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El receptor acoplado a proteína G vGPCR es expresado por el herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV). Es un receptor constitutivamente activo y oncogénico que subvierte la proliferación celular y dispara cascadas de señalización que inducen la transformación celular en el sarcoma de Kaposi (KS). La enzima Ciclooxigenasa-2 (COX-2) juega un rol importante en el proceso de inflamación y en la progresión del cáncer, y se encuentra altamente expresada en lesiones de KS. Con el objetivo de dilucidar los componentes moleculares que participan en los caminos de señalización que convergen en COX-2 encontramos varias líneas de evidencia que muestran que vGPCR regula tanto la expresión como la actividad de COX-2 a través de la señalización por MAPK. Nuestros resultados muestran que la expresión de vGPCR dispara señales que aumentan los niveles de COX-2 a través de un efecto dual entre su promotor y la región del 3’UTR que controla la estabilidad del ARN mensajero maduro. Ambos eventos se encuentran mediados a través de las kinasas ERK1/2 y p38, siendo estas intermediarias en la señalización disparada por vGPCR. Por otro lado, demostramos que la inhibición farmacológica de COX-2 en células transformadas por vGPCR afecta la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y la angiogénesis disparada por dicho receptor. Estos resultados contribuyen a dilucidar la naturaleza de la regulación disparada por el receptor oncogénico vGPCR y muestran a COX-2 como un factor crítico en la oncogénesis y un posible target para la prevención y tratamiento de la oncogénesis disparada por el KSHV. The G protein-coupled receptor vGPCR is encoded by the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV). It is a constitutively active and oncogenic receptor that subverts proliferative and inflammatory signaling pathways that induce cell transformation in Kaposi’s sarcoma (KS). Cyclooxygenase-2 (COX-2) is an inflammatory mediator that plays a key regulatory role in tumor progression. In order to find the molecular components that participate in the signaling pathways that converge in COX-2 we found evidence that shows that vGPCR regulates both COX-2 expression and activity through MAPK signaling. We show that vGPCR expression triggers signaling pathways that upregulate COX-2 levels due to a dual effect upon both its gene promoter region and, in mature mRNA, the 3’UTR region that controls mRNA stability. Both events are mediated through ERK1/2 and p38 MAPK pathways as a consequence of the signaling triggered by vGPCR. We demonstrate that pharmacological inhibition of COX-2 in vGPCR- transformed cells impairs the expression of the vascular endothelial growth factor (VEGF) and also impairs vGPCR-driven angiogenesis. These results contribute to define the nature of the regulation triggered by the oncogenic receptor vGPCR, defining COX-2 as a critical factor in KS tumorigenesis and as a potential target for the prevention and treatment of KSHV- oncogenesis. Fil: Medina, María Victoria. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Existen varios niveles de control que interactúan en forma dinámica y coordinada para mantener la especificidad de la señalización: la secuencia blanco alrededor del sitio de fosforilación, la presencia o ausencia de proteínas que permiten el anclaje de la quinasa a través de la subunidad regulatoria y que regulan de esta manera la interacción quinasa–sustrato, la localización subcelular diferencial de las subunidades catalíticas frente a distintos estímulos y los niveles de expresión del sustrato y la quinasa. La PKA de S.cerevisiae es una holoenzima compuesta por un dímero de subunidad regulatoria, Bcy1, y dos subunidades catalíticas, Tpk1, Tpk2 y Tpk3. Las distintas subunidades se expresan diferencialmente en condiciones como el estrés térmico y salino o disponibilidad y tipo de fuente de carbono. La regulación de la expresión de cada subunidad de la holoenzima es uno de los niveles de control que determinan la especificidad de la respuesta cAMP-PKA. El objetivo general de este trabajo fue contribuir a dilucidar los mecanismos moleculares que controlan la especificidad en la vía de señalización de cAMP-PKA en S.cerevisiae. En esta tesis estudiamos el mecanismo a través del cual la vía cAMP-PKA media su respuesta especifica al estrés térmico y a la adaptación térmica en la levadura. Demostramos que frente al estrés térmico a 37°C se inducen los niveles del mRNA de TPK1. Este incremento resulta de un aumento tanto en la actividad del promotor de TPK1 como de la vida media del transcripto. Sin embargo, no se detecta ningún cambio en los niveles de proteína Tpk1. Durante el estrés térmico el mRNA de TPK1 se ensambla en gránulos citoplasmáticos. Los gránulos resultan resistentes al tratamiento con cicloheximida y en un perfil de polisomas el transcripto de TPK1 se encuentra en mayor proporción en las fracciones que contienen monosomas o RNA libre, indicando que su traducción se encuentra inhibida. La regulación de la expresión de TPK1 se evaluó también durante condiciones de estrés térmico que promueven la termotolerancia. Una levadura que se expone de manera abrupta a un estrés térmico responderá de una forma menos eficiente que si, antes de exponerla a la temperatura elevada, se la somete por un período corto de tiempo a una temperatura no letal por encima de la óptima. En este caso la levadura adquiere una mayor capacidad de sobrevivir al estrés térmico. Este fenómeno se conoce como inducción de termotolerancia. En estas condiciones, realizando dos incubaciones a 37°C separadas por períodos de recuperación a 25°C, se observó que los gránulos que contienen mRNA de TPK1 son dinámicos, ensamblándose y desarmándose durante los cambios de temperatura. Mientras los niveles de mRNA aumentan en los períodos de incubación a 37°C, los niveles de proteína Tpk1 están significativamente aumentados en el periodo final de recuperación a 25°C. Entre los caminos que se activan en respuesta al estrés térmico en S. cerevisiae, se encuentra la vía CWI (Integridad de la pared celular). Para profundizar en el conocimiento de los mecanismos moleculares que regulan la expresión de TPK1, se analizó el entrecruzamiento entre las vías CWI y cAMP-PKA. Demostramos que el sensor Wsc3 es necesario para la regulación de la expresión de TPK1 durante el estrés térmico. De la cascada MAPK, que forma parte de la vía CWI y rio abajo del sensor, sólo la quinasa Mkk1 y el factor de transcripción Swi4 poseen un rol en la expresión de TPK1, en respuesta a este tipo de estrés. El ensamblado de los focos en el estrés térmico depende del sensor Wsc3. La expresión de proteína Tpk1 durante la termotolerancia es menor en una cepa mutante wsc3Δ que en la cepa WT. Se correlacionaron los cambios de expresión con la actividad PKA in vivo y consecuentemente al aumento de Tpk1 en la termotolerancia, se determinó que la actividad PKA en las células mutantes wsc3Δ resulta más baja. Todos estos resultados evidencian la participación de la vía CWI en la expresión de TPK1 durante el estrés térmico y aportan un antecedente más al entrecruzamiento de la vía CWI y PKA. Finalmente, realizamos experimentos para demostrar que la regulación de la expresión de la subunidad TPK1 en respuesta al estrés térmico, redunda en un cambio en la proporción de las isoformas que conforman la holoenzima. Demostramos que la cantidad de la isoforma Tpk1 en la holoenzima es significantemente mayor durante el segundo período de recuperación a 25°C, comparando con cualquiera de las otras condiciones testeadas. Los resultados en su conjunto indican la existencia de un mecanismo que regula la expresión de la subunidad Tpk1 frente a un determinado estímulo como es el estrés térmico. El incremento en la actividad de PKA dependiente de Tpk1 durante la adaptación celular al estrés por calor podría contribuir a la aptitud celular general cuando se restablecen condiciones ambientales más favorables. Los resultados indican la existencia de un mecanismo de regulación de la expresión de TPK1 que permite ajustar la especificidad de cAMP-PKA para que la célula logre la mejor respuesta a un determinado estímulo. Cells have developed complex signaling pathways that let them respond to different environmental stimuli. These signal transduction pathways allow the cell to monitor external environment and the internal state to mount the appropriate physiological responses. One of the most important signaling circuits in Saccharomyces cerevisiae is the cAMP-PKA (protein kinase A) pathway. In this yeast, extracellular glucose and a variety of signals related to growth and stress conditions regulate intracellular cAMP levels. cAMP modulates the activity of PKA, which by phosphorylation of target substrates, regulates a wide variety of cellular processes. The outcome of cAMP-PKA signaling requires tight control of responses specificity. There are several control levels that interact in a dynamic and coordinated way to maintain the specificity of the signaling: the target sequence around the phosphorylation site, the presence or absence of proteins that allow the anchoring of the kinase through the regulatory subunit, which regulates the kinase-substrate interaction, the differential subcellular localization of the catalytic subunits against different stimuli, and the expression levels of the substrate and the kinase. S.cerevisiae PKA is a holoenzyme composed of a regulatory subunit dimer, Bcy1, and two catalytic subunits, Tpk1, Tpk2, and Tpk3. The different subunits are differentially expressed under conditions such as thermal and saline stress or availability and type of carbon source. The expression regulation of each subunit from the holoenzyme is one of the control levels, which determine the specificity of the cAMP-PKA response. The general objective of this work was to contribute to elucidate the molecular mechanisms that control the specificity of the cAMP-PKA signaling pathway in S. cerevisiae. In this thesis we study the mechanism through which the cAMP-PKA pathway mediates its specific response to heat stress and thermal adaptation in yeast. We show that TPK1 mRNA levels are induced against heat stress at 37°C. This increase results from an increase in both TPK1 promoter activity and transcript half-life. However, no change in Tpk1 protein levels is detected. During heat stress TPK1 mRNA assembles into cytoplasmic granules. The granules are resistant to cycloheximide treatment and TPK1 transcript is found in greater proportion in the fractions containing monosomes or free RNA in a polysome profile, indicating translation inhibition. The regulation of TPK1 expression was also evaluated during heat stress conditions that promote thermotolerance. A yeast abruptly exposed to heat stress will respond less efficiently than if, prior to exposure to high temperature, it is subjected for a short period of time to a non-lethal temperature above the optimum. In this case, yeast acquires a greater ability to survive to heat stress. This phenomenon is known as thermotolerance induction. Under these conditions, carrying out two incubations at 37°C separated by recovery periods at 25°C, it was observed that the granules containing TPK1 mRNA are dynamic, assembling and disassembling during temperature changes. While mRNA levels increase in the 37°C incubation periods, Tpk1 protein levels are significantly increased in the final recovery period at 25°C. Among pathways that are activated in response to heat stress in S.cerevisiae is the CWI (Cell Wall Integrity) pathway. To deepen our knowledge of the molecular mechanisms that regulate TPK1 expression, the crossover between the CWI and cAMP-PKA pathways was analyzed. We show that Wsc3 sensor is required for the regulation of TPK1 expression during heat stress. From the MAPK cascade, which is part of the CWI pathway downstream the sensor, only the kinase Mkk1 and the transcription factor Swi4 play a role in TPK1 expression in response to this stress. The foci assembly in thermal stress depends on the sensor Wsc3. Tpk1 protein expression during thermotolerance is lower in a wsc3Δ mutant strain than in the WT strain. Changes in expression were correlated with PKA activity in vivo and consequently, as Tpk1 increased in thermotolerance, PKA activity in wsc3Δ mutant cells was lower. All these results show the CWI pathway participation in TPK1 expression during heat stress and provide another background to the crossover of CWI and PKA pathways. Finally we performed experiments to demonstrate that TPK1 subunit expression regulation in response to thermal stress results in a change in isoforms proportion that make up the holoenzyme. We show that the amount of the Tpk1 isoform in the holoenzyme is significantly higher during the second recovery period at 25°C, compared to any other conditions tested. The results as a whole indicate the existence of a mechanism that regulates Tpk1 subunit expression against a certain stimulus such as thermal stress. The increase in Tpk1-dependent PKA activity during cellular adaptation to heat stress could contribute to overall cellular fitness when more favorable environmental conditions are restored. The results indicate the existence of a mechanism for regulating TPK1 expression that allows adjusting the specificity of cAMP-PKA so that the cell achieves the best response to a given stimulus. Fil: Cañonero, Luciana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La hormona liberadora de corticotropina (CRH) ejerce un rol central en la respuesta neuroendocrina y comportamental al estrés, dirigiendo la activación del eje hipotálamo- hipófisis-adrenal y actuando como neuromodulador en el sistema nervioso central. Su desregulación se relaciona con desórdenes psiquiátricos y con el inicio de procesos neurodegenerativos. Nuestro objetivo es definir las vías de señalización de CRH por el receptor CRHR1 y los componentes moleculares involucrados, con potencial relevancia terapéutica en desórdenes ligados a estrés. CRHR1 es un GPCR clase B que se encuentra generalmente acoplado a proteína Gs, por lo que su activación promueve el aumento intracelular del segundo mensajero AMP cíclico (AMPc) y la consecuente activación de diversas cascadas de señalización. Hasta el momento, la vía de las MAP quinasas (MAPKs) fue la más estudiada río abajo de este receptor. En trabajos previos hemos descripto que el CRHR1 activa mecanismos dependientes de proteína G y otros dependientes de la endocitosis, los cuales se evidencian en la activación bifásica de la MAPKs ERK1/2 en la línea celular hipocampal murina HT22 que expresa el receptor de CRH tipo 1 (HT22-CRHR1). Hemos demostrado además que existen dos fuentes de AMPc asociadas a la activación del CRHR1, que involucran no solo a las adenilil ciclasas transmembrana (tmACs) sino también a la adenilil ciclasa soluble (sAC). Ambas fuentes participan en la fase aguda de activación de ERK1/2 pero solo sAC es esencial para la activación sostenida de esta quinasa. Como se ha descripto recientemente para un grupo de GPCRs, el CRHR1 activado continúa señalizando luego de su internalización. Akt es una serin/treonin quinasa presente en la mayoría de los tejidos, cuya actividad media procesos celulares diversos como el crecimiento, la proliferación y el metabolismo. En el cerebro, la vía de Akt tiene implicancias en la respuesta a estrés, la neurotransmisión y la plasticidad sináptica. A su vez, se ha descripto que el efecto antidepresivo de numerosas drogas es mediado por la cascada de PI3K-Akt. En este trabajo nos propusimos evaluar si la vía de PI3K-Akt estaba involucrada en la señalización del sistema CRH/CRHR1 y si existía un crosstalk con la ya descripta cascada de MAPKs. En las HT22-CRHR1, Akt se fosforila en respuesta al estímulo de CRH y esta fosforilación es dependiente del pool de AMPc generado por la sAC. Sin embargo, esta activación no depende de los efectores clásicos de AMPc (PKA y EPACs) sino que parece estar mediada por la proteína quinasa Src. En base al estado de fosforilación de diversos sustratos pudimos determinar que el Akt fosforilado (pAkt) es funcional en estas células. El perfil de activación de Akt resultó ser opuesto al de ERK1/2 lo cual sugería una posible conexión entre estas vías. La inhibición farmacológica de MEK no tuvo efecto sobre la activación de Akt, mientras que inhibir tanto PI3K como Akt disminuyó los niveles de ERK1/2 fosforilado (pERK1/2) en respuesta a CRH. Por el contrario, la inhibición de la vía PI3K-Akt llevó a un aumento de la respuesta global de AMPc mediada por CRH y de CREB fosforilado (pCREB). Teniendo en cuenta que la activación de Akt solapa temporalmente con la segunda fase de activación de ERK1/2 que es dependiente de la endocitosis, evaluamos los niveles de pAkt en células en las que la internalización fue bloqueada. Determinamos que al igual que para ERK1/2, la endocitosis del CRHR1 es crucial para la fosforilación de Akt. Mediante el análisis de colocalizaciones entre el receptor y marcadores de distintos compartimentos de vesículas y organelas de membrana, exploramos la identidad de las estaciones por las que transita el CRHR1 luego de su internalización. CRHR1 activado se detecta en endosomas tempranos (Rab5+), de reciclado (Rab11+) y en un compartimento sintaxina-6 positivo. CRHR1 colocaliza además, con los efectores de Rab5 APPL1 y EEA1. En HT22-CRHR1 silenciadas establemente mediante el uso de shRNAs, la depleción de APPL1 disminuyó los niveles de pAkt sin afectar la fosforilación de ERK1/2 en respuesta a CRH, mientras que la pérdida de EEA1 tuvo el efecto contrario. Estos resultados indican que la vía de PI3K-Akt se activa río abajo del CRHR1 en un contexto neuronal y que existe un crosstalk entre Akt y ERK1/2. Por otra parte, el hecho de que la fosforilación de Akt sea dependiente de la internalización del receptor y de la proteína endosomal APPL1, refuerza la idea de que el CRHR1 activado señaliza desde compartimientos intracelulares. Corticotrophin releasing hormone (CRH) plays a key role in the regulation of neuroendocrine, autonomic, and behavioral response to stress. In the central nervous system it drives hypothalamic-pituitary-adrenal axis activation and can act as a neuromodulator. Dysregulation of the CRH/CRHR1 system is crucial in the pathogenesis of disorders like anxiety and depression. Our aim is to characterize signaling pathways downstream CRH-activated CRHR1 with potential therapeutic value in stress-related disorders. CRHR1 is a class B GPCR that signals mainly by Gs coupling, leading to an increase of cyclic AMP (cAMP) and the activation of multiple signaling cascades. Up to date the MAPKs pathway has been the most studied downstream of this receptor. We have previously described that CRHR1 activates G protein-dependent and receptor endocytosis-dependent mechanisms evidenced as a biphasic ERK1/2 activation in the mouse hippocampal cell line HT22 stably expressing CRHR1 (HT22-CRHR1). We have shown that upon stimulation, CRHR1 engages separate cAMP sources, involving the soluble adenylyl cyclase (sAC) in addition to transmembrane adenylyl cyclases. Both sources participate in the acute activation of ERK1/2, but only sAC activity is essential for the sustained phospho-ERK1/2 (pERK1/2) phase. Moreover, we demonstrated that CRHR1 continues to generate cAMP from endocytic compartments, uncovering a link between sAC and endosome based GPCR signaling. Akt is a central serine/threonine kinase expressed in almost all cell types throughout the body which regulates several cellular processes such as cell growth, proliferation, and metabolism. In the brain, Akt pathway has significant functional impact on stress responses, neurotransmission, and synaptic plasticity. PI3K-Akt signaling has also been implicated in the etiology of mood disorders as well as in the antidepressant-like effects of various psychiatric drugs. In this work we wanted to assess whether the PI3K-Akt pathway was involved in CRH/CRHR1 signaling and if there was a crosstalk with the MAPKs cascade. In HT22-CRHR1 cells, Akt was phosphorylated downstream activated CRHR1 in a cAMP-dependent manner. However, this activation did not rely on classic cAMP effectors (PKA and EPACs) but seems to be mediated by Src kinase. Phosphorylated Akt (pAkt) was active as evidenced by the phosphorylation state of substrates. pAkt profile was opposite to that of pERK1/2 which suggested a possible crosstalk between these pathways. Inhibition of MEK had no effect on Akt activation, whilst pharmacological inhibition of either PI3K or Akt diminished pERK1/2 levels in response to CRH. On the contrary, PI3K-Akt inhibition appeared to increase CRH-mediated cAMP response and CREB phosphorylation. Given that Akt activation temporally overlapped with the endocytosis-dependent phase of ERK1/2 activation, we evaluated pAkt levels in cells where internalization had been blocked and found that CRHR1 endocytosis is indeed required for Akt phosphorylation. Next, we wanted to determine the identity of the endocytic compartments to which CRHR1 transits after internalization. Colocalization analysis between the receptor and several endocytic compartment markers showed that activated CRHR1 transits to early (Rab5+) and recycling (Rab11+) endosomes, as well as to a syntaxin-6 positive compartment. CRHR1 also colocalized with two Rab5 effectors, APPL1 and EEA1. APPL1 silencing by shRNAs lead to a decrease in pAkt levels without affecting ERK1/2 activation, whereas EEA1 depletion had the opposite effect. These results indicate that PI3K-Akt pathway is activated downstream CRHR1 in a neuronal context and that there is a crosstalk between Akt and ERK1/2. Moreover, Akt phosphorylation dependent on receptor internalization and endosomal APPL1, reinforces the idea of CRHR1 signaling from endosomes. Fil: dos Santos Claro, Paula Ayelén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

PipX es una proteína única de cianobacterias identificada por su habilidad para interactuar de forma excluyente con PII y NtcA, dos reguladores clave implicados en la integración de señales de nitrógeno/carbono y energía, estableciendo un vínculo mecanístico entre ambos. Sin embargo, los datos recabados indican que el papel de PipX no se limita únicamente a esto, sino que parece formar parte de una red de señalización más amplia exclusiva de cianobacterias. La formación de los complejos PII-PipX no solo permite el secuestro de PipX, impidiendo la co-activación de NtcA, sino que favorece la formación de los complejos con el regulador transcripcional cianobacteriano PlmA. Esta interacción con PII afecta a la localización dinámica de PipX en respuesta al estado energético de la célula, limitando su actividad a condiciones de alta energía. Además, PipX está funcionalmente conectado con pipY, el gen aguas abajo que codifica a un miembro de la familia de proteínas PLPBP, universalmente distribuidas e implicadas en la homeostasis de la vitamina B6 y amino ácidos y, en humanos, epilepsia dependiente de vitamina B6. No solo PipX sería capaz de controlar a nivel traduccional la expresión de PipY, sino que ambos participarían en el control de la expresión génica y vías metabólicas comunes. Por último, el análisis de genomas cianobacterianos posiciona a PipX en una red de interacción con PipY y otras 4 proteínas con las que PipX podría tener una relación funcional.

Summary Oncogenic transformation is associated with profound changes in cellular metabolism, but whether tracking these can improve disease stratification or influence therapy decision-making is largely unknown. Using the iKnife to sample the aerosol of cauterized specimens, we demonstrate a new mode of real-time diagnosis, coupling metabolic phenotype to mutant PIK3CA genotype. Oncogenic PIK3CA results in an increase in arachidonic acid and a concomitant overproduction of eicosanoids, acting to promote cell proliferation beyond a cell-autonomous manner. Mechanistically, mutant PIK3CA drives a multimodal signaling network involving mTORC2-PKCζ-mediated activation of the calcium-dependent phospholipase A2 (cPLA2). Notably, inhibiting cPLA2 synergizes with fatty acid-free diet to restore immunogenicity and selectively reduce mutant PIK3CA-induced tumorigenicity. Besides highlighting the potential for metabolic phenotyping in stratified medicine, this study reveals an important role for activated PI3K signaling in regulating arachidonic acid metabolism, uncovering a targetable metabolic vulnerability that largely depends on dietary fat restriction. Video Abstract, Graphical Abstract, Highlights • The iKnife offers near real-time diagnosis of PIK3CA mutant breast cancers • Oncogenic PIK3CA promotes enhanced arachidonic acid via mTORC2-PKCζ-cPLA2 signaling • Mutant PIK3CA regulates proliferation beyond a cell autonomous manner • cPLA2 inhibition and dietary fat restriction suppress PIK3CA-induced tumorigenicity, Metabolic fingerprinting using the iKnife offers near real-time diagnosis of PIK3CA mutant breast cancers and connects oncogenic PIK3CA with enhanced arachidonic acid metabolism. cPLA2 inhibition shows remarkable synergy with dietary fat restriction to restore tumoral immune cell infiltration and inhibit growth of mutant PIK3CA-bearing breast tumors.

Trypanosoma cruzi es un protozoo unicelular kinetoplástido de vida parasitaria y agente causal de la enfermedad de Chagas. La misma es endémica en Latinoamérica, aunque su contagio se ha expandido a otras regiones, y continúa siendo al día de hoy y desde su descubrimiento en 1909 una enfermedad desatendida. No existen vacunas que protejan de esta enfermedad ni ninguna otra causada por los tripanosomátidos patógenos relacionados (Trypanosoma brucei y Leishmania sp.). Las drogas terapéuticas usadas son las mismas desde hace 50 años, presentando una moderada eficacia en la mejora de la calidad de vida debido a los diversos efectos secundarios del tratamiento. Por lo tanto, es de vital importancia la continua búsqueda de blancos terapéuticos entre las vías celulares esenciales para la supervivencia y desarrollo del ciclo de vida de estos parásitos. T. cruzi posee un ciclo de vida digenético, atravesando dos estadíos proliferativos y dos infectivos, con morfologías y metabolismos muy diferentes. En su pasaje del insecto vector al hospedador mamífero, y viceversa, debe capacitarse para enfrentar cambios abruptos en las condiciones ambientales y sobrevivir. Estas adaptaciones se dan a través de las vías de respuesta a estrés. Es por la complejidad de este ciclo de vida que las vías de sensado y señalización que le permiten al parásito adaptarse presentan características únicas y divergentes con respecto a sus hospedadores y otros organismos de vida libre. Este trabajo inicia con la hipótesis que sugiere que el bloqueo de las vías de señalización mediadas por segundos mensajeros en el parásito llevaría a su inhabilitación para adaptarse y proseguir con su ciclo de vida. Una de las moléculas mensajeras más importantes en distintos tipos celulares son los nucleótidos de adenosina. En tripanosomátidos se han estudiado de manera exponencial y se vio que están involucrados en procesos esenciales como la diferenciación, la infección, la proliferación, el comportamiento social, entre otros. Sin embargo, muchas de las proteínas canónicas involucradas en estas vías no se pudieron hallar en los genomas de estos organismos. Y muchas veces, aquellas que sí se encuentran presentan características funcionales, estructurales y/o de secuencia divergentes y novedosas. Todo esto las vuelve prometedores blancos de drogas terapéuticas. En el primer capítulo evaluamos el rol del AMPc en la respuesta a estrés oxidativo en T. cruzi. Encontramos que un aumento de la concentración intracelular de AMPc por tratamientos con análogos permite que los epimastigotes sean más resistentes ante estrés oxidativo producido por tratamientos con peróxido de hidrógeno. Mientras que la sobre-expresión de la fosfodiesterasa citoplasmática TcrPDEA1, lo cual reduce los niveles de AMPc intracelular, los vuelve más sensibles. En el estadío de tripomastigote, sin embargo, los resultados fueron más complejos en su interpretación. El tratamiento solamente con el análogo de AMPc sobre los parásitos produjo una mayor infección luego de 48 hs. Sin embargo, el agregado de peróxido produjo una caída en la infección indistintamente de la presencia del análogo. Además, resultados obtenidos con dosis bajas de peróxido presentan la posibilidad de que las vías de señalización por AMPc y los procesos desencadenados por el estrés estén interactuando. En el segundo capítulo identificamos y caracterizamos la quinasa de proteínas activada por AMP en T. cruzi. Esta enzima heterotrimérica es central en la regulación de la homeostásis energética de las células, en especial en respuesta a diferentes tipos de estrés por variaciones en la disponibilidad de nutrientes o que alteran los balances AMP:ATP intracelulares. En este trabajo confirmamos por primera vez la presencia de genes que codifican para los ortólogos de las subunidades de AMPK en T. cruzi. Estos ortólogos presentan una alta conservación de los dominios proteicos esperados, aunque sus secuencias codificantes divergen de sus ortólogos en otros organismos. Así mismo, se encontraron dos isoformas de la subunidad catalítica, con divergencia en sus secuencias y funcionalidades diferentes. Estudios filogenéticos confirman que existieron procesos de selección positiva que llevaron a una posible neofuncionalización de estas subunidades. Mediante diferentes ensayos in vitro e in vivo confirmamos su funcionalidad, actividad y algunos de sus posibles roles en epimastigotes. Particularmente mostramos que la fosforilación necesaria para su activación es modulada ante la presencia o ausencia de glucosa o aminoácidos como fuentes de carbono. También encontramos por ensayos con inhibidores y líneas de epimastigotes sobre-expresantes, que esta enzima juega un rol en la autofagia durante el hambreado de los parásitos y en su proliferación. En conclusión, estos estudios revelan nuevos roles de los nucléotidos de adenosina y las proteínas que responden a estos mensajeros en procesos fisiológicos del parásito T. cruzi. También amplían el repertorio de vías de señalización por AMP conocidas en estos parásitos y los procesos en los que se encuentran involucradas. Trypanosoma cruzi is a unicelular kinetoplastid protozoan parasite and the causative agent of Chagas disease. This affliction is endemic in Latin America, although it has spread to other regions, and is, since its discovery in 1909 to this day, a neglected disease. There are no vaccines to prevent it or any of the other parasitic diseases caused by trypanosomatid parasites (Trypanosoma brucei and Leishmania sp.). The therapeutic drugs used today have been the only ones available for the last 50 years, with only a moderate efficacy in the improvement of the patient’s quality of life, due to the side effects of the treatment. Hence, it is of vital importance to continue the search for drug targets in the biological pathways essential for these parasites’ survival and development. T. cruzi has a digenetic life cycle, transitioning between two proliferative and two infective stages, with very different morphologies and metabolisms. Through its passage from the insect vector to the mammalian host and vice versa, the parasite must face abrupt environmental changes and adapt to survive. These adaptations depend on the stress response cellular pathways. It is due to the complexity of the life cycle that these pathways show unique and divergent characteristics compared to the hosts and other free-living organisms. This work begins with the hypothesis that suggests that the blockage of the signaling pathways mediated by second messengers in the parasite would lead to its inability to adapt and proceed with the life cycle. One of the most important messenger molecules in different organisms are the adenosine nucleotides. These have been exponentially studied in trypanosomatids and connected with essential cellular processes such as proliferation, differentiation, infection, social motility and behavior, amongst others. However, a lot of the canonic proteins found as participants of these pathways are not found in trypanosomatids’ genomes. And many times, those that are present, show new and divergent functional, morphological or sequence characteristics. All the facts described above make these proteins promising therapeutic targets. In the first chapter, we evaluate cAMP role in the oxidative stress response in T. cruzi. We found that an increase in intracellular concentrations of cAMP by treatment with cAMP analogs confers epimastigotes a higher resistance to oxidative stress caused by hydrogen peroxide. The overexpression of the cytoplasmic phosphodiesterase TcrPDEA1, which instead decreases the intracellular cAMP levels, increases the epimastigotes’ sensitivity to oxidative stress. For the trypomastigote stage, however, results were more complex. cAMP treatment alone on the parasites before infection increases amastigote number obtained after 48 h infections. Nonetheless, hydrogen peroxide treatment decreased infectivity in a dose dependent manner with or without cAMP treatment. In addition, results obtained with cAMP analogs and low doses of hydrogen peroxide suggest these pathways have some crosstalk in this stage. In the second chapter, we identified and characterized the AMP-activated protein kinase in T. cruzi (TcAMPK). This heterotrimeric enzyme is central to the regulation of cellular energy homeostasis, especially in response to stress produced by variations in carbon source or alterations of the AMP:ATP ratio. In this work we confirmed for the first time the presence of coding genes for the three AMPK subunits orthologs in T. cruzi. These genes present high conservation in the expected protein domains, although their sequences diverge from those in other organisms. Furthermore, we found two isoforms for the catalytic subunit (alpha), with important differences in their sequences and distinctive functions. Phylogenetic analysis confirmed that some residues in the alpha subunits’ sequences suffered positive selection through evolution that led to a possible neofunctionalization. Through different in vitro and in vivo assays we confirmed functionality, activity and putative roles in epimastigotes. Particularly, we show that the activation loop phosphorylation, necessary for AMPK activation, is modulated with the presence or absence of glucose or amino acids in the culture media. Also, using a specific AMPK inhibitor and epimastigotes overexpressing alpha subunits, we found that this enzyme plays a role in autophagy and in the growing curve. In conclusion, these studies reveal new roles for adenosine nucleotides and proteins involved in these pathways in physiological processes of T. cruzi. Also, they expand the repertoire of AMP signaling pathways know for these parasites and the processes they are involved in. Fil: Sternlieb, Tamara. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

RESUMEN: El cáncer de mama es la neoplasia más frecuente en la mujer y una de las principales causas de mortalidad. En sus inicios, la mayor parte de los tumores mamarios presentan un crecimiento dependiente de los estrógenos sintetizados en el ovario. Por lo tanto, en el tratamiento de este tipo de tumores se utilizan moléculas capaces de inhibir la síntesis y la acción de los estrógenos, como el tamoxifeno o los inhibidores de la aromatasa. La melatonina es una hormona que se sintetiza en la glándula pineal y alcanza su pico máximo en plasma en mitad de la noche. Su principal función es regular los ritmos circadianos. Otras funciones de la melatonina son la capacidad de modular el sistema inmunitario, actuar como anti-oxidante, o tener un papel protector en el sistema cardiovascular. Además, existen numerosos estudios que afirman que la melatonina posee acciones oncostáticas, protegiendo así contra el inicio y la progresión del cáncer mamario hormono-dependiente, debido a su capacidad antiestrógenica. En esta revisión bibliográfica, se ha recopilado la información existente acerca de las acciones de la melatonina en el cáncer de mama dependiente de estrógenos. Al mismo tiempo, hemos recogido la información existente sobre los ensayos realizados (aún no suficientes), que sugieren que esta hormona puede tener efectos beneficiosos para el paciente cuando es administrada en el tratamiento del cáncer de mama combinada con otras terapias convencionales (quimioterapia y radioterapia). Por último, también se recogen los estudios que proponen que la luz puede tener efectos carcinógenos sobre las mujeres que trabajan en turnos de noche durante años, ya que la exposición a la luz artificial durante la noche impide la secreción adecuada de melatonina nocturna y por lo tanto, ésta indolamina no puede frenar el efecto proliferativo del estradiol sobre las células tumorales. ABSTRACT: Breast neoplasms are the most common types of cancer among women and one of the main causes of mortality. Most of newly diagnosed breast tumors are at their initial stages hormonedependent, and estrogens, synthesized in the ovary, contribute to tumor genesis and progression. Therefore, in estrogen-responsive breast cancer, the use of drugs able to inhibit the synthesis of estradiol (aromatase inhibitors) or to block the estrogen receptor activity (tamoxifen) is indicated. Melatonin is the pineal gland hormone, with maximal nocturnal peak concentrations. Its main function is to act as a circadian synchronizer, but it also modulates the immune system, has antioxidant actions and protective effects in bone and cardiovascular system. Besides, many reports claim that melatonin is an oncostatic agent, impairing hormonedependent breast cancer initiation and progression, mainy through its antiestrogenic actions. In this state-of the-art review, our goal was to compile the knowledge about the oncostatic actions of the pineal hormone in hormone-dependent tumors and the findings suggesting that melatonin can have benefitial actions when applied in combination with radio- or chemotherapy. Finally, we reviewed the articles suggesting that light-at-night might have carcinogenic effects in woman in rotating night-shift work, since environmental light blocks melatonin secretion and thus, the inhibitory effects of the pineal hormone on estrogens synthesis would not be accomplished. Grado en Enfermería

Las vías de señalización celulares son las encargadas de transmitir la información sobre el estado del ambiente intra y extracelular. En el sistema de respuesta a feromona sexual (SRF), las células de levadura Saccharomyces cerevisiae convierten señales externas en medidas cuantitativas para tomar decisiones sobre su destino. Para aparearse, las levaduras deben evaluar la proximidad y la dirección de la compañera. Para ello, se comunican mediante la secreción y detección de feromonas sexuales. La concentración externa de feromona codifica la cercanía entre las células: sólo a altas concentraciones de la señal se produce el arresto del ciclo celular y la activación del programa de apareamiento. En el tipo sexual “a” la molécula que sensa la feromona es un receptor acoplado a proteína G, Ste2. Una característica notable de este sistema es que, a pesar de existir una elevada variabilidad en la cantidad de receptor en las distintas células, la respuesta de la población es uniforme. Resultados previos de nuestro laboratorio, basados en modelado matemático, indicaban que el SRF era capaz de medir la fracción de receptor ocupado en lugar de la cantidad total de complejo ligando-receptor y, así, responder de forma independiente al número de receptores Esta propiedad radica en que el receptor presenta actividades antagónicas: cuando está ocupado activa la respuesta mientras que cuando está desocupado la inhibe. En esta tesis, se demuestra que la medición fraccional depende la unión al receptor de una proteína inhibitoria (Sst2). Mutantes en que esta asociación se encuentra bloqueada pierden tanto la medición fraccional como la robustez al cambio en la cantidad de receptores. Por otro lado, dado que las levaduras son sésiles, la detección de la concentración externa de feromona no es suficiente para lograr el apareamiento: las células deben crecer en dirección a su compañera. En la determinación de la dirección del gradiente, el receptor unido a ligando recluta a la maquinaria de polarización para dirigir el crecimiento celular hacia la fuente de feromona. Sin embargo, esta maquinaria es compartida con el proceso de gemación que polariza utilizando marcas internas. Para estudiar la competencia entre el gradiente de feromona y estas marcas internas, se expuso a células a gradientes artificiales generados mediante microfluídica. Los resultados revelaron una compleja interacción entre las marcas internas y el gradiente externo donde algunas proteínas de posicionamiento orientan la polarización de forma dependiente de feromona (Rax1/2, Rsr1) y otras de forma independiente de la señal (Bud8, Bud9, Axl2). Se pudo comprobar que estas marcas interfieren con la detección de la dirección del gradiente. En conclusión, en esta tesis se describen dos aspectos fundamentales del procesamiento de la información extracelular: la medición fraccional de la concentración externa de una señal y su competencia con información proveniente del medio interno a la hora de polarizar en la dirección de un gradiente. Ambos aspectos resultan claves para comprender el proceso de apareamiento celular. Information about the external world is sensed and transmitted through cell signaling systems. In the pheromone response, Saccharomyces cerevisiae cells convert extracellular signals into quantitative measurements for cellular fate decisions. To achieve mating, yeast cells of opposite mating types must evaluate the proximity and the direction of the mating partner. Cells communicate by secreting and detecting sexual pheromones. External signal concentration codes the distance between cells in a way that only high concentrations of pheromone arrest the cell cycle and promotes mating. In MATa sexual type, Ste2, a G-protein coupled receptor, is the receptor that binds and senses pheromone. A notable feature of this system is that, in spite of the cell-to-cell variability in the expression of Ste2, the population of cells respond uniformly. This observation required mechanisms that could account for this receptor number independent behavior. Previous results from our group, based on mathematical modeling, indicated that the system was able the measure the fraction of ligand occupied receptors instead of the total number of ligand-receptor complexes. This property emerged from the antagonistic activities of the receptor: when occupied it activates signaling but, when unoccupied, it inactivates it. In this thesis, we demonstrated that this ability relies on the interaction between the receptor and an inhibitory protein (Sst2). Mutants in which this interaction is blocked showed both impaired fractional measurement as well as no robustness to changes in receptor abundance. On the other hand, given that yeast cells are sessile, concentration determination of pheromone is not enough to achieve mating: cells must grow in the direction of its partner. In gradient sensing, occupied receptors recruit the polarization machinery towards the source of pheromone. However, this machinery is shared with budding which polarizes using internal cues placed in the poles of the cell. To study the competence between the pheromone gradient and the internal landmarks, a microfluidic system was set up for the generation of stable pheromone gradients. Results revealed a complex interaction between these signals. Some positioning proteins oriented the polarization in a pheromone dependent way (Rax1/2, Rsr1) whereas others were signal independent (Bud8, Bud9, Axl2). When subjected to gradients, these landmarks interfered with gradient sensing. In summary, in this thesis we described two fundamental aspects of external information processing: fractional measurement of extracellular signal concentration and its competition with information from the internal cellular media for polarizing. Both behaviors are key to understand yeast mating. Fil: Vasen, Gustavo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil: Sapochnik, Daiana A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Bacillus subtilis responds to a sudden decrease in temperature by transiently inducing the expression of the des gene encoding for a lipid desaturase, D5-Des, which introduces a double bond into the acyl chain of preexisting membrane phospholipids. This D5-Des-mediated membrane remodeling is controlled by the cold-sensor DesK. After cooling, DesK activates the response regulator DesR, which induces transcription of des. We show that inhibition of fatty acid synthesis by the addition of cerulenin, a potent and specific inhibitor of the type II fatty acid synthase, results in increased levels of short-chain fatty acids (FA) in membrane phospholipids that lead to inhibition of the transmembraneinput thermal control of DesK. Furthermore, reduction of phospholipid synthesis by conditional inactivation of the PlsC acyltransferase causes significantly elevated incorporation of long-chain FA and constitutive upregulation of the des gene. Thus, we provide in vivo evidence that the thickness of the hydrophobic core of the lipid bilayer serves as one of the stimulus sensed by the membrane spanning region of DesK. Fil: Porrini, Lucía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario, Facultad de Ciencias Bioqu ímicas y Farmacéuticas, Departamento de Microbiolog ía; Argentina Fil: Cybulski, Larisa Estefania. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario, Facultad de Ciencias Bioqu ímicas y Farmacéuticas, Departamento de Microbiolog ía; Argentina Fil: Altabe, Silvia Graciela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario, Facultad de Ciencias Bioqu ímicas y Farmacéuticas, Departamento de Microbiolog ía; Argentina Fil: Mansilla, Maria Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario, Facultad de Ciencias Bioqu ímicas y Farmacéuticas, Departamento de Microbiolog ía; Argentina Fil: de Mendoza, Diego. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina. Universidad Nacional de Rosario, Facultad de Ciencias Bioqu ímicas y Farmacéuticas, Departamento de Microbiolog ía; Argentina

Nowadays, much attention has been paid to diet and dietary supplements as a cost-effective therapeutic strategy for prevention and treatment of a myriad of chronic and degenerative diseases. Rapidly accumulating scientific evidence achieved through high-throughput technologies has greatly expanded the understanding about the multifaceted nature of cancer. Increasingly, it is being realized that deregulation of spatio-temporally controlled intracellular signaling cascades plays a contributory role in the onset and progression of cancer. Therefore, targeting regulators of oncogenic signaling cascades is essential to prevent and treat cancer. A plethora of preclinical and epidemiological evidences showed promising role of phytochemicals against several types of cancer. Oleanolic acid, a common pentacyclic triterpenoid, is mainly found in olive oil, as well as several plant species. It is a potent inhibitor of cellular inflammatory process and a well-known inducer of phase 2 xenobiotic biotransformation enzymes. Main molecular mechanisms underlying anticancer effects of oleanolic acid are mediated by caspases, 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase, extracellular signal-regulated kinase 1/2, matrix metalloproteinases, pro-apoptotic Bax and bid, phosphatidylinositide 3-kinase/Akt1/mechanistic target of rapamycin, reactive oxygen species/apoptosis signal-regulating kinase 1/p38 mitogen-activated protein kinase, nuclear factor-kappa B, cluster of differentiation 1, CKD4, s6k, signal transducer and activator of transcription 3, as well as aforementioned signaling pathways. In this work, we critically review the scientific literature on the molecular targets of oleanolic acid implicated in the prevention and treatment of several types of cancer. We also discuss chemical aspects, natural sources, bioavailability, and safety of this bioactive phytochemical., This article is the outcome of an in-house financially non-supported study. A. Sureda was partially supported by the Spanish Ministry of Health, Social Services and Equality (CIBEROBN-CB12/03/ 30038).

El pH juega un papel clave en el control de la patogénesis fúngica. En el patógeno del suelo Fusarium oxysporum, causante de la marchitez vascular, el pH actúa como regulador maestro de Fmk1, una MAPK altamente conservada, esencial para el crecimiento invasivo y patogénesis en raíces de tomate. Estudios previos demostraron que el pH también regula las MAPKs Mpk1 y Hog1, de manera opuesta a Fmk1. Sin embargo, se desconocen los mecanismos moleculares de la respuesta al pH. En el presente trabajo se ha investigado, si el pH del medio afecta las rutas MAPK a través de un cambio en el pH intracelular (pHi). Se ha determinado que el pHi funciona como una señal para la regulación de las rutas MAPK en F. oxysporum. El tratamiento de las células con diethylstilbestrol (DES), un inhibidor especifico de Pma1, la principal bomba de protones de la membrana plasmática, conlleva una rápida y sostenida bajada del pHi, acompañada de una rápida y transitoria activación de las MAPKs Mpk1 y Hog1, y la inactivación de Fmk1. Esta respuesta esta conservada en la levadura panadera Saccharomyces cerevisiae, lo que indica que está conservado en hongos. Por ello se ha utilizado la levadura como modelo para investigar el mecanismo de activación de Mpk1 por acidificación del pHi. Se identificaron: una ruta alternativa de la respuesta a stress de pared, mediada por la quinasa Ypk1/2; la rama Sln1 de la ruta Hog1; y la MAPK fosfatasa Msg5 cuya abundancia es afectada por el pHi. En segundo lugar, un escrutinio realizado con mutantes knockout sensibles a ácido identificó un gran número de proteínas candidatas implicadas en la activación de Mpk1 inducida por DES. Muchos de ellos poseen ortólogos en F. oxysporum. Las funciones celulares más relevantes en este proceso son tráfico celular, homeostasis de iones (principalmente V-ATPase) y metabolismo de lípidos. Los resultados revelan que el pHi es un nuevo mecanismo de regulación de MAPKs en hongos, y sugieren que existe una compleja interacción entre rutas de señalización y funciones celulares en la regulación de este proceso. pH is as a key player in the control of fungal pathogenicity. In the soilborne vascular wilt fungus Fusarium oxysporum, ambient pH acts as a master switch for regulation of the conserved Fmk1 MAPK cascade, essential for invasive growth and pathogenicity toward tomato roots. Previous studies indicated that pH also modulates the activity of the two other MAPKs, Mpk1 and Hog1, in an opposite way to Fmk1. The molecular events underlying the pH response are currently unknown. Here we investigated whether ambient pH modulates MAPK signaling by affecting the intracellular pH (pHi). We found that pHi acts as a signal regulating MAPK activity in F. oxysporum. Diethylstilbestrol (DES), a specific inhibitor of the plasma membrane H+-ATPase Pma1, induced a rapid and sustained decrease of pHi accompanied by rapid and transitory phosphorylation of the MAPKs Mpk1 and Hog1, and inactivation of Fmk1. Analogously, pHi also regulates MAPK signaling in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, suggesting that this mechanism is conserved in fungi. We initially investigated the mechanism of pHi-induced Mpk1 activation in the yeast model, using a candidate gene approach. Our studies revealed three potential mechanisms: an alternative branch of the canonical cell wall integrity pathway mediated by the Ypk1/2 kinase; the Sln1 branch of the Hog1 cascade; and the dual specificity MAPK phosphatase Msg5 whose abundance is affected by pHi. Moreover, a screen with a subset of acid-sensitive yeast mutants identified a number of candidates affected in DES-triggered Mpk1 activation, many of which have predicted orthologues in F. oxysporum. These candidate proteins have conserved cellular functions including cellular trafficking, ion homeostasis (mainly V-ATPase function) and lipid metabolism. Our results discover pHi as a new mechanism for MAPK signaling in fungi and reveal a complex interplay between signaling pathways and cellular functions in the regulation of this process.

La histogénesis y la organogénesis durante el desarrollo embrionario de los vertebrados –incluidoslos seres humanos– implica la interacción de un epitelio (derivado del ectodermo y del endodermo)que tiene la capacidad de inducir un estímulo y del mesénquima subyacente (derivado del mesodermointramebrionario) que tiene la capacidad de recibirlo y responder al mismo. A nivel molecular, estainteracción se encuentra regulada por una red de señalización paracrina que incluye varios ligandosy sus respectivos receptores, además de una serie de factores de transcripción que controlan todoel sistema. Dentro de estos factores se encuentran los factores de crecimiento fibroblástico (Fgf),la familia Hedgehog (Hh), la familia Wingless (Wnt) y la superfamilia del factor de crecimiento defibroblastos beta (Tgf-β), quienes actúan de forma sinérgica o antagónica para organizar el patrónmorfogenético de un tejido, un órgano, un aparato y un sistema morfofuncional. Uno de los factoresque mas se ha estudiado es el Sonic hedgehog (Shh), el cual resulta fundamental para regular,mediante procesos célulares de proliferación, diferenciación, migración y supervivencia celular, laconformación de campos morfogéneticos en lugares específicos del esquema corporal del embriónen desarrollo o en el adulto. Por tanto, el objetivo de esta revision de tema es describir el rol de Shhen el desarrollo embrionario del tubo neural, las extremidades y los dientes. Abstract: Histogenesis and organogenesis of the vertebrates –including humans– involves theinteraction of an epithelium (derived from the ectoderm and endoderm) and the underlying mesenchyme(derived from the intraembryonic mesoderm). This interaction is regulated by a paracrinesignaling network that includes several ligands and their respective receptors, in addition to a seriesof transcription factors that control the whole system. Among these factors are fibroblast growthfactors (Fgf), Hedgehog family (Hh), Wingless family (Wnt) and beta-fibroblast growth factor superfamily(Tgf-β), which act to organize the morphogenetic pattern of a tissue, an organ, an apparatusand a morphofunctional system. One of the most studied factors is Sonic hedgehog (Shh), whichis essential for regulating the formation of morphogenetic fields in specific places of the embryo’sbody schema through cell proliferation, differentiation, migration and cell survival processes –indevelopment or in the adult–. Therefore, the purpose of this literature review is to describe the roleof Shh in the embryonic development of the neural tube, the limbs and the teeth. Key words: Biology development, embryonic development, signal transduction, Sonic hedgehogproteins.

15 Páginas; 6 Figuras, Several important biological activities have been attributed to the pentacyclic triterpene ursolic acid (UA), being its antitumoral effect extensively studied in human adenocarcinomas. In this work, we focused on the efficacy and molecular mechanisms involved in the antitumoral effects of UA, as single agent or combined with doxorubicin (DXR), in human soft tissue sarcoma cells. UA (5–50 μM) strongly inhibited (up to 80%) the viability of STS cells at 24 h and its proliferation in soft agar, with higher concentrations increasing apoptotic death up to 30%. UA treatment (6–9 h) strongly blocked the survival AKT/GSK3β/β-catenin signalling pathway, which led to a concomitant reduction of the anti-apoptotic proteins c-Myc and p21, altogether resulting in the activation of intrinsic apoptosis. Interestingly, UA at low concentrations (10–15 μM) enhanced the antitumoral effects of DXR by up to 2-fold, while in parallel inhibiting DXR-induced AKT activation and p21 expression, two proteins implicated in antitumoral drug resistance and cell survival. In conclusion, UA is able to induce intrinsic apoptosis in human STS cells and also to sensitize these cells to DXR by blocking the AKT signalling pathway. Therefore, UA may have beneficial effects, if used as nutraceutical adjuvant during standard chemotherapy treatment of STS., Research was supported by the Institute of Health Carlos III through the subprogramme “CIBERobn (Centro de Investigación Biomédica en Red de la Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición)”. VHV was supported by a predoctoral fellowship from ‘Govern de les Illes Balears, Conselleria d’Educació, Cultura i Universitats’ under a program of joint financing with the European Social Fund.

Las vías de señalización celulares son las encargadas de transmitir la información sobreel estado del ambiente intra e extracelular. Con esta información, las células "tomandecisiones" que afectan su destino, tales como dividirse, arrestarse, diferenciarse, o morir. A su vez, es común que células genéticamente idénticas, expuestas al mismo ambientetomen decisiones diferentes. Así, el objetivo general de mi tesis doctoral es, mediante unenfoque de Biología de Sistemas, estudiar los mecanismos moleculares que median estastomas de decisión de destino celular y el origen de la variabilidad observada en esa tomade decisión. Para esto, utilizamos a la respuestas a la feromona sexual de la levadura S.cerevisiae como sistema modelo. Los destinos celulares pueden ser clasificados en distintos fenotipos morfológicos, quedependen de la dosis del estímulo. Sin embargo, encontramos que dichos fenotipos coexistenen concentraciones de feromona intermedia, mostrando así una gran variabilidaden la población. Las causas de esta variabilidad son múltiples y actúan simultáneamente:influye la posición del ciclo celular, el tipo celular (madre o hija), la capacidad de lascélulas de sintetizar más o menos proteínas en general, y su "historia". Seguidamente, nosenfocamos en un fenotipo complejo observado a concentraciones intermedias de feromona:primero se arresta el ciclo celular y se desarrolla una proyección de apareamiento, paraluego reentrar en el ciclo celular. Descubrimos que esta desensibilización está mediadapor una rama estimulatoria del ciclo celular (paralela a la clásica inhibitoria) que se activatardíamente y depende del factor de transcripción Kar4. Asimismo estudiamos lasconsecuencias que el desarrollo de este fenotipo tiene sobre la progenie. Utilizamos paraesto experimentos genéticos combinando con microscopía de epifluorescencia y confocal,modelado matemático. Signal transduction pathways register and transmit information about the intra- andextracellular environment. Using this information, cells "make decisions" that affect theirfate, leading to division, cell cycle arrest, differentiation or death. At the same time, it iscommonly found that genetically identical cells, exposed to the same conditions, behavedifferently. Therefore, the general goal of my thesis is to study the molecular mechanismsthat govern a cell-fate decision system, and the origin of the observed cell-to-cell variability. For this studies, we used the pheromone response pathway in yeast S. cerevisiae as a modelsystem. Cell fates may be classified in different morphological phenotypes, which depend on theconcentration of the stimulus. However, we found that at intermediate doses of pheromone,some of the phenotypes coexist, generating a large population variability. We found severalcauses of this variability, which act simultaneously: cell cycle position, cell type (mother ordaughter cell), the ability of cells to express genes into proteins, and the cell history. Subsequently,we focused our efforts in exploring a particular phenotype/behavior that occursat intermediate doses of pheromone: first, cells arrest the cell cycle and grow a matingprojection, and then, cells reenter into the cell cycle. We found that this desensitization ismediated by a pathway branch that stimulates the cell cycle (opperating in parallel withthe classic inhibitory branch) and that it requires the transcription factor Kar4. We thenstudied the consequences of this behavior on the progeny. We used genetic experimentscombining fluorescence and confocal microscopy with mathematical modeling. Fil: Grande, Alicia Viviana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La vía TOR ("Target Of Rapamycin") de mamíferos es una red proteica de regulación para una amplia gama de procesos involucrados en el crecimiento y la diferenciación celular, constituyendo un interruptor funcional entre el metabolismo anabólico y catabólico de la célula. El Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, tiene un ciclo de vida muy complejo con diferentes estadios morfológicos en varios hospedadores. Este ciclo de vida implica que los parásitos enfrentan grandes fluctuaciones en el medio extracelular que deben ser detectadas y a las cuales deben responder adaptando su metabolismo. Un candidato a ser el mediador entre los receptores/sensores del medio y la respuesta adaptativa celular es la vía TOR. En este trabajo integramos los datos bibliográficos de la vía TOR de organismos tripanosomátidos con un análisis in silico (simulación computacional de procesos o estructuras biológicas) del genoma del parásito. Se proponen además posibles efectores y procesos regulados por esta ruta metabólica. Teniendo en cuenta que existe muy poca información sobre los mecanismos de transducción de señales en tripanosomátidos, consideramos que el mapa presentado en este trabajo puede ser una referencia para futuros trabajos experimentales.

Los receptores de hormonas esteroides han sido considerados históricamente como factores de transcripción nucleares. Sin embargo, en los últimos años surgieron evidencias que indican que su activación desencadena eventos rápidos, independientes de la transcripción y que involucran a diferentes segundos mensajeros; muchos de estos receptores han sido localizados en la membrana celular. Por otra parte, se han caracterizado varios receptores de hormonas esteroides noveles, de estructura molecular diferente al receptor clásico, localizados principalmente en la membrana celular. Esta revisión enfoca los diferentes efectos iniciados por los glucocorticoides, mineralocorticoides, andrógenos, estrógenos y progesterona, y los posibles receptores involucrados en los mismos.Steroid hormone receptors have been historically considered as nuclear transcription factors. Nevertheless, in the last years, many of them have been detected in the cellular membrane. It has been postulated that their activation can induce transcription independent rapid events involving different second messengers. In addition, several novel steroid hormone receptors, showing a different molecular structure than the classical ones, have also been characterized and most of them are also located in the plasmatic membrane. This review focuses on the variety of effects initiated by glucocorticoids, mineralocorticoids, androgens, estrogens and progesterone, and the possible receptors involved mediating these effects.

La célula cuenta con una red compleja de componentes biomoleculares capaz de detectar señalesexternas e internas y elaborar respuestas apropiadas que ayuden a responder frente a las dificultades quepresenta el entorno. Estas respuestas implican tomar decisiones de destino celular, como la introducción ono a un programa de diferenciación, proliferación, arresto o apoptosis. La descripción de estos procesosdesde una perspectiva modular propone la identificación de distintos módulos funcionales, de cuyainteracción emergen las distintas propiedades de los sistemas de toma de decisión. Como objetivo generalde esta tesis estudiamos, desde un enfoque de biología de sistemas, los mecanismos biomolecularesinvolucrados en la toma de decisión a nivel celular. En primer lugar nos centramos en el estudio de módulos ultrasensibles, que cumplen un rolfundamental en varios contextos celulares. Estos módulos se caracterizan por presentar una curva dosisrespuestasigmoidal, y proporcionan alinealidades que resultan necesarias para producir mecanismos máscomplejos tales como adaptación, biestabilidad, y oscilaciones. En este trabajo, estudiamos los factores quemodulan el desempeño de un motivo ultrasensible (es decir, su ultrasensibilidad), al ser embebido dentrode una cascada de señalización. Primero, utilizamos una configuración sencilla para analizar en qué medidalas limitaciones en los rangos barridos por los componentes río arriba y río abajo afectan a laultrasensibilidad efectiva que distintos mecanismos ultrasensibles aportan al sistema. De esta manera,encontramos que las limitaciones en el rango de entrada disminuyen la ultrasensibilidad del sistema,mientras que las limitaciones en el rango de salida pueden producir tanto un aumento como una disminuciónde la ultrasensibilidad. En este caso, identificamos que el comportamiento está determinado por lasasimetrías de la curva dosis-respuesta del módulo ultrasensible, y observamos que varios de los motivosultrasensibles más estudiados pueden producir ultrasensibilidades efectivas mucho mayores cuando elcomponente río abajo limita su rango de lectura. Por otra parte, hallamos una expresión analítica del aporte neto que realiza cada módulo en laconstrucción de la ultrasensibilidad de una cascada de señalización. Esto permite identificar los efectos delsecuestro de componentes compartidos y del reposicionamiento de los rangos dinámicos sobre laultrasensibilidad de la cascada. Luego, aplicamos la metodología desarrollada para estudiar 2 modelos decascadas de MAP kinasas de interés biológico. Este estudio aporta herramientas relevantes tanto paraentender el comportamiento de una unidad de procesamiento modular ultrasensible inmersa en su contextofisiológico, como para el diseño de módulos funcionales en un contexto de biología sintética. Finalmente estudiamos los mecanismos biomoleculares involucrados en la vía de respuesta aferomona del organismo modelo Saccharomyces cerevisiae. En este caso estudiamos el proceso de tomade decisión celular respecto a aparearse o no cuando la célula es estimulada con feromona. En particularnos centramos en el estudio de las bases moleculares que sustentan las respuestas celulares del tiposwitching. En este contexto, analizamos matemáticamente el modelo biológico propuesto por biólogos denuestro laboratorio. Testeamos si el modelo era capaz de reproducir los experimentos existentes y luegoextrajimos del modelo nuevas hipótesis a ser contrastadas experimentalmente. La posterior falsificación delmodelo dio lugar a la formulación de uno nuevo en el cual nos encontramos trabajando actualmente. The cell has a complex network of biomolecular components capable of detecting external andinternal signals and develop appropriate responses that help them respond to the challenges presented bythe environment. These responses involve cell fate decisions such as whether to initiate a program ofdifferentiation, proliferation, arrest or apoptosis. The description of these processes from a modularperspective proposes the identification of different functional modules, from whose interactions emerge thedifferent properties of decision making systems. The general objective of this thesis was to study, from asystems biology approach, the biomolecular mechanisms involved in decision making at the cellular level. First, we focused on the study of ultrasensitive modules, which play a fundamental role in variouscellular contexts. These modules are characterized by a sigmoidal dose-response curve, and provide thenon-linearities that are necessary to produce more complex mechanisms such as adaptation, bistability andoscillations. In this work, we studied the factors that modulate the performance of an ultrasensitive motif (i.e. their ultrasensitivity), when it is embedded within a signaling cascade. To do that, we first used a simpleconfiguration to analyze to what extent limitations in the range spanned by upstream and downstreamcomponents affects the effective ultrasensitivity that different mechanisms contribute to the system. Withthis analysis we found that limitations in the system’s input range decrease ultrasensitivity, while limitationsin the output range can cause both an increase and a decrease in ultrasensitivity. In this case, we identifiedthat the behavior is determined by the asymmetry of the dose-response curve of the ultrasensitive module,and we observed that several of the most studied ultrasensitive motifs can produce effectiveultrasensibilidades much greater when the downstream component limits its readout range. Moreover, we found an analytical expression of the effective contribution made by each module inthe construction of the ultrasensitivity of a signaling cascade. This allowed us to identify the effects ofsequestration of shared components and repositioning of the dynamic ranges on the cascadesultrasensitivity. We applied the developed methodology to study two models of MAP kinase cascades ofbiological interest. This study provides important tools for both understanding the behavior of anultrasensitive modular processing unit immersed in their physiological context, and for the design offunctional modules in the context of synthetic biology. Finally we studied the biomolecular mechanisms involved in the pheromone response pathway ofthe model organism Saccharomyces cerevisiae. In this case we studied the cell decision making process bywhich cells mate or not when stimulated with pheromone. In particular, we focused on the study of themolecular basis underlying the switching cellular response. In this context, we analyzed mathematically thebiological model proposed by biologists of our laboratory. We tested whether the model was able toreproduce the existing experiments and then we extracted from the model new hypotheses to be testedexperimentally. The subsequent falsification of the model led to the formulation of a new one in which weare currently working. Fil: Altszyler Lemcovich, Edgar Jaim. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

PARK2 is a gene implicated in disease states with opposing responses in cell fate determination, yet its contribution in pro-survival signaling is largely unknown. Here we show that PARK2 is altered in over a third of all human cancers, and its depletion results in enhanced phosphatidylinositol 3-kinase/Akt (PI3K/Akt) activation and increased vulnerability to PI3K/Akt/mTOR inhibitors. PARK2 depletion contributes to AMPK-mediated activation of endothelial nitric oxide synthase (eNOS), enhanced levels of reactive oxygen species, and a concomitant increase in oxidized nitric oxide levels, thereby promoting the inhibition of PTEN by S-nitrosylation and ubiquitination. Notably, AMPK activation alone is sufficient to induce PTEN S-nitrosylation in the absence of PARK2 depletion. Park2 loss and Pten loss also display striking cooperativity to promote tumorigenesis in vivo. Together, our findings reveal an important missing mechanism that might account for PTEN suppression in PARK2-deficient tumors, and they highlight the importance of PTEN S-nitrosylation in supporting cell survival and proliferation under conditions of energy deprivation., We thank Rodrick Bronson, the entire HMS Rodent Histopathology Core, and the ICR Pathology Core for technical help with the mouse histopathology and discussions concerning the project. We also thank David Carling for the generous gift of the 991 activator, Nick Leslie for the pHR-SIN-PTEN-WT and Tina Yuan for the pLV430G-oFL-T2A-eGFP vectors, Pier Paolo Pandolfi for giving us access to Pten knockout (KO) mice, and Olga Corti and Alexis Brice for providing Park2 KO mice. We thank Susanne Breitkopf and Min Yuan for help with mass spectrometry. This work was supported by grants from the NIH P01-CA120964 (J.M.A. and L.C.C.) and R01-GM041890. A.V. was funded by the Ministry of Education, Culture and Sport under the Program for Promoting and Hiring of Talent and its Employability (Subprogram for Mobility) of the Spanish Government. G.P. is funded by the ICR. Work in the D.A. lab is supported by MRC grant MC_UP_1202/1. L.C.C. owns equity in, receives compensation from, and serves on the Board of Directors and Scientific Advisory Board of Agios Pharmaceuticals. Agios Pharmaceuticals is identifying metabolic pathways in cancer cells and developing drugs to inhibit such enzymes to disrupt tumor cell growth and survival. Finally, we would like to dedicate this work to the memory of Professor Chris Marshall who was an esteemed colleague and mentor, whose scientific discoveries will continue to inspire us and translate basic science into benefits for cancer patients.

El ión calcio (Ca2+) desempeña un papel fundamental en el metabolismo y la fisiología de las células; controla procesos que dependen de la amplitud, la frecuencia y la localización subcelular de las señales de Ca2+ citosólico. La activación de la vía de los fosfoinosítidos, en eucariotas superiores, eleva la concentración citoplasmática de IP3,el cual libera calcio desde el sistema de Retículo Endoplásmico. El mecanismo por el cual el Ca2+ es liberado desde reservorios intracelulares en eucariotas inferiores es un tema controvertido y poco conocido, por ello en el presente trabajo se dilucidó como los epimastigotes de Trypanosoma cruzi pueden liberar calcio desde los reservorios intracelulares. Se demostró así, un receptor sensible a IP3 y rianodina (RyR) localizado en microsomas del parásito. Al respecto, se purificó la proteína hipotética de T. cruzi(RcIP3) siendo esta capaz de interaccionar con anticuerpos policlonales anti- RcIP3 yanti- RcRyR, sugiriendo la presencia de una posible proteína de ?330 kDa que posee características híbridas de los RcIP3/RyR. Hasta el momento no se había determinado la localización subcelular del receptor de IP3/RyR en formas epimastigote de T. cruzi,en este trabajo mostramos que la reacción positiva del anticuerpo anti-RcIP3 tipo II de humano y los epimastigotes fue visualizada en estructuras internas del parásito,sugiriendo una localización intracelular del receptor a IP3/RyR a semejanza de lo que ocurre en mamíferos.Además, en este trabajo se muestra la participación del intercambiador Na+/H+en respuesta a la hiperosmolaridad originado por manitol 0,5 M, determinado mediantel a alcalinización de las vacuolas ácídicas y su inhibición parcial por EIPA. De este modo, en formas epimastigote la relación entre la vía del inositol fosfato y la señal de calcio no está restringida sólo a la acción del IP3 como un segundo mensajero.Además, los tratamientos con alta osmolaridad condujeron también a la liberación de calcio desde los acido calcisomas como consecuencia de la activación conjunta de los intercambiadores Ca2+/nH+ y Na+/H+ y liberación del ión vía un canal de Ca2+sensible a IP3. Por otro lado, nos propusimos determinar la localización subcelular de dicho transportador en T. cruzi. La reacción positiva del anticuerpo anti-Na+/H+ y los epimastigotes fue visualizada en estructuras internas del parásito, mostrando que el intercambiador Na+/H+ está localizado en los acidocalcisomas.Es bien conocido, que en diferentes tipos celulares, los intercambiadoresNa+/H+ son regulados vía fosforilación por proteína quinasa C (PKC) y median la respuesta a muchas de las señales que intervienen en el control de la proliferación celular, la diferenciación, el volumen y los cambios de osmolaridad. En este trabajo, se muestra el papel de PKC en el estadio de epimastigote en similitud a lo que ocurre enel intestino del insecto vector. Así, la activación de PKC por PMA indujo una alcalinización vacuolar en el parásito. La reversión del efecto del PMA por el inhibidorde intercambiador Na+/H+ sugiere la participación de dicho transportador en el proceso de alcalinización vacuolar bajo estas condiciones.Por otro lado, el análisis de la secuencia de TcNHE reveló sitios consensos parala proteína quinasa A dependiente de AMPc (PKA). La adenil ciclasa que genera AMPc, la PKA y varias fosfodiesterasas que lo degradan, fueron informadas como enzimas activas en epimastigotes. Nuestros resultados sugieren un compromiso dePKA en la regulación del intercambiador Na+/H+ en condiciones de estrés hiperosmótico, ya que la presencia de 8-bromo AMPc, análogo no hidrolizable de PKA,incrementó significativamente la alcalinización organelar inducida por manitol. De modo que, es posible considerar que previamente a la activación de la PLCse produciría la del intercambiador Na+/H+, mediado por PKA, con la subsiguiente liberación de Ca2+. Estos hechos sugieren que la activación de la PLC es consecuencia del Ca2+ que proviene de estas vesículas ácidas.En base a los antecedentes de nuestro laboratorio y a los resultados en el presente trabajo inferimos que en el recto del triatomino los epimastigotes sufren shock hiperosmótico cuyos efectos en la membrana celular estarían a nivel de la activación de varias enzimas de señalización y consecuente formación de segundosmensajeros. El estrés hiperosmótico dispararía señales que conducen a los epimastigotes a cambios indicativos de la inducción de la metaciclogénesis,diferenciación de epi a tripomastigote. Si bien, las actividades enzimáticas mencionadas son estimuladas por la alta osmolaridad; no significa que sean las vías ejecutoras de la diferenciación del parásito pero si las responsables, en parte, de los cambios estructurales y bioquímicos que conducen a la diferenciación, por lo menos, al estadio intermedio. Fil: Usorach, Melina Noelia. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Biología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba; Argentina

Klebsiella pneumoniae is an etiologic agent of community-acquired and nosocomial pneumonia. It has been shown that K. pneumoniae infections are characterized by reduced early inflammatory response. Recently our group has shown that K. pneumoniae dampens the activation of inflammatory responses by antagonizing the activation of the NF-kappa B canonical pathway. Our results revealed that K. pneumoniae capsule polysaccharide (CPS) was necessary but not sufficient to attenuate inflammation. To identify additional Klebsiella factors required to dampen inflammation, we standardized and applied a high-throughput gain-of-function screen to examine a Klebsiella transposon mutant library. We identified 114 mutants that triggered the activation of NF-kappa B. Two gene ontology categories accounted for half of the loci identified in the screening: metabolism and transport genes (32% of the mutants) and envelope-related genes (17%). Characterization of the mutants revealed that the lack of the enterobactin siderophore was linked to a reduced CPS expression, which in turn underlined the NF-kappa B activation induced by the mutant. The lipopolysaccharide (LPS) O-polysaccharide and the pullulanase (PulA) type 2 secretion system (T2SS) are required for full effectiveness of the immune evasion. Importantly, these factors do not play a redundant role. The fact that LPS O-polysaccharide and T2SS mutant-induced responses were dependent on TLR2-TLR4-MyD88 activation suggested that LPS O-polysaccharide and PulA perturbed Toll-like receptor (TLR)-dependent recognition of K. pneumoniae. Finally, we demonstrate that LPS O-polysaccharide and pulA mutants are attenuated in the pneumonia mouse model. We propose that LPS O-polysaccharide and PulA T2SS could be new targets for the design of new antimicrobials. Increasing TLR-governed defense responses might provide also selective alternatives for the management of K. pneumoniae pneumonia., This work was supported by a grant from ERA-Net Pathogenomic 2008 (to P. J. S. and J. A. B.), Marie Curie Career Integration Grant (U-KARE) PCIG13-GA-2013-618162, Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) Grant BB/L007223/1, and Queen's University Belfast start-up funds (to J. A. B.). The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.; Recipient of a predoctoral fellowship from the Programa Nacional de Proyectos de Investigacion Fundamental (SAF2012-39841) del Ministerio de Ciencia e Innovacion.

Mesenchymal stem cells (MSCs) and macrophages are fundamental components of the stem cell niche and function coordinately to regulate haematopoietic stem cell self-renewal and mobilization. Recent studies indicate that mitophagy and healthy mitochondrial function are critical to the survival of stem cells, but how these processes are regulated in MSCs is unknown. Here we show that MSCs manage intracellular oxidative stress by targeting depolarized mitochondria to the plasma membrane via arrestin domain-containing protein 1-mediated microvesicles. The vesicles are then engulfed and re-utilized via a process involving fusion by macrophages, resulting in enhanced bioenergetics. Furthermore, we show that MSCs simultaneously shed micro RNA-containing exosomes that inhibit macrophage activation by suppressing Toll-like receptor signalling, thereby de-sensitizing macrophages to the ingested mitochondria. Collectively, these studies mechanistically link mitophagy and MSC survival with macrophage function, thereby providing a physiologically relevant context for the innate immunomodulatory activity of MSCs., We thank Mr Brian Brockway for technical assistance with histological analysis and Dr Clotilde Thery from the Pasteur Institute for her advice regarding exosome isolation. This work was funded by National Institutes of Health grants to L.A.O. (R01HL114795, R01HL110334) and D.G.P. (R24 OD018254). Clinical grade human MSCs were provided by the NHLBI-sponsored Production Assistance for Cellular Therapies Program at the University of Minnesota (Contract HHSN268201000008C).

194 p.-53 fig.-5 tab., Summary of the report entitled “Aspergillus nidulans alkaline ambient perception: the receptor-transducer complex” for Doctorate in Science of MSc. Daniel Lucena Agell. A.1-INTRODUCTION Living organisms are able to sense, respond and adapt to different environmental stimuli. In the same way, cells have developed homeostatic regulation systems to adapt to different external stimuli. The signal transduction, the manner that cells sense and external stimulus and transduce it inside them in a comprehensive signal, was first defined by Professor Martin Rodbell [1]. This system is always formed by a receptor, a transducer and an effector [1,2]. Over the wide type of receptors that cells have, there exists a superfamily of receptors called GPCRs which have approximately 800 members that are able to activate themselves to different external stimuli, from small molecules, cations and hormones, to light [3,4]. The main feature of this sort of receptors is the seven transmembrane &-helices that they have in their structure. GCPRs undergo a rearrangement in their structure upon ligand binding that ends in receptor activation. This activation allows the recognition of specific sites in the intracellular side of the receptor by a heterotrimeric G protein, which then dissociates in its subunits $ and B,Y that in turn, are able to activate through second messengers different signalling pathways inside the cell [4]. To avoid over-signalling by GPCRs, a desensitization system exists, based on the phosphorylation of the activated receptors by the GRKs (G protein coupled receptors kinases) or the PkcC or PkcA kinases which in turn, allows the recruitment of B-arrestins [5]., The binding of B-arrestin upon activated receptors blocks the interaction with a G protein and promotes the internalization of the complex receptor-arrestin. Recently, a new paradigm of signalling has emerged upon receptor-arrestin binding. After its internalization, this complex through the arrestin is able to interact with different proteins and activate different signalling pathways [5,6]. Fungi are able to grow over wide environmental conditions. pH is one of these conditions and fungi are able to adapt over a wide range. This is possible thanks to a signalling pathway called rim/pal that has extensively studied in Aspergillus nidulans. This pathway is formed by the product of the six pal genes: PalA, PalB, PalC, PalF, PalH and PalI and by the zinc transcription factor PacC [7-72 14]. PacC is activated after two processing steps. Firstly, PacC inactive form, PacC , is processed to 53 PacC in a pH and pal dependent manner. The second processing step that leads to PacC active form, 27 27 PacC , is mediated by the proteasome. PacC is able to enter to the nucleus and then activate genes that are required in alkaline conditions and repress those required in acidic conditions [15-18]. PalH and PalI are both membrane proteins [13]. PalH is the putative pH-sensing receptor which contains 7 predicted transmembrane helices [11], thus resembling GPCRs. Upon alkalinisation, PalF, the arrestin-like protein of the pH signalling pathway is recruited by PalH and then, is phosphorylated and ubiquitinated [19]. Ubiquitination is crucial to activate pH signalling [20] and mediates the recruitment of Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT)-I protein, Vps23, to plasma membrane [21]. Immediately, ESCRT-II and -III proteins arrive at the plasma membrane. In turn, ESCRT-III protein, Vps32, recruits PalC and PalA to cortical sites [14,21,22]., PalC arrives to the plasma membrane before PalA as Galindo et al. [21], demonstrated. PalA is able to 72 bind to YPXL/I motifs in PacC and recruit it [23]. On the other hand, Vps24 is able to recruit calpain-like protease PalB through its MIT motif that interacts with MIM motif of Vps24 [24]. Then, PalB 72 53 27 processes PacC to PacC which releases from PalA and is able to be processed to PacC by the proteasome. A.2-MAIN OBJECTIVES AND RESULTS The main goals of this thesis are: -To demonstrate that PalH is the pH-sensing receptor. -To study the role of PalH phosphorylation in the pH signalling context. -To demonstrate whether PalH endocytosis is required or not for pH signalling activation. -To study PalF subcellular localisation and the influence of PalF and PalI in PalH traffic. -To examine the long term response at alkaline pH in terms of PacC processing and PalH and PalF levels. The results of this thesis are divided into three different chapters: Chapter One, The first chapter has been focused in PalH. Overexpression analyses of PalH and PalF have demonstrated that PalF has a crucial role upon activation but PalH is necessary for pH signalling. In order to develop different studies based in site-directed mutagenesis of PalH, a triple HA (hemaglutinin) was used to tag palH. This construct was then re-inserted in palH locus by gene replacement. This tag allowed discovering that PalH is phosphorylated exclusively under alkaline conditions. Site-directed mutagenesis of palH::ha3 permitted the identification of critical residues for pH signalling in the second extracellular loop. Moreover, two substitutions located in TM6 and TM7 in PalH lead to the first alkalinity mutant ever found in a pal protein. Both substituted residues (Phe319 and Trp332), together with a conserved proline located at TM6 resembles a molecular switch found in some GPCRs which is named rotamer toggle [25]. On the other hand, deletion analyses of conserved regions in PalH sequence have allowed identifying a phosphorylation region within PalH. Studies focused in this region ruled out the GPCR-B-arrestin recruitment paradigm in which phosphorylation is required. In this way, PalH phosphorylation is not necessary for PalF recruitment, thus not affecting pH signalling activation. Deletion of the region contained between the PalF binding sites I and II (this sites are necessary for PalH-PalF interaction [19]) within PalH cytosolic tail (the C-terminal region of PalH) has demonstrated that both sites are sufficient to activate PacC processing. To finish this chapter, analyses of the endocytosis requirement in order to activate pH signalling have been carried out, using different endocytic-defective mutants. Studies with these mutants have shown that overexpressed PalH::GFP is located at the plasma membrane instead of the endovacuolar system as it occurs in the wild-type. Furthermore, PacC processing analyses in these defective mutants are not different of the wild-type PacC processing. Together, these results with those obtained by Galindo et al. [21,22], end with the idea that PalH endocytosis is required for pH signalling., Chapter Two The second chapter has been focused in PalF localisation. Using a mCherry tagging in the N-terminal region of arrestin-like protein, first-time microscopy of PalF has been carried out. PalF, although is prominent at the citosol, is able to localise at the plasma membrane without PalH necessity. Moreover, fusion of two PLC domains (which have high affinity for the phosphatydilinositol (4,5)-bisphosphate of the plasma membrane), to the N-terminal region of PalF has redirected it to the plasma membrane. In these conditions, PalF is able to signalling without PalH more efficiently that PalF with ubiquitin fusion [20], demonstrating that plasma membrane localisation of PalF is important for signalling. On the other hand, studies of overexpressed PalH::GFP and mCherry::PalF mutual localisation have been made. Both proteins mutually cooperate to localise at the plasma membrane more efficiently. Furthermore, the same analysis was carried out using a reproduction of two single substitutions that break PalH-PalF interaction [19], into the PalH and PalF fluorescent proteins, showing that Ser86Pro affects PalF sole localisation (is excluded from plasma membrane) and its interaction with PalH. However, studies of PalF and PalI localisation have been shown that they don’t directly interact and cooperate in their mutual plasma membrane localisation. Finally, microscopy analyses of the co-overexpression of PalH::HA3, PalI::GFP and mCherry::PalF have been made, giving an idea of PalF and PalI trafficking upon ambient alkalinisation., Chapter three The last chapter has been centred in the study of the steady-state of PacC processing. Different short-time and long-time PacC processing assays have been carried out. PacC activation requires minutes after the ambient alkalinisation whereas it arrives at equilibrium between its different forms at 150-180 minutes after the pH shift. In the same manner, PalH and PalF arrive to equilibrium between their different forms. Moreover, return to the basal state after acidification of the environment in a strain which has previously grown in alkaline conditions, requires hours. Finally, studies using a loss of function mutant of pacX, a zinc finger protein, have shown that negatively regulates PacC levels. These results together with the fact that PacX localises in a single focus inside the nucleus allow thinking that PacX is a transcription factor which repress pacC. A.3-CONCLUSIONS These are the main conclusions of this thesis: 1-PalH is the environmental pH sensing receptor. 2-The Phe319 and Trp332 residues in PalH play a main role in its activation. nd 3-There are some residues located in and around the 2 extracellular loop of PalH which are critical for pH signalling. 4-PalH is phosphorylated exclusively under alkaline conditions. 5-PalH phosphorylation is not implicated in PalF recruitment and is not necessary fo pH signalling. 6-PalH endocytosis is not necessary for pH signalling. 7-PalF localises at the plasma membrane without PalH necessity. 8-Plasma membrane sole localisation of PalF activates the pH signalling. 9-PalF and PalH mutually cooperate to localise at the plasma membrane., Proyectos BIO2009-07281 y BIO2012-30965 y por una beca F.P.I del Ministerio de Economía y Competitividad asignada al proyecto BIO2009-07281

Tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) is a proinflammatory cytokine that exerts both homeostatic and pathophysiological roles in the central nervous system. In pathological conditions, microglia release large amounts of TNF-alpha; this de novo production of TNF-alpha is an important component of the so-called neuroinflammatory response that is associated with several neurological disorders. In addition, TNF-alpha can potentiate glutamate-mediated cytotoxicity by two complementary mechanisms: indirectly, by inhibiting glutamate transport on astrocytes, and directly, by rapidly triggering the surface expression of Ca+ 2 permeable-AMPA receptors and NMDA receptors, while decreasing inhibitory GABA(A) receptors on neurons. Thus, the net effect of TNF-alpha is to alter the balance of excitation and inhibition resulting in a higher synaptic excitatory/inhibitory ratio. This review summarizes the current knowledge of the cellular and molecular mechanisms by which TNF-alpha links the neuroinflammatory and excitotoxic processes that occur in several neurodegenerative diseases, but with a special emphasis on amyotrophic lateral sclerosis (ALS). As microglial activation and upregulation of TNF-alpha expression is a common feature of several CNS diseases, as well as chronic opioid exposure and neuropathic pain, modulating TNF-alpha signaling may represent a valuable target for intervention., This work was supported by Grant Programa Pont la Caixa per a grups de recerca de la UIB to GO.

En su ambiente natural, las plantas están expuestas frecuentemente a condicionesambientales desfavorables para su crecimiento y desarrollo, causadas por diferentes factoresclimáticos (temperaturas extremas, sequía, inundación, aumento de la salinidad de los suelos).Dichos factores constituyen la principal causa de la disminución de la productividad de loscultivos de interés agronómico. Por otra parte, hay una necesidad actual de incrementar las áreascultivables, desplazándose a zonas menos favorables y por lo tanto, menos productivas.Desde hace más de dos décadas, nuestro grupo de investigación se ha enfocado en el estudiode las complejas respuestas de las plantas a diferentes estreses ambientales, con el objetivo deidentificar puntos regulatorios que permitan generar herramientas para la obtención de cultivosque resulten más tolerantes a sequía, temperaturas extremas y salinidad. En la actualidad laslíneas de investigación están enfocadas hacia el estudio de la interrelación entre el metabolismodel carbono y del nitrógeno y su vinculación con los distintos fenómenos ambientales adversos,haciendo énfasis en la comprensión de los caminos de señalización que involucran azúcares yreguladores de crecimiento. La identificación de los genes involucrados en dichas vías detransducción de señales que afecten la tolerancia de la planta frente a los estreses abióticos va apermitir diseñar estrategias para ser usadas en el mejoramiento de cultivos de interés. Fil: Martínez Noël, Giselle María Astrid. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; Argentina. Fundación para Investigaciones Biológicas Aplicadas; Argentina Fil: Lechner, Sonia Leandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; Argentina. Fundación para Investigaciones Biológicas Aplicadas; Argentina Fil: Martin, María Victoria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; Argentina. Fundación para Investigaciones Biológicas Aplicadas; Argentina Fil: Aznar, Nestor. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; Argentina. Fundación para Investigaciones Biológicas Aplicadas; Argentina Fil: Salerno, Graciela Lidia. Fundación para Investigaciones Biológicas Aplicadas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; Argentina

El objetivo principal de esta tesis fue estudiar la interacción entre las vías de MAP quinasas de Saccharomyces cerevisiae. Estas vías están representadas en humanos, donde su mal funcionamiento puedeconducir a patologías tales como cáncer o problemas en el desarrollo. La complejidad de los circuitos de señalización de MAP quinasas en células de mamíferos dificulta lacomprensión de como estas integran las señales que los activan. Para resolver este problema, una estrategiaes analizar sistemas biológicos más simples que comparten propiedades con los más complejos. En estesentido, nos propusimos caracterizar exhaustivamente sistemas de señalización de MAP quinasas en unsistema biológico simple, la levadura S. cerevisiae. En esta tesis decidimos determinar los puntos de flujo de información entre las vías de "Respuesta a Shock Hiperosmótico" (HOG) y de "Respuesta a Feromona" (PR) de levaduras, ya que estas vías compartencomponentes en sus vías de señalización y existe controversia sobre sus interacciones. A su vez, estudiamosestas vías en células individuales, estimulando las mismas controlando la dosis de los estímulos utilizados y enuna variada serie de condiciones experimentales. Finalmente, medimos las respuestas de estas vías de unmodo cuantitativo, estudiando su dinámica temporal y analizando el mayor número de respuestas posible encada célula. Resumiendo los resultados obtenidos, podemos decir, que la vía de HOG no presenta osmoadaptaciónperfecta como se había afirmado previamente y permanece activa en estado estacionario. Su activación esmayor cuanto mayor es la osmolaridad externa, y también depende del gradiente químico de glicerol. Además, vemos una alta variabilidad de la respuesta de HOG en células individuales. A nivel de las interacciones entre las vías de MAP quinasas, determinamos que la vía PR es capaz deactivar a la vía HOG en células adaptadas a alta osmolaridad. Esta compleja activación requiere de la MAPK dela vía de integridad de la pared celular (CWI) Slt2/Mpk1 y del polarisoma. La activación de HOG es pulsátil ypresenta una alta variabilidad en células individuales. Los picos de actividad de HOG coinciden con eventosmorfogenéticos inducidos por PR en los cuales se activa Slt2/Mpk1. La vía PR induce una salida de glicerol, queestaría mediada por Slt2/Mpk1, y este sería el mecanismo que llevaría a la activación de la vía HOG. Lainducción de HOG también puede lograrse a través de la activación de Slt2/Mpk1 mediante shock térmico. Ambos tipos de activaciones (por feromona o alta temperatura) son proporcionales a la osmolaridad externa ydependen del gradiente químico de glicerol. Una consecuencia fisiológica de esta activación de HOGpromovida por la vía PR es que las células en estas condiciones presentan una mejor capacidad deosmoadaptación. Finalmente, podemos agregar que los shocks hiperosmóticos inhiben a la vía PR durante la etapa derespuesta aguda, pero no hemos establecido aún los actores moleculares que median esta inhibición. Sin embargo, podemos descartar algunos componentes de la vía de HOG como Sho1, Ssk1 y Hog1. Para terminar,la alta osmolaridad, a largo plazo, en células ya adaptadas, cambia la dinámica de la respuesta de la vía PRreduciendo su sensibilidad a α factor. Esta reducción es proporcional a la osmolaridad externa. Esperamos que los resultados encontrados en este sistema biológico sean de utilidad, para pensar deuna manera más integrativa, como se comporta la dinámica de la respuesta en un dado sistema frente amúltiples señales externas, de acuerdo a como el mismo las integra globalmente. The main objective of this thesis was to study the interaction between MAPK signaling pathways in Saccharomyces cerevisiae. These pathways are represented in humans, were the malfunction of them canlead to pathologies such as cancer or developmental problems. The complexity of MAPK signaling circuits in mammalian cells difficult the understanding of how theyintegrate the signals activating them. As a means to solve this problem, one strategy is to analyze simplerbiological systems that share properties with the more complex ones. In these sense, we ought to characterizethoroughly MAPK signaling pathways in a simple biological system, the yeast S. cerevisiae. In this thesis we decided to determine the points of information flow between the yeast "High Osmolarity" (HOG) and the "Pheromone Response" (PR) pathways, because they share components in theirsignaling cascades and there is controversy in how they interact. In addition to these, we studied thesepathways in individual cells, stimulating them by controlling the stimulus doses and under a severalexperimental conditions. Finally, we measured the output of these pathways in a quantitative way, studyingtheir temporal dynamics and analyzing the most number of possible readouts. Summing up the results obtained, we can say that, the HOG pathway does not present perfectadaptation as it was previously stated and it remains active in steady state. Its activation is higher the higherthe external osmolarity and it also depends on the chemical gradient of glycerol. Besides, we see highvariability in the HOG output of individual cells. At the level of interactions between the MAPK pathways, we determined that the PR pathway canactivate the HOG pathway in cells adapted to high osmolarity. This complex activation requires the Cell Wall Integrity (CWI) MAPK Slt2/Mpk1 and the polarisome. This HOG activation occurs in pulses and presents highvariability in single cells. The peaks of HOG activity coincide with PR induced morphogenetical events where Slt2/Mpk1 is activated. The PR pathway induces a glycerol efflux, which would be controlled by Slt2/Mpk1,and that would be the mechanism leading to HOG pathway activation. HOG induction can also be achievedthrough Slt2/Mpk1 heat shock activation. Both kinds of activations (by pheromone or high temperature) areproportional to the external osmolarity and depend on the glycerol chemical gradient. One physiologicalconsequence of these PR promoted HOG activation is that the cells present a better osmoadaptation capacityin these conditions. Finally, we can add that hyperosmotic shocks inhibit PR pathway during the acute hyperosmoticphase, but we have not established yet the molecular actors that mediate this inhibition. However, we canrule out some of HOG pathway components like, Sho1, Ssk1 and Hog1. To finish, high osmolarity, at longertimes in cells already adapted, changes the dynamics of PR response reducing its sensitivity to α factor. Thisreduction is proportional to the external osmolarity. We hope the results found in this biological system are helpful, to think in a more integrative way,how the output dynamics of a system behaves, facing multiple external signals, depending on how itintegrates them globally. Fil: Baltanás, Rodrigo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

The therapeutic effect of doxorubicin (DXR) in the treatment of soft tissue sarcomas (STS) is limited by its toxicity and the development of multidrug resistance (MDR), the latter mainly induced by high expression of efflux pumps (e. g., P-glycoprotein [P-gp]). Therefore, the search for alternative therapies, which sensitize these tumors to chemotherapy while maintaining a low toxicity profile, is a rational approach. We assessed efficacy and molecular mechanisms involved in the antiproliferative effects of the tyrosine kinase inhibitors, nilotinib and imatinib, as single agents or in combination with DXR, in human synovial sarcoma SW982 and leiomyosarcoma SK-UT-1 cells. As single compound nilotinib (1-10 mu M) was more potent than imatinib inhibiting the growth of SK-UT-1 and SW982 cells by 33.5-59.6%, respectively. Importantly, only nilotinib synergized the antitumoral effect of DXR (0.05-0.5 mu M) by at least 2-fold, which clearly surpassed the mere sum of effects according to isobolographic analysis. Moreover, nilotinib in combination with DXR had a sustained effect on cell number (-70.3+/-5.8%) even 12 days after withdrawal of drugs compared to DXR alone. On the molecular level, only nilotinib fully blocked FBS-induced ERK1 and p38 MAPK activation, hence, reducing basal and DXR-induced up-regulation of P-gp levels. Moreover, efflux activity of the MDR-related proteins P-gp and MRP-1 was inhibited, altogether resulting in intracellular DXR retention. In high-risk STS tumors 53.8% and 15.4% were positive for P-gp and MRP-1 expression, respectively, with high incidence of P-gp in synovial sarcoma (72.7%). In summary, nilotinib exhibits antiproliferative effects on cellular models of STS and sensitizes them to DXR by reverting DXR-induced P-gp-mediated MDR and inhibiting MRP-1 activity, leading to a synergistic effect with potential for clinical treatment., Research was supported by grants Jose Ma Buesa del grupo GEIS and the Asociacion Espanola contra el Cancer (Junta de Baleares) and by Grand EC10-150 awarded by the Spanish Ministry of Health in 2010 (Independent Clinical Research Call). V. H. V. is supported by a PhD fellowship from the Conselleria d'Economia, Hisenda i Innovacio (Govern de les Illes Balears). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

El desarrollo de las plantas es un proceso que ocurre bajo fluctuaciones del ambiente lumínico que son percibidas por fotorreceptores específicos, principalmente los fitocromos phyA y phyB, y los criptocromos cry1 y cry2. El estudio de las respuestas de mutantes simples y múltiples de fotorreceptores en diferentes condiciones lumínicas es una herramienta muy útil para analizar las vías de señalización. Este trabajo de tesis tuvo como objetivo principal estudiar los mecanismos moleculares y bioquímicos de la transducción de señales lumínicas mediadas por fitocromos y criptocromos durante el desarrollo de Arabidopsis thaliana. En el primer capítulo estudiamos la participación de la subunidad α de la proteína G heterotrimérica (GPA1) en los caminos de señalización de los fotorreceptores. Los mutantes cry1 fueron los únicos simples mutantes que mostraron una reducción en la unión de GTPγS35, a niveles similares a los observados en el mutante gpa1. Hallamos interacción génica entre cry1 y GPA1 en la apertura del gancho apical en oscuridad y en la acumulación de antocianas en luz azul. Estas respuestas fueron dependientes de la presencia de sacarosa en el medio. Análisis moleculares nos llevaron a proponer un modelo en el que la posible modificación posttraduccional de GPA1 mediada por cry1 alteraría su actividad. En el segundo capítulo realizamos un estudio comparativo de los perfiles proteicos entre plántulas cuádruples mutantes phyA phyB cry1 cry2 y plántulas salvajes utilizando la técnica de geles bidimensionales. La identificación de proteínas sub-expresadas en el cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 fue consistente con la drástica reducción en la tasa fotosintética, el contenido de clorofila y el concomitante retraso en el desarrollo del mutante. Las proteínas sobreexpresadas en el cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 estuvieron involucradas en respuesta a estrés por temperatura y por sequía. Sin embargo, sólo la expresión de éstas proteínas no permitió explicar el comportamiento del cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 en condiciones de estrés. La reducción en la cantidad relativa de ácidos grasos insaturados de las membranas del cuádruple mutante phyA phyB cry1 cry2 fue consistente con una mayor sensibilidad a un shock de bajas temperaturas y una mayor tolerancia a un shock de altas temperaturas. Las posibles significancias fisiológicas y ecológicas de estos resultados son discutidas en esta tesis. Plant development is a process that occurs under fluctuating light environment which is perceived by specific photoreceptors, mainly by phytochromes phyA and phyB, and cryptochromes cry1 and cry2. The study of the behaviour of simple and multiple photoreceptor mutants in different light conditions is a useful tool to analyze signalling pathways. The main objective of this thesis was to study the molecular and biochemical transduction of light signalling mediated by phytochromes and cryptochromes during Arabidopsis thaliana development. In the first chapter we studied the involvement of the α- subunit of the Heterotrimeric G protein (GPA1) in photoreceptors signalling pathways. cry1 mutants were the only single mutants that showed GTPγS35 binding reduction, at similar levels to that observed for the gpa1 mutant. We found genetic interaction between cry1 and GPA1 on apical hook opening in darkness and anthocyanin accumulation under blue light. These responses were dependent on the presence of sucrose. Molecular approaches conducted us to propose a model where a potential post-translational modification of GPA1 mediated by cry1 would alter its activity. In the second chapter we made a comparative study of the protein profiles between the phyA phyB cry1 cry2 quadruple mutant and wild type seedlings using the two-dimensional gel electrophoresis technology. Under-expressed proteins in the phyA phyB cry1 cry2 quadruple mutant were consistent with the drastic reduction in photosynthetic rates, reduced chlorophylls contents and retarded development in the mutants. Over-expressed proteins were involved in temperature and drought stresses. However, the expression of these proteins does not explain the phyA phyB cry1 cry2 quadruple mutant behaviours under stress conditions. The reduction in the relative contents of unsaturated fatty acid of the phyA phyB cry1 cry2 quadruple mutant membranes was consistent with its sensitivity to a low temperature shock and its tolerance to a high temperature shock. The physiological and ecological significance of these results are discussed in this thesis. Fil: Fox, Ana Romina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Las CDPKs acoplan un sensor de calcio a un dominio quinasa y coordinan respuestas fisiológicas frente a estímulos. StCDPK3 codifica una CDPK funcional homóloga a isoformas de tomate y tabaco. Se amplificó el gen StCDPK3 (11366 pb), se generó y purificó la proteína recombinante y se determinaron sus parámetros cinéticos. Antagonistas de calmodulina disminuyen la actividad de 6xHisStCDPK3. La proteína recombinante se autofosforila y fosforila histonas. Se generó un anticuerpo policlonal que detecta a StCDPK3 en extractos particulados de hojas. StCDPK3 se expresa en respuesta a PGA y ABA, pero disminuye en respuesta a GA. Líneas transgénicas de fusión del promotor a GUS indican que es activo en hojas, raíces, ojos y brotes de minitubérculos y en estolones elongantes. La actividad GUS disminuye tras la elongación del estolón previo al inicio del crecimiento radial y aumenta en tubérculos tempranos. El factor de transcripción NtRSG es fosforilado por NtCDPK1. Se subclonó su homólogo en papa que es fosforilado in vitro por 6xHisStCDPK3. Además, StCDPK3 fosforila a StABF1. StCDPK3 podría participar en la transducción de señales asociada a procesos de crecimiento y elongación durante el desarrollo del tubérculo (modelo I), el desarrollo de raíces y brotes (modelo II) y como quinasa específica del FT StRSG (modelo III). CDPKs couple calcium sensors to a kinase domain, and coordinate physiological responses to stimuli. StCDPK3 encodes an active CDPK homologous to tobacco and tomato isoforms. The gene was amplified (11366 bp), the recombinant protein was produced and kinetic parameters were evaluated. Calmodulin antagonists, CPZ and 48/80 reduce 6xHisStCDPK3 activity. The recombinant protein autophosphorylates and is able to phosphorylate histones. A policlonal antibody was produced that detected StCDPK3 in particulate extracts from leaves. StCDPK3 is induced in response to PGA and ABA, but is reduced after GA treatment. Transgenic lines carrying the StCDPK3promotor fused to GUS displayed GUS activity in leaves, roots, minitubers eyes, sprouts and in elongating stolons. When stolon elongation ceases before the onset of radial growth, GUS activity was downregulated to be later detected in early tubers. NtRSG is a transcription factor (TF) phosphorylated by NtCDPK1. The potato homologue, StRSG, was subcloned. In vitro, 6xHisStCDPK3 could phosphorylate NtRSG and StRSG, and an ABA transcription factor, StABF1, suggesting that these TFs could be endogenous targets of the kinase. StCDPK3 could play a role in elongation and proliferation events associated to tuber development (model I), root and sprout growth (model II) and as a specific kinase for StRSG (model III). Fil: Grandellis, Carolina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.