A novel multiplexed interactome proteomics approach for studying cellular signaling

Cellular compartment organization, signaling transduction, and regulatory processes are governed by protein-protein interactions (PPIs). The affinity purification coupled mass spectrometry (AP-MS) and proximity-labeling methods such as BioID have been wildly applied to understand protein interaction networks. AP-MS methods are suited to identify and quantify protein interaction and protein complex stoichiometries, while the BioID method provides information regarding transient or close-proximity interactions. Both AP-MS and BioID can identify distinct interactions, and complementary provides a more comprehensive view of a protein's interactome. In this study, we developed an integrated approach utilizing 'multiple approaches combined' (MAC)-tag that utilizes both AP-MS and BioID in a single construct to parallel explore the protein interactive. First, we systematically applied the MAC-tag approach to 18 bona fide localization markers to generate a molecular context database for every cellular compartment. Using this molecular context as the reference, alignment interaction profile of other proteins of interest (POIs) on it can reveal the subcellular localization of the POIs. We named this reference database, mass spectrometry (MS)-microscopy. Similarly, we applied the MAC-tag approach on three sub-organelle localization markers of mitochondria to set up a sub-organelle molecular context proteome map. Using this sub-organelle reference proteome map, we could detect sub-mitochondrial localization of POIs by MS-microscopy system. Furthermore, by comparing interaction data from several MAC-tagged mitochondrial proteins, we could define the unique interactors of GrpE-like proteins (GRPEL1 and GRPEL2) to investigate their specific roles in mammalian mitochondria. Next, we utilized the MAC-tag approach to map the interactome of the mammalian Hedgehog signaling. We monitored the dynamic PPI network surrounding the core components in the absence and presence of Hh ligand. Our comparative PPI analysis showed that the interaction network recapitulates many known ciliary proteins, asserting the essential role of primary cilia in Hh signaling. Meanwhile, we characterized the interaction network at the level of cilium progression by monitoring the PPIs under cilia absence, ciliogenesis, and cilia absorption conditions. The significant overlap of the interaction between three states indicated that proteins could regulate the Hh signaling outside the primary cilia. Additionally, we expanded the coverage of MS-microscopy to the primary cilium, a transient organelle of the cell. Although what we present is just a glimpse of the Hh interaction network under ligand stimulation or specific growth conditions, these PPIs will extend our knowledge on the mammalian Hh signaling and help us to development of novel therapeutic strategies to inhibit abnormal Hh signaling in cancer. Collectively, the presented thesis introduces the MAC-tag approach that can be used for mapping local protein interactome, predicting subcellular localization of POIs, and reconstructing the interaction network of the signaling pathway. Soluosastojen organisaatiota, signalointitransduktiota ja säätelyprosesseja säätelevät proteiini-proteiini-vuorovaikutukset (PPI). Affiniteettipuhdistukseen kytkettyä massaspektrometriaa (AP-MS) ja läheisyysmerkintämenetelmiä, kuten BioID, on käytetty villisti ymmärtämään proteiini-vuorovaikutusverkkoja. AP-MS-menetelmät soveltuvat proteiinien vuorovaikutuksen ja proteiinikompleksisten stoikiometrioiden tunnistamiseen ja kvantifiointiin, kun taas BioID-menetelmä tarjoaa tietoa ohimenevistä tai läheisistä vuorovaikutuksista. Sekä AP-MS että BioID voivat tunnistaa erilliset vuorovaikutukset, ja komplementaariset tarjoavat kattavamman kuvan proteiinin interaktomista. Tässä tutkimuksessa kehitimme integroidun lähestymistavan, jossa hyödynnetään ”MAC-tagia” (useita lähestymistapoja yhdistettynä), jossa hyödynnetään sekä AP-MS: tä että BioID: tä yhdessä rakenteessa tutkiakseen rinnakkain proteiini-interaktomia. Ensinnäkin sovelsimme systemaattisesti MAC-tag-lähestymistapaa 18 vilpittömässä mielessä tapahtuviin lokalisointimarkkereihin molekyylikontekstitietokannan generoimiseksi jokaiselle soluosastoon. Käytettäessä tätä molekyylikontekstia referenssinä, muiden kiinnostavien proteiinien (POI: t) kohdistusvuorovaikutusprofiili voi paljastaa POI: ien sub-sellulaarisen lokalisaation. Nimeimme tämän referenssitietokannan, massaspektrometria (MS) -mikroskopia. Samoin sovelimme MAC-tag-lähestymistapaa mitokondrioiden kolmeen alaorganellin lokalisaatiomarkkeriin sub-organelle-molekyylin kontekstiproteomikartan perustamiseksi. Tätä sub-organelle-referenssiproteomikarttaa käyttämällä voimme havaita POI-kohteiden sub-mitokondriaalisen sijainnin MS-mikroskopiajärjestelmällä. Lisäksi vertaamalla useiden MAC-leimattujen mitokondriaalisten proteiinien vuorovaikutustietoja voimme määritellä GrpE: n kaltaisten proteiinien (GRPEL1 ja GRPEL2) ainutlaatuiset interaktorit tutkia niiden spesifisiä tehtäviä nisäkkäiden mitokondrioissa. Seuraavaksi käytimme MAC-tag-lähestymistapaa nisäkkäiden Hedgehog-signaloinnin interaktomin kartoittamiseen. Tarkkailemme ydinkomponentteja ympäröivää dynaamista PPI-verkkoa Hh-ligandin puuttuessa ja läsnä ollessa. Vertaileva PPI-analyysimme osoitti, että vuorovaikutusverkko yhdistää uudelleen useita tunnettuja siriaariproteiineja ja vakuuttaa primaaristen silikoiden oleellisen roolin Hh-signaloinnissa. Sillä välin luonnehdimme vuorovaikutusverkkoa ciliumin etenemisen tasolla seuraamalla PPI: itä silikoiden poissa ollessa, siliogeneesissä ja silikoiden imeytymisolosuhteissa. Kolmen valtion välisen vuorovaikutuksen merkittävä päällekkäisyys osoitti, että proteiinit voisivat säädellä Hh-signalointia primaarisen silikan ulkopuolella. Lisäksi laajensimme MS-mikroskopian kattavuuden primaariseen ciliumiin, solun ohimenevään organelliin. Vaikka se, mitä esittelemme, on vain välähdys Hh-vuorovaikutusverkosta ligandistimulaation tai erityisten kasvuolosuhteiden aikana, nämä PPI: t laajentavat tietämystämme nisäkkäiden Hh-signaloinnista ja auttavat meitä kehittämään uusia terapeuttisia strategioita estämään epänormaalia Hh-signalointia syöpään. Esitetyssä tutkielmassa esitellään kollektiivisesti MAC-tag-lähestymistapa, jota voidaan käyttää paikallisen proteiinivuorovaikutuksen kartoittamiseen, POI: ien sub-sellulaarisen lokalisoinnin ennustamiseen ja signalointipolun vuorovaikutusverkon rekonstruointiin.