyödyntää prognostisessa luokittelussa, jäännöstautianalyysissa sekä hoitopäätöksien teossa. Yksi näistä muutoksista on translokaatio t(5;11)(q35;p15.4)/NUP98-NSD1, joka löytyy noin 2%:lla aikuisista ja 16%:lla lapsista joilla on sytogeneettisesti normaali AML. Heistä jopa 90% kantaa FLT3-ITD mutaatiota ennustaen huonoa kemoterapiavastetta yhdessä NUP98-NSD1:n kanssa. Mekanistisesti NUP98-NSD1 pysäyttää solujen erilaistumisen estämällä HOX-AB geenien hiljentämisen. Subtelomeerialueen sijainnista johtuen t(5;11) translokaatiota ei voida tunnistaa rutiini sytogenetiikalla. Ensimmäisessä osaprojektissa pyrimme edistämään t(5;11):n molekyylitason monitorointia tutkimalla NUP98-NSD1:n RNA-juosteita. Löysimme indeksipotilaalta kolme erilaista NUP98-NSD1 juostetta, jotka sisälsivät fuusion NUP98 eksoni 12 ja NSD1 eksoni 6:n välillä sekä aiemmin AML:ssä tuntemattoman fuusion NUP98 eksoni 11 ja NSD1 eksoni 6:n välillä. Lisäksi löysimme uusia vaihtoehtoisesti silmukoituja alueita molemmista geeneistä. Löydetyt variantit löytyivät jatkoanalyysissä kaikilta t(5;11)+ AML-potilailta. NUP98 eksoni 11 ja NSD1 eksoni 6 liittävän juosteen suhteellinen osuus lisääntyi kahdella potilaalla taudin edetessä. Tulostemme perusteella harvinaisemman juosteen tunnistavien alukkeiden lisääminen diagnostisiin testeihin voisi edistää t(5;11) translokaation tunnistamista ja jäännöstautianalyysin tarkkuutta. Toisessa osaprojektissa päämääränä oli löytää tehokkaampia lääkkeitä NUP98-NSD1+ potilaille analysoimalla yli 300 syöpälääkkeen vaikutuksia ja niihin mahdollisesti liittyviä geeniekspressio muutoksia potilaiden ja terveiden luovuttajien luuydinsoluissa sekä kokeellisissa solumalleissa. Löysimme, että tyrosiinikinaasiestäjä dasatinib ja BCL-2 estäjä navitoklaksi tuhoaa täsmällisesti NUP98-NSD1+/FLT3-ITD+ syöpäsoluja yksin sekä yhdessä. Lääkeyhdistelmäkokeissa dasatinibin ja navitoklaksi väliltä löydettiin myös suuria synergia-arvoja. NUP98-NSD1+/FLT3-ITD+ AML solut yli-ilmensivät dasatinibin ja navitoklaksin kohdemolekyylejä LCK, FGR ja BCL2A1. Lisäksi löysimme, että NUP98-NSD1+/FLT3-ITD+ AML-solut ovat resistenttejä topoisomeraasi II estäjille. Löytöjen perusteella näiden potilaiden induktiossa topoisomeraasi II estäjien korvaaminen täsmälääkkeillä kuten dasatinib tai navitoklaksi voisi edistää hoitoennustetta.

Cancer is a leading cause of death worldwide, and its incidence is increasing due to modern lifestyle that prolonged human life. All cancers originate from a single cell that had acquired genetic aberrations enabling uncontrolled proliferation. Each cancer is unique in its aberrant genetic makeup, which defines, to large extent, its biology, aggressiveness, and vulnerabilities to different treatments. Furthermore, the genetic makeup of each cancer is heterogeneous among its constituent cancer cells, and dynamic with the ability to evolve in order to preserve the survival of cancer cells. Sequencing technologies are currently producing massive amounts of data that, with the help of specialized computational methods, can revolutionize our knowledge on cancer. A key question in cancer research is how to personalize the treatment of cancer patients, so that each cancer is treated according to its molecular characteristics. The first study in this thesis takes a step in that direction through a proposed novel molecular classification system of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), which is the most common hematological malignancy in adults. The suggested classification, derived from the integrative analysis of gene expression and DNA mutations, stratifies DLBCL into four groups with distinct biology, genetic landscapes, and clinical outcome. These subtypes could help identify patients at high risk who may benefit from an altered treatment plan. Understanding the genomic evolution of cancer that transforms a typically curable primary tumor into an incurable drug-resistant metastasis is another aspect of cancer research under intensive investigation. The second study in this thesis investigates the spreading patterns of metastasis in breast cancer, which is the most common cancer in women. Using phylogenetic analysis of somatic mutations from longitudinal breast cancer samples, the metastasis routes were uncovered. The study revealed that breast cancer spreads either in parallel from primary tumor to multiple distant sites, or linearly from primary tumor to a distant site, and then from that to another. However, in all cases, axillary lymph nodes did not mediate the spreading to distant sites. This provided a genetic-based evidence on the redundancy of lymph node dissection in breast cancer management. Towards a genetic-based diagnostics in cancer, the computational methods used to detect genetic aberrations need to be evaluated for their accuracy. The third study in this thesis performs a comparison of methods for detecting somatic copy number alterations from cancer samples. The study evaluated several commonly used methods for two different sequencing platforms using simulated and real cancer data. The results provided an overview of the weaknesses of the different methods that could be methodologically improved. Altogether, this thesis gives an overview on the field of computational cancer genomics and presents three studies that exemplify the clinical relevance of computational research. Not available

Cancer is one of the world’s most lethal diseases. Although our understanding of this disease is expanding continuously, treatments for many types of cancers are still ineffective. The main reason for the high mortality of cancer patients is resistant to therapy. Since resistance to therapy is a complex and dynamical process, an interdisciplinary approach is necessary to understand it. The emergence of a new field called integrative mathematical oncology can tackle many urgent clinical problems in the treatment of cancer that are impossible to address using, for example, an in vitro or in vivo approach. The primary goal of this new field is to translate the biological complexity of a tumor into a precise language, such as mathematical formulas, and to perform model simulations. Therefore, integrative mathematical oncology allows for biological experiments to be performed inexpensively and rapidly. This thesis applies the integrative mathematical oncology approach to investigate resistance to treatment in solid tumors at the molecular and cellular levels. A mathematical model of the most commonly dysregulated pathway in cancer (the p53 signaling pathway) underwent a bifurcation analysis to investigate the possibility of restoring its proper dynamics in two types of cancer: osteosarcoma and breast cancer. Next, a stochastic model of resistance to platinum compounds was developed to improve our understanding of chemo-resistance to this group of drugs in advanced high-grade serous ovarian cancer (HGSOC). Finally, virtual clinical trial simulations (VCTS) were performed to identify a novel drug combination in ovarian cancer. The application of integrative mathematical oncology deepened our understanding of radio- and chemo-resistance in solid tumors. Firstly, the results from the bifurcation analysis of the p53 signaling pathway suggested silencing Mdm2 using siRNA to overcome radio-resistance in breast cancer and osteosarcoma. Next, the stochastic model of platinum resistance was utilized to answer two urgent clinical questions about ovarian cancer: i) how many platinum resistance mechanisms are active at diagnosis, and ii) how many drug-resistance mechanisms must be targeted to improve patient outcomes. Finally, the clinical trial simulations suggested a novel drug combination to overcome platinum resistance in advanced high-grade serous ovarian cancer. Rak jest jedną z najbardziej śmiertelnych chorób na świecie. Pomimo tego, że wiedza na temat tej choroby jest ciągle rozwijana, terapia w przypadku wielu typów nowotworów jest nieefektywna.Głównym powodem wysokiej śmiertelności pacjentów chorych na raka jest oporność na terapię. Jakoże oporność na terapię jest skomplikowanym i dynamicznym procesem, interdyscyplinarne podejście jest niezbędne do jego zrozumienia. Pojawienie się nowej dziedziny zwanej zintegrowaną matematyką onkologiczną jest w stanie rozwiązać wiele palących problemów klinicznych, które są niemożliwe do rozwiązania przy użyciu \textit{in vitro} lub \textit{in vivo}. Głównym celem tej nowej dziedziny jest przetlumaczenie biologicznej złożoności nowotworów na precyzyjny język, taki jak formuły matematyczne, i wykonanie symulacji modelów. Dlatego zintegrowana onkologia matematyczna umożliwia wykonanie eksperymentów biologicznych szybko oraz bez dużych nakładów finansowych. W tej pracy, podejście matematyki onkologicznej zostało wykorzystane do zrozumienia oporności zbitych nowotworów na leczenie na dwóch skalach: molekularnej i komórkowej. Najpierw, model matematyczny najbardziej rozregulowanej ścieżki sygnałowej w raku (ścieżce sygnałowej p53) został poddany analizie bifurkacji celem zbadania możliwości przywrócenia prawidłowej dynamiki tej ścieżki sygnałowej w dwóch nowotworach: kostniakomiessakach i nowotworach piersi. Następnie, stochastyczny model lekooporności na platynę został wykonany celem zrozumienia mechanizmów lekoopornosci na platynę w zaawansowanym surowiczym raku jajnika. Na koniec, virtualne symulacje prób klinicznych zostały wykonane celem zidentyfikowania nowych kombinacji leków w raku jajnika Zasosowanie zintegriwanej matematyki onkologicznej pogłębiło naszą wiedzę o opornosci na radio- i chemo-terapię w nowotworach zbitych. Najpierw, wyniki z analizy bifurkacyjnej ścieżki sygnałowej p53 proponuje wyciszenie Mdm2 przy użyciu siRNA celem pokonania radiooporności w raku piersi i kostniakomięsaku. Następnie, stochastyczny model opornosci na platynę został wykożystany celem odpowiedzi na dwa pilne pytania kliniczne: i) ile mechanizmów oporności na platynę jest aktywnych podczas diagnozy i ii) ile mechanizmów lekoopornosci na platynę nalezy celować celem poprawy przeżywalności. Na koniec, symulacje prób klinicznych sugerują nową kombinację leków celem pokonania lekooporności na platynę w surowiczym raku jajnika.

Nearly all eukaryotic processes are regulated by cyclic phosphorylation-dephosphorylation of cellular signaling proteins, catalyzed by protein kinases and phosphatases, respectively. Until now, the kinases dominated the scientific research, however, in recent years only, the protein phosphatases have emerged as crucial regulators for setting up the levels and amplitude of phosphorylation-driven signaling events. Nevertheless, our molecular and biological awareness of these enzymes is still poor. This thesis aims to gather information on these vital aspects of phosphatase biology. Through our high-throughput systematic affinity-purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) approach, we provide the first glimpse on the cellular protein protein interactions and functional networks of human protein phosphatases from three broad families: phosphoprotein phosphatase, metal-dependent phosphatase, and protein tyrosine phosphatase. Next, we obtained the comprehensive view on their enzymatic structure-activity relationship by utilizing inhibitor Okadaic acid, revealing the effect of catalytic disruption on the phosphatase interaction profile and on the phosphorylation status of their various sub-complex components. From here, we expanded the thesis by investigating the functional relevance of unique phosphates-kinase interaction in the context of specific signaling. From dephosphorylation and luciferase assays we established the role of PTPRA phosphatase in negatively regulating RET kinase activities and its down-stream Ras-MAPK pathway, showing RET as novel PTPRA substrate. By including RET cancer mutants- MEN2A and MEN2B, we, further, shed light on the tumor suppressor functions of PTPRA in human cancers. Taken together, this thesis not only provides a global landscape of human protein phosphatase complexes and their functions but also furnish a reliable resource for futuristic investigations. Lähes kaikkia eukaryoottisia prosesseja säätelee proteiinikinaasien ja fosfataasien katalysoimien solusignalointiproteiinien syklinen fosforylaatio-defosforylaatio. Tähän saakka kinaasit hallitsivat tieteellistä tutkimusta, mutta vain viime vuosina proteiinifosfataasit ovat kehittyneet keskeisinä säätäjinä fosforylaation ohjaamien signalointitapahtumien tasojen ja amplitudin määrittämiseksi. Näiden entsyymien molekyyli- ja biologinen tietoisuus on kuitenkin edelleen huono. Opinnäytetyön tavoitteena on kerätä tietoa näistä tärkeistä fosfataasibiologian näkökohdista. Suuritehoisen systemaattisen affiniteettipuhdistuksemme, joka on yhdistetty massaspektrometriaan (AP-MS), avulla tarjoamme ensimmäisen katseemme soluvalkuaisproteiinien vuorovaikutuksiin ja ihmisen proteiinifosfataasien toiminnallisiin verkkoihin kolmesta laajasta perheestä: fosfoproteiinifosfataasi, metallipohjainen fosfataasi ja proteiinityrosiinifosfataasi. Seuraavaksi saimme kattavan kuvan niiden entsymaattisesta rakenteen ja aktiivisuuden suhteesta käyttämällä inhibiittoria Okadaic-happoa, paljastamalla katalyyttisen häiriön vaikutuksen fosfataasi-vuorovaikutuksen profiiliin ja niiden eri kompleksikomponenttien fosforylaatiotilaan. Tästä lähtien laajensimme opinnäytetyötä tutkimalla ainutlaatuisen fosfaatti-kinaasivuorovaikutuksen toiminnallista merkitystä tietyn signaloinnin yhteydessä. Defosforylaatio- ja lusiferaasimäärityksistä totesimme PTPRA-fosfataasin roolin RET-kinaasiaktiivisuuden negatiivisessa säätelyssä ja sen alaspäin virtaavassa Ras-MAPK-reitissä, mikä osoittaa RET: n uutena PTPRA-substraattina. Mukaan lukien RET-syöpämutantit - MEN2A ja MEN2B, valaisimme lisäksi PTPRA: n tuumorisuppressorifunktioita ihmisen syövissä. Yhteenvetona tämä väitöskirja tarjoaa paitsi ihmisen proteiinifosfataasikompleksien globaalin maiseman ja niiden toiminnot, myös tarjoaa luotettavan resurssin futuristisille tutkimuksille.

Actin is best-known from its functions in the cytoplasm, where it is a key component of the cytoskeleton. Nevertheless, functions of actin are not restricted to the cytoplasm, since actin is also present in the nucleus, where it has been linked to multiple functions from gene activation to chromatin remodeling. However, molecular mechanisms by which actin operates in the nucleus are still poorly understood. This is mainly because of the lack of well-characterized binding partners for nuclear actin. Therefore, the aim of this thesis was to identify and characterize novel nuclear actin-binding partners and elucidate the molecular mechanisms behind actin regulated transcription factors. To identify nuclear actin-binding partners, we used two complementary mass spectrometry (MS) techniques, affinity purification combined with MS (AP-MS) and proximity dependent biotin identification with MS (BioID). Analysis of our interactome data revealed that actin can form stable complexes with proteins related to chromatin remodeling but seems to function in a dynamic fashion in other nuclear processes, such as transcription and DNA replication. In our experimental setup actin seemed to be monomeric when it associated with nuclear complexes. We also discovered a novel actin-containing complex, human Ada-Two-A-containing complex (hATAC). HATAC is a histone modifying complex and actin directly binds one of it subunits, lysine acetyltransferase 14 (KAT14). We showed that actin-binding modulates histone acetyl transferase (HAT) activity of KAT14 in vitro and in cells. Our interactome data also indicated that actin could be involved in RNA splicing and mRNA processing. Further experiments showed, for the first time, that actin has a functional role in mRNA splicing, as alterations in nuclear actin levels disturbed survival motor neuron protein 2 (SMN2) alternative exon skipping. In addition, the nuclear actin interactome analysis provided new insights into nuclear processes already earlier linked to actin, such as chromatin remodeling, transcription and DNA replication, and hence this work provides a protein interaction platform for further mechanistic studies of nuclear actin-dependent functions. One well-known protein, which is known to bind nuclear actin and to regulate transcription is myocardin-related transcription factor A (MRTF-A), a co-activator of serum response factor (SRF). MRTF-A has a RPEL domain, which can regulate the localization and activity of MRTF-A in response to actin dynamics. Interestingly, also phosphatase and actin regulator (Phactr) protein family contains RPEL domain and binds protein phosphatase 1 (PP1). The molecular properties of MRTF-A intrigued us to study if the Phactr-proteins could be putative binding partners of nuclear actin. We revealed that the RPEL domain of Phactr4 do not regulate the subcellular localization of Phactr4. Instead, Phactr4 controls the activity of PP1 in response to actin monomer levels in the cytoplasm, thereby creating a feedback loop that maintains actin homeostasis in cells. In addition, we were able to show that MRTF-A subcellular localization is not solely dependent on actin, since DDX19, an ATP-dependent RNA helicase, can regulate nuclear import of full-length MRTF-A independently of actin dynamics. This thesis work has thereby broadened the knowledge of nuclear actin-binding partners as well as revealed novel regulatory properties of actin-regulated RPEL domain containing proteins. Tuma säätelee solun toimintaa ilmentämällä eri geenejä eri aikaan. Aktiinilla on tumassa tärkeä tehtävä geenien ilmentymisen säätelijänä. Aktiini tunnetaan paremmin tuman ulkopuolella, jossa se toimii osana solun tukirankaa ja vaikuttaa solun liikkumiseen. Aktiinin on todettu vaikuttavan geenien ilmentymiseen sekä suoraan (sitoutumalla RNA-polymeraasiin) että välillisesti (sitoutumalla erilaisiin transkriptiota sääteleviin proteiineihin). Vaikka aktiinin merkitys soluntukirangassa tunnetaan varsin hyvin, ja tutkimuksissa on löydetty kymmeniä aktiinin kanssa vuorovaikuttavia proteiineja, tuman aktiinin kanssa suorasti vuorovaikuttavia proteiineja tiedetään varsin vähän. Myös suorat todisteet tuman aktiinin molekulaarisista mekanismeista monien tuman tehtävien osalta puuttuvat. Tässä tutkimuksessa on kartoitettu uusia tuman aktiinin kanssa vuorovaikuttavia proteiineja massaspektrometriaan perustuvilla menetelmillä (AP-MS ja BioID). Tutkimuksemme osoittivat, että aktiini sitoutuu tuman komplekseihin monomeerina ja lisäksi se sitoutuu stabiilimmin kromatiininmuokkauskomplekseihin, mutta vain hetkellisesti transkriptioon ja DNA:n kahdentumiseen liittyviin proteiinikomplekseihin. Löysimme myös hATAC-proteiinikompleksin, jonka nyt osoitamme ensimmäistä kertaa sitoutuvan aktiiniin. HATAC tehtävänä on asetyloida histoneita ja tuloksemme osoittivat, että aktiini sitoutuu hATAC-kompleksin KAT14 alayksikköön ja säätelee KAT14:n histoniasetyylitransferaasi (HAT) aktiivisuutta in vitro ja in vivo. BioID:n avulla havaitsimme aktiinin vuorovaikuttavan dynaamisesti monien RNA:n silmukointiin liittyvien proteiinien kanssa. Tutkimuksemme osoittivat, että muutokset tuman aktiinin määrissä vaikuttavat SMN2 minigeenin vaihtoehtoiseen RNA:n silmukointiin. Täten osoitamme, ensimmäistä kertaa, että tuman aktiini on mukana RNA:n silmukoinnin säätelyssä. Uusien vuorovaikuttavien proteiininen löytäminen mahdollistaa perusteellisen molekulaaristen mekanismien tutkimisen tehtävissä, joihin tuman aktiini on aiemmin liitetty. Lisäksi väitöskirjatyössä on tutkittu, miten aktiini säätelee proteiineja, joilla on aktiini-monomeereja sitova RPEL domeeni. Parhaiten tunnettu, RPEL-domeenin sisältävä proteiini, on MRTF-A, joka on seerumi responsiivisen faktorin (SRF:n) koaktivaattori. Vasteena aktiinin polymerisaatiolle MRTF-A kulkeutuu solulimasta tumaan, jossa se yhdessä SRF:n kanssa aktivoi kohdegeenien transkriptiota. Toinen proteiiniperhe, joilla on RPEL-domeeni, on phosphatase and actin regulator (Phactr) proteiiniperhe. Näiden proteiinien on myös todettu sitoutuvat Protein Phosphatase 1 (PP1) proteiiniin. Tutkiessamme Phactr4 proteiinin RPEL-domeenin merkitystä ja havaitsimme, että Phactr4 aktivoi PP1 proteiinia aktiinivälitteisesti. Aktivoitunut PP1 proteiini säätelee paikallisesti aktiini-säkeiden ja aktiini-monomeerien tasapainoa soluissa, aktivoimalla säikeistä aktiinia pilkkovan kofiliinin. Täten todistimme, että aktiini itse pystyy säätelemään solun aktiini-säkeiden ja aktiini-monomeerien tasoja Phactr4:n RPEL-domeenin kautta. Lisäksi osoitimme, että aktiini ei yksinään säätele MRTF-A:n tumakuljetusta, sillä RNA helikaasi, DDX19, pystyy säätelemään MRTF-A:n tumakuljetusta aktiinin polymerisaatiosta riippumatta. Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimukseni on selkiyttänyt aktiini roolia tumassa kartoittamalla uusia, aktiinin kanssa vuorovaikuttavia proteiineja tuman sisällä. Tämän lisäksi olen työssäni löytänyt uusia säätelymekanismeja proteiineille, jotka sisältävät aktiini-monomeereja sitovan RPEL-domeenin.

The lacrimal apparatus products the tear film protecting the eye surface. The lacrimal gland, located in the orbit, produces 80% of the tear film components. These include growth factors destined to the avascular cornea, necessary for corneal epithelium maturation and renewal. A defective tear film leads to dry eye diseases which affect an increasing percentage of the population (more than 35% in the elderly). Although dry eye diseases can lead to visual loss in extreme cases, no definitive treatment has been developed so far. My thesis work focused on unravelling lacrimal gland early development, postnatal maturation and subsequent function in mouse models. I notably used a dry eye disease mouse model to study the implication of Ectodysplasin (Eda) pathway in lacrimal gland development, maturation, function, as well as in the cornea/lacrimal gland feedback loop during corneal healing process. In addition of improving the general knowledge on lacrimal gland biology, my work gave some insights on the dry eye phenotype associated to Ectodysplasin loss-of-function mutation and on the resulting defective cornea wound healing. Silmän kostutusjärjestelmä tuottaa kyynelnestettä, joka muodostaa suojaavan kalvon silmän pintaan. Kyynelrauhanen tuottaa 80 prosenttia kyynelnesteen komponenteista. Näihin lukeutuvat kasvutekijät, jotka ovat välttämättömiä sarveiskalvon kehitykselle ja uusiutumiselle. Viallinen kyynelkalvo aiheuttaa kuivasilmäisyyttä, josta kärsii yhä suurempi osa väestöstä (yli 35 % ikääntyneistä). Äärimmillään kuivasilmäisyys johtaa näönmenetykseen, mutta parantavaa hoitoa ei ole kyetty kehittämään. Väitöskirjatyössäni tutkittiin kyynelrauhasen kehitystä ja toimintaa eri hiirimalleissa. Näihin lukeutuu hiirilinja, jossa ektodysplasiini-geenin (Eda) toiminta on estynyt ja eläimellä on kuivat silmät. Mutanttilinjan avulla selvitin Eda-signaalinvälitysreitin vaikutusta sarveiskalvon ja kyynelrauhasen välisessä vuorovaikutuksessa sarveiskalvon paranemisprosessin aikana. Tutkimukseni lisäsi tietämystä kyynelrauhasen biologiasta. Lisäksi se antoi uusia näkökulmia Eda-puutoksesta johtuvaan kuivasilmäisyyteen ja heikentyneeseen sarveiskalvon haavan paranemiseen.

The turtle carapace has been considered one of the classic examples of an evolutionary novelty. It is diagnostic of the turtle clade and probably largely responsible for its success in evolution. In more detail, it consists of ossified dermal plates overlaying laterally extended ribs, as well as a regular array of epidermal scutes. Interestingly, the unique and complex mosaic pattern formed by the carapacial scutes is highly conserved amongst almost all extant turtle taxa. Since the morphogenesis of this remarkable pattern has not been studied much before, I present, in this dissertation, a novel computational approach to elucidating carapacial scute development. In a mathematical model, a combination of two mechanistically different reaction-diffusion systems together with growth reproduces scute formation in the carapace. In order to disentangle the underlying gene regulatory network, we disturb carapace development experimentally in embryos of Trachemys scripta and use the model to understand the resulting phenotypes. We show how the carapacial ridge acts as a signaling center which is required for the onset of scute development. Furthermore, the model suggests how phenotypic differences between species might arise and explains, in line with statistical data from different turtle species, how environmental stress, rather than genetic mutations, leads to the very specific patterns of variation found within turtle populations. Thus, our results suggest that environmental stress might be an underrated source of phenotypic variation within species. Developmental insight helps us understand why this particular variation occurs and at what frequencies. In order to further understand how environmental factors might interfere with development and to be able to account for more realistic tissue growth and biomechanics, I present a more general multiscale model of animal development that integrates biomechanics, GRN dynamics and cell behaviours in different, interacting cell types and tissues. Thus, this model does not only allow an advancement of our understanding of mechanisms by which phenotypic variation in the developing turtle scute might be generated, it is also a useful tool to understand more general features of development and variation. Finally, I discuss my work in the context of previous hypotheses about the origins of turtle scutes as well as their variation. By a comparison with the development of other ectodermal organs in different vertebrates, I try to integrate turtle scutes into a wider evolutionary background. Kilpikonnan selkää peittävää kilpeä on pidetty klassisena esimerkkinä evoluutiivisesta innovaatiosta. Kilpi on kilpikonnien lahkolle tyypillinen piirre ja yksi todennäköinen syy kilpikonnien evolutiiviselle menestykselle. Kilpikonnan kilpi koostuu luutuneista dermaalilevyistä jotka sijaitsevat lateraalisesti pidentyneiden kylkiluiden päällä. Kilven pintaa peittävät epidermaaliset kilpisuomut (carapacial scute) jotka muodostavat evolutiivisesti konservoituneen kuvion kilven pinnalle. Kilpisuomujen kuvion kehitysbiologista syntymekanismia ei juurikaan ole tutkittu aiemmin. Tässä väitöskirjassa esittelen matemaattisen mallin jonka avulla voidaan tarkastella kilpisuomujen muodostaman kuvion syntyä yksilönkehityksen aikana. Mallissa kaksi erillistä reaktio-diffuusiomekanismia yhdistettynä kasvuun saavat aikaan todenmukaisen kilpisuomukuvion. Työn kokeellisessa osassa manipuloimme kilpisuomujen kehitystä punakorvakilpikonnan (Trachemys scripta) alkioilla ja tulkitsimme syntyneitä ilmiasuja matemaattisen mallin avulla. Tulokset osoittavat että kehittyvän kilven reunoilla sijaitseva kilpiharjanne toimii signalointikeskuksena joka vaaditaan kilpisuomujen kehityksen käynnistymiselle. Malli ennustaa kuinka erilaiset kilpisuomukuviot voivat syntyä ja että luonnossa tavattavat ilmiasut ovat todennäköisesti seurausta ympäristön stressitekijöistä geneettisten muutosten sijaan. Tulosten perusteella näyttääkin siltä, että ympäristölähtöinen stressi voi olla aliarvostettu tekijä luonnossa esiintyvän ilmiasumuuntelun synnyssä. Laajempi ymmärrys kehitysbiologisista mekanismeista voi edelleen lisätä ymmärrystämme siitä miksi muuntelu on juuri havaitunlaista. Ymmärtääkseni ympäristötekijöiden vaikutusta yksilönkehitykseen laajemmin esittelen myös matemaattisen mallin joka yhdistää biomekaaniset ominaisuudet, geenisäätelyverkostojen dynamiikan sekä solujen toiminnan erilaisissa kudoksissa ja solutyypeissä. Tämä malli ei rajoitu pelkästään kilpikonnan kilpisuomukuvioiden mallintamiseen, vaan mahdollistaa yksilönkehityksen ja muuntelun tarkastelun laajemmin. Lopuksi tarkastelen tutkimukseni tuloksia aiempien kilpisuomujen synnystä ja muuntelusta esitettyjen hypoteesien valossa sekä vertaan kilpisuomujen kehitystä muiden ektodermaalisten elinten kehitykseen eri selkärankaislajeilla.

Mitochondrial diseases are the most common group of inherited metabolic disorders. The clinical symptoms of mitochondrial disease patients are highly variable, which makes both the diagnosis and the management exceptionally challenging. The molecular mechanisms of tissue-specificity and clinical variability in mitochondrial disorders are unknown. Currently, an effective pharmacological treatment and reliable single biomarkers that would sufficiently detect mitochondrial disorders are lacking. Due to the often severe neurological symptoms of mitochondrial disease patients, primary care and research often focus on the characterization and management of the neuromuscular manifestations, while the numerous and comparatively secondary metabolic complications remain neglected. Obesity and diabetes, for example, are common among certain mitochondrial disease groups, and therefore the contribution of mitochondrial dysfunction in metabolically active tissues is needed in mitochondrial medicine. In the first part of this thesis, the aim was to study the role of mitochondria in adipose tissue in mitochondrial disease and in acquired obesity. The metabolic and molecular consequences of mitochondrial dysfunction were analysed in 26 mitochondrial disease patients with different types of causative mutations and compared to 30 age-matched controls. The study revealed that patients with recessive mutations in mitochondrial DNA polymerase (mitochondrial recessive ataxia syndrome, MIRAS) were associated with central obesity, large adipocytes, insulin resistance and metabolic syndrome, whereas patients with a primary mitochondrial DNA mutation (mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactate acidosis and stroke-like episodes, MELAS/ maternally inherited diabetes and deafness, MIDD) had diabetes, lower volume of adipose tissue and less adipocytes. The molecular analysis of adipose tissue showed a reduction of mitochondrial biogenesis and oxidative capacity in MIRAS patients, and to a lesser extend also in MELAS/MIDD patients. The effect of acquired obesity on mitochondrial function in adipose tissue was further studied in 26 rare monozygotic twins discordant for body weight. In adipose tissue of the obese co-twins, mitochondrial oxidative metabolism was reduced and associated with whole-body insulin resistance and inflammation, present already before the clinical diagnosis of diabetes and other related complications of acquired obesity. In the second part of this thesis, the aim was to study metabolic changes of mitochondrial and other muscle-manifesting disease patients, and to identify potential metabolic biomarkers for mitochondrial disease diagnostics. Targeted metabolomics analysis of blood and/or muscle samples from 25 primary mitochondrial disease patients, 16 unaffected carriers, six inclusion body myositis patients, 15 non-mitochondrial neuromuscular disease patients, and 30 age-matched controls revealed different metabolic profiles that pointed to disease-specific mechanisms of pathogenesis. Changes in metabolites of transsulfuration pathway were specific for primary mitochondrial disease and inclusion body myositis patients, whereas creatine depletion marked neuromuscular diseases, inclusion body myositis and infantile-onset spinocerebellar ataxia patients. Low blood and muscle arginine was specific for MELAS/MIDD patients. The metabolomics data showed that blood metabolic fingerprints are potential multi-biomarkers for diagnostics. By combining a minimum of four metabolites (sorbitol, alanine, cystathionine and myoinositol), we created a metabolic multi-biomarker that distinguished primary mitochondrial disorders with sensitivity of 76% and specificity of 95%. Moreover, our results suggested that detected metabolites from affected pathways could be considered and further studied as disease therapy targets. In conclusion, this thesis highlights the role of mitochondria in obesity. It reveals that different mitochondrial genetic defects provoke different consequences to systemic metabolism, leading to a disease-specific metabolic phenotype - obesity or leanness. The thesis further highlights the insufficiency of mitochondrial oxidative capacity in the adipose tissue of the obese subjects and its association with metabolic complications in acquired obesity. It also shows that targeted metabolomics analysis is a valuable tool in personalized medicine for suggesting metabolic targets for treatment and diet. Mitokondriotaudit ovat yleisin ryhmä perinnöllisiä aineenvaihduntasairauksia. Kliiniset oireet ovat kuitenkin erittäin vaihtelevat, ja tämä tekee sekä diagnostiikasta että hoidoista haastavia. Vaihtelevaoireisten mitokondriotautien molekyylimekanismit sekä tekijät kudosspesifisyyden taustalla ovat edelleen varsin tuntemattomia. Tästä syystä mitokondriotaudeille ei ole kliinisessä käytössä selkeää diagnostista biomarkkeria eikä myöskään parantavaa hoitoa ei olla pystytty kehittämään. Mitokondriotaudit ilmenevät useimmiten vakavina hermoston tai lihasten rappeumina, ja sekä diagnostiikka että hoito perustuvat näiden oireiden tunnistamaiseen ja hallintaan. Vakavat neuromuskulaariset oireet saattavat peittää alleen verrattain toissijaisia, mutta vakavia aineenvaihdunnallisia oireita ja komplikaatioita. Esimerkiksi lääketieteellistä puuttumista vaativat ylipaino ja diabetes ovat varsin yleisiä tiettyjen mitokondriotautien yhteydessä, ja tästä syystä olisi tärkeää tuntea mitokondrioiden vaikutusta kaikkien aineenvaihdunnallisesti aktiivisten kudosten toiminnassa. Tämän väitöskirjan ensimmäinen osa käsitteleekin valkoisen rasvan mitokondrioiden toimintaa sekä geneettisesti todennetuilla mitokondriotautipotilailla että terveillä ylipainoisilla henkilöillä. Ensin rasvakudoksen mitokondrioiden toimintahäiriön seurauksia tutkittiin yhteensä 26 mitokondriotautipotilaalta ja tuloksia verrattiin kolmeenkymmeneen saman ikäiseen verrokkihenkilöön. Tutkimuksessa havaittiin, että potilailla, joilla taudin aiheuttaa resessiivinen mutaatio mitokondrion DNA:ta monistavassa polymeraasientsyymissä (Mitokondriaalinen resessiivinen ataksiasyndrooma, MIRAS), havaitaan keskivartalolihavuutta, suurikokoisia rasvasoluja, insuliiniresistenssiä ja metabolista oireyhtymää. Toisaalta taas potilailla, joiden tauti aiheutuu mitokondrio-DNA:n pistemutaatiosta (Mitokondriaalinen aivotauti, lihasoireet, maitohappo-asidoosi ja aivohalvaus, MELAS/Maternaalisesti periytyvä diabetes ja kuurous, MIDD), tunnusomaista on diabetes, mutta rasvasolut ovat pienempiä ja niitä on vähemmän. Rasvakudoksen molekyylitason analyysissä havaittiin, että MIRAS-potilaiden rasvan mitokondrioiden uudistuotanto ja oksidatiivinen kapasiteetti ovat selvästi alentuneet verrattuna verrokkeihin. Sama ilmiö on havaittavissa myös MELAS/MIDD potilailla, mutta vähemmässä määrin. Toisessa osassa tutkittiin lähtökohtaisesti terveiden mitokondrioiden roolia aineenvaihdunnan komplikaatioiden taustalla. Tutkimuksessa oli mukana 13 harvinaista identtistä kaksosparia, joista toinen kaksonen on painoindeksiltään normaali ja toinen ylipainoinen. Näiden kaksosparien avulla selvisi, että ylipainoisen kaksosen rasvakudoksessa mitokondrioiden oksidatiivinen aineenvaihdunta oli vähentynyt ja lisäksi heillä havaittiin koko kehon insuliiniresistenssi ja tulehdustila. Kiinnostavinta on, että mitokndrioiden alentunut aktiivisuus ylipainoisten kaksosten rasvakudoksessa edelsi kliinistä diabetesdiagnoosia ja muita ylipainoon liitettäviä komplikaatioita. Toinen tavoite tälle väitöskirjalle oli löytää uusia biomarkkereita mitokondrioitautien parempaan diagnostiikkaan ja patofysiologisten mekanismien tunnistamiseen. Tätä varten hyödynnettiin kohdennettua metabolomiikkaa, jossa veri- ja/tai lihasnäytteet analysoitiin 25 mitokondriotautipotilaalta, 16 terveeltä mitokondriotautimutaation kantajalta, kuudelta inkluusiokappalemyosiittipotilaalta, 15 ei-mitokondriaaliselta neuromuskulaaripotilaalta sekä 30 saman ikäiseltä terveeltä verrokilta. Metabolomiikassa selvisi, että näillä taudeilla on toisistaan poikkeavat ja tunnusomaiset aineenvaihdunnalliset profiilit, joiden perusteella voidaan erotella ja ennustaa patogeneettisiä reittejä mitokondriotaudeille. Muutokset erityisesti transsulfuraatioreitillä olivat tunnusomaisia mitokondriotauti- ja inkluusiokappalemyosiittipotilaille, kun taas kreatiinin puutos osoittautui tyypilliseksi ei-mitokondriaalisille neuromuskulaarisairauksille, inkluusiokappalemyosiitille ja infantiilille spinoserebellaarille ataksialle (IOSCA). Veren ja lihaksen alhainen arginiini taas oli tunnusomainen MELAS/MIDD potilaille. Metabolomiikka-aineiston perusteella pystyimme osoittamaan, että veren profiilista on mahdollista muodostaa multi-biomarkkeriyhdistelmiä diagnostisiin tarkoituksiin. Kun yhdistetään minimissään neljän metaboliitin (sorbitoli, alaniini, cystationiini ja myoinositoli) mittaukset, saadaan 76% herkkyydellä ja 95% tarkkuudella seulottua mitokondriotaudit muista kliiniseltä kuvaltaan samankaltaisista oireyhtymistä. Lisäksi materiaalista on mahdollista löytää molekyylejä aineenvaihduntareiteiltä, joiden tiedetään muuttuvan mitokondriotaudeissa, ja joiden soveltuvuutta terapeuttisiin tarkoituksiin voidaan edelleen arvioida. Yhteen vedettynä tämä väitöskirja valottaa mitokondrioiden roolia ylipainoisuuden taustalla, ja osoittaa, että erilaiset mitokondriotautimutaatiot johtavat koko kehon laajuisiin aineenvaihdunnan muutoksiin myötävaikuttaen näin eri taudeille tyypillisen ilmiasun syntyyn, kuten esimerkiksi yli- tai alipainoisuuteen. Myös lähtökohtaisesti terveiden mitokondrioiden alentunut toimintakyky rasvakudoksessa on yhteydessä ylipainoisilla yleisesti esiintyviin aineenvaihdunnan komplikaatioihin. Tässä väitöskirjassa osoitetaan, että kohdennettu metabolomiikka on arvokas työkalu pyrittäessä kohti henkilökohtaista hoitosuunnitelmaa, jossa pyritään puuttumaa erityisten aineenvaihduntareittien puutoksiin ruokavalion ja lääkehoitojen avulla.

Primary Immunodeficiency (PIDs) categorize a broad and heterogeneous group of inborn immunity errors. Despite being generally quite rare, PIDs collectively account for consistent morbidity and mortality. Currently, more than 350 monogenic PIDs have been recognised to embody clinical phenotypes ranging from life-threatening infections to autoimmune/inflammatory diseases, allergies and/or malignancy. Many PIDs display genetic and allelic heterogeneity with an overlap of symptoms among different syndromes, often making diagnoses challenging. In the past few years, advancements in genomic technologies have revolutionised the world of genetic testing, and currently, next-generation sequencing (NGS)-based approaches are widely applied to routine genetic diagnostics of human disorders. Among the different methods, whole-exome sequencing (WES) proved highly efficient in revealing the genetic variants behind rare disorders. To further depict the genetics of PIDs, a WES-based approach was carried out, targeting the possible disease-causing variants in Finnish subjects lacking a clinical diagnosis. The cohort included patients with a clinical suspicion of immune or/and haematological disorders (n= 212). In the first study, a Finnish founder mutation in the AICDA gene was identified in patients affected by hyper-IgM syndrome type 2 (HIGM2). The disease is a primary antibody deficiency characterised by early-onset recurrent infections, autoimmunity and an absence/low levels of IgG, IgA and IgE but elevated/normal levels of IgM. The retrieved ancestral founder allele is significantly enriched in Finns compared to other European populations (38.56-fold) and has accounted for all HIGM2 cases diagnosed in Finns thus far. In the second study, biallelic ADA2 mutations that cause a deficiency of adenosine deaminase 2 (DADA2) were identified in seven PID patients, all sharing one of the causal variants, which were significantly enriched in Finns (3.31-fold). DADA2 was originally associated with systemic autoinflammation, polyarteritis nodosa-type vasculitis and mild immunodeficiency. Only a fraction of the identified DADA2 patients presented with vasculopathies. In addition, recurrent haematological manifestations are noted, and for the first time, the occurrence of lymphoproliferation is described for some of the patients, expanding the phenotypic spectrum of DADA2. Finally, novel causal variants in telomere biology disorders (TBDs)-associated genes were identified in three families with heterogeneous phenotypes that lacked the classic clinical pathognomonic signs of telomeropathies. The phenotypes ranged from mild signs of Dyskeratosis congenita (DKC) to SCID. The genetic diagnosis was confirmed by an assessment of shortened telomere lengths in patients. In addition, the spectrum of TBD-associated phenotypes was enlarged, showing variable degrees of cytopenia in some patients. This work attests to the validity of clinical WES testing to identify rare disease-causing variants despite the heterogeneous and/or atypical clinical presentations of PIDs. The achievement of a genetic diagnosis allowed for updating the spectrum of reported phenotypes as well as including atypical clinical presentations that might have otherwise remained undiagnosed. In addition, the enrichment of some rare PID-causing mutations in Finland has been depicted, highlighting the correlation of the population history with the distribution of rare deleterious variants of clinical relevance. Primary Immunodeficiency (PIDs) categorize a broad and heterogeneous group of inborn immunity errors. Despite being generally quite rare, PIDs collectively account for consistent morbidity and mortality. Currently, more than 350 monogenic PIDs have been recognised to embody clinical phenotypes ranging from life-threatening infections to autoimmune/inflammatory diseases, allergies and/or malignancy. Many PIDs display genetic and allelic heterogeneity with an overlap of symptoms among different syndromes, often making diagnoses challenging. In the past few years, advancements in genomic technologies have revolutionised the world of genetic testing, and currently, next-generation sequencing (NGS)-based approaches are widely applied to routine genetic diagnostics of human disorders. Among the different methods, whole-exome sequencing (WES) proved highly efficient in revealing the genetic variants behind rare disorders. To further depict the genetics of PIDs, a WES-based approach was carried out, targeting the possible disease-causing variants in Finnish subjects lacking a clinical diagnosis. The cohort included patients with a clinical suspicion of immune or/and haematological disorders (n= 212). In the first study, a Finnish founder mutation in the AICDA gene was identified in patients affected by hyper-IgM syndrome type 2 (HIGM2). The disease is a primary antibody deficiency characterised by early-onset recurrent infections, autoimmunity and an absence/low levels of IgG, IgA and IgE but elevated/normal levels of IgM. The retrieved ancestral founder allele is significantly enriched in Finns compared to other European populations (38.56-fold) and has accounted for all HIGM2 cases diagnosed in Finns thus far. In the second study, biallelic ADA2 mutations that cause a deficiency of adenosine deaminase 2 (DADA2) were identified in seven PID patients, all sharing one of the causal variants, which were significantly enriched in Finns (3.31-fold). DADA2 was originally associated with systemic autoinflammation, polyarteritis nodosa-type vasculitis and mild immunodeficiency. Only a fraction of the identified DADA2 patients presented with vasculopathies. In addition, recurrent haematological manifestations are noted, and for the first time, the occurrence of lymphoproliferation is described for some of the patients, expanding the phenotypic spectrum of DADA2. Finally, novel causal variants in telomere biology disorders (TBDs)-associated genes were identified in three families with heterogeneous phenotypes that lacked the classic clinical pathognomonic signs of telomeropathies. The phenotypes ranged from mild signs of Dyskeratosis congenita (DKC) to SCID. The genetic diagnosis was confirmed by an assessment of shortened telomere lengths in patients. In addition, the spectrum of TBD-associated phenotypes was enlarged, showing variable degrees of cytopenia in some patients. This work attests to the validity of clinical WES testing to identify rare disease-causing variants despite the heterogeneous and/or atypical clinical presentations of PIDs. The achievement of a genetic diagnosis allowed for updating the spectrum of reported phenotypes as well as including atypical clinical presentations that might have otherwise remained undiagnosed. In addition, the enrichment of some rare PID-causing mutations in Finland has been depicted, highlighting the correlation of the population history with the distribution of rare deleterious variants of clinical relevance.

Psychiatric disorders in humans and their counterparts, behavioural disorders in dogs, are the major welfare problems in both species affecting the wellbeing of millions of people and dogs worldwide. Despite extensive research elucidating the pathobiological events leading to the onset of psychiatric/behavioural disorders, the exact etiology remains unattainable. Moreover, the complexity and multicausality of these mental disorders hampers research, addressing the need for more comprehensive approaches to provide insights into the molecular mechanisms of these disorders and to identify disorder-specific biomarkers. The aim of this thesis was to pilot the use of a non-targeted metabolomics approach in canine behavioural research, and to provide novel molecular information concerning two specific behavioural disorders in pet dogs, fearfulness and hyperactivity/impulsivity. Fearfulness is the most common behavioural disorder in dogs, characterized by excessive fear response when confronted with a threatening stimulus. During this thesis work, two separate non-targeted metabolomics characterization studies of canine fearfulness were conducted. The first study aimed to pilot the feasibility and potential of metabolomics technology in canine behavioural research, whereas the second metabolic characterization of canine fear was conducted with a larger sample size to optimize theoretical and analytical limitations observed in the first pilot study. The results showed clear differences in the blood metabolic profiles of fearful and non-fearful control dogs, including increased plasma glutamine abundance in fearful dogs. These alterations potentially originate from the systemic effects of chronic psychological stress. Hyperactive/impulsive dogs manifest inappropriate levels of activity, impulsivity and inattention, corresponding to attention deficit hyperactive disorder (ADHD) in humans. The non-targeted plasma metabolomics showed lower levels of plasma phospholipids in addition to altered tryptophan metabolism in hyperactive and impulsive dogs. These changes may reflect disturbances in the gut microbiota composition in the affected dogs. Collectively, this thesis has demonstrated the feasibility of metabolomics in canine behavioural research and provided novel molecular correlates and potential biomarkers for canine fearfulness and hyperactivity/impulsivity. Additionally, this study identifies changes which also had been reported in other species. This suggests that dogs could be used as a model to aid in gaining better understanding of human psychiatric disorders. Mielenterveyden häiriöt ihmisillä sekä koirien vastaavat tautitilat, käytöshäiriöt, ovat yleisimpiä elämänlaatua heikentäviä hyvinvointiongelmia molemmilla lajeilla. Laajamittaisista tutkimuksista huolimatta kyseisten tautitilojen etiologia on edelleen suurilta osin tuntematon. Sekä mielenterveyden häiriöt että käytöshäiriöt ovat taustaltaan monisyisiä sairauksia, mikä vaikeuttaa tutkimuksia. Sen vuoksi tarvitaan kokonaisvaltaisempia lähestymistapoja, jotka voivat tarjota lisätietoa tautitilojen molekulaarisista mekanismeista sekä tunnistaa tautikohtaisia merkkiaineita, biomarkkereita. Tässä väitöskirjassa pilotoitiin kohdentamattoman metabolomiikan eli aineenvaihdunnan tutkimuksen käyttöä koirien käyttäytymistutkimuksessa. Tavoitteena oli tuottaa uutta molekyylitason tietoa kahdesta käytöshäiriöstä, arkuudesta sekä yliaktiivisuudesta ja impulsiivisuudesta. Arkuus on yleisin koirilla esiintyvä käytöshäiriö, ja se ilmenee liiallisina pelkoreaktioina uhkaavan ärsykkeen, kuten toisen koiran tai vieraan ihmisen, läsnä ollessa. Tässä väitöskirjatyössä arkojen koirien aineenvaihduntaa tutkittiin kahdessa erillisessä tutkimuksessa. Ensimmäisen tutkimuksen tarkoitus oli testata metabolomiikan soveltuvuutta koirien käyttäytymistutkimuksessa, kun taas toisessa tutkimuksessa kehitettiin pilottitutkimuksessa havaittuja teoreettisia ja analyyttisiä puutteita suuremmassa aineistossa. Tulokset osoittivat, että arkojen ja ei-arkojen verrokkikoirien aineenvaihdunnassa oli selkeitä eroja, kuten kohonneet plasman glutamiinipitoisuudet aroilla koirilla. Nämä löydökset saattavat johtua arkojen koirien kärsimän kroonisen psykologisen stressin kokonaisvaltaisista seurauksista. Yliaktiiviset ja impulsiiviset koirat kärsivät jatkuvasta ja sopimattomasta yliaktiivisuudesta, impulsiivisuudesta ja tarkkaamattomuudesta. Kyseinen tautitila vastaa ihmisillä esiintyvää tarkkaavuus- ja yliaktiivisuushäiriötä (ADHD). Metabolomiikka-analyysi paljasti madaltuneen fosfolipidien määrän sekä aminohappo tryptofaanin aineenvaihdunnan häiriöiden olevan yhteydessä koirien yliaktiiviseen ja impulsiiviseen käytökseen. Havaitut muutokset voivat heijastua häiriintyneestä suoliston mikrobitasapainosta. Kaiken kaikkiaan tämä väitöskirjatyö on luonut pohjaa metabolomiikan laajemmalle käytölle koirien käyttäytymistutkimuksessa ja tarjonnut uutta molekyylitason tietoa koirien arkuudesta sekä hyperaktiivisuudesta ja impulsiivisuudesta. Lisäksi tutkimus on paljastanut molekyylitason yhtäläisyyksiä eri lajien välillä, mikä voi tulevaisuudessa hyödyttää eläinlääketieteen lisäksi myös ihmisen mielenterveyden häiriöiden tutkimusta.

In the Eukaryotes, DNA sequences in genes are often interrupted by non-coding sequences called introns. These sequences are removed from the transcripts via a process known as splicing either while the genes are being transcribed (co-transcriptionally) or after transcription (posttranscriptionally). In higher eukaryotes two separate pre-mRNA splicing machineries have been described: the U12-dependent spliceosome which is responsible for splicing of approximately 700-800 unique introns (known as the U12-type introns), and the U2-dependent spliceosome responsible for splicing all other introns (known as the U2-type introns). The two intron types show divergent sequence elements in their 5' splice site and branch point sequences. In addition, earlier reports have indicated that U12-type introns are spliced with a slower rate comparing to the U2-type introns, suggesting that the splicing of U12-type introns is rate-limiting to the expression of the U12-type intron containing genes. This slower splicing is manifested as unspliced or retained U12-type introns in the otherwise fully processed mRNA products. In this work I developed a novel computational tool called the intron-exon retention estimator (IntEREst) which allows accurate detection, quantification and differential analysis of the intron retention levels from RNAseq data. Additional features of IntEREst include a tool for identification of U12-type introns, and a number of tools to compare the retention levels of userdefined subclasses of introns across several samples. An already published RNAseq dataset (available under accession GSE63816 in NCBI Gene expression Omnibus database) from patients and control subjects of myelodysplastic syndrome (MDS) was used to assess the functionality by benchmarking IntEREst. This dataset included RNAseq data from MDS patients featuring mutations in the ZRSRS2 gene that functions in the recognition of U12-type introns, and from control subjects that were either healthy or MDS patients without ZRSR2 mutations. Additionally, I used a Maize dataset consisting of samples with mutated and wild-type RGH3 gene, which is an ortholog of human ZRSR2. My results indicate that IntEREst is a reliable tool for analyzing intron retention events from RNAseq data producing comparable or better results than the other similar methods. I used IntEREst to globally compare the retention of the U12-type introns to that of U2-type introns. I found that U12-type introns show on average a 2-fold higher retention levels compared to that of U2-type introns both in human and plant cells. This result recapitulates the findings from earlier studies using a small set of selected genes and generalizes the increased intron retention of U12-type introns to a genome-wide scale. Furthermore, the results of this work provide evidence that transcripts containing unspliced U12-type introns are degraded in the nucleus by the nuclear exosome. Together, these results support the hypothesis that U12-type introns are globally spliced less efficiently than the U2-type introns and can thus regulate the rate of mature mRNA formation with the genes containing U12-type introns. Additionally, intron retention analysis of human/plant cells containing mutations in the U12-dependent spliceosome showed that such defects lead to a further increase in the levels of unspliced U12-type introns. In conclusion, this thesis extends current knowledge concerning the significance of the correct splicing of U12-type introns and the consequences of their abnormal splicing. Furthermore, it describes a combination of available tools together with a novel software tool (i.e. IntEREst) that can be used to measure and compare the efficiency and accuracy of RNA splicing across multiple samples. We show that these tools can reveal valuable information about the molecular mechanisms involved in various conditions, e.g. diseases caused by defective spliceosome. Aitotumallisilla geenien DNA-sekvenssit sisältävät usein introneiksi kutsuttuja ei-koodaavia jaksoja. Nämä sekvenssit poistetaan transkripteista silmukoinniksi kutsutun prosessin kautta, joka voi tapahtua joko transkription aikana (kotranskriptionaalisesti) tai transkription jälkeen (posttranskriptionaalisesti). Korkeammilla aitotumallisilla on kuvattu kaksi erillistä silmukointikoneistoa: U12-tyypin spliseosomi, joka vastaa noin 700–800:n intronin silmukoinnista (U12-tyypin intronit), sekä U2-tyypin spliseosomi, joka vastaa kaikkien muiden intronien silmukoinnista (U2-tyypin intronit). Näissä kahdessa intronityypissä on erilaiset 5’-silmukointikohdan ja intronin haarautumiskohdan sekvenssielementit. Tämän lisäksi aiemmat tutkimukset ovat viitanneet siihen, että U12-tyypin intronit silmukoidaan hitaammin U2-tyypin introneihin verrattuna, minkä seurauksena U12-tyypin intronien silmukointi saattaa rajoittaa näitä introneja sisältävien geenien ekspressiota. Hidas silmukointi ilmenee silmukoimattomina tai retentoituina U12-tyypin introneina muuten täysin prosessoiduissa lähetti-RNA:issa. Tässä työssä olen kehittänyt uuden ohjelmistotyökalun nimeltä Intron-Exon Retention Estimator (IntEREst), joka mahdollistaa intronien retention havaitsemisen, kvantifikaation sekä retentiotasojen vertailun RNAsekvensointidataa käyttäen. IntEREstin muihin ominaisuuksiin kuuluvat työkalu U12-tyypin intronien tunnistamiseen sekä useita eri työkaluja käyttäjän määrittelemien intronien alaluokkien retentiotasojen vertailuun useiden näytteiden välillä. IntEREstin vertailuanalyysiin hyödynnettiin jo julkaistua RNAsekvensointidataa myelodysplastista oireyhtymää (MDS) sairastavailta potilailta ja verrokkiyksilöiltä (saatavilla tunnuksella GSE63816 NCBI Gene Expression Omnibus -tietokannasta). Tämä datasetti sisälsi RNA-sekvensointidataa MDS-potilailta, joilla on mutaatioita U12-tyypin intronien tunnistuksessa toimivassa ZRSR2-geenissä, sekä verrokkiyksilöiltä jotka olivat joko terveitä yksilöitä tai MDS-potilaita, joilla ei ole ZRSR2-mutaatioita. Tämän lisäksi käytin maissista peräisin olevaa datasettiä, joka koostui maissin ZRSR2ortologin, RGH3-geenin, suhteen villityyppisistä tai mutanteista näytteistä. Tulokseni viittaavat siihen, että IntEREst on luotettava työkalu intronien retention analyysiin RNA-sekvensointidatasta, joka tuottaa muiden menetelmien kanssa vertailukelpoisia tai niitä parempia tuloksia. Hyödynsin IntEREstiä U12-tyypin ja U2-tyypin intronien retention vertailuun globaalilla tasolla. Osoitin, että U12-tyypin inronien retentiotaso on keskimäärin kaksi kertaa korkeampi U2-tyypin introneihin verrattuna sekä ihmis- että kasvisoluissa. Tämä tulos toistaa aiemmissa tutkimuksissa muutamilla valikoiduilla geeneillä tehdyt löydökset sekä yleistää U12-tyypin intronien korkeamman retention genominlaajuiselle tasolle. Tämän lisäksi työn tulokset osoittavat, että silmukoimattomia U12-tyypin introneja sisältävät transkriptit hajotetaan tumassa tumaeksosomin toimesta. Yhdessä nämä tulokset tukevat hypoteesia, jonka mukaan U12-tyypin intronit silmukoidaan heikommalla tehokkuudella kuin U2-tyypin intronit ja ne voivat näin ollen säädellä U12-tyypin introneja sisältävistä geeneistä tuotettavan lähetti-mRNA:n muodostumisnopeutta. Lisäksi U12-tyypin spliseosomin mutaatioita sisältävien ihmis- ja kasvisolujen introniretentioanalyysi osoitti, että viat silmukoinnissa kohottavat entisestään silmukoimattomien U12tyypin intronien tasoja. Tämä väitöskirja laajentaa nykyistä tietämystä U12-tyypin intronien oikean silmukoinnin merkityksestä ja virheellisen silmukoinnin seurauksista. Lisäksi työssä kuvataan olemassa olevia työkaluja sekä uusi ohjelmistotyökalu (IntEREst), joita voidaan käyttää RNA:n silmukoinnin tehokkuuden ja tarkkuuden mittaamiseen ja vertailuun useiden näytteiden välillä. Osoitamme, että nämä työkalut voivat tuottaa arvokasta tietoa molekyylitason mekanismeista eri olosuhteissa, muun muassa viallisesti toimivasta silmukointikoneistosta johtuvissa sairauksissa.

Abnormal regulation of the microtubule-associated protein Tau leads to its misfolding, aggregation, and impairment of its physiological functions. Deposits of insoluble Tau are the hallmark of several neurodegenerative disorders called tauopathies. Tauopathies are characterized by the transcellular transfer of phosphorylated oligomeric Tau, which propagates the pathology along connected areas of the brain and promotes the conversion of healthy endogenous Tau molecules into misfolded pathological aggregates in the recipient cells. However, the mechanisms of Tau secretion and internalization between neuronal cells, as well as the templated-conformational modification of physiological Tau in presence of the pathological one, are still poorly understood. The aim of this thesis was to investigate the molecular mechanisms of Tau secretion and internalization in cultured cell lines and in primary cortical neurons. The main conclusions of the study are: (1) Knock down of FRMD4A, one of the risk genes that confer susceptibility for late onset Alzheimer’s disease (LOAD), reduces Tau secretion. Cytohesins, which interact with both FRMD4A and Arf6, mediates the modulation of Tau release. FRMD4A/cytohesin-dependent Arf6 activity via the polarity signaling complex, constituted by Par6 and PKCζ, stimulates Tau release. This provides for the first time a functional connection between genetic susceptibility of Alzheimer’s disease (AD) to Tau pathology. (2) Overexpressed pathological Tau localizes at the plasma membrane in discrete microdomains. The modulation of lipid composition in the plasma membrane affects Tau secretion. Ordered phases of the membrane, promoted by sphingolipids and cholesterol, favor Tau release to the extracellular space, while disordered and fluid phases, promoted by unsaturated fatty acids and depletion of cholesterol and sphingolipids, decrease it. Membrane-bound heparan sulphate proteoglycans (HSPGs) mediate the extraction from the membrane and the release of Tau to the extracellular space. (3) Hyperphosphorylated and oligomerized Tau internalized from the extracellular space localizes to and promotes formation of stress granules in a TIA-1-dependent manner. Additionally, Tau-containing stress granules persist longer in the cytoplasm compared to physiological stress granules and sensitize cells to secondary stress. Taken together, the results presented in this thesis provide novel findings that can help to elucidate the molecular mechanisms of cell-to-cell propagation of Tau pathology and to open new possibilities for treatments against tauopathies. Epänormaali mikrotubuluksiin liittyvän tau-proteiinin säätely johtaa tau-proteiinin virheelliseen laskostumiseen ja aggregoitumiseen, sekä taun fysiologisten toimintojen häiriintymiseen. Toiminnaltaan häiriöitynyt tau ja liukenemattoman taun kertymät ovat useiden tautopatioiksi kutsuttujen hermostorappeumasairauksien tunnusmerkki. Tautopatioille tunnusomaista on fosforyloituneen oligomeerisen taun transsellulaarinen kuljetus, mikä saa patologian leviämään yhteydessä olevia aivoalueita pitkin ja edistää terveen endogeenisen taun muuntumista väärin laskostuneiksi patologisiksi aggregaateiksi vastaanottavissa soluissa. Taun erittämisen ja sisäänoton mekanismit hermosolujen välillä, sekä fysiologisen taun konformaation muutos patologisen taun läsnä ollessa, tunnetaan kuitenkin huonosti. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli tutkia taun erityksen ja sisäänoton molekulaarisia mekanismeja viljellyissä solulinjoissa sekä primäärisissä kortikaalineuroneissa. Tutkimuksen pääasialliset johtopäätökset ovat: (1) myöhäisiässä puhkeavalle Alzheimerin taudille alttiutta lisäävän FRMD4A- geenin knockdown vähentää taun erittymistä. Sytohesiinit, jotka ovat vuorovaikutuksessa sekä FRMD4A:n että Arf6:n kanssa, säätelevät taun eritystä. FRMD4A/sytohesiini-riippuvainen Arf6:n aktiivisuus stimuloi taun vapauttamista polaarisuussignalointi-kompleksin kautta, joka koostuu Par6:sta ja PKCz:sta Tämä tarjoaa ensimmäistä kertaa toiminnallisen yhteyden Alzheimerin taudille geneettisen alttiuden ja tau-patologian välille. (2) Yliekspressoitu patologinen tau lokalisoituu solukalvolla erillisiin mikrodomeeneihin. Solukalvon lipidikoostumuksen muuttaminen vaikuttaa taun eritykseen. Solukalvon järjestäytyneet faasit, joita sfingolipidit ja kolesteroli edesauttavat, suosivat taun vapauttamista solunulkoiseen tilaan, kun taas epäjärjestäytyneet ja nestemäisemmät faasit, joita tyydyttymättömät rasvahapot sekä kolesterolin ja sfingolipidien puute edistävät, vähentävät taun eritystä. Solukalvoon sitoutuneet heparaanisulfaatti-proteoglykaanit säätelevät taun erittymistä solukalvolta ja vapauttamista solunulkoiseen tilaan. (3) Solunulkoisesta tilasta sisään otettu hyperfosforyloitunut ja oligomerisoitunut tau lokalisoituu stressijyväsiin sekä edesauttaa näiden muodostumista TIA-1 –riippuvaisella tavalla. Lisäksi tau-proteiinia sisältävät stressijyväset kestävät fysiologisia stressijyväsiä kauemmin sytoplasmassa sekä herkistävät solut sekundaariselle stressille. Tässä tutkimuksessa esitetyt tulokset tarjoavat uusia löydöksiä, jotka voivat auttaa selventämään taun solusta soluun leviämisen molekulaarisia mekanismeja ja avaamaan uusia mahdollisuuksia tautopatioiden hoitoon.

Leukemia is a cancer of the blood cells that has traditionally been treated with unselective chemotherapeutic agents. Advances in molecular biology and sequencing technologies have revolutionized the understanding of molecular and genetic factors in leukemia pathogenesis. Each leukemia patient harbors a unique set of genetic abnormalities, which result in impaired regulation of cell proliferation and differentiation. Increased cell proliferation is commonly mediated through overactive signaling cascades, such as JAK/STAT, PI3K/AKT/mTOR and MAPK pathways. The improved understanding of the molecular pathobiology has led to the development of small molecule inhibitors that can directly bind to target proteins and inhibit aberrant signaling. However, the molecular landscape of rare types of leukemia has not been comprehensively studied and our understanding of the relationship between cancer genotype, phenotype and drug function is limited. In study I, we aimed to identify novel driver mutations in large granular lymphocyte (LGL) leukemia. Earlier, our research group discovered that 40% of LGL leukemia patients had activating point mutations in the STAT3 gene. By using exome and targeted sequencing we identified 4/211 patients to carry an activating STAT5B mutation in the SH2 domain (N642H and Y640F). In study II, we identified STAT5B mutations in 6/68 (8%) T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) patients. The finding represents a novel mechanism leading to the activation of the IL7R/JAK/STAT5 pathway. Our initial results also suggest that hyperactive STAT5B might be involved in the overexpression of anti-apoptotic BCL-xL. In study III, using a functional reporter assay we screened 306 oncology compounds to find potential hits that can decrease the cellular activity of mutant STAT3. The most potent targeted compounds inhibiting STAT3 activity were cyclin-dependent kinase (CDK), mammalian target of rapamycin (mTOR), heat shock protein 90 (Hsp90), and Janus kinase (JAK) inhibitors. Among these compounds only the Hsp90 inhibitors effectively inhibited both the mutant and wild type STAT3 phosphorylation and activity. In study IV, we developed a flow cytometry-based drug screening assay to assess cell population specific drug responses in heterogenous AML samples. Using the assay, we were able to simultaneously measure the drug responses of leukemic blasts, more mature leukemic cells and lymphocytes. The data showed that targeted therapies have different efficacies towards leukemic AML cells at distinct stages of myeloid differentiation. Particularly, BCL2 inhibitor venetoclax was toxic to immature blasts but was not effective against more differentiated monocytic and granulopoietic cells. In conclusion, we identified novel STAT5B mutations in two rare lymphoproliferative diseases, T-ALL and LGL leukemia. Furthermore, we demonstrate that our ex vivo flow cytometry-based drug screening platform can increase the functional understanding of drug effects. Leukemia on joukko erilaisia verisyöpiä, joiden pääasiallisena hoitomuotona käytetään jakautuviin syöpäsoluihin kohdistuvia solunsalpaajia. Viime vuosikymmeninä kehittyneet molekyylibiologiset menetelmät (kuten koko genomin sekvensointi) ovat lisänneet ymmärrystä leukemian syntymekanismeista. Tautigeenien tunnistaminen on johtanut satojen erilaisten syöpälääkkeiden kehittämiseen, jotka täsmällisesti hiljentävät tietyn syöpägeenin tuottaman proteiinin toimintaa ja täten syövälle tärkeiden signalointireittien aktiivisuutta. Väitöskirjatutkimuksen tavoitteena oli tunnistaa uusia patogeenisiä mutaatioita harvinaisissa T-solu leukemioissa ja tutkia miten uudet kohdennetut syöpälääkkeet tehoavat syöpäsoluja vastaan. Osatöissä 1. ja 2. löysimme aktivoivia, ennen tunnistamattomia STAT5B mutaatioita kahdesta eri leukemian alatyypistä (LGL-leukemia 2% potilasta, T-ALL 8% potilaista). STAT proteiinit ovat transkriptiofaktoreita, jotka säätelevät muiden geenien toimintaa ja yliaktiivisina estävät solujen normaalin ohjelmoidun kuoleman. Tulokset vahvistavat STAT3 ja STAT5B transkriptiofaktoreiden merkitystä T-soluisten leukemioiden synnyssä. Aikaisemmin tutkimusryhmämme havaitsi, että STAT3 on mutatoitunut 40%:lla LGL leukemia potilaista. Osatyössä 3. tutkimme in vitro -lääkeherkkyysanalyysin avulla 306 lääkkeen vaikutusta STAT3 transkriptiofaktorin aktiivisuuteen lymfoproliferatiivisissa taudeissa. CDK-, mTOR-, Hsp90- ja JAK-proteiineja estävät täsmälääkkeet osoittautuivat tehokkaimmiksi STAT3 aktiivisuuden hiljentäjiksi. Tulokset voivat olla hyödyllisiä suunniteltaessa uusia hoitoja STAT3 mutatoituneille leukemiapotilaille. Osatyössä 4. kehitettiin moderni virtaussytometriapohjainen lääkeherkkyysmenetelmä, jonka avulla arvioitiin eri solutyyppien lääkeherkkyyttä AML potilaiden heterogeenisistä luuydinnäytteistä. Tutkimuksemme osoitti, että täsmälääkkeillä on erilainen teho eri kypsyysvaiheessa olevia leukemiasoluja kohtaan. Erityisesti BCL2 estäjä venetoklaksi oli tehokkaampi, kun syöpäsolukko oli lähtöisin epäkypsemmistä myeloisista soluista (blasteista), kun taas teho laski syöpäsolukon kypsyessä monosyytti- tai granulosyytti-suuntaan. Tulos on ajankohtainen, sillä kliinisissä kokeissa venetoklaksi on antanut lupaavia tuloksia AML:n hoidossa. Tällä hetkellä on kuitenkin epäselvää, ketkä potilaista saavat hyvän hoitovasteen ja tuloksemme voivat auttaa näiden potilaiden tunnistamisessa. Tarkempi laboratorio-olosuhteissa suoritettu lääkeherkkyystutkimus voi myös auttaa löytämään juuri kyseiselle täsmälääkkeelle herkät potilaat.

The aim of this study was to find and describe the genetic background of a new form of spinal muscular atrophy (SMA). Late-onset spinal motor neuronopathy (LOSMoN), later named spinal muscular atrophy, Jokela type (SMAJ), is a relatively benign autosomal dominant form of a lower motor neuron disorder. Disease onset is after the age of 30-40 years, and SMAJ is characterized by initial painful cramps and fasciculations affecting the proximal and distal muscles of the upper and lower limbs. The disease is slowly progressive, resulting in weakness and mild to moderate muscle atrophy later in life. SMAJ was originally identified in two families in Eastern Finland. The genome-wide scan study performed for these families showed that the disease is linked to chromosome 22q11.2-q13.2. The disease-associated haplotype was identical in both families, suggesting a founder effect. The founder hypothesis was also confirmed later, as several other unrelated patients carrying the same haplotype were identified. The disease-causing mutation, c.197G>T p.G66V in CHCHD10, was detected by whole-genome sequencing. The mutation was present in all then identified 55 SMAJ patients belonging to 17 families. At the same time, other dominant mutations in CHCHD10 were described to cause a wide range of neurological disorders. CHCHD10 was the first SMA-causing gene identified that encodes for a mitochondrial protein. The prevalence and clinical outcome of CHCHD10 mutations in Finnish neuromuscular disease patients were clarified in a screening study. The only detected mutation was c.197G>T p.G66V, and all patients carrying this mutation had a phenotype restricted to SMAJ. The prevalence of c.197G>T p.G66V was estimated to be around 4/100 000 in Finland, i.e. approximately 200 symptomatic SMAJ patients. The results of this study confirm that SMAJ is a genetically distinct entity caused by a dominant mutation c.197G>T p.G66V in CHCHD10. This finding enables genetic testing of SMAJ, providing patients with an accurate diagnosis and prognosis. According to our genotyping results, c.197G>T p.G66V is a founder mutation in Finland, all SMAJ patients having common ancestry. SMAJ was shown to be relatively common in Finland. It is clearly the most common CHCHD10-related disease reported, and in Finland it may be the most common form of SMA. Because SMAJ seems to be absent from other populations, it can be considered a part of the Finnish disease heritage. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kuvata LOSMoN-taudin eli myöhään alkavan spinaalisen motoneuronitaudin geneettinen tausta. LOSMoN, joka sittemmin nimettiin Jokela-tyypin spinaaliseksi lihasatrofiaksi (SMAJ), on suhteellisen lievä, autosomissa vallitsevasti periytyvä alemman motoneuronin sairaus. Tauti alkaa 30-40 vuoden iässä, ja sen alkuoireita ovat kivuliaat lihaskrampit ja lihasnykinät, joita esiintyy proksimaalisesti ja distaalisesti sekä ala- että yläraajoissa. Tauti on hitaasti etenevä, ja se johtaa lihasten heikkouteen sekä lievään tai keskivaikeaan lihasten surkastumiseen myöhäisellä iällä. SMAJ tunnistettiin alun perin kahdessa itäsuomalaisessa perheessä. Koko genomin kartoituksessa näiden perheiden taudin havaittiin kytkeytyvän kromosomialueeseen 22q11.2-q13.2. Tautiin kytkeytyvä haplotyyppi oli molemmissa perheissä samanlainen, mikä viittaa siihen, että perheiden taudilla on yhteinen alkuperä. Tämä perustajavaikutus saatiin vahvistettua, kun tutkimuksessa löydettiin muita, alkuperäisiin perheisiin kuulumattomia potilaita, joilla oli sama tautiin kytkeytyvä haplotyyppi. Taudin aiheuttava mutaatio, CHCHD10-geenin muutos c.197G>T p.G66V, löydettiin koko genomin sekvensoinnilla. Kyseinen mutaatio havaittiin kaikilta siihen mennessä tunnistetuilta 55 SMAJ-potilaalta, jotka kuuluivat 17 eri perheeseen. Samaan aikaan CHCHD10-geenin muiden vallitsevasti periytyvien mutaatioiden kuvattiin aiheuttavan erilaisia neurologisia sairauksia. CHCHD10 oli ensimmäinen mitokondriaalista proteiinia koodaava geeni, jonka on kuvattu aiheuttavan spinaalista lihasatrofiaa. CHCHD10¬-geenin mutaatioiden yleisyyttä ja niiden aiheuttamia tauteja selvitettiin suomalaisille neuromuskulaaritautipotilaille toteutetussa seulontatutkimuksessa. Ainoa tutkimuksessa havaittu mutaatio oli c.197G>T p.G66V, ja kaikkien sitä kantavien potilaiden taudinkuva vastasi SMAJ:a. Mutaation c.197G>T p.G66V yleisyydeksi Suomessa arvioitiin noin 4/100 000, mikä tarkoittaa noin 200 oireista SMAJ-potilasta. Tämä tutkimus osoitti, että SMAJ on geneettisesti erillinen tauti, joka johtuu vallitsevasti periytyvästä CHCHD10-geenin c.197G>T p.G66V –mutaatiosta. Tutkimuksen tulosten myötä SMAJ:lle on voitu kehittää geenitesti, jonka avulla potilaat voivat saada taudilleen oikean diagnoosin ja ennusteen. Genotyypitystulokset osoittivat, että c.197G>T p.G66V on perustajamutaatio suomalaisväestössä. Tämän tutkimuksen perusteella SMAJ on Suomessa suhteellisen yleinen tauti. SMAJ on selvästi yleisin CHCHD10-geeniin liitetyistä taudeista, ja Suomessa se on mahdollisesti yleisin SMA:n muoto. Koska SMAJ:a ei ilmeisesti esiinny muissa väestöissä, sitä voidaan pitää osana suomalaista tautiperintöä.

Despite effective treatments, the prognosis of patients with metastatic cancer remains poor due to the recurrence of chemotherapy-resistant cancer. Genomic instability and the accumulation of mutations in progressive tumors drive cancer cell inherent features, such as invasion and proliferation. However, tumor progression and treatment resistance are not isolated events due to cancer-genetic and epigenetic alterations but also require a permissive tumor microenvironment (TME). Transduced into cancer cells by cell surface receptors, such as integrins and receptor tyrosine kinases (RTKs), the signaling cascades from the TME and extracellular matrix (ECM), promote the development of metastases as well as resistance to treatments by regulating cancer growth, tissue penetration, and apoptosis evasion. However, the key mechanisms and pathways activated during cancer evolution, including invasion, metastasis, and tissue responses to chemotherapy, remain to be systematically identified. The aim of this thesis was to study the cancer cell-ECM interactions and cancer cell-intrinsic factors enabling tumor progression and treatment resistance. In this thesis, we found that disease progression and chemotherapy treatment induce desmoplastic reaction in the TME of high-grade serous ovarian cancer (HGSC), both in the primary tumor and metastatic tissues. The results indicate that the stiff fibrotic tumor ECM, specific ECM substrates, and chemotherapy itself promote tumor cell proliferation, spreading, and chemoresistance. In particular, we demonstrated that in response to stiffness, platinum treatment, and collagen VI, the activation of focal adhesion kinase (FAK)-integrin β1-YAP signaling enhances the apoptosis evasion of HGSC cells harboring intrinsic treatment resistance. We also found a robust mechanism, whereby HGSC cells gain platinum resistance via platinum treatment-induced, adaptive RSK1/2-EphA2-GPRC5A signaling switch. Mechanistically, this signaling switch was blocked by the inhibition of RSK kinase, resulting in platinum re-sensitization of HGSC cells. In addition, by using a fibrotic tumor stroma-mimicking 3D model, we found that RTK RET proto-oncogene-mediated Ras-MAPK pathway activity, responsible for multiple tumor progression features, such as cancer invasion, is inhibited by PTPRA phosphatase. Finally, we established a robust multi-modal analysis to merge reliable conclusions of tumor progression associated molecular, cancer-genetic, and phenotypic factors based on studies from multiple research institutes and technology platforms. Using this analysis, we found a novel driver gene, ECHDC1, acting as a tumor-suppressor that inhibits invasive cancer growth. To summarize, the studies compiled in this dissertation support the need for precision medicine approaches to target novel cancer cell-intrinsic tumor progression regulators, as well as to target the ECM-signaling pathways and their effects on disease development and chemoresistance. Tehokkaista hoidoista huolimatta etäpesäkkeistä syöpää sairastavien potilaiden ennuste on edelleen huono, johtuen solunsalpaajille resistentin syövän uusiutumisesta. Progressiivisessa syövässä genomin epävakaus sekä mutaatioiden kertyminen ajavat syöpäsoluille ominaisia piirteitä, kuten hallitsematonta kasvua ja tunkeutumista kudoksiin. Syövän kasvun eteneminen sekä hoitoresistenssi eivät kuitenkaan ole yksittäisiä syövän geneettisistä ja epigeneettisistä muutoksista johtuvia tapahtumia, vaan vaativat myös tietynlaisen syöpäsolukon ulkopuolisen mikroympäristön. Syöpäsolujen pintareseptorit, kuten integriinit ja reseptorityrosiinikinaasit (RTK:t), välittävät näitä mikroympäristön ja soluväliaineen signaaleja edistäen etäpesäkkeiden kehittymistä sekä syöpäsolujen hoitoresistenssiä säätelemällä syövän kasvua, tunkeutumista kudoksiin ja ohjelmoidun solukuoleman, apoptoosin, välttämistä.Tässä väitöskirjatyössä selvitettiin syövän mikroympäristön soluväliaineen ja syöpäsolun vuorovaikutuksia, jotka mahdollistavat syövän kasvun etenemisen ja hoitoresistenssin. Tämän työn tutkimuksissa havaitsimme, että syövän eteneminen ja solunsalpaajahoito aktivoivat desmoplastisen reaktion korkea-asteisen seroosi munasarjasyövän primäärikasvaimessa sekä etäpesäkkeisten kudosten mikroympäristössä. Tuloksemme osoittavat, että desmoplastinen ympäristö, soluväliaineen syöpäsolukkoon kohdistama paine, tietyt soluväliaineen proteiinit ja solunsalpaajahoito itsessään edistävät syöpäsolujen jakautumista, leviämistä ja solunsalpaajaresistenssiä. Erityisesti havaitsimme fokaalisen adheesiokinaasin (FAK)-integriini β1-YAP-signaloinnin aktivoitumisen vasteena kudokseen kohdistuvalle paineelle, platinapohjaisille solunsalpaajille ja soluväliaineen tyypin VI kollageenille tehostaen resistenttien munasarjasyöpäsolujen apoptoosin välttämistä. Löysimme myös mekanismin, jonka avulla munasarjasyövän solut aktivoivat adaptiivisen RSK1/2-EphA2-GPRC5A-signalointikytkimen, edesauttaen resistenssiä platinapohjaisia solunsalpaajia vastaan. RSK kinaasin estäminen johti syöpäsolujen onnistuneeseen platinahoitovasteeseen. Käyttämällä tutkimusmallia, joka jäljittelee potilaan desmoplastista syöpäsolukkoa, havaitsimme myös, että PTPRA-fosfataasi estää RTK RET-esisyöpägeenivälitteisen Ras-MAPK-reitin aktiivisuutta, rajoittaen syöpäsolujen kykyä tunkeutua kudokseen. Työn viimeisessä osassa loimme monimodaalisen analyysin, joka yhdistää eri tutkimusinstituuteista ja eri teknologia-alustoja apuna käyttäen saadut tulokset kasvaimen etenemiseen liittyvistä molekulaarisista, syöpägeneettisistä ja fenotyyppisistä tekijöistä. Tämän analyysin avulla löysimme uuden kasvunrajoitegeeninä toimivan ECHDC1:n, joka estää syövän invasiivista kasvua. Tässä esitetyn väitöskirjatyön tutkimustulokset tuovat tukea yksilöllistetyn hoidon tutkimustarpeesta, mahdollistaaksemme uusien, syöpäsolujen omien, kasvaimen etenemistä reguloivien tekijöiden täsmähoidon. Tämän lisäksi tulokset tuovat uutta ymmärrystä täsmähoitaa syövän soluväliaineen signalointireittejä sekä niiden vaikutuksia estääksemme syövän ja solunsalpaajahoitoresistenssin kehittymisen.

Nanotechnology is exerting a huge impact on various sectors of everyday life as it has a tremendous potential for revolutionizing a long list of consumer products and industrial applications. The key to success in the nanotechnology field lies in the fact that materials at the nanoscale possess novel and enhanced properties such as greater strength and improved conductivity when compared with their bulk-sized equivalents. The most probable occupational and consumer routes of exposure to engineered nanomaterials (ENM) are via the respiratory tract and skin. Due to their small size, ENM are able to bypass physical and chemical barriers in the human body and come into contact with the immune system which is capable of recognizing foreign structures including ENM. However, the downscaling of the materials also increases their chemical reactivity, which in combination with the small size and other physicochemical properties, means that ENM could influence our immune system exerting possibly beneficial but also adverse effects on our health. The aim of this thesis was to investigate modulatory effects and physiological outcomes of ENM on a healthy and a compromised immune system in the lungs and skin. The main findings of the thesis were that rigid, rod-like but not long and tangled carbon nanotubes (CNT) were able to induce a condition similar to allergic airway inflammation via activation of innate immunity. Although nanofibrillated celluloses triggered acute pulmonary inflammation, their effects subsided within one month and regardless of the material’s biopersistence, their health outcomes differed significantly from the long-term pathologies of rigid, rod-like CNT. Uncoated and functionalized CuO nanomaterials demonstrated an ability to worsen allergic asthma by eliciting pulmonary neutrophilia, however it was found that surface PEGylation significantly suppressed the inflammatory potential of the pristine CuO ENM; this effect was especially evident at the transcriptional level. Topical exposure to nano-sized ZnO in a murine model of atopic dermatitis revealed that the particles were able to pass through mechanically injured allergic skin. This penetration of the material resulted in a local inhibition of pro-inflammatory and allergic reactions and a systemic exacerbation of IgE antibody production. This work provides knowledge of pulmonary and dermal effects of ENM. The results of this thesis demonstrate that ENM with different physicochemical characteristics possess an ability to modulate our immune system. These observations emphasize the diversity and complexity of the materials as well as highlighting their impacts on the immune system and the resulting consequences on health. These data contribute to the safety assessment of ENM as well as information that can be useful in nanomedicine. Nanoteknologialla on suuri vaikutus arkielämän eri osa-alueisiin, koska sillä on valtava potentiaali mullistaa kulutushyödykkeitä ja teollisia sovelluskohteita. Nanoteknologian menestyksen avain perustuu nanokokoisten materiaalien uusiin ja paranneltuihin ominaisuuksia, kuten lujuuteen ja johtokykyyn verrattuna vastaaviin, mikrokokoisiin materiaaleihin. Sekä kuluttajat että työntekijät altistuvat todennäköisimmin teollisesti tuotetuille nanomateriaaleille (ENM, engl. engineered nanomaterials) hengitysteiden ja ihon kautta. ENM:n pienen koon vuoksi ne pystyvät ohittamaan ihmiskehon fysikaaliset ja kemialliset esteet, minkä jälkeen ne joutuvat kosketuksiin immuunijärjestelmän kanssa, joka kykenee tunnistamaan elimistölle vieraita rakenteita, kuten ENM:eja. Materiaalien partikkelikoon pienentäminen lisää myös niiden kemiallista reaktiivisuutta, joka yhdessä pienen koon ja muiden fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien kanssa tarkoittaa, että ENM:t voivat vaikuttaa immuunijärjestelmäämme, ja vaikutukset voivat olla hyödyllistä mutta myös haitallisia terveydellemme. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli tutkia ENM:ien vaikutuksia ja fysiologisia seurauksia terveessä ja heikentyneessä immuunijärjestelmässä sekä keuhkoissa että ihossa. Väitöskirjatyön päähavainnot olivat, että jäykät ja sauvamaiset, mutta eivät pitkät ja lankakerämäiset, hiilinanoputket (CNT, engl. carbon nanotubes) pystyivät aktivoimaan luontaisen immuniteetin ja aiheuttamaan samanlaisen tilan kuin allerginen hengitysteiden tulehdus. Vaikka nanofibrillimäiset selluloosat aiheuttivat akuuttia pulmonaarista tulehdusta, niiden vaikutukset vähenivät kuukaudessa ja aineen biopysyvyydestä huolimatta niiden terveysvaikutukset erosivat merkittävästi jäykän, sauvanmuotoisen CNT:n aiheuttamista pitkäaikaisista patologisista vaikutuksista. Sekä päällystämättömät että funktionalisoidut CuO-nanomateriaalit pahensivat allergista astmaa aiheuttamalla keuhkojen neutrofiliaa, mutta partikkelin pinnan PEGylaatio vähensi merkittävästi muokkaamattomien CuO ENM:n tulehdusvaikutuksia, mikä havaittiin erityisen selvästi transkriptionaalisella tasolla. Paikallinen ihoaltistuminen nano-kokoiselle ZnO:lle hiiren atopisen dermatiitin mallissa paljasti, että partikkelit kykenivät kulkemaan allergisen ihon läpi, mikä oli mekaanisesti rikkoutunut. Tämä materiaalin tunkeutuminen johti pro-inflammatoristen ja allergisten reaktioiden paikalliseen vähentymiseen, sekä IgE-vasta-ainetuotannon systeemiseen lisääntymiseen. Tämä työ antaa tietoa ENM:ien vaikutuksista keuhkoissa ja ihossa. Tämän väitöskirjatyön tulokset osoittavat, että ENM:t, joilla on erilaisia fysikaalis-kemiallisia ominaisuuksia, kykenevät moduloimaan immuunijärjestelmäämme. Nämä havainnot korostavat materiaalien moninaisuutta ja monimutkaisuutta, sekä korostavat niiden vaikutuksia immuunijärjestelmään ja sen seurauksia terveydelle. Nämä tiedot edistävät ENM:n turvallisuuden arviointia, ja niistä voi olla hyötyä nanolääketieteessä.

A mitochondrion is a cytoplasmic organelle responsible for the energy production of the eukaryotic cells. Mitochondria contain their own genome, mitochondrial DNA (mtDNA), which is a double-stranded circular molecule. Due to mitochondria’s essential role in metabolism, a cell can contain hundreds of thousands of copies of mitochondrial DNA, depending upon the cell’s energy requirements. In mammals, mtDNA is generally maternally inherited, meaning that it is transmitted from a mother to all of her descendants. Although mtDNA constitutes only a small fraction of the cell genome, it has several qualities which make it widely used in population genetic studies such as uniparental inheritance, and the fact that the mitochondrial genome does not recombine. Moreover, mtDNA has a mutation rate ten times higher than that of the nuclear genome and therefore allows us to trace back matrilineal lineages through generations and subsequently make inferences about maternal ancestors. The human mtDNA sequence consists of approximately 16,570 base pairs and also contains both a coding region and a non-coding control region, the latter constituting around 7% of the whole mtDNA genome. Since mtDNA does not undergo recombination, an individual’s mitochondrial haplotype can be determined simply by the direct sequencing of target amplicons. Haplotypes containing certain defining variants are considered to be descendants of a common ancestor and are classified into haplogroups. The geographical distribution of haplogroups among contemporary populations is well-known – for instance, the majority of Europeans exhibit mitochondrial lineages H, U, J, K, T and V. Ancient DNA research has uncovered that lineage U was already highly prevalent among the earliest hunter-gatherer settlers of Europe, whereas the gradual spread of agriculture from the Near East that started approximately 10,000 years ago brought along new people and hence also novel mitochondrial lineages (H, J, K and T). Previous studies have stated that compared with other European populations, contemporary Finns do not seem to be an exception in terms of mitochondrial genome pool. This is rather surprising, since other genetic markers have revealed that contemporary Finns are characterized by a strong Eastern genetic influence and are distinguishable from other Europeans. Moreover, the evident East-West distinction within Finland, apparent in Y-chromosomes and autosomes, has not been previously identified in the mtDNA. This thesis outlines the mitochondrial DNA variation among present-day Finns in a Bayesian framework. The aims were to evaluate if Finns display a homogeneous geographical distribution of haplogroups and if the mtDNA composition of Finns resembles that of other European populations, as previously suggested. While no spatial differences have previously been detected in the mitochondrial haplogroup frequencies within Finland, a clear geographical distinction arose when clustering haplogroups into ‘hunter-gatherer’ (U and V) and ‘farmer’ associated lineages (H, J, K and T). Whereas the farmer related haplogroups were notably more common in Southwestern Finland, the hunter-gatherer lineages had higher densities in the Northeastern parts compared to the Southwest. Furthermore, utilization of the complete mitochondrial genomes allowed for reassessing the Finnish mtDNA pool on a larger scale. One third of the subhaplogroups in Finland today were characteristic only of Finns, i.e. these lineages were virtually absent from other populations. When further partitioning the Finnish samples based on their inclusion in ‘local’ and ‘non-local’ lineages, two notably different demographic trajectories were obtained. The population history for Finn-characteristic lineages was more in accordance with what is known through other data types, such as Y-chromosomal and archaeological data. In general, the observed geographical within-country deviation in the Finnish mtDNA pool and the high proportion of Finn-characteristic lineages reflected the signals reported from other genetic markers. Alongside Finnish mtDNA, this thesis explores the molecular rate variation among the different subhaplogroups of lineage U. Unexpectedly, a noteworthy discrepancy emerged from the tip calibrated phylogenies: haplogroup U5b had a notably lower substitution rate when compared to U2, U4 and U5a. This lineage-specificity in the rates most likely arose, at least to some extent, from differences in past population dynamics. In particular, U4 and U5a have been associated with the rapid population expansion which occurred during the Bronze Age, whereas the frequency of U5b has remained rather stable. Subsequently, the observed rate of deviation influences the divergence estimates for subhaplogroups, suggesting that U5b emerged considerably earlier than U5a. Since molecular rates are fundamental to several population genetic analyses and the timing of divergence and demographic events relies heavily on the rate used, more attention should be paid to the interlineage molecular rate variation. The results of this thesis demonstrate not only the importance of using complete mtDNA genomes and the appropriate molecular rate, but also the relevance of approaching the data from new angles when assessing the demographic past of mitochondrial lineages. Mitokondrio on tuman ulkopuolella sijaitseva soluelin, jonka pääasiallisena tehtävänä on vastata solujen energia-aineenvaihdunnasta. Mitokondrioilla on muusta perimästä erillinen rengasmainen genominsa, mitokondriaalinen DNA (mtDNA), joka periytyy äidiltä kaikille jälkeläisille. Vaikka mtDNA muodostaakin vain pienen osan yksilön koko perimästä, sitä on hyödynnetty populaatiogeneettisissä tutkimuksissa laajalti: jäljittämällä äitilinjoja ajassa taaksepäin pääsemme tarkastelemaan naisten väestöhistoriaa. Yksilön mtDNA-sekvenssiä kutsutaan hänen mitokondriaaliseksi haplotyypikseen. Haplotyypit jaotellaan muuntelun samankaltaisuuden perusteella haploryhmiin, joiden maantieteellinen jakautuneisuus nykyväestöissä tunnetaan hyvin. Haploryhmien yleisyydet eri väestöissä kertovat ihmisten liikkeistä ja väestösisäisen muuntelun määrän perusteella on mahdollista tehdä päätelmiä myös populaation koon vaihteluista. Viime vuosikymmeninä muinais-DNA-tutkimus on valottanut lukuisten mitokondriolinjojen alkuperää ja tiedämme, että esimerkiksi Euroopassa huomattava enemmistö kivikautisista metsästäjä-keräilijöistä edusti haploryhmää U. Maatalouden levitessä Lähi-Idästä noin 10,000 vuotta sitten saapui Eurooppaan kulttuurisen innovaation mukana lukuisia uusia haploryhmiä, kuten linjat H, J, K sekä T. Yhä tänä päivänä eurooppalaiset edustavat näitä eri alkuperää olevia haploryhmiä suomalaisten mitokondriaalisen rakenteen muistuttaessa pitkälti muita Euroopan väestöjä. Muusta genomista poiketen mitokondrioissamme ei ole nähtävissä eurooppalaisittain merkittävää itäistä vaikutusta. Niin ikään muussa perimässä selkeästi erottuvaa Suomen sisäistä geneettistä itä-länsi -jakoa ei ole toistaiseksi havaittu äitilinjoissamme. Tämä väitöskirja tarkastelee nykysuomalaisten mitokondriaalista koostumusta Bayesilaisessa viitekehyksessä. Tutkimuksissa havaittiin, että vaikka päähaploryhmiemme jakauma onkin hyvin eurooppalainen, alahaploryhmistämme jopa kolmasosaa ei ole toistaiseksi löydetty Suomen ulkopuolelta lainkaan tai vain hyvin harvoin. Osittamalla äitilinjamme tähän ‘suomalaiskomponenttiin’ sekä muihin haploryhmiin, näemme toisistaan poikkeavat väestöhistoriat. Suomalaiskomponentin perusteella populaatiokoko on ollut pitkään pieni ja kasvanut merkittävästi vasta muutaman sata vuotta, kun taas muut mtDNA-linjat tuottavat hyvin ”eurooppalaisen” tuloksen: väestö on alkanut kasvaa merkittävästi tuhansia vuosia sitten. Muuntelun kerroksellisuuden lisäksi mtDNA-linjoissamme havaittiin maan sisäistä variaatiota: muinaisille metsästäjä-keräilijöille ominaiset linjat (U ja H) olivat Itä- ja Pohjois-Suomessa muuta maata yleisempiä kun taas maanviljelijöihin liitetyt haploryhmät (H, J, K, T) olivat yleisimmillään maan etelä- ja länsiosissa. Havainnot mtDNA-linjojen Suomen sisäisestä rakenteesta sekä muista eurooppalaisista erottuvasta ‘suomalaiskomponentista’ ovat linjassa sen kanssa, mitä suomalaisten taustoista tiedetään aiempien, esimerkiksi Y-kromosomianalyyseihin ja arkeologisiin löytöihin perustuvien, tutkimusten perusteella. Väitöskirja käsittelee lisäksi evolutiivisten muuntelunopeuksien vaihtelua mitokondrion alahaploryhmien U2, U4, U5a sekä U5b välillä. Pääosin läntisen Euraasian alueelta koottujen muinaisten sekä modernien mtDNA-sekvenssien perusteella haploryhmän U5b substituutionopeus osoittautui merkittävästi muita tarkasteltavia linjoja alhaisemmaksi. Selitys havaittuun vaihteluun löytynee, ainakin osittain, linjojen läpikäymistä erilaisista populaatioprosesseista: haploryhmät U4 ja U5a on yhdistetty Pronssikaudella Euroopassa tapahtuneeseen nopeaan ja voimakkaaseen väestön leviämiseen, kun taas linjan U5b vallitsevuus vaikuttaa pysyneen maltillisen alhaisena vuosituhansien ajan. Eroavaisuudet substituutionopeuksissa vaikuttavat myös alahaploryhmien ikäarvioihin: aiemmista tutkimuksista poiketen linja U5b vaikuttaisi eriytyneen yhteisestä kantamuodosta huomattavasti linjaa U5a aiemmin. Muuntelunopeuksien eroilla on siis merkittävä roolinsa myös linjojen erkaantumisten sekä erilaisten demografisten tapahtumien ajoittamisessa. Vastaavaa evolutiivisten nopeuksien vertailua ei tiettävästi ole aiemmin toteutettu ihmisen mtDNA-linjoille, mutta tutkimuksen tulokset osoittavat haploryhmäkohtaisten substituutionopeuksien tarkastelun tärkeyden.

Human mesenchymal stromal cells (hMSCs) are fibroblast-like cells that have an exceptional ability to modulate immune cells. Due to their immuno-modulatory properties, hMSCs have been employed in various clinical trials in the treatment of autoimmune or inflammatory diseases. Even though hMSC therapy has yielded multiple promising results, not all trials have been successful. Due to the discrepancies in the therapeutic response, hMSC therapy requires further development and standardisation. While optimisation of the culture conditions provides one method to improve the therapeutic efficacy of hMSCs, fine-tuning the culture conditions requires deep understanding of the hMSC immunomodulatory mechanisms. It has been established that hMSCs mediate their therapeutic effect via cell-cell contact and especially by secreting several paracrine factors that include lipid mediators and extracellular vesicles (EVs). Intriguingly, hMSC-derived EVs (hMSC-EVs) are able to mediate the therapeutic response of MSCs, which has led to a growing interest in and research on cell-free hMSC-EV therapy. In addition to EVs, lipid metabolism and especially the lipid mediator prostaglandin E2 (PGE2) are vital to the hMSC immunomodulation. Interestingly, the membrane lipid composition correlates with the immunosuppressive capacity of hMSCs, suggesting that membrane lipids play a role in mediating the immunomodulatory response of hMSCs. Lipid mediators are derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs) that can be stored in membrane phospholipids. Over the past few decades, the significance of PUFA-derived lipid mediators in orchestrating the dampening phase of inflammation, i.e., resolution, has been unravelled. These novel specialized proresolving mediators (SPMs) have several essential roles in modulating immune cells, including macrophages. The role of these SPMs in hMSC immunomodulation has received only marginal interest, and whether hMSCs produce multiple SPMs has not been determined. Keeping in mind that hMSC-EVs mediate the therapeutic response of MSCs, we investigated the lipid metabolism of hMSCs and their EVs after supplementing the cells with lipid mediator precursor PUFAs: arachidonic acid, eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid (DHA). Due to the supplementation, the membrane phospholipid and fatty acid composition were notably modified and the downstream lipid mediator production was enhanced. Excitingly, we were able to demonstrate for the first time that hMSCs produce several SPMs, which may mediate the immunomodulatory response of hMSCs. Remarkably, we showed that the PUFA modifications in the phospholipid composition were transferred into the EVs, highlighting the importance of EVs as transporters of the immunomodulatory factors derived from hMSCs. Because of their importance in the resolution of inflammation, we investigated the effects of hMSCs and hMSC-EVs on macrophages with a focus on regulatory macrophages (Mregs). We elucidated that both hMSCs and hMSC-EVs enhanced the anti-inflammatory and proresolving properties of these less-studied macrophages, highlighting the importance of PGE2 in the function of hMSC-EVs. Moreover, the hMSC secretome increased the CD206 expression and Candida albicans phagocytosis activity of macrophages, demonstrating a functional change in the macrophage properties. Fascinatingly, the DHA-supplemented hMSCs even further skewed the macrophage phenotype in an anti-inflammatory direction. However, the change was limited, and the elucidation of the functional effects of PUFA supplementations on hMSCs require additional investigations. In conclusion, this thesis provides further evidence that the lipid metabolism has an essential role in hMSC functionality and that the SPM production may represent an additional mechanism in hMSC immunomodulation. For the first time, we have explored the impact of hMSCs and hMSC-EVs on Mregs and our results highlight the importance of EVs as the mediators of hMSC immunomodulation. Furthermore, we investigated the possibility of improving the hMSC immunomodulation with PUFA supplementations that would represent an easy and safe way to enhance the therapeutic potential of hMSCs or hMSC-EVs. A more detailed understanding of the complex immunomodulatory mechanisms of hMSCs is in key position when investigating new possibilities in the development of hMSC therapy. Aikuisesta ihmisestä peräisin olevia mesenkymaalisia stroomasoluja (hMSC) on käytetty erilaisissa soluterapiasovellutuksissa jo kymmenien vuosien ajan lupaavin tuloksin. Potilaat kuitenkin reagoivat soluterapiaan hyvin eri tavoin eikä solujen toimintamekanismeja tunneta edelleen täysin. Näiden seikkojen vuoksi on tärkeää kehittää hMSC-terapiaa pidemmälle. Aiempien tutkimusten perusteella on osoitettu, että solunulkoiset vesikkelit (EV) välittävät hMSC:jen terapeuttista vastetta. Lisäksi solukalvon lipidikoostumus on linkitetty solujen vasteen tehoon. Solukalvon fosfolipidit ja niiden rakennusosaset eli monityydyttymättömät rasvahapot (PUFA) ovat esiasteita tulehduksessa toimiville lipidimediaattoreille. Tulehdusta vaimentavat lipidimediaattorit ovat hyvin tärkeitä tulehdusreaktion aktiivisessa alasajossa. Onkin ajateltu, että hMSC:t osallistuisivat tulehduksen alasajoon, mutta näiden solujen ja tulehdusta vaimentavien lipidimediaattoreiden välistä yhteyttä ei ole kunnolla muodostettu. Väitöskirjassa tutkittiin hMSC:jen ja hMSC-EV:en toimintamekanismeja erityisesti lipidomiikan näkökulmasta. Havaitsimme, että hMSC:t ja hMSC-EV:t paransivat säätelevien makrofagien tulehdusta alentavaa ilmiasua. Lisäksi makrofagien solusyöntiaktiivisuus, joka on tärkeää tulehduksen alasajossa, lisääntyi hMSC:jen vaikutuksesta. Tutkimme myös, miten PUFA:t vaikuttavat hMSC:jen ja hMSC-EV:en lipidikoostumukseen. Havaitsimme, että nämä lipidimediaattoreiden esiasteet tulivat osaksi solukalvoja ja muokkasivat solujen rasvahappokoostumusta. Lisäksi lisätyt PUFA:t lisäsivät tulehdusta vaimentavien lipidimediattorien tuotantoa. Havaitsimme myös, että nämä PUFA:illa muokatut hMSC:t saivat aikaan kaikkein suurimman vasteen aikaan makrofageissa tarkoittaen, että näiden hMSC:jen immuunisoluja säätelevä vaste oli kaikkein voimakkain. Väitöskirjassa tuotimme uutta tietoa hMSC:jen ja hMSC-EV:ien vaikutuksesta sääteleviin makrofageihin. Lisäksi havaintomme PUFA:jen vaikutuksista hMSC:jen lipidiaineenvaihdunnalle ja immuunisoluja säätelevälle vasteelle tukevat muiden tutkimusten tuloksia siitä, että nämä rasvahapot edistävät solujen terapeuttista tehoa. Lipidimediaattoreiden esiasteina toimivien rasvahappojen lisäykset olisivat helppoja ja turvallisia keinoja parantaa hMSC:jen ja hMSC-EV:en terapeuttista tehoa ja siten parantaa potilasturvallisuutta.

Phosphorylation is one of the most pivotal post-translational modifications that transmit intracellular signals. Protein kinases, the enzymes that phosphorylate other proteins, can be divided into three groups: Serine/threonine specific, tyrosine-specific, and dual-specificity protein kinases. In this study we focused on discovering intracellular interactions of receptor tyrosine kinases (RTKs), which are included in the tyrosine-specific kinase group. RTKs control cellular responses to various extracellular stimuli. Any mutation that induces changes in the functionality of these enzymes can cause unusual cellular responses, which can lead to various diseases, including cancer. Oncogenic gene mutations, or oncofusions, are a type of mutation, which causes oncogenic changes in the functionality of protein kinases. It is estimated that oncofusions cause up to 20 % of cancer patient morbidity, and sequence-level studies have identified oncofusions in all cancer types. However, fusion proteins produced by oncofusions have received relatively little attention in research. The aims of this thesis were twofold: 1) to identify largest the protein groups found in oncofusions, and create an overall view of the protein-level changes brought about by fusion events, and 2) to perform a systemic characterization of intracellular RTK-protein interactions, and RTK substrates. To investigate oncofusions thus far identified in human cancer tumors, we analyzed the protein-level changes in nearly 30000 oncofusions previously identified in the data of the Cancer Genome Atlas project. We discovered that 30 % of the fusions could produce fusion proteins, which have characteristics from both wild type parent genes. Furthermore, we identified transcription factors and protein kinases as the two biggest gene groups found in the protein-producing oncofusions. Especially RTKs were overrepresented in the oncofusions, in particular those, which include an intact tyrosine kinase domain. RTKs have been extensively studied. However, research has often focused on single RTKs, and functions of many are not well known. Thus, we next characterized protein-protein interactions and substrates of the RTK family as a whole utilizing mass spectrometry-based methods. The results may provide the largest systemic mapping of RTK interactions and substrates today. The results cover 90 % of all human RTKs, and highlight RTK-RTK interactions across different RTK subfamilies as well as shared downstream signaling pathways as important facets among the functions of the RTK subfamily. The identified substrates and protein-protein interactions represent a major addition to known information especially for the less well-studied receptors. The results add information particularly regarding the interconnectedness of RTK signaling networks, and possible interplay between receptors across the RTK family. Fosforylaatio on yksi tärkeimmistä solunsisäistä viestintää välittävistä translaation jälkeisistä proteiinien muokkauksista. Proteiinikinaasit ovat entsyymejä, jotka fosforyloivat proteiineja, ja ne voidaan jakaa kolmeen ryhmään: seriini/treoniinispesifiset, tyrosiinispesifiset, ja kaksoisspesifiset proteiinikinaasit. Tässä tutkimuksessa keskityimme selvittämään tyrosiinispesifisiin proteiinikinaaseihin kuuluvien reseptorityrosiinikinaaasien (RTK) solunsisäisiä vuorovaikutuksia. RTK:t kontrolloivat soluvasteita erilaisiin (solunulkoisiin) ärsykkeisiin. Mikä tahansa entsyymien toimintaa muuttava mutaatio voi aiheuttaa epätavallisia soluvasteita, mikä voi johtaa useisiin eri tauteihin, mukaanlukien syöpään. Onkogeeniset fuusiomutaatiot, t.s. onkofuusiot, ovat mutaatiotyyppi, joka usein tuottaa syöpää aiheuttavia muutoksia proteiinikinaasien aktiivisuudessa. Onkofuusioiden on arvioitu aiheuttavan jopa 20 % syöpäpotilaiden kuolleisuudesta, ja niitä on tunnistettu sekvenssitason tutkimuksissa kaikista syöpätyypeistä. Tästä huolimatta onkofuusioiden tuottamia fuusioproteiineja ei ole vielä runsaasti tutkittu. Tämän väitöskirjan tavoitteina oli 1) tunnistaa suurimmat onkofuusioissa tavattavat proteiiniryhmät, ja luoda yleistason kuva fuusioiden tuottamista proteiinitason muutoksista, sekä 2) kartoittaa systemaattisesti RTK:iden kanssa vuorovaikuttavat proteiinit, joista erikseen RTK:iden substraattiproteiinit. Tutkiaksemme syöpäkasvaimista löydettyjä onkofuusioita, analysoimme lähes 30000:n tunnetun onkofuusion proteiinitason muutokset. Havaitsimme, että 30 % fuusioista voi tuottaa proteiineja, joissa on ominaisuuksia molemmista villityypin geeneistä. Lisäksi huomasimme, että kaksi suurinta geeniryhmää proteiinia tuottavissa fuusioissa ovat proteiinikinaasit ja transkriptiotekijät. Proteiinikinaasien ryhmässä erityisesti RTK:t olivat yliedustettuina, etenkin onkofuusioissa, joiden tuotteissa on kokonainen proteiinityrosiinikinaasidomeeni. RTK geeniperhettä on tutkittu paljon. Kuitenkin tutkimukset ovat usein keskittyneet yksittäisiin reseptoreihin, ja monien funktiot eivät ole hyvin tunnettuja. Tunnistaaksemme kaikkien ihmisen RTK:iden kanssa vuorovaikutuksessa olevat proteiinit, sekä erikseen substraatit, käyttäen massaspektrometriamenetelmiä. Tutkimuksen tulokset ovat laajin systemaattinen RTK:iden vuorovaikutussuhteiden ja substraattien kartoitus. Tulokset kattavat 90 % kaikista ihmisen RTK:ista, ja korostavat jaettuja solunsisäisiä signalointireittejä ja RTK-RTK vuorovaikutuksia tärkeinä RTK:iden funktioiden osa-alueina. Tunnistetut substraatit ja proteiini-proteiini vuorovaikutukset edustavat suurta lisäystä tunnettuun tietoon, etenkin vähän tutkituilla RTK:illa. Erityisesti tulokset lisäävät tietoa RTK:iden signalointiverkkojen yhdistyneisyydestä ja reseptorien välisistä vuorovaikutuksista.

Since the annotation of the dog genome in 2005, dogs have emerged as excellent models of human disease. Many disease associations of variant alleles in homologous genes have been discovered in dogs, providing new therapeutic candidates to the corresponding human diseases as well as establishing preclinical large animal models. Significant progress in genetic studies has happened after moving from microarrays to next generation sequencing or combining the two approaches. This transition has required the development and application of novel bioinformatic approaches to facilitate genetics and genomics. This thesis established a variety of bioinformatic approaches and tools to facilitate canine genomics and disease gene discovery. In study I, the successful development and application of the bioinformatic pipelines resulted in the identification of causal variants of three new disease genes, SLC37A2, SCARF2 and FAM20C, of relevance to Caffey disease, van den Ende Gupta syndrome (VDEGS) and Raine syndrome in human, respectively. In study II, novel genomic content was discovered through de novo assembly of genomic reads of Border Collies, which didn’t map to the current canine genome reference. This study revealed sequences that filled the existing gaps in the reference genome and identified gene models that were missing from the reference. Overall, this study reveals novel genomic content to facilitate the improvement of upcoming canine genome reference for disease variant allele discovery in candidate genes. In study III, a novel bioinformatic tool, webGQT, was successfully developed and piloted to handle and filter large amounts of next generation sequencing (NGS) data. This tool is purported to non-bioinformatics users to mine genetic information from millions to billions of variants among thousands of genomes. This tool has been successfully utilized in various disease genetics projects. In summary, new bioinformatic approaches have been successfully developed and applied in this thesis to facilitate both the transition of the field to the NGS era and disease gene discovery and genomics in dogs. These findings in this thesis have implications to veterinary research, diagnostics and human medicine with novel candidate genes in three rare disorders.

Sphingolipids, a major component of the plasma membrane, regulate various cellular activities and display essential physiological functions. The cellular processes that control sphingolipid homeostasis are complex and incompletely understood. The lysosomes are responsible for digesting intracellular and extracellular materials, including sphingolipids, and these organelles play a role as a hub in metabolic signaling, coordinating cellular anabolism and catabolism. Lysosome-associated protein transmembrane 4 B (LAPTM4B) is highly expressed in many types of cancers and associates with poor prognosis. On the cellular level, LAPTM4B affects cellular processes including nutrient sensing, autophagy, proliferation, cell migration, drug resistance, and sphingolipid homeostasis. Less is known regarding the function of LAPTM4B at the molecular level, because studies have been hampered by a lack of molecular tools and of specific LAPTM4B antibodies. In this thesis, we sought to elucidate the lipid and protein environment of LAPTM4B, and how these are coordinated to regulate downstream signaling events. In our first study, we combined approaches from biochemistry, computer simulations, and lipid biology to show that the third transmembrane domain of LAPTM4B contains a ceramide-regulated element consisting of a sphingolipid interaction motif and an adjacent aspartic acid residue (D202). This feature is essential for regulating the interaction between LAPTM4B and 4F2hc, a subunit of the amino acid transporter CD98. The ceramide induced an interaction between LAPTM4B and 4F2hc, and this interaction promotes downstream mTORC1 signaling. In our second study, we characterized a novel monoclonal antibody, which we used to visualize the subcellular distribution of endogenous LAPTM4B for the first time. By site-directed mutagenesis of putative start codons, we identified LAPTM4B-24 as the major expressed and physiologically important isoform in a majority of human cells and tissues. We further showed that endogenous LAPTM4B has a fast turnover, and is regulated by nutrient availability and ceramide, pointing to a role at the crossing-point of sphingolipid metabolism and nutrient signaling. In our third study, we investigated the role of LAPTM4B in regulating the lipidomes of cells and the secreted extracellular vesicles. We found LAPTM4B to be sorted into intraluminal vesicles of multivesicular bodies and subsequently to be released from cells in small extracellular vesicles (sEVs). The secretion dynamics of LAPTM4B was dependent on the ceramide-regulated motif. Shotgun lipidomics revealed that LAPTM4B regulates the sphingolipid- and ether lipid content in cells and in sEVs. This thesis provides evidence that LAPTM4B is a dynamically regulated protein that functions at the intersection of sphingolipid metabolism and nutrient signaling. Crosstalk between LAPTM4B and ceramide facilitates nutrient signaling, and these processes may in part underlie the association observed between LAPTM4B and cancer progression. Future work is warranted to elucidate the molecular function of LAPTM4B in the endosomal-lysosomal system, and to elucidate the LAPTM4B isoform-specific functions in different organs and diseases, as well as to solve the three-dimensional structure of LAPTM4B. Such knowledge will deepen our understanding of LAPTM4B- and ceramide-related pathophysiology in cancers and in sphingolipid-metabolism disorders. Sfingoilipidit, jotka ovat plasmakalvon tärkeä osa, säätelevät erilaisia solutoimintoja ja esittävät keskeisiä fysiologisia toimintoja.Solujen prosessit, jotka ohjaavat sfingolilipidin homeostaasi ovat monimutkaisia ja epätäydellisesti ymmärretty.lysosomit ovat vastuussa solunsisäisten ja solun ulkopuolisten materiaalien, mukaan lukien sfingolifidit, sulattamisesta, ja nämä organellit ovat keskeisessä asemassa aineenvaihduntaopastuksessa, solujen anabolism in ja katabolismin koordinoinnissa.Lysososososoihin liittyvä proteiinitransmembraani 4 B (LAPTM4B) ilmaistaan voimakkaasti monissa syöpälajeissa ja liittyy huonoon ennusteeseen.Solujen tasolla LAPTM4B vaikuttaa soluprosesseihin, kuten ravinteiden havaitsemiseen, autofaagiin, proliferaatioon, soluihin siirtymiseen, lääkeresistenssiin ja sfingolilipidin homeostaasiin.Vähemmän tiedetään LAPTM4B: n toiminnasta molekyylitasolla, koska tutkimuksia on vaikeuttanut molekyylityökalujen ja tiettyjen LAPTM4B- vasta- aineiden puute.Tässä tutkielmassa yritimme selvittää LAPTM4B:n rasva- ja proteiiniympäristöä ja sitä, miten niitä koordinoidaan myöhemmän vaiheen merkkitapahtumien sääntelemiseksi. Ensimmäisessä tutkimuksessamme yhdistimme biokemian lähestymistapoja, tietokonesimulaatioita ja lipidibiologiaa osoittaaksemme, että LAPTM4B:n kolmas transmembraanidomain sisältää keramidin säätelemän elementin, joka koostuu sfingolilipidin vuorovaikutuksesta ja sitä seuraavasta aspartiinihapon jäämästä (D202).Tämä ominaisuus on välttämätön, jotta voidaan säännellä aminohapposiirtimen CD98-bakteerin (LAPTM4B) ja 4F2hc:n (joka on aminohapposiirtimen CD98) välistä vuorovaikutusta.Keramidi aiheutti interaktion LAPTM4B:n ja 4F2hc:n välillä, ja tämä yhteisvaikutus edistää myöhempää mTORC1- merkkien antamista. Toisessa tutkimuksessa luonnehdimme uutta monoklonaalista vasta-ainetta, jota käytimme visualisoimaan endogeenisen LAPTM4B: n subsellulaarisen jakautumisen ensimmäistä kertaa.Positiivinen mutageneesi oletetulla aloituskoodionilla määrittelimme LAPTM4B- 24:n tärkeimmäksi ilmaistuksi ja fysiologisesti tärkeäksi isomuodoksi suurimmassa osassa ihmisen soluja ja kudoksia.Lisäksi osoitimme, että endogeenisellä LAPTM4B: llä on nopea liikevaihto, ja sitä säätelevät ravinteiden saatavuus ja keramidi, mikä osoittaa, että sillä on rooli risteysvaiheessa, jossa sfingolibidi metaboloituu ja ravinteiden signaali. Kolmannessa tutkimuksessa tutkimme LAPTM4B:n roolia, kun se sääteli solujen lipidomeja ja erittyneitä solun ulkopuolisia rakkuloita.Löysimme LAPTM4B:n, joka on lajiteltu multivesikulaarikehojen sisävalorakkuloihin ja joka myöhemmin vapautuu soluista pienissä soluissa (sEV).LAPTM4B: n erittymisen dynamiikka riippui keramidin säätelemästä motiivesta.Shotgun lipidomiikka paljasti, että LAPTM4B säätelee sfingolilipidiä ja eetterilipidiä soluissa ja sEV:issä. Tämä teesi osoittaa, että LAPTM4B on dynaamisesti säännelty proteiini, joka toimii sfingolibidin aineenvaihdunnan ja ravintoaineiden merkkien risteyksessä.Ristiriita LAPTM4B:n ja keramidin välillä helpottaa ravinteiden opastamista, ja nämä prosessit voivat osittain olla perustana LAPTM4B:n ja syövän etenemisen väliselle yhteydelle.Tulevaisuudessa on tehtävä työtä, jotta voidaan selvittää LAPTM4B:n molekyylifunktio endosomaalisessa lysosomaalisessa järjestelmässä ja selvittää LAPTM4B:n isoform-spesifisiä toimintoja eri elimissä ja sairauksissa,sekä LAPTM4B:n kolmiulotteisen rakenteen ratkaisemiseksi. Tällaiset tiedot syventävät käsitystämme LAPTM4B- ja keramidiin liittyvästä patofysiologiasta syöpien ja sfingolilipidien aineenvaihduntahäiriöiden osalta.

Fundamental processes of essentially each cell of the human body depend on structures built of actin. This relatively small (MW=42 kDa) protein is a central building block of the cytoskeleton. Actin-based structures contribute to diversified processes, including cell migration, morphogenesis, and intracellular transport. Above-mentioned activities are crucial in multiple basic physiological events, for example embryonal development, wound healing and immunological responses. Moreover, abnormal regulation of actin networks has implications in various diseases, such as cancer. Although extensively studied over the years, the field of actin-based structures still lacks answers for many important questions. For example, contractile actomyosin bundles of non-muscle cells, stress fibers, are essential for cell morphogenesis, adhesion and mechanosensing. However, the precise mechanisms regulating their assembly and function remain unclear. Studies included in this thesis reveal novel aspects underlying regulation of contractile structures in non-muscle cells. Assembly and organization of stress fibers depend not only on biochemical signals, but also on mechanical ones. Study I identifies mechanosensitive Ca2+-dependent CaMKK2-activation as an upstream regulator of AMPK-VASP pathway, which is crucial for contractile stress fiber maturation. Studies II and III unravel how two distinct proteins, calponin-3 and caldesmon, contribute to regulation of stress fiber organization and contractility in non-muscle osteosarcoma cells. We show, that calponin-3 is a dynamic component of all stress fiber subtypes. Moreover, its presence is essential to manage their proper contractility, as calponin-3 deficiency leads to uncontrolled behavior and breakage of stress fibers due to increased tension. We also show for the first time that non-muscle caldesmon is present exclusively in contractile stress fibers, where it colocalizes with myosin II motor domains. Moreover, we demonstrate an important role for caldesmon in regulation of stress fiber contractility, as lack of this protein leads to lower number of thick contractile bundles and reduced traction forces. Together, these studies broaden our knowledge on the mechanisms underlying assembly and regulation of contractile stress fibers in non-muscle cells. Useat solujemme tärkeistä prosesseita ovat riippuvaisia aktiinista muodostuvista rakenteista. Tämä varsin pienikokoinen (molekyylipano 42 kDa) proteiini on solun tukirangan keskeinen komponentti. Aktiinista koostuvat rakenteet osallistuvat moninaisiin solun prosesseihin, kuten liikkumiseen, muodonmuutoksiin ja solun sisäisiin kuljetusreaktioihin. Nämä aktiini-riippuvaiset prosessit ovat edelleen tärkeitä muun muassa yksilönkehityksessä, haavojen paranemisessa ja immuunivasteessa. Tämän lisäksi häiriöt aktiinitukirangan säätelyssä ovat tyypillisiä erilaisissa sairauksissa, kuten syövässä. Vaikka aktiinitukirankaa on intensiivisesti tutkittu jo vuosien ajan, monia tärkeitä avoimia kysymyksiä on vielä jäljellä. Esimerkiksi ne mekanismit, joilla solujen supistuvat aktiinirakenteet, stressisäikeet, muodostuvat on edelleen huonosti tunnettu. Stressisäikeet ovat tärkeitä muun muassa solujen kiinnittymisessä alustaansa, muodonmuutoksissa, sekä solun vasteissa ympäristön mekaanisille ominaisuuksille. Tässä väitöskirjassa esitetyissä tutkimuksissa selvitimme miten stressisäikeiden muodostumasta ja supistumista säädellään soluissa. Stressisäikeiden muodostuminen ei ole ainoastaan riippuvaista biokemiallisista signaaleista, sillä myös solun ulkoiset ja sisäiset mekaaniset ominaisuudet säätelevät stressisäikeiden muodostumista ja toimintaa. Julkaisussa I identifioimme mekanosensitiivisen, Ca2+ -riippuvaisen CaMKK2 aktivaation olevan keskeinen AMPK-VASP signalointipolun säätelijä, joka on välttämätön stressisäikeiden muodostumiselle soluissa. Julkaisut II ja III valaisevat miten kaksi aktiinia sitovaa proteiinia, calponin-2 ja caldesmon, osallistuvat stressisäikeiden organisaatioon ja säätelevät niiden supistumista osteosarkooma-soluissa. Tutkimuksemme osoittivat, että calponin-3 on dynaaminen stressisäikeiden komponentti. Havaitsimme myös, että calponin-3 on välttämätön stressisäikeiden normaalille supistumiselle, sillä sen poistaminen soluista johti stressisäikeiden kontrolloimattomaan supistumiseen, ja tämän seurauksena usein niiden katkeamiseen. Tämän lisäksi havaitsimme, että caldesmon on supistuvien stressisäikeiden komponentti, joka lokalisoituu myosiini II:n moottoridomeinin välittömään läheisyyteen. Myös caldesmonilla on keskeinen merkitys stressisäikeiden supistumisen säätelijänä, sillä sen poisto soluista johti stressisäikeiden ohenemiseen ja heikompaan supistumiseen. Yhdessä nämä tutkimukset laajentavat ymmärrystämme niistä mekanismeista, jotka säätelevät stressisäikeiden muodostumista ja supistumista soluissa.

Cells are the minimal compartments of life that constantly respond to cues coming from both inside and outside of their environment. In response, cells migrate, transport different molecules and undergo sudden shape changes to meet their environmental demands. These processes are regulated by the actin cytoskeleton, a ubiquitous component of eukaryotic organisms that dynamically cycles between monomeric and polymeric form at the sites of cellular rearrangements. Polymerization of actin against plasma membranes and organelles provides force to the constant remodeling of cells. Consequently, the actin cytoskeleton is critical for many fundamental cellular processes, including cell division, cell migration, cellular morphogenesis, endo- and exocytosis. Actin molecules bind ATP and polymerize to polar filaments with structurally two different ends. Actin filaments grow from the ‘plus’ (+) ends by the incorporation of ATP-actin monomers, after which they convert through ATP-hydrolysis to ADP-state that populates the ‘minus’ (-) end of the filaments. ADP-state renders actin molecules to a state of depolymerization, and thus actin filaments slowly shrink from the (-) ends in steady-state conditions. This is a fundamental property of actin filaments that drives their directional growth in the force production. Thus, cells require a constant supply of actin monomers from depolymerization of ‘old’ filaments and conversion of these actin monomers from ADP- to ATP-state. Several proteins, including evolutionary conserved ADF/cofilin and cyclase-associated protein (CAP), are involved in the regulation of these steps in cells, but the exact molecular mechanisms have remained elusive. In this work, I studied the molecular principles of how actin filaments are dynamically converted between monomeric and filamentous forms. CAP is a multidomain protein and earlier shown to be critical for actin dynamics in various model organisms. However, the molecular mechanisms by which CAP regulates actin dynamics have remained unknown. In the first and second parts of my thesis, I utilized X-ray crystallography, mutagenesis and biochemical assays to reveal how CAP interacts with both actin monomers and filaments. I show that the N-terminal domains of CAP are responsible for binding to the (-) ends of actin filaments and catalysis of rapid filament depolymerization in synergy with ADF/cofilin. The C-terminal domains of CAP scavenge the depolymerized ADP-actin molecules from ADF/cofilin and catalyze their conversion to ATP-state. These data establish CAP as a recycling machine for actin molecules and explain the earlier in vivo observations why different domains of CAP are vital for rapid actin dynamics in cells. In the fourth part of my thesis, I show how rapid actin dynamics are achieved in an evolutionary distant organism, pathological Leishmania parasite that contains only a very simple actin-regulatory machinery. By utilizing the molecular tools developed in the third study, combined with cryo-electron microscopy, mutagenesis and biochemical assays, I show that Leishmania actin filaments are inherently dynamic and susceptible to disassembly by ADF/cofilin, and reveal the atomic mechanisms behind these attributes. These data help to understand the mechanisms that regulate the actin cytoskeleton evolved in eukaryotic organisms and could provide a molecular rationale for development of inhibitory compounds against Leishmania parasite actin in future. Together, this work provides a detailed molecular level understanding of new mechanism by which the dynamics of actin cytoskeleton are regulated in eukaryotic organisms. This work also provides insight into the evolution of the actin cytoskeleton and its regulatory mechanisms. Finally, the findings presented here help understanding the basic mechanisms of biological processes, and also provide molecular level understanding of the mechanisms of human diseases. Solut ovat elämän perusyksiköitä, jotka reagoivat ympäristössä tapahtuviin muutoksiin solun ulkoisten tai sisäisten viestien sanelemana. Näiden seurauksena solut voivat liikkua ympäristössään, muuttaa muotoaan ja vaihtaa molekyylejä ympäristönsä kanssa. Nämä solun perustoiminnot ovat riippuvaisia solujen aktiinitukirangasta. Tämä pääasiassa aktiini-nimisestä proteiinista koostuva verkosto on jokaisen aitotumallisen solun erityisrakenne, joka vaihtelee aktiivisesti monomeerisen ja säikeisen muodon välillä. Aktiinin säikeistyminen tuottaa voimaa solukalvojen ja soluelinten muodonmuutoksille sekä uudelleenjärjestelylle. Tästä syystä aktiinitukiranka on tärkeä useissa erilaisissa solutoiminnoissa, solujakautumisesta solujen liikkumiseen ja muodonmuutoksiin, sekä ekso- ja endosytoosiin. Aktiinimolekyylit sitovat ATP:tä ja säikeistyvät kaksinapaisiksi rakenteiksi. Tasapainotilassa aktiinisäikeet kasvavat liittämällä ATP-tilassa olevia aktiinimonomeereja ’plus’ (+) päähän, minkä jälkeen ne muuntuvat ATP-hydrolyysireaktion kautta ADP-tilaan ja purkautuvat hitaasti säikeen ’miinus’ (-) päästä. Tämä aktiinisäikeiden perusominaisuus kasvaa (+) päistä ja pienentyä (-) päistä on tärkeää kohdennetussa voiman tuotossa. Solut tarvitsevatkin jatkuvasti ATP-tilassa olevia aktiinimonomeerejä kierrättämällä niitä ’vanhoista’ aktiinisäikeistä ADP/ATP-nukleotidin vaihtoreaktiossa. Näitä aktiinin kierrätysvaiheita säätelevät soluissa useat proteiinit, mukaan lukien ADF/kofiliini ja syklaasiin-assosioituva proteiini. Kyseisten säätelytekijöiden molekulaariset perustat aktiinin kierrätykselle ovat kuitenkin huonosti ymmärrettyjä. Tässä tutkielmassa tutkin molekylaarisia mekanismeja, joilla aktiinisäikeitä säädellään aktiivisesti säikeisen ja monomeerisen tilan välillä. Syklaasiin-assosioituva proteiini on useista domeeneista koostuva proteiini, joka on aiemmin havaittu tärkeäksi aktiinin säätelytekijäksi eri malliorganismeissa. Tärkeydestään huolimatta tämän proteiinin molekylaarinen perusta aktiinitukirangan säätelyssä on huonosti ymmärretty. Tutkielmani ensimmäisessä ja toisessa osatyössä selvitin syklaasiin-assosioituvan proteiinin ja aktiinin välisiä vuorovaikutuksia hyödyntäen röntgensädekristallografiaa ja biokemiallisia aktiivisuuskokeita soluista eristetyillä proteiineilla. Tämän tutkielman tulokset osoittavat molekyylitason mekanismin, joilla syklaasiin-assosioituvan proteiinin aminopäässä oleva domeeni vuorovaikuttaa aktiinisäikeiden (-) pään aktiinimolekyyleihin niiden purkautumista nopeuttavalla tavalla, mikä on riippuvaista ADF/kofiliinin ja aktiinin välisistä vuorovaikutuksista. Lisäksi nämä tulokset osoittavat molekyylitasolla miten syklaasiin-assosioituvan proteiinin karboksipäässä oleva domeeni vastaanottaa (-) päästä purettuja ADP-tilassa olevia aktiinimolekyylejä, ja katalysoi niiden ADP/ATP-nukleotidivaihtoreaktiota. Nämä tulokset havainnollistavat molekyylitasolla miksi syklaasiin-assosioituva proteiini on elintärkeä tekijä aktiinitukirangan säätelyssä aitotumallisissa soluissa. Tutkielmani neljännen osatyön tulokset osoittavat kuinka aktiinitukirankaa säädellään Leishmania-loisen soluissa. Hyödyntäen apunani kolmannessa osatyössä kehitettyjä työkaluja, kryoelektronimikroskopiaa ja biokemiallisia aktiviisuuskokeita, osoitimme että Leishmania-parasiitin aktiinisäikeet purkautuvat luonnostaan hyvin nopeasti ja ovat erityisesti alttiita ADF/kofiliinin säätelylle. Pystyimme myös selvittämään näiden erityisominaisuuksien molekylaarisen perustan. Työni tulokset lisäävät ymmärrystä aktiinitukirangan evoluutiosta ja voivat auttaa tulevaisuudessa kehittämään Leishmania-loisen aktiinitukirangan toimintaa estäviä yhdisteitä. Tämä väitöskirjatyö havainnollistaa uusia molekyylitason mekanismeja, joilla aktiinisäikeitä säädellään aitotumallisissa soluissa. Lisäksi tämä työ lisää ymmärrystä aktiinitukirangan muutoksista evoluutiossa sekä sen säätelystä aitotumallisissa soluissa. Nämä havainnot ovat tärkeitä solun perusmekanismien ymmärtämisessä, ja voivat siten auttaa myös ymmärtämään eri sairauksien perusmekanismeja.