Expressão de xilanases de Aspergillus nidulans em Pichia pastoris: purificação, caracterização e aplicação na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar

O bagaço de cana-de-açúcar é o resíduo agrícola mais abundante no Brasil e apresenta elevado potencial para ser utilizado na produção de etanol de segunda geração. Entretanto, a grande complexidade da biomassa lignocelulósica requer diferentes enzimas para uma hidrólise eficiente. Neste trabalho, foi realizada a purificação, a caracterização bioquímica, a caracterização cinética e a aplicação na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar de duas xilanases de Aspergillus nidulans clonadas em Pichia pastoris: AN1818.2 e AN3613.2. A indução da expressão dos genes das xilanases foi realizada em meio BMMY contendo metanol, o qual induz a ativação do promotor AOX1, envolvido no metabolismo deste álcool. O sobrenadante do cultivo constitui-se no extrato bruto, o qual foi submetido à cromatografia de afinidade em coluna His Trap HP e, em seguida, à cromatografia de exclusão molecular em coluna Superdex 200. A temperatura ótima de atividade para a xilanase AN1818.2 foi 60 ºC, já para a xilanase AN3613.2 foi 50 ºC. Ambas as enzimas mostraram-se estáveis quando pré-incubadas a 50 ºC e pouco estáveis quando pré-incubadas a 60 ºC. A xilanase AN1818.2 apresentou um pH ótimo de atividade de 7,5 e a xilanase AN3613.2 apresentou melhor atividade em pH 6,0. Ambas as xilanases foram altamente estáveis quando pré-incubadas durante uma hora em tampões na faixa de pH de 2,5 a 13 e retornadas ao pH 5,0. As enzimas AN1818.2 e AN3613.2 foram fortemente inibidas por HgCl2, SDS, CuSO4 e xilotriose. A xilanase AN1818.2 hidrolisou melhor o substrato arabinoxilana de trigo e a xilanase AN3613.2 o substrato xilana beechwood. O valor de Km utilizando xilana beechwood como substrato foi de 1,66 e 4,23 mg/mL para as xilanases AN1818.2 e AN3613.2, respectivamente. A hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar com o coquetel Multifect CL Genencor® foi mais eficiente quando suplementada com a xilanase AN1818.2 em combinação com a xilanase AN3613.2. Já a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar com o coquetel Accellerase 1500 Genencor® foi mais eficiente quando suplementada apenas com a xilanase AN3613.2. Sugarcane bagasse is the most abudant agricultural waste in Brazil and has a high potential to be used in the production of second generation ethanol. However, the high complexity of lignocellulosic biomass requires different enzymes for efficient hydrolysis. In this study, two xylanases from Aspergillus nidulans, AN1818.2 and AN3613.2, cloned in Pichia pastoris were purified, biochemically characterized, kinetically characterized and applied in sugarcane bagasse hydrolysis. BMMY medium was used to induce xylanases gene expression. This medium contains methanol, which induces AOX1 promoter, involved in methanol metabolism. The enzymatic extract was submitted to affinity (His Trap HP) and gel filtration (Superdex 200) chromatographies. Xylanase AN 1818.2 is optimally active at 60 oC and in pH 7,5. AN3613.2 was optimally active at 50 oC and in pH 6,0. Both xylanases were higly thermostable at 50 oC and in pH range from 2,5 to 13 and less stable at 60 oC. HgCl2, SDS, CuSO4 and xylotriose inhibited enzymatic activities. Wheat arabinoxylan was the best substrate for AN1818.2 hydrolysis and AN3613.2 is better suitable for beechwood xylan hydrolysis. Km for AN1818.2 and AN3613.2 was 1,66 and 4,23 mg/mL, respectively, using beechwood xylan as substrate. Sugarcane bagasse hydrolysis with Multifect CL Genencor® was more efficient when xylanase AN1818.2 was added with xylanase AN3613.2. Sugarcane bagasse hydrolysis with Accellerase 1500 Genencor® was more efficient when only xylanase AN3613.2 was added.