Search

Arthrose (OA) ist eine bis heute nicht vollständig verstandene degenerative Gelenkerkrankung, die das gesamte Gelenk, also den Gelenkknorpel und die umgebenden Strukturen und Gewebe betrifft und für die aufgrund des fehlenden Verständnisses nur unzureichende therapeutische Optionen zur Verfügung stehen. Insbesondere biologische Therapien zur Prävention sowie zur kausalen Therapie stehen momentan noch nicht zur Verfügung. Nach (Kompressions-)Trauma kommt es im Knorpelgewebe zu einem signifikanten Zelltod durch Apoptose und Nekrose, wobei direkt nach dem Trauma Nekrose dominiert und im Verlauf die Apoptose überwiegt. Außerdem kommt es zum Verlust an Matrixbestandteilen, insbesondere sulfatierten Glykosaminoglykanen, Aggrecan sowie Kollagen Typ II. Dieser Verlust der Makromoleküle geht mit der Apoptose einher. Zelltod scheint ein relevanter Faktor der OA- Entstehung sowie der OA-Progression zu sein. FGF-2 (auch basic FGF genannt) wird endogen im Knorpelgewebe hergestellt und bindet an Perlecan, ein PG und Bestandteil der ECM, das das gebundene FGF-2 bei Belastung freisetzt. Neben der Regulation der Apoptose durch FGF-2 kommt es durch die Bindung und Aktivierung von FGF-2 an den FGFR1 über den Ras- und den PKCδ-Signalweg zu katabolen Prozessen im humanen Gelenkknorpel, wie vermehrte Produktion Matrix-abbauender Enzyme, Hemmung der Ansammlung von Matrixproteinen sowie der Proteoglykansynthese sowie Clusterbildung der Chondrozyten. CCN2 ist über die Bindung des CT-Module von CCN2 an FGF-2 in der Lage, die Aktivierung von FGFR-1 zu hemmen, was zu einer verminderten Phosphorylierung und Aktivierung des Ras-Raf-MAPK-Signalweg mit den MAPK ERK, JNK und p38 führt und in der Folge zu einer verminderten Phosphorylierung und Aktivierung von MMP-13. Zusätzlich wird die Proliferation der Chondrozyten durch Hemmung des FGFR-1 gehemmt. Folglich scheint das CT-module ein Regulator der FGF-2- und damit der Knorpelhomöostase zu sein. Demzufolge sollte es durch die Hemmung der Aktivierung des FGFR-1 über die Hemmung der MAP-Kinasen sowie des PKCδ-Signalweges zu einer Reduktion der Apoptose, verminderten Clusterbildung der Chondrozyten sowie über die Hemmung von MMP-13, ADAMTS-5 und vermehrten Expression von Aggrecan zu einer verminderten Degradierung des Knorpelgewebes kommen. In der vorliegenden Arbeit konnte ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der posttraumatischen Inkubation mit CCN2 und der Reduktion des Anteils toter Zellen nachgewiesen werden. Inkubiert man Knorpel-Discs der Superficial Zone (SZ) nach einem Kompressionstrauma mit CCN2, führt dies in den untersuchten Zeiträumen zu einer signifikanten Reduktion des Anteils toter Zellen. Die Ergebnisse legen einen direkten Zusammenhang zwischen dem Einfluss des CCN2 auf die oben beschriebenen Signalwege und der Reduktion des Anteils toter Zellen nahe. Weitere Untersuchungen bezüglich der Art des Zelltodes (Nekrose versus Apoptose) sowie RT-PCR- und Western-Blot- Untersuchungen sind notwendig, um den Einfluss auf die Signalwege durch CCN2 zu beweisen. Beim posttraumatischen Verlust an Matrixproteinen konnte nur eine Tendenz, aber kein signifikanter Zusammenhang nachgewiesen werden. Hier sind weitere Experimente, eventuell mit höherer Kompressionsbelastung, notwendig, um diesen Sachverhalt weiter zu untersuchen. Mit der vorliegenden Arbeit konnten wir einen Beitrag zum besseren Verständnis der Pathophysiologie der OA und der resultierenden Gewebezerstörung leisten und einen Grundstein für weiterführende Forschung und möglicher Therapieansätze legen. Wir konzentrierten uns in der vorliegenden Arbeit auf humanen Kniegelenksknorpel, genauer auf die weiche SZ möglichst gesunden Knorpels der distalen Femurkondylen nach Kniegelenks-Totalendoprothesen, da diese Schicht vulnerabel für Kompressionstrauma und früh im Krankheitsverlauf der OA betroffen ist.

Trotz vieler medizinischer Fortschritte ist das Pankreaskarzinom weiterhin eine Erkrankung mit einer infausten Prognose. Die 5-Jahres-Überlebensrate beträgt lediglich 5-7%. Grund dafür ist vor allem die Resistenz gegenüber Chemotherapie-vermittelter Apoptose. Diese Resistenz wird unter anderem durch die Überexpression anti-apoptotischer Proteine wie Bcl-2, Bcl-xl und Mcl-1 bedingt. TRAIL ist in der Lage, selektiv in Tumorzellen Apoptose zu induzieren. Jedoch sind viele primäre Krebszellarten resistent gegenüber TRAIL. In jüngerer Zeit wurden BH3-Mimetics entwickelt. Diese Substanzen können selektiv anti-apoptotische Proteine inhibieren und eignen sich somit potenziell als TRAIL-sensitivierende Substanzen. Im Rahmen dieser Dissertation wurde erstens analysiert, ob die Expressionsprofile der drei anti-apoptotischen Proteine Bcl-2, Bcl-xl und Mcl-1 im Tumorgewebe von Patienten eine prognostische Relevanz haben. Zweitens wurde getestet, ob eine Kombinationsbehandlung von TRAIL und BH3-Mimetics die Apoptoseresistenz von Pankreaskarzinomzellen überwinden kann. Drittens wurde untersucht, welche funktionelle Rolle die einzelnen anti-apoptotischen Proteine für die Apoptoseresistenz spielen. Es wurden die BH3-Mimetics Navitoclax, Venetoclax und S63845 verwendet. Zuerst wurden diese als Monotherapie in verschiedenen Pankreaskarzinomzelllinien getestet. Danach erfolgten Kombinationsversuche mit TRAIL. Anschließend wurden Überexpressionsversuche sowie Knock-down-Versuche mittels siRNA durchgeführt. Zusammenfassend zeigte sich, dass die Expressionsprofile keine prognostische Relevanz hatten. Die Kombinationsbehandlung von TRAIL und BH3-Mimetics zeigte jedoch einen stärkeren Effekt als die jeweilige Monotherapie und insbesondere Mcl-1 scheint eine entscheidende Rolle für die Apoptoseresistenz zu spielen.

Centrifugation steps are regularly used for neutrophil isolation. Thereby, the influences of applied g-forces on the functionality of PMNs have hardly been analyzed and could consequently have been overlooked or led to biased results. We now hypothesize that blood PMNs—when gently isolated—can be long-lived cells and they physiologically become apoptotic rather than NETotic. Neutrophils were isolated from whole blood without centrifugation using a sedimentation enhancer (gelafundin). PMNs were analyzed via live-cell imaging for migratory activity and vitality condition by fluorescent staining. Native neutrophils showed still relevant migratory activity after more than 6 days ex vivo. The percentage of cells that were annexin V+ or PI+ increased successively with increasing ex vivo time. In addition, the characteristics of DAPI staining of gently isolated granulocytes differed markedly from those obtained by density gradient separation (DGS). We conclude that NETosis occurring after DGS is the consequence of applied g-forces and not a physiological phenomenon. Future studies on neutrophils should be performed with most native cells (applied g-time load as low as possible).

Das Epithel der Darmmukosa wird durch eine einzelne Schicht von Enterozyten gebildet, die apikal durch die Tight Junction (TJ) miteinander verbunden sind. Diverse Studien zeigen, dass eine Störung der TJ-Integrität sowie ein vermehrtes Auftreten von Epithelzellapoptosen zu einer Barrierestörung führen, die durch einen verminderten transepithelialen Widerstand und eine erhöhte Molekülpermeabilität gekennzeichnet ist. Dieses lässt sich bei verschiedensten intestinalen und systemischen Erkrankungen, die mit einer intestinalen Barrierestörung einhergehen, beobachten. Aus der Barrieredysfunktion resultieren ein verstärkter Verlust von Ionen und Wasser (Diarrhö) und eine gesteigerte Translokation von Allergenen, Antigenen und anderen Noxen, die wiederum eine Immunaktivierung und Entzündungsreaktion triggern können. Insbesondere die Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine, wie zum Beispiel TNFalpha oder IL-13, hat eine Verstärkung des Barrieredefekts zur Folge, da diese ebenfalls modulatorisch auf die TJ wirken und Epithelzellapoptosen induzieren können. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entschlüsselung und Charakterisierung von Pathomechanismen der Barrierestörung einerseits und mit protektiven Mechanismen, die die Barrierefunktion schützen und stärken können andererseits. Die Identifizierung und molekulare Erforschung solcher Mechanismen bildet die Basis, auf der potenziell die Entwicklung neuer, effektiver therapeutischer oder präventiver Interventionen zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer Barrierestörung verknüpft sind, erfolgen kann. Im ersten Teil werden Pathomechanismen der bakteriell induzierten Barrierestörung analysiert. Untersuchungen in einem murinen Infektionsmodell charakterisieren erstmalig einen Pathomechanismus des Durchfallerregers Yersinia enterocolitica im Kolon. Das Bakterium verursacht hier eine Barrierestörung, die auf einer Expressionsminderung der TJ-Proteine Claudin-8, Occludin und Tricellulin und einer fokalen Umverteilung von Claudin-5 und Occludin aus der TJ basiert. Auch für Klebsiella oxytoca, den Erreger der Antibiotika-assoziierten-hämorrhagischen Kolitis, kann im Zell- und Mausmodell eine verminderte Expression und Umverteilung von Claudin-5 und -8 sowie eine Apoptose-abhängige Expressionsminderung von Claudin-1 nachgewiesen werden. Dieser neu identifizierte Pathomechanismus trägt, zusammen mit der bereits bekannten Induktion von Epithelzellapoptosen zur Barrierestörung und Diarrhöentstehung bei. Dem gegenüber steht im zweiten Teil die Analyse protektiver Mechanismen an der epithelialen Barriere durch das Probiotikum Escherichia coli Nissle (EcN), dem Milchprotein Lactoferrin und den Punicallagin-Metaboliten Ellagsäure und Urolithin A. Die Untersuchungen identifizieren das von EcN in den Kulturüberstand sezernierte Protein TcpC, das über die Aktivierung der Signalkinasen PKCzeta und ERK1/2 eine Expressionszunahme des abdichtenden Claudin-14 stimuliert und somit die Barriere stärkt. Lactoferrin zeigt sich einerseits wirksam gegenüber der durch Yersinia enterocolitica hervorgerufenen Barrierestörung, wobei es die durch den Erreger stimulierte Phosphorylierung der JNK hemmt und somit die Expressionsminderung des abdichtenden Caudin-8 verhindert. Andererseits hemmt Lactoferrin durch das proinflammatorische Zytokin TNFalpha induzierte Epithelzellapoptosen. Urolithin A inhibiert hingegen die durch TNFalpha stimulierte Expressionsregulation und Umverteilung der Claudine 1 und 2, wohingegen Ellagsäure die Barrierefunktion per se über eine MLCK-abhängige Expressionsregulation von Claudin-4, -7 und -15 stabilisiert. Zusammenfassend zeigen die Untersuchungen, dass die epitheliale TJ sowie die Regulation von Epithelzellapoptosen zentrale Angriffspunkte sowohl für Barrierestörung als auch für Bar-rierestabilisierung und/ oder -protektion darstellen. Das Ausmaß und die Spezifität der Ex-pressionsregulation und Lokalisation distinkter TJ-Proteine bzw. das Ausmaß der Apoptoseregulation ist, in Abhängigkeit des jeweiligen Stimulus, verschieden und wird darüber hinaus durch dessen Bioverfügbarkeit und/oder den Wirkungsort mitbestimmt.

Humane endogene Retroviren (HERVs) wurden während der Evolution durch Infektionen mit exogenen Retroviren in unser Genom integriert. Eine Vielzahl dieser Elemente wird epigenetisch reprimiert, sodass sie in den meisten regulären Zellen nicht oder nur in geringem Maße nachgewiesen werden können. In dem Kontext der Karzinogenese sind jedoch viele dieser HERV-Elemente sehr gut detektierbar. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf der Aktivierung von HERV-env-Proteinen in chemotherapie-refraktären Mammakarzinommodellen. Dabei wurde der potenzielle Einfluss von HDAC-Inhibitoren auf die Überexpression bestimmter HERV-Transkripte untersucht. Die synergistische Interaktion von HDAC-Inhibitoren mit TLR 7-Agonisten zeigte eine HERV-Überexpression und es löste eine intrinsische Apoptose in den Karzinomzellen aus. Es wurde somit eine Variante der "Shock and Kill"-Therapie, die aus der HIV-Eradikation bekannt ist, auf die Therapie von Mammakarzinomen übertragen.

Diese Bachelorarbeit beschäftigt sich mit den Auswirkungen der chemischen Substanz Bisphenol A auf die ovarielle Karzinomzelllinie NIH-OVCAR-3. Dieses endokrin aktives Monomer begegnet dem Menschen z.B. als Bestandteil von Innenbeschichtungen von Essensverpackungen und Trinkflaschen ständig im alltäglichen Leben und ist daher von großem Forschungsinteresse. Zu diesem Zweck wurden die Zellen mit den BPA Konzentrationen 1 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 250 μM und 500 μM über einen Zeitraum von 72 Stunden stimuliert. Mithilfe einer FACS Analyse wurden die Auswirkungen der verschiedenen Konzentrationsstufen auf die Vitalitätsrate der Zellen untersucht. Durch eine qPCR wurde die Expression von Genen, welche große Bedeutung bei der Zellentwicklung, Stress- und Apoptose Regulierung besitzen, bei zuvor stimulierten Zellen analysiert. Dabei wurden die Expression der Gene KI-67, HIF1-α, LH/HCG, TNFα, BCL-2, BAX, Fas beobachtet. Die Resultate der FACS Analyse zeigen einen starken Zusammenhang der BPA Konzentrationen mit dem Vitalitätsstatus der Zellen. Mit steigender BPA Konzentration steht der Anteil indirekt proportional zum prozentuellen Anteil der lebenden Zellen, wohingegen die früh apoptotischen und nekrotischen Zellen mit steigender Konzentration zunehmen. Diese Beobachtung wurde mithilfe einer ANOVA bestätigt. Bei dieser konnte ein signifikanter Unterschied der prozentuellen Anteile der lebenden Zellen ab der Konzentrationsstufe 100 μM im Vergleich zu den Kontrollzellen gefunden werden. Die Bisphenol A Konzentration hat daher einen direkten Einfluss auf die Überlebensrate der NIH-OVCAR-3 Zellen. Die Resultate der qPCR zeigen eine signifikante Zunahme der Genexpression von mit höheren BPA Konzentrationen stimulierten Zellen bei den Genen Fas und TNFα. So deutet die vermehrte Expression bei mit Bisphenol A stimulierten Zellen auf den Weg der Apoptose über die beiden Todesrezeptoren hin. This bachelor thesis deals with the effects of the chemical substance bisphenol A on the ovarian carcinoma cell line NIH-OVCAR-3. This endocrine active monomer is constantly encountered by humans in everyday life e.g., as a component of inner coatings of food packaging and drinking bottles and is therefore of great research interest. For this purpose, cells were stimulated with BPA concentrations of 1 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 250 μM and 500 μM over a period of 72 hours. FACS analysis was used to examine the effects of the different concentration levels on the viability rate of the cells. By qPCR, the expression of genes involved in cell development, stress and apoptosis regulation was analyzed in previously stimulated cells. The expression of KI-67, HIF1-α, LH/HCG, TNFα, BCL-2, BAX, Fas genes was observed. The results of FACS analysis showed a strong correlation of BPA concentrations with cell viability status. As the BPA concentration increases the number of alive cells lowers, whereas the populations early apoptotic and necrotic grow with higher concentrations. This observation was confirmed by an ANOVA. In this, a significant difference in the percentages of live cells could be found starting at the 100 μM concentration level compared to the control cells. Therefore, the bisphenol A concentration has a direct influence on the survival rate of the NIH-OVCAR-3 cells. The qPCR results show a significant increase in gene expression of cells stimulated with higher BPA concentrations in Fas and TNFα. Thus, increased expression in cells stimulated with bisphenol A suggests the pathway of apoptosis via these two death receptors.

Adenosin ist ein Signalmolekül, welches einerseits das Tumorwachstum durch die Hemmung der Funktion der Immunzellen und andererseits die Tumorentstehung über eine direkte Aktivierung von Adenosinrezeptoren auf Tumorzellen beeinflussen kann. Adenosin moduliert diese onkogenen Prozesse besonders in Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs. Um diese Prozesse genauer zu verstehen, soll die Rolle der Aktivität des Adenosinrezeptors A2B (ADORA2B) auf HNSCC-Zelllinien und deren tumorigener Eigenschaften genauer untersucht werden. Hierfür wird der Rezeptor durch den inversen Agonisten PSB-603 inhibiert. Dies führt in vitro zu einer Hemmung der Zellproliferation im Sinne eines Zellzyklusarrestes und einer Induktion der Apoptose. In in-vivo-Xenotransplantationsexperimenten führt die Inhibierung der ADORA2B-Aktivität zu einer Abnahme des Wachstums sowie zu einer reduzierten Vaskularisation des Tumors. Diese Ergebnisse postulieren, dass ADORA2B als Teil des adenosinergen Systems eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs einnimmt.

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine Erkrankung des blutbildenden Knochenmarks, die verschiedene Subtypen umfasst. Acht verschiedene AML-Zelllinien wurden auf Unterschiede hinsichtlich der Sensitivität gegenüber dem Apoptoseinduktor ABT-737 (IC50: 9,9 nM - 16 μM) sowie der 18F-FDG-Aufnahme (4,1- 13,0%) analysiert. Zudem konnte durch Differenzierung mit all-trans-Retinsäure (ATRA) in den AML-Zelllinien NB-4 und AML-193 eine signifikante Zunahme der Sensitivität gegenüber ABT-737 bei gleichzeitiger Abnahme der 18FFDG Aufnahme gezeigt werden. Somit könnte die 18F-FDG-Aufnahme als prädiktiver Marker für die Sensitivität gegenüber der Behandlung mit ABT-737 herangezogen werden. Acute myeloid leukemia (AML) is a malignant disease of the bone marrow, comprising various subtypes. We investigated eight different AML cell lines that showed different sensitivities towards the inducer of apoptosis ABT-737 (9.9 nM - 16 μM) and distinct differences in 18F-FDG uptake (4.1 - 13.0%). Furthermore, differentiation of AML cell lines NB-4 and AML-193 with all-trans-retinoic-acid (ATRA) induced a significant increase in sensitivity towards ABT-737 along with a reduced uptake of 18F-FDG. Therefore, 18F-FDG uptake could be predictive on sensitivity to treatment with ABT-737.

ASPP2 is an independent haplo-insufficient tumor suppressor that initiates induction of apoptosis upon cellular stress and DNA damage. We discovered an oncogenic alternative splicing variant, truncated at its C-terminus. Even though ASPP2κ was firstly discovered in acute leukemia, the detection of ASPP2κ in solid tumors provides novel insights into the biology of cancer. Soft tissue sarcoma (STS) is still under-studied and, to this day, not curable with single chemotherapy. Similarly, colorectal carcinoma (CRC), especially in advanced metastatic stage, has only palliative treatment options. Understanding the molecular mechanisms of tumorigenesis and therapy resistance remains a critical clinical need in both entities. Also, the need for prognostic as well as predictive biomarkers to direct more effective therapies is pivotal. Using tissue from consented STS and CRC patients we detected significant increase in the expression of ASPP2κ in comparison to tumor-free areas from the same individuals. Using short hairpin RNA against ASPP2κ, we performed functional analysis, both in rhabdomyosarcoma and colorectal carcinoma ASPP2κ-silenced cell models. Silencing of ASPP2κ promoted tumor suppression, by (i) mediating chemotherapy response, (ii) attenuating cellular proliferation and (iii) decreasing the migratory potential. On the contrary, ASPP2κ overexpression in CRC cell lines, resulted into increased oncogenic potential. To elucidate the splicing mechanism of ASPP2κ, we screened exon 17 neighbor intron regions. We identified consensus regions responsible for alternative splicing, thus promoting the exon 17 skipping. For this, we designed splice switching antisense oligonucleotides to target these regions and restore the constitutive splicing of ASPP2. Die Dissertation ist gesperrt bis zum 19. Juli 2024 ! ASPP2 ist ein unabhängiger haplo-insuffizienter Tumorsuppressor, der bei zellulärem Stress und DNA-Schäden die Induktion von der Apoptose einleitet. Wir haben eine alternative onkogene Spleiß Variante von ASPP2 entdeckt, die an ihrem C-Terminus trunkiert ist. Obwohl ASPP2κ zuerst bei akuter Leukämie entdeckt wurde, bietet der Nachweis von ASPP2κ in soliden Tumoren, neue Einblicke in die Biologie von Krebs. Weichteilsarkome (STS) sind wenig erforscht, und bis zum heutigen Tag mit Chemotherapie nicht heilbar. Auch für die kolorektalen Karzinome (CRC), insbesondere in deren fortgeschrittenen metastasierten Stadien, gibt es nur palliative Behandlungsmöglichkeiten. Das Verständnis der molekularen Mechanismen der Tumorgenese und der Therapieresistenz ist bei beiden Entitäten nach wie vor ein entscheidender klinischer Bedarf. Durch die Untersuchung von Gewebe, von STS- und CRC-Patienten, konnten wir eine erhöhte Expression von ASPP2κ, im Vergleich zu tumorfreien Geweben derselben Individuen feststellen. Unter Verwendung von short-hairpin RNA gegen ASPP2κ führten wir eine funktionelle Analyse sowohl in Rhabdomyosarkom als auch in kolorektalem Karzinom Zellmodellen durch, bei denen die Expression von ASPP2κ inhibiert wurde. Das Silencing von ASPP2κ förderte die Tumorsuppression, indem es (1) die Reaktion auf Chemotherapie erhöhte, (2) die Zellproliferation hemmte und (3) das Migrationspotential verringerte. Um die Spleiß Mechanismen von ASPP2κ aufzuklären, untersuchten wir benachbarte Intron-regionen des ASPP2 Exons 17. Wir konnten Konsensregionen, die für alternatives Spleißen verantwortlich sind und somit das Skippen des 17. Exons fördern. Zu diesem Zweck entwarfen wir Splice Switching Antisense Oligonukleotide, die auf diese Regionen abzielen und das konstitutive Spleißen von ASPP2 wiederherstellen. Diese Beobachtungen bilden die Grundlage für weitere Analysen von ASPP2κ als onkogenem Treiber sowie als potenziellem prädiktiven Marker bei menschlichen Krebserkrankungen. Unsere Ergebnisse haben weitreichende Konsequenzen für künftige therapeutische Strategien für ASPP2κ- exprimierende Krebspatienten und liefern den Grundsatzbeweis für die weitere Erforschung von ASPP2κ als potenzielles Ziel für die Therapie menschlicher Malignome.

Einleitung: Das Ziel der Arbeit ist es, die Expression von PD-1 und PD-L1, sowie verwandter Immunparameter bei KKS, HIV-KS und KAS und deren Korrelation mit anderen Parametern und klinischen Daten zu vergleichen. Methode: Zur Evaluation der Expression wurden immunhistochemische Verfahren verwendet. Der Zusammenhang der Immunreaktivität von PD-1 und PD-L 1 mit den klinischen Daten wurde statistisch ausgewertet. Ergebnis: Die PD-1-Expression korrelierte signifikant mit der PD-L1-Expression. Die PD-1- und PD-L1-Expression korrelierte signifikant mit der CD56- und FoxP3-Expression. Eine hohe FoxP3-Expression war signifikant mit einem Krankheitsrezidiv assoziiert. Grundsätzlich war die PD-1- und PD-L1-Expression relativ schwach und unterschied sich nicht signifikant zwischen KKS-, HIV-KS- und KAS-Patienten. Diskussion: KAS exprimieren PD-L, es gibt keinen signifikanten Zusammenhang mit dem PFS und dem OOS. Die PD-L1-Expression könnte bei der Therapie von AS sehr nützlich sein.

In dieser Promotionsarbeit wurde untersucht, ob regionsspezifische Unterschiede in der Expression von microRNAs im Tiermodell der Wobbler-Maus existieren. Daf��r wurden Gewebeproben von gesunden und kranken Tieren zu den Zeitpunkten p0 und p40 in Kleinhirn und R��ckenmark untersucht. MicroRNA-Analysen lieferten erste Hinweise auf differenzielle Expression. Die Genexpressionslevel der vier am st��rksten divergierenden microRNAs wurden mittels qPCR validiert. Der Fokus wurde auf miR-29b gelegt und deren Wirkungsort mittels insitu-Hybridisierung ermittelt. Expressionsh��he und -ort verschiedener Mitglieder der intrinsischen apoptotischen Signalkaskade, Bmf, Bax und Caspase 3, wurden mittels qPCR, Western Blot und Immunhistochemie verglichen. In dieser Doktorarbeit konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass sowohl miR-29b als auch mehrere Mitglieder der apoptotischen Signalkaskade in Kleinhirn und R��ckenmark von Wobbler-M��usen im Vergleich zu Kontrolltieren abweichend exprimiert werden.

Die akute lymphatische Leukämie ist die häufigste Krebserkrankung bei Kindern und Jugendlichen. Die Überlebenswahrscheinlich liegt bei 90%. Dennoch: Rezidive oder schlechtes Therapieansprechen vermindern den Heilungserfolg, insbesondere beim Subtyp der T-lymphatischen Leukämie (T-ALL). Daher ist die Suche nach alternativen Therapieansätzen von großer Bedeutung. In dieser Promotionsarbeit wurde der Lysosomen-induzierte Zelltod, der durch Cathepsine vermittelt wird und die Hemmung von anti-apoptotischen BCL-2 Proteinen in vier Zelllinien der T-ALL untersucht. Ziel war es, herauszufinden, ob die Kombination beider Ansätze zu einer synergistischen Zelltodsteigerung führt. Hierzu wurde das Betulinsäurederivat B10 als Lysosomen-permeabilisierende Substanz und der BCL-2 Inhibitor ABT-263 verwendet. B10 vermittelte als Einzelsubstanz Zelltod und eine Lysosomen Permeabilisierung konnten nachgewiesen werden. Ebenso induzierte ABT-263 Apoptose, jedoch zeigten sich zwei Zelllinien resistent gegenüber dem BCL-2 Inhibitor. Die Kombinationstherapie aus B10 und ABT-263 führte nur in den als ABT-263-resistent eingestuften Zelllinien zu einer synergistischen Zelltodsteigerung. Der B10-vermittelte Zelltod war jedoch nicht abhängig von lysosomalen Cathepsinen, es konnten aber Apoptose-typische Zellveränderungen wie die Permeabilisierung der Mitochondrien und die Aktivierung von Caspasen nachgewiesen werden. Da das pro-apoptotische Protein BAX in den Zelllinien durch B10 nicht aktiviert wurde, wiesen die Ergebnisse daraufhin, dass B10 durch eine direkte Permeabilisierung von Mitochondrien Zelltod induzieren kann. Als Fazit der Arbeit kann man ziehen, dass der Cathepsin-vermittelte Zelltod in den vier untersuchten Zelllinien der T-ALL nicht nachgewiesen werden konnte. Dennoch gibt die Arbeit den Hinweis, dass Patienten, die unzureichend auf die Behandlung mit einem BCL-2 Inhibitor ansprechen, von einer Kombination mit Substanzen, die die mitochondriale Membranintegrität beeinflussen, profitieren könnten.

Die moderne biopharmazeutische Industrie beschäftigt sich mit der Herstellung von Wirkstoffen, die in Bioprozessen produziert werden. Ein breites Anwendungsgebiet haben Biopharmaka, zu denen Impfstoffe, therapeutische Proteine und biologische Moleküle gehören. Säugetierzellen bilden eine wichtige Gruppe der Wirtszellen in der Bioproduktion. Der Zellkultivierungsprozess der Säugetierzellen ist komplexer als andere Grundoperationen (Engl. unit operations), daher sind hierbei umfangreiche Prozessüberwachung und -kontrolle notwendig, um eine hohe Qualität und Sicherheit der Biopharmaka zu gewährleisten. Im Rahmen der PAT-Initiative (Engl. Process Analytical Technology) setzen sich die biopharmazeutische Industrie und die regulatorischen Behörden dafür ein, dass der Bioprozess genauer überwacht und verstanden wird. Auf Basis von Multivariate Datenanalyse (MVDA) und Sensorik mit modernen Prozessanalysetechniken, zwei PAT-Elemente, stellt die Methode der Spektroskopie zur Bioprozessüberwachung als geeignet dar. Die Arbeit behandelt die Evaluierung der MIR-, 2DF- und UV/VIS-Spektroskopie zur Überwachung eines Zellkultivierungsprozesses mit CHO-Zellen. Methoden aus der MVDA wurden stets verwendet. In erstem Teil der Arbeit wurde mit Hilfe der MIR- und 2DF- Spektroskopie fünf CPPs (Engl. critical process parameters) untersucht: Glucose-, Laktat- und Glutamin-Konzentrationen, sowie Gesamtzellzahl und Lebendzellzahl. Es konnte gezeigt werden, dass die beiden spektroskopischen Methoden parallel zu einander verschiedene Zielanalyten simultan detektieren können. In zweitem Teil der Arbeit wurde eine Methode zur gezielten Induktion von Apoptose in CHO-Zellen entwickelt. Es konnten mit der Methode Zellkulturen mit verschiedenem Anteil apoptotischer Zellen generiert werden. Die induzierte Apoptose wurde als ein neuer Prozessparameter im letzten Teil der Arbeit eingeführt. Die 2DF- und UV/VIS-Spektroskopie diente hierbei erfolgreich der Überwachung, um den Anteil apoptotischer Zellen sowie die Gesamtzellzahl im Bioreaktor zu detektieren.

Einleitung: ��berm����ige Bestrahlung mit ultraviolettem (UV) Licht f��hrt zu akuten und chronischen UV-Sch��den und ist der Hauptrisikofaktor f��r die Entstehung von Hautkrebs. Zur Pr��vention werden ��blicherweise Sonnenschutzmittel verwendet, deren Wirksamkeit ��ber die Messung der minimalen Erythemdosis (MED), basierend auf makroskopischen Ver��nderungen der Haut, bestimmt wird. Das Standardverfahren f��r eine detailliertere Analyse der UV-induzierten Hautver��nderungen ist bislang die Histologie. Eine neuere nicht-invasive Untersuchungsm��glichkeit bietet die konfokale Laserscanmikroskopie (KLM), mit der sich die Haut in vivo mit einer Aufl��sung auf zellul��rer Ebene darstellen l��sst. Ziel: Das Ziel dieser Studie ist die morphologische Darstellung standardisierter klinischer und histologischer Merkmale der akut sonnengesch��digten Haut mittels KLM sowie die Testung der Effektivit��t von Sonnenschutzmitteln auf zellul��rer Ebene. Methoden: Hierf��r wurden die Unterarme von zehn Studienteilnehmern einmalig mit UVB-Licht mit ansteigender Dosierung (96, 132, 168, 204, 240 mJ/cm2) bestrahlt. Der linke Unterarm blieb dabei ungesch��tzt, w��hrend der rechte Unterarm durch eine hochpotente Sonnencreme gesch��tzt war. Die Untersuchung mittels KLM erfolgte nach 24, 48 und 72 Stunden. Zur Validierung der Ergebnisse wurde von einem Studienteilnehmer eine Biopsie von der ungesch��tzten Haut entnommen. Ergebnisse: Die mittels KLM identifizierten morphologischen Ver��nderungen im ungesch��tzten Hautareal beinhalteten das Auftreten von Spongiose, Sunburn cells (apoptotische Zellen), Mikrovesikel und einer Vasodilatation sowie den Verlust der Honigwabenstruktur. Das Vorkommen von Sunburn cells und Mikrovesikel hing von der UVB-Dosis und von der individuellen Sensitivit��t der Studienteilnehmer ab. Im gesch��tzten Hautareal trat nur einmalig eine Spongiose auf. Die Ergebnisse wurden durch den Nachweis von Sunburn cells und Mikrovesikel in der Hautbiopsie validiert. Schlussfolgerung: Die KLM ist ein geeignetes Verfahren zur nicht invasiven Beurteilung von UV-Licht-induzierten, akuten dynamischen Ver��nderungen der Haut. ��hnlich wie bei der Histopathologie lassen sich durch die KLM akute schwere UV- Sch��den durch den Nachweis von Sunburn cells und Mikrovesikel darstellen. Die KLM k��nnte daher in Zukunft bei der Klassifikation von Sonnenbrandreaktionen und bei der Analyse der Effektivit��t von Sonnenschutzmitteln auf zellul��rer Ebene Verwendung finden., Background: Excessive ultraviolet (UV) radiation leads to acute and chronic UV damage and is the main risk factor for the development of skin cancer. Sunscreens are usually used for prevention. Their efficacy is determined by measurement of the minimal erythema dose (MED) which is based on the observation of macroscopic changes occurring to the skin. Currently, histology represents the standard procedure for more accurate morphological alterations of the skin caused by UV light. A novel non-invasive imaging approach is offered by Reflectance confocal microscopy (RCM), a tool that allows in vivo visualization of the skin at cellular-level resolution. Aim: The aim of this study is to provide a morphological representation of standardized clinical and histological features of acutely sun-damaged skin using RCM as well as analysing the efficacy of sunscreens at a cellular level. Methods: For this purpose, the forearms of ten study participants were irradiated once with gradually increasing doses of UVB light (96, 132, 168, 204, 240 mJ / cm2) using an irradiation device. The left forearm was unprotected while the right forearm was protected by a highly potent sunscreen. The RCM investigation was performed 24, 48 and 72 hours after irradiation. To validate the results a biopsy was taken from the unprotected skin of one of the study participants. Results: The morphological changes in the unprotected skin area identified by RCM encompassed appearance of spongiosis, sunburn cells (apoptotic cells), microvesicles and vasodilation as well as the disruption of honeycomb pattern. The detection of sunburn cells and microvesicles depended on the UVB dose and the individual sensitivity of the study participants. Only one time spongiosis was observed in the protected skin. The results were validated by histological detection of sunburn cells and microvesicles in the skin biopsy. Conclusion: The RCM is a suitable method for the non-invasive assessment of acute dynamic changes in the skin triggered by UV light. Similar to histopathology, RCM can identify acute severe UV damage by detecting important features like sunburn cells and microvesicles. In the future, RCM could therefore be used to classify sunburn reactions and to investigate the effectiveness of sunscreens at a cellular level.

Retinoide sind als Schlüsselmoleküle in der Karzinogenese vieler Tumore involviert und werden bereits als therapeutische Agentien eingesetzt. Durch Zellkulturversuche konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation gezeigt werden, dass die gleichzeitige Applikation von Retinolsäure (RA) und Knochenwachstumsfaktor bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) zu einer additiven Apoptoseinduktion in verschiedenen Retinoblastom (RB)-Zelllinien führt. In dieser Arbeit wurde die durch RA/BMP-4 additiv gesteigerte Apoptoseinduktion in WERI-Rb1 RB-Zellen näher charakterisiert und die zugrundeliegende Apoptose-Signalkaskade sowie involvierte Rezeptoren detailliert analysiert. Zellkulturversuche, basierend auf der intrazellulären Blockade von Caspasen sowie einer immunzytochemischen Behandlung mit einem aktivierten Caspase-3-Antikörper, zeigten, dass die additive Apoptoseinduktion durch RA und BMP-4 zu einem Großteil Caspase-abhängig über den Signalweg der intrinsischen Caspase-3 vermittelt wird. RA und BMP-4 führten zudem zu einer additiven Induktion von Apaf-1 und zu einer gesteigerten Spaltungsaktivität der Initiator-Caspase-9, was die durch RA und BMP-4 gesteigerte Proteinexpression der aktivierten Caspase-3 erklärt. Per polymerase chain reaction (PCR)-Studien konnte gezeigt werden, dass RA und BMP-4 die Rezeptorsubtypen retinoic acid receptor α (RARα), RARβ, retinoic X receptor β (RXRβ) und RXRγ sowie bone morphogenetic protein receptor II (BMPR II) auf messenger ribonucleic acid (mRNA)-Ebene induzieren. Zudem wurde durch Agonisten-Studien demonstriert, dass sowohl Retinsäure-Rezeptoren (RARs) als auch Retinoid X-Rezeptoren (RXRs) an der additiv gesteigerten Apoptose in WERI-Rb1 Zellen beteiligt sind. Zur näheren Charakterisierung der beteiligten Rezeptor-Subtypen wurden RAR-Antagonisten-Studien sowie ein RXRβ- und RXRγ-Genknockdown durchgeführt. So konnte dargelegt werden, dass die additive Apoptoseinduktion durch die Subtypen RARα, RARβ, RXRβ und RXRγ vermittelt wird. RA weist zudem die Fähigkeit auf mit cellular retinoic acid binding protein II (CRABP II), dessen Expression durch RA/BMP-4 Doppelbehandlung signifikant hochreguliert wird, zu interagieren und so die Gentranskription und die Apoptose zu verstärken. Zusammenfassend stellt die vorliegende Dissertation eine prospektive Grundlage für zukünftige Retinoid- bzw. Rexinoid-basierte Therapiestrategien für das Retinoblastom dar., Retinoids are already used and discussed as promising therapeutic agents for the treatment of various human cancers. In the present dissertation, combined application of recombinant retinoic acid (RA) and bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) resulted in an additive apoptosis induction in different retinoblastoma (RB) cell lines. In the study presented, the mechanisms behind this interaction and the involved receptors were analysed in WERI-Rb1 cells. Blocking experiments with a general caspase inhibitor showed that RA and BMP4 induced apoptosis in WERI-Rb1 cells is at least partially caspase-dependent. Immunocytochemical staining with a specific cleaved caspase-3 antibody revealed that RA and BMP4 additively mediate apoptosis via the caspase-3 pathway. Thus, RA and BMP-4 additively increased Apaf-1 mRNA levels and caspase-9 cleavage activity. PCR analyses showed that combined application of RA and BMP-4 enhances messenger ribonucleic acid (mRNA) levels of the retinoic acid receptors (RARs) RARα and RARß and the retinoic X receptor (RXR) RXRγ as well as mRNA levels of the bone morphogenetic protein receptor II (BMPR II). By performing agonist studies, it was proved that both RARs and RXRs are involved in RA/BMP-4 additively enhanced apoptosis in WERI-Rb1 cells. Using specific RAR subtype antagonists and a RXRß and RXRγ gene knockdown, it was shown that additive apoptosis induction of RA and BMP-4 in WERI-Rb1 cells requires the subtypes RARα, RARß, RXRß and RXRγ. Besides, combined RA/BMP-4 treatment significantly up-regulated cellular retinoic acid binding protein II (CRABP II) mRNA levels, indicating another mechanism of augmenting additive apoptosis induction by RA and BMP-4. In conclusion, the present dissertation provides useful starting-points for future retinoid-based therapy strategies of retinoblastoma.

Elektrisch aktive Implantate sollen bei Herzinsuffizienz-Patienten mit hochgradig eingeschr��nkter linksventrikul��rer Ejektionsfraktion den Prozess eines Reverse Remodelings induzieren. Ziel der prospektiven Kohortenstudie ist es, im Vergleich zu einer Kontrollgruppe ohne Therapieumstellung, Ver��nderungen echokardiographischer, laborchemischer und leistungsphysiologischer Parameter nach Implantation eines CRT- oder CCM-Systems aufzuzeigen. Unter einer CRT-Therapie fanden sich bereits nach 6 Monaten positive Ver��nderungen, welche ein Indiz f��r ein Reverse Remodeling sein k��nnten, bezugnehmend auf Symptomlast, Leistungsf��higkeit und Ventrikelgeometrie, begleitet von einer Abnahme des BNP, des Apoptose-Markers Galectin-3 und des Fibrose-Markers ST-2. In der CCM-Gruppe waren weniger messbare Ver��nderungen nachzuweisen. Es fanden sich Hinweise auf eine gebesserte Symptomatik und Leistungsf��higkeit, jedoch keine ausreichenden messbaren Effekte, die ein Zeichen eines Reverse Remodelings w��ren.

Hintergrund: Sauerstoff ist für den Energiestoffwechsel nahezu aller eukaryotischen Lebewesen essentiell. Sauerstoffmangel (Hypoxie) stellt somit eine für das Überleben maßgebliche Veränderung dar, die zwingend einer Anpassung bedarf. Der Hypoxia Inducible Factor (HIF) ist ein Hauptmediator in Hypoxie. Er vermittelt u. a. die Anpassung der anaeroben Glykolyserate und die pH-Regulation. Episodische Hypoxie stellt eine Sonderform dar, die durch wiederkehrende Phasen aus Hypoxie und Reoxygenierung gekennzeichnet ist und bisher vorrangig im Kontext von kardiovaskulären Erkrankungen und obstruktiver Schlafapnoe untersucht wurde. Kürzlich wurde jedoch auch gezeigt, dass die Gabe des Immunsuppressivums Cyclosporin A (CsA) in der Niere eine episodische Hypoxie auslöst. Die hierbei aktivierten Signalwege unterscheiden sich deutlich von denen einer kontinuierlichen Hypoxie. Ziel dieser Arbeit war es, die zelluläre Anpassung an episodische Hypoxie mit Fokus auf der Aktivität von HIF in einem in vitro Modell zu untersuchen. Methoden: Die in vitro Untersuchungen zur renalen episodischen Hypoxie erfolgten durch Inkubation von DCT- und HT1080-Zellen für 4 h pro Tag unter 1 % Sauerstoff über einen Zeitraum von 6 Tagen. Zum Vergleich dienten normoxische Kontrollzellen sowie eine einmalige Inkubation bei 1 % Sauerstoff für 4 h bzw. 24 h. Für die Untersuchungen zur HIF Aktivität wurden qPCRs ausgesuchter HIF Zielgene und Reportergen-Assays durchgeführt und HIF interagierende Faktoren quantifiziert. Mit Hilfe der Bisulfitkonversion erfolgten Analysen zum Methylierungsstatus hypoxieresponsiver Elemente in den Promotorregionen ausgewählter HIF Zielgene. Western Blot Analysen dienten zur Quantifizierung und subzellulären Lokalisierung von HIF-1a sowie dem Nachweis des Apoptose-Markers aktive Caspase-3. Intrazelluläre ROS Mengen wurden durch Behandlung mit 2‘7‘-Dichlorfluorescein-Diacetat-Assays bestimmt. Ergebnisse: Im Zellmodell führte episodische Hypoxie zu stark erhöhten HIF-1a Proteinmengen, wobei eine erhöhte Expression von HIF-1 Zielgenen ausblieb. Die geringe HIF Aktivität in episodischer Hypoxie korrelierte mit einer beeinträchtigten nukleären Translokation von HIF- 1a, nicht jedoch mit einer HRE-Methylierung in Promotorregionen getesteter HIF Zielgene. Die HIF Kofaktoren Ep300 und Cited-2 zeigten keine Expressionsänderung auf mRNA-Ebene. Episodische Hypoxie führte gegenüber Kurz- und Langzeithypoxie zu einem veränderten zellulären Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und schützte vor einer Staurosporin induzierten Apoptose. Schlussfolgerung: Episodische Hypoxie im Zellmodell bildet das weitgehend HIF unabhängige Transkriptom wiederholter CsA-Gaben in vivo nach. Die Hemmung der HIF Aktivität wird durch eine unzureichende nukleäre HIF-1a Translokation erzeugt. Die zelluläre Anpassung an episodische Hypoxie erfolgt demnach scheinbar HIF unabhängig. Hingegen scheint die tägliche Wiederholung von Hypoxie/Reoxygenierung eine Aktivierung zellulärer Schutzmechanismen hervorzurufen, die gegen Zellstress und Apoptose schützen, wobei moderat erhöhte ROS Mengen vermutlich als Signalgeber fungieren. Parallelen zu dem als „Präkonditionierung“ beschriebenen Phänomen müssen weiter untersucht werden., Background: During evolution, aerobic organisms developed numerous mechanisms to cope with hypoxia and ensure an adequate oxygen supply. As a key mediator of those adaptations, the hypoxia inducible factor (HIF) orchestrates a couple of processes such as a metabolic switch to anaerobic glycolysis and pH regulation. Episodic hypoxia is characterized by repetitive cycles of hypoxia and reoxygenation and has been mainly described in the context of cardiovascular diseases and obstructive sleep apnea. Recently, it has been shown that treatment with the immunosuppressant cyclosporine A (CsA) causes renal episodic hypoxia. Here we establish an in vitro model of episodic hypoxia to investigate the underlying signaling pathways, especially the HIF response. Methods: DCT- and HT1080 cells were cultured under 4 h hypoxia (1% O2) for 6 daily courses to mimic episodic hypoxia. Cells grown in normoxia or short (4 h) and long-term (24 h) hypoxia served as controls. Reporter gene assays and qPCR measurements served for quantification of the transcriptional activity of HIF-1 and to scan for alterations in HIF co-transcription factors. Western Blot analyses were conducted to quantify and reveal the subcellular localization of HIF- 1a. Bisulfite conversion was performed to investigate the methylation status of hypoxia response elements of selected HIF target genes. Active Caspase-3, as a marker of apoptosis, was detected by Western blotting and intracellular ROS levels were detected in a 2’7’-dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) assay. Results: In vitro, episodic hypoxia exhibited elevated HIF-1aprotein levels. However, transcriptional activity of HIF-1 was inhibited, which has been associated with impaired nuclear translocation of the HIF-1a subunit. In contrast, no alteration in HRE methylation of promoter regions of HIF target genes was found. Furthermore, no alteration was found in the expression level of HIF co-transcription factors Ep300 or Cited-2 at mRNA level. Following episodic hypoxia, cellular ROS levels were different compared to short- and long-term hypoxia and were associated with increased resistance to staurosporine-induced apoptosis. Conclusion: In vitro, episodic hypoxia largely mimics the HIF independent renal transcriptome, that has been described following repetitive CsA application in vivo. Although HIF-1a protein levels are strongly elevated following episodic hypoxia, transcriptional activity of HIF is low due to an impaired nuclear translocation. Thus, the cellular adaptation to daily cycles of short hypoxic episodes seems to be HIF independent. However, episodic hypoxia activates protective mechanisms against cellular stress and apoptosis that seems to be mediated by moderately elevated ROS levels. Further investigations are needed to elucidate potential parallels to the “preconditioning” phenomenon.

Die Inzidenz des malignen Melanoms hat in den letzten Jahrzehnten zugenommen. Weltweit wird jedes Jahr bei ungefähr 300.000 Patienten ein Melanom diagnostiziert. Das Melanom gehört damit zu den zehn häufigsten Tumorarten in Nordamerika, Westeuropa und Ozeanien. In den letzten Jahren hat die Zulassung von selektiven Inhibitoren für MAP-Kinasen BRAF und MEK sowie von Immuncheckpoint-Inhibitoren, wie beispielsweise Antikörper gegen PD-1 und CTLA-4, die Melanomtherapie signifikant verbessert. Dennoch sind die oft frühzeitige Metastasierung und die hohe Therapieresistenz von Melanomen dafür verantwortlich, dass nach 5 Jahren nur 25 % der Patienten überleben, bei denen Metastasen aufgetreten sind. Deshalb besteht weiterhin der dringende Bedarf, neue Therapien zu entwickeln. Ein vielversprechendes neues Behandlungskonzept ist der Einsatz von onkolytischen Viren, die selektiv in Tumorzellen replizieren und diese dadurch zerstören. Bisher wurden die zwei onkolytischen Viren Rigvir und T-VEC für die Behandlung von Melanomen zugelassen. Um die Effizienz von onkolytischen Viren zu verbessern, werden diese häufig mit Transgenen ausgestattet, die die antitumorale Aktivität der onkolytischen Viren weiter steigert. Da gezeigt werden konnte, dass eine Apoptoseresistenz häufig ursächlich für die Therapieresistenz von Melanomzellen ist, wurde vor Kurzem das onkolytische Adenovirus Ad-TRAIL entwickelt. Ad-TRAIL ist ein selektiv in Melanomzellen replizierendes onkolytisches Adenovirus, das mit TRAIL unter Kontrolle eines Dox-abhängigen Promotors ausgestattet ist. TRAIL ist ein Mitglied der TNF-Superfamilie und induziert Apoptose in Tumorzellen, während normale Zellen geschützt sind. In in vitro und in vivo Studien mit Ad-TRAIL zeigte sich, dass die Kombination von viraler Onkolyse und selektiver Apoptoseinduktion zu einer signifikant verbesserten antitumoralen Aktivität des Virus in Melanomzellen beitrug. Darüber hinaus wies Ad-TRAIL ein deutlich erhöhtes Sicherheitsprofil auf. Trotz der vielversprechenden Ergebnisse war der Einsatz von Ad-TRAIL jedoch begrenzt, da einige Melanomzellen intrinsisch resistent gegenüber TRAIL sind oder nach längerer Exposition eine Resistenz gegen TRAIL entwickelten. Zahlreiche Studien deuten dabei darauf hin, dass antiapoptotische Bcl-2-Proteine, vor allem Mcl-1, wesentlich für das Überleben von Melanomzellen sind und eine Resistenz gegenüber einer TRAIL-induzierten Apoptose vermitteln. In diesem Zusammenhang verfolgte die vorliegende Arbeit zwei Ziele. Erstens sollte aufgeklärt werden, ob Melanomzellen durch eine Herunterregulation von Mcl-1 gegenüber Ad-TRAIL sensitiviert werden können. Zweitens sollten verschiedene RNA-Interferenz-vermittelnde Sequenzen für den Knockdown von Mcl-1 verglichen werden, um zukünftig die effizienteste Sequenz in das Genom von Ad-TRAIL inserieren zu können und somit die Apoptoseinduktion durch TRAIL sowie die Herunterregulation von Mcl-1 in einem Virus zu vereinen. Die Verbesserung der Effizienz des onkolytischen Adenovirus Ad-TRAIL in resistenten Melanomzellen war dabei das übergeordnete Ziel dieser Arbeit. Zunächst konnte in diesem Zusammenhang die deutlich unterschiedliche Sensitivität von vier Melanomzelllinien gegenüber löslichem TRAIL und Ad-TRAIL bestätigt werden (Mel-HO > SK-Mel-19 > Mel-2a > MeWo). Anschließend wurde untersucht, ob ein Knockdown von Mcl-1 Melanomzellen gegenüber Ad-TRAIL sensitivieren kann. Um dabei den Einfluss der unterschiedlichen Sensitivitäten der Melanomzelllinien vergleichen zu können, wurden für diese Experimente zum einen die TRAIL-resistenten MeWo- und zum anderen die TRAIL-sensitiven Mel-HO-Zellen eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die allgemeine zytolytische Aktivität, die Apoptoseinduktion und die Nekroseinduktion von Ad-TRAIL signifikant durch eine Herunterregulation von Mcl-1 gesteigert werden konnte, insbesondere wenn die TRAIL-Expression durch Dox induziert wurde. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die erhöhte Apoptoseinduktion durch TRAIL in Kombination mit der Herunterregulierung von Mcl-1 mit einer stärkeren Aktivierung der Effektor-Caspase-3 einhergeht. Der positive Effekt des Knockdowns von Mcl-1 wurde in der TRAIL-resistenten Zelllinie MeWo, aber auch in der TRAIL-sensitiven Zelllinie Mel-HO beobachtet. Dies zeigt, dass die Vorteile der Herunterregulierung von Mcl-1 nicht auf Melanomzellen mit TRAIL-Resistenz beschränkt sind. Relativ gesehen war der positive Effekt der Herunterregulation von Mcl-1 jedoch in MeWo-Zellen stärker als in Mel-HO-Zellen. Beim Vergleich der verschiedenen RNA-Interferenz-vermittelnden Sequenzen für den Knockdown von Mcl-1 stellte sich die Dreifachkopie einer amiRNA gegen Mcl-1 (3xamiRMcl-1) im Vergleich zu den anderen untersuchten miRNAs und shRNAs als am effizientesten und sichersten für den Knockdown von Mcl-1 heraus. Zusammenfassend legen diese Daten daher eine Herunterregulierung von Mcl-1 als Strategie zur Verbesserung von Ad-TRAIL nahe. In Zukunft könnte in das Genom von Ad-TRAIL die 3xamiRMcl-1-Sequenz inseriert werden, um die induzierbare Expression von TRAIL und die Herunterregulation von Mcl-1 durch RNA-Interferenz in einem Virus zu vereinen., The incidence of malignant melanoma has been increasing over the past decades. Globally each year approximately 300,000 new patients are diagnosed with cutaneous melanoma, which thus belongs to the ten most common cancers in North America, Western Europe and Oceania. Only recently, selective inhibitors for the MAP kinases BRAF and MEK as well as immune checkpoint inhibitors, like PD-1 or CTLA-4 antibodies, have significantly improved melanoma therapy. However, since melanoma is often characterized by early dissemination and severe therapy resistance the current survival rate of patients with metastases still does not exceed 25 % after 5 years. Hence, new strategies to further improve melanoma therapy are required. A promising new strategy is the use of oncolytic adenoviruses, which selectively replicate in and destroy tumor cells. So far, the two oncolytic viruses Rigvir and T-VEC have been approved for the treatment of melanoma. Arming of oncolytic viruses with transgenes, that support the antitumoral activity, has been shown to be a valuable approach to increase the oncolytic efficacy of these viruses. As apoptosis deficiency plays a major role in therapy resistance of melanoma, previously the oncolytic adenovirus Ad-TRAIL was developed. Ad-TRAIL selectively replicates in melanoma cells and is armed with TRAIL under control of a Dox-dependent promoter. TRAIL is a member of the TNF superfamily, that induces apoptosis in tumor cells, while normal cells are largely protected. In vitro and in vivo studies with Ad-TRAIL demonstrated that the combination of viral oncolysis and selective induction of apoptosis contributed to a significantly improved antitumor activity of the virus in melanoma cells. Ad-TRAIL also exhibited a distinctly higher security profile. Despite the promising results the overall efficacy of Ad-TRAIL remained limited, as some melanoma cells were intrinsically resistant to TRAIL or developed resistance to TRAIL after prolonged exposure. Numerous studies indicate that antiapoptotic Bcl-2 proteins - in particular Mcl-1 - are essential for the survival of melanoma cells and mediate resistance to TRAIL-induced apoptosis. Therefore, the present study pursued two aims. First, to investigate whether melanoma cells can be sensitized to Ad-TRAIL by silencing of Mcl-1. Secondly, to compare different RNA interference-mediating sequences for the knockdown of Mcl-1 in order to be able to insert the most efficient sequence into the genome of Ad-TRAIL in the future to thus unite the apoptosis-inducing TRAIL and the silencing of Mcl-1 in one virus. Taken together, the superior aim of this study was to improve the efficiency of the oncolytic adenovirus Ad-TRAIL in resistant melanoma cells. In the present study the different sensitivities of four melanoma cell lines towards soluble TRAIL and Ad-TRAIL could be confirmed (Mel-HO > SK-Mel-19 > Mel-2a > MeWo). Therefore, it was subsequently examined whether a knockdown of Mcl-1 sensitized melanoma cells to Ad-TRAIL. In order to be able to compare the influence of different sensitivities of melanoma cells, the TRAIL-resistant MeWo and the TRAIL-sensitive Mel-HO cells were used for these experiments. It was demonstrated, that the general cytolytic activity, the induction of apoptosis and the induction of necrosis by Ad-TRAIL was significantly increased by the silencing of Mcl-1, in particular when TRAIL expression was induced by Dox. Furthermore, it was shown that the significantly enhanced induction of apoptosis by Ad-TRAIL in combination with the knockdown of Mcl-1 was accompanied by a stronger activation of the main effector caspase-3. The positive effect of Mcl-1 silencing was seen in TRAIL-resistant MeWo, but also in TRAIL-sensitive Mel-HO cells, demonstrating that the benefits of downregulating Mcl-1 were not limited to melanoma cells with TRAIL resistance. However, in relative terms the positive effect of Mcl-1 silencing was stronger in MeWo than in Mel-HO cells. In regard to the evaluation of the different RNA interference-mediating sequences, 3xamiRMcl-1 was found to be the most efficient and safest sequence for the knockdown of Mcl-1 compared to the other miRNAs and shRNAs examined. Taken together, these findings suggest Mcl-1 silencing as a new strategy to further enhance the oncolytic activity of Ad-TRAIL in melanoma. As a future perspective, the 3xamiRMcl-1-sequence could be inserted into the genome of Ad-TRAIL in order to combine the inducible expression of TRAIL and the silencing of Mcl-1 by RNA interference in one virus.

Ichthyoses are hereditary cornification disorders that occur in isolation (nonsyndromic) or with associated internal diseases (syndromic) and can lead to life-threatening complications. The identification of the genetic causes has led to an understanding of the molecular mechanisms, but also to reclassification. The pathological changes in skin biopsies were also more precisely characterized. Certain histological patterns could be defined, which are based on the defects of epidermal differentiation but also on the inflammatory pattern. Complementary histo- and immunohistochemical methods sometimes allow a precise diagnosis, or at least a limitation of the differential diagnoses.

Die ambulant erworbene Pneumonie ist eine akute Infektion des Lungengewebes und führt weltweit zu einer hohen Morbidität und Mortalität. Neben bakteriellen Erregern zählen Influenza-A-Viren (IAV) zu den häufigsten isolierten Erregern. Schwere Verläufe einer IAV-Infektion können zu einem akuten Lungenversagen führen. Als ursächlich hierfür wird ein diffuser Alveolarschaden mit Barrierestörung der alveolo-kapillaren Membran angesehen, infolge dessen der pulmonale Gasaustausch gestört ist. Ein wesentlicher Faktor des Alveolarschadens scheint eine erhöhte Apoptoserate von Typ-II Alveolarepithelzellen (AEC II) zu sein. Allerdings sind die zugrundeliegenden Mechanismen der Apoptoseinduktion während der IAV-Infektion bisher nur unvollständig verstanden. Insbesondere die Rolle der mitochondrialen Dysfunktion ist weitgehend unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wird erstmals in einem humanen ex vivo Lungenmodell der zeitliche Infektionsverlauf von IAV in AEC II Zellen mittels Lebendgewebemikroskpie gezeigt. Zeitgleich konnten Alterationen an den Mitochondrien beobachtet werden. Überdies gelang nach Etablierung eines in vitro Infektionsmodells mit A549-Zellen für die Lebendzellmikroskopie die Messung mitochondrialer Funktionen während der IAV-Infektion. Dabei konnte demonstriert werden, dass mitochondriale Funktionen über einen langen Zeitraum während der IAV-Infektion erhalten bleiben. Trotz frühzeitiger Caspasen-3/7-Aktivierung finden mitochondriale Alterationen erst sehr spät im Infektionsprozess statt. Sobald diese eintraten, konnte eine Abrundung der Mitochondrien, ein Verlust des mitochondrialen Membranpotentials, die Rekrutierung von BCL-2-associated X protein sowie eine Freisetzung von cytochrom C detektiert werden, welche eine starke Caspase 3/7-Aktivierung induzierte und zur Apoptose der infizierten Zelle führte. Schlussfolgernd zeigen die Ergebnisse, dass IAV-infizierte AEC II über einen langen Zeitraum der Infektion stabile mitochondriale Parameter aufweisen und erst mit deren später Alteration Apoptose in infizierten Zellen auftritt, trotz bereits voraktivierter Effektor-Caspasen. Hiermit geben die vorliegenden Daten Hinweise auf die zentrale Bedeutung der Mitochondrien im IAV-Infektionsprozess bis hin zur Induktion des Zelltodes., Community acquired pneumonia is an acute infection of lung tissue and causes high morbidity and mortality worldwide. Influenza A virus (IAV) is the most common isolated pathogen besides bacteria. Severe IAV infections can lead to acute lung injury. The cause of this is considered to be a diffuse alveolar damage with disruption of the alveolar-capillary barrier resulting in disturbance of pulmonary gas exchanges. An important factor of alveolar damage seems to be an increased apoptosis rate of type II alveolar epithelial cells (AEC II). However, the underlying mechanism of apoptosis induction during IAV infection and the contribution of mitochondrial alterations in particular are currently only partially understood. In this thesis it was possible for the first time to show the effects of an IAV infection in real time on mitochondria in AEC II using spectral confocal microscopy. Moreover, after establishment of an in vitro infection model with A549 cells for live cell imaging, mitochondrial activity could be measured. It could be demonstrated that mitochondrial activity was unaffected over the timespan of an IAV infection. Even though early caspase 3/7 activation was detected, mitochondrial alterations took place very late during the infection process. As soon as mitochondrial alterations occured, mitochondrial fragmentation, loss of mitochondrial membran potential, recruitment of BCL-2-associated X protein and the release of cytochrom C could be detected, which induced a strong caspase 3/7 activation und led to apoptosis of the infected cells. In summary, the results indicate that IAV infected AEC II preserve mitochondrial activity over a long timespan and despite preactivated effector caspases, only dying cells have alterations of mitochondria. The available data hereby supports the importance of mitochondria during the IAV infection process up to the induction of cell death.

Weltweit zählt das Glaukom zu den häufigsten Erblindungsursachen. Trotz intensiver Forschung bleibt die Pathogenese des Glaukoms weitestgehend ungeklärt. Ziel dieser Forschungsarbeit war es zu überprüfen, welche Zelltodmechanismen bei dem Glaukom eine Rolle spielen. Außerdem sollte überprüft werden, ob es zu einer Aktivierung der Makrogliazellen kommt. In einem experimentellen autoimmunen Glaukommodell wurden drei Gruppen gebildet: die behandelte Gruppe wurde mit retinalen Ganglienzellen (RGA), Freunds Adjuvant (FA) und Pertussistoxin (PTX) immunisiert, die Kontrollgruppe erhielt nur FA und PTX und die Nativgruppe blieb unbehandelt. Es ließ sich lediglich erneut eine Aktivierung der Apoptose in der behandelten Gruppe nachweisen, nicht jedoch eine Nekroptose- oder Autophagozytoseaktivierung. Auch ließ sich keine Makrogliazellaktivierung nachweisen. In Normaldruckglaukomen scheint somit die Apoptose der entscheidende Zelltodmechanismus zu sein., Glaucoma is one of the most common causes of blindness worldwide. Despite intensive research, the pathogenesis of glaucoma remains largely unexplained. The aim of this research work was to examine which cell death mechanisms play a role in glaucoma. It should also be checked whether the macroglial cells are activated. In an experimental autoimmune glaucoma model, three groups were formed: the treated group was immunized with retinal ganglion cells (RGA), Freund's adjuvant (FA) and pertussis toxin (PTX), the control group received only FA and PTX and the native group remained untreated. Activation of apoptosis could only be demonstrated in the treated group, but not activation of necroptosis or autophagocytosis. There was also no evidence of macroglial cell activation. In normal pressure glaucoma, apoptosis seems to be the crucial cell death mechanism.

Tumor Treating Fields (TTFields) sind alternierende Wechselfelder mit einer intermediären Frequenz und niedrigen Intensität, die zu einer Destabilisierung des Spindelapparates während der Mitose führen. Sie sind als zusätzliche Behandlungsoption bei Glioblastoma multiforme zugelassen. Der mitotische Spindelkontrollpunkt überwacht eine fehlerhafte Anheftung der Spindelfasern von Schwesterchromatiden und leitet Reparaturprozesse ein. Monopolar spindle 1 (MPS1) ist eine Schlüsselkomponente dieses Kontrollpunktes und kann den durch TTFields physikalisch induzierten Spindelschäden entgegenwirken. Durch Zellzahlmessung, Zellzyklusuntersuchungen und durchflusszytometrische Analysen als auch Fluoreszenzfärbungen konnte gezeigt werden, dass eine Inhibition von MPS1 die antimitotischen Wirkungen von TTFields verstärken kann., Tumor Treating Fields (TTFields) are alternating electric fields with low intensity and intermediate frequency approved for the therapy of glioblastoma multiforme. TTFields therapy interrupts the spindle formation through mitosis leading to misalignment of chromosomes. Spindle assembly checkpoint (SAC) and its key component monopolar spindle 1 (MPS1) regulate proper chromosomal arrangement and segregation. Here, we show that through the combination of physically interfering spindle formation by TTFields and chemical inhibition of MPS1, TTFields effects can be augmented promising a new target for multimodal treatment in glioblastoma therapy.

Bei „Innate lymphoid cells“ (ILCs) handelt es sich um eine heterogene Gruppe lymphoider Immunzellen, die zum angeborenen Immunsystem gehören. Sie modulieren die Gewebshomöostase in verschiedenen Organen und regulieren anti-mikrobielle Immunantworten. Programmierter Zelltod, auch Apoptose genannt, ist essentiell für die Entwicklung sowie die Funktion des Immunsystems. Ob und wie der extrinsische Apoptosesignalweg die Entwicklung bzw. die Funktion von ILCs reguliert, war zu Beginn der vorliegenden Dissertation nicht bekannt. Um diese Frage zu beantworten wurden NK Δc-FLIP -Mäuse hergestellt, in denen das anti-apoptotische Protein c-Flip selektiv in NKp46 + -ILCs fehlte. Die durchflusszytometrische Analyse der Immunzellpopulationen in verschiedenen Organen von NK Δc-FLIP -Mäusen und NK WT -Mäusen zeigte eine starke Reduktion der NKp46 + -Zellen in NK Δc-FLIP -Mäusen. Die Entwicklung von T- und B-Zellen bzw. myeloiden Zellen war im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen unbeeinträchtigt. Bei der NK Δc-FLIP -Maus handelt es sich demnach um ein neues Modell, mit dessen Hilfe sich die Bedeutung von NKp46 + -ILCs in Mäusen mit intaktem Immunsystem testen lässt. Um den molekularen Mechanismus der c-Flip-abhängigen Entwicklung von NKp46 + -ILCs zu studieren, wurde ein experimentelles System etabliert, mit dessen Hilfe sich Teile der ILC-Entwicklung in vitro nachvollziehen ließen. Innerhalb von 9 Tagen konnte die Entwicklung NK1.1 + NKp46 + -ILCs aus NK1.1 - NKp46 — ILC-Vorläuferzellen rekapituliert werden. Die Experimente zeigten, dass die Entwicklung von NK Δc-FLIP NK1.1 + NKp46 + -ILCs im Vergleich zu NK WT -Kontrollen stark eingeschränkt war. Durch die Gabe eines Caspase- Inhibitors konnte dieser Entwicklungsdefekt teilweise kompensiert werden. Dies lässt den Rückschluss zu, dass c-Flip hauptsächlich die Caspase-vermittelte Apoptose in ILC-Vorläufern inhibiert und dadurch die Differenzierung zu reifen NKp46 + -ILC ermöglicht. Der Caspase 8-abhängige, extrinsische Weg der Apoptoseinduktion wird durch Signale von sogenannten „Todesrezeptoren“ ausgelöst. Der Einsatz blockierender Antikörper im Zellkulturmodell durchgeführt zeigte, dass c-Flip die TNF-α-vermittelte Apoptose in einem frühen Stadium der Reifung von NKp46 + -ILCs inhibiert. Die Expression von c-Flip in NKp46 + -ILC ist daher essentiell für die Entwicklung und Reifung dieser Zellen im Knochenmark.

Diese experimentelle Studie wurde mit dem Ziel durchgeführt, die beiden Substanzen N-Acetylcystein (NAC) und 2-Mercaptoethansulfonat-Natrium (MESNA) im Zellkulturmodell hinsichtlich ihrer nephroprotektiven Eigenschaften bei der Anwendung von jodhaltigen Röntgenkontrastmitteln näher zu verglichen. Als Zellkulturmodell wurden „human kidney-2 Zellen" (HK-2 Zellen) verwendet und als Kontrastmittel die zwei jodhaltigen Kontrastmittel Iopromid und Iodixanol. Um das Ausmaß des Kontrastmittelschadens und der nephroprotektiven Wirkung von NAC und MESNA zu eruieren, wurden Zellzählungsversuche und Western-Blots durchgeführt. HK-2 Zellen wurden zunächst mit NAC oder MESNA inkubiert und dann entweder Iopromid oder Iodixanol hinzugegeben. Für die Western-Blots wurde die Expression des pro-apoptotischen Bcl-2-associated X protein (Bax) ausgewertet, welches beim intrinsischen Ablauf der Apoptose eine Rolle spielt. Als Outcome wurde hierbei die Bandenintensität gemessen, während bei der Zellzählung die Anzahl der Zellen unter der Neubauer-Zählkammer nach verschiedenen Inkubationszeiten bestimmt wurde. Bezüglich der Auswahl der nephroprotektiven Substanz NAC oder MESNA zeigte sich eine Ähnlichkeit in ihrer nephroprotektiven Wirkung, wobei NAC im Vergleich zu MESNA eine tendenziell bessere Wirkung erzielte, MESNA aber bessere pharmakokinetische Eigenschaften (hohe renale Elimination) aufweist. Eine periinterventionelle NAC-Gabe vor Kontrastmittelapplikation ist in der CIN-Prävention bei Patienten mit vorliegenden Risikofaktoren in vielen Kliniken implementiert. MESNA kann ebenso zur CIN-Prävention betragen, wird aber klinisch eher selten verwendet. Für die weitere Etablierung von MESNA müssen jedoch noch weitere klinische Studien folgen.