Physical and chemical aspects on the reactivation and stability of 1,2-dihydroxynaphthalene dioxygenase (DoxG)

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Bactérias do gênero Pseudomonas apresentam um arsenal formidável de enzimas que permitem que hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) sejam utilizados como única fonte de carbono. Dentre essas enzimas, a 1,2-dihidroxinaftaleno dioxigenase de Pseudomonas sp. C18 (DoxG), uma extradiol dioxigenase Fe+2-dependente, catalisa a conversão do 1,2-dihidroxinaftaleno em 2-hidroxi-2H-cromeno-2-carboxilato via uma dioxigenação. Uma reação que não encontra correspondência em síntese clássica. Essa enzima destaca-se por possuir um sítio ativo volumoso que a dota de promiscuidade, sendo capaz de clivar, além de uma série de catecóis, bifenis policlorados (BPCs). Essa formidável capacidade contrasta com a fácil oxidação do cofator Fe+2 pelo oxigênio presente no ar, processo observado durante a lise e purificação da enzima que leva a sua inativação. Nosso objetivo foi determinar quais fatores influenciam a reativação da enzima, bem como as estratégias para aprimorar sua estabilidade e atividade catalítica. A DoxG foi expressa e purificada em condições aeróbicas. A caracterização foi feita pela determinação de sua massa monomérica via eletroforese e experimentos de espalhamento dinâmico de luz consistentes com um estado octamérico com massa de aproximadamente 270 kDa em solução aquosa. A velocidade de reconstituição da holoenzima mostrou ser um processo sensível a vários fatores: (1) a incubação com o íon Fe2+ mostrou-se a forma mais eficiente de reativação; (2) a velocidade de reativação depende da concentração do íon Fe2+; (3) o pH de 5,75 propiciou a forma mais rápida de reativação, sendo que em meios mais alcalinos a disponibilidade do cofator foi limitada e em meios mais ácidos o processo foi afetado negativamente pela protonação de resíduos do sítio ativo que se complexam ao cofator; (4) embora a força iônica com NaCl ou KCl não afetou a reativação, sais ou tampões com ânions capazes de se ligar ao Fe+2 (ex. sulfato) afetaram a disponibilidade do mesmo; (5) a reativação de 90% da enzima requereu duas horas e meia de incubação com o íon Fe2+. Além desses pontos, observou-se que o íon Mn+2 não pôde substituir o íon Fe+2 como cofator, no entanto, conferiu maior estabilidade a DoxG. Estudos de inativação térmica demonstraram que na presença de Mn+2, a enzima não perdeu sua atividade consideravelmente após ser incubada por quarenta minutos a 60 °C. Os estudos de atividade enzimática mostraram que a DoxG foi capaz de catalisar a clivagem do catecol, 3-metilcatecol e 2,3-dihidroxibifenil, sendo que a eficiência catalítica (kcat/Km) para a clivagem do 2,3-dihidroxibifenil foi 1000 vezes maior do que para o catecol e 10 vezes maior do que para o 3-metilcatecol. Bacteria of the genus Pseudomonas have a formidable arsenal of enzymes allowing them to use polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) as the sole carbon source. Among these enzymes, the 1,2-dihydroxynaphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. C18 (DoxG), a Fe+2-dependent dioxygenase extradiol, catalyzes the conversion of 1,2-dihydroxynaphthalene to 2-hydroxy-2H-chromene-2-carboxylate via a dioxygenation. A reaction with no match in classical synthesis. This enzyme exhibits a large active site endorsing its promiscuity, which is able to cleave, in addition to a series of catechols, the polychlorinated biphenyls (BPCs). This formidable capacity contrasts with the facile oxidation of the Fe+2 cofactor by the oxygen present in the air, a process that occurs throughout the lysis and purification of the enzyme and leads to its inactivation. Our goal is to determine the factors to efficient enzyme reactivation, as well as strategies to improve its stability and catalytic activity. Therefore, DoxG was expressed and purified under aerobic conditions. Characterization was done by its monomeric mass determined by electrophoresis and by its oligomeric state estimated using dynamic light scattering, which was consistent with an octamer in aqueous solution showing a molecular mass of about 270 kDa. The rate of holoenzyme reconstitution was sensitive to several factors: (1) incubation with Fe2+ was the most efficient form of reactivation; (2) the reactivation rate depends on concentration of the Fe2+; (3) the pH of 5.75 provided the fastest reactivation. In more alkaline media the availability of the cofactor was limited and in more acidic media the process was negatively affected by protonation of active-site residues involved in the complexation of the cofactor; (4) although the ionic strength using NaCl or KCl did not affect the reactivation, salts or buffers with anions capable of binding Fe+2 (e.g. sulfate) affected its availability; (5) reactivation of 90% of the enzyme required two and a half hours of incubation with Fe2+. In addition, it was observed that Mn+2 could not replace the Fe+2 as cofactor, however, it provided greater stability to DoxG. Thermal inactivation studies showed that in the presence of Mn+2, the enzyme did not lose its activity considerably after being incubated for forty minutes at 60 °C. The enzyme activity studies showed that DoxG was able to catalyze the cleavage of catechol, 3-methylcatechol, and 2,3-dihydroxybiphenyl. The catalytic efficiency (kcat/Km) for cleavage of 2,3-dihydroxybiphenyl was 1000-fold and 10-fold greater than catechol and 3-methylcatechol, respectively.