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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico A inclusão de energia, principalmente de amido, na dieta dos bovinos é crescente devido à necessidade de aumento de produtividade e aumento de eficiência zootécnica e financeira nos rebanhos destinados a produção de leite e corte. No entanto, as altas inclusões de amido trazem transtornos metabólicos aos bovinos. O objetivo deste trabalho foi estudar as principais alterações metabólicas de novilhos submetidos a duas dietas com diferentes inclusões de amido (36,96% e 16,81% de amido na MS). Foram utilizados 16 novilhos da raça Holandês com peso vivo inicial médio de 250 + 25,5 Kg, avaliados ao longo de 91 dias de confinamento. As avaliações foram comparadas entre dias e em cada dia avaliado foram coletados amostras nas horas , zero, quatro, seis, oito e dez utilizando com referência a primeira distribuição de alimento do dia. Os animais foram distribuídos de acordo com o peso, 8 animais por grupo. Foram avaliados parâmetros ruminais (pH de fluido ruminal e tempo de redução do azul de metileno), parâmetros sanguíneos (glicose, lactato, albumina, magnésio, cloreto, fósforo, cálcio, ferro, beta hidroxibutirato (B-HBO), ácidos graxos não esterificados (AGNE), insulina, IGF-1, pCO2, TCO2, bicarbonato, hemoglobina dentre outros) e o proteinograma, analisando alfa 1- glicoproteína ácida, alfa 2 macroglobulina, apolipoproteína A1, Apolipoproteína A4, IgG, cerulolasmina, haptoglobina e transferrina. O aumento da inclusão de amido na dieta induziu respostas metabólicas. Os animais que ingeriram dietas com maior proporção de amido apresentaram quadros de compensação de acidose metabólica mais acentuados que animais que ingeriram deitas com menor concentração de amido. Os dois grupos estavam em estado anabólico com ganho de peso de 0,89 e 1,79kg/dia para o grupo de menor e maior inclusão de amido na dieta, respectivamente. Quanto maior o nível de amido na dieta, maiores foram os valores de glicose observados. The aim of this study was to determine the main metabolic alterations I calves that underwent two different diets, one using a 36.96% starch in dry matter composition and another using 16.81%. Sixteen Hollsteiner calves were used, initially weighting an average of 250 + 25,5 Kg, evaluated along a 91-day confinement period. Evaluations were made comparing between experimental days and different sampling moments within the day, at 0, 4, 6, 8 and 10 hours, using as reference the first serving of the day. Animals were distributed in groups of eight components each, according to their weight. Ruminal parameters such as pH of ruminal fluid and blue methylene reduction time were evaluated, as well as blood parameters such as blood glucose, lactate, albumin, magnesium, chloride, phosphorus, calcium, iron, beta-hydroxybutyrate (B-HBO), nonesterified fatty acids, insulin, IGF-1, pCo2, acid glycoprotein, alpha-2-macroglobulin, apolipoprotein A1, apolipoprotein A4, IgG, ceruloplasmin, haptoglobin and transferrin. Evaluating both metabolic and ruminal profile, it was observed that inclusion of higher percentages of starch in diets are able to cause metabolic responses. Animals that have undergone a higher starch-composed diet presented more severe acidosis compensations when compared to the other experimental group. Both experimental groups were in anabolic gain weight of 0,89 e 1,79kg/day for the 36.96% starch-group and 18.81% starch-group, respectively. The higher the starch concentration in the diet, the higher the glucose values obtained. The inclusion of energy in diet, specially coming from starch addition, is becoming increasingly used in calves’ diet in order to increase productivity rates and zootechnic and financial efficiency in both beef and dairy cattle. However, exceedingly higher starch concentrations may cause metabolic disturbances to calves.

O confinamento de gado corte é uma atividade crescente no Brasil e é uma forma de oferecer um produto de melhor qualidade ao consumidor, aumentar a produtividade do rebanho, melhorar a taxa de retorno do capital investido e otimizar as áreas das propriedades. No entanto, quando ocorre a concentração de animais há maior probabilidade de transmissão de patógenos, além de outros fatores de risco pelos quais os bovinos passam durante essa fase terminal do ciclo de produção, como transporte, alimentação com inclusão de altos teores de concentrado, ressocialização com outros indivíduos, estresse térmico e excesso de poeira, que podem predispor a doenças. O presente estudo teve como objetivo avaliar as principais causas de morbidade e mortalidade de bovinos confinados. Foi realizado em um confinamento comercial, onde 15.269 animais foram avaliados diariamente durante seis meses por inspeção, e os animais que morriam eram realizadas necropsias. A morbidade e a mortalidade foi maior em bovinos com mais de noventa dias de confinamento. A morbidade observada foi de 2,43 %, 1,01%, 0,24%, 0,11%, 3,95%. 0,75% e 0,60% para doenças neurológicas, respiratórias, urinárias, comportamentais, locomotoras, oculares e outras doenças, respectivamente, e as taxas de mortalidade foram 0,55%, 0,39%, 0,12%, 0,22%, 0,007% e 0,22% para mortes causadas por doenças respiratórias, neurológicas, urinárias, fraturas e acidentes, outras causas e causas indeterminadas, respectivamente. As doenças foram responsáveis por um tempo médio maior de confinamento e menor ganho de peso médio diário, quando comparado animais doentes com animais saudáveis. Os animais que tiveram algum quadro de doença durante o confinamento tiveram maior custo de produção e margem liquida produtiva negativa, em relação aos animais saudáveis. The beef cattle feedlot is an activity that is growing in Brazil and is a way to offer a better quality product to the consumer, increase herd productivity, improve the rate of return on invested capital and optimize areas of the properties. However, when there is the concentration of animals is most likely transmission of pathogens, and other risk factors by which the cattle pass through during this final phase of the production cycle, such as transportation, powered inclusion of high concentrate grades, rehabilitation with others, heat stress and excessive dust, which may predispose to disease. This study aimed to evaluate the main causes of morbidity and mortality of confined cattle. It was conducted in a commercial feedlot, where 15,269 animals were assessed daily for six months for inspection, and the animals that died were performed necropsies. Morbidity and mortality was higher for cattle aged over ninety days of confinement. The morbidity was observed 2,43 %, 1,01%, 0,24%, 0,11%, 3,95%. 0,75% and 0,60% for neurological diseases, respiratory, urinary, behavior, locomotion, ophtalmological and other diseases, respectively. Mortality rates were 0,55%, 0,39%, 0,12%, 0,22%, 0,007% and 0,22% for deaths from respiratory diseases, neurological, urinary, fractures and accidents, and other undetermined causes, respectively. The disease accounted for a higher average time of confinement and lower average daily gain weight when compared sick animals to healthy animals. The animals that had any illness in the feedlot above had higher production cost and production negative net margin, compared to healthy animals.

O extremo Norte de Minas Gerais se encontra em uma faixa ecotonal localizada entre os biomas Cerrado e Caatinga, região com vários biótopos que devem ser compreendidos como a expressão espacial de uma geobiocenose que apresenta elementos bióticos e abióticos. É nesse cenário marcado pela abundância de diversos biótopos que se localiza o Parque Estadual da Mata Seca. Visando compreender melhor a interação solo/planta/sociedade, este trabalho teve como objetivo analisar a influência dos aspectos químicos, físicos e mineralógicos dos solos e dos fatores antropogênicos sobre as características florísticas, fisionômicas e estruturais dos componentes vegetacionais dos biótopos da área de estudo. Em cada biótopo foram demarcadas cinco parcelas de 15m x 30m (450 m2) com 30 metros de interstício entre estas. Em cada parcela foram amostrados e marcados com etiquetas numeradas todos os indivíduos vivos com circunferência à altura do peito (CAP = 1,30 m do solo) 15 cm. As amostras de solos coletadas foram analisadas química, física e mineralogicamente. A análise mineralógica foi feita na fração argila e na fração areia. Usou-se a da técnica de Difratometria de raios-X (DRX). Os dados sobre a influência antrópica foram obtidos através de entrevistas realizadas com antigos funcionários da fazenda que deu origem ao parque. Nas correlações entre a vegetação e o solo empregou-se a técnica de Analise de Correspondência Canônica (CCA). Foram identificadas cinco classes de solos. A maioria desses solos são eutróficos, desprovidos de alumínio na solução, hipoférricos, com alta concentração de Ca e Mg, com acidez fraca a moderada e argila de atividade alta (Ta). A Difratometria de Raios X (DRX) mostrou o predomínio do quartzo na fração areia. Na fração argila constatou-se presença de caulinita, ilita e montmorilonita na maioria dos solos. O ataque sulfúrico ressaltou o caráter hipóferrico de todos os solos. Os atributos pedológicos foram importantes, mas insuficientes para diferenciar os tipos vegetacionais, pois todos os solos são eutróficos e a área apresenta florestas estacionais em distintos estágios sucessionais. Os fatores antropogênicos, como o corte seletivo de espécies e os desmates cíclicos nas pastagens se destacaram como os mais relevantes na explicação das diferenças entre as formações vegetais do parque. A vegetação do Parque Estadual da Mata Seca apresenta grande riqueza florística que se expressa em 83 espécies distribuídas em 25 famílias. As famílias floristicamente mais ricas foram a Fabaceae, a Bignoneaceae e a Euphorbiaceae. Esses resultados evidenciam os efeitos edáficos e antrópicos sobre as comunidades arbóreas e ainda ressaltam que todos os biotópos possuem árvores jovens inseridas em processos sucessionais de diferentes idades. A CCA proporcionou um agrupamento de três contextos vegetacionais ou setores. O primeiro setor é composto pela Mata Ciliar e o segundo é formado pelas Florestas Estacionais Deciduais em diferentes níveis sucessionais. O terceiro setor constitui-se de parcelas da Caatinga Arbustiva Aberta.Em cada setor ocorreu um agrupamento de espécies geralmente encontradas em ambientes edáficos correspondentes às respectivas áreas. The extreme North of Minas Gerais is located in an ecotone zone between the biomes of Cerrado and Caatinga, a region with various biotypes which must be understood as a spacial expression of a geobiocenosis that contains biotic and abiotic elements. It is in this scenario full of various biotypes that the Mata Seca State Park is located. Aiming at a better understanding of the interaction among soil, plant, and society, the objective of this work is to analyze the influence of chemical, physical and mineralogical aspects of soil and of anthropogenic factors upon the floristic, physiognomic and structural characteristics of the vegetational components of the biotypes in the areas of study. In each biotype five portions of 15 m X 30 m (450 m2) were marked with 30 meters of interstice among them. In each portion all the live individuals with diameter at breast height were tagged and numbered (DBH = 1,30 m from the soil) 15 cm. The samples of the soil were chemically, physically, and mineralogically analyzed. The mineralogical analysis was done in the fraction of clay and in the fraction of sand. The technique used was the X-ray diffractometer (XRD). The data about the anthropic influence was obtained through interviews done with old employees from the farm where the park began. In the correlations between vegetation and soil, the technique of Canonical Correspondence Analysis (CCA) was used. Five classes of soil were identified. Most of them are eutrophic without aluminum in the solution, low in iron, with high concentration of Ca and Mg, with weak to moderate acidity and high clay activity (Ta). The X-ray diffractometer (XRD) showed predominance of quartz in the fraction of sand. In the clay fraction, the presence of kaolinite, illite, and montmorillonite was noticed in most portions of soil. The sulfuric acid attack highlighted that all the soil was low in iron. The pedological attributes were important, but not enough to differentiate the vegetational types, since all the soil portions are eutrophic and there are seasonal forests in different successional stages in the area. The anthropogenic factors, such as the selective cutting of species and the cyclic deforestation in the fields are the most relevant aspects in the explanation of the differences between the vegetational formations in the park. The vegetation in the Mata Seca State Park has such a rich floristic that it expresses itself within 83 species distributed in 25 families. The richest families in terms of floristic were the Fabaceae, the Bignoneaceae, and the Euphorbiaceae. These results show the evidence of the edaphic and anthropic effects upon the tree communities and still point that all the biotypes contain young trees undergoing successional processes at different ages. The CCA made it possible to group three vegetational contexts or sectors. The first sector is composed by Riparian Forest and the second is formed by Decidual Seasonal Forest in different successional levels. The third sector constitutes portions of the open shrubby Caatinga. In each sector there was a grouping of species generally found in edaphic environments correspondent to the respective areas.

O Parque Estadual Mata Seca localiza-se no município de Manga, Norte do Estado de Minas Gerais e apresenta um mosaico vegetacional bastante complexo devido à diversidade de formações vegetais encontradas dentro dos seus limites. Além das diversas fitofisionomias do bioma Caatinga o Parque também possui áreas de pastagens artificiais, manchas de Florestas Decíduas alteradas em diferentes estágios sucessionais e Lagoas Marginais de grande importância para a biota do Rio São Francisco. A área vem sofrendo diversos tipos de pressões antrópicas como a prática da agricultura irrigada, queimadas, carvoejamento clandestino, pisoteio do gado, pesca e caça predatórias. Este trabalho pretendeu fazer um zoneamento ambiental que possa subsidiar a implementação dessa unidade de conservação, além de contribuir para a discussão sobre os desafios que surgem à medida que uma área de proteção integral é implementada. Esse zoneamento foi realizado através de uma metodologia que se baseia no mapeamento de biótopos. Foram identificados e mapeados nove biótopos constatando que a unidade de conservação apresenta uma expressiva variedade de ambientes. Posteriormente foi realizada uma caracterização através de um planilhamento e descrição sumária das áreas amostrais dos biótopos. A Floresta Estacional Decidual de alto porte, a Caatinga Arbórea Aberta e as Matas Ciliares se destacaram por apresentar um ótimo estado de conservação e um avançado processo de sucessão ecológica. As Lagoas Marginais e a Floresta de Afloramentos mostraram-se bastante conservados e com poucos impactos. O Biótopo Florestas Alteradas apresentou impactos como o pisoteio do gado e o efeito de borda. A Sede, o Pivô Cultivado e o Pivô abandonado foram os biótopos mais impactados. A identificação e valoração dos biótopos utilizando-se graus de relevância e indicadores ecológicos permitiram o estabelecimento de zonas específicas para a área. O Parque foi dividido em três zonas a saber: Zona Intangível, Zona Primitiva e Zona de Recuperação. A Zona intangível possui a melhor qualidade ambiental da unidade de conservação, ocupando 64,61% de sua extensão, o que reforça a sua importância na conservação da área e indica a necessidade de ações que visem a sua proteção. A Zona Primitiva ocupa 33,59% da unidade de conservação e apresentou uma qualidade ambiental considerável. No entanto, essa zona abrange áreas que precisam de ações que assegurem a completa e equilibrada regeneração das florestas ai existentes. A Zona de Recuperação ocupa a menor extensão dentro da unidade de conservação (1,80%) evidenciando a elevada qualidade ambiental Parque como um todo. No entanto, deve-se ressaltar que a Zona de Recuperação merece um tratamento muito especial por abranger os biótopos que refletem as maiores alterações e impactos sofridos pela vegetação orignal da área. Por fim, o trabalho discute a solução para os problemas que ameaçam a preservação dos recursos naturais do parque a partir de uma perspectiva que considera o contexto socioeconômico e cultural da região visando alcançar os verdadeiros propósitos do zoneamento ambiental que é garantir a qualidade ambiental dos recursos hídricos e do solo e a conservação da biodiversidade, garantindo o desenvolvimento sustentável e a melhoria das condições de vida da população.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Bactérias do gênero Pseudomonas apresentam um arsenal formidável de enzimas que permitem que hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) sejam utilizados como única fonte de carbono. Dentre essas enzimas, a 1,2-dihidroxinaftaleno dioxigenase de Pseudomonas sp. C18 (DoxG), uma extradiol dioxigenase Fe+2-dependente, catalisa a conversão do 1,2-dihidroxinaftaleno em 2-hidroxi-2H-cromeno-2-carboxilato via uma dioxigenação. Uma reação que não encontra correspondência em síntese clássica. Essa enzima destaca-se por possuir um sítio ativo volumoso que a dota de promiscuidade, sendo capaz de clivar, além de uma série de catecóis, bifenis policlorados (BPCs). Essa formidável capacidade contrasta com a fácil oxidação do cofator Fe+2 pelo oxigênio presente no ar, processo observado durante a lise e purificação da enzima que leva a sua inativação. Nosso objetivo foi determinar quais fatores influenciam a reativação da enzima, bem como as estratégias para aprimorar sua estabilidade e atividade catalítica. A DoxG foi expressa e purificada em condições aeróbicas. A caracterização foi feita pela determinação de sua massa monomérica via eletroforese e experimentos de espalhamento dinâmico de luz consistentes com um estado octamérico com massa de aproximadamente 270 kDa em solução aquosa. A velocidade de reconstituição da holoenzima mostrou ser um processo sensível a vários fatores: (1) a incubação com o íon Fe2+ mostrou-se a forma mais eficiente de reativação; (2) a velocidade de reativação depende da concentração do íon Fe2+; (3) o pH de 5,75 propiciou a forma mais rápida de reativação, sendo que em meios mais alcalinos a disponibilidade do cofator foi limitada e em meios mais ácidos o processo foi afetado negativamente pela protonação de resíduos do sítio ativo que se complexam ao cofator; (4) embora a força iônica com NaCl ou KCl não afetou a reativação, sais ou tampões com ânions capazes de se ligar ao Fe+2 (ex. sulfato) afetaram a disponibilidade do mesmo; (5) a reativação de 90% da enzima requereu duas horas e meia de incubação com o íon Fe2+. Além desses pontos, observou-se que o íon Mn+2 não pôde substituir o íon Fe+2 como cofator, no entanto, conferiu maior estabilidade a DoxG. Estudos de inativação térmica demonstraram que na presença de Mn+2, a enzima não perdeu sua atividade consideravelmente após ser incubada por quarenta minutos a 60 °C. Os estudos de atividade enzimática mostraram que a DoxG foi capaz de catalisar a clivagem do catecol, 3-metilcatecol e 2,3-dihidroxibifenil, sendo que a eficiência catalítica (kcat/Km) para a clivagem do 2,3-dihidroxibifenil foi 1000 vezes maior do que para o catecol e 10 vezes maior do que para o 3-metilcatecol. Bacteria of the genus Pseudomonas have a formidable arsenal of enzymes allowing them to use polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) as the sole carbon source. Among these enzymes, the 1,2-dihydroxynaphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. C18 (DoxG), a Fe+2-dependent dioxygenase extradiol, catalyzes the conversion of 1,2-dihydroxynaphthalene to 2-hydroxy-2H-chromene-2-carboxylate via a dioxygenation. A reaction with no match in classical synthesis. This enzyme exhibits a large active site endorsing its promiscuity, which is able to cleave, in addition to a series of catechols, the polychlorinated biphenyls (BPCs). This formidable capacity contrasts with the facile oxidation of the Fe+2 cofactor by the oxygen present in the air, a process that occurs throughout the lysis and purification of the enzyme and leads to its inactivation. Our goal is to determine the factors to efficient enzyme reactivation, as well as strategies to improve its stability and catalytic activity. Therefore, DoxG was expressed and purified under aerobic conditions. Characterization was done by its monomeric mass determined by electrophoresis and by its oligomeric state estimated using dynamic light scattering, which was consistent with an octamer in aqueous solution showing a molecular mass of about 270 kDa. The rate of holoenzyme reconstitution was sensitive to several factors: (1) incubation with Fe2+ was the most efficient form of reactivation; (2) the reactivation rate depends on concentration of the Fe2+; (3) the pH of 5.75 provided the fastest reactivation. In more alkaline media the availability of the cofactor was limited and in more acidic media the process was negatively affected by protonation of active-site residues involved in the complexation of the cofactor; (4) although the ionic strength using NaCl or KCl did not affect the reactivation, salts or buffers with anions capable of binding Fe+2 (e.g. sulfate) affected its availability; (5) reactivation of 90% of the enzyme required two and a half hours of incubation with Fe2+. In addition, it was observed that Mn+2 could not replace the Fe+2 as cofactor, however, it provided greater stability to DoxG. Thermal inactivation studies showed that in the presence of Mn+2, the enzyme did not lose its activity considerably after being incubated for forty minutes at 60 °C. The enzyme activity studies showed that DoxG was able to catalyze the cleavage of catechol, 3-methylcatechol, and 2,3-dihydroxybiphenyl. The catalytic efficiency (kcat/Km) for cleavage of 2,3-dihydroxybiphenyl was 1000-fold and 10-fold greater than catechol and 3-methylcatechol, respectively.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A aflatoxicose é a intoxicação provocada pela ingestão de aflatoxina por intermédio de alimentos e rações contaminados. Há um grande interesse tanto do meio acadêmico quanto tecnológico na utilização de sensores miniaturizados e relativamente baratos para a detecção de aflatoxina B1. O desenvolvimento de biossensores para diagnóstico é alvo de várias pesquisas e o grafeno surge como modelo para essa aplicação devido às suas propriedades físico-químicas únicas. A realização deste projeto proposto se justifica pela escassez de informações sobre os sensores efetivos da exposição à aflatoxina B1, dada ausência de biossensores que possibilitem esse diagnóstico e visa desenvolver método para ser utilizado como dispositivo do tipo point-of-care para detectar e quantificar a aflatoxina B1-N7-guanina oriundo da ingestão dietética de aflatoxina B1. O grafeno utilizado foi crescido por método de deposição química em fase vapor. Um método de transferência eletroquímica foi utilizado para se retirar o grafeno de seu substrato de crescimento. O dispositivo foi construído contendo um canal de silicone fechado com aberturas unicamente para entrada das soluções da reação e do eletrodo de medição. A área do grafeno foi delimitada por fotolitografia a pequenos retângulos microscópicos sobre contatos de ouro. O grafeno foi funcionalizado com uma solução contendo um linker, o ácido 1-pirenobutanoico éster N-hidroxisuccinimida, uma molécula capaz de interagir com o grafeno e proteínas. A condição intrínseca do grafeno construído em cada chip fabricado foi caracterizada eletricamente por curvas de corrente por tensão de fonte e dreno (IFD × VFD) para todos os conjuntos de eletrodos produzidos. Amostras obtidas do crescimento realizado no laboratório apresentam resistências da ordem de 800 a 3 kΩ. Para averiguar que o grafeno produzido era composto por uma monocamada, algumas medidas de espectroscopia Raman foram realizadas e ensaios de microscopia de fluorescência foram feitos para se determinar a adesão de anticorpos anti-aflatoxina ao grafeno. Com o intuito de utilizar o grafeno como um biossensor, foram avaliados o comportamento e a resposta deste ao efeito de campo por meio da verificação das curvas IFD × VFD. Uma análise de microscopia de força atômica foi realizada para se visualizar a distribuição em nível nanométrico do conjunto linker e proteína. Os dados ilustram uma relação linear dentro da faixa de 0 a 50 nmol/L com R² = 0,977. O limite de detecção de aflatoxina B1-N7-guanina foi calculado em 3,26 nmol/L. Este trabalho apresenta como perspectivas empregar os sensores de grafeno para detecção de aflatoxina B1-N7-guanina atribuindo confiabilidade no diagnóstico rápido de intoxicação e exposição à aflatoxina B1. Aflatoxicosis is an intoxication caused by ingestion of aflatoxin through contaminated food and ration. There is great interest from both academia and industry in the use of relatively inexpensive miniaturized sensors for the detection of aflatoxin B1. The development of diagnostic biosensors has been the subject of much research and graphene is a model for this application due to its unique physicochemical properties. The realization of this proposed project is justified by the scarcity of information about the effective exposure sensors to aflatoxin B1, given the absence of biosensors that allow this diagnosis and aims to develop a method to be used as a point-of-care device to detect and quantify aflatoxin B1-N7-guanine from dietary ingestion of aflatoxin B1. The graphene used was grown by chemical vapor deposition method. An electrochemical transfer method was used to remove graphene from its growth substrate. The device was constructed containing a closed silicon channel with openings solely for the input of reaction solutions and the measuring electrode. The area of graphene was delimited by photolithography to small microscopic rectangles on gold contacts. Graphene was functionalized with a solution containing a linker, 1-pyrenobutanoic acid N-hydroxysuccinimide ester, a molecule capable of interacting with graphene and proteins. The intrinsic condition of the graphene built on each chip manufactured was electrically characterized by source and drain voltage curves (ISD × VSD) for all electrode assemblies produced. Samples obtained from the growth performed in the laboratory have resistances of 800 to 3 kΩ. To verify that the graphene produced was composed of a monolayer, some Raman spectroscopy measurements were performed and fluorescence microscopy assays were performed to determine the adhesion of anti-aflatoxin antibodies to the graphene. In order to use graphene as a biosensor, its behavior and response to the field effect were evaluated by checking the ISD × VSD curves. An atomic force microscopy analysis was performed to visualize the nanometer level distribution of the linker and protein assembly. The data illustrate a linear relationship within the range of 0 to 50 nmol / L with R² = 0.977. The detection limit of aflatoxin B1-N7-guanine was calculated at 3.26 nmol / L. This paper presents the prospects of employing graphene sensors for the detection of aflatoxin B1-N7-guanine, providing reliability in the rapid diagnosis of aflatoxin B1 poisoning and exposure.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Proteínas ligantes de RNA (RBPs) são componentes essenciais na regulação da expressão gênica. A interação entre RBPs e seus mRNA alvos formam os complexos ribonucleoproteicos que ditam o destino dos transcritos e podem se agregar em grânulos citoplasmáticos microscopicamente visíveis em resposta a estímulos capazes de causar a parada súbita da tradução. No Trypanosoma cruzi existe um grande repertório de grânulos, que podem integrar os mecanismos que conferem a esse parasito a sua notável resistência a diferentes tipos de estresse. A ribonucleoproteína RBP42, estudada frequentemente nos tripanosomatídeos, foi descrita pela primeira vez no Trypanosoma brucei como sendo uma proteína citoplasmática essencial para a viabilidade celular. Nesse trabalho realizamos a caracterização da proteína RBP42 do T. cruzi CL Brener (TcbRBP42). Inicialmente, as características dos genes e da proteína TcbRBP42 foram estudadas in silico. As predições de estrutura secundária e buscas por domínios conservados mostraram que a proteína TcbRBP42 apresenta uma estrutura modular composta por dois domínios estruturados, NTF2-like e RRM, ligados entre si por uma longa região central desordenada e enriquecida em sequências de baixa complexidade. Essas características também foram encontradas em seus ortólogos presentes em outros cinetoplastídeos. Adicionalmente, essa proteína é codificada por apenas dois alelos no genoma do parasito. A proteína TcbRBP42 também foi caracterizada no contexto do estresse celular induzido pela radiação gama e pelo benzonidazol, dois agentes aos quais esse parasito apresenta resistência. Para fins de detecção, uma versão recombinante dessa proteína marcada com uma cauda de histidina (rTcbRBP42) foi expressa em epimastigotas. A expressão de rTcbRBP42 não alterou o padrão de crescimento das epimastigotas mantidas em condições normais de cultivo ou submetidas aos tratamentos com radiação gama e benzonidazol. A parada de crescimento ocasionada pelo estresse foi muito similar em epimastigotas expressoras de rTcbRBP42 e wild type. Ensaios de imunofluorescência mostraram que o tratamento dos parasitos com esses agentes promove a distribuição diferencial de rTcbRBP42 que se acumula em estruturas citoplasmáticas granulares, cujas características variam de acordo com o tipo de estresse aplicado. A marcação dos RNAs sintetizados após a indução de estresse também revelou o efeito diferencial dos tratamentos na distribuição celular desses RNAs. Após a irradiação, os RNAs recém-sintetizados não formam grânulos; em vez disso, estes são transportados e se espalham por todo o citoplasma dos parasitos. Em contrapartida, foi observada a agregação desses em focos citoplasmáticos após exposição ao benzonidazol. Esses focos não foram colocalizados com aqueles de rTcbRBP42, o que sugere que os RNAs presentes nessas estruturas provavelmente não são alvos dessa proteína. Em conjunto, os dados sugerem que TcbRBP42 é uma ribonucleoproteína capaz de formar grânulos em resposta a diferentes condições de estresse. Esses grânulos provavelmente variam em composição de acordo com o estresse aplicado e podem ser parte dos muitos mecanismos que permitem a sobrevivência do T. cruzi aos estresses causados pela radiação gama e pelo benzonidazol. RNA binding proteins (RBPs) are essential components for gene expression regulation. The interaction between RBPs and target mRNAs forms ribonucleoprotein complexes that dictate RNA fate and may aggregate into microscopically visible cytoplasmic foci in response to stimuli capable of stalling translation. In Trypanosoma cruzi, there is a large repertoire of granules that may integrate the mechanisms underlying the remarkable resistance this parasite presents to different kinds of stress. The ribonucleoprotein RBP42, frequently studied in trypanosomatids, was first described in Trypanosoma brucei as a cytoplasmic protein essential for cell viability. In this work, we characterize the protein RBP42 present in the T. cruzi CL Brener (TcbRBP42). Initially, TcbRBP42 genes and protein characteristics were studied in silico. Secondary structure predictions and conserved domain searches revealed the modular architecture of TcbRBP42. There are two structured domains, NTF2-like and RRM, linked together by an extended disordered region enriched in low complexity sequences. These characteristics were also found in its orthologues from other kinetoplastids. Additionally, only two alleles code for this protein in the parasite genome. TcbRBP42 was also characterized under the cellular stress induced by gamma radiation and benznidazole. T. cruzi presents resistance to both agents. For detection purposes, a 6His-tagged version of this protein was transfected into epimastigotes (rTcbRBP42). The rTcbRBP42 expression did not modify epimastigotes growth pattern in both normal and stress culturing conditions. The growth arrest caused by stress was very similar in transfected and wild-type epimastigotes. Immunofluorescence assays revealed that both stress conditions tested promote a differential distribution of rTcbRBP42. This protein accumulates into granular cytoplasmic structures with characteristics varying according to the kind of stress applied. Labeling of RNAs synthesized after stress induction also showed the differential effect of both treatments tested on RNA cellular distribution. After irradiation, newly synthesized RNAs do not form granules; instead, they are transported to and spread throughout the parasite cytoplasm. In contrast, after benznidazole exposure these RNAs aggregate into cytoplasmic foci. These foci were not colocalized with those of rTcbRBP42, suggesting this protein does not interact with the RNAs present in these structures. Taken together, our data suggest that TcbRBP42 is a ribonucleoprotein capable of forming granules in response to stress conditions. These structures probably vary in composition according to the kind of stress applied and may be part of the various mechanisms allowing parasite survival to the stresses caused by gamma radiation and benznidazole.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Os Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs), compostos orgânicos formados por anéis benzênicos fusionados, são contaminantes ambientais que ocorrem naturalmente durante a combustão de matéria orgânica como também pelo derramamento de petróleo e outros processos industriais. Existe uma grande diversidade de bactérias capazes de degradar os HAPs e as enzimas presentes na vias metabólicas podem ser utilizadas para remediar esses poluentes. O naftaleno é um dos HAPs mais tóxicos sendo utilizado como modelo no estudo de degradação desses compostos e, em P. putida G7 o metabolismo do naftaleno é um processo bem estudado. O complexo enzimático da naftaleno dioxigenase (NahA) atua na primeira reação da via de degradação desse contaminante e a NahA pertence a uma grande família de Rieske oxigenases que iniciam a degradação de diversos compostos aromáticos. Todavia, a busca por potenciais enzimas envolvidas na degradação de HAPs não está limitada à P. putida G7, sendo que diferentes fontes validadas podem ser incluídas para enriquecer os bancos de dados. Neste trabalho foi realizada a busca por proteínas homólogas a NahA com o intuito de se obter um complexo dioxigenase que atue sobre vários substratos aromáticos. As sequências gênicas das proteínas de Achromobacter xylosoxidans A8, denominadas de Aa, Ab, Ac e Ad foram selecionadas a partir de bases genômicas e metagenômicas de diferentes organismos. As proteínas recombinantes foram expressas separadamente em três componentes (Aa, Ab e AcAd) bem como co-expressas em conjunto e após a expressão, as células foram submetidas a lise celular para a liberação das proteínas e o extrato resultante foi imediatamente utilizado para a purificação por cromatografias de afinidade e de exclusão molecular. O processo de purificação com o sistema contendo o complexo dioxigenase (AaAbAcAd) foi o mais satisfatório e por isso, decidiu-se dar prosseguimento com essa amostra. As proteínas recombinantes foram identificadas por western blotting e por espectrometria de massa. Através dos ensaios de ensaios de espalhamento dinâmico de luz (DLS) as proteínas apresentaram-se, em solução, como monodispersas sendo Aa em forma dimérica e AcAd como hexamérica. A atividade enzimática do complexo dioxigenase foi demonstrada pelo consumo de NADH. A estrutura cristalográfica contendo as proteínas AcAd, foi resolvida a 1,35 Å e o modelo cristalográfico apresentou enovelamento α/β típico das Rieske oxigenases, com os domínios Rieske [2Fe-2S] e catalítico na subunidade alfa bem definidos, com exceção da presença do átomo de manganês mononuclear no sítio ativo, ao invés do ferro, metal conservado para as dioxigenases. Na unidade assimétrica, a molécula foi encontrada na forma de heterodímero αβ e através de operações de simetria cristalográfica observou-se a unidade biológica, na forma de heterohexâmero (α3β3). Os resíduos Cys-104, His-106, Cys-124 e His-127 no domínio Rieske e os resíduos His-232, His-237 e Asp-379 no domínio catalítico são conservados para todas as Rieske oxigenases sendo importantes para a catálise. Os resíduos não conservados presentes no sítio catalítico Leu-325, His-323, Val-375 e Ile-369 se mostraram importantes, podendo contribuir para a especificidade e acomodação de substratos. No modelo cristalográfico contendo o catecol, este apresentou-se ligado ao sítio ativo, interagindo com a Asn-226. Os resultados deste trabalho apresentam pela primeira vez estudos sobre as características estruturais em relação ao componente catalítico do complexo dioxigenase de Achromobacter xylosoxidans A8, os quais contribuem para estudos futuros sobre a identificação de resíduos-chave para catálise sobre diversos substratos. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs), organic compounds formed by fused benzene rings, are environmental contaminants that occur naturally during the combustion of organic matter as well as by oils spills and other industrial processes. There is a great diversity of bacteria capable of degrading the PAHs and the enzymes present in the metabolic pathways can be used for the bioremediation of these pollutants. Naphthalene is one of the most toxic HAPs being used as a model in the degradation study of these compounds and in P. putida G7 the metabolism of naphthalene is a well-studied process. The enzymatic complex of naphthalene dioxygenase (NahA) acts in the first reaction of the degradation pathway of this contaminant and NahA is a member of a large family of Rieske oxygenases which initiates the degradation of various aromatic compounds. However, the search for potential enzymes involved in the degradation of PAHs is not limited to P. putida G7, and different validated sources can be included to enrich the databases. In this work the search for proteins homologous to NahA was carried out in order to obtain a dioxygenase complex that could act on several aromatic substrates. The gene sequences of the dioxygenase complex proteins Aa, Ab, Ac and Ad from Achromobacter xylosoxidans A8 were selected from genomic and metagenomics databases of different organisms. Recombinants proteins were expressed separately in three components (Aa, Ab and AcAd) as well as co-expressed together and after the expression, cells were lysed for protein release and the resulting extract was immediately subjected to purification by affinity chromatography followed by a size exclusion chromatography. The purification process with the system containing the dioxygenase complex (AaAbAcAd) was the most satisfactory and therefore it was decided to proceed with this sample. Recombinant proteins were identified by western blotting and mass spectrometry. Dynamic light scattering (DLS) assays with the samples showed the proteins presented in solution as monodisperse, with Aa as monomeric and AcAd as hexameric forms.The enzymatic activity of the complex was measured by the NADH consumption. Crystallographic structure of the AcAd proteins was solved at 1.35 Å and the crystallographic model presented an α/β folding typical of the Rieske oxygenases, with the well-defined Rieske [2Fe-2S] and catalytic domains in the alpha subunit, except for the presence of the mononuclear manganese in the active site, rather than iron, a conserved metal of the dioxygenases. In the asymmetric unit, the molecule was found in the form of αβ heterodimer and with crystallographic symmetry operations the biological unit was observed, in the form of heterohexamer (α3β3). Cys-104, His-106, Cys-124 and His-127 residues in the Rieske domain and His-232, His-237 and Asp-379 in the catalytic domain are conserved residues for all Rieske oxygenases being important for catalysis. The non-conserved residues present in the catalytic site Leu-325, His-323, Val-375 and Ile-369 proved to be important and could contribute to the specificity and accommodation of substrates. In the crystallographic model containing catechol, it was bound to the active site, interacting with Asn-226. The results of this work present, for the first time, studies of structural characteristics concerning the catalytic component of the dioxygenase complex from Achromobacter xylosoxidans A8, which can contribute for future studies on the identification of key residues for catalysis on several substrates.

A interrupção da tradução em eucariotos por mRNAs desprovidos de códons de terminação, ou contendo códons raros, ou ainda que sofreram clivagem acidental, é capaz de recrutar aos ribossomos sequestrados o complexo RQC, responsável pela ubiquitinação do polipeptídeo defeituoso recém-sintetizado, marcando-o para a degradação proteassomal. Em Saccharomyces cerevisiae, a ausência da proteína ubiquitina ligase E3 Ltn1p promove a formação de agregados proteicos a partir dos polipeptídeos defeituosos não-degradados pela atividade da proteína Tae2p. Através do uso de repórteres que promovem a interrupção traducional, identificamos que a agregação de polipeptídeos sintetizados por mRNAs contendo códons raros necessita da atividade de Hel2p, uma proteína associada ao ribossomo. Curiosamente, Hel2p também parece estar relacionada com a degradação desses polipeptídeos defeituosos recém-sintetizados a partir de mRNAs que sofrem clivagem acidental em sua região codificante. Além disso, verificamos que a proteína Rqc1p promove grande sensibilidade à higromicina B, antibiótico aminoglicosídico que promove frameshifting tradicional. Em conjunto, nossos dados abrem a possibilidade de execução de um estudo mais aprofundado sobre os mecanismos de geração de agregados proteicos em decorrência de defeitos da tradução, que podem estar relacionados à ocorrência de doenças neurodegenerativas Translational arrest in eukaryotes promoted by mRNAs lacking stop-codons, or harboring rare codons, or those which undergo accidental cleavage, is capable of recruiting the RQC (Ribosome Quality Control) complex towards ribosomes. The RQC complex is responsible for the ubiquitination of the newly-synthesized, defective polypeptides, marking them for proteasomal degradation. In S. cerevisiae, the absence of the ubiquitin ligase E3 Ltn1p promotes the formation of protein aggregates from non-degraded defective polypeptides due to the activity of Tae2p. Using reporters that promote translational arrest, we observed that the aggregation of polypeptides synthesized from mRNAs containing rare codons requires the activity of Hel2p, a ribosome-associated protein. Interestingly, Hel2p also appears to be related to the degradation of newly-synthesized defective polypeptides from mRNAs that undergo accidental cleavage inside their coding region. In addition, we verified that the Rqc1p protein promotes high sensitivity to hygromycin B, an aminoglycoside that promotes translational frameshifting. Altogether, our data open the possibility of carrying out a more detailed study on the mechanisms of generation of protein aggregates as a result of translation defects, which may be related to neurodegenerative diseases

A função e a forma de proteínas estão intimamente ligadas. A compreensão da estrutura tridimensional delas se faz então necessária na elucidação detalhada dos processos biológicos nos quais elas participam. A cristalografia é uma poderosa técnica empregada na determinação estrutural de proteínas. Vasto conhecimento de física e bioquímica são necessários na capacitação de um profissional apto a trabalhar em todas as etapas do processo envolvido na determinação estrutural por cristalografia de proteínas. O objetivo do presente trabalho foi visitar todas essas etapas, que incluem expressão proteica por técnicas de DNA recombinante, a purificação e a cristalização da proteína, experimentos de difração de raios X por monocristal (XRD), processamento de dados, solução da estrutura e análises do modelo proposto. Para realizar todas as etapas, três proteínas foram estudadas: uma efingomielinase D (SMase D), o domínio E2 do papiloma vírus bovino tipo 1 (E2 de BPV-­¿1) e o complexo NahK/NahL. O trabalho com cada uma das proteínas cobriu partes distintas do processo de determinação estrutural. Foi feita a expressão, purificação, cristalização e experimentos de XRD com cristais da SMase D; a estrutura do domínio E2 de BPV-­¿1 foi elucidada a partir de dados de XRD e o modelo foi devidamente analisado; e os dados de XRD de um cristal de NahK/NahL, que indicaram uma desordem no mapa de densidade eletrônica experimental, foram devidamente reprocessados e analisados, resultando na proposta de um novo modelo para a estrutura do complexo. Proteins¿ shape and function are intimately related. Hence, the comprehension of their tridimensional structures is necessary for the detailed elucidation of the biological processes in which they participate. Crystallography is a powerful technique applied on protein structure determination. Great knowledge of Physics and Biochemistry is needed when capacitating a professional to be able to work on every stage of the process of structure determination by protein crystallography. The present work aimed at visiting every one of those stages, including recombinant protein expression, protein purification and crystallization, X-ray diffraction experiments (XRD), data processing, structure solution and analyses. To cover the whole process, three proteins were studied: a sphingomyelinase D (SMase D), the bovine papillomavirus-1 E2 DNA binding domain (BPV-1 E2) and the NahK/NahL complex. Different parts of the process of structure determination were covered working with each of the proteins. SMase D was expressed, purified and crystallized and XRD experiments were performed with its crystals; the structure of BPV-1 E2 was elucidated from XRD data and the proposed model was properly analyzed; XRD data from a crystal of the NahK/NahL complex, which indicated an unordered region on the experimental electron density map, were reprocessed and analyzed, resulting on the proposition of a new structural model of the complex.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Cruzaína é a principal cisteíno protease do Trypanosoma cruzi, sendo um alvo validado para o desenvolvimento de fármacos nesse parasito. O T. cruzi é o agente etiológico da doença Chagas, uma doença negligenciada da América Latina. O tratamento dessa doença hoje no Brasil é feito apenas com o Benznidazol, um medicamento com eficácia comprovada apenas na forma aguda da doença e que apresenta uma série de efeitos colaterais que diminuem a adesão ao tratamento. Sendo assim, o desenvolvimento de medicamentos alternativos é imprescindível e o presente trabalho se propõe a fazer uma contribuição nesse sentido. É proposta uma triagem virtual com docking molecular na busca de possíveis inibidores de cruzaína. O diferencial desse trabalho é a inclusão da ideia de seletividade já na etapa de triagem de moléculas. Isso foi incorporado ao se realizar o docking não apenas contra cruzaína, mas também contra duas enzimas homólogas em humanos, catepsinas L e B. Assim, foram selecionados oito compostos que a partir da triagem e de uma análise visual possuem o potencial de serem inibidores de cruzaína seletivos quando comparados a pelo menos uma dessas enzimas. As perspectivas desse trabalho incluem a realização de ensaios enzimáticos para determinar a atividade e a potência das moléculas contra as três enzimas, e havendo um ligante, propor modificações para melhorar sua atividade a seletividade. Cruzain is the major Trypanosoma cruzi cysteine proteinase, a validated target for drug development against this parasite. T. cruzi is the etiological agent of Chagas Disease, a pathological condition from Latin America, considered a neglected disease. Benznidazole is the medicine currently used in the treatment of this disease in Brazil. Its efficacy is proven only in the acute phase of the disease, presenting many side effects which contribute to the treatment abandonment by the patients. Therefore, it is very important to develop alternative drugs, and this work aims to contribute in this sense. To do so, a virtual screening strategy employing molecular docking was proposed to search for possible cruzain inhibitors. A differential aspect of this work was the inclusion of the selectivity idea already in the screening step. This has been incorporated by docking molecules against cruzain, but also against the human homologous enzymes cathepsin L and B. Thereby, after the virtual screening protocol and visual inspection of top scoring compounds, eight hits that might be selective for cruzain were selected. Perspectives include the evaluation of these molecules in enzymatic assays and, if a hit is confirmed, design analogues with improved activity and selectivity.

Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, é exposto a várias situações de estresse oxidativo durante o seu complexo ciclo de vida. Para lidar com este tipo de estresse, uma das estratégias utilizadas pelo parasito para detoxificar hidroperóxidos é um peculiar sistema de defesa antioxidante dependente de tripanotiona. Entretanto, o repertório antioxidante do T. cruzi não inclui a enzima catalase, a qual decompõe peróxido de hidrogênio (H2O2) e é encontrada na maioria dos organismos aeróbicos. Para investigar a razão pela qual o T. cruzi não possui a enzima catalase, geramos uma linhagem do parasito capaz de expressar o gene desta enzima. Parasitos que expressam catalase apresentam uma resistência aumentada ao tratamento com H2O2 em relação aos selvagens (WT). O pré-tratamento de parasitos WT com uma baixa concentração de H2O2 antes do tratamento com a mesma substância faz com que os mesmos sejam tão resistentes ao H2O2 quanto àqueles que expressam catalase. Porém, esta adaptação ao pré-tratamento não foi observada com a mesma intensidade nos parasitos mutantes. A expressão de catalase em T. cruzi aumentou o nível da enzima ferro-superóxido dismutase B e diminuiu o nível de tripanotiona redutase, resultando em níveis aumentados de H2O2 após a exposição a esta substância. Embora a expressão heteróloga de catalase contribua para o aumento da proliferação do parasito no inseto vetor, a mesma não induziu um grande aumento na virulência em camundongos. Nossos resultados, associados às informações de que a catalase está presente em tripanossomatídeos monoxênicos e que o H2O2 é capaz de atuar como segundo mensageiro, indicam que a ausência de catalase em T. cruzi seja importante para que o parasito possa sinalizar melhor o estresse oxidativo Trypanosoma cruzi, the causal agent of Chagas disease, is exposed to oxidative stress situations during its complex life cycle. To deal with these stresses, one of the strategies employed by this parasite for hydroperoxides detoxification is a peculiar trypanothione-dependent antioxidant system. However, T. cruzi's antioxidant repertoire does not include catalase, an enzyme that decomposes H2O2 and is found in most aerobic organisms. In order to investigate the reason why T. cruzi does not have the catalase gene, a T. cruzi cell line which expresses this enzyme was generated. Parasites expressing catalase have an increased resistance to H2O2 in relation to wild type cells (WT). Moreover, pretreatment of parasites with a low concentration of H2O2 before treatment with higher concentrations makes the WT cells as resistant to H2O2 as cells expressing catalase. However, improvement in resistance to H2O2 after pretreatment was not observed with the same intensity in cells expressing catalase. Catalase expression in T. cruzi decreased the trypanothione reductase and increased superoxide dismutase levels, which resulted in higher levels of H2O2 after H2O2 treatment. More important, although the heterologous expression of catalase contributed to higher proliferation rates in the insect vector, expression of catalase does not induce a large increase in virulence of mice. These results, associated with the facts that catalase is present in monoxenous trypanosomatids and that H2O2 can act as second messenger, indicate that the absence of the catalase gene in T. cruzi was important in order to allow cells with a better capacity in sensing oxidative stress

FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais Outra Agência Naftaleno é um composto tóxico bastante estudado dentre os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e sua degradação pela bactéria Pseudomonas putida G7 tem sido o foco de diversas pesquisas. Nesse organismo, as enzimas NahK (4- xalocrotonato descarboxilase, 28,4 kDa) e NahL (vinilpiruvato hidratase, 27,9 kDa) pertencem à via inferior de degradação do naftaleno e ocorrem in vivo como um complexo que catalisa uma interessante sequência de reações utilizando um Intermediário instável, levantando uma série de questões mecânicas e estruturais. Nosso objetivo foi caracterizar cinética e estruturalmente as enzimas NahK, NahL e seu complexo. Os genes nahK e nahL foram subclonados separadamente no vetor pET28a-TEV, e também subclonados juntos no vetor pETDuet-1 para coexpressão em Escherichia coli BL21(DE3). NahK e seu complexo com NahL foram purificados por cromatografia de afinidade ao níquel e por gel filtração. As amostras proteicas foram analisadas por Espalhamento de Luz Dinâmico, Dicroísmo Circular, e seus parâmetros cinéticos foram obtidos. O complexo também foi analisado por Espalhamento de Raios-X a Baixo Ângulo. Amostras de NahK e do complexo, em sua forma apo ou ligada a análogos de substrato, foram cristalizadas e dados de Difração de Raios-X foram coletados. NahK, tanto em forma isolada quanto complexada, e NahL exibem valores de kcat/KM próximos de 107 M-1s-1. As estruturas cristalinas de NahK em sua forma apo, ligada a Mg2+ e a análogos de substrato permitiram propor um mecanismo de reação envolvendo um domínio tampa. Resultados de SAXS mostram que o complexo se comporta como uma partícula de 275 kDa, e sua estrutura cristalina sugeriu uma montagem com 10 subunidades. NahK e NahL exibem as cavidades de seus respectivos sítios-ativos uma para a outra em uma estrutura quaternária grande, elegante e funcional. Juntas, essas enzimas realizam importantes passos na degradação do naftaleno em P. putida G7. Este trabalho provê um profundo conhecimento estrutural e funcional desse interessante complexo proteico. Naphthalene is a toxic and well-studied polycyclic aromatic hydrocarbon. Its degradation by the bacterium Pseudomonas putida G7 is the focus of numerous studies. In this organism, the enzymes NahK (4-oxalocrotonate decarboxylase, 28.4 kDa) and NahL (vinylpyruvate hydratase, 27.9 kDa) belong to the lower pathway of naphthalene degradation. They exist in vivo as a protein complex, catalyzing an interesting sequence of reactions with an unstable intermediate that raises a number of mechanistic and structural questions. Our aim was to characterize kinetically and structurally the enzymes NahK, NahL and their complex. The nahK and nahL genes were subcloned separately into pET28a-TEV vector for expression, and also subcloned together into pETDuet-1 vector for co-expression in Escherichia coli BL21(DE3) cells. NahK and its complex with NahL were purified by Immobilized Metal Ion Affinity and Size-Exclusion Chromatographies. The protein samples were analyzed by Dynamic Light Scattering, Circular Dichroism, and the steady-state kinetic parameters for their natural substrates were obtained. The NahK/NahL complex was also analyzed by Small-Angle X-Ray Scattering. NahK and NahK/NahL samples in their apo or ligated forms with different substrate analogues were crystallized and X-Ray Diffraction data were collected. NahK expressed alone and co-expressed with NahL was purified to homogeneity and both enzymes shown a kcat/KM values up to 107 M-1s-1. The crystalline structures of NahK in apo and ligated forms with Mg2+ and substrate analogues allowed the proposition of a reaction mechanism involving a lid domain. SAXS measurements suggested a particle of 275 kDa for the NahK/NahL complex, and the crystalline structure of this complex suggested a heterodecamer assembly. NahK and NahL face their active site cavities to each other in a large, elegant and functional quaternary structure. Together, these enzymes perform important steps during naphthalene degradation in P. putida G7. This work provided a deep structural and functional knowledge of this interesting protein complex.

Neste trabalho buscou-se caracterizar a enzima salicilato hidroxilase (NaHG) de Pseudomas putida cepa G7 em relação a sua dinâmica proteica e mecanismo de catálise. Essa enzima participa da via de degradação do naftaleno, sendo uma monooxigenase flavodependente que catalisa, ao custo de NADH e O2, a descarboxilação oxidativa do ácido salicílico (AS)para originar catecol. A análise de dados estruturais obtidos por espalhamento de Raios-X a baixo ângulo (SAXS) mostrou que a NahG não ligada a FAD sofreu uma contração estrutural em relação a holoenzima.No mesmo sentido, a titulação fluorimétrica revelou que a ligação do FAD foi seguida por uma forte supressão da fluorescência em 340 nm e um aumento do rendimento quântico em 524 nm, sugerindo que resíduos de triptofano sofrem uma mudança de meio e próximos ao FAD produziram transferência ressonante de energia por fluorescência (FRET). Na determinação de parâmetros cinéticos para a NahG observou-se que os valores de Km para FAD e O2são da ordem de concentração utilizadade enzima, indicando que a reação entre O2 e flavina para formar um complexo C4ahidroperoxiflavina foi altamente favorável. Desses resultadosobservou-se que a etapa determinante de velocidade de reação deve ser posterior a qualquer evento de formação da C4a-hidroperoxiflavina. Os dados cinéticos em função do pH para as enzimas nativas e mutantes H110N e H322Y indicam que duas isoformas catalisam a reação de descarboxilação oxidativa do ácido salicílico na NahG. A desprotonação ou mutação dos resíduos de histidina favorece a catálise, mas diminuem a afinidade da NahG pelo AS.Os perfis de Log kcat em função do pH mostram três constantes de ionização, duas dessas constantes foram atribuídas a H110 e ao grupo peroxila da C4ahidroperoxiflavina. Os estudos cinéticos com NahG nativa utilizando como substratos os ácidos salicílicos substituídos mostraram um formato curvo para o perfil de Hammett com Log kcat. Isso indicou mudança da etapa determinante da velocidade de reação, que ocorre por um mecanismo tipo substituição eletrofílica aromática (SEAr). The goal of this study was to characterize the enzyme salicylate hydroxylase (NaHG) of Pseudomonas putida strain G7 regarding its protein dynamics and mechanism of catalysis. This enzyme is aflavine-dependent monooxygenase participating in the naphthalene degradation pathway at cost of NADH and O2 catalyzing the oxidative decarboxylation of salicylic acid (SA) to yield catechol. The analysis of the structural data obtained by small angle X-ray scattering (SAXS) showed that NahG unbound to FAD has undergone a structural contraction relative to the holoenzyme. Likewise, fluorimetric titration revealed that FAD binding was followed by strong suppression of the fluorescence at 340nm and increased of the quantum yield at 524 nm, suggesting that tryptophan residues underwent a change in their environment and near to FAD produced fluorescence resonance energy transfer (FRET). The Km values for FAD and O2 are within the order of enzyme concentration used in the experiment as determinated by kinetic parameters for NahG, indicating that the reaction between O2 and FAD to form the C4a-hydroperoxiflavine complex was highly favorable. These results suggested that the rate-determining step occur after any event of C4a-hydroperoxiflavine formation. The kinetic data as a function of pH for the native and mutants (H110N and H322Y)NahG indicatedthe participation of two isoforms in the catalysis of the oxidative decarboxylation reaction of salicylic acid. The deprotonation or mutation of these histidine residues promoted catalysis, whereas decreased the affinity of NahG by AS. The Log kcat-pH profiles showed three ionization constants, two of these constants were attributed to H110 and the peroxyl group of C4a-hydroperoxiflavine. Kinetic studies for substituted salicylic acids showed a curved Hammett profile for log kcat. This indicated change of the rate-determining step of the reaction, which occurs by an electrophilic aromatic substitution (SEAr)type mechanism.

Os Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs), um grupo de compostos orgânicos formados por anéis benzênicos fusionados, são contaminantes ambientais amplamente distribuídos tanto devido a fontes naturais quanto antropogênicas, sendo as atividades de produção de carvão vegetal e mineral, de refino e transporte de petróleo os principais contribuintes para o despejo localizado de HAPs. Devido à sua ocorrência ubíqua , potencial de bioacumulação e atividade carcinogênica, vários HAPs foram listados como poluentes prioritários para a remediação destacando a importância da sua remoção do meio ambiente. Diversos microrganismos têm sido extensamente estudados em virtude de sua versatilidade em degradar uma gama de compostos aromáticos. A bactéria Pseudomonas putida G7 possui um plasmídeo associado ao metabolismo do naftaleno, o mais simples e abundante HAP, cuja degradação ocorre através de duas vias catabólicas ditas superior e inferior. NahI, uma 2- hidroximuconato semialdeído desidrogenase (2-HMSD) atuante na via inferior, converte 2- hidroximuconato semialdeído (2-HMS) a 2-hidroximuconato (2-HM) na presença de NAD+. Mesmo a despeito da baixa identidade de sequencia, uma característica comum entre enzimas aldeído desidrogenases (ALDHs) é a manutenção de um enovelamento estrutural semelhante, salvas as inúmeras particularidades concernentes ao estado de oligomerização e às interações específicas estabelecidas entre enzima, substrato e cofator. Assim, este trabalho se propôs a caracterizar cinética e estruturalmente a enzima NahI, uma vez que, através da elucidação de sua estrutura tridimensional e comparação com as de outras ALDHs, possibilita-se inferir distinções no sítio catalítico responsáveis por mudanças sistemáticas nas propriedades cinéticas destas enzimas sobre uma variedade de substratos aldeídos. Após purificação por cromatografia de afinidade e de exclusão molecular, ensaios de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) foram realizados para analisar o estado oligomérico da enzima em solução, identificada como um tetrâmero. No que diz respeito à estrutura cristalográfica, NahI apresentou o enovelamento / típico da superfamília ALDH organizado em domínio de oligomerização e domínios de ligação ao dinucleotídeo e ao substrato, este último também conhecido como catalítico. Através de operações de simetria cristalográfica, observou-se o tetrâmero de NahI formado por um dímero de dímeros. Ensaios de cinética confirmaram a preferência da enzima para o substrato alifático 2-HMS, porém não se observou qualquer atividade sobre salicilaldeído, substrato aromático natural de NahF, uma ALDH pertencente à mesma via de degradação do naftaleno. Mutações foram propostas para NahI a fim de aumentar o volume do bolso catalítico, uma vez que resíduos de cadeia lateral volumosa poderiam dificultar a atividade desta enzima sobre substratos aromáticos. Surpreendentemente, as formas mutantes não apresentaram atividade sobre salicilaldeído. Além disso, o alargamento da entrada do bolso catalítico afetou ligeiramente a afinidade da enzima para o seu substrato natural, 2-HMS. Sugere-se ainda que o resíduo L156 parece ser crucial para a oxidação do substrato. Os resultados desta investigação apresentam, pela primeira vez, características estruturais e cinéticas em relação à enzima NahI e favorecem futuros estudos sobre a identidade e função de resíduos cruciais para a catálise e a descrição de como a reação se processa. The Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs), a group of organic compounds consisting of fused benzene rings, are contaminants widely distributed in the environment due to natural as well as anthropogenic sources. Activities of production of coal, refining and transportation of oil are the major contributors to the contamination with PAHs. Due to their ubiquitous occurrence, potential to bio-accumulate and carcinogenic activity, a number of PAHs were listed as priority pollutants for remediation highlighting the importance of their removal from the environment. Several microorganisms have been extensively studied because of its versatility to degrade a wide range of aromatic compounds. The bacterium Pseudomonas putida G7 has a plasmid associated with the metabolism of naphthalene, the simplest and most abundant PAH. Its degradation by P. putida occurs through the upper and the lower catabolic pathways. NahI, a 2-hydroxymuconate semialdehyde dehydrogenase (2-HMSD) belonging to the lower pathway, converts 2-hydroxymuconate semialdehyde (2-HMS) to 2- hydroxymuconate (2-HM) in the presence of NAD+. A common feature among aldehyde dehydrogenases (ALDHs) is the similar scaffold, even despite their overall low sequence identity, modes of oligomerization and substrate specificity. Thus, this study was proposed to characterize the structure and kinetics of NahI. By elucidation of its three-dimensional structure and comparison with other ALDHS, it becomes possible to infer distinctions in the catalytic site that are responsible for systematic changes in the kinetic properties of these enzymes within a variety of aldehyde substrates After purification by affinity and sizeexclusion chromatography, dynamic light scattering (DLS) and small-angle X-ray scattering (SAXS) experiments were conducted to analyze the oligomeric state of the enzyme in solution, which was identified as being a tetramer. With regard to the crystal structure, NahI displayed a typical / aldehyde dehydrogenase superfamily fold with three well defined domains: the oligomerization domain, the nucleotide binding and the catalytic domains. Through crystallographic symmetry operations, the NahI tetramer formed by a dimer of dimers was observed. Kinetic assays confirmed the preference of the enzyme for the aliphatic substrate 2-HMS. On the other hand, NahI showed no activity with salicylaldehyde, the natural substrate for NahF enzyme, another ALDH belonging to the same naphthalenedegradation pathway. Mutations have been proposed for NahI in order to increase the volume of the catalytic pocket, since bulky side chain residues could hinder the activity of this enzyme with aromatic substrates. Surprisingly, the mutant forms showed no activity with salicylaldehyde. Moreover, the enlargement of the catalytic pocket entrance slightly affected the affinity of the enzyme for its natural substrate, 2-HMS. It also suggests that the L156 residue appears to be crucial for the oxidation of the substrate. For the first time, these findings show the structural and kinetic properties relative to the NahI enzyme and highlights further studies concerning the identity and function of critical residues for catalysis and description of how the reaction proceeds.

O bagaço de cana-de-açúcar é o resíduo agrícola mais abundante no Brasil e apresenta elevado potencial para ser utilizado na produção de etanol de segunda geração. Entretanto, a grande complexidade da biomassa lignocelulósica requer diferentes enzimas para uma hidrólise eficiente. Neste trabalho, foi realizada a purificação, a caracterização bioquímica, a caracterização cinética e a aplicação na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar de duas xilanases de Aspergillus nidulans clonadas em Pichia pastoris: AN1818.2 e AN3613.2. A indução da expressão dos genes das xilanases foi realizada em meio BMMY contendo metanol, o qual induz a ativação do promotor AOX1, envolvido no metabolismo deste álcool. O sobrenadante do cultivo constitui-se no extrato bruto, o qual foi submetido à cromatografia de afinidade em coluna His Trap HP e, em seguida, à cromatografia de exclusão molecular em coluna Superdex 200. A temperatura ótima de atividade para a xilanase AN1818.2 foi 60 ºC, já para a xilanase AN3613.2 foi 50 ºC. Ambas as enzimas mostraram-se estáveis quando pré-incubadas a 50 ºC e pouco estáveis quando pré-incubadas a 60 ºC. A xilanase AN1818.2 apresentou um pH ótimo de atividade de 7,5 e a xilanase AN3613.2 apresentou melhor atividade em pH 6,0. Ambas as xilanases foram altamente estáveis quando pré-incubadas durante uma hora em tampões na faixa de pH de 2,5 a 13 e retornadas ao pH 5,0. As enzimas AN1818.2 e AN3613.2 foram fortemente inibidas por HgCl2, SDS, CuSO4 e xilotriose. A xilanase AN1818.2 hidrolisou melhor o substrato arabinoxilana de trigo e a xilanase AN3613.2 o substrato xilana beechwood. O valor de Km utilizando xilana beechwood como substrato foi de 1,66 e 4,23 mg/mL para as xilanases AN1818.2 e AN3613.2, respectivamente. A hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar com o coquetel Multifect CL Genencor® foi mais eficiente quando suplementada com a xilanase AN1818.2 em combinação com a xilanase AN3613.2. Já a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar com o coquetel Accellerase 1500 Genencor® foi mais eficiente quando suplementada apenas com a xilanase AN3613.2. Sugarcane bagasse is the most abudant agricultural waste in Brazil and has a high potential to be used in the production of second generation ethanol. However, the high complexity of lignocellulosic biomass requires different enzymes for efficient hydrolysis. In this study, two xylanases from Aspergillus nidulans, AN1818.2 and AN3613.2, cloned in Pichia pastoris were purified, biochemically characterized, kinetically characterized and applied in sugarcane bagasse hydrolysis. BMMY medium was used to induce xylanases gene expression. This medium contains methanol, which induces AOX1 promoter, involved in methanol metabolism. The enzymatic extract was submitted to affinity (His Trap HP) and gel filtration (Superdex 200) chromatographies. Xylanase AN 1818.2 is optimally active at 60 oC and in pH 7,5. AN3613.2 was optimally active at 50 oC and in pH 6,0. Both xylanases were higly thermostable at 50 oC and in pH range from 2,5 to 13 and less stable at 60 oC. HgCl2, SDS, CuSO4 and xylotriose inhibited enzymatic activities. Wheat arabinoxylan was the best substrate for AN1818.2 hydrolysis and AN3613.2 is better suitable for beechwood xylan hydrolysis. Km for AN1818.2 and AN3613.2 was 1,66 and 4,23 mg/mL, respectively, using beechwood xylan as substrate. Sugarcane bagasse hydrolysis with Multifect CL Genencor® was more efficient when xylanase AN1818.2 was added with xylanase AN3613.2. Sugarcane bagasse hydrolysis with Accellerase 1500 Genencor® was more efficient when only xylanase AN3613.2 was added.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A resposta ao dano de DNA (DDR) é um mecanismo coordenado de sinalização do dano, no qual a detecção da lesão leva à parada do ciclo celular e o recrutamento da maquinaria de reparo. Uma das vias da DDR é ativada pela cinase ATR. Em resposta à replicação parada, o complexo 9-1-1, formado por Rad9, Rad1 e Hus1, é carregado para regiões de DNA de fita simples recobertas pela proteína RPA. A presença de 9-1-1 facilita o recrutamento de TopBP1, ativador alostérico de ATR. ATR ativa é capaz de fosforilar a cinase Chk1 que, por sua vez, fosforila e inativa Cdc25, promovendo o checkpoint de replicação e a parada do ciclo celular. Estudos em Leishmania major sugerem a associação entre Hus1 e o aumento da capacidade desse parasito em lidar com o estresse replicativo. Os mecanismos envolvidos na resposta ao estresse replicativo não estão elucidados em Trypanosoma cruzi. Dessa forma, este trabalho visou caracterizar o gene Hus1 de T. cruzi, o parasito causador da doença de Chagas. Para estudar a função de TcHus1 foi construída uma linhagem de T. cruzi com níveis aumentados deste gene. Assim, formas epimastigotas da cepa CL Brener foram transfectadas com o vetor pROCKhigro contendo o gene TcHus1. A análise do perfil de crescimento do parasito superexpressor em condições normais de cultivo, sugeriu que a expressão elevada desse gene não compromete as funções básicas da célula. Também foi analisado o perfil de crescimento dos parasitos quando submetidos ao tratamento com agentes genotóxicos causadores de estresse replicativo. Os tratamentos realizados com benzonidazol, cisplatina, camptotecina, hidroxiureia e metil metano sulfonato (MMS) não apresentaram diferença no perfil de crescimento da célula superexpressora de TcHus1 quando comparada com as células controle. Contudo, a reação de PCR quantitativa em tempo real de células submetidas ao tratamento com MMS mostrou que apenas os parasitos pROCK-Hus1 foram capazes de aumentar a expressão de Hus1 em resposta ao estresse replicativo gerado pelo MMS. Os resultados apresentados neste trabalho não permitem concluir se a função do gene Hus1 de T. cruzi é promover a ativação da cinase de checkpoint ATR, como descrito nos demais eucariotos. Mais estudos serão necessários para compreender a função e a importância dessa via na manutenção da integridade do genoma desse protozoário. The DNA damage response (DDR) is a coordinated mechanism of damage signaling, in which lesion detection leads to cell cycle arrest and recruitment of repair machinery. One branch of the DDR is activated by the ATR kinase. In response to replication arrest, the 9-1-1 complex, formed by Rad9, Rad1 and Hus1, is loaded into single strand DNA regions covered by RPA. The presence of 9-1-1 facilitates the recruitment of TopBP1, allosteric activator of ATR. Active ATR is capable of phosphorylating the Chk1 kinase which in turn phosphorylates and inactivates Cdc25, promoting replication checkpoint and cell cycle arrest. Studies in Leishmania major suggest an association between Hus1 and increased capacity of this parasite in dealing with replicative stress. The mechanisms involved in the replicative stress response are not elucidated in Trypanosoma cruzi. Thus, this study aimed to characterize the Hus1 gene in T. cruzi, the parasite that causes Chagas disease. To study TcHus1 function was constructed a T. cruzi strain with increased levels of this gene. Thus, epimastigotes of CL Brener strain were transfected with the vector pROCKhigro containing the gene TcHus1. The analysis of overexpressor parasite growth profile under normal culture conditions suggested that overexpression of this gene does not compromise the basic functions of the cell. The growth profile of the parasites treated with replicative stress inducing drugs was analyzed. The treatment with benznidazole, cisplatin, camptothecin, hydroxyurea and methyl methane sulfonate (MMS) showed no difference in the growth profile between TcHus1 overexpressing cells and control cells. However, the quantitative real time PCR reaction of MMS treated cells showed that only pROCK-Hus1 parasites were able to increase Hus1 expression in response to replicative stress generated by MMS. The results presented in this study do not allow to conclude whether the function of Hus1 gene in T. cruzi is to promote the activation of the checkpoint kinase ATR, as describing in other eukaryotes. More studies are needed to understand the role and the importance of this pathway in the maintenance of genome integrity on this protozoan.

O carbaryl é um inseticida carbamato inibidor competitivo da enzima acetilcolinesterase, enzima responsável pela hidrólise da acetilcolina e alvo de diversos estudos em várias áreas da ciência. A maioria das técnicas utilizadas para se pesquisar cinética enzimática emprega substratos modificados ou sintéticos capazes de gerar sinais químicos ou elétricos reconhecíveis por alguns equipamentos. Para estudos com acetilcolinesterase, usa-se o substrato acetiltiocolina, onde um produto da catálise enzimática, a tiocolina, é capaz de reagir com algumas moléculas que tem a propriedade de absorver luz em um comprimento de onda. Essa reação acoplada pode sofrer variações de acordo com o meio e mascarar o resultado da reação em questão, ou seja, da hidrólise da acetiltiocolina. Sendo assim, esse método não é capaz de informar sobre a hidrólise de acetilcolina. Técnicas sofisticadas diretas podem ser empregadas, um exemplo é a calorimetria de titulação isotérmica. A técnica consegue mostrar a reação de hidrólise não só da acetiltiocolina, mas também da acetilcolina, por meio da troca de calor que acontece durante a catálise, não necessitando de quaisquer outras moléculas, senão a enzima e seu substrato. Com o objetivo de comparar os valores cinéticos obtidos nas hidrólises dos dois substratos, esse trabalho empregou duas técnicas, a espectrofotométrica e a calorimétrica. A técnica espectrofotométrica criada por Ellman utiliza uma molécula como agente cromóforo. A técnica calorimétrica consegue criar condições onde o substrato consegue se acumular na cela de reação e a cinética é determinada pela quantidade de calor trocada por tempo. Foram utilizadas distintas análises matemáticas, comuns da área de enzimologia, para comparar os resultados obtidos nas reações utilizando acetilcolina e acetiltiocolina, nos dois métodos empregados. O presente trabalho utilizou diferentes concentrações de carbaryl para se determinar a constante de inibição deste composto, também pelos métodos espectrofotométrico e calorimétrico, com uso de diferentes análises matemáticas. Os resultados mostram uma semelhança entre os valores obtidos com ambos os substratos, sendo esses sensivelmente maiores para a acetilcolina, o substrato natural da enzima. E ambas as técnicas, ainda que com erros maiores na espectrofotométrica, foram similares entre si. Isso mostra a robustez da técnica calorimétrica no estudo cinético e a proximidade dos valores de acetiltiocolina com a acetilcolina, demonstra que o uso desse substrato sintético retorna valores semelhantes com o substrato natural. Carbaryl is a carbamate insecticide and a competitive inhibitor of the enzyme acetylcholinesterase, an enzyme responsible for the hydrolysis of acetylcholine and subject of several studies in different fields of science. Most of the techniques used to screen enzyme kinetics employ modified or synthetic substrates capable of generating a chemical or an electrical signal, recognizable by some equipment. For studies using acetylcholinesterase, acetylthiocholine is used as a substrate, where one of its catalytic products, the thiocholine, is capable of reacting with some molecules having the property of absorbing light at one wavelength. This coupled reaction can vary according to the experimental conditions and alter the result of the aforementioned reaction, namely the acetylthiocholine hydrolysis. This method is not able to inform about the hydrolysis of acetylcholine. Direct techniques may be used, but are more sophisticated, an example is isothermal titration calorimetry. The technique can show not only the hydrolysis reaction of acetylthiocholine but also of acetylcholine, through the heat exchange that occurs during catalysis, not requiring any other molecules, but the enzyme and its substrate only. In order to compare the kinetic values obtained in the hydrolysis of both substrates; this work has employed two techniques, spectrophotometric and calorimetry. The spectrophotometric technique created by Ellman uses a molecule as chromophore agent. The calorimetric technique can create conditions where the substrate can accumulate in the reaction cell and the kinetics is determined by the amount of heat exchanged by time. Different mathematical analysis, common in enzymology area, was used to compare the results obtained in the reactions using acetylcholine and acetylthiocholine, at the two methods employed. The present study utilized different concentrations of carbaryl to determine the inhibition constant thereof also by spectrophotometric and calorimetric methods, using different mathematical analysis. The results show a similarity between the values obtained with both substrates, these being considerably greater for acetylcholine, the natural substrate of the enzyme. Moreover, both techniques, although with larger errors in spectrophotometric, were similar to each other. This shows the robustness of the calorimetric technique in the kinetic study, and the proximity of acetylthiocholine values with acetylcholine shows that the use of this synthetic substrate returns values similar to the natural substrate.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As leishmanioses são doenças que afetam indivíduos em cinco continentes, sendo endêmicas em 98 países, incluindo o Brasil. A cada ano são reportados oficialmente 58.000 novos casos de leishmaniose visceral (LV) e 220.000 novos casos de leishmaniose cutânea. A espécie Leishmania amazonensis é um dos agentes causadores das leishmanioses, podendo levar a uma ampla variedade de manifestações clínicas da doença. O objetivo desse estudo foi analisar a relação entre o cultivo axênico de L. amazonensis por longos períodos de tempo e a variação da capacidade infectiva dos parasitas, no intuito de identificar proteínas que possam estar envolvidas nesse processo. Para isso, parasitas em fase estacionária foram cultivados por 150 dias e amostras foram coletadas a cada 50 dias. As amostras foram utilizadas para avaliar a infecciosidade dos parasitas por meio de experimentos in vitro e in vivo, e para uma caracterização proteômica. Em relação aos resultados obtidos, após a realização da eletroforese bidimensional, 315 spots apresentaram variação de intensidade ao longo do cultivo, sendo que 258 spots foram identificados por espectrometria de massa. Das 56 proteínas selecionadas, 37 e 19 apresentaram diminuição ou aumento significativo de sua expressão, respectivamente, ao longo do cultivo. Dessas proteínas, cinco tiveram sua variação de expressão validada por Immunoblotting. As análises da eletroforese bidimensional associada com a espectrometria de massas e estudos por bioinformática indicaram que a diminuição de infecciosidade em parasitas cultivados por longos períodos sob condições axênicas pode ser ocasionada pelo controle de vias metabólicas específicas, da atuação de proteínas envolvidas no sistema redox do parasita, ou de proteínas do citoesqueleto. As informações apresentadas nesse estudo podem contribuir para um melhor entendimento dos processos biológicos envolvidos com a diminuição da infecciosidade de L. amazonensis quando submetida a culturas axênicas por longos períodos de tempo. Essas descobertas representam uma contribuição para o descobrimento de novos candidatos vacinais, agentes para diagnóstico e/ou alvos imunoterapêuticos contra as leishmanioses, usando as proteínas conhecidas e/ou hipotéticas que apresentaram variação significativa de sua expressão ao longo das culturas axênicas. Leishmaniasis is an endemic disease that affects people in five continents and 98 countries, including Brazil, being officially reported 58,000 new cases of visceral leishmaniasis and 220,000 new cases of cutaneous leishmaniasis each year. Leishmania amazonensis , a causative agent of leishmaniasis, can cause a wide variety of clinical manifestations of the disease. The aim of this study was to analyzethe relationship between the L. amazonensis axenic cultivation for long periods with the infectivity ability of the parasite in order to identify proteins that may be involved in this process. For that purpose, L. amazonensis stationary phase was grown for 150 days and aliquots were collected every 50 days, been used to analysis of of infectivity of the parasite by in vitro and in vivo experiments, and to proceed with proteomic characterization. After 2-DE, from the 315 spots with variation in intensity throughout the cultivation, 258 were identified by mass spectrometry. From the 56 selected proteins, 37 have possible decreased of expression over the passages and 19 different proteins showed possible increased of expression during the parasite cultivation. The expression variation of five of these proteins was validated by Immunoblotting. Twodimensional electrophoresis associated with mass spectrometry and bioinformatics analyzes showed that loss of infectivity observed in cultured parasites for prolonged periods under axenic conditions may be caused by the control of specific metabolic pathways, as well as by the control of the performance of the proteins involved with the parasite redox system or by changes in cytoskeletal proteins. The information presented in this study may help to a better understanding of biological processes involved in the reduction of infectivity of L. amazonensis when subjected to axenic cultures for long periods of time. Moreover, these findings may represent a contribution to the elucidation of novel vaccine candidates, diagnostic agents and / or immunotherapeutic targets against the parasite-induced disease, using known and hypothetical proteins with significant changes in their expression along the axenic cultures.

O Trypanosoma cruzi e considerado um dos eucariotos mais resistentes a Radiação ionizante, suportando doses sub-letais de ate 1,0 kGy. A radiação ionizante do tipo gama promove a quebra das fitas simples e duplas do DNA, além de gerar espécies reativas de oxigênio (ROS). Apos a irradiação, os parasitos cessam o seu crescimento por ate 96 horas, retomando-o em seguida e atingindo a fase estacionaria em ate 240 horas apos irradiação. O padrão de bandas cromossomais, que são extensamente fragmentadas pela radiação, e restabelecido cerca de 48 horas apos o estresse. Para tolerar tais danos, e necessário um eficiente aparato de reconhecimento e reparo de lesões. Neste trabalho, investigamos a radioresistencia em T.cruzi, mediante a análise do seu perfil de expressão protéica e da sua atividade mitocondrial em diferentes tempos apos uma dose de 500 Gy de radiação gama. Utilizando a metodologia 2D-DIGE, foram encontrados 543 spots protéicos diferencialmente expressos apos a exposição do T. cruzi a radiação. A partir destes spots, 53 proteínas foram identificadas por espectrometria de massas (MS/MS) e classificadas de acordo com sua função biológica. Analisando a anotação funcional das 53 proteínas, observamos uma tendência para a superexpressão de proteínas com peso molecular abaixo do predito. Esta tendência indica a possível existência de modificações pos-traducionais e/ou de mecanismos de processamento das proteínas identificadas, que geraria polipeptídios mais curtos do que o predito em resposta a radiação gama. Outras tendências observadas em nossas analises de proteômica incluem alterações nos seguintes processos biológicos: regulação positiva do processo de síntese de proteínas, repressão de proteínas envolvidas no processo de enovelamento (exceto pela indução de duas chaperonas do retículo endoplasmático), repressão das vias de geração de ATP por fosforilação oxidativa, da glicolise, e do metabolismo de aminoácidos. Nossos resultados também indicam que a síntese protéica de#novo e essencial para a recuperação do T. cruzi apos o estresse por exposição a radiação gama, pois o tratamento com inibidores de tradução interfere drasticamente no retorno ao crescimento dos parasitos irradiados. Ao avaliarmos a atividade mitocondrial de T. cruzi, xvi! verificamos que parasitos irradiados produzem mais ATP do que parasitos não irradiados, alem de consumirem mais O2. Adicionalmente, a análise da expressão gênica de T. cruzi irradiado por qRT-PCR mostrou que os genes do maxicírculo mitocondrial foram induzidos apos a irradiação. Ambos os resultados indicam uma maior atividade da mitocôndria apos o estresse. Entretanto, observamos uma menor produção de H2O2 nos parasitos irradiados, indicando assim a existência de um mecanismo eficiente de eliminação de radicais livres. O presente estudo revela a resposta peculiar de T. cruzi a radiação ionizante e suscita questionamentos pertinentes sobre como este organismo e capaz de modificar seu perfil de expressão protéica e sua atividade mitocondrial para possibilitar a sobrevivência em condições tão adversas. The Trypanosoma cruzi is considered as one of the eukaryotes most resistant to ionizing radiation, enduring sub-lethal doses of up to 1.0 kGy. The ionizing radiation by gamma rays promotes double-strand and single-strand breaks on the DNA and, additionally, generates reactive oxygen species (ROS). After irradiation the parasites cease growing for as long as 96 hours, further resuming growth and reaching the stationary phase no later than 240 hours after irradiation. The pattern of chromosomal bands which are extremely fragmented by radiation exposure is restored approximately 48 hours after the stress. To enable the parasite to tolerate such damage condition, an efficient apparatus to recognize and repair lesions is necessary. In the present work we investigate T. cruzi radioresistance by analyzing its protein expression patterns and mitochondrial activity in different time points after a dose of 500 Gy of gamma rays. Using the 2DTDIGE methodology, 543 spots were identified as significantly differentially expressed after T. cruzi exposure to radiation. From these 543 spots, 53 different proteins were identified by mass spectrometry (MS/MS) and classified according to biological function. When the functional annotation of these 53 proteins was analyzed, a tendency of overexpression of proteins with molecular weight lower than predicted was observed. This tendency suggests the presence of post-translational modifications and/or processing mechanisms acting upon the identified proteins, leading to the emergence of peptides which are shorter than predicted in response to gamma radiation exposure. Other tendencies observed on proteomic analysis include alterations on the following biological processes: positive regulation of the protein synthesis process, repression of proteins involved with folding processes (except for two endoplasmic reticulum chaperones, which are induced), repression of ATP generation through oxidative phosphorylation, of glycolysis, and of the amino acids metabolism. Our results also indicate that the de novo protein synthesis is essential for T. cruzi recovery from gamma radiation exposure, since the treatment with translation inhibitors drastically interferes with the growth resumption on irradiated parasites. When the mitochondrial activity of T. cruzi xviii was evaluated, we verified that irradiated parasites generate higher levels of ATP than their non-irradiated counterparts, with an associated higher O2 consumption by the former. Additionally, the gene expression analysis of irradiated T. cruzi using qRT-PCR showed that genes from the mitochondrial maxicircle were induced after radiation exposure. Both of these results point to a higher mitochondrial activity after irradiation-caused stress. Nevertheless, we have also observed a lower H2O2 production by irradiated parasites, thus indicating the existence of an efficient mechanism for free radicals clearance in the organism. The present study unravels the peculiar response of T. cruzi to ionizing radiation and evokes questions about the manner in which this organism is capable of performing drastic changes on its protein expression profile and mitochondrial activity to enable its survival in such adverse conditions.

O conhecimento da estrutura tridimensional de enzimas nos permite determinar seus mecanismos de ação, atuar de forma orientada na estrutura destas moléculas e, eventualmente, alterar propriedades físico-químicas objetivando alguma aplicação biotecnológica específica,além de contribuir para o conhecimento básico da relação estrutura-função de proteínas. As enzimas cis-naftaleno dihidrodiol desidrogenase (NahB) e salicilato hidroxilase (NahG) dePseudomonas putida G7 estão envolvidas na degradação do naftaleno, um hidrocarboneto aromático policíclico (HAPs). A maioria dos HAPs são tóxicos, mutagênicos e carcinogênicos. A biorremediação é uma estratégia para a eliminação dos HAPs do meio ambiente, a qual utiliza enzimas ou microorganismos que possuem a capacidade de metabolizar esses compostos e transformá-los em substâncias menos tóxicas. No presente trabalho foram feitas a caracterização estrutural da proteína NahB e as caracterizações bioquímica e estrutural da NahG. Os genes nahB e nahG foram clonados e expressos em células de Escherichia coli RosettaTM (DE3) cultivadas a 18º C por 16 horas. A análise do pellet e do sobrenadante revelou que as proteínas estavam na fração solúvel. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e exclusão molecular. A proteína NahB recombinante apresenta massa molecular de 29,5 kDa e foi denominada 6xHis- NahB, a NahG recombinante possui massa molecular de 48,9 kDa e foi denominada 6xHis- NahG. Para obter as proteínas corretamente enoveladas, estáveis e monodispersas foramtestados diferentes protocolos de lise celular e de purificação, além da adição de ligantes. Após otimização, foram obtidos cristais de ambas as proteínas, os quais foram submetidos à difração de raios-X. Um cristal da 6xHis-NahB difratou até 1.64 Å e sua estrutura foi resolvida pelo método de Substituição Molecular. A enzima 6xHis-NahB apresenta o clássico motivo de Rossman de ligação de nucleotídeo, formado por uma folha beta central constituída por sete fitas- e por nove -hélices, sendo que são 3 hélices de cada lado flanqueando a folha beta. Para resolução da estrutura tridimensional da 6xHis-NahG foi utilizado o método dos átomos pesados. Um cristal nativo da enzima 6xHis-NahG difratou até 2.20 Å e um cristal derivado com iodo até 2.00 Å. Esta enzima foi caracterizada pela presença de três folhas beta constituída por oito, quatro e três fitas- e por quatorze -hélices, sendo estruturalmente similar a outras hidroxilases dependentes de FAD. A 6xHis-NahG converte ácido salicílico em catecol via hidroxilação descarboxilativa e os valores de KM para a enzima sem cauda de seis histidinas foram 27,31; 1,26 e 22,74 M para o substrato ácido salicílico e para as coenzimas FAD e NADH, respectivamente. The three dimensional structure of enzymes allows us to determine their action mechanism, to act in a targeted manner in the structure of these molecules and eventually change physicochemical properties in favor of any specific biotechnological applications, and contribute to a basic understanding of the proteins structure-function. cis-Naphthalenedihidrodiol dehydrogenase (NahB) and salicylate hydroxylase (NahG) enzymes from Pseudomonas putida G7 are involved in degradation of naphthalene, a polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH). Most PAHs are toxics, mutagenics and carcinogenics. Bioremediation is a strategy for the removal of PAHs from the environment, which uses enzymes ormicroorganisms that have the ability to metabolize these compounds and turn them into less toxic substances. In the present study the structural characterization of the NahB protein and the biochemical and structural characterizations of NahG were done. The nahB and nahG genes were cloned and expressed in Escherichia coli RosettaTM (DE3) cells at 18° C for 16 hours, leading to expression of the enzymes in the soluble fraction. The recombinant proteins were purified by affinity and molecular exclusion chromatographies. In order to obtain folded, stable and monodisperse proteins, different protocols for cell lysis and purification were tested, besides the addition of ligands. After optimization, protein crystals of both enzymes were obtained and analyzed using a X-ray diffraction experiment. 6xHis-NahB crystal diffracted to 1.64 Å and its structure was solved by the Molecular Replacement method. The6xHis-NahB enzyme has the classic Rossman motif of nucleotide binding, comprising a central beta-sheet consisting of seven -strands and nine -helices, having three helices each side flanking the -sheet. The heavy atoms method was used to solve the 6xHis-NahG threedimensional structure. A native crystal of the 6xHis-NahG enzyme diffracted to 2.20 Å and an iodine derivative to 2.00 Å. This enzyme is characterized by the presence of three -sheets composed of eight, four and three -strands and fourteen -helices, and is structurally similarto other FAD-dependent hydroxylases. The 6xHis-NahG converts salicylic acid to catechol by descarboxylative hydroxylation and KM values of the enzyme without six histidines tag were 27.31, 1.26 and 22.74 M for the substrate salicylic acid, FAD and NADH coenzymes, respectively.

Estudos sobre a cristalização em extratos biológicos realizados em meados do século XIX contribuíram para a descoberta das proteínas. Na segunda metade do século XX foram desenvolvidas técnicas da Biologia Molecular que possibilitam a produção em larga escala de proteínas e a difração de raios X tornou-se a principal ferramenta de investigação de estrutura destas moléculas. Desde os primeiros experimentos até os dias atuais, o processo de cristalização tem sido o grande gargalo para a realização de estudos estruturais de proteínas. Os protocolos de cristalização utilizados atualmente consistem em misturar um conjunto de soluções de precipitantes, aditivos e soluções tampão com a solução de proteína para promover a cristalização, desprezando diversos parâmetros físicos. Amostras cristalinas são obtidas por tentativa e erro e com grande taxa de irreprodutibilidade. O objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos da temperatura no processo de cristalização de proteínas. Foram realizados ensaios de cristalização com a proteína lisozima em diferentes temperaturas nos quais foram observados uma dramática mudança de regime de crescimento, com impacto sobre o número e tamanho médio de cristais obtidos acima e abaixo de 12oC. Para avaliar a influência da temperatura na dinâmica de formação dos cristais de lisozima, foram realizados ensaios de cristalização com monitoramento in situ pela técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS). Esta técnica permitiu determinar o tamanho médio dos agregados de proteínas em solução durante a cristalização. Os resultados obtidos indicam que a temperatura não altera a evolução temporal das raios dos agregados e que a quantidade deles em solução é maior para temperaturas mais baixas. Cristais obtidos em diferentes temperaturas foram analisados utilizando difração de raios X e as estruturas obtidas não apresentaram nenhuma mudança relevante. Ainda há lacunas nas teorias que descrevem a dinâmica do processo de cristalização de proteínas que justificam estudos posteriores sobre este fenômeno visando, sobretudo, a elaboração de protocolos de cristalização mais assertivos. Studies on crystallization in biological extracts made in the mid-nineteenth century contributed to the discovery of proteins. In the second half of the twentieth century Molecular Biology techniques enabled large-scale production of proteins and X-ray diffraction became the main tool for the investigation of protein structure. From the earliest experiments to the present day, the crystallization process has been the major bottleneck to structural studies of proteins. The current crystallization protocols consist of mixing the precipitating agents, buffers, and additives to the protein solution to promote crystallization discarding various physical parameters. Crystalline samples are obtained by trial and error and with a great rate of non-reproducibility. The aim of this work was to study the effects of the temperature on the protein crystallization process. Crystallization trials with the protein lysozyme at different temperatures showed change of the growth regime, with a remarkable change in the number and in the average size of crystals obtained above and below 12oC. In order to study the influence of temperature on the dynamics of the formation of crystals of lysozyme, crystallization trials with the in situ monitoring by Dynamic Light Scattering technique (DLS) were performed. This technique allowed the determination of the average size of the protein aggregates in solution during crystallization. The results indicated that the temporal evolution of the radii of the aggregates is not affected by temperature. However the amount of aggregates in solution is higher for lower temperatures. Crystals obtained at different temperatures were finally analyzed by X-ray diffraction techniques and the structures obtained did not show any significant change. There are still gaps in the theories that describe the dynamics of the protein crystallization process that justify further studies of this phenomenon, targeting above all, more assertive crystallization protocols.

A cristalografia de raios-X, em relação ao número de estruturas depositadas no Protein Data Bank (PDB), é o método mais utilizado para se obter informações estruturais de macromoléculas biológicas. Tais informações são úteis para o entendimento dos sistemas biológicos dos quais essas macromoléculas participam. Nesse trabalho, duas proteínas com interesse biotecnológico foram estudadas do ponto de vista bioquímico e estrutural: a proteína antigênica Pb27 de Paracoccidioides brasiliensis e a enzima NahF de Pseudomonas putida. O fungo P. brasiliensis é o agente causador de uma das mais importantes micoses sistêmicas do Brasil, a paracoccidioidomicose (PCM) e a proteína Pb27, apesar de já ter sido utilizada com alta especificidade e sensibilidade no diagnóstico e como adjuvante no tratamento da PCM, tem sua função ainda desconhecida e não apresenta proteínas similares com estrutura terciária resolvida. Com o intuito de resolver sua estrutura por cristalografia de raios-X, a proteína Pb27 recombinante (Pb27r) foi expressa em bactérias E. coli BL21(DE3) e purificada por cromatografia de afinidade e gel filtração de onde eluiu com volume equivalente a um monômero (24 kDa após remoção da cauda de histidinas N-terminal). Estudos de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e dicroísmo circular (CD) mostraram essa proteína estava monodispersa e enovelada. Cristais da Pb27 foram obtidos em MgCl2 0,25 M, PEG 4000 25%, Tris-Cl 100 mM pH 7,0, com grupo espacial P212121 e difrataram com resolução de 1,9 Å. Para a obtenção de cristais derivados para a resolução da estrutura da Pb27r por espalhamento anômalo ou substituição isomórfica, foram realizados soaking e co-cristalização com sais de átomos pesados (NaI, CsCl, GdCl3, sais de Hg e Pt) além de marcação com Se-Met, no entanto, ainda não foram obtidos cristais com diferença isomórfica/anômala suficiente para determinação da estrutura da Pb27. Já a enzima NahF catalisa a oxidação do salicilaldeído em salicilato utilizando NAD+ como cofator, última reação da via superior de degradação do naftaleno em P. putida. O naftaleno é o composto mais abundante e tóxico do petróleo e tem sido utilizado como modelo em estudos de biorremediação. Para a compreensão dos determinantes estruturais da atividade dessa enzima, a proteína NahF recombinante (NahFr) foi expressa em E. coli Arctic Express a 12 oC e purificada por cromatografias de afinidade e gel filtração de onde eluiu em três frações. A fração principal, que continha a proteína em sua forma dimérica e monodispersa (dados obtidos por DLS) foi utilizada em ensaios cinéticos e estruturais. A NahFr apresentou maior atividade em pH 8,5 e 60 oC. EDTA, DTT e SDS inibiram a atividade enzimática enquanto Ni2+ a elevou em quase 20%. A enzima apresentou altos valores de kcat/KM e preferência para aldeídos aromáticos e por aldeídos alifáticos de cadeia longa. A sua estrutura mostrou um enovelamento do tipo / com os domínios de oligomerização de ligação ao cofator e catalítico bem definidos. O salicilaldeído estava presente em um bolsão profundo na estrutura da enzima onde também estavam a Cys284 e o Glu250 catalíticos. Os resíduos Arg157, Gly150 e Trp96 se mostraram importantes para a especificidade por aldeídos aromáticos. O entendimento das características da enzima NahF que são responsáveis por sua atividade e especificidade e, também, suas diferenças para outras ALDHs de outros organismos pode abrir possibilidades para, por exemplo, o aumento da sua estabilidade e outras características por mutações sistemáticas, tornando possível o seu uso e o de outras enzimas relacionadas em processos biotecnológicos According to the number of structures deposited on Protein Data Bank (PDB), the X-ray crystallography is the main method used to obtain structural information of biological macromolecules. Such information is useful for understanding the biological systems of which these macromolecules participate. In this study, two proteins with biotechnological interest were studied from the structural and biochemical view: the antigenic protein Pb27 from Paracoccidioides brasiliensis and the enzyme NahF from Pseudomonas putida. The fungus P. brasiliensis is the agent of one of the most important systemic mycoses in Brazil, paracoccidioidomycosis (PCM) and the protein Pb27, despite having been used with high sensitivity and specificity in the diagnosis and as an adjuvant in the treatment of PCM, Pb27s function is still unknown and this protein has no similar proteins with tertiary structure solved. Aiming to solve its structure by X-ray crystallography, recombinant Pb27 protein (Pb27r) was expressed in bacteria E. coli BL21(DE3) and purified by affinity chromatography and gel filtration, which was eluted with a volume equivalent to a monomer (24 kDa after removing the N-terminal Histag). Studies of dynamic light scattering (DLS) and circular dichroism (CD) revealed that protein is monodisperse and folded. Pb27 crystals were obtained in 0.25 M MgCl2, 25% PEG 4000, 100 mM Tris-Cl pH 7.0, with space group P212121 and diffracted up to 1.9 Å of resolution. In order to obtain crystals derivatives for solving the structure of Pb27r by anomalous scattering or isomorphous substitution it was performed soaking and co-crystallization with heavy atom salts (NaI, CsCl, GdCl3, Hg and Pt salts) were performed in addition to Se-Met labeling. However, derivative crystals with isomorphic/anomalous difference enough to determine Pb27 structure were not obtained yet.The NahF enzyme catalyzes the oxidation of salicylaldehyde to salicylate using NAD+ as a cofactor, the last reaction of the degradation upper pathway of naphthalene in P. putida. The naphthalene is the most abundant and toxic compound in oil and has been used as a model for bioremediation studies. To understand the structural determinants of activity of this enzyme, the recombinant protein NahF (NahFr) was expressed in E. coli Arctic Express at 12 oC and purified by affinity chromatography and gel filtration in which it eluted in three fractions. The main fraction contained the protein in its dimeric form and monodisperse (data obtained by DLS) and was used for kinetic and structural studies. NahFr was most active at pH 8.5 and 60 oC. EDTA, DTT and SDS inhibited the enzymatic activity while the Ni2+ increased by almost 20%. The enzyme showed high values of kcat/KM and preference for aromatic and long chain aliphatic aldehydes. The structure showed an / folding with the oligomerization, cofactor binding and catalytic domains well defined. The salicylaldehyde was present in a deep pocket in the structure where the catalytic Cys284 and Glu250 were seen. Moreover, the residues Arg157, Gly150 and Trp96 were important to specificity for aromatic aldehydes. The understanding of the characteristics of the enzyme NahF that are responsible for its activity and specificity and also its differences for other ALDHs from other organisms may open up possibilities for, for example, increased stability and other characteristics by systematic mutations, making it possible its use and other related enzymes in biotechnological processes

Neste trabalho é descrito um algoritmo usado para predizer pares de resíduos de aminoácidos em proteínas alvo (com estrutura tridimensional conhecida) que poderiam ser mutados por pares diferentes de resíduos de aminoácidos com o objetivo de introduzir uma nova/diferente interação entre estes resíduos. Isto resulta em um mutante in silico com possibilidades estereoquímicas de existir in vitro com o aumento da estabilidade conformacional e térmica. Para alcançar isso, foi criado um banco de dados baseado no PDB composto de pares de resíduos de aminoácidos interagentes observados em proteínas de estrutura conhecida. As mutações são propostas de forma a manter o enovelamento da proteína alvo (e consequentemente sua função) através, basicamente, da conservação da conformação da cadeia principal dos resíduos mutados. Neste trabalho também são apresentados os aspectos principais dessa base de dados, a forma como encontrar os pontos de mutação e alguns resultados. Uma busca completa na estrutura de uma proteína alvo foi realizada para identificar cada par que poderia ser mutado usando alguns dos pares do banco. Pretende-se com este procedimento, verificar um número de possíveis mutantes em diferentes enzimas com potencial de aplicação em processos de biorremediação, onde condições ambientais agressivas são esperadas. É apresentada a ferramenta RID (Residue Interaction Database), uma nova base de dados e algoritmo para propor mutação de pares de resíduos em uma proteína objetivando aumentar sua estabilidade focando na manutenção da conformação de sua cadeia principal. São descritos os detalhes do algoritmo para gerar a base de dados dos resíduos de aminoácidos interagentes e o método para otimizar a busca. Comparado com outros métodos, RID aumenta as alternativas de proposição de mutação devido à variedade de interações usadas para criar o banco de dados e que irão contribuir para o aumento da estabilidade proteica. A ferramenta se encontra disponível em http://www.bioest.icb.ufmg.br/RID. In this work we describe an algorithm which is used to predict amino acid residue pairs in target proteins (with known 3D structure) that could be replaced by a different amino acid residue pair in order to introduce a new/different interaction between residues. This might result in an in silico mutant with stereochemistry possibilities to exist in vitro with increased thermo and conformational stability. To address this, we have created a PDB-based database composed of pairs of interacting amino acid residues observed in proteins with known structure. The mutations are proposed in a way to maintain the target protein's fold (and function) as, basically, the main chain conformation of mutated residues are supposed to be conserved. In this work we also present the main aspects of this database, the way to find the mutation points and some results. A complete search in a target protein structure was performed to identify each residue pair that could be mutated using some of the pairs in the database. We intend to use this procedure to verify a number of possible mutations in different enzymes with potential application in bioremediation processes, where aggressive environmental conditions are expected. We present RID (Residue Interaction Database), a novel database and algorithm to propose a residue pair mutation in a protein aiming to increase its stability focusing in the conformation maintainability. We describe the details of the algorithm do generate the database of interacting amino acid residues and the method to optimize the database for quick searches. Compared to other methods, RID increases the alternatives to propose mutation because of the variety of the interactions used to create the database and that will contribute to increase the protein stability. The tool is available at: http://www.bioest.icb.ufmg.br/RID.

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva que causa a Linfadenite Caseosa (LC), uma doença infecto-contagiosa crônica que acomete pequenos ruminantes, promovendo a redução da produtividade dos animais infectados. A doença se caracteriza pela formação de abscessos em nódulos linfáticos superficiais e/ou órgãos internos. Vários métodos para o diagnóstico da LC subclínica foram desenvolvidos, porém não alcançaram eficácia e praticidade satisfatórias. Assim, nesse trabalho selecionamos seis alvos protéicos dos 104 previamente descritos, caracterizamos os produtos gênicos das Open Reading Frame(ORFs) e produzimos as proteínas recombinantes para a otimização de um Teste Intradérmico de Hipersensibilidade (TIH) paraa LC. Os insertos das seis ORFs foram amplificados após a extração do DNA genômico da linhagem 1002 de C. pseudotuberculosiscom a utilização de iniciadores específicos, que ligados aos vetores pAE e pET-28a foram transformados em Escherichia coliDH5para a clonagem molecular. Para verificar a expressão das proteínas recombinantes, os clones foram transformados em E. coli C43 pLysSe a cinética de expressão realizada. Duas proteínasrecombinantes foram produzidas e submetidas a Western blotcom soros de caprinos infectados com C. pseudotuberculosis, demonstrando antigenicidade nesses testes preliminares. Novos testes de caracterização das proteínas recombinantes serão realizados e esperamos que as mesmas possam ser utilizadas na otimização de um TIH de elevada acurácia, para o controle da LC nos rebanhos de ovinos e caprinos. Corynebacterium pseudotuberculosisis a Gram-positive bacterium that causes caseous lymphadenitis (CLA), a chronic infectious disease that affects small ruminants, promoting the reduction of productivity of infected animals. The disease is characterized by the formation of abscesses in the lymph nodes surface and/or internal organs. Several methods for the diagnosis of subclinical CLA been developed, but have not reached satisfactory efficacy and practicability. Thus, this study selected six of the 104 proteins targets previously described, we characterize the genics products of the Open Reading Frame(ORF) and produce recombinant proteins for the optimization of an Intradermal Hypersensitivity Test (IHT) to LC. The inserts of the six ORFs were amplified after extraction of genomic DNA from strain 1002 of C. pseudotuberculosiswith the use of specific primers which bound to vectors pAE and pET-28a were transformed into Escherichia coliDH5for molecular cloning. To verify the expression of recombinant proteins, clones weretransformed into E. coliC43 pLysS and expression kinetics performed. Two recombinant proteins were produced and subjected to Western blotwith sera from goats infected with C. pseudotuberculosis, demonstrating antigenicity in these preliminary tests. New tests for characterization of recombinant proteins will be made and hopefully they can be used in the optimization of an IHT high accuracy for control of CLA in flocks of sheep and goats.

Devido ao uso do petróleo e seus derivados, diversos tipos de poluentes são liberados no meio ambiente. Alguns deles são classificados como Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs). A maioria dos HAPs, ou seus metabólitos, são capazes de interagir com bases nitrogenadas causando lesões no DNA, potencializando mutações e, consequentemente, o desenvolvimento de câncer. Como resultado disso, houve nas últimas décadas um aumento substancial na atenção dada às contaminações de solos e lençóis freáticos por HAPs. Inúmeros microrganismos possuem a capacidade de utilizar essas moléculas tóxicas como fontes de carbono e energia. O uso de determinadas bactérias (ou de suas enzimas) através de técnicas de biorremediação é uma estratégia em potencial para eliminação dos HAPs do ambiente. O HAP mais comum e tóxico é o naftaleno, e graças à capacidade da bactéria Pseudomonas putida em degradá-lo completamente, ela tem sido o foco de inúmeras pesquisas. Neste trabalho foram estudadas duas enzimas de P. putida envolvidas na degradação de naftaleno: NahE (uma hidratase-aldolase) e NahK (uma decarboxilase). O objetivo principal do trabalho foi a amplificação e clonagem dos genes nahE e nahK, expressão e purificação das respectivas enzimas para ensaios bioquímicos e estruturais. Os genes foram clonados inicialmente no vetor de expressão pET28a-TEV e expressos em Escherichia coli. A proteína recombinante NahE foi detectada em fração insolúvel e diversas estratégias foram utilizadas, sem sucesso, para obtenção da proteína expressa em fração solúvel. NahE solúvel foi obtida utilizando purificação em condições desnaturantes seguida por reenovelamento. Por outro lado, a proteína recombinante NahK foi detectada em fração solúvel e purificada por cromatografias de afinidade e de exclusão molecular. As proteínas purificadas foram submetidas a ensaios de Espalhamento Dinâmico de Luz e Dicroísmo Circular. Também foram realizados ensaios de cristalização com NahK visando o crescimento de cristais para a elucidação de sua estrutura tridimensional por cristalografia de Raios-X. Many pollutants are released to the environment due the use of petroleum and its derivatives. Some of them are classified as Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs). Most of PAHs, or their metabolites, can interact with nitrogenous bases or cause lesions in DNA, potentiating mutations and consequently inducing the development of cancer. As a result of this, in the last decades, the concerns about contamination of soil and groundwater by PAHs have substantially increased. Various microorganisms have the capacity to use these hazardous molecules as carbon and energy source. The use of these microorganisms and/or their enzymes for the elimination of PAHs to the environment is a potential strategy for bioremediation. One of the most common and hazardous PAH is naphthalene, and because of the bacteria Pseudomonas putida ability to completely degrade it, it has been the focus of numerous studies. This work was focused in the study of two enzymes from P. putida involved in naphthalene degradation: NahE (a hydratase-aldolase) and NahK (a decarboxylase). The main objectives of this work were the amplification and cloning of nahE and nahK genes, expression and purification of NahE and NahK enzymes for biochemical and structural assays. The genes were initially cloned into the expression vector pET28a-TEV and expressed in Escherichia coli. The recombinant protein NahE was mainly detected in insoluble fraction and different trials were performed to obtain the protein in the soluble fraction, without success. Soluble NahE was obtained only when using denaturizing conditions of purification followed by a refolding protocol. On the other hand, NahK was detected in the soluble fraction and was purified by affinity and size-exclusion chromatographies. The purified proteins were submitted to Dynamic Light Scattering and Circular Dichroism experiments. Crystallization assays were also performed with NahK aiming crystal growth for elucidation of its three-dimensional structure by X-Ray Crystallography.

Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) são compostos orgânicos formados por dois ou mais anéis aromáticos fundidos. A maioria deles é mutagênico e carcinogênico aos homens e animais. Os HAPs são liberados no meio ambiente principalmente por atividades antropogênicas, relacionadas à extração, ao transporte, ao refino, à transformação e ao uso do petróleo e seus derivados. A biorremediação é uma estratégia para a eliminação dos HAPs do meio ambiente, a qual utiliza enzimas ou microorganismos que possuem a capacidade de metabolizar esses compostos e transformá-los em substâncias inertes. O naftaleno é um dos HAPs mais comumente encontrado no ambiente. A degradação do naftaleno por Pseudomonas sp. é uma alternativa para a remediação de ambientes com esse poluente. Em Pseudomonas putida G7, os genes catabólicos são organizados em dois óperons no plasmídeo NAH7: um deles codifica as enzimas da via superior envolvidas na conversão do naftaleno a salicilato, o segundo codifica as enzimas da via inferior envolvidas na conversão do salicilato a intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico. O gene nahB é responsável pela codificação da proteína cis-1,2-dihidro-1,2-dihidroxinaftaleno-1,2-desidrogenase (NahB), a qual é a segunda enzima da via superior. Nesse trabalho foi feita a clonagem do gene nahB em vetor pCR®2.1-TOPO e a subclonagem nos vetores de expressão pET-28a-GST-TEV e pET-28a-TEV. A expressão heteróloga da enzima NahB foi feita em RosettaTM (DE3) e ArticExpressTM (DE3). O vetor de expressão pET-28a-GST-TEV-NahB, responsável pela codificação da enzima GST-NahB, foi seqüenciado e a proteína recombinante está correta. Esta foi expressa na fração solúvel a baixas temperaturas, em RosettaTM (DE3) a 20ºC e em ArticExpressTM (DE3) a 12ºC. A purificação foi feita por cromatografia de afinidade e cromatografia de troca aniônica. Após a purificação, foi realizada a clivagem com a protease TEV. A proteína NahB proveniente da GST-NahB, permanece com três resíduos de aminoácidos além da sequência nativa e foi denominada GGS-NahB. A massa molecular dessa enzima recombinante foi determinada por espectrometria de massa e o valor foi bem próximo do teórico. Características estruturasis da enzima GGS-NahB foram determinadas por Espalhamneto Dinâmico da Luz e por Dicroísmo Circular. Pelo DLS, verificou-se que a proteína apresenta-se monodispersa e na forma tetramérica em solução. Os experimentos de CD evidenciaram uma enzima com aproximadamente 25% de -hélice, 30% de fita- paralela e antiparalela, 15 % de volta beta e 40% de estrutura randômica. Novas purificações estão sendo conduzidas para a realização de ensaios de cristalização. O vetor de expressão pET-28a-TEV-NahB, também foi seqüenciado e a proteína recombinante His-NahB apresenta, após a clivagem com a protease TEV, ao invés de dois resíduos de aminoácidos além da sequência nativa, 21 resíduos. O gene nahB será, novamente, subclonado no vetor pET-28a-TEV para expressão da enzima His-NahB. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are organic compounds consisting of two or more fused aromatic rings. Most of them are mutagenic and carcinogenic to humans and animals. PAHs are released through the environment mainly by anthropogenic activities related to the extraction, transport, refine, transformation and use of petroleum and its derivatives. Bioremediation is a strategy for PAHs elimination from the environment which uses enzymes or microorganisms displaying the capacity to metabolize these compounds and transform them into inert substances. Naphthalene is one of the most commonly found PAHs in the environment. The degradation of naphthalene by Pseudomonas sp. is an alternative procedure for the remediation of the environment with this pollutant. In Pseudomonas putida G7 the catabolic genes are organized in two operons on NAH7 plasmid: one encoding the upper-pathway enzymes involved in the conversion of naphthalene to salicylate, the second encoding the lower-pathway enzymes involved in the conversion of salicylate to tricarboxylic acid cycle intermediates. The nahB gene is responsible for codification of the protein cis-1,2-dihydro-1,2-dihydroxynaphthalene-1,2-dehydrogenase (NahB), which is the second enzyme from the upper-pathway. In the present work we present the cloning of nahB gene into the vector pCR®2.1-TOPO and the subcloning into the expression vectors pET-28a-GST-TEV and pET-28a-TEV. The heterologous expression was performed in RosettaTM (DE3) and ArticExpressTM (DE3). The expression vector pET-28a-GST-TEV-NahB, responsible for encoding the enzyme GST-NahB, was sequenced and the recombinant protein is correct. This was expressed in the soluble fraction at low temperatures in RosettaTM (DE3) at 20ºC and in ArticExpressTM (DE3) at 12ºC. The purification was performed by affinity chromatography and anion exchange chromatography. After purification, was conducted the cleavage with protease TEV. The protein NahB from the GST-NAHB remains with three amino acid residues than the native sequence and was called GGS-NAHB. The molecular mass of this recombinant enzyme was determined by mass spectrometry and the value was very close to theoretical. Structural characteristics of the enzyme GGS-NahB were measured by Dynamic Light Scattering and Circular Dichroism. By DLS, it was found that the protein is monodisperse and in tetrameric form in solution. CD experiments revealed an enzyme with approximately 25% -helix, 30% of parallel and antiparallel -sheet, 15% of beta turn and 40% of random coil. Further purification is being conducted for protein crystallization assays. The expression vector pET-28a-TEV-NahB, was also sequenced and the recombinant protein His-NahB presents, after cleavage with TEV protease, instead of two amino acid residues than the native sequence, 21 residues. The gene nahB will again subcloned into vector pET-28a-TEV for expression of His-NahB.

A família gênica masp (proteína de superfície associada a mucina), identificada durante a anotação do genoma do Trypanosoma cruzi, é a segunda maior família mutligênica neste parasito, consistindo de aproximadamente 1400 membros. Membros da família MASP contêm domínios N- e C-terminais conservados que codificam para um peptídeo sinal e um sítio de adição de âncora de GPI, respectivamente. A região central é variável em comprimento e em sequência de aminoácidos, e contém um grande repertório de motivos repetitivos, os quais sugerem que MASP esteja envolvida em interações parasito-hospedeiro. Uma vez que nenhum membro da família MASP foi caracterizado até o momento, decidiu-se estudar as estruturas secundária e terciária de diferentes MASPs. Para este objetivo, optou-se por clonar e expressar em Escherichia coli a região central das sequências de quatro membros MASP. Para isso, algumas características das proteínas alvo foram consideradas, tais como curto comprimento da sequência de aminoácidos, em torno de 170 resíduos, baixo conteúdo de sítios potenciais de glicosilação e baixo grau de desordem estrutural. Uma vez que regiões de baixa complexidade normalmente correspondem a segmentos desenovelados ou estruturas extendidas, foi utilizado o servidor PONDR VL-XT para predizer regiões desordenadas nos quatro membros MASP. Proteínas nativamente desenoveladas têm sido descritas por possuírem elevada taxa de resíduos carregados e baixa taxa de resíduos hidrofóbicos. Gráficos de carga líquida média versus taxa de hidrofobicidade foram obtidos para as regiões centrais das quatro MASPs. Estas análises revelaram a presença das quatro regiões centrais no espaço designado para proteínas nativamente desenoveladas. As sequências foram amplificadas por PCR, clonadas nos sistemas de clonagem TOPO e/ou pGEM-T e submetidas ao sequenciamento de DNA. Posteriormente, os produtos de PCR foram transferidos para dois vetores de expressão derivados do vetor pET-28a (Novagen), que foram modificados no Centro de Biologia Molecular e Estrutural (CeBiME, Campinas / SP). Em ambos os vetores, o sítio de reconhecimento por trombina foi substituído pelo sítio de reconhecimento da protease TEV (tobacco etch vírus). As quatro proteínas MASP em fusão a cauda de histidina N-terminal foram expressas na forma solúvel, enquanto que aquelas fusionadas a GST N-terminal foram expressas como corpos de inclusão insolúveis, exceto a recombinante MASP1:GST. A purificação da MASP 3 fusionada a cauda de histidina foi realizada por cromatografia de afinidade. Após a clivagem da etiqueta por TEV, a proteína foi purificada por cromatografia de troca iônica. O estudo da estrutura tridimensional de proteínas MASP permitirá uma compreensão mais detalhada destas moléculas, tal como a localização de seus epítopos e seu enovelamento, o que pode contribuir para a identificação de sua função biológica no T. cruzi. The Trypanosoma cruzi masp (mucin associated surface protein) gene family was identified during the annotation of the genome as the second largest gene family in this human pathogen, consisting of approximately 1400 members. MASP members contain N- and C- terminal conserved domains that encode a putative signal peptide and a GPI-anchor addition site, respectively. The central region is variable both in length and in amino acid sequence and contains a large repertoire of repetitive motifs, which suggests MASP may be involved in parasite-host cell interaction. Since no member of the MASP family has been characterized to date, we have decided to study the secondary and tertiary structures of distinct MASPs. For this purpose, we have decided to clone and express in E. coli the central region sequences of four MASP members. For this, some features of the target proteins were considered such as short amino acid sequence length, around 170 residues, low content of potential glycosylation sites and low intrinsic disorder degree. Knowing that sequence regions with low complexity nearly always correspond to nonfolding segments or extended structures, we have used the web server PONDR VL-XT to predict disordered regions in MASPs. Natively unfolded proteins have been described to possess a high ratio of charged residues and a low ratio of hydrophobic residues. The mean net charge versus mean hydrophobicity ratio was ploted for the four MASPs central region. This analysis showed that the four central regions falls in the phase space of natively unfolded proteins. After that, the sequences were PCR amplified and cloned into TOPO and/or pGEM-T cloning systems and submitted to DNA sequencing. Subsequently, the PCR products were transferred to two expression vectors derived from pET-28a vector (Novagen), which were modified in the Center of Molecular and Structural Biology (CeBiME, Campinas/SP). In both vectors, the thrombin recognition site was replaced by a TEV (tobacco etch virus) protease recognition site. The four N-terminal fusion His-tag MASP proteins were expressed in the soluble forms, whereas the N-terminal GST fusion MASPs were expressed as insoluble inclusion bodies, except the recombinant GST:MASP1. Purification of the Histidine-tagged MASP3 was carried out by affinity chromatography. After His-tag cleavage by TEV, the protein was purified by ion exchange chromatography. The study of the three-dimensional structure of MASP proteins will enable a more detailed understanding of these molecules, such as the location of their epitopes and its fold, which may contribute to the identification of its biological function on T. cruzi.

Leucurolisina-a (leuc-a) e uma metaloprotease de veneno de serpente (SVMP) de classe P-I presente no veneno de Bothrops leucurus. A leuc-a teve sua estrutura primaria completamente sequenciada, apresentando uma unica cadeia polipeptidica com 202 residuos de aminoacidos e alta similaridades com outras SVMPs de classe P-I ja descritas. A leuc-a, mesmo em altas concentracoes, nao provoca hemorragia, apresentando apenas atividade proteolitica em proteinas de matriz extracelular. Essa enzima foi cristalizada, pelo metodo de difusao de vapor, e dois conjuntos de dados de difracao de raios-x, um a 1,8 eoutro a 1,6 A, foram coletados. Os dados mostraram que os cristais pertencem ao grupo espacial P212121, com parametros de celula unitaria muito similares A estrutura cristalografica da leuc-a foi resolvida pelo metodo de substituicao molecular usando o modelo da metaloproteinase BaP1 (PDB code 1ND1) purificada do veneno da serpente Bothrops asper. O modelo da leuc-a, a 1,8 A de resolucao, foi refinado ate um Rfator final = 0,168 e Rlivre = 0,235. A estrutura apresenta o conservado motivo de ligacao ao zinco H142E143XXH146XXG149XXH152 assim como o motivo gmet turn h C164I165M166, caracteristico da superfamilia metzincina. Um atomo de zinco foi observado no sitio catalitico da enzima sendo estabilizado pelos NÃ2 dos tres aneis imidazolicos dos residuos de histidinas H142H146H152 e uma molecula de agua entre o espaco do atomo de zinco e a cadeia lateral do residuo E143. Um ion calcio tambem foi observado unido das extremidades N e C-terminais da estrutura. Esse atomo e estabilizado por duas moleculas de agua e cinco atomos presentes nas cadeias laterais de residuos conservados: o oxigenio da carbonila do residuo Glu9; os dois oxigenios do carboxilato do residuo Asp93, o oxigenio da carbonila do residuo Cys197 e o oxigenio da carboxamida do residuo Asn200. A leuc-a possui seis residuos de cisteina (Cys117-Cys197, Cys157-Cys164, and Cys159-Cys181) envolvidos na formacao de pontes dissulfeto. A resolucao de outro conjunto de dados, com 1,6 A de resolucao, apresentou uma densidade eletronica desconhecida no sitio catalitico da enzima. Esse ligante foi identificado, sintetizado e utilizado com sucesso em ensaios de inibicao da atividade proteolitica da leuc-a. Leucurolysin-a (leuc-a) is a P-I class snake venom metalloproteinase (SVMP) from the venom of Bothrops leucurus, a poisonous snake which is responsible for the majority of snakebites in the northeast of Brazil. It has been shown that leuc-a degrades fibrin clots directly in vitro without activating plasminogen (Pg), and does not elicit any hemorrhagic response. Leuc-a is a single chain zinc binding endopeptidase composed of 202 amino acids residues, which shows high similarity with other P-I SVMPs. In this work, leuc-a was crystallized using the hanging-drop vapour-diffusion method. Two data set were collected,one with 1.8 A, and other with 1.6 A. Data sets showed that the crystals belongs to the orthorhombic P212121 space group, with unit-cell parameters very similar. The crystallographic structure of leuc-a was solved by Molecular Replacement technique using the Bothrops asper metalloproteinase (BaP1) structure (PDB code 1ND1) as template.Leuc-a model was refined to a final Rfactor of 0.168 and Rfree of 0.235 against diffraction data of 1.80 A of resolution. The structure displayed the zinc binding motif H142E143XXH146XXG149XXH152 as well as the C164I165M166 motif ( gMet-turn h), which characterize the metzincin superfamily of metalloproteinases. A Zn2+ ion was observed inthe active site cleft of the enzyme and one structural Ca2+ ion was assigned on the molecular surface close to its C-terminal. The Zn2+ ion was tetra-coordinated by three imidazole NÃ2 atoms from H142, H146 and H152 and one catalytic water molecule anchored to the side-chain carboxyl group of E143. Leuc-a has six cysteine residues involved in threedisulfide bridges (Cys117-Cys197, Cys157-Cys164, and Cys159-Cys181). The other data set, with 1.6 A of resolution, was was refined to a final Rfactor of 0.178 and Rfree of 0.231. This model showed a unknown electron density at active site. This ligand was identified, synthesized and tested with leuc-a. The results showed a inhibition of proteolitic activity leuc-a over dimethyl casein.

Após a descoberta dos primeiros peptídeos potenciadores de bradicinina (PPBs) no início dos anos 70, por Sérgio Ferreira e colaboradores, várias moléculas similares foram identificadas na peçonha de artrópodes e vertebrados. Utilizando ferramentas proteômicas, uma nova família de peptídeos foi isolada da peçonha do escorpião Tityus serrulatus e denominada T. serrulatus Hipotensinas (TsHpts). Estes peptídeos são lineares e capazes de potenciar os efeitos hipotensivos da bradicinina (BK). Foi realizado um estudo de minimização da estrutura primária de TsHpt-I (AEIDFSGIPEDIIKQIKETNAKPPA), um membro desta família, para inferir os resíduos de aminoácidos cruciais para a atividade biológica das Hipotensinas, além de avaliar a estrutura primária mínima capaz de manter esta atividade. Utilizando a extremidade C-terminal de TsHpt-I como molde, foram sintetizados os peptídeos TsHpt-I[17-25] (KETNAKPPA); TsHpt-I[21-25] (AKPPA); TsHpt-I[22-25] (KPPA); TsHpt-I[23-25] (PPA); TsHpt-I[22-24] (KPP); TsHpt-I[22-23] (KP); TsHpt-I[23-24] (PP); TsHpt-I[24-25] (PA) e TsHpt-I[ac22-24] (acKPP), que não contém uma carga positiva na sua cadeia lateral. Todos os peptídeos que apresentam as duas prolinas C-terminais foram capazes de potenciar a BK, sendo que a carga positiva do radical da lisina se mostrou crucial para que estes peptídeos induzam uma hipotensão imediata e transiente, quando administrados intravenosamente. O efeito vasodilatador, dependente de endotélio e da síntese de NO, também foi afetado pela ausência da carga positiva deste resíduo de aminoácido. Diferentemente da grande maioria dos PPBs descritos, TsHpt-I e seus análogos sintéticos não foram capazes de inibir a ECA. Este estudo também revelou que a minimização estrutural de TsHpt-I não alterou significativamente os seus efeitos cardiovasculares, muito importante do ponto de vista biotecnológico, pois peptídeos de baixa massa molecular apresentam poucos, ou nenhum ponto de clivagem proteolítica, além de terem baixo custo de síntese. Using a proteomic approach, a new structural family of peptides was put in evidence in the venom of the yellow scorpion Tityus serrulatus. T. serrulatus Hypotensins (TsHpt) are random-coiled linear peptides that act as bradykinin potentiating peptides (PPBs). Aiming to better understand the relationship between the primary structure of TsHpt-I (AEIDFSGIPEDIIKQIKETNAKPPA) and its capacity to potentiate the hypotensive effect of BK, some synthetic peptides were constructed using the C-terminal portion of TsHpt-I as model; TsHpt-I[17-25] (KETNAKPPA); TsHpt-I[21-25] (AKPPA); TsHpt-I[22-25] (KPPA); TsHpt-I[23-25] (PPA); TsHpt-I[22-24] (KPP); TsHpt-I[22-23] (KP); TsHpt-I[23-24] (PP); TsHpt-I[24-25] (PA) and TsHpt-I[ac22-24] (acKPP), which do not have the positive charge in the lysine radical. All synthetic peptides holding the doublet PP at the C-terminal could potentiate the hypotensive effect of BK, but only the analogs that have the lysine residue, could induce a transient hypotension when intravenously administrated in male rats, indicating that the positive charge located towards the radical of this amino acid residue is crucial for this cardiovascular effect. The capacity of these peptides to induce an endothelium and NO dependent vasorelaxating effect was either affected by the absence of this positive charge. Despite several PPBs inhibit ACE, TsHpt-I and the synthetic analogs could not inhibit this enzyme. This study has also demonstrated that the reduction of the primary structure of TsHpt-I does not significantly alter the biological effects of this native peptide, which could be interest by biotechnological purpose, as minimization of enzymatic hydrolysis points, as well as lowering production costs.

COITINHO, J. B. Caracterização estrutural da forma recombinante da proteína Pb27 de Paracoccidioides brasiliensis. 2009. Dissertação (Mestrado) - Departamento de Bioquímica e Imunologia. Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, 2009. Paracoccidioidomicose (PCM) é uma das mais importantes micoses sistêmicas do Brasil. O agente etiológico da doença é o fungo termo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. A infecção causa lesões nos pulmões e pode disseminar para outros órgãos e tecidos. No entanto, ainda não existe um protocolo específico de controle da doença nem diagnóstico padronizado ou protocolo de tratamento. O antígeno recombinante de 27k-Da (Pb27r) tem sido utilizado com alta especificidade e sensibilidade no diagnóstico da PCM, mas sua função biológica no fungo é desconhecida. Além disso, nenhuma outra proteína similar foi descrita nos bancos de dados. O gene para a Pb27 foi inicialmente clonado em nosso laboratório no vetor de expressão fusionado à GST, mas as tentativas de cristalizar a proteína purificada falharam e construções diferentes foram preparadas. O gene para a Pb27 foi subclonadono vetor de expressão pET-DEST42 com cauda de histidinas C-terminal.Pb27r-CHis foi expressa em E. coli BL21 e purificada utilizando cromatografia de afinidade. Para confirmar a expressão da proteína, foi realizado um Western blot utilizando soro de camundongos anti-Pb27. Ensaios de cristalização da Pb27r-CHis foram inicialmente realizados através de kits de cristalização utilizando a técnica de difusão de vapor, mas nenhum cristal de proteína foi observado. Outras 544 condições foram testadas automaticamente, mas novamente, cristais não se formaram. Nesse meio tempo, o gene da Pb27 foi subclonado em outro vetor de expressão (pDEST 17) com cauda de histidina N-terminal (Pb27r-NHis). Essa proteína foi expressa e purificada seguindo omesmo protocolo para a Pb27r-CHis, mas, novamente, nenhum cristal foi observado. Os resultados dos experimentos de espalhamento dinâmico da luz (DLS) e dicroísmo circular (CD) indicaram que as duas proteínas, apesar de parcialmente polidispersas em solução, apresentavam-se estruturadas, com cerca de 40 % de -hélices. Na tentativa de facilitar a formação de cristais pela minimização da entropia de superfície da proteína Pb27r, foi realizada mutação sítio dirigida para trocar dois resíduos teoricamente de superfície, K e E por duas A. Essa proteína (Pb27r-mut) foi clonada no vetor pDEST 17 mas se tornou insolúvel. Para remover regiões protéicas mais flexíveis que dificultam aformação de cristais, as proteínas Pb27r-CHis e Pb27r-NHis foram submetidas à proteólise limitada com tripsina. Uma região de aproximadamente 25 kDa se manteve constante nas duas construções quando analisadas por SDS-PAGE e MALDI-MS. Como até o momento, todas as tentativas de cristalizar a Pb27 recombinante não foram bem sucedidas, tentavas de cristalização da proteína nativa através de sua purificação por afinidade utilizando anticorpos anti-Pb27 obtidos da imunização de coelho serão realizadas. O estudo da estruturatridimensional desta proteína permitirá um entendimento mais detalhado desta molécula, tal como a localização de seus epitopos e seu dobramento. Além disso, a informação estrutural dessa proteína provavelmente ajudaria a identificar sua função no fungo P. brasiliensis. COITINHO, J. B. Structural characterization of recombinant form of theprotein Pb27 from Paracoccidioides brasiliensis. 2009. Dissertation(Masters). Departamento de Bioquímica e Imunologia. Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, 2009. Paracoccidiodomycosis (PCM) is one of the most important systemic mycoses in Brazil. The etiologic agent of the disease is the thermal dimorphic fungusParacoccidioides brasiliensis. The infection causes lesions in the lungs and can disseminate to other organs and tissues. So far, there is no specific control program, standardized diagnostic or treatment protocol for this disease. The recombinant 27-kDa antigen (Pb27r) has been used with high sensibility and specificity in the diagnosis of PCM but its biological function in the fungus is unknown. Besides, no other similar protein has been described so far in databases. The gene of Pb27 was initially cloned in our laboratory into the expression vector pGEX with a GST-tag, but the attempts to crystallize the purified protein were unsuccessful and different constructs have been prepared. The gene was subcloned into the expression vector pET-DEST42 with a His-tagat the C-terminus. Pb27r-CHis was expressed in E. coli BL21 and purified using a metal-affinity chromatography. To confirm the Pb27r expression, a Western blot using mouse anti-Pb27 serum was performed. Crystallization of Pb27r-CHis was initially performed with commercially available sparse-matrix screens using the hanging-drop vapour diffusion technique. So far, no protein crystals have been observed and others 544 conditions were tested automatically, but nocrystals were formed again. In the mean time, the Pb27 gene was alsosubcloned into another expression vector (pDEST 17) with an N-terminal Histag (Pb27r-NHis). This protein was expressed and purified using the same protocol for Pb27r-CHis but the initial crystallization attempts did not produce crystals. The results of the experiments of dynamic light scattering (DLS) and circular dichroism (CD) showed that the proteins, although partially polydisperses in solution, were structured, with about 40% of -helix. In an attempt to facilitate the formation of crystals by minimizing the entropy of the Pb27r surface, site directed mutation was held to exchange two theoretically surface residues, E and K for two A. This protein (Pb27r-mut) was cloned in the vector pDEST 17 but became insoluble. To remove more flexible protein regions that hinder the formation of crystals, the proteins Pb27r-CHis and Pb27r-NHis were subjected to limited proteolysis with trypsin. A region of approximately 25 kDa remained constant in the two constructs when analyzed by SDS-PAGE and MALDI-MS. As so far, all attempts to crystallize therecombinant Pb27 failed, the crystallization of the native protein through its affinity purification by using anti-Pb27 antibodies obtained from theimmunization of rabbits will be performed. The study of the three-dimensional structure of this protein will enable a more detailed understanding of this molecule, such as the location of their epitopes and its folding. Besides, structural information about this protein could probably help to identify its biological function on P. brasiliensis.

Neste trabalho foi feita uma análise comparativa entre duas metodologias clássicas no estudo de contatos em proteínas: a dependente de um delimitador de distância (CD - CutoffDependent) e outra que não é dependente de um delimitador, a decomposição de Delaunay (DT Delaunay Tessellation). Essas técnicas foram avaliadas usando-se duas formas diferentes de representação de resíduos (centróides): pelo carbono alfa (CA) e pelo centro geométrico da cadeia lateral (GC). Um banco de dados foi montado, compreendendo dois conjuntos chamados ALPHA e BETA contendo cadeias das duas principais classes do sistema de classificação CATH: all-alpha e all beta, respectivamente. Um delimitador em 7.0 Å emergiu como um importante parâmetro de distância na análise dos contatos inter-resíduos em proteínas. Este valor marca o ponto de bifurcação no comportamento das curvas decontatos entre as técnicas CD e DT. Até 7,0 Å, as propriedades CD e DT são unificadas numa mais abrangente: nesta distância, todos os contatos (arestas) são totais e verdadeiro-positivos (completos e não-oclusos). A distância de 7,0 Å é o ponto também em que a primeira camada de vizinhos encontra-se otimamente separada das demais, constituindo-se principalmente de contatos de primeira-ordem. É demonstrado que 7,0 Å é um ponto de transição entre os comportamentos lineares e quadráticos da curva do número total de vizinhos por resíduo. Também é mostrado que a técnica DT tem uma conhecida anomalia em sua contagem de arestas que, em proteínas, pode produzir omissões indesejáveis e sistemáticas afetandoprincipalmente a rede de contatos de proteínas betas com centróides em CA. Uma técnica auxiliar reconhecida por tratar essa anomalia é o quase-Delaunay (AD Almost Delaunay). É observado que mesmo AD não se mostra uma técnica proveitosa em proteínas. É empiricamente demonstrado que DT+AD convergem para CD, na medida que o parâmetro de perturbação em AD cresce. Isto alerta que DT e técnicas correlatas devem ser usadas com precaução em proteínas. Como conseqüência, no estrito intervalo de 0,0 Å a 7,0 Å, CD revela-se uma metodologia mais simples, completa e confiável. Por fim, é evidenciadotambém que a redução na representação dos resíduos aos centróides CA e GC pode introduzir tendências estatísticas na análise de vizinhos em delimitadores até 6,8 Å, com CA em favor ALPHA e GC em favor de BETA. Para valores acima de 6,8 Å, este viés parece ser eliminado. Isto provê um argumento a mais em benefício do limite em 7,0 Å, como umparâmetro de referência, robusto e de carácter geral, a ser usado de forma segura como um confiável delimitador de distância nos estudos em massa de contatos de proteínas. In this study we carried out a comparative analysis between two classical methodologies used to prospect residue contacts in proteins: the traditional cutoff dependent (CD) approach and the cutoff free Delaunay tessellation (DT). Additionally, two alternative coarse-grained forms to represent protein residues were tested: using alpha carbon (CA) and using side chain geometric center (GC). A database was built, comprising two top classes according to CATH classification: all alpha and all beta. We found that the cutoff value at about 7.0 Å emerges asan important distance parameter in analysis of contacts in proteins. This value was not only independent of residue representation and of protein class but it was also the point where CD and DT methods diverged regarding their results. Up to 7.0 Å, CD and DT properties areunified, which implies that at this distance all identified contacts (edges) are fully truepositives (complete and not occluded). This unification may also imply that the edges distribution up to 7.0 Å is constituted mainly by contacts involving buried sites of the first coordination shell. We also have shown that DT techniques have a known anomaly, comprehending points near the degenerate condition, which in proteins may producedangerous and systematic errors affecting mainly the contact network in beta chains with CA residue representation. The almost-Delaunay (AD) approach has been proposed to solve this DT anomaly. We found that even AD may not be an advantageous solution. We empiricallydemonstrated that the DT+A results converge to CD, as the AD threshold perturbation parameter grows. This warns that DT and correlated techniques should be used with care in contacts analysis of proteins. As a consequence, in the strict range up to 7.0 Å, the CD approach revealed to be a simpler, more complete and reliable technique than DT (or DT+AD) to prospect protein contacts. Finally, we have shown that coarse-grained residue representation may introduce bias in the analysis of neighbors in cutoffs up to 6.8 Å, with CA in favor of all alpha proteins and GC in favor of all beta proteins. Beyond 6.8 Å, this bias isapparently eliminated. This provides an additional argument in benefice of the value 7.0 Å as an important lower bound cutoff to be used in contact analysis of proteins, for both CA and GC coarse-grained models.

Brucella abortus é uma bactéria intracelular facultativa, Gram-negativa, que infecta animais domésticos e o homem, causando a brucelose. O LPS presente em sua membrana é um dos principais fatores de virulência. Esta estrutura determina a morfologia das colônias que podem ser lisas ou rugosas. Este trabalho tem como objetivo a inativação do gene wbkC, que codifica uma enzima formiltransferase envolvida na biossíntese do LPS, das linhagens selvagem e vacinal da B. abortus visando o desenvolvimento de uma nova cepa vacinal. Por recombinação homóloga dupla foram obtidos os mutantes B. abortus wbkC S2308 e B. abortus wbkC S19. A confirmação da mutação no gene wbkC foi avaliada pelas técnicas de PCR e Southern blot. As colônias destes mutantes apresentaram morfologia rugosa quando coradas com cristal violeta. Através da técnica de imunoblotting utilizando anticorpo específico para o LPS rugoso, o LPS das cepas mutantes foi reconhecido, porém com um padrão de bandas diferenciado do LPS liso das cepas parentais. Os mutantes obtidos foram avaliados em modelos animais em camundongos C57BL/6 e camundongos deficientes para o gene que codifica o fator regulador de interferon do tipo 1 (IRF-1(-/-)). As cepas mutantes da B. abortus apresentaram uma menor persistência quando comparadas com as cepas parentais B. abortus S2308 e S19, e uma virulência bastante semelhante à cepa vacinal RB51. A capacidade dos mutantes conferirem proteção ao desafio com a cepa selvagem B. abortus S2308 também foi avaliada. B. abortus wbkC S2308 induziu uma proteção em camundongos IRF-1(-/-) semelhante à observada naqueles animais vacinados com as cepas vacinais B. abortus S19 e RB51. Pode-se concluir que os mutantes da B. abortus para o gene wbkC apresentaram reduzida virulência quando comparados às linhagens selvagem e vacinais. Além disso, o mutante B. abortus wbkC S2308 induziu uma proteção em camundongos IRF(-/-) semelhante às cepas vacinais mostrando-se ser um candidato em potencial para compor uma vacina viva contra a brucelose. Brucella abortus is a Gram-negative facultative intracellular pathogen that affects several domestic animals and occasionally man, causing brucellosis. Brucella LPS is one of the main virulence factors of this bacterium. Additionally, the wbkC gene product, the focus of this study, participates in LPS biosynthesis as a formyltransferase enzyme. Alterations in wbkC may cause modifications in LPS structure altering bacterial colony morphology from smooth (S) to rough (R). The main goal of this study was to inactivate the wbkC gene of the B. abortus wild type and vaccine strains in order to generate a new vaccine strain. Mutants B. abortus wbkC S2308 and B. abortus wbkC S19 were obtained by double homologous recombination. Characterization of these mutants was performed by PCR using specific primers. Southern blot confirmed that the wild type wbkC gene was disrupted within Brucella mutants. Morphology of mutant colonies presented rough phenotype demonstrated by crystal violet staining. Immunobloting analysis of Brucella mutants was performed and their LPS were recognized by rough LPS specific monoclonal antibodies. Persistence of the mutants were studied in both murine models: IRF(-/-) and C57BL/6. Brucella wbkC mutants were shown to be less virulent than wild type and B. abortus S19 strains and similar phenotype to B. abortus RB51 strain. Regarding protective immunity, the mutant B. abortus wbkC S2308 strain was able to induce similar protection when compared to S19 and RB51 vaccine strains in IRF(-/-) mice. In conclusion, wbkC mutants were less virulent than the wild type and vaccine strains, but only B. abortus wbkC S2308 induced similar protection level as induced by the vaccine strains commercially available. This data suggests that B. abortus wbkC S2308 is a potential candidate for the development of a live vaccine against brucellosis.