Regulation of contractile actin structures in non-muscle cells

Fundamental processes of essentially each cell of the human body depend on structures built of actin. This relatively small (MW=42 kDa) protein is a central building block of the cytoskeleton. Actin-based structures contribute to diversified processes, including cell migration, morphogenesis, and intracellular transport. Above-mentioned activities are crucial in multiple basic physiological events, for example embryonal development, wound healing and immunological responses. Moreover, abnormal regulation of actin networks has implications in various diseases, such as cancer. Although extensively studied over the years, the field of actin-based structures still lacks answers for many important questions. For example, contractile actomyosin bundles of non-muscle cells, stress fibers, are essential for cell morphogenesis, adhesion and mechanosensing. However, the precise mechanisms regulating their assembly and function remain unclear. Studies included in this thesis reveal novel aspects underlying regulation of contractile structures in non-muscle cells. Assembly and organization of stress fibers depend not only on biochemical signals, but also on mechanical ones. Study I identifies mechanosensitive Ca2+-dependent CaMKK2-activation as an upstream regulator of AMPK-VASP pathway, which is crucial for contractile stress fiber maturation. Studies II and III unravel how two distinct proteins, calponin-3 and caldesmon, contribute to regulation of stress fiber organization and contractility in non-muscle osteosarcoma cells. We show, that calponin-3 is a dynamic component of all stress fiber subtypes. Moreover, its presence is essential to manage their proper contractility, as calponin-3 deficiency leads to uncontrolled behavior and breakage of stress fibers due to increased tension. We also show for the first time that non-muscle caldesmon is present exclusively in contractile stress fibers, where it colocalizes with myosin II motor domains. Moreover, we demonstrate an important role for caldesmon in regulation of stress fiber contractility, as lack of this protein leads to lower number of thick contractile bundles and reduced traction forces. Together, these studies broaden our knowledge on the mechanisms underlying assembly and regulation of contractile stress fibers in non-muscle cells. Useat solujemme tärkeistä prosesseita ovat riippuvaisia aktiinista muodostuvista rakenteista. Tämä varsin pienikokoinen (molekyylipano 42 kDa) proteiini on solun tukirangan keskeinen komponentti. Aktiinista koostuvat rakenteet osallistuvat moninaisiin solun prosesseihin, kuten liikkumiseen, muodonmuutoksiin ja solun sisäisiin kuljetusreaktioihin. Nämä aktiini-riippuvaiset prosessit ovat edelleen tärkeitä muun muassa yksilönkehityksessä, haavojen paranemisessa ja immuunivasteessa. Tämän lisäksi häiriöt aktiinitukirangan säätelyssä ovat tyypillisiä erilaisissa sairauksissa, kuten syövässä. Vaikka aktiinitukirankaa on intensiivisesti tutkittu jo vuosien ajan, monia tärkeitä avoimia kysymyksiä on vielä jäljellä. Esimerkiksi ne mekanismit, joilla solujen supistuvat aktiinirakenteet, stressisäikeet, muodostuvat on edelleen huonosti tunnettu. Stressisäikeet ovat tärkeitä muun muassa solujen kiinnittymisessä alustaansa, muodonmuutoksissa, sekä solun vasteissa ympäristön mekaanisille ominaisuuksille. Tässä väitöskirjassa esitetyissä tutkimuksissa selvitimme miten stressisäikeiden muodostumasta ja supistumista säädellään soluissa. Stressisäikeiden muodostuminen ei ole ainoastaan riippuvaista biokemiallisista signaaleista, sillä myös solun ulkoiset ja sisäiset mekaaniset ominaisuudet säätelevät stressisäikeiden muodostumista ja toimintaa. Julkaisussa I identifioimme mekanosensitiivisen, Ca2+ -riippuvaisen CaMKK2 aktivaation olevan keskeinen AMPK-VASP signalointipolun säätelijä, joka on välttämätön stressisäikeiden muodostumiselle soluissa. Julkaisut II ja III valaisevat miten kaksi aktiinia sitovaa proteiinia, calponin-2 ja caldesmon, osallistuvat stressisäikeiden organisaatioon ja säätelevät niiden supistumista osteosarkooma-soluissa. Tutkimuksemme osoittivat, että calponin-3 on dynaaminen stressisäikeiden komponentti. Havaitsimme myös, että calponin-3 on välttämätön stressisäikeiden normaalille supistumiselle, sillä sen poistaminen soluista johti stressisäikeiden kontrolloimattomaan supistumiseen, ja tämän seurauksena usein niiden katkeamiseen. Tämän lisäksi havaitsimme, että caldesmon on supistuvien stressisäikeiden komponentti, joka lokalisoituu myosiini II:n moottoridomeinin välittömään läheisyyteen. Myös caldesmonilla on keskeinen merkitys stressisäikeiden supistumisen säätelijänä, sillä sen poisto soluista johti stressisäikeiden ohenemiseen ja heikompaan supistumiseen. Yhdessä nämä tutkimukset laajentavat ymmärrystämme niistä mekanismeista, jotka säätelevät stressisäikeiden muodostumista ja supistumista soluissa.