Signal Transduction Mediated by Adenosine Nucleotides in Trypanosoma cruzi : evaluation of Their Role in Stress Responses

Trypanosoma cruzi es un protozoo unicelular kinetoplástido de vida parasitaria y agente causal de la enfermedad de Chagas. La misma es endémica en Latinoamérica, aunque su contagio se ha expandido a otras regiones, y continúa siendo al día de hoy y desde su descubrimiento en 1909 una enfermedad desatendida. No existen vacunas que protejan de esta enfermedad ni ninguna otra causada por los tripanosomátidos patógenos relacionados (Trypanosoma brucei y Leishmania sp.). Las drogas terapéuticas usadas son las mismas desde hace 50 años, presentando una moderada eficacia en la mejora de la calidad de vida debido a los diversos efectos secundarios del tratamiento. Por lo tanto, es de vital importancia la continua búsqueda de blancos terapéuticos entre las vías celulares esenciales para la supervivencia y desarrollo del ciclo de vida de estos parásitos. T. cruzi posee un ciclo de vida digenético, atravesando dos estadíos proliferativos y dos infectivos, con morfologías y metabolismos muy diferentes. En su pasaje del insecto vector al hospedador mamífero, y viceversa, debe capacitarse para enfrentar cambios abruptos en las condiciones ambientales y sobrevivir. Estas adaptaciones se dan a través de las vías de respuesta a estrés. Es por la complejidad de este ciclo de vida que las vías de sensado y señalización que le permiten al parásito adaptarse presentan características únicas y divergentes con respecto a sus hospedadores y otros organismos de vida libre. Este trabajo inicia con la hipótesis que sugiere que el bloqueo de las vías de señalización mediadas por segundos mensajeros en el parásito llevaría a su inhabilitación para adaptarse y proseguir con su ciclo de vida. Una de las moléculas mensajeras más importantes en distintos tipos celulares son los nucleótidos de adenosina. En tripanosomátidos se han estudiado de manera exponencial y se vio que están involucrados en procesos esenciales como la diferenciación, la infección, la proliferación, el comportamiento social, entre otros. Sin embargo, muchas de las proteínas canónicas involucradas en estas vías no se pudieron hallar en los genomas de estos organismos. Y muchas veces, aquellas que sí se encuentran presentan características funcionales, estructurales y/o de secuencia divergentes y novedosas. Todo esto las vuelve prometedores blancos de drogas terapéuticas. En el primer capítulo evaluamos el rol del AMPc en la respuesta a estrés oxidativo en T. cruzi. Encontramos que un aumento de la concentración intracelular de AMPc por tratamientos con análogos permite que los epimastigotes sean más resistentes ante estrés oxidativo producido por tratamientos con peróxido de hidrógeno. Mientras que la sobre-expresión de la fosfodiesterasa citoplasmática TcrPDEA1, lo cual reduce los niveles de AMPc intracelular, los vuelve más sensibles. En el estadío de tripomastigote, sin embargo, los resultados fueron más complejos en su interpretación. El tratamiento solamente con el análogo de AMPc sobre los parásitos produjo una mayor infección luego de 48 hs. Sin embargo, el agregado de peróxido produjo una caída en la infección indistintamente de la presencia del análogo. Además, resultados obtenidos con dosis bajas de peróxido presentan la posibilidad de que las vías de señalización por AMPc y los procesos desencadenados por el estrés estén interactuando. En el segundo capítulo identificamos y caracterizamos la quinasa de proteínas activada por AMP en T. cruzi. Esta enzima heterotrimérica es central en la regulación de la homeostásis energética de las células, en especial en respuesta a diferentes tipos de estrés por variaciones en la disponibilidad de nutrientes o que alteran los balances AMP:ATP intracelulares. En este trabajo confirmamos por primera vez la presencia de genes que codifican para los ortólogos de las subunidades de AMPK en T. cruzi. Estos ortólogos presentan una alta conservación de los dominios proteicos esperados, aunque sus secuencias codificantes divergen de sus ortólogos en otros organismos. Así mismo, se encontraron dos isoformas de la subunidad catalítica, con divergencia en sus secuencias y funcionalidades diferentes. Estudios filogenéticos confirman que existieron procesos de selección positiva que llevaron a una posible neofuncionalización de estas subunidades. Mediante diferentes ensayos in vitro e in vivo confirmamos su funcionalidad, actividad y algunos de sus posibles roles en epimastigotes. Particularmente mostramos que la fosforilación necesaria para su activación es modulada ante la presencia o ausencia de glucosa o aminoácidos como fuentes de carbono. También encontramos por ensayos con inhibidores y líneas de epimastigotes sobre-expresantes, que esta enzima juega un rol en la autofagia durante el hambreado de los parásitos y en su proliferación. En conclusión, estos estudios revelan nuevos roles de los nucléotidos de adenosina y las proteínas que responden a estos mensajeros en procesos fisiológicos del parásito T. cruzi. También amplían el repertorio de vías de señalización por AMP conocidas en estos parásitos y los procesos en los que se encuentran involucradas. Trypanosoma cruzi is a unicelular kinetoplastid protozoan parasite and the causative agent of Chagas disease. This affliction is endemic in Latin America, although it has spread to other regions, and is, since its discovery in 1909 to this day, a neglected disease. There are no vaccines to prevent it or any of the other parasitic diseases caused by trypanosomatid parasites (Trypanosoma brucei and Leishmania sp.). The therapeutic drugs used today have been the only ones available for the last 50 years, with only a moderate efficacy in the improvement of the patient’s quality of life, due to the side effects of the treatment. Hence, it is of vital importance to continue the search for drug targets in the biological pathways essential for these parasites’ survival and development. T. cruzi has a digenetic life cycle, transitioning between two proliferative and two infective stages, with very different morphologies and metabolisms. Through its passage from the insect vector to the mammalian host and vice versa, the parasite must face abrupt environmental changes and adapt to survive. These adaptations depend on the stress response cellular pathways. It is due to the complexity of the life cycle that these pathways show unique and divergent characteristics compared to the hosts and other free-living organisms. This work begins with the hypothesis that suggests that the blockage of the signaling pathways mediated by second messengers in the parasite would lead to its inability to adapt and proceed with the life cycle. One of the most important messenger molecules in different organisms are the adenosine nucleotides. These have been exponentially studied in trypanosomatids and connected with essential cellular processes such as proliferation, differentiation, infection, social motility and behavior, amongst others. However, a lot of the canonic proteins found as participants of these pathways are not found in trypanosomatids’ genomes. And many times, those that are present, show new and divergent functional, morphological or sequence characteristics. All the facts described above make these proteins promising therapeutic targets. In the first chapter, we evaluate cAMP role in the oxidative stress response in T. cruzi. We found that an increase in intracellular concentrations of cAMP by treatment with cAMP analogs confers epimastigotes a higher resistance to oxidative stress caused by hydrogen peroxide. The overexpression of the cytoplasmic phosphodiesterase TcrPDEA1, which instead decreases the intracellular cAMP levels, increases the epimastigotes’ sensitivity to oxidative stress. For the trypomastigote stage, however, results were more complex. cAMP treatment alone on the parasites before infection increases amastigote number obtained after 48 h infections. Nonetheless, hydrogen peroxide treatment decreased infectivity in a dose dependent manner with or without cAMP treatment. In addition, results obtained with cAMP analogs and low doses of hydrogen peroxide suggest these pathways have some crosstalk in this stage. In the second chapter, we identified and characterized the AMP-activated protein kinase in T. cruzi (TcAMPK). This heterotrimeric enzyme is central to the regulation of cellular energy homeostasis, especially in response to stress produced by variations in carbon source or alterations of the AMP:ATP ratio. In this work we confirmed for the first time the presence of coding genes for the three AMPK subunits orthologs in T. cruzi. These genes present high conservation in the expected protein domains, although their sequences diverge from those in other organisms. Furthermore, we found two isoforms for the catalytic subunit (alpha), with important differences in their sequences and distinctive functions. Phylogenetic analysis confirmed that some residues in the alpha subunits’ sequences suffered positive selection through evolution that led to a possible neofunctionalization. Through different in vitro and in vivo assays we confirmed functionality, activity and putative roles in epimastigotes. Particularly, we show that the activation loop phosphorylation, necessary for AMPK activation, is modulated with the presence or absence of glucose or amino acids in the culture media. Also, using a specific AMPK inhibitor and epimastigotes overexpressing alpha subunits, we found that this enzyme plays a role in autophagy and in the growing curve. In conclusion, these studies reveal new roles for adenosine nucleotides and proteins involved in these pathways in physiological processes of T. cruzi. Also, they expand the repertoire of AMP signaling pathways know for these parasites and the processes they are involved in. Fil: Sternlieb, Tamara. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.