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Immunotherapy including immune checkpoint inhibitors (ICIs) has become the backbone of treatment for most lung cancers with advanced or metastatic disease. In addition, they have increasingly been used for early stage tumors in neoadjuvant and adjuvant settings. Unfortunately, however, only a subset of patients experiences meaningful response to ICIs. Although programmed death-ligand 1 (PD-L1) protein expression by immunohistochemistry (IHC) has played a role as the principal predictive biomarker for immunotherapy, its performance may not be optimal, and it suffers multiple practical issues with different companion diagnostic assays approved. Similarly, tumor mutational burden (TMB) has multiple technical issues as a predictive biomarker for ICIs. Now, ongoing research on tumor- and host immune-specific factors has identified immunotherapy biomarkers that may provide better response and prognosis prediction, in particular in a multimodal approach. This review by the International Association for the Study of Lung Cancer Pathology Committee provides an overview of various immunotherapy biomarkers, including updated data on PD-L1 IHC and TMB, and assessments of neoantigens, genetic and epigenetic signatures, immune microenvironment by IHC and transcriptomics, and microbiome and pathologic response to neoadjuvant immunotherapies. The aim of this review is to underline the efficacy of new individual or combined predictive biomarkers beyond PD-L1 IHC and TMB.

Background The expression of programmed death (PD) ligand 1 (PD-L1) protein expression assessed by immunohistochemistry (IHC) has been correlated with response and survival benefit from anti-PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibitor therapies in advanced non-small cell lung carcinoma (NSCLC). The efficacy of several agents appears correlated with PD-L1 expression. It remains controversial whether PD-L1 is prognostic in NSCLC. We assessed the prognostic value of PD-L1 IHC and its predictive role for adjuvant chemotherapy in early stage NSCLC. Patients and methods Tumor sections from three pivotal adjuvant chemotherapy trials (IALT, JBR.10, CALGB 9633) using the E1L3N antibody were studied in this pooled analysis. PD-L1 staining intensity and percentage in both tumor cells (TCs) and immune cells (ICs) were scored by two pathologists. The average or consensus PD-L1 expression levels across intensities and/or percent cells stained were correlated with clinicopathological and molecular features, patient survivals and potential benefit of adjuvant chemotherapy. Results Results from 982 patients were available for analysis. Considering staining at any intensities for overall PD-L1 expression, 314 (32.0%), 204 (20.8%) and 141 (14.3%) tumor samples were positive for PD-L1 staining on TCs using cut-offs at ≥1%, ≥10% and ≥25%, respectively. For PD-L1 expressing ICs, 380 (38.7%), 308 (31.4%) and 148 (15.1%) were positive at ≥ 1%, ≥10% and 25% cut-offs, respectively. Positive PD-L1 was correlated with squamous histology, intense lymphocytic infiltrate, andKRAS but not withTP53 mutation.EGFR mutated tumors showed statistically non-significant lower PD-L1 expression. PD-L1 expression was neither prognostic with these cut-offs nor other exploratory cut-offs, nor were predictive for survival benefit from adjuvant chemotherapy. Conclusions PD-L1 IHC is not a prognostic factor in early stage NSCLC patients. It is also not predictive for adjuvant chemotherapy benefit in these patients.

Resume L’adenocarcinome est la forme histologique la plus frequente de cancer bronchopulmonaire. Les nouvelles classifications des adenocarcinomes pulmonaires proposees recemment par l’International Association for the Study of Lung cancer, l’American Thoracic Society et l’European Respiratory Society (IASLC/ETS/ERS, 2011), ainsi que l’Organisation mondiale de la sante (OMS, 2015), definissent un nombre important de types et sous-types d’adenocarcinomes qui se differencient entre autres par une prise en charge et un pronostic distincts. En tomodensitometrie, ces entites lesionnelles se traduisent par differentes presentations, generalement correlees avec les resultats histopathologiques, ce qui met l’accent sur le role primordial du radiologue dans le diagnostic et la prise en charge de ces patients. L’objectif de cette revue est d’aider les radiologues a comprendre les principes de base des dernieres classifications histopathologiques des adenocarcinomes, les correlations entre les examens d’imagerie et l’histopathologie et comment les utiliser en pratique clinique, ainsi que les correlations avec d’autres techniques d’imagerie (radiogenomique, analyse quantitative, TEP–TDM).

Introduction Les anti-PD-1 permettent un gain de survie dans les cancers bronchiques non a petites cellules (CBNPC) metastatiques. Cependant, la majorite des patients ne tire pas de benefice de ces traitements. Nous avons evalue l’interet de l’analyse a haut debit du methylome de CBNPC dans la prediction de l’efficacite des anti-PD-1. Methodes Etude multicentrique (15 centres) internationale (France, Espagne, Italie) retrospective. Criteres d’inclusion : CBNPC metastatique traite par anti-PD-1et prelevement tumoral disponible. Une cohorte decouverte (n = 34) a permis d’evaluer la correlation entre caracteristiques epigenetiques des tumeurs evaluees par methylome a haut debit (Illumina 850 K array beadchip) et efficacite des anti-PD-1. Une signature epigenetique (EPIMMUNE) predictive de l’efficacite des anti-PD-1 a ete elaboree et confirmee dans une cohorte de validation (n = 47). Nous avons isole un site specifique de methylation associe au benefice clinique et confirme son interet predictif par une technique de pyrosequencage dans une troisieme cohorte independante (n = 61). La methode de Kaplan–Meier a ete utilisee pour estimer la survie sans progression (SSP) et la survie globale (SG), le test de log-rank pour comparer les groupes de patients. Un modele de COX multivarie a ete construit pour identifier les variables independamment associees avec la SSP et la SG. Resultats La signature EPIMMUNE+ etait associee a une SSP allongee (HR 0,010, IC95 % 3,29 × 10–0,0282 ; p = 0,0067) et une SG allongee (HR 0,080, IC95 % 0,017–0,373 ; p = 0,0012) avec les anti-PD-1 dans la cohorte decouverte ( Fig. 1 ). Ces resultats etaient confirmes en SSP dans la cohorte validation. EPIMMUNE+ n’etait pas associee a l’expression de PD-L1, a l’infiltrat CD8 ou a la charge mutationnelle. Les tumeurs EPIMMUNE–etaient enrichies en macrophages, en polynucleaires neutrophiles, en fibroblastes et en cellules endotheliales senescentes. Le status demethyle du gene FOXP1 etait associe a une SSP allongee (p = 0,0063) et une SG allongee (p = 0,0094) dans la cohorte decouverte et dans une deuxieme cohorte de validation. EPIMMUNE+ et la demethylation de FOXP1 n’avait pas de valeur pronostique dans le TCGA. Conclusion Les caracteristiques epigenetique des cellules tumorales et du microenvironnement conditionnent l’efficacite des anti-PD-1 dans les CBNPC. La demethylation de FOXP1 pourrait etre un biomarqueur predictif de l’efficacite des anti-PD1 utilisable en clinique, complementaire de PD-L1 ou de la charge mutationnelle. Etude soutenue par le FRSR.

Introduction Differents variants de fusion ont ete decrits dans les rearrangements du gene ALK au sein des cancers pulmonaires non a petites cellules (CPNPC) et influeraient sur la sensibilite cellulaire au traitement par crizotinib. Le but de cette etude etait de tester et d’ameliorer l’efficacite du sequencage massif parallele (NGS) a partir d’ARN base sur des PCR multiplexes (RNA-seq) dans la detection du rearrangement et des variants de fusion ALK par rapport a l’immunohistochimie (IHC) et l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) dans des echantillons de CPNPC. Le second objectif etait de mettre en evidence un lien entre la nature du variant de fusion ALK et la reponse au crizotinib. Methodes Cinquante-trois echantillons fixes au formol et inclus en paraffine ALK-positifs en FISH et/ou en IHC et 23 echantillons ALK-negatifs ont ete testes par RNA-seq. Dans un 2e temps, un protocole associant le RNA-seq a une PCR ancree multiplexe a ete evalue sur 10 echantillons en echec apres RNA-seq. Resultats Un resultat concluant par RNA-seq a ete obtenu dans 75 % des echantillons. Parmi les 33 cas ALK-positifs en RNA-seq, un transcrit de fusion a ete identifie parmi 27 echantillons. Comparees a l’association IHC/FISH, la sensibilite et la specificite du RNA-seq etaient respectivement de 80 et 100 %. Dans les cas ALK-positifs en IHC et en FISH, le RNA-seq a detecte un rearrangement ALK dans 100 % des cas analysables. Le RNA-seq a rendu un resultat concluant dans tous les cas equivoques et/ou borderlines en FISH et IHC. Concernant les cas discordants en IHC et FISH, le RNA-seq a ete mis en echec pour 5 des 7 echantillons. Sur les 10 echantillons consideres en echec apres RNA-seq testes, l’ajout d’une PCR ancree multiplexe dans le protocole de RNA-seq a permis de detecter 3 transcrits de fusion dont un variant CLIP1(12)-ALK(20) jamais decrit auparavant. Au sein des patients traites par crizotinib, la survie sans progression mediane etait plus allongee pour ceux presentant un variant 1 ou 2 d’EML4-ALK par rapport a ceux arborant un variant 3a/b (314 contre 192 jours, respectivement ; p = 0,1743). Conclusion Le RNA-seq est efficace pour le diagnostic des rearrangements ALK dans les CPNPC et pourrait etre integre a l’algorithme diagnostique de cette anomalie. De plus, il autorise l’identification des transcrits de fusion ALK qui pourraient constituer un marqueur pronostique chez ces patients.

Resume Les carcinomes non a petites cellules integrent d’apres la classification toujours en vigueur de l’OMS 2004 les adenocarcinomes, les carcinomes malpighiens et les carcinomes a grandes cellules, ainsi que leur lesions preneoplasiques eventuelles. Une recente proposition de nouvelle classification des adenocarcinomes par l’IASLC/ATS/ERS a permis de redefinir les entites d’adenocarcinome in situ (ex.: bronchiolo-alveolaire, dont le terme disparait) et d’adenocarcinome a invasion minime ( in situ avec 100 % de survie a 5 ans. Elle prone la disparition du terme d’adenocarcinome de sous-type mixte au profit de celui d’adenocarcinome invasif dont on doit determiner le contingent architectural majoritaire, facteur d’orientation pronostique et moleculaire, ainsi que les autres composants eventuels evalues par pourcentage degressif. Cette classification integre des recommandations sur les termes a employer pour le diagnostic des carcinomes non a petites cellules sur petits prelevements et propose un algorithme d’immunomarquages diagnostiques. De nouvelles recommandations pour la gestion de ces prelevements en vue d’analyses moleculaires ulterieures sont a integrer.

Introduction: Advances in the pathology and computed tomography (CT) of lung adenocarcinoma and bronchioloalveolar carcinoma (BAC) have demonstrated important new prognostic features that have led to changes in classification and diagnostic criteria. Methods: The literature and a set of cases were reviewed by a pathology/CT review panel of pathologists and radiologists who met during a November 2004 International Association for the Study of Lung Cancer/American Society of Clinical Oncology consensus workshop in New York. The group addressed the question of whether sufficient data exist to modify the 2004 World Health Organization (WHO) classification of adenocarcinoma and BAC to define a "minimally invasive" adenocarcinoma with BAC. The problems of diffuse and/or multicentric BAC and adenocarcinoma were evaluated. Results: The clinical concept of BAC needs to be reevaluated with careful attention to the new 2004 WHO criteria because of the major clinical implications. Existing data indicate that patients with solitary, small, peripheral BAC have a 100% 5-year survival rate. The favorable prognostic impact of the restrictive criteria for BAC is already being detected in major epidemiologic data sets such as the Surveillance Epidemiology and End-Results registry. Most lung adenocarcinomas, including those with a BAC component, are invasive and consist of a mixture of histologic patterns. Therefore, they are best classified as adenocarcinoma, mixed subtype. This applies not only to adenocarcinomas with a solitary nodule presentation but also to tumors with a diffuse/multinodular pattern. The percentage of BAC versus invasive components in lung adenocarcinomas seems to be prognostically important. However, at the present time, a consensus definition of "minimally invasive" BAC with a favorable prognosis was not recommended by the panel, so the 1999/2004 WHO criteria for BAC remain unchanged. In small biopsy specimens or cytology specimens, recognition of a BAC component is possible. However, it is not possible to exclude an invasive component. The diagnosis of BAC requires thorough histologic sampling of the tumor. Conclusion: Advances in understanding of the pathology and CT features of BAC and adenocarcinoma have led to important changes in diagnostic criteria and classification of BAC and adenocarcinoma. These criteria need to be uniformly applied by pathologists, radiologists, clinicians, and researchers. The 2004 WHO classification of adenocarcinoma is readily applicable to research studies, but attention needs to be placed on the relative proportion of the adenocarcinoma subtypes. Other recently recognized prognostic features such as size of scar, size of invasive component, or pattern of invasion also seem to be important. More work is needed to determine the most important prognostic pathologic features in lung adenocarcinoma.

Introduction La Haute Autorite de sante (HAS), conjointement a l’avis rendu lors de l’inscription du gefitinib (IRESSA®) au remboursement le 04 novembre 2009, a demande la mise en place d’une etude observationnelle destinee a decrire la population de patients (pts) traites par gefitinib en France et l’impact du traitement sur la morbi-mortalite ( Fig. 1 ). Methodes Etaient eligibles les pts atteints d’un cancer bronchique non a petites cellules (CBNPC) de stades avances, de tous types histologiques, mutes pour l’EGFR ayant debute entre janvier 2011 et mars 2013 un traitement par gefitinib quelle que soit la ligne de traitement. A partir de janvier 2012 ont ete inclus des pts traites par gefitinib soit avant leur entree dans l’etude (pts « prevalents »), soit a l’inclusion dans l’etude (pts « incidents »). Les donnees d’efficacite, de tolerance et de qualite de vie ont ete collectees sur une periode de suivi de 2 ans. Les evaluations tumorales etaient realisees en routine par les investigateurs selon les criteres RECIST 1.1. Resultats Un total de 361 pts ont ete recrutes par 104 centres jusqu’en mars 2013, dont 116 (32 %) pts « incidents ». Les pts etaient majoritairement des femmes (72,6 %), de type caucasien (93,6 %) et d’âge moyen de 69,1 ans (± 11,7). L’anciennete du diagnostic etait en moyenne de 7,2 mois (± 18,6). Au total, 96,3 % des pts avaient un adenocarcinome et 85,9 % une maladie de stade IIIb/IV au diagnostic initial. La recherche de mutation de l’EGFR a ete realisee pour 98,3 % des pts. La duree mediane de suivi etait de 20,8 mois. Le gefitinib a ete prescrit principalement en 1re ligne de traitement (80,3 %). Les evenements indesirables relies au traitement les plus frequemment reportes etaient des affections dermatologiques (24,6 %) et gastro-intestinales (19,6 %). Conclusion L’etude EPIDAURE montre que les donnees d’efficacite (TRO, SSP, SG) du gefitinib en vraie vie chez les CBNPC mutes EGFR sont similaires a celles observees dans les essais cliniques avec le meme profil de tolerance. Un TRO plus eleve et une SSP/SG prolongees chez les pts avec une deletion de l’exon 19 indiquent que les tumeurs avec ce sous-type moleculaire semblent plus sensibles aux ITKs, de maniere concordante avec les resultats observes avec l’afatinib.

On review of 115 poorly or undifferentiated lung cancers from 671 lung tumors resected over a 7-year period, we have found 38 cases of basaloid carcinoma. The cardinal histopathologic features distinguishing this tumor from other non-small cell lung cancers are a lobular growth pattern of small cells with moderately hyperchromatic nuclei, with no prominent nucleoli, and with scant cytoplasm, a high mitotic rate, and peripheral palisading. Basaloid carcinoma was present in a pure form in 19 cases and the other 19 tumors were of a mixed, but prominent, basaloid type associated with squamous cell carcinoma, large cell carcinoma, or adenocarcinoma. The immunophenotype of basaloid cancers was close to that of basal bronchial epithelial cells, with a low level of expression of low molecular weight cytokeratins. Staining for neuroendocrine markers was infrequent and inconsistent. Ultrastructural study showed an absence of neurosecretory granules and the presence of some squamous and/or glandular differentiation. This morphologic and immunologic phenotype suggests that basaloid carcinoma is derived from a pluripotent reserve cell or a basal bronchial epithelial stem cell. This unique histologic form of lung tumor has a poor prognosis, with a median survival rate of 22 months for stage I and II disease. This justifies classification of basaloid carcinoma as a distinct form of lung cancer, separate from small cell lung carcinoma.

Introduction : L’essai IFCT 0002 a compare chez des patients avec CBNPC de stade I et II, deux doublets de chimiotherapie et deux schemas d’administration, soit tout neo-adjuvant (2 cures, et si reponse 4 avant chirurgie), soit peri-operatoire (2 cures pre-operatoires et 2 cures post-operatoires en cas de reponse a deux cures). Une etude de marqueurs moleculaires pronostiques constituait l’objectif secondaire de l’etude. Methodes : 528 patients ont ete inclus entre 2001 a 2005. 490 patients n’etaient pas en reponse complete histologique. 40 centres ont pu organiser une congelation de 208 (42 %) tumeurs a – 80 °C. Une collecte de 461 (94 %) blocs paraffine a ete possible. L’extraction centralisee de l’ADN tumoral a permis l’analyse des mutations K-Ras, EFGR, p53, des methylations de RASSF- 1A, DAP-K, APC, p16, des desequilibres alleliques 3p, 5p, 9p, 17p. Les coupes en paraffine ont permis l’etude immunohistochimiques de marqueurs de resistance aux sels de platine (ERCC1), aux taxanes (beta-tubuline 3), ou d’angiogenese (EPO, EPOR, HIF1α). Les analyses multivariees ont inclus une correction de Bonferroni pour comparaisons multiples. Resultats : Les mutations de K-Ras (19,9 %) sont les seules a predire la non-reponse a la chimiotherapie (RR = 1,46 ; p = 0,0022 en multivariee). Elles n’ont par contre pas d’influence pronostique. Les resultats des marquages IHC ERCC1 et beta-tubuline 3 seront presentes lors des J2R. La methylation du gene pro-apoptotique RASSF-1A (dans 21,8 % des cas) predit une survie sans progression plus courte (mediane de 16,7 mois contre 64,1 mois aux patients avec RASSF-1 sauvage, p = 0,0071). La survie globale des patients avec RASSF-1A methyle est plus courte (mediane de 33 mois contre plus de 75 mois) que celle des patients sans methylation (HR ajuste = 2,09, p = 0,020). Chez les patients avec methylation de RASSF- 1A la survie est plus longue pour les patients traites par paclitaxel + carboplatine (HR = 0,47, p = 0,042) versus gemcitabine-cisplatine, alors que, chez les patients avec RASSF-1A sauvage, il n’y a pas de difference entre les deux bras de chimio (test d’interaction : p = 0,032) Conclusion : Il s’agit de la premiere etude moleculaire prospective de CBNPC traites par chimio neoadjuvante. Un « banking » a ete possible a l’echelle nationale. Une chimioresistance et/ou un pronostic defavorable peuvent etre anticipes par certains marqueurs : la methylation de RASSF-1A permet non seulement de caracteriser un sous-groupe de patients pour lesquels la chimiotherapie peri-operatoire est manifestement inefficace, mais aussi de predire l’efficacite d’une chimiotherapie, stabilisant le reseau de tubuline avec lequel cette proteine interagit.

Introduction : Durant la derniere decennie, des cellules tumorales capables de s’auto-renouveler indefiniment ont ete qualifiees de cellules souches cancereuses (CSC). Des etudes ont montre que la reparation des lesions epitheliales pulmonaires est induite par une sous-population de cellules progenitrices multipotentes. Apres une (des) mutation(s) initiale(s), ces cellules pourraient etre a l’origine des CSC et donc agir comme des precurseurs dans l’initiation de la tumorigenese. En effet, des etudes faites sur des modeles murins suggerent fortement que certains adenocarcinomes proviennent de cellules souches au niveau de la jonction bronchiolo-alveolaire. Leur presence pourrait avoir un impact en therapie puisque les cellules souches sont chimio-resistantes. Grâce a nos modeles murins du carcinome bronchique a petites cellules (CBPC) humain, nous mettons en place des methodes ou identifier et caracteriser les cellules progenitrices impliquees dans l’initiation et la progression de ce cancer. Methodes : Dans nos modeles de souris, les genes suppresseurs de tumeurs, Trp53 et Rb, peuvent etre inactives de facon somatique et conditionnelle grâce au systeme Cre/lox, par intubation intratracheale d’un adenoCrevirus. Les tumeurs pulmonaires developpees chez ces souris sont fortement similaires au CBPC humain. Les poumons entiers sont digeres de facon enzymatique pour obtenir des cellules epitheliales pulmonaires qui sont ensuite triees (FACSAria). Nous basons le tri cellulaire sur l’expression de marqueurs de surface : les cellules Sca1+, CD34+, Pecam- et CD45- sont isolees et mises en culture. Resultats : Les premiers tris cellulaires ont montre que les cellules Sca1+, CD34+, Pecam- et CD45- representent moins de 0,5 % de la population epitheliale totale et qu’elles sont capables de former des spheres en culture. Des souris Rb -/- ; Trp53 -/- ont ete infectees et elles developpent des lesions neuroendocrines hyperplasiques precoces dans lesquelles nous verifierons la presence de cellules progenitrices. Ceci constituerait une premiere preuve de la presence de cellules souches capables de s’auto-renouveler dans les lesions cancereuses precoces. Conclusions : A l’aide de nos modeles de souris, nous devrions pouvoir detecter les CSC et elucider leur role dans le cancer du poumon. De plus, nos resultats pourront etre valides sur des echantillons de CBPC humain et ils seront, par consequent, tres utiles en clinique.

Introduction : E2F1 est un facteur de transcription qui joue un role cle dans la progression du cycle cellulaire mais aussi dans l’apoptose. Nous avons decrit la deregulation de son expression dans les cancers du poumon suggerant un role important de cette proteine lors de la carcinogenese bronchique. L’acetylation est une modification epigenetique reversible des residus lysines des proteines, qui emerge comme un nouveau systeme de signalisation controlant la croissance cellulaire. Nous avons recemment mis en evidence le role cle de l’histone acetyltransferase (HAT) Tip60 dans la reponse aux dommages de l’ADN induite par les carcinogenes du tabac [1] . Il est connu que E2F1 est implique dans la reponse aux dommages de l’ADN et que son activite biologique est regulee par acetylation. Ces donnees nous ont conduits a emettre l’hypothese que E2F1 pourrait etre une cible de Tip60. Methodes : L’acetylation de E2F1 a ete analysee in vitro par un test HAT utilisant des proteines recombinantes et de l’Acetyl-CoA radiomarque, et in vivo par immunoprecipitation et immunodetection avec un anticorps anti-lysine acetylee. L’interaction entre E2F1 et Tip60 a ete etudiee in vitro par GST pull down et in vivo par co-immunoprecipitation sur des cellules co-transfectees. L’activite transcriptionnelle de E2F1 a ete analysee dans des experiences de co-transfection a l’aide d’un vecteur reporteur codant pour le gene de la luciferase sous le controle du promoteur de la Cycline E. Resultats : Nous montrons l’interaction entre Tip60 et E2F1in vivo et mettons en evidence par des techniques in vitro que cette liaison est directe et implique les acides amines 191 a 284 de E2F1 comprenant notamment son domaine de dimerisation avec son co- facteur DP1. Nous montrons aussi que la proteine E2F1 est acetylee par Tip60 in vitro et in vivo. Nos resultats in vitro indiquent que cette acetylation s’effectue au niveau des lysines 120 et 125 jouxtant son domaine de liaison a l’ADN. De facon interessante, nous demontrons egalement la capacite de Tip60 a inhiber l’activite transcriptionnelle de E2F1. Conclusions : Ces resultats dentifient E2F1 comme une nouvelle cible directe de Tip60 et suggerent que la regulation des fonctions de E2F1 par Tip60 pourrait contribuer a l’activation des voies de reponse aux dommages de l’ADN induite par les carcinogenes du tabac.

Introduction : L’Epidermal growth factor receptor (EGFR) joue un role important dans la croissance des cancers du poumon non a petites cellules. Les inhibiteurs de tyrosine kinase de l’EGFR (EGFR-TKI) font partie des therapies ciblees emergentes dans les CPNPC, mais sont efficaces seulement pour certains sous-groupes de patients, en particulier ceux de sexe feminin, d’origine asiatique, non-fumeur, avec des mutations somatiques de l’EGFR, ou un adenocarcinome de type bronchioloalveolaire. L’expression de l’IGF1R a ete recemment decrite comme predictive de la resistance aux EGFR-TKI dans les CPNPC. Methodes : Nous etudions par immunohistochimie sur la plateforme de « Detection moleculaire in situ» (CHU de Grenoble) les voies de survie mises en jeu par l’EGFR et l’IGF1R dans des adenocarcinomes (ADC) provenant du Centre de Ressources Biologiques (CRB) de Grenoble et dans des ADC avec une composante bronchioloalveolaire (ADC-BAC) de patients traites par gefitinib (protocole IFCT0401-Bio). Resultats : Nos resultats reliminaires indiquent, une surexpression de l’amphireguline, ligand de l’EGFR, dans les ADC non-BAC mais pas dans les ADC-BAC (p Conclusions : Cette etude devrait nous permettre de clarifier l’ambivalence entre les voies de l’EGFR et de l’IGF1R dans la reponse au traitement des ADC bronchiques. Nous esperons ainsi determiner les voies de resistance aux EGFR-TKI developpees par les tumeurs et definir des marqueurs potentiels permettant d’identifier les patients susceptibles d’avoir une reponse, une stabilisation ou une progression de la maladie sous gefitinib. Ce travail est supporte par la Ligue contre le cancer, comite de la Drome et l’INCa.

Introduction : L’incidence du cancer du poumon augmente de maniere exponentielle avec l’âge. Parallelement, les cellules senescentes s’accumulent dans les tissus au cours du vieillissement. Ces cellules secretent de nombreux facteurs qui modifient le microenvironnement et favorisent le developpement tumoral. Par consequent, la senescence cellulaire pourrait faire le lien entre cancer et vieillissement. Dans ce contexte, notre etude vise a identifier et caracteriser de nouveaux facteurs secretes par les cellules senescentes pouvant jouer un role dans la tumorigenese. Methodes et resultats : Par microarrays dans des fibroblastes pulmonaires, nous avons identifie le gene codant pour la proteine WNT16B WNT16B appartient a une famille de proteines secretees (les WNT) impliquees dans de nombreux cancers. Par PCR temps reel et western blot nous avons confirme la surexpression de la proteine WNT16B et valide son statut de marqueur de la senescence grâce a deux modeles de reversion de la senescence : l’inhibition de p53 et l’expression de la telomerase. L’expression de WNT16B a egalement ete testee dans trois modeles de senescence prematuree induite par un stress, pour observer que WNT16B est surexprime dans chaque experience. Afin de preciser la fonction de WNT16B au cours de la senescence, nous avons induit l’expression d’un ARN interference dans des cellules pre-senescentes. L’inhibition de WNT16B empeche l’entree en senescence des cellules. Ce resultat montre que WNT16B est necessaire pour l’entree en senescence des fibroblastes. De plus, la surexpression de WNT16B dans des fibroblastes jeunes entraine un ralentissement de la croissance cellulaire. Conclusion : Cette etude decrit la proteine WNT16B (1) comme un marqueur et (2) comme impliquee dans le processus de senescence cellulaire dans les fibroblastes pulmonaires MRC5.

Introduction The angiogenesis is an absolute requirement for tumor survival and progression. The Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF-A) is one of the most potent angiogenic factor and is upregulated in many tumors. VEGF-A exists in most tissues as multiple pro-angiogenic isoforms, termed VEGFxxx, generated by alternative splicing of a single gene product. A novel family of splice variants formed by the use of a distal splice acceptor site in the terminal exon 8 of the VEGF-A gene has been recently described. These isoforms, termed VEGFxxxb possess anti-angiogenic properties and are downregulated in tumors. To date, the cellular signaling pathways controlling this VEGF-A splicing switch remain unknown. In this study, we have investigated the potential role of the transcription factor E2F1 in the control of VEGF-A alternative splicing. Methods To analyze VEGF mRNA and protein levels, RT-PCR, RT-qPCR, ELISA assays, RNA interference and WB experiments were performed in stable inducible clones derived from H358 pulmonary adenocarcinoma cells, in which E2F1 is overexpressed upon doxycyclin addition. Results In our cells, deprived of p53 function, we provide evidence that E2F1, but not the mutant E2F1(E132) unable to bind DNA, down-regulates the VEGF promoter activity in normoxic conditions, leading to a decrease of all VEGFxxx isoforms, at both mRNA and protein levels. More importantly, we further provide evidence that E2F1 increases the level of anti-angiogenic VEGFxxxb mRNAs, as well as leads to the accumulation of the VEGF165b protein isoform. These data indicate that E2F1 selectively enhances the inclusion of VEGF-A alternative exon 8b. We recently identified the splicing factor SC35, a member of the Ser-Rich Arg (SR) proteins family that play a key role in constitutive and alternative splicing events, as a new direct transcriptional target of E2F1. Finally, we demonstrate that SC35 is absolutely required for upregulation of VEGFxxxb splice variants in response to E2F1, while it is dispensable for E2F1-mediated VEGF-A transcriptional repression. Conclusion These findings demonstrate that E2F1 regulates the angiogenic switch of VEGF-A, in favor of anti-angiogenic splice variants, and identify the splicing factor SC35 as a key component of this process. Such effects could have a physiological relevance during tumoral neo-angiogenesis of lung carcinoma, in which E2F1 is abnormally expressed.

Introduction p14ARF est un gene suppresseur de tumeur qui fait partie d’une voie ARF/MDM2/p53 qui exerce un controle negatif sur la croissance cellulaire. De plus, p14ARF est egalement implique dans des processus physiologiques varies independants de MDM2/p53, lui permettant d’arreter le cycle cellulaire et/ou d’induire l’apoptose. Dans ce cadre, plusieurs etudes ont recemment demontre que pl4ARF interfere de facon directe ou indirecte avec des composants de la voie de signalisation du gene suppresseur de tumeur RB pour medier son activite antiproliferative. L’objectif de ce travail etait d’investiguer l’impact fonctionnel de pl4ARF sur Rb en explorant l’existence de relations directes entre les deux proteines. Methodes Nous avons utilise un modele cellulaire humain d’adenocarcinome bronchique (H358) exprimant de facon stable et inductible par la doxycycline la proteine pl4ARF et les lignees cellulaires tumorales humaines SAOS2 (RB-/-, pl4ARF +/+) et H1299 (RB +/+, pl4ARF +/+). L’expression de la proteine RB a ete etudiee par western blottting et son acetylation par test HAT in vitro et par immunoprecipitation. Les dommages a l’ADN ont ete generes par traitement avec un agent alkylant (melphalan). Resultats Nous avons montre que l’expression exogene de pl4ARF induit l’accumulation de la proteine RB sous une forme hypoacetylee. A la recherche des mecanismes moleculaires impliques, nous avons identifie l’acetyltransferase Tip60 comme un nouveau partenaire physique de RB et avons montre que Tip60 acetyle la proteine RB sur son extremite C-terminale. De plus, nous avons mis en evidence que de facon unusuelle, l’acetylation de RB par Tip60 conduit a sa degradation par le proteasome. Par ailleurs, nous avons montre qu’en inhibant l’acetylation de RB mediee par Tip60, pl4ARF empeche sa degradation et induit son accumulation. Enfin, nous avons mis en evidence que RB s’accumule de facon dependante de pl4ARF en reponse aux dommages sur l’ADN. Conclusion Ces resultats identifient RB comme une cible directe de pl4ARF et mettent en evidence un nouveau mecanisme par lequel pl4ARF controle la voie RB pour medier son activite antiproliferative.

Introduction La proteine E2F-1 est un facteur de transcription situe a l’interface des voies de signalisation des proteines suppressi-ves de tumeur p53 et RB. E2F-1 est un facteur-cle de la transition Gl/S du cycle cellulaire et est aussi capable d’induire une apoptose p53-dependante ou independante. Nous avons decrit son expression differentielle dans les tumeurs pulmonaires de notre banque et notamment sa faible expression dans les carcinomes pulmonaires non a petites cellules (Eymin et coll., Oncogene 2001). Dans la mesure ou les souris knock-out pour E2F-1 developpent des adeno-carcinomes pulmonaires, et sur la base de notre observation dans les tumeurs humaines, nous avons emis l’hypothese que la perte de E2F-1 pourrait participer a la carcinogenese de ce type de tumeurs par defaut d’apoptose. Methodes Nous avons etabli au laboratoire un modele de clones stables inductibles par la doxycycline pour l’expression de E2F-1 dans la lignee d’adenocarcinome pulmonaire H358 (Systeme Tet-On, Clontech). Resultats Dans ce modele, nous avons montre qu’E2F-l induit l’apoptose par un mecanisme original impliquant une diminution de l’expression de la proteine anti-apoptotique c-FLIP courte conduisant a l’activation de la caspase-8 au niveau du DISC (Death Inducing Signaling Complex). De facon importante, nous avons aussi montre qu’E2F-l, en diminuant l’expression de c-FLIP courte, sensibilise les cellules tumorales mais aussi les cellules normales a l’apoptose induite en reponse a la stimulation des recepteurs de mort Fas et TRAIL. Finalement, nous avons observe la surexpression specifique de c-FLIP courte dans les adenocarcinomes pulmonaires de notre banque de tumeurs qui expriment un faible niveau d’expression de E2F-1. Conclusions Nos resultats identifient donc E2F-1 comme un determinant critique de la sensibilite des cellules tumorales a l’apoptose mediee par la voie des recepteurs de mort et suggerent que la faible expression de E2F-1 detectee dans les carcinomes pulmonaires non a petites cellules pourrait contribuer a l’echappement des cellules tumorales a la reponse immunitaire via la surexpression de c-FLIP courte.

Introduction En reponse aux stimuli oncogeniques, la proteine suppressive de tumeur pl4 ARF stabilise p53 conduisant a un arret du cycle cellulaire et/ou l’apoptose. D’autre part, nous avons decrit la capacite de pl4 ARF a inhiber la proliferation cellulaire independamment de p53 dans differents modeles cellulaires (Eymin et coll., 2003). L’objectif de ce travail etait d’investiguer les voies de signalisation impliquees dans cet effet. Methodes Nous avons etabli au laboratoire un modele de clones stables inductibles par la doxycycline pour l’expression de pl4 ARF dans les cellules H358 deficientes en p53 et derivees d’un adenocar-cinome pulmonaire (Systeme Tet-On, Clontech). Dans ce modele, la surexpression de pi4 ARF induit un arret des cellules en phase G2 du cycle cellulaire precedant une apoptose. Resultats Nous avons montre que pl4 ARF previent la croissance cellulaire en activant la voie des kinases ATM/ATR/CHK jusqu’alors impliquees dans la reponse aux dommages de l’ADN, et ce par un mecanisme original necessitant le recrutement de l’histone acetyl-transferase Tip60. Ces resultats suggerent un modele selon lequel pl4 ARF et Tip60 pourraient induire un remodelage de la chromatine qui contribuerait a l’activation de ces voies. De facon importante, nous avons aussi montre que pl4 ARF s’accumule en reponse aux agents alkylants et aux carcinogenes du tabac. Dans ce contexte, pl4 ARF mais aussi Tip60 sont indispensables a l’activation des kinases ATM et CHK2. Finalement, et en accord avec un role actif de pl4 ARF dans cette reponse au stress, nous avons trouve une correlation directe tres significative (p ARF et celle de la forme active phosphorylee de CHK2 dans les tumeurs pulmonaires. Conclusions Ces resultats identifient donc pl4 ARF et Tip60 comme 2 acteurs majeurs de la reponse cellulaire aux dommages de l’ADN et relocalisent pl4 ARF a l’interface des voies de reponse aux stimuli oncogeniques et genotoxiques. Ils pourraient expliquer la perte frequente de pl4 ARF dans les tumeurs neuroendocrines de haut grade (Gazzeri et coll., 1998) car cette inactivation pourrait participer a l’echappement des cellules tumorales aux points de controle actives en reponse notamment aux carcinogenes du tabac.