Search

Glavna uloga proteina BPM1 u uročnjaku (Arabidopsis thaliana L.) je u kompleksu kulin3- ovisnih E3 ligaza gdje domenom MATH prepoznaje specifične proteinske supstrate usmjeravajući ih u ubikvitinaciju i degradaciju na proteasomu 26S. Metodama ko-imunoprecipitacije i spektrometrije masa utvrđena je interakcija proteina BPM1 s DMS3 i RDM1 komponentama kompleksa DDR uključenog u RNA-posredovanu metilaciju DNA (RdDM). Kompleks DDR regrutira Polimerazu V te sudjeluje u pozicioniranju metilacijskog kompleksa na genom. Navedene interakcije nisu posredovane domenom MATH, ukazujući kako se kroz ovu interakciju proteini DMS3 i RDM1 ne degradiraju. U svrhu razjašnjena uloge proteina BPM1 u RdDM-u, odabrano je pet gena za analizu metilacije bisulfitnim mapiranjem i pirosekvenciranjem. Geni FWA i CML41 korišteni su kao kontrole budući da je njihova regulacija RdDM-om poznata od ranije. Kromatinskom imunoprecipitacijom identificirali smo zajedničke vezne regije proteina BPM1 i DMS3 na genomu linije s nefunkcionalnom proteasomalnom degradacijom, te izdvojili gene AGL14, RKP i FBW2 kao nove mete proteina BPM1 i RdDM-a. Metilacijski obrasci za svako metilacijsko mjesto i metilacijski kontekst, uspoređeni su između divljeg tipa te linije s overekspresijom proteina BPM1 i linije s nefunkcionalnim proteinom DMS3. Rezultati su pokazali značajno više razine metilacije povezane s RdDM-om u biljkama s povišenom ekspresijom proteina BPM1 te gubitak metilacije u RdDM nefukcionalnoj mutanti dms3.

U biljaka proces embriogeneze, može započeti iz oplođene jajne stanice (zigotna embriogeneza), ali i indukcijom somatskih stanica (somatska embriogeneza). U oba slučaja dolazi do značajnog epigenetičkog reprogramiranja, a jedan od ključnih mehanizama je metilacija DNA posredovana malim molekulama RNA (engl. RNA-directed DNA methylation, RdDM) koja osigurava metilaciju de novo. Uročnjakov protein BPM1 dio je velike porodice proteina MATH-BTB koji sudjeluju u brojnim razvojnim procesima biljaka i životinja kao komponente proteina ubikvitinskih ligaza ovisnih o kulinu. Dodatno, protein BPM1 stupa u interakciju s proteinima DMS3 i RDM1, važnim komponentama u procesu RdDM-a. Interakcije se ostvaruju neovisno o kulinu, upućujući na ulogu proteina BPM1 u regulaciji metilacije DNA de novo. Kromatinskom imunoprecipitacijom identificirane su zajedničke vezne regije proteina BPM1 i DMS3 na genomu uročnjaka te su odabrani geni na kojima su provedene analize ekspresije i metilacije u somatskim i zigotnim embrijima uročnjaka. Također, ispitana je učinkovitost indukcije somatskih embrija u transgeničnim linijama s prekomjernom ekspresijom proteina BPM1 ili DMS3, u liniji s utišanim genima BPM te liniji s nefunkcionalnim proteinom DMS3. Embriogeni potencijal linije s utišanim genima BPM bio je smanjen, dok u linijama s prekomjernom ekspresijom nije došlo do značajnih promjena u odnosu na divlji tip. Dobiveni rezultati upućuju na novu ulogu proteina MATH-BTB u regulaciji metilacije DNA tijekom embriogeneze.

Voda, temperatura i svjetlost neophodni su za prekid dormancije i klijanje sjemena. Zbog klimatskih promjena, vegetacijsko razdoblje sve je sušnije, prosječna je temperatura u porastu, a češći su i toplinski udari. Promjena klime koju očekujemo u nadolazećem razdoblju utjecat će na poljoprivredu i značajno ugroziti bioraznolikost. Biljke imaju brojne mehanizme koji im omogućuju da se prilagode uvjetima okoline, a osnova tih promjena je epigenetičke prirode. Stoga je za razumijevanje interakcija između biljaka i okoliša potrebno razumijevanje epigenetičke osnove osjetljivosti na temperaturu. U ovom je radu istraženo kako temperatura utječe na klijanje triju biljnih vrsta - modelne biljke uročnjaka (Arabidopsis thaliana) i dviju globalno važnih poljoprivrednih vrsta: kineskog kupusa (Brassica rapa) i rajčice (Solanum lycopersicum). Za svaku je vrstu istraženo koja je najviša temperatura koja omogućuje klijanje sjemenki, kao i kako povišenje temperature utječu na globalnu metilaciju DNA.

Proteini MATH-BTB sadrže 2 domene, MATH (Meprin and TRAF Homology) i BTB (Bric-A-Brac, Tramtrack, Broad Complex) i opisani su kao adapteri u kompleksu E3 ligaza ovisnih o Cul3. Proteini MATH-BTB u sklopu ovog kompleksa djeluju kao sustav navođenja ciljanih proteina na ubikvitinaciju, a zatim i degradaciju na proteasomu 26S. U genomu uročnjaka Arabidopsis thaliana 6 gena kodira proteine MATH-BTB, nazvane AtBPM1-6. Dosad opisane mete proteina AtBPM transkripcijski su faktori iz porodice R2R3 MYB, ERF/AP2 i razreda I HD-Zip, čime su proteini AtBPM dovedeni u vezu s procesima poput regulacije cvjetanja (1), razvoja sjemena (2) i odgovora na abiotički stres (3). Transkripcijski faktor DREB2A regulira odgovor biljke na toplinski stres aktivacijom ekspresije velikog broja nizvodnih gena, među kojima je i gen HsfA3, a nedavno je pokazano da proteini AtBPM ulaze u interakciju s proteinom DREB2A te reguliraju njegovu razgradnju (4). S ciljem istraživanja fiziološke uloge proteina BPM1, proizvedene su transgene biljke A. thaliana koje prekomjerno eksprimiraju protein BPM1 fuzioniran sa zelenim fluorescentnim proteinom (GFP). Klijanci transgene linije uročnjaka izlagani su povišenim temperaturama, a prisutnost i distribucija proteina AtBPM1 detektirana je konfokalnom mikroskopijom. Iz tkiva tretiranih klijanaca izolirani su ukupni topivi proteini te je protein GFP-BPM1 analiziran imunodetekcijom pomoću anti-GFP antitijela. Dok je u kontrolnim uvjetima zabilježena degradacija proteina GFP-BPM1, izlaganje povišenim temperaturama potaknulo je značajnu stabilizaciju proteina GFP-BPM1. Kvantitativnom metodom PCR analizirana je ekspresija gena HsfA3 u transgenim klijancima izloženima povišenoj temperaturi (37 °C). U odnosu na divlji tip, ekspresija gena HsfA3 bila je značajno smanjena. Zajedno, ovi rezultati ukazuju na potencijalnu fiziološku ulogu proteina BPM1 u prilagodbi uročnjaka na povišene temperature.

Proteini BPM uročnjaka pripadaju porodici proteina MATH-BTB koji sudjeluju u brojnim razvojnim procesima biljaka i životinja, te su se pokazali ključnim regulatorima staničnog ciklusa. Genom uročnjaka sadrži šest gena koji kodiraju proteine BPM (BPM1-6). Uročnjakovi proteini BPM djeluju kao specifični adapteri za kulin3 koji je dio kompleksa ubikvitinskih ligaza E3. Proteini BPM vežu kulin3 svojom domenom BTB, dok domena MATH prepoznaje specifične supstrate poput transkripcijskih faktora te ih usmjerava na ubikvitinaciju i posljedičnu proteasomsku razgradnju [1]. Unutarstanična lokalizacija proteina BPM1 u jezgri, ali i jezgrici upućuje na funkciju ovog proteina neovisnu o kulinu3 [2]. Preliminarna istraživanja pokazala su da protein BPM1 ulazi u interakciju s proteinima DMS3 i RDM1, važnim komponentama u procesu metilacije DNA de novo usmjerene malim molekulama RNA (RdDM). S ciljem razjašnjavanja funkcije proteina BPM1 u procesu RdDM analizirana je unutarstanična kolokalizacija proteina BPM1 s DMS3 i RDM1 te značaj pojedinih proteinskih domena u ostvarivanju specifične unutarstanične lokalizacije. Sustavom dvaju kvašćevih hibrida istražene su interakcije šest proteina BPM i varijanti proteina BPM1 bez pojedinačne proteinske domene s proteinima DMS3 i RDM1. Rezultati ukazuju da proteini BPM ostvaruju interakcije s DMS3 i RDM1, te da je domena BTB važna za interakciju s RDM1. Protein BPM1 primarno lokalizira u jezgri u kojoj je potvrđena njegova kolokalizacija s proteinima DMS3 i RDM1. Delecija pojedinih domena proteina ne narušava kolokalizaciju proteina BPM1 u jezgri, ali se odražava na lokalizaciju u jezgrici. Interakcije proteina BPM1 s proteinima DMS3 i RDM1 unutar jezgre upućuju na potencijalnu ulogu proteina BPM1 u regulaciji metilacije DNA de novo regulirane mehanizmom RdDM. Nadalje, značaj domene BTB u pokazanim interakcijama ukazuje da mehanizam kojim protein BPM1 sudjeluje u putu RdDM nije temeljen na usmjeravanju regulacijskih proteina RdDM (DMS3 i RDM1) u razgradnju na proteasomima, a rasvjetljavanje mehanizma opisane interakcije u putu RdDM-a predmet je daljnjih istraživanja.

Temperatura je važan čimbenik za rast i razvoj biljaka. Ona varira s geografskom širinom, ali se također mijenja kao posljedica globalnog zatopljenja. Vlaga, svjetlost i temperatura tri su čimbenika presudna za germinaciju, a pored hormonskog statusa, sinteze i degradacije proteina tijekom germinacije, presudnu ulogu u adaptaciji biljaka na okolišne uvjete imaju epigenetičke promjene. U svrhu proučavanja učinka povišene temperature na metilaciju DNA istražena je sposobnost germinacije modelne biljke Arabidopsis thaliana (uročnjak), te dviju poljoprivredno važnih vrsta Nicotiana tabacum (duhan) i Brassica rapa (poljska vrzina) u uvjetima povišene temperature. Za germinacijske su testove sjemenke navedenih vrsta izložene setu temperaturnih tretmana od 28 do 48 °C te je određena maksimalna permisivna temperatura klijavosti. U uzorcima izloženim povišenim temperaturama odredit će se stupanj metilacije DNA.

Grk je autohtona hrvatska sorta vinove loze koja se isključivo uzgaja na otoku Korčuli. Jedna je od rijetkih sorti vinove loze s funkcionalno ženskim cvijetom, što uzrokuje određene probleme u proizvodn ji grožđa uzrokovane smanjenom stopom uspješne oplodnje. Grozd Grka u punoj zrelosti sadrži kombinaciju potpuno razvijenih bobica sa sjemenkama, ali i značajan udio manjih besjemenih bobica, čiji optimalni udio ima pozitivan utjecaj na kvalitetu vina. I mu ški i ženski gametofiti Grka razvijaju se normalno te u zrelosti sadrže dvije spermalne stanice u muškom odnosno jajnu i središnju stanicu u ženskom gametofitu. Glavni razlog umanjene stope oplodnje i posljedični razvoj besjemenih plodova je nevijabilonost peludnog zrna uzrokovana akolporatnom građom vanjske stijenke peludnog zrna kao i izostankom uspješne oplodnje nakon strano - oprašivanja zbog čega dolazi do propadanja sjemenog zametka

Konzervirane proteinske domene BTB i MATH prisutne su u brojnim proteinima kao zasebne, zajedno ili u kombinaciji s drugim proteinskim domenama. Opisana je različita funkcija proteina s domenom BTB. Proteini BTB obitelji su transkripcijski represori, regulatori citoskeleta i dinamike aktina, dok je MATH domena prisutna u proteinima uključenim u prijenos signala vezan uz stanični rast i apoptozu, aktivaciju transkripcijskih faktora te uz hidrolizu faktora rasta, biološki aktivnih peptida i proteina izvanstaničnog matriksa. Gen TaMAB2 iz pšenice aktivan je samo u zigoti i dvo-staničnom proembriju pšenice. Protein TaMAB2 u interfaznim stanicama BY2 lokalizira polarno na jezgrinoj ovojnici stvarajući velike proteinske komplekse. Tijekom staničnog ciklusa lokalizacija proteina TaMAB2 mijenja se u zavisnosti s reorganizacijom mikrotubula. Analiza multiproteinski komplekasa izoliranih iz transgeničnih biljaka A. thaliana u kojima je stabilno ugrañen i eksprimiran pšenični TaMAB2 ukazuje na veći proj potencijalnih interakcijskih partnera koji ukazuju na ulogu ovog proteina u regulaciji stanične diobe. Unutarstanična lokalizacija uročnjakovog proteina AtBPM1 pokazuje ovisnost o staničnom ciklusu. Protein AtBPM1prisutan je tijekom interfaze u jezgri i jezgrici. Pojačana ispoljenost fluorescentno obilježenog proteina AtBPM1 u transgeničnim linijama A. thaliana ukazuje na varijabilnost unutarstanične lokalizacije ovisnu o tipu stanica. Uloga obaju gena tijekom staničnog ciklusa biti će raspravljena.

Većina biljnih fenolnih metabolita sintetizira se iz t-cimetne kiseline koja nastaje deaminacijom L-Phe pomoću enzima fenilalanin-amonij-lijaze (PAL). Smatra se da PAL ima ključnu ulogu u preusmjeravanju primarnih metabolita u fenolni sekundarni metabolizam. Uzgojene su linije transgenog korijenja ukrasne koprive Coleus blumei u kojima je gen PAL1 iz uročnjaka Arabidopsis thaliana pod kontrolom konstitutivnog promotora CaMV 35S. Aktivnost PAL u transgenim linijama bila je od 67% do 350% u usporedbi s normalnim, netransgenim korijenjem ukrasne koprive. Pojačana aktivnost PAL-a utjecala je na rast i sintezu sekundarnih metabolita u transgenom korijenju. Linije sa značajno pojačanom PAL aktivnosti rasle su značajno sporije te su nakupljale manje fenolnih sekundarnih metabolita, ružmarinske kiseline (glavnog sekundarnog metabolita u ukrasnoj koprivi) te klorogenske kiseline, ali značajno više kavine kiseline. Nemogućnost poticanja sinteze ružmarinske kiseline s hidrolizatom kazeina i/ili L-Tyr upućuje na važnost t-cimetne kiseline kao regulatora rasta i sinteze ružmarinske kiseline u ukrasnoj koprivi.

Somatska embriogeneza je proces u kojemu somatske stanice prolaze karakteristične stadije embrijskog razvoja. U većine biljnih vrsta somatska embriogeneza može se postići dodatkom auksina u podlogu. U bundeve (Cucurbita pepo L.) embriogeno tkivo dobiveno je na eksplantatima zigotnog embrija (neovisno o dodatku auksina), na podlozi MS s NH4Cl kao jedinim izvorom dušika. Različite dušikove soli, odnosno omjer reduciranog i oksidiranog dušika, određivale su daljnji tijek embriogeneze. Budući da je utvrđen utjecaj sintetskih auksina na porast metilacije DNA kao i promjena razine metilacije tijekom embriogeneze, analizirali smo razinu metilacije citozina u molekuli DNA u tri embriogene linije bundeve dobivene na podlogama MS s i bez dodatka auksina i s različitim izvorima dušika. Najviša razina metilacije u sve tri linije bila je na podlogama koje su održavale rane faze embriogeneze (MS bez dodatka auksina i s NH4Cl; MS s dodatkom 2,4-diklorofenoksioctene kiseline). Razina metilacije opadala je tijekom kultivacije tkiva na podlogama pogodnim za sazrijevanje embrija. Dodatak demetilirajućeg nukleozidnog analoga 5-azacitidina izazivao je smanjenje razine metilacije iako dugotrajno izlaganje tkiva djelovanju 5-azacitidina nije uzrokovalo gubitak embriogenog potencijala.

The production of tolerant and resistant plants via plant biotechnology has the potential to improve agriculture. In the paper we discuss environmental stresses and their many forms and the differences in plant species in their sensitivity and response to some abiotic stresses. Biochemical studies have revealed similarities in processes induced by stress thad lead to the accumulation of metabolites, including nitrogen-containing compounds (proline, other amino acids, polyamines, antifreeze proteins) and hydroxyl compounds (sucrose, poliols, polyamines, trehalose). We show through several examples (drought tolerance in tobacco, salt tolerance in Arabidopsis) that genetic engineering in model plants can greatly increase the plant's ability to survive stress.

Nesmetano odvijanje osnovnih procesa poput replikacije, transkripcije te popravka DNA esencijalni su za opstanak stanice. Prisustvo specifičnog tipa oštećenja pod nazivom kovalentno vezanje proteina na DNA (engl. DNA-protein crosslink, DPC) onemogućava odvijanje osnovnih staničnih procesa, čime se narušava stanična homeostaza. Zato što akumulacija DPC u stanici doprinosi razvoju tumora te starenju, humana proteaza SPRTN, koja je usko vezana uz proteolitički popravak DPC, predmet je brojnih istraživanja. U ovom radu pozornost je stavljena na nekarakteriziranu domenu MIU proteina SPRTN. Testirali smo interakcijske partnere domene MIU, te time pokušali predvidjeti njenu funkciju koju obavlja za vrijeme proteolitičkog uklanjanja DPC. Tumorske stanične linije HeLa i HepG2 su tretirane formaldehidom i UV-zračenjem u svrhu indukcije DPC. Korištenjem metode pulldown ispitali smo interakciju domene MIU s proteinima XRCC1, CHK1, PMS2, GAPDH, MLH1 te proteinima koji su obilježeni s ubikvitinom ili SUMO-2/3 posttranslacijskom modifikacijom. Interakcija proteina je provjerena metodom Western blot. Domena MIU nije vezala ni jedan testirani protein. Protein XRCC1 te PMS2 su definirani kao novi C-terminalni interaktori proteina SPRTN dok je za CHK1 ustanovljeno da se veže za N-terminalni dio proteina SPRTN. The unobstructed performance of basic processes, such as DNA replication, transcription and repaire, is essential for cell survival. The presence of a specific type of damage called DNAprotein crosslink (DPC) prevents the execution of basic cellular processes, thereby disrupting cellular homeostasis. Due to the fact that an accumulation of DPC in cells contributes to tumor development and aging, a human protease SPRTN, closely related to the proteolytic repair of DPC, is the subject of numerous studies. This study focuses on the MIU domain, an uncharacterized domain of SPRTN protein. We tested interaction partners of the MIU domain, and thereby tried to predict its function during the proteolytic removal of DPC. For the purpose of DPC induction, tumor cell lines HeLa and HepG2 were treated with formaldehyde and UV radiation. Using the pulldown method, we examined interactions of the MIU domain with XRCC1, CHK1, PMS2, GAPDH, MLH1 and proteins labeled with ubiquitin or SUMO-2/3 post-translational modification. Protein interactions were verified by a Western blot method. The MIU domain did not bind any tested protein. The XRCC1 and PMS2 proteins were defined as new C-terminal interactors of SPRTN protein, while CHK1 was found to bind the N-terminal part of SPRTN protein.

Za optimalni učinak, koncentracija auksina u stanicama je strogo regulirana transportom i metabolizmom auksina. Konjugati auksina predstavljaju skladišnu ili razgradnu formu auksina. Auksinske amidohidolaze su enzimi koji hidroliziraju konjugate te oslobađaju aktivni oblik auksina. U ovom istraživanju, odredio sam relativnu ekspresiju gena za auksinske amidohidrolaze ILR1, ILL2 i IAR3 u nadekspresorskim linijama ILR1 13.3, ILR1 3.1, ILL2 25.6, ILL2 27.2, ILL2 8.2, IAR3 11.5 te IAR3 13.4 vrste Arabidopsis thaliana, ekotipa Wassilewskija. Istražio sam utjecaj solnog (150 mM NaCl), osmotskog (300 mM manitola) i temperaturnog stresa (38 °C) na produžni rast i razvoj korijena kod nadekspresora i mutanata (ilr1-2, ill2-1, iar3-2, ill2-1iar3-2 i ilr1-2ill2-1iar3-2) auksinskih amidohidrolaza. Uz to, analizirao sam lokalizaciju rekombinantnog proteina ILL2-GFP u korijenu biljke nadekspresora ILL2 8.2 uzgajanih u uvjetima solnog, osmotskog i temperaturnog stresa. Nadekspresorske linije ILR1 3.1, ILR1 13.3 i ILL2 27.2 imale su 731.17, 182.5 odnosno 350.93 puta veću ekspresiju odgovarajućeg gena auksinske amidohidrolaze u odnosu na divlji tip. Navedene linije su imale i značajnu promjenu u arhitekturi korijena u uvjetima solnog stresa u odnosu na divlji tip. U uvjetima solnog i osmotskog stresa nakupljanje proteina ILL2 bilo je povećano u zoni sazrijevanja korijena, dok se u vršku korijena nije mijenjalo u odnosu na kontrolne uvjete. Auxins act in concentration dependant manner, that is tightly controled by auxin metabolism as well as its transportation. Auxin conjugates are storage or degradable forms of auxins. Auxin amidohydrolases are enzymes that hydrolyse conjugates and release the active form of auxin. In this research, I measured relative expression of auxin amidohydrolases ILR1, ILL2 i IAR3 in Arabidopsis thaliana, ecotype Wassilewskija, overexpressing lines ILR1 13.3, ILR1 3.1, ILL2 25.6, ILL2 27.2, ILL2 8.2, IAR3 11.5 and IAR3 13.4. To reveal function of auxin amidohydrolases in plant stress response I investigated the influence of salt (150 mM NaCl), osmotic (300 mM mannitol) and temperature stress (38 °C) on growth and development of roots in overexpressing lines and auxin amidohydrolase mutants (ilr1-2, ill2-1, iar3-2, ill2- 1iar3-2 i ilr1-2ill2-1iar3-2). Further, I analysed localisation of recombinant protein ILL2-GFP in the overexpressing line ILL2 8.2, grown in conditions of salt, osmotic and temperature stress. Overexpressing lines ILR1 3.1, ILR1 13.3 and ILL2 27.2 had 731.17, 182.5 and 350.93 times higher expression of corresponding native gene compared to wild type, respectively. The root architecture of those overexpressing lines was significantly changed in salt stress condition, compared to wild type. In salt and osmotic stress, the accumulation of ILL2 was significanly increased in the root maturation zone and did not change in the root tip compared to the control conditions.

Globano zagrijavanje i klimatske promjene zahtijevaju selekciju otpornih biljaka koje unatoč temperaturnim ekstremima i sušnim periodima mogu davati dobre prinose. Raštika (Brassica oleracea var. acephala) je biljka koja odlično uspijeva pri visokim temperaturama i u slanome tlu. U prvom dijelu rada testirana su 33 varijeteta raštike iz različitih dijelova Hrvatske i Hercegovine izlaganjem klijanaca toplinskom stresu (maksimum 38 °C), suši (uz primjenu 0,3 M manitola), te kombinaciji tih stresnih uvjeta. Usporedbom rezultata prirasta korijena, biomase, sadržaja vode i količine prolina odabrana su dva otpornija i dva neotporna kultivara na kojima je u drugom dijelu pokusa mjerena brza fluorescencija klorofila a (metoda OJIP), sadržaj vodikova peroksida, stupanj lipidne peroksidacije i aktivnost katalaze. Zatim je napravljena imunodetekcija proteina HSP70, HSP90 i Rubisco, te je analizirana ekspresija gena NAC041 i NAC084. Pronađeno je da u svim kultivarima raštike osmotski stres uzrokuje veće morfološke promjene klijanaca, veću akumulaciju prolina i veća oksidativna oštećenja nego povišena temperatura. Usporedbom otpornih i manje otpornih kultivara utvrđeno je da otporni prilikom izlaganja osmotskom i toplinskom stresu imaju bolju sposobnost očuvanja fotosintetske učinkovitosti, te da dolazi do povećanja količine proteina HSP70, HSP90 i Rubisco. Kod osjetljivog kultivara raštike ekspresija gena NAC041 smanjena je u osmotskom stresu, a ekspresija gena NAC084 smanjena je primjenom kombinacije toplinskog i osmotskog stresa. Otporan kultivar raštike ne pokazuje statistički značajno odstupanje u ekspresiji gena NAC041 i NAC084 između kontrolnog i stresnih tretmana. Global warming and climate change create an increased demand for the identification of drought and high temperature resistant plants in order to minimalize yield loss in crop plants. Kale (Brassica oleracea var. acephala) is a plant that has shown the ability to grow in high temperature environments and saline soils. In the first part of the experiments 33 varietes of kale from different parts of Croatia and Hercegovina were tested by exposing the seedlings to temperature stress (maximum 38 °C), drought (0,3 M mannitol) and the combination of the two stresses. Root growth, biomass, water and proline content were analyzed and two of the most and least resistant cultivars were chosen for further investigation and comparison. The four kale varieties were exposed to stresses previously described and chlorophyll a fluorescence was measured (OJIP method) as well as hydrogen peroxide content, lipid peroxidation and catalase activity. Levels of HSP70, HSP90 and Rubisco protein were estimated after immunodetection and expression analysis was performed for NAC041 and NAC084 genes. It was found that osmotic stress caused greater morphological changes, greater proline accumulation and more oxidative damage than high temperature stress. The comparison of sensitive and resistant varieties revealed that when exposed to osmotic and high temperature stress, the resistant varieties are able to maintain better photosystem II functionality and performance and had increased levels of HSP70, HSP90 and Rubisco protein. In the sensitive kale cultivar the expression of the NAC041 gene was reduced under osmotic stress and the NAC084 gene under combined high temperature and osmotic stress. The resistant kale cultivar did not show a statistically significant change in NAC041 and NAC084 gene expression between control and stress treatments.

Analize genske ekspresije u pojedinim embrionalnim stadijima daju uvid u genetske mehanizme i regulatorne mreže koji omogućuju potpuni razvoj embrija. Zbog točno određenog i predvidljivog razvoja tijekom embriogeneze, uročnjak (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) je idealan model u takvim istraživanjima. Brojne tehničke poteškoće povezane s izolacijom različitih stadija zigotnih embrija otežavaju analize ekspresije gena tijekom embriogeneze. Ovim radom uhodane su lako primjenjive metode izolacije pojedinih stadija embrija uročnjaka koje omogućuju izdvajanje velikog broja čistih embrija, oslobođenih od stanica majčinske biljke koje u ovakvom tipu istraživanja predstavljaju kontaminaciju. Uhodan je postupak mikromanipulacije zigotnih embrija, upotrebom invertnog mikroskopa s mikrodisektorom, koji omogućuje izdvajanje nekoliko razvojnih stadija embrija. Na različitim transgeničnim i mutantnim linijama uročnjaka provedena je metoda izolacije dovoljne količine mRNA za analize ekspresije gena u kotiledonarnim embrijima. Metodom reverzne transkripcije mRNA su prepisane u cDNA koja je korištena kao kalup za umnažanje u kvantitativnoj lančanoj reakciji polimeraze (qPCR), te je analizirana relativna ekspresija gena CML41 i FBW2 u kotiledonarnim embrijima. Provedeno istraživanje ukazuje da je za analizu genske ekspresije do 6 gena metodom qPCR potrebno izolirati ukupnu mRNA iz 70-tak kotiledonarnih embrija. Metode izolacije embrija i mRNA provedene u ovom radu pomoći će u planiranju eksperimenata transkriptomske analize embrija u budućim istraživanjima. Gene expression analyses at individual embryonic stages give insight into genetic mechanisms and regulatory networks which enable completion of embryonic development. Due to its precise and predictable pattern of embryogenesis, Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. represents an ideal model plant. Numerous technical difficulties of zygotic embryo isolation at different stages hinder gene expression analyses during embryogenesis. Here, easily applicable methods of A. thaliana embryo isolation were described, enabling separation of a large number of embryos clean from surrounding tissues. A micromanipulation procedure using inverted microscope with microdissector was optimized, enabling isolation of embryos at different developmental stages. Furthermore, a method of mRNA isolation from cotyledonary embryos of different transgenic and mutant lines in quantities sufficient for subsequent gene expression analysis was performed. Using reverse transcription method, equivalent quantities of mRNA were transcribed to cDNA, which was used as template for amplification in quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and relative gene expression levels of CML41 and FBW2 in cotyledonary embryos were analysed. This research shows that total mRNA isolated from 70 cotyledonary embryos is sufficient for quantitative gene expression analysis by qPCR of at least 6 genes. Embrio and mRNA isolation methods performed in this research will help in future planning of embryo transcriptome analyses.

Članovi proteinske porodice MATH-BTB/POZ, koji sudjeluju u degradaciji proteina ovisnoj o ubikvitinu, utječu na odgovor biljke u stresnim uvjetima kroz interakciju s različitim transkripcijskim faktorima. Šest gena (BPM1-6) u uročnjaku (Arabidopsis thaliana L.) kodira za najmanje 16 različitih proteina BPM koji nastaju u procesu alternativnog prekrajanja gena. Novo istraživanje je pokazalo induciranu ekspresiju gena BPM1-3 te različiti intenzitet umnažanja varijanti gena BPM1 tijekom izlaganja biljke povišenoj temperaturi. U ovom radu je istražen učinak temperature na ekspresiju varijanti gena BPM1-3 pomoću lančane reakcije polimerazom. Osim toga nastojalo se ispitati postojanje novih ekspresijskih varijanti koje nastaju pod utjecajem temperaturnih varijacija. U tu svrhu dizajnirane su i optimizirane specifične početnice za umnažanje varijanti gena BPM1-3. Iz klijanaca uročnjaka izloženih različitim temperaturama izolirana je cDNA koja je korištena kao kalup u umnažanju, a fragmenti koji su se umnožili ugrađeni su u vektor pGEM®-T Easy tehnikom TA kloniranja. Kako bi se usporedila sličnost s postojećim varijantama gena BPM1-3, nova varijanta gena je sekvencirana. Potvrđeno je da su genska ekspresija i alternativno prekrajanje gena BPM1-3 inducirani temperaturom. Otkrivena je nova varijanta gena BPM2.6 koja se sintetizira u normalnim uvjetima rasta i u uvjetima povišene temperature. S obzirom na izostanak domene BTB/POZ koja je neophodna za interakciju s kulinom, otkriće ove varijante predstavlja osnovu za daljnja istraživanja u okviru uloga proteina BPM neovisnih o kulinu. Members of MATH-BTB/POZ protein family, which participate in the ubiquitin-dependent protein degradation, affect plant response under stress conditions through the interaction with various transcription factors. Six genes (BPM1-6) in Arabidopsis thaliana L. encode for at least 16 different BPM proteins in the process of alternative gene splicing. A new research has shown an induced expression of BPM1-3 genes and a differential expression of BPM1 gene variants during plant exposure to elevated temperature. Here, effects of temperature on the expression of BPM1-3 gene variants were analyzed by using PCR method. Furthermore, the existence of new splicing variants that could be generated due to temperature variations was examined in this work. For this purpose, gene-specific primers for amplification of BPM1-3 gene variants were designed and optimized. cDNA was generated from A. thaliana seedlings which had been exposed to different temperatures and used in amplification. During this analysis, fragments which have been nonspecifically amplified, were subsequently cloned into a vector pGEM®-T Easy using TA cloning. New variant was sequenced to compare its similarity with known BPM1-3 variants. Temperature-dependent regulation of gene expression and alternative splicing of BPM1-3 genes was confirmed. A new splicing variant BPM2.6 was discovered under normal conditions and conditions of elevated temperature. Due to the absence of BTB/POZ domain which is crucial for interaction with cullin, the discovery of new splicing variant provides the basis for further research regarding cullin-independent roles of BPM proteins.

Proteini BPM sudjeluju u ciljanoj degradaciji proteina putem proteasoma 26S. Tijekom rasta, razvoja i u stresu, u stanici neprekidno dolazi do ciljane degradacije proteina. Pri tome ključnu ulogu ima degradacija transkripcijskih faktora koji su važni regulatori rasta i razvoja. Proteini BPM su adaptori E3 ligazi CUL3 (kulin 3) te svojim vezanjem na transkripcijske faktore sudjeluju u njihovoj ubikvitinaciji i regulaciji degradacije. Dosadašnja istraživanja su pokazala da protein BPM1 iz uročnjaka (Arabidopsis thaliana) lokalizira u jezgri i u citoplazmi transformiranih stanica duhana BY2 te je otkriven C-terminalni bipartitni nuklearni lokalizacijski signal (NLS) proteina BPM1, a u ovome je radu istražena njegova uloga u uročnjaku. U tu svrhu regenerirane su transgenične biljke uročnjaka s pojačanom ekspresijom krnjeg BPM1 proteina (kojem je deletirana C-terminalna NLS regija) fuzioniranog sa zelenim fluorescentnim proteinom (GFP), te biljke s pojačanom ekspresijom nuklearnog lokalizacijskog signala proteina BPM1 fuzioniranog s GFP-om. U transgeničnim biljkama provjerena je prisutnost transgena i njihova ekspresija, a imunodetekcijom je provjerena prisutnost rekombinantnih proteina. Fluorescentnom mikroskopijom je utvrđeno da nuklearni lokalizacijski signal proteina BPM1 fuzioniran s GFP-om (NLSbpm1-GFP) lokalizira u jezgri te da je time zaslužan za smještaj proteina BPM1 u jezgru, što je preduvjet za sudjelovanje proteina BPM1 u različitim staničnim procesima koji se u jezgri odvijaju. Sub-stanična lokalizacija krnjeg proteina BPM1 fuzioniranog s proteinom GFP (delta-3-BPM1-GFP) nije utvrđena. BPM proteins participate in targeted protein degradation via the 26S proteasome. During growth, development and stress in the cell, targeted degradation of the protein occurs continuously. The degradation of transcription factors, which are important regulators of growth and development, plays a key role in this. BPM proteins are adapters of the E3 ligase CUL3 (cullin 3) and by their binding to transcription factors participate in their ubiquitination and regulation of degradation. Studies to date have shown that the Arabidopsis thaliana BPM1 protein localizes to the nucleus and cytoplasm of transformed BY2 tobacco cells, and the C-terminal bipartite nuclear localization signal (NLS) of BPM1 protein was detected. Its role in the Arabidopsis was investigated in this paper. For this purpose, transgenic plants with enhanced expression of truncated BPM1 protein (to which the C-terminal NLS region was deleted) fused with green fluorescent protein (GFP) and plants with enhanced expression of the nuclear localization signal of BPM1 protein fused with GFP were regenerated. In transgenic plants, the presence of transgenes and their expression was checked, and the presence of recombinant proteins was checked by immunodetection. Fluorescence microscopy has determined that the nuclear localization signal of BPM1 fused with GFP (NLSbpm1-GFP) localizes to the nucleus and is thus responsible for the placement of BPM1 in the nucleus, which is a prerequisite for the involvement of BPM1 in various cellular processes in the nucleus place. Sub-cellular localization of truncated BPM1 protein fused with GFP protein (delta-3-BPM1-GFP) has not been established.

BPM proteini vrste A. thaliana usmjeravaju nekoliko transkripcijskih faktora u 26S proteasomsku razgradnju ovisnu o ubikvitinu. U preliminarnom istraživanju, nakon kopurifikacije proteina TAP-tag metodom iz klijanaca uročnjaka, pokazana je interakcija između proteina BPM1 i DMS3, odnosno RDM1, članova puta DNA metilacije usmjerene RNA molekulom (RdDM). U ovom diplomskom radu, interakcije između BPM1, transkripcijskog faktora HB6 te DMS3, odnosno RDM1 proteina, analizirane su metodom kopurifikacije (pull-down), jedan na jedan i jedan na dva. U tu su svrhu prikladni ekspresijski plazmidi konstruirani pomoću ligacije ili In-Fusion metode. Plazmidi su kemijski transformirani u E. coli soj RosettaTM. Nakon indukcije ekspresije gena, fuzijski su proteini pročišćeni afinitetnom kromatografijom i vizualizirani SDS-PAGE metodom, bojanjem proteina u gelu i imunodetekcijom. U ovom diplomskom radu, potvrđena je interakcija između RDM1 i BPM1, te DMS3 i BPM1. Interakcija između HB6 i BPM1-GST nije potvrđena, budući da se protein HB6 vezao i na GST (negativna kontrola). Ovi eksperimenti predstavljaju osnovu za daljnja istraživanja koja bi mogla razriješiti potencijalnu ulogu proteina BPM1 u putu RdDM. BPM proteins in A. thaliana are known to direct several transcription factors to ubiquitinmediated 26S proteasome degradation. Preliminary investigation, after protein copurification by TAP-tag from Arabidopsis seedlings, has shown that BPM1 also potentially interacts with members of the RNA-directed DNA methylation (RdDM) pathway, DMS3 and RDM1. Here, interactions of BPM1 with transcription factor HB6 and proteins DMS3 and RDM1 were analyzed in one to one and one to two pull-down assays. For this purpose, suitable expression plasmids were generated using ligation or In-Fusion cloning methods. RosettaTM E. coli strain was chemically transformed with generated constructs. Protein expression was induced, and fusion proteins were purified. Finally, pull-down assays were performed and proteins visualized by SDS-PAGE, staining and immunodetection. In the conditions carried out here, RDM1 and DMS3 interacted with BPM1. Since HB6 interacted with both BPM1-GST and GST alone (negative control), a direct HB6 interaction could not be shown. These experiments provide a basis for future analyses which could elucidate the potential function of BPM1 in the RdDM pathway.

Proteini BPM sudjeluju u regulaciji nekoliko transkripcijskih faktora kroz ubikvitinsko-proteasomski put. Proteini DMS3 i RDM1 su važne komponente sustava za RNA-posredovanu metilaciju DNA (RdDM). U preliminarnom istraživanju pokazalo se da su DMS3 i RDM1 potencijalni interakcijski partneri proteina BPM1. U ovom radu su istražene interakcije proteina BPM1, DMS3 i RDM1 pomoću bimolekulske fluorescencijske komplementacije (BiFC). Radi provedbe analize BiFC, generirani su prikladni plazmidni konstrukti tehnikom kloniranja In-Fusion. Stanice epiderme duhana Nicotiana benthamiana, epiderme luka Allium cepa i stanice duhana BY-2 transformirane su generiranim plazmidnim konstruktima pomoću agroinfiltracije ili bombardiranjem mikročesticama zlata. Detekcija proteinskih interakcija provedena je fluorescencijskom mikroskopijom. DMS3 i RDM1 su imali interakciju u svim istraživanim stanicama, dok je formacija dimera DMS3 detektirana u epidermalnim stanicama duhana N. benthamiana i luka A. cepa. Interakcija proteina BPM1 i DMS3 je potvrđena u duhanu N. benthamiana i u stanicama BY-2. Interakcija između BPM1 i RDM1 nije detektirana u ovom radu. Potrebna su dodatna istraživanja kako bi se bolje razumjele pojedinosti interakcije između BPM1 i DMS3 te potencijalni utjecaj BPM1 na RdDM. BPM proteins are known to participate in the regulation of several transcription factors via the ubiquitin proteasome pathway. DMS3 and RDM1 proteins are important components of the RNA-directed DNA methylation (RdDM) machinery. In preliminary research, DMS3 and RDM1 were shown to be potential interactors of BPM1. Here, interactions of BPM1, DMS3 and RDM1 proteins were analyzed via bimolecular fluorescence complementation (BiFC). To perform BiFC analysis, suitable plasmid constructs were generated using In-Fusion cloning technique. Nicotiana benthamiana, Allium cepa and BY-2 cells were transiently transformed with the generated constructs via agroinfiltration or microparticle bombardment. Finally, fluorescence microscopy was used to detect and analyze protein interactions. DMS3 and RDM1 interacted in all examined cells, while DMS3 dimer formation was detected in N. benthamiana and A. cepa epidermal cells. Interaction between BPM1 and DMS3 was proved in N. benthamiana leaf epiderm and in tobacco BY-2 cells. By using BiFC, no interaction was detected between BPM1 and RDM1 in this study. Further research is required to better understand the details of interaction between BPM1 and DMS3 proteins and the potential effect of BPM1 on RdDM.

U ovom radu su opisani mehanizmi biosinteze, transporta i konjugacije indol-3-octene kiseline (IAA), kao dominantnog oblika auksina, i njen učinak na razvojne i fiziološke procese, s posebnim osvrtom na spoznaje o detaljima tih procesa kod eksperimentalne biljke Arabidopsis thaliana. Tehnologijom in-fusion sintetiziran je binarni vektor pHOV:AtILL2-GFP, te su metodom floral dip regenerirane transgenične biljke A. thaliana ekotip WS i Col-0 s pojačanom ekspresijom gena AtILL2 i rekombinantnog gena AtILL2-GFP. Lokalizacija fuzijskog proteina AtILL2-GFP, praćena fluorescencijskom mikroskopijom, sugerira endoplazmatski retikulum kao mjesto djelovanja hidrolaze ILL2, što je u skladu s dosadašnjim rezultatima istraživanja. Analizirane su mutante s utišanom ekspresijom gena AtILR1, AtILL2 i AtIAR3, te je metodama PCR-a i elektroforeze izdvojena jednostruka nul mutanta ill2-1 u kojoj je identificirana insercijska mutacija u genu AtILL2 koja uzrokuje pomak u okviru čitanja i sintezu krnjeg, nefunkcionalnog proteina. Metodama PCR-a i sekvenciranja izdvojene su jednostruke mutante ilr1-1 i iar3-2 u kojima je identificirana mutacija Gly224Glu u genu AtIAR3 (mutanta iar3-2) i mutacija Gly139Asp u genu AtILR1 (mutanta ilr1-1) koje uzrokuju potpuni ili djelomični gubitak funkcije hidrolaza ILR1 i IAR3. Kombinacijom PCR-a, elektroforeze i sekvenciranja izdvojena je dvostruka mutanta ill2-1/iar3-2 koja ima mutaciju Gly224Glu u genu AtIAR3 i insercijsku mutaciju u genu AtILL2, i trostruka mutanta ilr1-1/ill2-1/iar3-2 koja ima mutaciju Gly139Asp u genu AtILR1, insercijsku mutaciju u genu AtILL2 i mutaciju Gly224Glu u genu AtIAR3. Mutante dobivene i analizirane u ovom radu dalje će se koristiti za istraživanja metabolizam IAA naročito tijekom izloženosti biljaka abiotskom stresu. Indole acetic acid (IAA) is the most dominant form of the naturally occurring auxin in Arabidopsis thaliana. Here, the mechanisms of biosynthesis, transport and conjugation of IAA in A. thaliana are reviewed, and mutants involved in IAA-aminoacid hydrolyze analyzed and regenerated. Binary vector pHOV:AtILL2-GFP was synthesized by using in-fusion technology, and transgenic A. thaliana plants, ecotypes WS and Col-0, with overexpression of AtILL2 and AtILL2-GFP transgenes were regenerated after floral dip transformation. Localization of protein AtILL2-GFP, tracked by fluorescence microscopy, suggest endoplasmic reticulum as the site of action of hydrolase ILL2. Mutants with reduced expression of AtILR1, AtILL2 and AtIAR3 genes were analyzed. Using PCR and electrophoresis mutant ill2-1 with insertional mutation in gene AtILL2, which causes synthesis of truncated nonfunctional protein, was confirmed. Mutants ilr1-1 and iar3-2 were analysed using PCR and sequencing. The mutations Gly224Glu, and Gly139Asp were confirmed in AtIAR3 (iar3-2 mutant) and AtILR1 gene (ilr1-1 mutant), respectively. The double mutant ill2-1/iar3-2 contained mutation Gly224Glu in gene AtIAR3 and insertional mutation in gene AtILL2, and the triple mutant ilr1-1/ill2-1/iar3-2 contained mutation Gly139Asp in gene AtILR1, insertional mutation in gene AtILL2 and mutation Gly224Glu in gene AtIAR3. All mutants will be used further to investigate IAA metabolism, especially during abiotic stress.

Cilj istraživanja je razvijanje staničnih linija fibroblasta PS120, bez i s proteinom NHERF2, transfeciranih s mutiranim izmjenjivačima Na+ i H+ izooblika 3 (NHE3). Stanice de se u kasnijim funkcionalnim studijama koristiti za istraživanje mehanizama regulacije NHE3 pomodu Ca2+/kalmodulin ovisne kinaze II (CaMK-II). Metodom usmjerene mutageneze mutirana su na sekvenci HANHE3 potencijalna fosforilacijska mjesta za CaMK-II. Sedam mutacija je provedeno na nativnoj sekvenci HANHE3 (pcDNA/TM7-HANHE3), dok se šest mutacija nalazi na krnjoj sekvenci HANHE3 (pcDNA/TM6-d24HANHE3). Krnja sekvenca HANHE3 (d24HANHE3) je mutanta iz koje je uklonjeno vezno mjesto za CaMK-II, segment dug 24 aminokiseline (Leu586-Arg609). Mutirana su slijededa fosforilacijska mjesta: Ser554, Ser562, Ser607, Ser663, Ser693, Ser694 i Ser810. U ekspresijskom vektoru pcDNA/TM7-HANHE3 mutacije su provođene uzastopno, jedna nakon druge, pri čemu su korištene slijedede metode: reakcija PCR, transformacija bakterija mutiranom HANHE3, umnožavanje bakterija u tekudem mediju, izolacija umnoženog plazmida iz bakterija i sekvenciranje. Ekspresijski vektor pcDNA/TM6-d24HANHE3 je konstruiran u dva koraka. U prvom je pomodu krnje sekvence d24HANHE3 konstruirana mutanta pcDNA/TM2-d24HANHE3 unutar koje su mutirani Ser554/Ser562 u Ala554/Ala562. U drugom koraku su najprije restrikcijskom endonukleazom PmaCI pocijepani pcDNA/TM7-HANHE3 i pcDNA/TM2-d24HANHE3 u po dva DNA isječka, duži vektorski dio i kradi umetak. Vektorski dio (f-pcDNA/TM4-HANHE3) izoliran iz pcDNA/TM7-HANHE3 sadržavao je četiri mutacije, dok umetak (fTM2-d24HANHE3) izoliran iz pcDNA/TM2-d24HANHE3 sadržavao dvije mutacije i deleciju veznog mjesta. Zatim je povezivanjem vektora i umetka pomodu ligacije konstruiran ekspresijski vektor pcDNA/TM6-d24HANHE3. Ekspresijski vektori su postupkom transfekcije unijeti u stanične linije fibroblasta PS120 bez i s proteinom NHERF2. Selekcijskim antibiotikom G418 selektirane su uspješno transfecirane stanice, a zakiseljavanjem transfeciranih staničnih linija selektirane su stanice s funkcionalnim mutiranim proteinom NHE3 na površini stanica. Goal of this research was development of PS120 fibroblast cell lines transfected with mutated Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3), with or without NHERF2. Developed cell lines will be used in future studies to examine Ca2+/calmodulin dependent kinase II (CaMK-II) regulation mechanisms of NHE3. Site directed mutagenesis was used on a gene sequence for HANHE3 to develop point mutations on potential phosphorylation sites for CaMK-II. Seven mutations were made on a native HANHE3 sequence (pcDNA/TM7-HANHE3), while six mutations were made on HANHE3 sequence that has 24 amino acids long (Leu586-Arg609) deletion of CaMK-II binding site (d24HANHE3). Mutations were made on following amino acids: Ser554, Ser562, Ser607, Ser663, Ser693, Ser694 and Ser810. Mutations on pcDNA/TM7-HANHE3 where made successively, one after the other, using: PCR reactions, bacterial transformation with mutated sequence, amplifying of bacteria in liquid medium, isolation of amplified product, and sequencing. Construction of pcDNA/TM6-d24HANHE3 was a two-step process. First, mutations Ser554Ala and Ser562Ala were made on d24HANHE3 as a template (pcDNA/TM2-d24HANHE3). Second, both pcDNA/TM7-HANHE3 and pcDNA/TM2-d24HANHE3 were cut using PmaCI restriction enzyme to acquire insert and vector needed for construction of pcDNA/TM6-d24HANHE3. Vector (f-pcDNA/TM4-HANHE3) was isolated from pcDNA/TM7-HANHE3, and it had four mutations, while insert (fTM2-d24HANHE3) was isolated from pcDNA/TM2-d24HANHE3 and had two mutations of CaMK-II potential phosphorylation sites and the deletion of CaMK-II binding site. Then using ligation, vector and insert were connected to form pcDNA/TM6-HANHE3. Mutated plasmids pcDNA/TM7-HANHE3 and pcDNA/TM6-HANHE3 were transfected into PS120 fibroblast cell lines with or without NHERF2. Cells were selected with antibiotic G418 to make sure that transfection was successful. Acid loading of transfected cells was performed to select cells with expression of functional mutated NHE3.

Proteini BPM, kojima je dosada opisana uloga u degradaciji proteina putem ubikvitin proteasoma, ulaze u interakciju s proteinima koji su uključeni u de novo metilaciju DNA uročnjaka Arabidopsis thaliana. Nije poznato utječu li proteini BPM na metiliranost molekule DNA, a kako bi se provjerila potencijalna uloga proteina BPM u metilaciji DNA, koristile su se linije biljaka u kojima je promijenjena ekspresija gena BPM. Analizirala se metiliranost lokusa molekule DNA koji bi mogli biti pod utjecajem de novo metilacije. Analiza metiliranosti DNA provela se enzimatskom digestijom restrikcijskim enzimima koji su ovisni ili osjetljivi na metilaciju DNA, nakon koje je uslijedilo umnažanje istraživanih lokusa lančanom reakcijom polimerazom. Nakon gel elektroforeze i denzitometrijske obrade, te usporedbe rezultata dobivenih za nepocijepanu DNA i DNA pocijepanu metilacijski ovisnim enzimima MspJI i metilacijski osjetljivim enzimima HaeIII ili AluI, utvrdile su se promjene u metiliranosti u biljaka divljeg tipa kao i u biljaka koje različito eksprimiraju gene BPM. Rezultati pokazuju da promijenjene ekspresije gena BPM dovode do promjene u stupnju metiliranosti ponavljajućih sekvenci molekule DNA dok rezultati istraživanja promotorskih regija određenih gena ne daju jasnu sliku promjene obrasca metiliranosti te su potrebna dodatna istraživanja kako bi se to utvrdilo. BPM proteins, which have a known role in protein degradation via the ubiquitin proteasome pathway, interact with proteins involved in de novo DNA methylation in Arabidopsis thaliana. It is still unknown how BPMs effect DNA methylation. To assess the role of BPMs in DNA methylation, different plant mutants with altered expression of BPM genes were used. DNA methylation analysis was performed using the methylation dependent and methylation sensitive restriction enzymes after which the polymerase chain reaction was used to amplify specific, targeted regions of DNA which may be under the influence of de novo methylation. After the gel electrophoresis and densitometric analysis of the amplified undigested DNA and DNA digested with methylation dependant MspJI enzyme and with methylation sensitive HaeIII or AluI enzymes, changes of DNA methylation in wild type, as well in plants with altered BPM gene expression,were determined. Results show that there is a change in methylation pattern in repeating DNA sequences while the results of examined promotor regions of specific genes don't give clear image on how the methylation pattern changes so further research is needed.

Tema ovog rada bila je stvoriti mutirani transmembranski proteinski izmjenjivač Na+/H+ izooblik 3 (NHE3). Postupkom delecije uklonjene su 24 aminokiseline (Leu 586 – Arg609) važne za vezanje pojedinih stimulatora i inhibitora aktivnosti proteina NHE3 koji sudjeluje u održavanju homeostaze pH stanica. Delecija je provedena pomoću lančane reakcije polimerazom (PCR) metodom preklapanja dvaju fragmenta DNA sekvence gena NHE3. Predložak je bio plazmid pcDNA 3.1(+) s prethodno ugrađenom cDNA sekvencom gena HA-NHE3 (pcDNA/HA-NHE3). Uspješnost delecija provjerena je usporedbom dobivenog mutiranog fragmenta AD s kontrolnim fragmentom bez delecije. Fragment AD i plazmid pcDNA/HA-NHE3 tretirani su restrikcijskim enzimom PmaCI koji sekvencu NHE3 cijepa na dva mjesta. Pocijepani plazmid pcDNA/HA-NHE3 i fragment AD spojeni su ligazom i kao rezultat dobiven je plazmid s mutiranom sekvencom gena NHE3, pcDNA/dHA-NHE3. Produkt ligacije transformirao je bakterijske stanice Escherichia coli soja DH5α. Iz izraslih kolonija izoliran je plazmid pcDNA/dHA-NHE3 i pomoću restrikcijskih enzima HindIII i KpnI dokazana je uspješnost ligacije i pravilna orijentacija umetnutog fragmenta AD. Reakcijom PCR dokazana je uspješnost mutacije pomoću negativne početnice koja se veže za deletiran dio unutar gena NHE3. Konačna potvrda postojanja delecije je sekvenciranje dobivenog plazmida. Plazmidom pcDNA/dHA-NHE3 transficirane su stanične linije fibroblasta PS120. Postupkom zakiseljavanja medija dokazana je funkcionalnost proteina NHE3 unatoč mutaciji što bi značilo da unutar sekvence NHE3 postoji više regulacijskih mjesta aktivnosti proteina NHE3, zasebno ili u interakciji. The subject of this thesis was the construction of a mutated transmembrane isoform 3 Na+/H+ protein exchanger (NHE3). 24 amino acids deleted (Leu 586 – Arg609) are crucial for NHE3 protein regulation. The role of this exchanger is maintaining the homeostasis of cellular pH, by certain stimulators or inhibitors. The deletion has been accomplished by standard polymerase chain reaction method (PCR) using fragments of NHE3 sequence with flanking ends. The template for the reaction was pcDNA 3.1(+) plasmid with an inserted HA-NHE3 cDNA sequence (pcDNA/HA-NHE3). The efficacy of the deletion was checked by comparing the mutated fragment AD with control, unmutated fragment. After that, both pcDNA/HA-NHE3 plasmid and fragment AD were treated with PmaCI restriction enzyme having two restriction sites within the NHE3 sequence. Then, using the products of the reaction and treating them with ligase, a plasmid with a mutated NHE3 sequence was constructed, pcDNA/dHA-NHE3. Escherichia coli, DH5μ were transformed with ligation product and pcDNA/dHA-NHE3 plasmid was isolated from transformed colonies. The efficacy of the ligation and the proper orientation of the insert were examend by restriction analysis. The efficacy of the mutation was shown by PCR reaction using an anti-sense primer annealing to the deleted amino acid sequence. The final confirmation of the deletion was the sequencing of the isolated plasmid. A fibroblast PS120 cell line was transformed by pcDNA/dHA-NHE3 plasmid and the functionality of the NHE3 protein was shown by acid loading. The mutated protein was functional, leading to the conclusion that the protein contains several regulation sequences, separate or together.

U prethodnim istraživanjima pripremljene su transgenične linije modelne biljke Arabidopsis thaliana transformirane genima BPM1 (AT5G19000.1) i SerRS (AT5G27470) koji sudjeluju u homeostazi proteina. Protein BPM1 je adaptor ubikvitin ligaze kulin 3 te sudjeluje u procesu obilježavanja proteina koji se razgrađuju putem proteasoma 26S. Protein SerRS je seril-tRNA sintetaza koja sudjeluje u procesu sinteze proteina. Dosadašnja istraživanja ekspresije gena BPM1 i SerRS upućuju na ulogu oba ova proteina tijekom stresa. U ovom radu je funkcionalno okarakterizirana uloga proteina BPM1 i SerRS tijekom solnog i osmotskog stresa, i prilikom izlaganja apscizinskoj kiselini. Istražena je klijavost biljaka te je praćen rast korijena na hranidbenim podlogama uz dodatak 0,1-50 μM apscizinske kiseline, 50-200 mM NaCl, 25-150 mM KCl i 100-500 mM manitola. Pokazano je da pojačana ekspresija proteina BPM1 omogućava bolje klijanje sjemenki transgeničnih biljaka izloženih stresu, u odnosu na biljke divljeg tipa dok pojačana ekspresija proteina SerRS smanjuje klijanje transgeničnih sjemenki. Rast korijena transgeničnih linija prilikom izloženosti stresu nije značajnije varirao u odnosu na biljke divljeg tipa. In previous researches the transgenic lines of the model plant Arabidopsis thaliana had been prepared and transformed with genes BPM1 (AT5G19000.1) and SerRS (AT5G27470) which are part of homeostasis of proteins. The BPM1 protein is adapter for ubiquitin ligase cullin 3 and it participates in the process of marking the proteins for degradation by proteasome 26S. The SerRS protein is seryl-tRNA synthetase which participates in process of protein synthesis. Recent research of BPM1 and SerRS genes expression indicates that these two genes have function during stress. In this thesis the function of BPM1 and SerRS proteins are characterized during salt and osmotic stress, and during exposure to the abscisic acid. Germination of plants has been analyzed and root growth was monitored on nutrient media with addition of 0.1-50 μM abscisic acid, 50-200 mM sodium chloride, 25-150 potassium chloride and 100-500 mM mannitol. It was shown that enhanced expression of BPM1 protein allows increased germination of seeds exposed to stress with regard to wild type plants. Enhanced expression of SerRS protein decreases germination of transgenic seeds. Root growth of transgenic lines did not significantly vary in comparison to wild type plants during stress exposure.

Proteini MAB sadrţe dvije funkcionalno bitne interakcijske domene: MATH i BTB. Do sada je pokazano da su oni dio sustava eliminacije proteina koji stanici više nisu potrebni. Neki od istraženih proteina MAB (CeMEL-26, HsSPOP) dio su multiproteinskih kompleksa kulin 3 E3 ligaza i sluţe za prepoznavanje supstrata koje treba razgraditi. Tijekom razvoja pšenice ekspresija gena TaMAB2 prisutna je samo u oplođenoj jajnoj stanici, u zigoti te u dvostaničnom embriju. U ovom radu napravljena je heterologna ekspresija gena TaMAB2 iz pšenice u uročnjaku. Utvrđeno je da transgenične biljke proizvode cjeloviti protein TaMAB2 koji se u stanicama nakuplja. Sam protein TaMAB2 je ubikvitiniran, te vjerojatno stvara homo- i heterodimere. Rast i razvoj transgeničnih biljaka je značajno fenotipski promijenjen u odnosu na biljke divljeg tipa ali im fototropizam i gravitropizam nisu poremećeni. Analizom unutarstanične lokalizacije proteina TaMAB2 u stanicama BY-2 i pokožici luka utvrđeno je nakupljanje velikih agregata oko jezgrine ovojnice i u blizini stanične membrane. Ovi rezultati ukazuju da bi protein TaMAB2 mogao imati bitnu ulogu u eliminaciji proteina i uspostavljanju polarnosti tijekom rane embriogeneze pšenice. MAB proteins contain two functionally important interaction domains: MATH and BTB. It is known that MAB proteins function as a part of system by which cells eliminate unwanted proteins. Some MAB proteins (CeMEL-26, HsSPOP) are part of cullin 3 E3 ligase enzymatic complex and function as substrate adaptors. In wheat, TaMAB2 gene is specifically expressed only in fertilized egg cell, zygote and two-cell embryo. In this research heterologous expression of TaMAB2 gene in Arabidopsis was induced. High amount of TaMAB2 protein is accumulated inside the cells of transgenic plants. In transgenic plants TaMAB2 is ubiquitinated and probably assembled in homo- and heterodimers. Growth and development of transgenic plants are significantly changed regarding to wild type plants, but transgenic plants have normal phototropism and gravitropism. In BY-2 cells and onion epidermal cells TaMAB2 protein form aggregates that localizes unilaterally around nuclear envelope and near cell membrane. This results indicate on the important role of TaMAB2 in protein elimination and establishment of cell polarity during early embryogenesis of wheat.

Alternativno izrezivanje introna proces je kojim se iz jednog genskog transkripta dobivaju različite izoforme zrele mRNA. Prisutno je u svim višim eukariotima i ima ulogu u funkcionalnom proširenju proteoma, kao i u posttranskripcijskoj regulaciji ekspresije gena. Procesi alternativnog izrezivanja introna u biljaka nisu dovoljno istraženi i tek se očekuju brojna istraživanja na tom području sukladno s razvojem novih metoda detekcije tog procesa. Sekvencioniranje genoma A. thaliana (a i drugih biljnih vrsta u novije vrijeme) omogućilo je nova saznanja o alternativnom izrezivanju introna u biljaka, a uročnjak je biljka koja se najčešće koristi u ovim istraživanjima. U praktičnome dijelu rada navedene su neke hipotetske izoforme proteinskih produkata BPM gena uročnjaka dobivene alternativnim izrezivanjem introna zbog alternativnih donorskih i akceptorskih mjesta. Alternative splicing is a process of producing different isoforms of mature mRNA which originate from a common locus. Alternative splicing is present in all higher eukaryotes and has roles in expanding proteome diversity and post-transcriptional regulation. Alternative splicing in higher plants has not been studied extensively and new studies are anticipated as the new tools to accurately predict and visualize alternative splicing are being developed. Sequencing of the A. thaliana genome (and of other plant species, recently) has provided new information about alternative splicing in higher plants, Arabidopsis being the most commonly used species in these researches. Here, in the practical part of this work, the BPM genes of Arabidopsis are studied and some of the hypothetical isoforms of protein products derived from alternative splicing using the alternative donor and acceptor splice sites are created.

Proteini s proteinskim domenama BTB/POZ su identificirani u mnogih eukariota gdje su im definirane raznolike funkcije. Takvi proteini mogu sadržavati i dodatne domene, kao što je domena MATH. Domene MATH/BTB (BPM) proteinima biljaka Arabidopsis thaliana omogućuju različite proteinske interakcije. Pretpostavlja se da protein AtBPM1 sudjeluje u prepoznavanju supstrata i njegovoj ubikvitinaciji u sklopu ubikvitin ligaza E3 koje sadrže kulin 3 (CUL3). Točna funkcija proteina AtBPM1 nije definirana. Kako bi pridonijeli razumijevanju funkcije proteina AtBPM1, u ovom radu je istražena njegova lokalizacija u transgeničnim biljkama uročnjaka te u transformiranim stanicama duhana BY-2. Kotransformacijom stanica BY-2 metodom Biolistic® utvrđeno je da proteini AtBPM1 i ZmCUL3 kolokaliziraju u citoplazmi, a manjim dijelom u jezgri. Protein AtBPM1 lokalizira najvećim dijelom u jezgrici gdje mu je funkcija najvjerojatnije neovisna o CUL3. Nije utvrđeno postojanje stabilnih homodimera i heterodimera proteina AtBPM1, kao ni ubikvitinacija navedenog proteina. Tretman inhibitorom proteasoma MG132 rezultirao je nakupljanjem proteina AtBPM1 i ZmCUL3, što ukazuje na razgradnju navedenih proteina proteasomima. BTB/POZ proteins are identified in many eukaryotes in which they obtain different functions. Such proteins can have some additional domains, like MATH domain. Those domains enable Arabidopsis thaliana MATH/BTB (BPM) proteins to have different protein-protein interactions. It is assumed that AtBPM1 protein participates in substrate recognition and ubiquitination in CUL3 E3 ubiquitin ligases. The exact function of AtBPM1 protein is not defined. In order to contribute to the knowledge of AtBPM1 protein function, the aim of this study was to investigate its localization in transgenic A. thaliana plants and in transformed tobacco BY-2 cells. Due to Biolistic® transformation of BY-2 cells, it is determined that AtBPM1 and ZmCUL3 proteins co-localize in cytoplasm, and partly in nucleus. AtBPM1 protein localizes to a large extent in nucleolus, where its function is probably independent of CUL3. Stable homodimers or heterodimers and ubiquitinated AtBPM1 protein is not found. Treatment with proteasome inhibitor MG132 lead to accumulation of AtBPM1 and ZmCUL3, what indicates on involvement of proteasome in degradation of examined proteins.

Korovi su neželjeni ali nezaobilazni dio svake proizvodnje. Oni utječu na prirodnu raznolikost i ravnotežu ekosustava, mogu izazvati zdravstvene probleme kod ljudi i životinja, u poljoprivredoj proizvodnji kompetitori su uzgajanim biljkama za svjetlost, prostor i hraniva. S agronomskog aspekta važna je i činjenica da mogu biti domaćini brojnim uzročnicima bolesti kultiviranog bilja. Cilj naših istraživanja bio je utvrditi mikopopulaciju korova u usjevima pšenice, ječma i okopavinskim kulturama. Uzorci su prikupljani tijekom 11 godina (1997.-2008.) na području istočne Hrvatske. Identifikacija gljiva je obavljna standardnim fitopatološkim metodama (morfološke, kulturalne karakteristike i biometrijske vrijednosti reproduktivnih struktura), a tamo gdje je to bilo nužno korištene su i molekularne tehnike (PCR-RFLP i analiza ITS regija). Tijekom rada s 54 korova izolirane su 103 gljivične vrste. Najveći broj gljiva (17) izoliran je s vrste Abutilon theophrasti Med. Neke od izoliranih gljiva su osobito značajne jer uzrokuju važne bolesti kultiviranog bilja. Umjetnim infekcijama dokazano je da pojedini izolati s korova imaju veću patogenost za kultivirano bilje u odnosu na izolate iste vrste dobivene s pšenice, ječma, suncokreta i soje. Proučavanje mikopopulacije korova u istočnoj Hrvatskoj proširilo je spoznaje o bioraznolikosti gljivičnih vrsta na korovima i njihovoj važnosti kao domaćina za uzročnike bolesti.

Učinak zagađenja na razini makromolekula značajan je u područjima najveće ljudske aktivnosti (De Flora i sur.1991, Bihari i sur.2005) i utječe na cjelovitost DNA (Jakšić i sur.2005). Posebno mjesto u tim istraživanjima imaju dagnje koje obitavaju zagađena i nezagađena područja mora (Bihari i sur.2004). Na staništima pod stalnim antropogenim utjecajem, popravak DNA je narušen što uvjetuje promjene u ekspresiji specifičnih gena, poremećaje u staničnom ciklusu i indukciju apoptoze (Mičić i sur.2002). Kod dagnji sa zagađenih staništa utvrđene su promjene u staničnom ciklusu: varijabilnost u veličini genoma, aneuploidija i apoptoza (Bihari i Fafanđel 2004, Bihari i sur.2003).U laboratorijskim uvjetima takve promjene induciraju organokositreni spojevi, herbicidi, aromatski ugljikovodici, polikloriranih bifenili i nitrokvinolini (Mičić i sur. 2004, Fafanđel i sur.2003, Jakšić i Batel 2003). Oštećenja DNA aktiviraju niz proteina čija je uloga usporavanje i blokiranje staničnog ciklusa u kontrolnim točkama zastoja do potpunog popravka. Osnovni principi detekcije i prijenosa signala o oštećenju DNA sačuvani su kod svih organizama (Wahl i Carr 2001). Eliminacija stanica narušenog DNA integriteta procesima apoptoze uključuje tumor supresorske proteine (P53) tj. transaktivatore niza proapoptotskih gena i regulatora progresije staničnog ciklusa. Kod sisavaca se P53 sustav koristi u odgovoru na oštećenja DNA, termički stres i hipoksiju, te neopravdanu progresiju stanica kroz stanični ciklus (Irwin i Kaelin 2001). Oštećenja DNA mogu stabilizirati P53 protein potiskivanjem njegove degradacije fosforilacijom specifičnim mjesta (Ser15), dok se P73 protein stabilizira fosforilacijom na tirozinu. Posljednje spoznaje nam govore da možemo razlikovati tri paralogna gena koji imaju slične funkcije ; P53 je klasičan tumor supresorski gen, dok su P73 i P63 uključeni u njegovu regulaciju (Strano i sur.2001). Jednoznačno je dokazano da poliklorirani bifenili kod nekih školjkaša (Spisula sp.) mogu inducirati promjene u ekspresiji drugih članova P53 gena (Jessen-Eller i sur.2002). Dosadašnja istraživanja članova P53 gena u školjkaša su nedostatna i kontradiktorna: opisane su djelomične sekvence u školjaka Mytilus edulis i Mya arenaria, a te su sekvence sačuvane u dvije funkcionalno važne regije gena (Ciocan i Rotchell 2005). Ne postoje nikakve korelacije između ekspresije pojedinih P53 gena i izlaganja dagnji modelnim genotoksičnim zagađivalima, pa tako niti povećanog oštećenja DNA. Ovaj rad treba dati doprinos razjašnjavanju strukture i funkcije tumor supresorskih gena i njihovih produkata u dagnje Mytilus galloprovincialis, te nove spoznaje u njihovoj regulaciji i ekspresiji.

Trofički status, ontogenetske i sezonske hranidbene navike murine Muraena helena L. (N=79) iz južnog Jadrana (Elafiti i Mljet) su određene uporabom frekvencije pojave, brojčanog postotka mase, te indeksa relativne vlažnosti (IRI). Schoener-ov indeks preklapanja je korišten za usporedbu ishrane po dužinama i sezonama. Uzorci su ulovljeni pridnenim parangalom (dubina 15-40 m). Murina je noćna i teritorijalna vrsta, uobičajeno vreba iz rupa zmijoliko vijugajući kroz pukotine stijena, ispod hridi i koralja ; lovi agresivnim napadom iz zasjede. Sastav raznolike ishrane uključuje najmanje 14 različitih svojti pljena. Nije uočena statistički značajna razlika obzirom na dužinu jedinki. Hrani se ribama, rakovima, glavonošcima, puževima i školjkašima. Osnovne su skupine plijena prema padajućoj važnosti: Pisces (prevladava Phycis phycys, Sparidae (Diplodus sp.), Labrus bimaculatus, opna žumanjčane vreće Mustelus sp., neodređeni poluprobavljeni i probavljeni ostaci, Crustacea (različiti desetonožni rakovi, Galathea sp., Pilumnus hirtellus, Herbstia condyliata, Munida sp., Natantia sp., neodređeni ostaci, Celphalophoda (vjerojatno Octopus vulgaris i Loligo vulgaris ; dosta probavljeno) Gastopoda (Haliotis tuberculata), Bivalvia (možda tek slučajno pojedena ljuštura Lithophaga litophaga) i Polichaeta sp., te Alge sp. Sezonske razlike u ishrani nisu značajne zbog malog broja analiziranih jedinki (obuhvaćeni uzorci iz razdoblja listopad-ožujak). Trofički status plijena murine je 4, 4+-S.E.

Starost i rast cipla plutaša, Oedalechilus labeo (Risso, 1810), je obrađena na 389 jedinki sakupljenih u akvatoriju otoka Visa i Kornata (srednji istočni Jadran) tijekom 2008. Ukupna dužina tijela je bila 2, 2 do 24, 4 cm, masa od 0, 1 do 160, 0 g. Jedanaest starosnih razreda u rasponu od 1 do 11 godina starosti je određeno čitanjem ljusaka. Srednja ukupna dužina tijela po starosnim skupinama je korištena za određivanje parametara rasta prema von Bertalanffy jednadžbi: Linf = 25, 92, K = 0, 192, to = -1, 427. Dužinsko-maseni odnos samo odraslih jedinki (224) je ukazao na pozitivno alometrijski rast riba: W = 0, 0088×L3, 020. Omjer spolova je bio 1:1, 3 u korist ženki.

Utjecaj povišene koncentracije hranjivih soli na razvoj obraštaja i osedravanje istraživan je na Plitvičkim jezerima upotrebom podloga koje otpuštaju nutrijente. Podloge obogaćene nitratima, fosfatima, njihovom kombinacijom i kontrolne podloge eksponirane su tijekom tri tjedna na četiri postaje koje su se razlikovale po intenzitetu osedravanja i brzini strujanja vode. Nitrati i fosfati su uzrokovali jači razvoj autotrofnog perifitonskog matriksa, što je vjerojatno dovelo i do jačeg osedravanja na dijelu tih podloga, budući da alge sudjeluju u zadržavanju i vezivanju kristalića kalcita. Zabilježena je manja bioraznolikost praživotinja i manjih mnogostaničara na obogaćenim podlogama u uvjetima veće brzine strujanja, dok na nižim brzinama nije bilo takvog trenda. Perifitonske zajednice općenito su se više razlikovale između postaja nego između kontrolne podloge i podloga s nutrijentima na istoj postaji. Zaključeno je da iako su nitrati i fosfati limitirajući nutrijenti na Plitvičkim jezerima, taj učinak se samo djelomično kaskadno prenosi u hranidbenoj mreži perifitona.

Bajaši su jedan od ogranaka Romskog naroda, govore rumunjskim jezikom i naseljeni su diljem središnje, istočne i jugoistočne Europe. Kako bi se izučila molekularna arhitektura i podrijetlo bajaške očinske zalihe analizirano je 16 bialelnih i 17 mikrosatelitskih biljega kromosoma Y u uzorku od 151 Bajaša te uspoređeno s postojećim podacima za romske i ne-romske populacije iz Europe, Turske i južne Azije. Otkrivena su dva temeljna sloja bajaške očinske zalihe gena: drevni (indijski) i skorašnji (europski). Niska raznolikost drevnog sloja upućuje na mali broj genetičkih osnivača koji su se odvojili od jedne kaste ili plemena između 8. i 10. stoljeća u Indiji. S druge strane, skorašnjim slojem dominira specifičan skup E1b1b1a nasljednih linija kakve se ne pojavljuju kod niti jedne od balkanskih populacija u kojima je ta haplogrupa inače prisutna. Kod Bajaša je došlo do pojave najmanje dviju privatnih mutacija u razdoblju nakon što su otpočele njihove migracije s juga Balkana prema Rumunjskoj. Prisutnost još nekoliko tipičnih europskih haplogrupa (R1a, R1b1b2, I1, I2a, J2 i G) dodatno svjedoči o mješanju s balkanskim stanovništvom tijekom ranog razdoblja europske romske povijesti. Čimbenici koji su utjecali na uobličavanje današnje romske i bajaške genetičke strukture jesu relativna endogamija i izolacija te naglašeno djelovanje genetičkog drifta u malim i rascjepkanim subpopulacijama kao i nekoliko epizoda toka gena.

Proteini s domenama MATH i BTB (MAB) su od iznimne važnosti u embrionalnom razvoju mnogih vrsta. Upleteni su i u uspostavljanje reda mreže kortikalnih mikrotubularnih niti koje izgrađuju vreteno tijekom stanične diobe. Pored toga, oni su dio kompleksa kulin E3 ligaze, kojoj povećavaju specifičnost prema različitim supstratima i sudjeluju u njihovoj razgradnji. Cilj ovog rada bio je identificirati gene MAB u genomu bundeve C. pepo. Služeći se slijedom gena BPM1 iz vrste A. thaliana, konstruirane su probe za hibridizaciju po Southernu pomoću kojih je dokazana postojanost homolognih gena u vrste C. pepo. Na temelju sličnosti sekvenci gena s MATH i BTB domenama iz različitih biljnih vrsta konstruirane su degenerirane početnice koje su upotrijebljene za umnažanje gena u bundevi. Degeneriranim početnicama na kalupu genomske DNA bundeve umnožene su međugenske razmaknice ribosomalnih gena, dok na kalupu komplementarne DNA embriogenog tkiva bundeve nije bilo moguće umnožiti gene MAB. MATH-BTB domain-containing proteins (MAB) are essentially important in a variety of species during the time of embryogenesis and post-embryonic development. Also, MAB proteins are involved in establishing the order within the cortical microtubule network which builds the spindle during the cell division, and increase the specificity of cullin E3 ligase against different substrates. Because of its importance, the aim of this study was to investigate the existence of genes with the MATH and BTB domains in the C. pepo genome. Using the gene sequence of the BPM1 gene from A. thaliana, the probes for the Southern hybridization were constructed and MAB genes were identified in C. pepo. Based on similarities between different MAB gene sequences, primers were constructed for amplification of homologuos genes in pumpkin. Using genomic DNA as template, intergenic spacers of ribosomal genes were amplified, and using complementary DNA from embriogenic pumpkin tissue as template, no gene was amplified.

Nastavna tehnologija obuhvaća nastavna sredstva, pomagala i postupke u nastavi čije primjereno korištenje djeluje motivirajuće na učenike. Cilj istraživanja je utvrditi koliko, na koji način i koju tehnologiju koriste učitelji u nastavi prirode i društva. Istraživanje je provedeno u prosincu 2008. godine na uzorku od 63 učitelja razredne nastave različitog radnog iskustva. Podaci su prikupljeni korištenjem ankete. Preko 90% ispitanika u nastavi koristi grafoskop i ploču, 27% koristi računala, a 87% televizor. Većina ispitanika smatra da korištenje suvremene tehnologije motivira učenike. Iako malo koriste računalo i nastavi čak 87% koristi ga u pripremi nastavnih materijala. Internet za prikupljanje nastavnih materijala koristi 97% ispitanika. Polovica ispitanika upoznata je s e-learningom, a 75% njih tvrdi da bi koristilo taj način podučavanja. Preko 96% učionica posjeduje video, DVD player i grafoskop dok svega 4% ima računalo i LCD projektor. Njih 54% smatra da im u učionici nedostaje računalo i LCD projektor. Polovica ispitanika tvrdi da dovoljno koristi suvremenu obrazovnu tehnologiju dok oni koji je ne koriste navode kao razlog nedovoljnu opremljenost škola (84%), nepoznavanje suvremene tehnologije (8%) ili daju prednost izvornoj stvarnosti (8 %). Istraživanje je također pokazalo da bi nastavnici više koristili suvremenu tehnologiju kada bi postojalo više primjerenih materijala na hrvatskom jeziku.

Komunikacija nastavnika i studenata uglavnom ovisi o njihovoj volji i raspoloživom vremenu. Trajanje i učestalost konzultacija često se svodi na najmanju moguću mjeru zbog ostalih obveza. Smatramo da se to ne smije događati jer konzultacije pozitivno utječu na uspjeh studenata. Cilj rada bio je pokazati utjecaj konzultacija na uspješnost studenata u svladavanju zadaća iz metodike nastave biologije. Istraživanje je provedeno tijekom akademske godine 2008./09. sa studentima cjelovitog studija nastavničkog smjera kemije i biologije. Tijekom istraživanja praćen je broj konzultacija studenta s mentorom i pripremljenost studenata za konzultacije. Dobivene vrijednosti uspoređene su s uspješnošću pri izvođenju nastavnog sata i rezultatima završnog kolokvija. Zbog uočenih odstupanja u rezultatima završnog kolokvija i uspješnosti u izvođenju nastavnog sata, provedena je anketa o uzrocima postignutih rezultata. Kod većine studenata uočena je pozitivna korelacija između broja konzultacija, njihovog trajanja i kvalitete s uspješnošću u izvođenju nastavnog sata, kao i s rezultatima postignutim na završnom kolokviju. Rezultati istraživanja potvrđuju da je potrebno osigurati dovoljno vremena za konzultacije i poticati kvalitetnu komunikaciju između nastavnika i studenata kako bi se osiguralo kvalitetno obrazovanje.

Tumor supresorski gen NF2 je prvotno opisan uz neurofibromatozu tipa 2 koju karakterizira povećana sklonost razvoju tumora, najčešće središnjeg živčanog sustava. Proteinski produkt ovog gena, merlin, je smješten na mjestu interakcije membrane i citoskeleta te ima ulogu u primanju izvanstaničnih signala, kontroli komunikacije između stanica kao i komunikacije stanica s izvanstaničnim matriksom. Budući da su ovi procesi i općenito važni za proces tumorigeneze i metastaziranja odlučili smo ispitati moguću ulogu gena NF2 u nastanku i napredovanju sporadičnog karcinoma debelog crijeva. U našem istraživanju ispitali smo gubitak heterozigotnosti (LOH) gena NF2 u 130 sporadičnih tumora debelog crijeva. U LOH analizi smo koristili 3 intragenska polimorfna biljega: NF2CAIV, NF2CAV i NF2TET. Učestalost gubitka heterozigotnosti (LOH) gena NF2 bila je 20.8%. Nije utvrđena statistički značajna povezanost gubitka heterozigotnosti gena NF2 sa stupnjem diferenciranosti tumora. NF2 LOH je bio prisutan u 5.9% dobro, 65.2% umjereno, te 38.5% slabo diferenciranih tumora. Također je uočen pozitivni trend između gubitka heterozigotnosti gena NF2 i stadija tumora po Dukesu: NF2 LOH je bio prisutan u 16.0% tumora klasificiranih kao Dukes' A, 26.7% tumora Dukes' B te 37.1% tumora klasificiranih kao Dukes' C. Budući da je gubitak heterozigotnosti gena NF2 bio učestaliji u uznapredovalim, metastatskim tumorima naši bi rezultati mogli upućivati na važnost gena NF2 u procesu nastanka i napredovanja sporadičnih tumora debelog crijeva.

Odabiranje vrućih točaka provedeno je upotrebom multivarijantne i prostorne (GIS) analize za deset pograničnih rijeka s topografskim i hidrološkim slivom u Hrvatskoj i Bosni i Hercegovini. Rijeke su prema morfološkim i hidrološkim karakteristikama podijeljene u segmente koji su analizirani na osnovi 19 definiranih kriterija, podijeljenih u četiri grupe indeksa: indeks bioraznolikosti, indeks prijetnji, okolišni indeks, indeks upravljanja. Vruće točke bioraznolikosti definirane su kao oni segmenti rijeka koji imaju najviši indeks bioraznolikosti, a istovremeno su pod najvećom prijetnjom (indeks prijetnji). Multivarijantne analize su pokazale jasno grupiranje rijeka jadranskog sliva kao grupe s najvišim vrijednostima indeksa bioraznolikosti. Indeks okoliša i upravljanja nisu imali veliki utjecaj na rezultate analiza - indeks okoliša izdvojio je segmente koji su izmijenjeni gradnjom brana i hidroakumulacija, dok je indeks upravljanja izdvojio segmente koji su već pod nekim oblikom zaštite. Provedenim multivarijantnim i prostornim analizama delta Neretve i segmenti Krke i Cetine izdvojeni su kao vruće točke bioraznolikosti. Iako su neke od vrućih točaka bioraznolikosti pod određenim stupnjem zaštite, upravljanje bi u budućnosti trebalo bazirati na interdisciplinarnom principu koji uključuje prioritizaciju zaštite, koordiniranu provedbu planova upravljanja i redoviti monitoring.

Velebitski i Paški kanal čine 40 km dugačak i 4 – 14 km širok sustav koji se pruža paralelno sa sjeveroistočnom obalom Jadrana. Unutrašnji dio Velebitskog kanala nastavlja se na estuarij rijeke Zrmanje dok je vanjski dio sustava povezan s otvorenim morem, pa područje čini trofički gradijent. Uzorci su prikupljeni crpcem i planktonskom mrežom na 7 postaja duž kanala tijekom studenog 2008. Koncentracije nutrijenata bile su niske (0.001 - 0.1 µ ; mol L^-1 ortofosfata, 0.85 - 7.0 µ ; mol L^-1, ukupnog anorganskog dušika, 0.3 - 15.4 µ ; mol L^-1 ortosilikata). Visok Redfieldov omjer (31 – 3180) ukazuje na ograničavajući rast fosforom. Ukupno je određeno 80 taksona mikrofitoplanktona, većinom dijatomeja, s maksimalnom abundancijom od 7.3 x 10^4 stanica L^-1 u oligotrofnom te 9.6 x 10^5 stanica L^-1 u obogaćenom dijelu sustava. Dominantne vrste (abundancija > 10^4 stanica L^-1) bile su Bacteriastrum sp, Chaetoceros sp., C. compressus, C. curvisetus, Leptocylindrus danicus, Nitzschia longissima, Thalassionema nitzschioides, Pseudo-nitzschia spp i nedeterminirani kokolitoforidi. Analiza uzoraka elektronskim mikroskopom pokazala je prisutnost triju potencijalno toksičnih dijatomeja roda Pseudo-nitzschia: P. calliantha, P. cuspidata i P. manii.

Replikatni uzorci (3) sakupljeni su u kolovozu 2002. godine na mikrostaništima različite longitudinalne udaljenosti od sedrene barijere Grabusovog slapa na Mrežnici, smještenog oko 200 m od naselja Sv. Petar Mrežnički. Izmjerene vrijednosti brzina strujanja vode iznosile su od 0, 44 do 1, 205 ms-1. Makrofauna bentosa separirana je i determinirana, a rezultati brojnosti jedinka obrađeni su statistički. U dijelovima staništa sa bržim strujanjem vode, zbog povećane stope prozračivanja u najvećem broju su zastupljeni predstavnici Gastropoda i Diptera, koji sudjeluju u izgradnji sedre. Najgušće su populacije zabilježene nizvodno, a najmanji broj jedinka je zabilježen na samom kataraktu što je posljedica otplavljivanja, te na postaji uzvodno gdje je prisutno ujezerenje. Transverzalno je izraženiji utjecaj prisustva vegetacije, čiji retencijski mehanizmam uz stvaranje utočišta za faunu potvrđuju i Habdija et al. (2004), u odnosu na presudnu ulogu brzine strujanja vode, koju su kao ograničavajući faktor za strukturu zajednica makrofaune bentosa sedrene barijere utvrdli i Miliša et al. (2006).

Virus tristeza (Citrus tristeza virus, CTV, Closteroviridae) replicira se samo u floemu agruma. Virioni su nitasti (2000x11 nm) i imaju najdulji (+)RNA-genom među biljnim virusima (19, 3 kb). Ovisno o virusnom “ soju” , plemci i podlozi agruma, CTV može prouzročiti sindrom propadanja stabla, jamičavosti drva (stem pitting, SP) ili žuticu sjemenjaka. Svaki izaziva velike gubitke, ali postoje i blagi “ sojevi” virusa. Oni mogu biti nezamijećeni jer na nekim kombinacijama plemke i podloge ne uzrokuju nikakve simptome. Takva je i u nas najčešće uzgajana kombinacija mandarine unšiu ili Satsuma na podlozi Poncirus trifoliata. No, blagi “ sojevi” mogu postati jako patogeni ukoliko se prenesu na nove domaćine, u drugo područje ili ako se virusna populacija drastično promijeni npr. zbog evolucijskih uskih grla uslijed prijenosa lisnim ušima ili cijepljenjem. CTV u domaćinskoj biljci postoji kao smjesa biogrupa (“ sojeva” , patotipova) koji su i sami skup varijanti genoma koje se ponašaju kao kvazivrste. „ Sojevi“ se mogu razlikovati cijepljenjem na agrumskim bioindikatorima. Njihove biološke značajke su izgleda povezane s varijabilnošću virusnog gena za kapsidni protein (capsid protein, CP). Na temelju filogenetskih analiza CP-a definirano je 7 skupina. Provodimo opsežno istraživanje povezanosti monofiletskih izolata iz svake od 7 skupina s karakterističnim biološkim značajkama tj. patogenim potencijalom. U slučaju postojanja korelacije, pravi sojevi CTV-a mogli bi se lakše definirati. Izolati CTV-a nađeni u našim agrumima su iznenađujuće raznoliki. Pojedinačna stabla su često inficirana izolatima iz različitih filogenetskih skupina, a u našim mandarinama identificirani su i SP-sojevi za koje se smatralo da nisu prisutni na Mediteranu. Faktori koji oblikuju populacije RNA-virusa važni su i u oblikovanju populacija virusa tristeza, ali suprotno od očekivanoga, patogenost populacije tj. izolata iz jednog stabla ne ovisi nužno o biološkim značajkama najzastupljenije varijante.

Različite vrste svjetlosnih atraktanata koje proizvode umjetno svjetlo izazivaju različite promjene u ponašanju kukaca. Tijekom dvogodišnjeg istraživanja atraktivnosti svjetlosnih atraktanata na komarce, u urbanom području (Osijek) i šumskom području (Kopački rit) utvrđeno je 20 vrsta komaraca. Prilikom uzorkovanja komaraca korištena je klopka za sakupljanje komaraca uz različite vrste svjetlosnih atraktanata (UV svjetiljka 15W, fluorescentna cijev od 40W, fluorescentna cijev od 8W, obična žarulja od 100W, obična žarulja od 25W). Ukupno je determinirano 8207 ženki komaraca. UV svjetiljka 15W pokazala je najbolju atraktivnost u odnosu na ostale atraktante kako na urbanom tako i na šumskom području. Najslabiju atraktivnost pokazala je fluorescentna cijev 40W na gradskom i žarulja od 100 W na šumskom području. U urabnom području na svakom atraktantu pojedinačno zabilježeno je najviše jedinki vrste Aedes vexans. U šumskom području na svakom atraktantu pojedinačno zabilježeno je najviše jedinki vrste Anopheles maculipennis k.

Knjiga sažetaka 10. Hrvatskog biološkog kongresa, održanog od 14. do 20. rujna 2009. u Osijeku. Book of Abstracts of the 10th Croatian Biological Congress, held in Osijek, 14-20 september 2009.

Biljka, tumor i teratom hrena (A lapathifolia Gilib.) koji rastu u uvjetima in vitro, uspoređeni su s obzirom na sastav izvanstaničnih proteina i glikoproteina. Tumor vrata korijena induciran je na fragmentima lista divljim sojem bakterije A. tumefacines. Uspostavljene su dvije linije transformiranog tkiva: neorganizirana tumorska linija (TN) i teratomska linija (TM), koja razvija malformirane izdanke. Izvanstanični proteini lista, TM i TN razdvojeni su SDS-elektroforezom i obojeni (srebrov nitrat i Sypro Ruby). Reakcija glikoproteina s lektinom ConA otkrila je glikoproteine s D-manozom i D-glukozom u glikanskoj komponenti. Daljnja karakterizacija glikana provedena je lektinima: GNA, DSA, PNA, MAA i SNA. Otkriveni su razvojno specifični izvanstanični proteini lista od 26 i 37 kDa. Tkivo TM i TN sadrži specifični protein od 44 kDa dok su 20 i 43 kDa proteini karakteristični za TN. Proteini od 34, 45 i 66.2 kDa su bili prisutni u svim tkiva, a kvantitativno najjače u TN. Glikoproteini od 34, 45 i 66.2 kDa otkriveni lektinom ConA utvrđeni su u listu i TN, dok je glikoprotein od 44 kDa bio prisutan u tkivu TM i TN. Glikoproteini od 20 i 27 kDa bili su prisutni samo u TN, dok je glikoprotein od 26 kDa utvrđen samo u listu. Lektin GNA reagirao je s glikoproteinima od 66.2, 47, 45, 44 i 35 kDa samo u TN. Dobiveni rezultati pokazuju da izvanstanični proteini obje transformirane linije imaju veći stupanj N-glikozilacije, naročito TN linija, u usporedbi s listom hrena.

Tijekom srpnja 2008. godine potvrđeno je postojanje prve sigurne i stabilne populacije ivanjskog rovaša (Ablepharus kitaibelii Bibron & Bory, 1833) na području Parka prirode Papuk (sjeveroistočna Hrvatska). Lokalitet je iznimno značajan jer je izoliran i udaljen više od 130 km od najbliže poznate populacije u Srbiji (Fruška gora) i Mađarskoj (gorje Balaton), a površinom je manji od 2, 5 km2. Ostali lokaliteti ranije spomenuti u literaturi (Donji Miholjac i Ilok) odnose se na neobjavljena osobna opažanja bez fotografija ili muzejskih primjeraka dostupnih autorima. Uzimajući u obzir navedeno, možemo ustvrditi da je populacija ivanjskog rovaša sa Papuka trenutno i jedina takva u Hrvatskoj, dok je postojanje ove vrste na području Donjeg Miholjca i Iloka još potrebno potvrditi. Na temelju vrlo malog područja rasprostranjenja, izrazite izolacije od ostalih poznatih populacija i ustvrđenih ugrožavajućih faktora, predlažemo da se vrsti Ablepharus kitaibelii dodjeli regionalni IUCN status gotovo ugrožen (NT) u Hrvatskoj.

Uspješnost usvajanja bioloških sadržaja prema hijerarhijskim razinama učenja i njihovo zaboravljanje istraživano je testovima provjere znanja u osnovnim školama u Drnju, Hlebinama i Koprivnici. Znanje se provjeravalo tri puta tijekom školske godine. Podaci prikupljeni testiranjima analizirani su s obzirom na spol ispitanika, razred koji ispitanici pohađaju, uspjeh iz nastave prirode, biologije i opći uspjeh te uspješnosti pri rješavanju testova. Rezultati su pokazali da se usvojeni sadržaji zaboravljaju tijekom vremena zbog nemogućnosti pronalaženja informacija. Najviše se zaboravljaju sadržaji koji su se kodirali u dugoročno pamćenje obradom na najnižim razinama i dubinama te da učenje novog gradiva u tekućoj školskoj godini ne utječe na zaboravljanje do tada naučenog. Također se pokazalo da su djevojčice u usvajanju bioloških sadržaja uspješnije od dječaka, a da su učenici uspješniji u usvajanju životno primjenjivih bioloških znanja nego u usvajanju znanja značajnog samo za biologiju.

Hrvatska zbog svoga položaja na prijelazu između kontinentalne i alpske biogeografske regije u mediteransku ujedino čini i južnu granicu distribucije vrste Vipera berus u Zapadnoj i Srednjoj Europi. U Hrvatskoj se mogu razlikovati tri odvojene populacije ove vrste od kojih dvije pripadaju podvrsti V. berus bosniensis a treća podvrsti V. berus berus. Nizinske populacije V. berus bosniensis naseljavaju kontinentalne nizine i doline velikih rijeka (Sava, Drava i Dunav) do 400 m n.m., dok planinske populacije iste podvrste naseljavaju visoko-planinska staništa iznad 1500 m n.m. i poznate su u Hrvatskoj samo sa dva lokaliteta na Dinari i Troglavu. Nominalna podvrsta Vipera berus berus poznata je samo iz područja Gorskog Kotara i naseljava gorska staništa između 900 i 1600 m n.m. U svim populacijama se uz jedinke sa karakterističnim cik-cak uzorkom javljaju i melanistične jedinke, no u vrlo različitom udjelu generalno u populaciji, ali i među spolovima. Visoko-planinske populacije V. berus bosniensis uglavnom karakterizira leđni uzorak sa razlomljenim, poprečno položenim prugama. Na temelju novih podataka prikupljenih u razdoblju 2007.-2009. izrađena je precizna karta rasprostranjenosti, te su iznesene novi argumenti o ugroženosti ove svojte u Hrvatskoj.

Zametne stanice koje omogućuju regeneraciju tkiva, nalaze se u različitim organskim sustavima u tijelu i obično su smještene u dobro zaštićenim dijelovima organa i tkiva. Za zametne stanice kože ili rožnice takva su mjesta u najdubljem sloju epiderme ili u bazalnom dijelu epitela rožnice, njezinog limbalnog područja nazvanog Voightove palisade. Rastuće zanimanje za alo- i ksenotranslantate predmnijeva temeljita istraživanja regeneracijskog potencijala tih stanica, kao i definiranje njihovih osobitosti u in vitro kulturama za presađivanje. Cilj ovog istraživanja bio je vrednovanje osobitosti uzgajanja svinjskih kožnih i limbalnih zametnih stanica u kulturi i optimiziranje uvjeta njihovog uzgajanja radi uspostavljanja pouzdanog biomedicinskog modela pogodnog za istraživanje potencijala alo- i ksenotransplantata podrijetlom od svinjskih tkiva/organa. Nedavno smo uspostavili jednostavnu metodu za uzgajanje svinjskih zametnih epitelnih stanica kože/rožnice dobivenih biopsijom. Uzorci kože i limbalnog područja uzeti su od svinja na liniji klanja. Nakon 5 dana inkubacije primarnih kultura svinjskih keratinocita iz kože/rožnice, utvrdili smo 100%, odnosno 80% uspješnost uzgajanja, sličnu onoj u humanih tkivnih ekvivalenata. Svinjski ekvivalenti zametnih stanica imaju potencijale u reparativnoj/regenerativnoj veterinarskoj medicini za kućne ljubimce, konje i visokoselekcionirane pasmine životinja namijenjenih ljudskoj prehrani, ali također i u ksenotranslantaciji za čovjeka.

U radu su uspoređeni neki biološki parametri srdele Sardina pilchardus (Walbaum, 1972) i srdele goleme Sardinella aurita (Valenciennes, 1847). Analizirano je ukupno 1219 jedinki srdele, te 2033 srdele goleme tijekom razdoblja: ožujak 2004.-siječanj 2009. Svi su uzorci potjecali iz lovina plivarice ostvarenih u obalnom (Virsko more) i otvorenom moru (Dugi otok) zadarskog područja. Uspoređen je reprodukcijski ciklus, te količina masnoće i vode (vlage) u tijelu navedenih vrsta. Raspon vrijednosti totalnih dužina srdele je bio između 13, 0 i 19, 0 cm, a srednja vrijednost je iznosila 16, 0 ? 0, 88 cm. Srdela golema je imala raspon totalnih dužina od 10, 0 do 32, 5 cm sa srednjom vrijednošću od 22, 0 ? 3, 65 cm. Mriješćenje srdele je trajalo od listopada do kraja svibnja, a nakon toga je uslijedilo mriještenje srdele goleme ? od lipnja do početka rujna. Količina masnoće u suhoj tvari se kod srdele kretala od 1, 1% (siječanj) do 41, 1 % (kolovoz), a kod srdele goleme od 1, 61% (srpanj) do 7, 9% (listopad), dok je vode u tijelu srdele bilo od 60, 1% (kolovoz) do 75, 2% (veljača), te kod srdele goleme od 69, 7% (studeni) do 79, 0% (ožujak). Kolebanje masnoće je bilo obrnuto razmjerno kolebanju vode u tijelu i sa sazrijevanjem gonada kod obje vrste. One pripadaju istoj obitelji i dijele ekološku nišu u Jadranskom moru a pokazale su značajno različite količine masnoće i vode u tijelu.

Dnevne vertikalne migracije ličinki eufauzida su istraživane u južnom Jadranu na postaji dubine 1200 m u srpnju 2003. godine. Obavljeno je 19 serija uzorkovanja planktonskom mrežom na zatvaranje finoće tkanja 200  m u različitim dobima dana unutar osam dubinskih slojeva u vremenskom intervalu od 96 sati (152 vertikalna poteza). Od ukupno 11 zabilježenih vrsta po učestalosti nalaza i brojnosti izdvajamo vrste Euphasia krohnii i Stylocherion abbreviatum, te Stylocherion longicorne, Nematoscelis megalops i Stylocherion maximum. Isključivši malobrojne kaliptopise N. megalops, svi razvojni stadiji navedenih vrsta pokazuju velike dubinske raspone raspodjele pojavljivanja: E. krohnii - kaliptopisi 0-800 m, furcilije 0-1200 m ; N. megalops - furcilije 0-1200 m ; S. abbreviatum - kaliptopisi 200-1200 m, furcilije 0-400 m ; S. longicorne - kaliptopisi 100-600 m, furcilije 0-800 m ; S. maximum - kaliptopisi i furcilije 100-1200 m. Izračuni središnje tendencije dubinske distribucije za svaki stadij i vrstu pokazali su da sve ličinke obavljaju opsežne dnevne vertikalne migracije, a najveće su zabilježene za kaliptopise vrsta E. krohni (552 m) i S. longicorne (280 m), a među furcilijama za vrste S. maximum (811 m) i N. megalops (447 m). Naši rezultati su prvi podaci za ličinke eufauzida u Jadranu te predstavljaju znatan doprinos poznavanju sastava i uloge mrežnog zooplanktona u hranidbenoj mreži ovog dubokog oligotrofnog ekosustava.