Caracterização estrutural das enzimas cis-naftaleno dihidrodioldesidrogenase e salicilato hidroxilase recombinantes de Pseudomonas putida G7 envolvidas na degradação do naftaleno

O conhecimento da estrutura tridimensional de enzimas nos permite determinar seus mecanismos de ação, atuar de forma orientada na estrutura destas moléculas e, eventualmente, alterar propriedades físico-químicas objetivando alguma aplicação biotecnológica específica,além de contribuir para o conhecimento básico da relação estrutura-função de proteínas. As enzimas cis-naftaleno dihidrodiol desidrogenase (NahB) e salicilato hidroxilase (NahG) dePseudomonas putida G7 estão envolvidas na degradação do naftaleno, um hidrocarboneto aromático policíclico (HAPs). A maioria dos HAPs são tóxicos, mutagênicos e carcinogênicos. A biorremediação é uma estratégia para a eliminação dos HAPs do meio ambiente, a qual utiliza enzimas ou microorganismos que possuem a capacidade de metabolizar esses compostos e transformá-los em substâncias menos tóxicas. No presente trabalho foram feitas a caracterização estrutural da proteína NahB e as caracterizações bioquímica e estrutural da NahG. Os genes nahB e nahG foram clonados e expressos em células de Escherichia coli RosettaTM (DE3) cultivadas a 18º C por 16 horas. A análise do pellet e do sobrenadante revelou que as proteínas estavam na fração solúvel. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e exclusão molecular. A proteína NahB recombinante apresenta massa molecular de 29,5 kDa e foi denominada 6xHis- NahB, a NahG recombinante possui massa molecular de 48,9 kDa e foi denominada 6xHis- NahG. Para obter as proteínas corretamente enoveladas, estáveis e monodispersas foramtestados diferentes protocolos de lise celular e de purificação, além da adição de ligantes. Após otimização, foram obtidos cristais de ambas as proteínas, os quais foram submetidos à difração de raios-X. Um cristal da 6xHis-NahB difratou até 1.64 Å e sua estrutura foi resolvida pelo método de Substituição Molecular. A enzima 6xHis-NahB apresenta o clássico motivo de Rossman de ligação de nucleotídeo, formado por uma folha beta central constituída por sete fitas- e por nove -hélices, sendo que são 3 hélices de cada lado flanqueando a folha beta. Para resolução da estrutura tridimensional da 6xHis-NahG foi utilizado o método dos átomos pesados. Um cristal nativo da enzima 6xHis-NahG difratou até 2.20 Å e um cristal derivado com iodo até 2.00 Å. Esta enzima foi caracterizada pela presença de três folhas beta constituída por oito, quatro e três fitas- e por quatorze -hélices, sendo estruturalmente similar a outras hidroxilases dependentes de FAD. A 6xHis-NahG converte ácido salicílico em catecol via hidroxilação descarboxilativa e os valores de KM para a enzima sem cauda de seis histidinas foram 27,31; 1,26 e 22,74 M para o substrato ácido salicílico e para as coenzimas FAD e NADH, respectivamente. The three dimensional structure of enzymes allows us to determine their action mechanism, to act in a targeted manner in the structure of these molecules and eventually change physicochemical properties in favor of any specific biotechnological applications, and contribute to a basic understanding of the proteins structure-function. cis-Naphthalenedihidrodiol dehydrogenase (NahB) and salicylate hydroxylase (NahG) enzymes from Pseudomonas putida G7 are involved in degradation of naphthalene, a polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH). Most PAHs are toxics, mutagenics and carcinogenics. Bioremediation is a strategy for the removal of PAHs from the environment, which uses enzymes ormicroorganisms that have the ability to metabolize these compounds and turn them into less toxic substances. In the present study the structural characterization of the NahB protein and the biochemical and structural characterizations of NahG were done. The nahB and nahG genes were cloned and expressed in Escherichia coli RosettaTM (DE3) cells at 18° C for 16 hours, leading to expression of the enzymes in the soluble fraction. The recombinant proteins were purified by affinity and molecular exclusion chromatographies. In order to obtain folded, stable and monodisperse proteins, different protocols for cell lysis and purification were tested, besides the addition of ligands. After optimization, protein crystals of both enzymes were obtained and analyzed using a X-ray diffraction experiment. 6xHis-NahB crystal diffracted to 1.64 Å and its structure was solved by the Molecular Replacement method. The6xHis-NahB enzyme has the classic Rossman motif of nucleotide binding, comprising a central beta-sheet consisting of seven -strands and nine -helices, having three helices each side flanking the -sheet. The heavy atoms method was used to solve the 6xHis-NahG threedimensional structure. A native crystal of the 6xHis-NahG enzyme diffracted to 2.20 Å and an iodine derivative to 2.00 Å. This enzyme is characterized by the presence of three -sheets composed of eight, four and three -strands and fourteen -helices, and is structurally similarto other FAD-dependent hydroxylases. The 6xHis-NahG converts salicylic acid to catechol by descarboxylative hydroxylation and KM values of the enzyme without six histidines tag were 27.31, 1.26 and 22.74 M for the substrate salicylic acid, FAD and NADH coenzymes, respectively.