Search

Ubrzani razvoj analitičkih tehnika u posljednjih nekoliko desetljeća omogućio je temeljito istraživanje procesa N-glikozilacije u brojnim patofioziološkim stanjima, a uočene promjene u mnogima od njih dovele su do strelovitog rasta interesa za glikobiologiju. Promjene u N-glikozilaciji danas se smatraju vrijednim biljezima raznih bolesti, te se njihova specifičnost pokušava iskoristiti u diferencijalne, dijagnostičke i prognostičke svrhe. Prethodne studije pokazale su da je N-glikanski profil plazmatskih proteina promijenjen u šećernoj bolesti tipa 1 (ŠBT1). Jedna od izraženije uočenih promjena bila je ona u zastupljenosti visoko-manoznih glikanskih struktura u plazmatskom N-glikomu. Ove strukture dominantno bi mogle potjecati s komponente komplementa C3, budući da je to glikoprotein s isključivo visoko-manoznim glikanima vezanima na proteinsku okosnicu za kojeg je poznato da doprinosi razvoju ŠBT1 pojačavanjem autoimunih upalnih procesa. Iz tog je razloga u ovom radu razvijena visokoprotočna metoda za analizu N-glikozilacije pojedinih glikozilacijskih mjesta ljudskog C3 proteina upotrebom tekućinske kromatografije spregnute sa spektrometrom masa (LC-MS) temeljena na njegovu obogaćivanju iz plazme pomoću lektinskog afinitetnog medija visokog afiniteta za manozu. Novorazvijenom metodom zatim je analizirana krvna plazma ispitanika novodijagnosticiranih šećernom bolesti tipa 1 i njihove zdrave braće i sestara te su uočene značajne promjene C3 N-glikoma. ŠBT1 povezana je s porastom manje procesuiranih struktura s više manoznih podjedinica na oba N-glikozilacijska mjesta. Nadalje, C3 N-glikozilacija je analizirana u odrasloj populaciji ispitanika s različitim stupnjem najčešćih komplikacija ŠBT1 – retinopatije i albuminurije. Pokazano je da se C3 N-glikom značajno mijenja u teškoj albuminuriji u ŠBT1, no da je neovisan o trajanju bolesti. Retinopatija je pak dovela do promjene samo jedne glikoforme, dok su svi osim jednog C3 glikopeptida značajno povezani s razinama hemoglobina A1c (HbA1c). Predstavljene spoznaje ukazuju na uključenost N-glikozilacije i C3 komponente komplementa u patofiziologiju šećerne bolesti tipa 1 te upućuju na značaj C3 N-glikoma kao potencijalnog dijagnostičkog i prognostičkog biljega ove bolesti i njoj pridruženih komplikacija. Rapid development of analytical techniques in the last few decades has enabled a thorough investigation of the N-glycosylation process in numerous pathophysiological conditions, and the observed changes in many of them have led to a rapid growth of interest in the field of glycobiology. Changes in N-glycosylation are now considered valuable biomarkers of various diseases, and their specificity is being exploited for differential, diagnostic and prognostic purposes. Previous studies have shown that the N-glycan profile of plasma proteins is altered in type 1 diabetes (T1D). One of the more pronounced changes observed was in he abundance of high-mannose glycans in the plasma N-glycome. These structures could predominantly originate from the complement component C3, a glycoprotein with exclusively high-mannose glycans attached to its protein backbone, which is known to contribute to the development of T1D by enhancing autoimmune inflammatory processes. For this reason, a high-throughput method for the site-specific N-glycosylation analysis of human C3 protein was developed in this study using liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC-MS), based on its enrichment from plasma using lectin affinity matrix. The newly developed method was then used to analyze blood plasma of subjects newly diagnosed with type 1 diabetes and their healthy siblings, and significant changes in C3 N-glycome were observed. T1D was associated with an increase in less processed structures with more mannose subunits at both C3 N-glycosylation sites. Furthermore, C3 N-glycosylation was analyzed in the adult population of T1D subjects with different degrees of the most common complications of T1D – retinopathy and albuminuria. It was shown that C3 N-glycome significantly changes in severe albuminuria in T1D, but is independent of disease duration. Retinopathy led to a change in only one glycoform, while all but one C3 glycopeptide was significantly associated with levels of hemoglobin A1c (HbA1c). The findings presented indicate the involvement of N-glycosylation and the C3 complement component in the pathophysiology of type 1 diabetes and indicate the importance of C3 N-glycome as a potential diagnostic and prognostic biomarker of this disease and its associated complications.

Loratadin je antihistaminik, koji prema biofarmaceutskom klasifikacijskom sustavu spada u skupinu lijekova slabe topljivosti. Međutim njegova topljivost, ali i stabilnost može se poboljšati stvaranjem inkluzijskih kompleksa s ciklodekstrinima. Stabilnost lijekova od velike je važnosti u farmaceutskoj industriji jer utječe na njihovu sigurnost i učinkovitost. Forsiranom razgradnjom dobivaju se informacije o stabilnosti lijeka i razgradnim produktima koji nastaju. U ovom radu istražen je utjecaj β-ciklodekstrina na stabilnost loratadina. Postotak razgradnje loratadina određen je tekućinskom kromatografijom ultra visoke djelotvornosti. Uzorci s uočenim potencijalnim razgradnim produktima analizirani su vezanim sustavom tekućinske kromatografije i spektrometrije masa visokog razlučivanja. Na temelju MS i MS/MS spektara predložene su strukture razgradnih produkata. Loratadine is antihistamine that is categorized in Biopharmaceutics Classification System as a poorly soluble drug. However, its solubility and stability can be improved by formation of inclusion complexes with cyclodextrins. The stability of drugs is of great importance in the pharmaceutical industry because it affects their safety and efficacy. Forced degradation provides information on stability of drugs and resulting degradation products. In this work effect of β-cyclodextrin on stability of loratadine was studied. Ultra-high performance liquid chromatography was used to determine the percentage of degradation in each sample. Liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometer was used on selected samples. Structures of degradants and fragmentation pathways were proposed based on obtained results.

abezioza i dilatacijska kardiomiopatija važne su bolesti koje se nalaze u pasa, ali i ljudi. Jedna je od najčešćih komplikacija kod babezioze pasa uzrokovane protozoonom Babesia canis akutna ozljeda bubrega. Drugi je po učestalosti uzrok zatajenja srca u pasa idiopatska dilatacijska kardiomiopatija (iDCM) koja rezultira zatajenjem srca ili iznenadnom srčanom smrću zbog nastanaka aritmije. Svrha je istraživanja bila otkriti promjene u metabolomu seruma i urina pasa s promijenjenom funkcijom bubrega kod babezioze, te u metabolomu plazme pasa s iDCM-om u odnosu na zdrave pse. U istraživanju su primijenjeni neciljani i ciljani metabolomski pristup upotrebom tekućinske kromatografije spregnute sa spektrometrijom masa te metabolomska analiza temeljena na plinskoj kromatografiji spregnutoj sa spektrometrijom masa. U metabolomu seruma i urina pasa s babeziozom otkrivene su promjene povezane s oksidacijskim stresom, upalnim odgovorom domaćina, hipoksijom, anemijom i energetskim metabolizmom. U istraživanju iDCM-a identificirane su promjene u metabolomu plazme pasa i poremećaji u metaboličkim putevima koji su uključeni u razvoj iDCM-a. Babesiosis and dilated cardiomyopathy are important diseases in dogs and humans. Acute kidney injury is one of the most common complications in canine babesiosis caused with protozoa Babesia canis. The second most common cause of heart failure in dogs is idiopathic dilated cardiomyopathy (iDCM), which results in heart failure or sudden cardiac death due to arrhythmia. This study aimed to determine changes in the serum and urine metabolome of dogs with renal failure in babesiosis, and in the plasma metabolome of dogs with iDCM compared to healthy dogs. In this study, we applied an untargeted and targeted metabolomics approach using liquid chromatography coupled to mass spectrometry and gas chromatography coupled to mass spectrometry-based metabolomics. In the serum and urine samples of dogs with babesiosis were found differences associated with oxidative stress, inflammatory host response, hypoxia, anemia, and energy metabolism. We discovered changes in canine plasma metabolome and metabolic pathway disorders involved in the development of iDCM.

N-glikozilacija, proces enzimski posredovanog vezanja šećernih struktura na asparaginske ostatke proteina, istraživana je u brojnim bolestima, u mnogima od kojih su promjene i potvrđene. Pronalazak specifičnih promjena N-glikozilacije nudi mogućnost razvoja predikcijskih, dijagnostičkih i prognostičkih alata potrebnih u sprječavanju i liječenju različitih bolesti. Studije ukupne N-glikozilacije proteina plazme provedene u istraživanju predispozicije za šećernu bolest tipa 2, kao i istraživanju šećerne bolesti zrele dobi kod mladih osoba (MODY), identificirale su promjene u glikozilaciji za koje se vjeruje da potječu s alfa-1-kiseloga glikoproteina (AGP). S ciljem detaljnijeg istraživanja ovih promjena, razvijena je metoda za visokoprotočnu analizu N-glikozilacije AGP-a koja uključuje obogaćenje ovog proteina te analizu njegovih glikopeptida metodom tekućinske kromatografije spregnute sa spektometrijom masa (LC-MS). Inicijalnom analizom 14 zdravih ispitanika utvrđena je temporalna stabilnost Nglikoma AGP-a, kao općeniti preduvjet za dijagnostičku upotrebu. Novorazvijenom metodom zatim je analizirana glikozilacija AGP-a 108 ispitanika koji se razlikuju po svojoj predispoziciji za razvoj šećerne bolesti tipa 2 te je utvrđena povezanost porasta grananja i smanjenja sijalinizacije glikana AGP-a s povećanim rizikom od razvoja šećerne bolesti tipa 2. Nadalje, kod 466 pacijenata oboljelih od različitih tipova šećerne bolesti (HNF1A-, HNF4AMODY, šećerna bolesti tipa 1 i tipa 2) analizom fukozilacije AGP-a ustanovljeno je njezino smanjenje koje je pokazano specifično za HNF1A-MODY. Nadalje, analizom uzoraka 98 pacijenata oboljelih od šećerne bolesti ranog nastupa bez autoimunosne podloge, pokazano je da je smanjena fukozilacija prisutna samo kod pacijenata s oštećujućim HNF1A mutacijama – sržnim uzrokom bolesti. Također, pokazana je visoka uspješnost identifikacije HNF1A-MODY pacijenata na temelju individualnih glikopeptida AGP-a. Prikupljene spoznaje upućuju na mogućnost upotrebe glikozilacije AGP-a kao predikcijskog biljega za šećernu bolest tipa 2, kao i biljega identifikacije pacijenata oboljelih od HNF1A-MODY-a što bi dalo velik doprinos pravovremenom prepoznavanju rizika kao i diferencijalnoj dijagnostici šećerne bolesti. N-glycosylation, the process of enzymatically mediated binding of sugar structures to proteins' asparagine residues, has been investigated in a number of diseases, in many of which the changes have been confirmed. The discovery of specific N-glycosylation changes offers a possibility for development of prediction, diagnostic and prognostic tools needed in the prevention and treatment of various diseases. Studies of total plasma protein N-glycosylation performed in type 2 diabetes predisposition research, as well as in the research of maturity-onset diabetes of the young (MODY), identified changes in glycosylation believed to originate from alpha-1-acid glycoprotein (AGP). In order to investigate these changes in more detail, a method for high-throughput AGP N-glycosylation analysis was developed. The method is based on enrichment of AGP and analysis of its glycopeptides by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS). Initial analysis performed on 14 healthy subjects confirmed the temporal stability of AGP N-glycome, as a general prerequisite for diagnostic use. The newly developed method was then used to analyze AGP glycosylation in 108 subjects differing in their predisposition for type 2 diabetes development. The results confirmed an association of increased branching and decreased sialylation of AGP glycans with an increased risk of type 2 diabetes development. Analysis of samples from 466 patients diagnosed with different types of diabetes (HNF1A-, HNF4A-MODY, type 1 and type 2 diabetes) revealed a reduction in AGP fucosylation, which was shown to be specific for HNF1A-MODY. Furthermore, analysis of samples from 98 patients with early-onset non-autoimmune diabetes showed that decreased fucosylation was present only in patients carrying damaging HNF1A mutations - the core cause of the disease. Also, high success rate of identification of HNF1A-MODY patients based on individual AGP glycopeptides was demonstrated. The findings suggest the possibility of utilizing AGP glycosylation as a predictor of type 2 diabetes, as well as a marker for identification of HNF1A-MODY patients. This would present a valuable contribution to timely risk identification and differential diagnosis of diabetes.

Pimavanserin je atipični antipsihotik koji se koristi za liječenje halucinacija i deluzija povezanih s Parkinsonovom bolesti. Budući da se radi o relativno novom lijeku na tržištu, dostupan je ograničeni broj farmakokinetičkih podataka i analitičkih metoda. Doktorski rad opisuje razvoj kromatografske metode ultravisoke djelotvornosti za istovremeno određivanje pimavanserina i njegova četiri procesna onečišćenja. Metoda je razvijena primjenom načela „analitičke kvalitete osigurane dizajnom“ (AQbD). Kao kritične značajke metode (CMA) odabrani su: faktor kapaciteta onečišćenja A, vrijeme trajanja analize koje je definirano vremenom zadržavanja onečišćenja D kao posljednje eluirajuće komponente, kritično razlučivanje između onečišćenja B i C, faktor simetrije i broj teorijskih odsječaka. Procjena rizika u ranoj fazi razvoja metode ukazala je na kritične parametre metode (CMP): temperaturu kolone, vrijeme trajanja gradijenta i pH-vrijednost pokretne faze (vodena komponenta, A). Procjena utjecaja odabranih kritičnih parametra metode (CMP) na definirane kritične značajke metode (CMA) te određivanje radnog područja analitičke metode (MODR) provedeno je primjenom dizajna eksperimenata (DoE) pomoću softvera DryLab. Na temelju procjene rizika te rezultata ispitivanja robusnosti i preciznosti predložena je strategija kontrole metode s definiranim kriterijima prikladnosti sustava. Razvijena metoda je validirana prema ICH Q2 (R1) smjernicama ispitivanjem sljedećih izvedbenih karakteristika: specifičnost, granica detekcije, granica kvantifikacije, linearnost, preciznost, točnost, robusnost i stabilnost. Studija prisilne razgradnje provedena je sa svrhom utvrđivanja stabilitetno-indikativnih svojstava razvijene analitičke metode. Produkti prisilne razgradnje pimavanserina identificirani su pomoću tekućinske kromatografije ultravisoke djelotvornosti vezane sa spektrometrijom masa visoke razlučivosti (UHPLC-QTOF). Dodatno, provedena je in silico evaluacija potencijalnih produkata razgradnje upotrebom komercijalnog softvera Zeneth® pri čemu je postignuto dobro podudaranje s eksperimentalno identificiranim razgradnim produktima. Glavni razgradni produkti nastali su kao rezultat kisele i bazne hidrolize (m/z 223, 16 [M+H]+ na RRT 0, 37) i u uvjetima oksidativnog stresa (m/z 444, 26 [M+H]+ na RRT 0, 57). Rezultati su pokazali da se pimavanserin razgrađuje hidrolizom ureje u kiselim i bazičnim uvjetima i N-oksidacijom alifatskog tercijarnog amina. Ispitane su i validirane visokoosjetljive analitičke metode koje omogućavaju kvantitativno određivanje niskih koncentracija potencijalno genotoksičnih onečišćenja pimavanserina upotrebom tekućinske kromatografije ultravisoke djelotvornosti i plinske kromatografije vezane sa spektrometrijom masa. Primjenjene analitičke metode omogućavaju kvantitativno određivanje potencijalno genotoksičnih onečišćenja pri prihvatljivim koncentracijama specifičnim za svaki spoj (temeljem praga toksikološke zabrinutosti). Validacijom metoda potvrđena je njihova prikladnost, potvrđivanjem specifičnosti, linearnosti, ponovljivosti, točnosti i robusnosti. Dodatno je ispitana i validirana metoda za kvantifikaciju elementnih onečišćenja pimavanserin ljekovite djelatne tvari primjenom vezanog sustava spektrometrije masa s induktivno spregnutom plazmom (ICP-MS). Jaki oksidacijski uvjeti tijekom pripreme uzorka uzrokovali su probleme pri određivanju tragova osmija. Osmij u prisutnosti dušične kiseline stvara jako hlapljiv i iznimno otrovan plin osmijev tetraoksid. Kako bi se to izbjeglo i osiguralo da je primjenjena metoda sigurna za analitičara, razvijena je prikladna metoda pripreme uzorka dodatkom tioureje za stabilizaciju osmija koja je uspješno validirana prema USP smjernicama.

Cinarizin je piperazinski derivat koji djeluje kao antihistaminik. Uglavnom se koristi za liječenje posljedica Meniereove bolesti (endolimfatični hidrops) i nekih drugih poremećaja vestibularnog sustava srednjeg uha, ali i za prevenciju i liječenje kinetoza. Budući da je slabo topljiv u vodi, cinarizin se prema biofarmaceutskom sustavu klasifikacije djelatnih tvari svrstava u lijekove skupine II. Već je ranije utvrđeno da se topljivost i bioraspoloživost cinarzina moţe poboljšati kompleksiranjem s ciklodekstrinima, no inkluzijski kompleksi cinarizina s ciklodekstrinima korištenjem spektrometrije masa do sada nisu proučavani. U sklopu ovog diplomskog rada spektrometrijom masa je detaljno proučeno kompleksiranje cinarizina prirodnim β-ciklodekstrinom kao i njegovim hidroksipropiliranim sintetskim derivatom, 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrinom. Stabilnost izoliranih odabranih iona kompleksa cinarizina i ciklodekstrina u plinskoj fazi procijenjena je na temelju rezultata eksperimenata tandemne spektrometrije masa koji su provedeni tehnikom kolizijom izazvane disocijacije. Predložene su odgovarajuće sheme fragmentiranja te su konstruirani grafovi ovisnosti relativne zastupljenosti iona kompleksa o primijenjenom kolizijskom potencijalu. Cinnarizine is a piperazine derivative with antihistaminic properties. It is widely used for the treatment of Meniere’s disease (endolymphatic hydrops) and a variety of other vestibular disorders but for prevention and treatment of kinetosis as well. Due to its poor aqueous solubility, cinnarizine is categorized as a class II compound according to the Biopharmaceutical Classification System. Earlier studies have shown that its solubility and bioavailability can be improved by complexation with cyclodextrins but inclusion complexes of cinnarizine with cyclodextrins have not yet been characterized by mass spectrometry. The complexation of cinnarizine by natural β-cyclodextrin and its hydroxypropylated derivative, 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin was extensively studied by mass spectrometry in this thesis. The stability of selected complex ions in the gas phase was estimated by means of tandem mass spectrometry analysis which was performed by collision-induced dissociation technique. Corresponding fragmentation schemes were suggested and collision-energy breakdown curves were constructed as well.

Zbog sve veće potražnje za biljnim dodacima prehrani, kao i biljnim lijekovima, porastao je i broj njihovih ilegalnih, neodobrenih te zabranjenih sastojaka, kao što su inhibitori fosforodiesteraze tipa 5 (PDE-5), anabolički steroidi te hipoglikemična i antihipertenzivna sredstva. Interakcija s drugim lijekovima te prekomjerna i nepravilna upotreba mogu uzrokovati nuspojave kao što su srčani ili moždani udar, halucinacije, tahikardija, povraćanje, grčevi i uzrujanost. Praćenjem proizvodnje i razvoja biljnih pripravaka žele se zaštiti zdravlje i sigurnost potrošača. Neke od metoda koje se koriste u kontroli kvalitete ovih proizvoda su tekućinska kromatografija-spektrometrija masa (LC-MS) i plinska kromatografija-spektrometrija masa (GC-MS). Ovaj rad će se pobliže dotaknuti same tehnike spektrometrije masa (MS) kao i njene primjene u analizi biljnih pripravaka s ciljem pronalaska ilegalnih farmaceutski aktivnih tvari. Due to the high demand for botanical dietary supplements and herbal remedies, there is an increase in illegal, unapproved and prohibited ingredients such as phosphodiesterase type 5 (PDE-5) inhibitors, anabolic steroids, hypoglycemic and antihypertensive agents adulterated within these products. Interaction with other medications, overuse and misuse can lead to serious side effects, such as heart attack, hallucinations, tachycardia, vomiting, convulsions, agitation and seizures. Monitoring the development of these products will ensure the health and safety of consumers. Some of the analytical techniques used for the aforementioned monitoring are liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) and gas chromatography-mass spectrometry (GC–MS). This thesis will address mass spectrometry (MS) and its application in the analysis of botanical dietary supplements and herbal remedies in order to detect illegal pharmaceutical adulterants.

Inkluzijski kompleksi, nastali uslijed nekovalentnih interakcija između molekule domaćina i molekule gosta, rješenje su problema slabo topljivih lijekova. Kompleksiranje lijeka, zarobljenog u hidrofobnoj šupljini molekule domaćina, poboljšava njegova fizikalno-kemijska svojstva poput topljivosti i biodostupnosti. β-ciklodekstrin i njegov nasumično metilirani derivat izabrani su kao molekule domaćini, dok je molekula gost loratadin, lijek korišten u liječenju alergijskih poremećaja. Nastali inkluzijski kompleksi, također i spojevi koji ih grade, analizirani su hibridnim spektrometrom masa s kvadrupolom i analizatorom vremena leta. Tandemna spektrometrija masa provedena je nad izabranim ionima te je na temelju dobivenih rezultata predložen fragmentacijski put analiziranih spojeva. Korištena ionizacijska tehnika je elektroraspršenje, a spektri masa snimljeni su u pozitivnom i negativnom načinu snimanja. Inclusion complexes, formed by noncovalent interactions between host molecule and guest molecule, are the solution of the problem of poorly soluble drugs. Encapsulation of the drugs in the hidrophobic cavity of the host molecule improves its physico-chemical properties, such as solubility and bioavailability. β-cyclodextrin and its randomly methylated derivative were selected as host molecules, while the guest molecule was the drug loratadine, used in the treatment of allergic disorders. Inclusion complexes, as well as the coumpounds that form them, were analyzed by a hibrid mass spectrometer with a quadrupole and a time-of-flight analyzer. Tandem mass spectrometry was performed on the selected ions and the fragmentation pathway of the analyzed compounds was proposed based on the obtained results. Electrospray was used as the ionization technique, and the mass spectra were recorded in positive and negative mode.

Bakar je esencijalni element koji se nalazi u aktivnim mjestima enzima neophodnih za normalno funkcioniranje ljudskog organizma te je stoga važno pratiti njegovu koncentraciju. Analitičke metode kojima se bakar određuje su spektrofotometrija, spektrometrija masa te atomska apsorpcijska spektroskopija (AAS), a upravo je AAS preporučena metoda za njegovo određivanje. Cilj ovog istraživanja bio je usporediti UV-VIS spektrofotometrijsku metodu i spektrometriju masa (ICP-MS) za određivanje koncentracija bakra u biološkom uzorku. Obje su metode uspoređene s obzirom na parametre validacije i postupak pripreme uzorak te su primijenjene za analizu koncentracija bakra u uzorcima humane plazme. Uzorci humane plazme dobiveni su od dobrovoljnih zdravih i bolesnih darivatelja s bolestima štitne žlijezde (n = 28). Svi prikupljeni rezultati statistički su obrađeni, a dobiveni rezultati za koncentracije bakra u humanoj plazmi UV-VIS spektrofotometrijskom i ICP-MS metodom su uspoređeni upotrebom Spearmanove korelacije i Passing-Bablok regresijske analize (p < 0,05). Ispitivanje validacije sa standardima bakra (500 – 5000 μg/L za spektrofotometrijsku metodu i 5,0 – 150,0 μg/L za ICP-MS) pokazalo je da su obje metode linearne i precizne te da imaju zadovoljavajući limit detekcije (LOD) i kvantifikacije (LOQ). Također pokazano je da priprema uzoraka za obje metode nije zahtjevna, iako je priprema uzoraka za spektrofotometrijsko određivanje koncentracija bakra podložnija mogućim interferencijama. Vrijednosti koncentracija bakra izmjerene UV-VIS spektrofotometrijskom i ICP-MS metodom su se razlikovale (raspon vrijednosti: 575,54 – 4352,54 μg/L za spektrofotometrijsku metodu i 165,01 – 1064,02 μg/L za ICP-MS) što je potvrdila i statistička obrada koja je pokazala da nema korelacije u rezultatima dobivenim dvjema metodama. Vrijednosti koncentracija bakra izmjerene spektrofotometrijskom metodom bile su u referentnom intervalu, dok su vrijednosti izmjerene ICP-MS metodom bile niže od referentnog intervala. Mogući razlog nižih vrijednosti koncentracija bakra izmjerenih ICP-MS metodom je nepotpuno razaranje uzorka i njegova ionizacija, a što se treba ispitati u daljnjim istraživanjima. Copper is essential element found in active sites of enzymes necessary for normal function of human organism. Because of low concentrations in organism, it is important to keep track of copper concentrations. Analytical methods used for copper concentration measurement are spectrophotometry, mass spectrometry and atomic absorption spectroscopy (AAS), from which later is recommended method for copper measurement. The aim of this study was to compare UV-Vis spectrophotometry and mass spectrometry (ICP-MS) as methods for measurement of copper in biological samples. Both methods were compared with validation parameters as well as sample preparation process and were used to measure copper concentrations in human plasma samples. Samples were collected from voluntary healthy subjects and subjects with diagnosed thyroid gland diseases (n = 28). All results were statisticaly processed with Spearman correlation and Passing-Bablok regression analysis (p < 0,05). Validation testing with copper standards (500 – 5000 μg/L for spectrophotometric method and 5,0 – 150,0 μg/L for ICP-MS) showed that both methods are linear in given range of concentrations, precise and that they have satisfactory limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ). Sample preparation process for both methods is not challenging, although sample preparation for spectrophotometry is more susceptible to possible interferences. Copper concentration values were different (value range: 575,54 μg/L – 4352,54 μg/L for spectrophotometry and 165,01 – 1064,02 μg/L for ICP-MS) which was also confirmed by statistical analysis which showed there is no correlation between values measured by both methods. Values obtained by spectrophotometry were in reference range of values of copper in serum, while values measured with ICP-MS were lower than reference range. Most probable cause of lower values of copper concentrations obtained by ICP-MS is unproper sample preparation and its ionisation that should be investigated in further research.

svrhu pronalaska potencijalnih markera za rano otkrivanje neuroloških poremećaja provedena je karakterizacija cijaninskih boja, kao i analiza njihovog vezanja s proteinom IbpA te nisu pronađeni uvjeti i radni parametri pogodni za vezanje. Okarakteriziran je i tripeptid fenilalanil-fenilalanil-alanin (FFA) te je ispitivan utjecaj biološke matrice odnosno, pokazano je da se FFA s Cu2+ veže u molarnim omjerima 1:1 i 2:1 dok su za kompleks FFA-Zn2+ ti omjeri: 1:1, 2:1, 3:1, 4:1. Analiza sastava metala cerebrospinalnog likvora ukazuje na to da su smanjene vrijednosti ukupnog željeza potencijalni indikator demijelinizirajućih bolesti. Spektrometrija masa (MS) odabrana je kao metoda za karakterizaciju potencijalnih markera neuroloških poremećaja i analizu sastava metala cerebrospinalnog likvora s obzirom da se primjenom raznih MS tehnika može brzo i efikasno okarakterizirati veliki broj različitih analita. Spektrometrija masa uz ionizaciju elektroraspršenjem (ESI-MS) odabrana je za karakterizaciju cijaninskih boja i tripeptida FFA, dok je analiza udjela metala u cerebrospinalnom likvoru provedena spektrometrijom masa uz induktivno spregnutu plazmu (ICP-MS). In order to find potential markers for early detection of neurological disorders, cyanine dyes were characterized. Suitable conditions and operating parameters for analysis of cyanine dye-IbpA protein interactions were not found. Also, tripeptide phenylalanine-phenylalanine-alanine (FFA) was characterized and analysis of the influence of biological matrix shows that FFA binds to Cu2+ in molar ratios: 1:1 and 2:1, while these ratios for complex FFA-Zn2+ are: 1:1, 2:1, 3:1 and 4:1. Furthermore, analysis of total metal concentrations in cerebrospinal fluid (CSF) shows that lower concentrations of iron can be an indicator for demyelinating diseases. Mass spectrometry (MS) is selected as a method for the characterization of potential markers for neurological disorders and analysis of selected metals in CSF, because different MS techniques are suitable for the fast and efficient characterization of a large number of analytes. Cyanine dyes and tripeptide FFA were characterized by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). The content of metals in CSF was analysed by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS).

Pretilost, upala, inzulinska rezistencija, hiperglikemija, dislipidemija i hipertenzija značajni su čimbenici rizika za kardiovaskularni morbiditet i mortalitet. Nedavno otkriven razred hidroksiestera masnih kiselina (engl. Fatty acid esters of hydroxy fatty acids, FAHFA) djeluje protuupalno, inzulinsenzitizirajuće i hipoglikemizantno, a razina im je snižena u inzulin-rezistentnih pojedinaca. Cilj istraživanja je detaljno kvalificirati i kvantificirati FAHFA u hrani biljnog porijekla, budući da je do sada istražen njihov djelomičan sastav samo u jabuci, brokuli, jajetu, piletini i govedini. Analizirano je 20 namirnica iz svakodnevne prehrane te jelovnika za metaboličku optimizaciju. U analizi je primijenjena nova tehnika: ionizacija u negativnom načinu rada spektrometra masa na nanoLC-ESIMS hifeniranom sustavu uz primjenu postkolumnog modifikatora. Obuhvaćeno je 16 FAHFA, izmjerene su nanogramske količine uz značajnu varijabilnost među namirnicama. Najviše koncentracije nađene su u zobi. U hrani s metaboličkim benefitima SAHSA (engl. Stearic acid hydroxystearic acid) je bila najzastupljenija FAHFA, dok PAHSA (engl. Palmitic acid hydroxystearic acid), jedine prethodno istraživane u antihiperglikemijskom i inzulin-senzitizirajućem smislu, u nekim vrstama hrane uopće nema. Ovo je istraživanje, uz razvoj novih analitičkih metoda, dovelo do novih spoznaja o FAHFA sastavu hrane te ukazalo na važnost otkrivanja istog u što većem broju namirnica. Cilj je u budućnosti hranu bogatiju FAHFA inkorporirati u jelovnike za metaboličku optimizaciju te pronaći adekvatne nosače FAHFA, kako bi se ciljne namirnice mogle njima obogaćivati. Obesity, inflammation, insulin resistance, dyslipidemia, hyperglycemia and hypertension are risk factors for cardiovascular morbidity and mortality. Recently discovered fatty acids (Fatty acid esters of hydroxy fatty acids, FAHFA) provide antiinflammatory, insulin-sensitizing and glucose-lowering effect, and show a decreased level in insulin-resistant individuals. Aim of this study was a detailed qualitative and quantitative analysis of FAHFA in plant foods, as to date only partial analyses in apple, broccoli, egg, chicken and beef are performed. In this study, 20 plant foods from everyday meals and diet plans for metabolic normalization were analysed. Analysis included a new technique: negative ionization mode of nanoLC-ESI-mass spectrometry system and postcolumn modifier addition. 16 FAHFA were analysed (hydroxyesters of palmitic, oleic, palmitoleic and stearic acids). Nanogram levels were detected, showing a significant interfood variability. Highest concentrations were found in oat. In foods with metabolic benefits, SAHSA (stearic acid hydroxystearic acid) was the most abundant FAHFA, whereas PAHSA (palmitic acid hydroxystearic acid), the only FAHFA previously investigated in anti-hyperglycemic and insulin-sensitizing manner, showed no presence in some foods. This study, along with development of new analytic methods, provided new knowledge about FAHFA composition of foods and emphasized the importance of further research in extended number of foods. Future aims are to enable incorporation of FAHFA-rich foods into diet plans targeting metabolic control, and to find adequate FAHFA carriers that could enable food enrichment.

Citosolske raspodjele nekoliko odabranih elemenata (Cd, Co, Cu, Fe, Mn, Mo, Pb, Se i Zn) u jetrima i ńkrgama dvaju slatkovodnih bioindikatorskih organizama, klena (Squalius cephalus) iz rijeke Sutle u Hrvatskoj i vardarskog klena (Squalius vardarensis) iz triju rijeka sjeveroistoĉne Sjeverne Makedonije, izuĉavane su primjenom tekućinske kromatografije visoke djelotvornosti s iskljuĉenjem po veliĉini (SEC-HPLC) i spektrometrije masa visoke rezolucije s induktivno spregnutom plazmom (HR ICP-MS). OdreĊene su raspodjele metala/nemetala meĊu citosolskim biomolekulama razliĉitih molekulskih masa svojstvene uvjetima niske izloņenosti metalima u rijeĉnoj vodi, kao i promjene u raspodjelama koje su javljaju kao posljedica povińenih razina izloņenosti. Primjena anionsko izmjenjivaĉke kromatografije (AEC-HPLC) kao drugog stupnja razdvajanja i proĉińćavanja citosolskih biomolekula te dviju tehnika spektrometrije masa (MALDI-TOF-MS i LC-MS/MS) omogućila je identifikaciju ili precizno odreĊivanje molekulskih masa nekoliko citosolskih biomolekula koje veņu metale u jetrima i ńkrgama vardarskog klena, poput izoformi metalotioneina koje veņu Cd, Cu i Zn, hemoglobinskih podjedinica koje veņu Fe te toplinski stabilnih biomolekula koje veņu Mo. Primijenjeni analitiĉki pristup pokazao se korisnim u istraņivanju unutarstaniĉne sudbine i ponańanja metala u organima riba te otkrivanju potencijalnih novih biomarkera izloņenosti i uĉinaka metala. The cytosolic distributions of several selected elements (Cd, Co, Cu, Fe, Mn, Mo, Pb, Se, and Zn) in the liver and gills of two freshwater bioindicators, European chub (Squalius cephalus) from the Sutla River in Croatia and Vardar chub (Squalius vardarensis) from three rivers of north-eastern Macedonia, were studied using size-exclusion high performance liquid chromatography (SEC-HPLC) and high resolution inductively coupled plasma mass spectrometry (HR ICP-MS). Distributions of metals/non-metal among the biomolecules of different molecular masses which are characteristic for low metal exposure in the river water were determined, as well as the changes in distribution which occur as a consequence of increased exposure to metals. The use of anion-exchange high performance liquid chromatography (AEC-HPLC) as the second step of separation and purification of cytosolic biomolecules, as well as the use of two mass spectrometry techniques (MALDI-TOF-MS and LC-MS/MS) have enabled the identification or exact determination of molecular masses of several cytosolic biomolecules that bind metals in the liver and gills of Vardar chub, such as the metallothionein isoforms that bind Cd, Cu and Zn, the hemoglobin subunits that bind Fe and heat stable biomolecules that bind Mo. Applied analytical approach has proven to be useful in the study of intracellular fate and behavior of metals in organs of fish, as well as in the process of discovery of potential new biomarkers of metal exposure and effects.

Reakcijom srebrova(I) nitrata i derivata dijodpiridina (2,5-I2py, 3,5-I2py, 2,6-I2py) u množinskom omjeru 1 : 2 u vodeno-alkoholnom mediju pripravljena su tri nova kompleksa opće formule [Ag(NO3)(I2py)2]. Dobiveni spojevi identificirani su elementnom analizom, a njihova struktura u otopini okarakterizirana je spektrometrijom masa i spektroskopijom NMR. Od 1D tehnika NMR korištene su 1H i 13C ATP, a od 2D homonuklearni 1H-1H COSY te heteronuklearni 1H-13C HMQC i 1H-13C/15N HMBC. U čvrstom stanju, kompleksi su okarakterizirani spektroskopijom IR zračenja. Kristalna i molekulska struktura kompleksa [Ag(NO3)(2,5–I2py)2] određena je i rentgenskom strukturnom analizom. Dobiveni rezultati ukazuju na vezanje srebrovog(I) iona s dvama ligandima preko nesparenog elektronskog para atoma dušika piridinskog prstena. Rentgenska strukturna analiza monokristala spoja [Ag(NO3)(2,5–I2py)2] otkriva da su pored kovalentnih veza (Ag– Npy, Ag–O, Ag–I), u strukturu kristala uključene i nekovalentne halogenske interakcije (O···I–C) koje pridonose stvaranju polimerne strukture spoja., Three novel 1:2 complexes of general formula [Ag(NO3)(I2py)2] were prepared in water-alcohol solution by reaction of silver (I) nitrate with diiodopyridine derivatives (2,5-I2py, 3,5-I2py, 2,6-I2py). All prepared compounds were identified by elemental analysis. Their structure in solution were characterized by mass spectrometry and NMR spectroscopy (1H, 13C ATP, 1H-1H COSY, 1H-13C HMQC, 1H-13C/15N HMBC). In solid state, the complexes were characterized by IR spectroscopy. The crystal and molecular structure of the [Ag(NO3)(2,5–I2py)2] complex was revealed by single crystal X-ray analysis. The obtained results confirmed the binding of silver(I) ion with two ligands via the lone electron pair of nitrogen atoms of the pyridine ring. X-ray structural analysis of [Ag(NO3)(2,5-I2py)2] reveals that beside covalent bonds (Ag–Npy, Ag–O, Ag–I), supramolecular halogen interactions are also present in its crystal structure (O···I–C). Halogen interactions contribute to the final dimensionality by forming polymeric structure of the compound.

U ovom radu provedena je detaljna masenospektrometrijska analiza kompleksnih spojeva galij(III) i aromatskih hidrazona pripravljenih iz nikotinohidrazida i salicilaldehida, odnosno 2-hidroksi-3-metoksi-, 2-hidroksi-4-metoksi- i 2-hidroksi-5-metoksibenzaldehida u sustavu otapala metanol/voda. Kao ionizacija korišteno je elektroraspršenje, a kao analizator masa trostruki kvadrupol. Analizirane su otopine kompleksa prireĎene na dva načina: (i) miješanjem otopina galijeva(III) perklorata i navedenih aromatskih hidrazona pri čemu je variran molarni omjer metala i liganda od 1:1 do 1:4 te (ii) otapanjem čvrstih kompleksnih spojeva galija i aromatskih hidrazona. Spektri masa su u slučaju (i) snimljeni odmah po pripravi otopina i nakon 24 sata. TakoĎer je ispitan utjecaj dodatka perklorne i klorovodične kiseline na intenzitet signala u spektrima masa. Snimljeni su i MS/MS spektri odabranih iona, a na temelju rezultata tandemne spektrometrije masa predložene su odgovarajuće sheme fragmentiranja. In this thesis a detailed mass spectrometric analysis of gallium(III) complexes with aromatic hydrazones derived from nicotinic acid hydrazides and salicylaldehyde, namely 2-hydroxy-3- methoxy-, 2-hydroxy-4-methoxy- and 2-hydroxy-5-methoxybenzaldehyde in methanol/water system was performed. Electrospray was used for ionization, and triplequadrupole as mass analyzer. The solutions of complexes were prepared in two different ways: (i) by mixing solutions of gallium(III) perchlorate and aromatic hydrazones in different molar ratio from 1:1 to 1:4 and (ii) by dissolving solid complexes of gallium(III) and hydrazones. In case of (i) MS spectra were recorded immediately after the preparation of solutions and after 24 hours. The addition of perchloric or hydrochloric acid on signals intensities in mass spectra were examined as well. MS/MS spectra of selected ions were acquired and corresponding fragmentation schemes were proposed.

U ovome radu provedena je detaljna karakterizacija kompleksnih spojeva lantanoida (lantana, iterbija i europija) i aromatskih hidrazona izvedenih iz nikotinske kiseline i salicilaldehida te različito supstituiranih benzaldehida (2-hidroksi-3-metoksi- i 2-hidroksi-4-metoksibenzaldehid) u sustavu otapala metanol:voda 1:1 te u acetonitrilu. Spektri masa snimljeni su uz ionizaciju elektroraspršenjem u pozitivnom načinu rada. Ispitan je utjecaj otapala (metanola i acetonitrila) na ionizaciju kompleksa iterbija i aroilhidrazona. Također je praćena ovisnost intenziteta signala kompleksa s euoropijem o vremenu. Provedena je tandemna spektrometrija masa na odabranim ionima te su na temelju dobivenih rezultata predložene sheme fragmentiranja kompleksnih spojeva. In this work, a detailed characterization of complexes of lanthanides (lanthanum, ytterbium and europium) and aroylhydrazones derived from nicotinic acid and salicylaldehyde, and differently substitued benzaldehydes (2-hydroxy-3-metoxy- and 2-hydroxy-4-metoxybenzaldehyde) in a solvent system methanol:water 1:1 and in acetonitrile was performed. Electrospray in positive ion mode was used for ionization. The influence of solvent (methanol and acetonitrile) on ionization of ytterbium complexes with aroylhidrazone was investigated. Furthermore, the dependance of signal intensity of europium complex on time was monitored. Tandem mass spectrometry was performed on selected ions, and based on the obtained results, complex fragmentation schemes were proposed.

Aromatski hidrazoni izvedeni iz nikotinohidrazida i različito supstituiranih aldehida dobro vežu ione meta, uključujući katione lantanoida. Spektrofotometrijskim titracijama određene su konstante vezanja aromatskih hidrazona (Slika 1) i odabranih kationa lantanoida (lantana, europija, gadolinija i iterbija), a metodom kontinuirane varijacije sastavi kompleksnih spojeva [1, 2]. Utvrđeno je da stabilni kompleksi trenutačno nastaju s derivatima N'-saliciliden-3- piridinkarbohidrazidom (1) i N'-(2-hidroksi-4- metoksifenilmetiliden)-3-piridin-karbohidrazidom (3). Apsorpcijski spektar kompleksa s N'-(2- hidroksi-3-metoksifenil-metiliden)-3- piridinkarbohidrazidom (2) mijenjao se tijekom vremena te je pretpostavljeno da kompleks koji prvobitno nastaje podliježe dodatnoj ravnoteži. Kako bi se dobio detaljniji uvid u vezanje lantanoida aromatskim hidrazonima, u ovom radu nastajanje kompleksnih spojeva praćeno je tehnikom spektrometrije masa. Spektri masa otopina lantanoida i aromatskih hidrazona sastava 1:1 snimljeni su uz ionizaciju elektroraspršenjem u pozitivnom načinu rada (ESI+ MS) neposredno po pripravi otopina. Obzirom da je za komplekse lantanoida sa spojem 2 uočena promjena u UV-Vis spektrima tijekom vremena, spektri masa otopine europija(III) i 3-metoksi derivata snimljeni su i nakon 5 dana. Istražen je utjecaj otapala na intenzitete signala kompleksnih iona u spektru masa te su kao otapala korišteni acetonitril i smjesa metanola i vode omjera 1:1. Za sve navedene sustave provedena je i analiza tandemnom spektrometrijom masa. Na temelju MS/MS spektara iona kompleksa predložene su odgovarajuće sheme fragmentiranja i uspoređene s fragmentiranjem samih liganada [3].

Tehnikom spektrometrije masa uz ionizaciju elektroraspršenjem analizirana su vezna svojstva sedam različitih kaliks[4]arenskih te kaliks[6]arenskih derivata s odabranim kationima lantanoida (La3+, Eu3+, Yb3+). Kompleksiranje izostaje u slučaju esterskih derivata kaliksarena bez obzira na veličinu kaliksarenske šupljine, dok amidni derivati sa svim kationima lantanoida grade stabilne 1:1 komplekse. Provedena je tandemna spektrometrija masa na odabranim ionima kaliksarena i kompleksnih spojeva, predložene su odgovarajuće sheme fragmentiranja te je procijenjena stabilnosti derivata kaliksarena i njihovih kompleksnih spojeva u plinskoj fazi. Pri fragmentiranju izoliranih iona kaliksarenskih derivata i njihovih kompleksnih spojeva uočeno je heterolitičko (induktivno) i homolitičko cijepanje veza. Disocijacija kompleksnih spojeva nije uočena. Analize su provedene na dva različita instrumenta, trostrukom kvadrupolu i ionskoj stupici te su uspoređeni rezultati dobiveni uz različite analizatore masa. Binding properties of seven different calix[4]arenes and calix[6]arenes with selected lanthanide cations (La3+, Eu3+, Yb3+) were investigated by electrospray ionization mass spectrometry. Complexation was not observed in the case of ester calixarene derivatives, regardless of the size of the calixarene cavity, while amide derivatives formed stable 1:1 complexes with all lanthanide cations. Tandem mass spectrometry analysis of the selected calixarene and complex ions was performed, corresponding fragmentation schemes and stability estimation of calixarene derivatives and their complex compounds in the gas phase were suggested. During the fragmentation of the isolated ions of the calixarenes and their complex compounds, heterolytic (inductive) bond cleavage and homolytic bond cleavage were observed. Dissociation of the complex compounds was not observed. The analyses were performed by using two different instruments, triple quadrupole and quadrupole ion trap, and comparisons of the results obtained with different mass analyzers were made.

U okviru provedenih istraživanja osmišljen je i pripravljen novi reagens za derivatizaciju karbonilnih spojeva, hidrazino-derivat glutaminske kiseline, koji je upotrebljen za određivanje karbonilnih spojeva LC-MS/MS metodom. Istraživanje je obuhvatilo i njegovu karakterizaciju spektroskopskim i spektrometrijskim metodama. Reakcijom hidrazino-derivata glutaminske kiseline i odabranih karbonilnih spojeva dobiveni su Glu-hidrazoni, koji su prema potrebi reducirani u Glu-hidrazide. Nastali produkti su izolirani te okarakterizirani spektroskopskim i spektrometrijskim metodama. U doktorskom radu istražene su fragmentacijske reakcije nastalih hidrazona i hidrazida u MS/MS eksperimentima kako bi se identificirali specifični ioni produkti koji su upotrijebljeni za razvoj LC-MS/MS metode. Istraženi su i optimirani reakcijski uvjeti koji su osigurali kvantitativnost derivatizacijske reakcije. Za usporedbu, sintetizirani su i okarakterizirani produkti odabranih karbonilnih spojeva s najčešće korištenim reagensom za derivatizaciju karbonilnih spojeva, 2,4 dinitrofenilhidrazinom. The scope of the study included the design and preparation of a glutamic acid-related hydrazine reagent as new reagent for the derivatization of carbonyl compounds for LC-MS/MS analysis and its characterization by spectroscopic and spectrometric methods. Reaction of the glutamic acid-related hydrazine reagent and the selected carbonyls resulted in the corresponding Glu-hydrazones which were optionally reduced to Glu-hydrazides. The formed products were isolated and characterized by spectroscopic and spectrometric methods. Fragmentation patterns of prepared hydrazones and hydrazides in MS/MS experiments were also investigated for the identification of “marker ions”, used for the development of LC-MS/MS method. The optimization of reaction conditions was performed to provide a quantitative derivatization. For comparison purposes, products of selected carbonyls with the most exploited derivatization reagent 2,4-dinitrophenylhydrazine, were also synthesized and characterized.

Lišmanioze su u mnogim krajevima svijeta postale zaboravljene tropske bolesti, no ponajviše klimatske promjene uzrokuju širenje bolesti na nova područja gdje do sada nisu bile zabilježene. Uzročnici ovih bolesti su različite vrste bičaša iz roda Leishmania, a prenose ih različite vrste sitnih insekata, koji se u Hrvatskoj zovu papatači. Težina bolesti varira od subkliničkih do vrlo teških oblika, a vrlo rijetko invazije mogu završiti i smrtno. Psi su rezervoari uzročnika, a ljudi slučajne žrtve. Zbog toga je važno je pravovremeno dijagnosticirati bolest i liječiti invadirane životinje. Imajući na umu navedeno, kvantitativni proteomski pristup visoke rezolucije primijenjen je za profiliranje proteoma seruma pasa. Razvijena je metoda spektrometrije masa temeljena na podatkovno neovisnoj akviziciji (DIA) te testirana na kliničkim arhivskim uzorcimaseruma kontrolne skupine (zdravih) i bolesnih pasa (kojima je serološkim metodama dijagnosticirana lišmanioza). Nova metoda DIA je brza, jednostavna i osjetljivija te omogućuje identifikaciju potencijalnih biomarkera lišmanioze u pasa. Leishmaniasis is one of the most dangerous neglected tropical diseases which has (re)- emerged in many geographic regions, mostly due to climatic changes. It is caused by protozoan parasites of the genus Leishmania, transmitted by the bite of a female phlebotomine sandfly. The severity of disease may vary from non-symptomatic to fatal. Infected dogs are the main reservoir for human infection. Due to its zoonotic potential, it is very important to diagnose the disease, and treat infected animals. Whithin this aim, the high-resolution quantitative proteomic approach has been employed for canine serum proteome profiling. The mass spectrometry (MS) method based on data independent acquisition (DIA) was developed and tested using clinical samples - serum of healthy and Leishmania-infected dogs. The new DIA MS method is simple, fast and more sensitive, and provides a detailed insight into canine serum proteome, enabling the identification of potential biomarkers for canine leismaniasis

Crijevna mikrobiota čovjeka se sastoji od velikog broja mikroorganizama te se njihova disbioza povezuje s mnoštvom bolesti. Identifikacija tih mikroorganizama je vrlo važna kako bi se bolje rzumjela veza između bolesti i crijevne mikrobiote. Metaproteomika koja se definira kao identifikacija svih proteina iz mikrobne zajednice nekog uzorka pruža informacije o vrsti mikroorganizma. Zasniva se na digestiji proteina, sekvencioniranju peptida tandemnom spektrometrijom masa i pretragom baza podataka. Cilj ovog rada je bio usporediti utjecaj metoda za izolaciju proteina i utjecaj spekrometra masa te pretražnog programa na taksonomsku kompoziciju crijevne mikrobiote. Rezultati su uspoređeni s literaturnim podacima i s genomskom analizom. Najviše proteina i bakterijskih vrsta je određeno koristeći 4% SDS i B-PER u kombinaciji s ultrazvukom kada se analiza provodila na spektrometru masa ESI-Q-TOF i kada je korišten novorazvijeni bioinformatički program temeljen na LSI. Metagenomska analiza je rezultirala manjim brojem bakterija Bacteroidetes nego metaproteomika te se podudarala s rezultatima metaproteomike u koljenima Firmicutes i Proteobacteria. Human intestinal microbial consists of a large number of microorganisms and their dysbiosis is associated with a great number of diseases. Identification of these microorganisms is very important in order to better interrupt the connection between the disease and the intestinal microbiota. Metaproteomics, which is defined as the identification of all proteins from a sample, provides information on the species of microorganisms. The worklow consists of digestion of proteins, sequencing of the peptides by tandem mass spectrometry and database searching. The aim of this study was to compare the effect of the protein isolation method and the influence of the mass spectrometer and the bioinformatic tool on the taxonomic composition of the intestinal microbiote. The results were compared with literary data and genomic analysis. The biggest number of bacterial species was determined using 4% SDS and B-PER in combination with sonification when analyzed on ESI-Q-TOF mass spectrometer and when a newly-developed bioinformatic LSI tool was used. Metagenomic analysis resulted in a smaller number of bacteria from phyilia Bacteroidetes than metaproteomics but it had similar results in phylia Firmicutes and Proteobacteria.

Spektrometrijom masa analizirani su aroilhidrazoni 1–12, te kompleksi spojeva 6 i 7 sa željezom(III). Osnovni signal u MS spektru hidrazona pripisan je protoniranoj molekuli ([M+H]+). Osim iona karakterističnih za dio koji potječe od hidrazida nikotinske kiseline, u spektrima masa hidrazona 2– 12 uočeni su i signali iona koji nastaju gubitkom 122 Da (– C5H4NCONH2) pri čemu naboj ostaoje na dijelu molekule koji potječe od aldehida ili ketona. Na temelju različitih intenziteta signala u MS/MS spektrima hidrazona razlikovani su pojedini strukturni izomere. Spoj 6 u plinskoj fazi stabilniji je u keto obliku (–NHCH=C–C=O), dok je ravnoteža spoja 7 pomaknuta prema enolnom obliku (–N=CH–C–C–OH). Strukturni izomeri određeni su na temelju fragmentacije fragmentnog iona m/z 150. Primjenom tandemne spektrometrije masa i uslijed "ortho efekta" također je bilo moguće razlikovati strukturne izomere 3–5 (spojeve s hidroksilnim skupinama smještenim u orto, meta i para položaju na fenilnom prstenu) te izomere 8 i 9 (spojeve s atomima klora u orto i para položaju u odnosu na hidroksilnu skupinu). Tijekom fragmentacije spoja 11 s nitro skupinom na fenilnom prstenu uočeno je homolitičko pucanje veza i nastajanje kationskog radikala. U spektrima masa kompleksa spojeva 6 i 7 sa željezom(III) uočeni su signali jednostruko nabijenih iona [Fe(L)]+ visokih intenziteta u kojem je ligand dvostruko deprotoniran, kao i signali dvostruko nabijenih iona [Fe(HL)]2+ niskih intenziteta. Ma temelju MS/MS spektara navedenih iona predložene su odgovarajuće sheme fragmentiranja.

S obzirom na činjenicu da je nešto više od četvrtine Europljana u dobi od 15 do 64 godine tijekom života probalo nezakonite droge, zlouporaba droga predstavlja ozbiljan javnozdravstveni problem. Jedna od metoda prevencije ovisnosti o drogama je rano otkrivanje zlouporabe droga analizom bioloških uzoraka. Za provjeru uzimanja droga razvijen je niz brzih, relativno jeftinih testova za analizu droga u urinu, kojima se razlikuju negativni od vjerojatno pozitivnih nalaza. Preporučeni analitički protokol zahtijeva potvrdu svih pozitivnih nalaza specifičnom i osjetljivom tehnikom plinske kromatografije uz spektrometar masa kao detektor (GC/MS). Sustav GC/MS još uvijek predstavlja zlatni standard u analizi droga jer omogućuje nedvojbenu potvrdu strukture droge koju dokazujemo. Kosa kao biološki uzorak ima prednost u usporedbi s urinom, najčešće korištenim uzorkom za analizu droga. Za razliku od analize urina čiji rezultati ukazuju na konzumiranje droga uglavnom dva do četiri dana prije uzorkovanja urina, analiza pramena kose proširuje mogućnost detekcije droge na mjesece unatrag, ovisno o duljini kose. U Institutu za medicinska istraživanja i medicinu rada u Zagrebu dugi se niz godina analiziraju uzorci kose navedenom tehnikom radi utvrđivanja prisutnosti droga i njihovih metabolita: morfina, kodeina, heroina, 6-acetilmorfina (specifičnog metabolita heroina), metadona, kokaina, te amfetamina, metamfetamina, 3, 4-metilendioksiamfetamina (MDA), 3, 4-metilendioksimetamfetamina (MDMA – ecstasy) i 3, 4-metilendioksietilamfetamina (MDEA). U razdoblju 1999. – 2018. u našem je laboratoriju analizirano više od 1600 uzoraka kose. Rezultati analize bili su pozitivni na prisutnost jedne ili više droga u 22 % uzoraka, a najčešće detektirana droga u kosi bila je ecstasy. Analiza droga u kosi sve se češće primjenjuje u sudskoj praksi, prometnoj medicini, toksikologiji, te prilikom prijave na različita radna mjesta.

Reakcijom razrijeđene octene kiseline i para- nitrofenilhidrazina s para-metoksiacetofenonom, odnosno s para-nitrobenzaldehidom u molarnom omjeru 1 : 1 priređena su dva nova derivata hidrazina, C13H10N4O4 i C15H15N3O3. Pripravljeni spojevi identificirani su pomoću elementne analize, dok je njihova struktura u otopini okarakterizirana 1D i 2D tehnikama spektroskopije NMR (1H, 13C, 15N). Reakcijom srebrova(I) nitrata s pripravljenim ligandima istražen je utjecaj različitih otapala (DMSO-d6, CD3CN-d3, CDCl3-d) na vezanje liganda i metala u omjeru 1:1, [(AgL(NO3)]. Koncentracijskim titracijama praćenima snimanjem 1H NMR spektara uzoraka istražen je množinski omjer vezanja te mjesto koordinacije liganda na metal. Pripravljeni kompleksi okarakterizirani su 1H i 1H-15N HMBC tehnikama NMR te spektrometrijom masa (ESI–MS).

Doktorski rad opisuje razvoj analitičkih metoda za određivanje onečišćenja u djelatnoj farmaceutskoj tvari nepafenaku. Razvijena je metoda tekućinske kromatografije ultravisoke djelotvornosti s C18 nepokretnom fazom i gradijentnim eluiranjem. Razvijena metoda je validirana i napravljeni su eksperimenti prisilne razgradnje, prilikom čega je provjerena selektivnost metode klasičnim pristupom provjere čistoće pika uporabom detektora s nizom dioda kao i uporabom dvodimenzionalne kromatografije ultravisoke djelotvornosti vezane sa spektrometrijom masa visoke razlučivosti, te je provjerena čistoća pika uporabom spektrometrije masa visoke razlučivosti. Glavna razgradna onečišćenja identificirana su primjenom tekućinske kromatografije visoke djelotvornosti vezne sa spregnutom spektrometrijom masa kao i primjenom dvodimenzionalne UHPLC vezane sa spektrometrijom masa visoke razlučivosti. Pretpostavljeni su putevi razgradnje nepafenaka što omogućuje predviđanje toksičnosti razgradnih spojeva, objašnjen je utjecaj svjetlosti, vlažnosti, temperature, pH- vrijednosti i prisutnosti oksidansa na razgradnju nepafenaka te su predloženi odgovarajući kinetički modeli razgradnje u kiselim i baznim uvjetima kao i razgradnje uslijed oksidacije. Razvijena metoda je dodatno provjerena uporabom komercijalnog računalnog program DryLab® uz pomoću kojega se na temelju dvanaest preliminarnih eksperimenata predvidjela promjena kromatografskog razlučivanja s promjenom eksperimentalnih uvjeta. Dobiveni optimalni uvjeti provjereni su eksperimentalno te je uočeno slaganje matematičkog modela i eksperimentalnih podataka. Potvrđeno je teorijsko područje robusnosti metode, odnosno višedimenzionalno područje unutar kojega varijacije kritičnih procesnih parametara ne uzrokuju značajne promjene kritičnih značajki kvalitete. Razvijena je i validirana metoda fluidne kromatografije pri superkritičnim uvjetima za kvantitativno određivanje nepafenaka i onečišćenja. Razvijene metode su uspređene s aspekta osjetljivosti, razlučivanja kao i granica primjene.

Nanočestice srebra (AgNP) se zbog antimikrobnih svojstava koriste u širokom spektru nanotehnoloških proizvoda, koji se, između ostaloga, koriste u medicini, prehrambenoj tehnologiji i proljoprivredi. Toksičnost AgNP dokazana je na brojnim organizmima, a ovisi o veličini, obliku i površinskom naboju nanočestica, tipu molekula-omotača i otpuštanju iona srebra. Duhan (Nicotiana tabucum L.) je ekonomski važna kultura i u molekularnoj biologiji uvriježen modelni organizam. U ovom diplomskom radu istražila sam utjecaj AgNP istog oblika, veličine i koncentracije, a stabiliziranih različitim omotačima (bPEI, citrat ili PEG), na klijance duhana. Sjemenke duhana isklijavala sam u tekućem mediju s dodatkom različitih AgNP ili srebrovog nitrata u koncentraciji 100 μM, a u slučaju kontrole bez dodatka srebra. Klijance sam koristila za istraživanje desetog dana tretmana. Tretmani su inhibirali rast korijena, narušili strukturu meristema korijena i uzrokovali promjene u ultrastrukturi kloroplasta. Sadržaj fotosintetskih pigmenata i parametri fluorescencije klorofila također su bili promijenjeni. Proteom klijanaca duhana pokazao je povećanu ekspresiju proteina prvenstveno vezanih uz fotosintezu i odgovor na stres. Nekoliko proteina pokazalo je različit odgovor na nanočestice i ione srebra. AgNP različitih omotača utjecale su na klijance duhana na različit način, no pokazale su se toksičnijima od iona srebra iste koncentracije. Silver nanoparticles (AgNPs) are used for their antimicrobial properties in a wide variety of nanotechnology products used in many fields, including medicine, food technology, and agriculture. The toxicity of AgNPs was proven on many organisms and depends on their size, shape, surface charge, type of coating and release of silver ions. Tobacco (Nicotiana tabucum L.) is an important cash crop and an established model organism in molecular biology. In this thesis, I investigated the influence of AgNPs of the same shape, size, and concentration and stabilised with different coatings (bPEI, citrate or PEG) on tobacco seedlings. Tobacco seeds were germinated in liquid medium containing different AgNPs or silver nitrate in 100 μM concentration. In the case of control, no silver was added. The seedlings were used for research on the tenth day of the treatment. The treatments inhibited root growth, disrupted root meristem structure and caused changes in chloroplast ultrastructure. Photosynthetic pigments' content and chlorophyll fluorescence parameters also changed. Tobacco seedling proteome showed an increased expression of proteins, primarily related to photosynthesis and stress response. A few proteins differed in response to AgNP and silver ion treatment. Differently coated AgNPs affected tobacco seedlings in a different manner and showed to be more toxic than silver ions of equal concentration.

Plazma stanice luče protutijela tj. imunoglobuline. Do danas je poznato pet vrsta imunoglobulina kategoriziranih kao IgA, IgG, IgM, IgD, IgE. Područje interesa ovoga rada je IgG, odnosno N-glikozilacija fragmenta Fc imunoglobulina G. Glikozilacija ovog fragmenta je od velike važnosti; najmanja promjena može utjecati na efektorsku ulogu samog IgG-a, a time u konačnici na imunološku reakciju. Prvi dio rada usredotočen je na optimizaciju predanalitičkih koraka već postojeće metode. Drugi dio rada je usredotočen na analizu stabilnosti glikozilacije IgG-a. Analizirana je glikozilacija fragmenta Fc IgG-a kod 8 ispitanika u tri vremenske točke. Dobiveni rezultati ovom metodom (LC-ESI-MS) upućuju na to da postoje promjene u glikozilaciji IgG-a. Promjene su uočene u IgG4 kod dvije glikoforme; G0FN te G1FN u istog ispitanika. Plasma cells secrete antibodies ie. immunoglobulins. Until now, there are five types of immunoglobulins known classified as IgA, IgG, IgM, IgD, IgE. The area of interest in this thesis is IgG, particularly N-glycosylation of the Fc fragment of immunoglobulin G. Glycosylation of this fragment is of great importance; the smallest change can affect the effector role of IgG, and thus ultimately the immunological reaction. The first part of the thesis focuses on the optimization of preanalytical steps of existing method. The second part focuses on stability analysis of glycosylation of IgG. Glycosylation of Fc fragment of IgG is analysed in 8 subjects at three time points. The results obtained by this method (LC-ESI-MS) indicate that there are changes in the glycosylation of IgG. Changes are observed in the IgG4 in two glycoforms; G0FN and G1FN in the same subject.

Nanočestice srebra (AgNP) se zbog svojih protubakterijskih i protugljivičnih svojstava sve više koriste u proizvodima široke potrošnje kao i u raznim industrijskim granama. Međutim, zbog svoje velike površine u odnosu na volumen, AgNP su vrlo reaktivne i podložne otpuštanju iona srebra (Ag+), što potencijalno povećava njihovu toksičnost. Dosada je zabilježen fito-, cito- i genotoksični učinak AgNP na različite biljne i animalne organizme. U ovom diplomskom radu istražen je utjecaj nanočestica srebra stabiliziranih citratom (AgNP-citrat) i srebrovog nitrata (AgNO3), primijenjenih u 100 μM koncentraciji, na ukupne topive proteine klijanaca i odraslih biljaka duhana (Nicotiana tabacum L.). Dvodimenzionalnom elektroforezom analizirane su promjene u proteinskim profilima cjelovitih klijanaca te korijena i lista odraslih biljaka nakon navedenih tretmana, a spektrometrijom masa identificirani su proteini različitog stupnja ekspresije. Ustanovljeno je kako su AgNP i AgNO3 izazvali slične promjene u proteinskoj slici određenog tkiva, a razina ekspresije pokazala se ovisnom o razvojnom stadiju duhana. Većina proteina s promijenjenom ekspresijom sudjeluje u metabolizmu ugljikohidrata, fotosintezi, odgovoru na stres i odgovoru na oksidacijski stres. Rezultati su pokazali da AgNP i AgNO3 uglavnom izazivaju povećanu ekspresiju proteina u klijancima duhana, a smanjenu ekspresiju u korijenu i listovima odraslih biljaka. Iz dobivenih rezultata može se zaključiti da se klijanci duhana bolje nose sa stresom izazvanim tretmanima sa 100 μM AgNP i AgNO3 u odnosu na odrasle biljke. Due to its antimicrobial and antifungal properties, silver nanoparticles (AgNPs) are increasingly applied in consumer products as well as in various industries. However, because of their large surface area to volume ratio, AgNPs are highly reactive and subjected to silver ions (Ag+) release, which potentially increases their toxicity. So far, phyto-, cyto-and genotoxic effects of AgNPs to the various plant and animal organisms were observed. In this graduation thesis, the impact of 100 μM citrate-stabilized AgNPs and silver nitrate (AgNO3) on expression of total soluble proteins of tobacco (Nicotiana tabacum L.) seedlings and adult plants was examined. Two-dimensional gel electrophoresis was applied to analyse changes in protein profiles of whole tobacco seedlings as well as roots and leaves of adult plants, while mass spectrometry was used to identify proteins with different expression levels. It was revealed that AgNP and AgNO3 induced similar changes in the protein profiles of the certain tissue, while the expression level was found to be dependent on the developmental stage. Most of the proteins with altered expression are involved in the metabolism of carbohydrates, photosynthesis, response to stress and response to oxidative stress. The results showed that AgNP and AgNO3 mostly induced up-regulation of identified proteins in tobacco seedlings, while the protein expression was mainly reduced in the roots and leaves of adult plants. From the obtained results it can be concluded that the tobacco seedlings cope better with the stress induced with 100 μM AgNP and AgNO3 treatments compared to adult plants.

Nanočestice srebra (AgNP) proizvode se brzo i u velikim količinama zbog iznimnih fizikalnih, kemijskih i bioloških svojstava koja povećavaju učinkovitost protumikrobnog djelovanja srebra. Međutim, radi svoje velike površine u odnosu na volumen, AgNP su vrlo reaktivne i podložne otpuštanju iona srebra (Ag+) što potencijalno povećava njihovu toksičnost. U ovom diplomskom radu proučen je utjecaj AgNP stabiliziranih različitim omotačima (citrat, CTAB, PVP) i utjecaj ionskog srebra (AgNO3) na morfologiju stanica i ekspresiju ukupnih topivih proteina korijena luka (Allium cepa L.). U provedenom istraživanju nisu uočene značajne morfološke promjene u ultrastrukturi stanica, ali je primijećen ulazak i akumulacija AgNP u njima. Dvodimenzionalnom elektroforezom analizirane su promjene u proteinskim profilima različito tretiranih korijena luka, a spektrometrijom masa identificirani su proteini drugačijeg stupnja ekspresije. Ustanovljeno je kako su oba oblika srebra uzrokovala različite promjene u proteinskoj slici korijena luka i to povećanu ekspresiju proteina koji sudjeluju u metabolizmu ugljika, mehanizmima obrane od stresa, biljnom rastu i razvoju, procesima vezanima za hormone rasta, staničnom disanju i regulaciji transkripcije te smanjenu ekspresiju proteina uključenih u transport, zarazu i obranu, sintezu proteina i stabilnost kromosoma. Rezultati su pokazali da ionsko srebro i AgNP stabilizirane trima različitim organskim omotačima međusobno različito djeluju na veličinu/debljinu korijena i da prvenstveno utječu na povećanu ekspresiju proteina u korijenu luka. Silver nanoparticles (AgNPs) are being manufactured quickly and in large quantities due to their exeptional physical, chemical and biological properties that increase the efficiency of antimicrobial action of silver. However, because of their large surface area to volume ratio, AgNPs are highly reactive and subjected to silver ions (Ag+) release which potentially increases their toxicity. In this graduation thesis the impact of AgNPs stabilized with different coatings (citrate, CTAB, PVP) and the impact of AgNO3 on onion root morphology and the expression of total soluble proteins were examined. Significant morphological changes in the ultrastructure of onion root cells were not observed in this research, but it was found that AgNPs entered those cells and accumulated in them. Changes in protein profiles of differently treated onion roots were analyzed with two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry was used to identify proteins with different expressions. It was found that both forms of silver caused different changes in protein profile of root cells; they increased expression of proteins included in carbohydrate metabolism, plant mechanisms against stress, plant growth and development, processes associated with growth hormones, cellular respiration and regulation of transcription and decreased expression of proteins that play a role in transport, defence, protein synthesis and chromosome stability. The results showed that silver ions and AgNPs stabilized with three different organic coatings have mutually different effects on root size/thicknes and primarily cause the increased expression of the proteins in onion root cells.

Nastajanje negativnih iona elektroraspršenjem za cijelu klasu biomakromolekula (peptidi, proteini, DNA, RNA, ugljikohidrati) je energetski nepovoljnije od nastajanja pozitivnih iona u ionskom izvoru spektrometra masa. Jedan od razloga je vezan uz nemogućnost postizanja stabilnog elektroraspršenja u negativnom načinu rada spektrometra masa. Nastajanje i analiza negativnih iona peptida i proteina ima izraziti značaj u području proteomike, gdje bi se takvom primjenom pospješila uspješnost analize ukupnog aminokiselinskog slijeda proteina i njegovih posttranslacijskih modifikacija. Prijašnja istraživanja pokazala su pozitivan utjecaj formaldehida na formiranje negativnih iona selektivnih modulatora androgenih receptora. Smatra se da bi sličan utjecaj mogli imati i drugi aldehidi, ketoni i esteri jer podliježu sličnoj reakciji u kiselom mediju kao i formaldehid. Proučavana je ionizacija negativnih iona peptida i proteina nano-elektroraspršenjem na hibridnom spektrometru masa koji se sastoji od T-vala, kvadrupola i analizatora vremena leta u neprekinutom slijedu (T-val Q-TOF MS). Tijekom predselekcije poboljšivača ionizacije (aldehida, ketona i estera) pokazalo se da su najveći utjecaj na nastajanje negativnih iona imali 2,2-dimetilpropanal, etil-metanoat i 2-fenil-2-oksoetanal. Da bi se pospješila ionizacija, odabrani poboljšivači ionizacije negativnih iona su umiješani u tok pokretne faze pri protoku od 0,4 L min-1 uz pomoć poslijekolonskog injekcijskog sustava. Rezultati su pokazali da se umiješavanjem mikromolarnih količina navedenih spojeva u matičnicu pokretne faze postiže ionizacija negativnih iona peptida i proteina u ESI-MS-u. For a wide variety of biological compounds (peptides, proteins, DNA, RNA, carbohydrates),negative ion formation by electrospray ionization is energetically less favorable than positive ion formation in mass spectrometer ion source. One of the reasons is inability to maintain stable electrospray in negative ion mode. Formation and analysis of negative ions of peptides and proteins is of great importance in proteomics research, as they would significantly improve amino acid sequence analysis of proteins and analysis of their posttranslational modifications. Previous research showed favorable effects of formaldehyde on the negative-ion formation of selective androgen receptor modulators. It is assumed that other aldehydes, ketones and esters would have similar effect because their reaction mechanism in acidic medium is similar to the reaction mechanism of formaldehyde. Hybrid T-wave quadrupole time-of-flight mass spectrometer (T-wave Q-TOF MS) was used for the study of nano electrospray formation of negative ions of peptides and proteins. Preselection of the negative-ion enhancers (aldehydes, ketones and esters) showed that the greatest effect on negative-ion formation had 2,2-dimethylpropanal, ethyl methanoate and 2-oxo-2-phenylethanal. The selected negative-ion enhancers were added postcolumn at a flow rate of 0,4 L min-1 to a mobile phase flow to enhance ionization. Results showed that formation of negativeions of peptides and proteins in ESI-MS was achieved by addition of micromolar quantities of the mentioned negative-ion enhancers to the mobile phase flow.

Nanotehnologija je zadnja u nizu tehnologija koje najavljuju novu eru u napretku društva. Male dimenzije nanočestica (engl. nanoparticles, NPs), s barem jednom dimenzijom između 1 i 100 nm, rezultiraju jedinstvenim kemijskim i fizikalnim značajkama, zbog čega se nanočestice proizvode u velikim količinama za upotrebu u proizvodima za široku potrošnju. Među različitim vrstama dostupnih nanomaterijala dominiraju nanočestice srebra (AgNP), zbog dobro poznatog protubakterijskog i protugljivčnog učinka srebra. Zbog široke upotrebe AgNP, raste zabrinutost glede sigurnosti njihove upotrebe i mogućih štetnih učinaka na okoliš. Iako je do sada objavljeno nekoliko toksikoloških studija na nanočesticama srebra, još uvijek je teško donijeti konačne zaključke o njihovoj toksičnosti. Naime, čim se oslobode u okoliš, započinje njihova transformacija, što mijenja njihova svojstva i time direktno utječe na transport, sudbinu i moguću toksičnost nanosrebra. Kao primarni proizvođači, biljke predstavljaju vitalan dio zdravog ekološkog sustava, ali također imaju i važnu ulogu u transportu i bioakumulaciji toksičnih tvari u hranidbene lance. Toksikološke studije o učincima AgNPs provedene na biljkama su malobrojne i nedorečene. Nadalje, nedostaju i podaci o učincima AgNPs na važne stanične procese. Stoga, u našim istraživanjima želimo otkriti i objasniti toksične učinke nanosrebra na biljke, što će doprinijeti procjeni okolišnog rizika izlaganja nanočesticama srebra, ali i novim saznanjima o mehanizmima toksičnosti. Istraživanja provodimo na luku i duhanu, ekonomski važnim biljnim vrstama koje se često koriste i kao modelni organizmi u istraživanjima abiotičkog stresa. Cilj nam je utvrditi dolazi li tijekom izlaganja različitih razvojnih stadija ovih biljaka nanosrebru do kvalitativnih i kvantitativnih promjena u ekspresiji proteina i definirati osjetljive i selektivne biomarkere toksičnosti nanočestica srebra koji bi se mogli koristiti u biomonitoringu okoliša. Dobiveni rezultati moći će se primijeniti i za procjenu sigurnosti korištenja nanočestica srebra u poljoprivrednim proizvodima, kao što su umjetna gnojiva i pesticidi, koji se sve više koriste u uzgoju ostalih poljoprivrednih vrsta., Nanotechnology is the latest in a long series of technologies which announces new era of technologies-driven prosperity. The small size of nanoparticles (NPs), with at least one dimension between 1 and 100 nm, results in unique chemical and physical characteristics, which is why they are being produced in large quantities for implementation in various consumer products. Among different available NPs, silver nanoparticles (AgNPs) are the dominating nanomaterial because of well-known silver antibacterial and antifungal properties. Due to widespread use and exposure to these nanomaterials, there is ever-growing concern regarding their potential detrimental impacts on the environment. Although there have been quite a number of toxicological studies published on AgNPs, it is still difficult to draw definite conclusions about their toxicity. As soon as AgNPs are released into the environment, they start to transform, which modifies their properties influencing their transport, fate and possible toxicity. As primary producers plants are the vital part of healthy ecosystems but also play a significant role in transport and bioaccumulation of possibly toxic substances into food chains. Toxicological studies of AgNPs conducted on plants are scare and inconclusive. Moreover, there is a lack of information about AgNPs-induced effects on important cellular processes. Therefore, in this research we aim to reveal and explain the toxicity of a set of diverse AgNPs to plants, onion and tobacco, in order to contribute to the environmental hazard assessment of AgNPs as well as to the basic knowledge about the mechanisms of their toxicity. We want to establish the possible proteomic changes upon exposure to treatments with AgNPs. The results will be used to define biomarkers of AgNP-induced phytotoxicity, which could be useful for environmental biomonitoring. Obtained results can also be applied to estimate the possibility of use and safety of AgNPs implemented in agricultural products, such as fertilizers and pesticides.

Nanotehnologija je zadnja u nizu tehnologija koje najavljuju novu eru u napretku društva. Male dimenzije nanočestica (engl.nanoparticles, NPs), s barem jednom dimenzijom između 1 i 100 nm, rezultiraju jedinstvenim kemijskim i fizikalnim značajkama, zbog čega se nanočestice proizvode u velikim količinama za upotrebu u proizvodima za široku potrošnju. Među različitim vrstama dostupnih nanomaterijala dominiraju nanočestice srebra (AgNP), zbog dobro poznatog protubakterijskog i protugljivčnog učinka srebra. Zbog široke upotrebe AgNP, raste zabrinutost glede sigurnosti njihove upotrebe i mogućih štetnih učinaka na okoliš. Iako je do sada objavljeno nekoliko toksikoloških studija na nanočesticama srebra, još uvijek je teško donijeti konačne zaključke o njihovoj toksičnosti. Naime, čim se oslobode u okoliš, započinje njihova transformacija, što mijenja njihova svojstva i time direktno utječe na transport, sudbinu i moguću toksičnost nanosrebra. Kao primarni proizvođači, biljke predstavljaju vitalan dio zdravog ekološkog sustava, ali također imaju i važnu ulogu u transportu i bioakumulaciji toksičnih tvari u hranidbene lance. Toksikološke studije o učincima AgNPs provedene na biljkama su malobrojne i nedorečene. Nadalje, nedostaju i podaci o učincima AgNPs na važne stanične procese. Stoga, u našim istraživanjima želimo otkriti i objasniti toksične učinke nanosrebra na biljke, što će doprinijeti procjeni okolišnog rizika izlaganja nanočesticama srebra, ali i novim saznanjima o mehanizmima toksičnosti. Istraživanja provodimo na luku i duhanu, ekonomski važnim biljnim vrstama koje se često koriste i kao modelni organizmi u istraživanjima abiotičkog stresa. Cilj nam je utvrditi dolazi li tijekom izlaganja različitih razvojnih stadija ovih biljaka nanosrebru do kvalitativnih i kvantitativnih promjena u ekspresiji proteina i definirati osjetljive i selektivne biomarkere toksičnosti nanočestica srebra koji bi se mogli koristiti u biomonitoringu okoliša. Dobiveni rezultati moći će se primijeniti i za procjenu sigurnosti korištenja nanočestica srebra u poljoprivrednim proizvodima, kao što su umjetna gnojiva i pesticidi, koji se sve više koriste u uzgoju ostalih poljoprivrednih vrsta.

Nastajanje negativnih iona elektroraspršenjem za cijelu klasu kemijskih spojeva (peptidi, proteini, DNA, RNA itd.) je energetski nepovoljnije od nastajanja pozitivnih iona u ionskom izvoru spektrometra masa. Jedan od razloga je vezan uz nemogućnost postizanja stabilnog elektroraspršenja u negativnom načinu rada spektrometra masa. Nastajanje i analiza negativnih iona peptida i proteina ima izraziti značaj u području proteomike, gdje bi se takvom primjenom pospješila uspješnost analiza ukupnog aminokiselinskog slijeda proteina i njegovih posttranslacijskih modifikacija. Prijašnja istraživanja pokazala su pozitivan utjecaj formaldehida na formiranje negativnih iona selektivnih modulatora androgenih receptora. Smatra se da bi sličan utjecaj mogli imati i drugi aldehidi, ketoni i esteri jer podliježu sličnoj reakciji u kiselom mediju kao i formaldehid. Proučavana je ionizacija negativnih iona peptida i proteina nano- elektroraspršenjem na hibridnom spektrometru masa koji se sastoji od kvadrupola i analizatora vremena leta u neprekinutom slijedu. Tijekom predselekcije klasa kemijskih spojeva (aldehida, ketona i estera) pokazalo se da su najveći utjecaj na ionizaciju negativnih iona imali 2, 2- dimetilpropanal, etil metanoat i 2-fenil-2- oksoetanal. Da bi se pospješila ionizacija, odabrani poboljšivači ionizacije negativnih iona su umiješani u tok pokretne faze pri protoku od 0, 4 µL min-1 uz pomoć poslijekolonskog injekcijskog sustava. Rezultati su pokazali da se umiješavanjem mikromolarnih količina navedenih spojeva u matičnicu pokretne faze postiže ionizacija negativnih iona peptida i proteina u ESI-MS-u.

Metode za detekciju i analizu aminokiselinskog slijeda proteina i peptida te potom za identifikaciju istih spektrometrijom masa većinom se temelje na derivatizaciji peptida ili proteina. Signali peptida i proteina koji se ne mogu detektirati spektrometrijom masa u negativnom načinu rada spektrometra masa postaju detektabilni pomoću derivatizacijskih reagensa u MS i u MS/MS načinu rada. U ovom se radu ispitivalo ponašanje 3, 5-disulfoetil-4- metoksibenzaldehida, novosintetiziranog analoga disulfonične kiseline, kao derivatizacijskog reagensa u odnosu na 2, 4- disulfobenzaldehid. Triptički peptidi goveđeg seruma albumina te peptid angiotenzin korišteni su kao model uspješnosti derivatizacijskog postupka i ionizacije u negativnom MS, te negativnom i pozitivnom MS/MS načinu rada spektrometra masa. Derivatizacijski postupak sulfoniranja N-kraja peptida u vodenoj otopini optimiziran je u odnosu na količinu dodanog reagensa i peptida. Analiza se provodila na instrumentima MALDI TOF/TOF i MALDI Q-TOF u pozitivnom i negativnom načinu rada spektrometra masa uz korištenje kapilarnog tekućinskog kromatografa s kolonom obrnutih faza te s ionskom kolonom za pročišćavanje i razdvajanje derivatiziranih analita. Dobiveni rezultati pokazuju da je za peptide derivatizirane 3, 5-disulfoetil-4- metoksibenzaldehidom potrebna veća energija cijepanja nego za peptide derivatizirane 2, 4- disulfobenzaldehidom. Mogući razlog tome je odsustvo rezonancijske stabilnosti sulfatne skupine u spoju 3, 5-disulfoetil-4- metoksibenzaldehid. U usporednom spoju 2, 4- disulfobenzaldehid, sulfatna skupina je neposredno vezana na benzenski prsten što kod iona u plinskoj fazi stabilizira nastale derivatizirane negativne ione. Moguće predloženo rješenje nastalo istraživanjem ovim diplomskim radom predviđa uvođenje dvostruke veze na alkilni lanac 3, 5- disulfoetil-4- metoksibenzaldehida. Time bi se tijekom fragmentacije negativnih iona dodatno stabilizirala sulfatna skupina i time poboljšala učinkovitost nastajanja b-serije iona, što u konačnici omogućava poboljšano iščitavanje aminokiselina u negativnom načinu rada spektrometra masa.

Nanočestice srebra (AgNP) proizvode se brzo i u velikim količinama zbog iznimnih fizikalnih, kemijskih i bioloških svojstava koja povećavaju učinkovitost protumikrobnog djelovanja srebra. Međutim, radi svoje velike površine u odnosu na volumen, AgNP su vrlo reaktivne i podložne otpuštanju iona srebra (Ag+) što potencijalno povećava njihovu toksičnost. U ovom diplomskom radu proučen je utjecaj AgNP stabiliziranih različitim omotačima (citrat, CTAB, PVP) i utjecaj ionskog srebra (AgNO3) na morfologiju stanica i ekspresiju ukupnih topivih proteina korijena luka (Allium cepa L.). U provedenom istraživanju nisu uočene značajne morfološke promjene u ultrastrukturi stanica, ali je primijećen ulazak i akumulacija AgNP u njima. Dvodimenzionalnom elektroforezom analizirane su promjene u proteinskim profilima različito tretiranih korijena luka, a spektrometrijom masa identificirani su proteini drugačijeg stupnja ekspresije. Ustanovljeno je kako su oba oblika srebra uzrokovala različite promjene u proteinskoj slici korijena luka i to povećanu ekspresiju proteina koji sudjeluju u metabolizmu ugljika, mehanizmima obrane od stresa, biljnom rastu i razvoju, procesima vezanima za hormone rasta, staničnom disanju i regulaciji transkripcije te smanjenu ekspresiju proteina uključenih u transport, zarazu i obranu, sintezu proteina i stabilnost kromosoma. Rezultati su pokazali da ionsko srebro i AgNP stabilizirane trima različitim organskim omotačima međusobno različito djeluju na veličinu/debljinu korijena i da prvenstveno utječu na povećanu ekspresiju proteina u korijenu luka.

Dan je pregled aktivnosti i znanstvenih rezultata suradnika Laboratorija za kemijsku kinetiku (kasnije Laboratorija za kemijsku kinetiku i atmosfersku kemiju) Instituta Ruđer Bošković na području spektrometrije masa od 1959. do danas., An overview is given of activities and scientific results by coworkers of the Laboratory for Chemical Kinetics (later Laboratory for Chemical Kinetics and Atmospheric Chemistry) of the Rudjer Boskovic Institute in the field of mass spectrometry from 1959 to the present.

Fragmentacijske metode spektrometrije masa upotrjebljene su u analizi primarne strukture proteina kako bi se pokušalo odrediti zašto protein ne kristalizira. Eksperiment s izoelektričnim fokusiranjem pokazao je da je uzorak pročišćenog proteina smjesa tri komponente s različitim izoelektričnim točkama. MALDI TOF spektri pokazali su da je protein većim dijelom kraći od očekivanog te da postoji heterogenost u uzorku. Kako bi se odredilo gdje je protein kraći, napravljeno je triptičko cijepanje uzorka i dobivena triptička mapa je dala jasniji uvid gdje bi protein mogao biti kraći, ali ne i točno koje aminokiseline nedostaju. Zbog nejednoznačnih rezultata u eksperimentu s tripsinom provedeno je i kemijsko cijepanje cijanogen bromidom u svrhu dobivanja jednostavnije smjese s manjim brojem većih peptida. Dobiveni peptidi su dijalizirani i snimljen je MALDI TOF spektar, a izmjerene vrijednosti uspoređene s teorijskim. Na temelju dobivenih rezultata zaključeno je da je protein kraći na N-terminalnom kraju za 19 amino kiselina. Smjesa CNBr peptida je razdvojena tekućinskom kromatografijom te su prikupljene frakcije. Za sve frakcije snimljen je MALDI TOF spektar masa kako bi se ustanovilo u kojoj od njih se nalazi željeni peptid koji odgovara N- terminalnom kraju proteina. S ciljem potvrde pretpostavljene sekvence izoliranog N- terminalnog peptida otopina odgovarajuće frakcije je analizirana ESI MS/MS eksperimentom gdje je izoliran ion naboja +10 na kojem su primijenjene dvije komplementarne fragmentacijske metode. CID fragmentacija dala je mali broj b i y fragmentacijskih iona te se nije moglo sa sigurnošću tvrditi da je pretpostavljena sekvenca peptida točna. Nakon CID fragmentacije, ion peptida podvrgnut je ETD fragmentiranju pri čemu su dobiveni rezultati uspoređeni s izračunatim vrijednostima c i z fragmentacijskih iona. Broj dobivenih fragmentacijskih iona je veći nego u CID spektru. ETD metoda potvrdila je sekvencu peptida i mjesto gdje je protein skraćen.

Integrin v3 je transmembranski heterodimerni receptor koji posreduje u komunikaciji stanica s izvanstaničnim matriksom. Ima važnu ulogu u adheziji, proliferaciji, migraciji i preživljenju stanica, kao i otpornosti na citostatike. U radu je korištena stanična linija karcinoma pločastih stanica jezika čovjeka Cal27, te integrin 3-stabilno transficirani klon Cal27-2B1, koji de novo eksprimira integrin v3 na površini, te pokazuje povećanu ekspresiju integrina v5, smanjenu migraciju i povećanu otpornost na citostatike. Kako bi se dobio uvid u stanične mehanizme odgovorne za nastale promjene, diferencijalno su analizirani proteomi navedenih staničnih linija i identificirani su proteini kojima se razlikuju ekspresije u ovisnosti o ekspresiji integrina v3. v3 integrin is a transmembrane heterodimeric receptor that mediate cell to cell and cell to ECM communication. It has an important role in adhesion, proliferation, migration and cell survival, as well as drug resistance. Focus of this research were human tongue squamous cell carcinoma cell line Cal27 and integrin 3 stably transfected clone Cal27-2B1, with de novo expression of integrin v3, overexpression of integrin v5, decreased cell migration and increased drug resistance. Proteomes of these cell lines were differentialy analized to get an insight into mechanisms responsible for observed changes, and proteins with different expressions depending on integrin v3 expression were identified.

Određivanje primarne strukture proteina temeljni je zahtjev većine proteomskih analiza. Za određivanje slijeda aminokiselina se, uz metode Edmanove odgradnje, koristi tandemna spektrometrija masa temeljena na fragmentaciji peptidnih iona. Fragmentacija uvelike ovisi o sastavu i broju aminokiselina te posttranslacijskim modifikacijama. Radi poboljšanja ionizacije i fragmentacije se, osim kemijskog obilježavanja peptida, koriste i inicijatori fragmentacije koji desolvatiraju peptidne ione ili generiraju radikale u plinovitoj fazi spektrometra masa. Tijekom izrade doktorske disertacije ispitana je kontrolirana fragmentacija peptida u izvoru iona spektrometra masa MALDI-TOF/TOF (matricom pomognuta ionizacija uz desorpciju laserskim zračenjem-analizator vremena leta/ analizator vremena leta) djelovanjem inicijatora fragmentacije iz skupine persulfata, peroksida, sulfona te nitrila, dodanih u smjesu peptida i matrice. Predloženi su mehanizmi fragmentacije peptidnih iona inicirani radikalima, koji su dodatno eksperimentalno potvrđeni fragmentacijom kemijski obilježenih peptida. Spektri masa peptida nakon dodatka inicijatora fragmentacije u prvom stupnju MS-analize odgovaraju tandemnom spektru masa uz korištenje kolizijske ćelije, a ione produkte moguće je fragmentirati u drugom stupnju analize, čime je omogućena višestruka tandemna spektrometrija masa (tzv. pseudo MS3). Protein primary structure elucidation is the key requirement in proteomics analyses. Except the Edman degradation, unambiguous amino acid sequence determination can be regularly performed by usage of tandem mass spectrometry, based on peptide ion fragmentation. Protein characteristics such as size, amino acid composition or post-translational modifications affect fragmentation. For ionization and fragmentation efficacy improvements, except chemical modification of peptides, fragmentation initiators can be used. Fragmentation initiators facilitate desolvation and generate gas phase radicals in the mass spectrometer. In this thesis, controlled in source peptide ion fragmentation induced by addition of fragmentation initiators was studied by means of matrix-assisted desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF MS). Fragmentation initiators used were classified as persulfates, peroxides, sulphones and nitriles. Radical mechanisms of peptide ion fragmentation mediated by fragmentation initiators were elucidated and confirmed by orthogonal experiment - chemically modified peptides fragmentation. Mass spectra obtained in the first stage mass spectrometry after fragmentation initiators addition are almost identical to conventional tandem mass spectra produced by collision induced dissociation. Product ions formed in ion source can be further fragmented in the second step of MS analysis. This concept enables multiple tandem mass spectrometry (pseudo MS3).

Farmaceutici, koji se ubrajaju u ''nova zagađivala'', zaokupili su veliku pozornost znanstvenika zbog spoznaje o njihovoj opasnosti i negativnim utjecajima na cjelokupni živi svijet. Kako bi se izbjegle neželjene posljedice potrebno je zakonsko propisivanje maksimalno dopuštenih koncentracija (MDK) i konsantan nadzor ovih tvari u okolišu. U tu svrhu potrebno je razviti analitičke metode separacije farmaceutika iz realnih uzoraka kao i metode kvalitativnog i kvantitativnog određivanja aktivnih farmaceutskih tvari. U ovom radu razvijena je i validirana analitička metoda za određivanje smjese makrolida (eritromicin, klaritromicin, azitromicin, roksitromicin, tilozin i DHL) u suspendiranim česticama. Ciljani analiti su kvalitativno i kvantitativno određivani tekućinskom kromatografijom vezanom sa spektrometrijom masa (HPLC-MS/MS) uz ekstrakciju čvrstom fazom (SPE) kao metodom priprave uzorka. Ispitivani su uvjeti pri kojima je ekstrakcija čvrstom fazom najučinkovitija s obzirom na vrstu sorbensa u koloni, vrstu otapala za eluiranje i različito vrijeme zadržavanja. Kromatografsko razdvajanje optimizirano je s obzirom na sastav pokretne faze, nepokretne faze i način eluiranja (izokratno i gradijentno). Detekcija je izvedena na spektrometru masa s trostrukim kvadripolom pri pozitivnoj ionizaciji elektroraspršenjem. Napon fragmentora i kolizijska energija optimizirani su za svaki pojedini analit kako bi se dobili najbolji uvjeti za identifikaciju određivanih farmaceutika. Snimanja je provedeno praćenjem višestrukih reakcija (MRM) pri kojim se za svaki izvorni spoj prate dva fragmenta za njegovu kvantifikaciju i identifikaciju. Razvijena i optimirana LC-MS/MS metoda je validirana određivanjem izvedbenih značajki: linearnosti, granica detekcije (GD), granica kvantifikacije (GK), osjetljivost, obnovljivosti i ponovljivosti.

Farmaceutici se svakodnevno upotrebljavaju u velikim količinama te se stoga kontinuirano unose u okoliš. Iako su koncentracije farmaceutika određene u okolišu male, još uvijek se ispituje utjecaj kontinuirane izloženosti i tako malim koncentracijama te smjesama različitih farmaceutika prisutnim u okolišu. Najznačajnije mjesto prikupljanja i ispuštanja farmaceutika u okoliš su postrojenja za obradu otpadnih voda. Ispitivanja ispusnih voda i riječnih sedimenata pokazala su da postojeća postrojenja za obradu voda mogu samo djelomično ukloniti faramceutike i njihove metabolite. Stoga je potrebno razviti postupke obrade voda koji će onemogućiti njihovo ispuštanje u okoliš. U ovom radu praćena je fotolitička i fotokatalitička razgradnja prazikvantela tekućinskom kromatografijom visoke djelotvornosti vezanom sa spektrometrijom masa (HPLC-MS/MS).. Otopine prazikvantela su pripremljene u koncentracijama 1 i 10 mg/L te podvrgnute fotolitičkoj (pri 254 i 365 nm) i fotokatalitičkoj (uz TiO2 film) razgradnji. Praćena je brzina razgradnje prazikvatela te nastajanje i razgradnja razgradnih produkata. U eksperimentima provedenim pri 254 nm prazikvantel se u potpunosti razgradio unutar ispitivanih 90 min. Dodatakom TiO2 kao katalizatora, razgradnja je očekivano ubrzana te je prazikvantel u potpunosti razgrađen u ispitivanom vremenu od 60 min. U eksperimentima fotolitičke i fotokatalitičke razgradnje pri 365 nm nije postignuta potpuna razgradnja prazikvantela. Uz praćenje razgradnje prazikvantela, važan dio ovoga rada je identifikacija nastalih razgradnih produkata. Detektirani su razgradni produkti sljedećih m/z omjera: m/z 273, m/z 269, m/z 189, m/z 147 i m/z 132 te su, na temelju masenih spektara, predložene njihove strukturne formule.

Iako kaktus Mammillaria gracilis Pfeiff. nije komercijalno zanimljiva biljna vrsta u Europi, njegove prilagodbe na suha staništa čine ga prikladnim modelnim organizmom za proučavanje biokemijskih i molekularnih mehanizama koji se aktiviraju tijekom izlaganja biljaka solnom i osmotskom stresu. Tkiva kaktusa u kulturi in vitro rastu u obliku habituiranog neorganiziranog kalusa, koji zadržava regeneracijski potencijal, te u obliku potpuno neorganiziranog tumora dobivenog transformacijom stanica kaktusa bakterijom Agrobacterium tumefaciens. Ovim istraživanjem pokazano je da kalusno i tumorsko tkivo reagiraju na prisutnost solnog i osmotskog stresa na razini ekspresije topivih staničnih proteina. Mehanizmi uključeni u odgovore biljke na solni i osmotski stres razlikuju se i ovise o vrsti ispitivanog tkiva, ali čini se da je tumorsko tkivo jače pogođeno stresom od kalusnog tkiva. Razlikovna analiza ekspresije proteina u ispitivanim tkivima ukazala je na proteine toplinskog šoka i gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu kao potencijalne opće biljege prisutnosti solnog i osmotskog stresa kod biljaka. Although cacti Mammillaria gracilis Pfeiff. is not commercially interesting plant species in Europe, its adaptations on arid environments make it suitable model organism for studying biochemical and molecular mechanisms which activate during exposure of plants to salt and osmotic stress. Cacti tissues grow in vitro as habituated calli of unorganised growth capable of regeneration potential retention, and as completely unorganised tumors induced via transformation of cacti cells with Agrobacterium tumefaciens bacteria. This research showed that calli and tumor tissues respond to salt and osmotic stress at the level of soluble cell proteins synthesis. Mechanisms underlying these responses differ and are dependent of tissue used, but it seems that tumor tissue is, at least to some extent, more sensitive to impact of stress factors than calli. Differential expression protein analysis implicated heat shock protein family, as well as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase protein, as general markers of salt and osmotic stress presence in plants.

Proteomska tehnologija u istraživanju tumorskih bolesti koristi se u detekciji ranih stadija bolesti, određivanju stadija i progresije bolesti, otkrivanja potencijalnih meta i biomarkera za liječenje bolesti te u konačnici za primjenu terapije prilagođene svakom individualnom pacijentu na osnovu njegovog proteomskog profila. Tumor prostate jedno je od najčešće dijagnosticiranih malignih oboljenja muškaraca nakon pedesete godine života. U ovom radu primijenjen je proteomski pristup za utvrđivanje razlikovnog prikaza oboljenja karcinoma prostate, a u svrhu pronalaska potencijalnih novih biomarkera za bolju procjenu progresije i agresivnosti bolesti. Nakon histopatološkog nalaza, proteini tumorom zaraženog i zdravog tkiva prostate identificirani su dvodimenzionalnom gel elektroforezom u sprezi sa spektrometrijom masa. Dobiveni rezultati i razvijena metodologija čine okosnicu za daljnja istraživanja na većem broju uzoraka. Proteomics technology in the research of tumor diseases is used in detection of early stages of disease development, tumor staging and progression, identification of potential targets and biomarkers. Collected proteomics data could direct disease treatment and could have impact on administrated therapy adjusted for every individual patient based on his proteomics profile. Prostate tumor is one of the leading diagnosed malignant disease of men after the age of 50. Proteomics methodology applied in the thesis utilitized for an observation of differential display of prostate tumor disease vs. health disease. Final goal was identification of potential novel biomarkers for better understanding of disease progression and agression. After histopathological determination, proteins from tumor-infected and health prostate tissue were separated by two-dimensional gel electrophoresis followed by mass spectrometry identification. Presented results and methodology can be used as basis for following population researches.

U ovom radu razvijene su i optimirane metode za određivanje farmaceutika u uzorcima voda. Za određivanje dvadeset i dva farmaceutika iz različitih skupina (makrolidi, fluorokinoloni, tetraciklini, sulfonamidi, antihelmintici, anestetici i ostali) u otpadnim vodama, razvijena je i optimirana metoda na sustavu tekućinske kromatografije visoke djelotvornosti vezana s tandemskom spektrometrijom masa (HPLC-MS/MS) uz ekstrakciju čvrstom fazom (SPE) kao metodom pripreme uzorka. Metoda za određivanje antihelmintika u površinskim vodama razvijena je i optimirana na sustavu tekućinske kromatografije ultravisoke djelotvornosti vezane uz kvadripol-linearnu ionsku klopku (UHPLC-QqLIT) uz pripremu uzorka ekstrakcijom čvrstom fazom. Za obje metode optimirani su parametri pripreme uzorka (pH uzorka, vrsta čvrste faze i otapala za eluiranje), kromatografski uvjeti (pokretna i nepokretna faza) te uvjeti na spektrometrima masa (uvjeti na prvom i drugom kvadripolu). Optimirane metode su validirane određivanjem izvedbenih značajki: linearnost, granice dokazivanja, granice kvantifikacije, obnovljivost i ponovljivost. Granice dokazivanja za otpadne vode su u rasponu 1, 0 – 535, 7 ng/L ovisno o analitu. Iskorištenja ekstrakcije čvrstom fazom određena su za dvije koncentracije analita te je ispitan utjecaj matice uzorka i mogući načini njegovog uklanjanja. Validirane metode primijenjene su za analizu realnih uzoraka otpadnih voda i površinskih voda. U otpadnim vodama prije pročišćavanja detektirano je četrnaest farmaceutika iz različitih skupina. Usporedbom rezultata analiza otpadnih voda prije i nakon pročišćavanja uočeno je da su neki farmaceutici u potpunosti uklonjeni procesom pročišćavanja (sulfametazin, sulfadiazin i oksitetraciklin) dok su ostali djelomično uklonjeni ili uopće nisu. Za neke farmaceutike uočeno je povećanje koncentracije nakon pročišćavanja (sulfametoksazol, ciprofloksacin, lidokain i azitromicin). U površinskim vodama detektirano je osam antihelmintika čije su vrijednosti koncentracija bile u niskom ng/L području, a najveća koncentracija 39, 4 ng/L određena je za levamisol. Nadalje, HPLC-MS/MS metoda primijenjena je za optimizaciju postupaka uklanjanja sulfametazina i febantela naprednim oksidacijskim procesima (AOP). Promatrana je brzina fotolitičke i fotokatalitičke razgradnje navedenih farmaceutika, uz TiO2 sloj kao katalizator. Također, identificirani su produkti nastali takvom razgradnjom. Na temelju analiza provedenih na spektrometrima masa predložene su strukturnie formule razgradnih produkata sulfametazina i febantela.

Svakodnevnim korištenjem farmaceutika povećava se njihova prisutnosti u okolišu, a predviđa se daljnje povećanje. Farmaceutici ulaze u vode, tlo i sediment te mogu imati utjecaja na biljni i životinjski svijet. Izloženi raznim utjecajima u okolišu farmaceutici se mogu razgraditi. Do razgradnje može doći djelovanjem organizama poput bakterija i gljivica te abiotičkim procesima oksidacije, hidrolize i fotolize. Moguće nuspojave njihovog utjecaja na organizme još uvijek nisu poznate kao ni koje su maksimalno dozvoljene koncentracije u okolišu za sve farmaceutike. Zbog svoje velike raširenosti i stalne prisutnosti u okolišu potrebno je pronaći načine njihovog uklanjanja. U ovom radu istraživani su razgradni produkti antihelmintika prazikvantela nastali fotolitičkom i fotokatalitičkom razgradnjom. Otopine prazikvantela su pripremljene u koncentracijama 1 i 10 mg/L te podvrgnute fotolitičkoj razgradnji pri 254 i 365 nm. Fotokatalitička razgradnja uključivala je elektromagnetsko zračenje valnih duljina 254 ili 365 nm uz TiO2 kao katalizator. Uslijedila je analiza tekućinskom kromatografijom vezanom sa spektrometrom masa (HPLC-MS/MS). Prazikvantel se razgradio pri uvjetima 254 nm i 254 nm + TiO2. Pri 365 nm se nije došlo do razgradnje. Pratila se brzina razgradnje prazikvatela te nastajanje razgradnih produkata. Detektirani su razgradni produkati sljedećih m/z omjera: m/z 273, m/z 269, m/z 189, m/z 147 i m/z 132. Na temelju njihovih masa i spektara masa ponuđene su moguće strukturne formule.

Antibiotici se koriste za liječenje bakterijskih infekcija kod ljudi i životinja. Njihovo učestalo i nepotrebno korištenje prouzročilo je pojavu rezistentnih patogenih bakterija. Poznavanje mehanizama djelovanja antibiotika te mehanizama rezistencije na antibiotike postaje neophodna za suzbijanje i kontrolu rezistentnih bakterija. S ciljem razvitka brze metodologije za određivanje mehanizama rezistencije, u ovom radu testirana je nova metoda bazirana na proteomskoj analizi patogene bakterije. Uropatogena bakterija Escherichia coli MFBF 10519 pokazala je rezistentnost na šest različitih β-laktamskih antibiotika te je korištena kao test mikroorganizam za ispitivanje mehanizama rezistencije metodom CAF-/CAF+. Rezultati razlikovnog proteomskog ispitivanja mehanizama rezistencije bakterije E. coli MFBF 10519 na penicilin G ukazuju na povećanu sintezu osam proteina. Četiri od njih, β-laktamaza LEN-26, porin OmpX, transpozaza IS66 i protein OmpA, direktno utječu na rezistenciju E. coli MFBF 10519 na penicilin G.

Detaljna strukturna analiza četiri derivata nikotinohidrazida: N′-(2, 3-dihidroksifenilmetiliden)-3-piridinkarbohidrazid (spoj 1), N′-(2, 4-dihidroksifenilmetiliden)-3-piridinkarbohidrazid (spoj 2), N′-(2, 5-dihidroksifenilmetiliden)-3-piridinkarbohidrazid (spoj 3), N′-(2-hidroksi-5-nitrofenilmetiliden)-3-piridinkarbohidrazid (spoj 4), provedena je spektrometrijom masa uz ionizaciju elektroraspršenjem. Snimljeni su ESI(+) i ESI(−) MS te MS/MS spektri. Istražen je utjecaj otapala, metanola i acetonitrila, na izgled spektra masa. Tandemna spektrometrija masa provedena je na protoniranim/deprotoniranim molekulama derivata nikotinohidrazida, fragmentnim ionima te aduktima s natrijem i kalijem. Na temelju MS/MS spektara predložene su sheme fragmentiranja pojedinog aroilhidrazona. Izomeri, spojevi 1–3, koji se razlikuju u položaju hidroksilnih skupina na fenilnom prstenu mogu se djelomično razlikovati spektrometrijom masa jer različito fragmentiraju. U ESI(+) MS spektru spoja 4 uočeni su kationski radikali. Snimljeni su i ESI(+) MS spektri inkluzijskih kompleksa α- i β-ciklodekstrina sa spojevima 1 i 4.

Gangliozidi su sijalilirani glikosfingolipidi najzastupljeniji u vanjskom sloju lipidnog dvosloja staničnih membrana živčanih stanica sisavaca, gdje sudjeluju u brojnim staničnim procesima. Njihov se sastav izrazito mijenja u tumorski transformiranim stanicama i te promjene koreliraju s tumorskim rastom i progresijom. U ovom je radu detaljno karakteriziran kvalitativni i kvantitativni sastav nativnih smjesa gangliozida izoliranih iz patohistološki definiranih primarnih moždanih tumora u usporedbi s kontrolnim tkivima. Istraženi su prvenstveno tumori neuroepitelijalnog porijekla. Detekcija i strukturna analiza gangliozida provedene su metodama spektrometrije masa i tankoslojne kromatografije visokog učinka. Rezultati su pokazali izrazito sniženi sadržaj ukupnih gangliozida u većini tumorskih tkiva u odnosu na kontrolna tkiva. Utvrđen je i značajno promijenjeni kvalitativni sastav gangliozida u tumorskim uzorcima, poglavito u građi ceramidnog dijela gangliozidnih vrsta, te veći udio strukturno jednostavnijih gangliozida u odnosu na zdravo tkivo. Pojavnost O-acetiliranih vrsta u tumorskim je tkivima izrazito promijenjena u odnosu na kontrolna tkiva. Detaljno poznavanje sastava gangliozida u tumorima moglo bi pomoći u subklasifikaciji pojedinih tipova tumora, te doprinijeti prepoznavanju novih ciljnih molekula za razvoj antitumorske terapije.

Svrha: Željelo se pronaći optimalne uvjete i metode za identifikaciju maksimalnog broja proteina u uzorcima tkiva gingive pacijentice s agresivnim parodontitisom. Pritom smo se koristili tehnologijom Label-free kvantifikacije, tekućinske kromatografije i spektrometrije masa (LC –MS/MS), te usporedili proteom zdravih i bolesnih uzoraka tkiva gingive. Materijali i metode: Četiri uzorka gingivnog tkiva (dva zdrava i dva bolesna) uzeta su od pacijentice, inače nepušačice, koja boluje od teškog oblika generaliziranog agresivnog parodontitisa. Proteini tkivnog lizata razdvojeni su 1D gel-elektroforezom nakon koje je slijedila digestija u gelu te mjerenje proteina nanoljestvicom HPLC-sistema preko nanoelektro spreja, ionizacijskog izvora i spektrometra mase. Dobiveni podaci obrađeni su u programu MaxQuant. Rezultati: Label-free kvantifikacija i LC-MS/MS analiza, zajedno s pripremom uzoraka, 1D gel-elektroforezom i digestijom u gelu pokazali su se kao učinkovita metoda za analizu proteoma gingivnog tkiva. Ukupan broj identificiranih i kvantificiranih proteina iznosio je 2429. Proteini koji su pokazali pojačanu ekspresiju u tkivu zahvaćenom agresivnim parodontitisom bili su: imunoglobulinski gama-1 lanac regije C, imunoglobulinski kapa lanac regije C i imunoglobulinski gama-3 lanac regije C (Ig gamma-1 chain C region, Ig kappa chain C region i Ig gamma-3 chain C region), a desmoplakin, aneksini, proteini S100-A8/A9 i keratini pokazali su sniženu ekspresiju. Zaključak: Ovo eksperimentalno istraživanje omogućuje novi uvid u proteomski profil zdravog i bolesnog gingivnog tkiva, što bi moglo pridonijeti napretku u dijagnostici i prognozi te boljem razumijevanju patogeneze agresivnog parodontitisa. Tehnologija LCMS/ MS pokazala se učinkovitom kad je riječ o proteomskoj analizi gingivnog tkiva., Aim: The aim of this study was to find an optimal method to identify maximal number of proteins from human gingival tissue samples in a patient with aggressive periodontitis using label-free quantitative liquid chromatography mass spectrometry technology (LC-MS/MS), and to compare proteome of healthy and diseased gingival tissue samples. Materials and methods: Four gingival tissue samples (2 healthy, 2 diseased) were obtained from a nonsmoking female patient suffering from severe generalized aggressive periodontitis. Proteins from the tissue lysate were separated by 1D gel electrophoresis, in gel digested, measured by nano-scale HPLC system coupled to a mass spectrometer through a nano-electrospray ionization source. Raw data were processed by MaxQuant software. Results: Label-free quantitative LC-MS/MS analysis together with sample preparation, 1D gel electrophoresis and in-gel digestion showed to be an effective method for the proteome analysis of the gingival periodontal tissues. A total of 2429 proteins were identified and quantified. Among proteins upregulated in disease were: Ig gamma-1 chain C region, Ig kappa chain C region, Ig gamma-3 chain C region, and among downregulated proteins in the disease were: Desmoplakin, annexins, S100-A8/A9 proteins, and keratins. Conclusions: This pilot study is providing a novel insight into the protein profiles of gingival healthy and diseased tissues, which may contribute to the improvements in diagnosis, prognosis and better understanding of aggressive periodontitis pathogenesis. LC-MS/MS technology proved to be an effective method for the proteome analysis of the gingival tissues.