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How pathogens coevolve with and adapt to their hosts are critical to understanding how host jumps and/or acquisition of novel traits can lead to new disease emergences. The Xanthomonas genus includes Gram-negativeplant-pathogenic bacteria that collectively infect a broad range of crops and wild plant species. However, individual Xanthomonas strains usually cause disease on only a few plant species and are highly adapted to their hosts,making them pertinent models to study host specificity. This review summarizes our current understanding of the molecular basis of host specificity in the Xanthomonas genus, with a particular focus on the ecology, physiology,and pathogenicity of the bacterium. Despite our limited understanding of the basis of host specificity, type III effectors, microbe-associated molecular patterns, lipopolysaccharides, transcriptional regulators, and chemotacticsensors emerge as key determinants for shaping host specificity.

Hoplochelus marginalis Fairmaire (Coleoptera: Melolonthidae) endemic from Madagascar was introduced in the seventies into Réunion Island where this white grub rapidly became a serious pest of sugarcane. Several strains of an entomopathogenic fungus belonging to the genus Beauveria (Ascomycota: Hypocreales) were isolated from H. marginalis in Madagascar and introduced into Reunion. We have recently demonstrated that these strains corresponded to a new species, Beauveria hoplocheli. A commercial product (Betel®) based on this fungus has been used for three decades in Réunion for the biological control of H. marginalis. To assess the sustainability of the biological control, tools are needed to monitor the evolution of the bioinsecticide in the field soils. Microsatellites are useful tools to evaluate the genetic diversity of populations and to follow their evolution. However, only microsatellites developed for B. bassiana and B. brongniartii are available. The aim of this work was to develop, specifically for B. hoplocheli, microsatellite markers that will enable the study the genetic diversity of populations present in the soils of Reunion Island. DNAs of 12 strains were pooled to achieve a DNA microsatellites enriched bank. The bank allowed the identification of 359 sequences containing microsatellites for which it was possible to design PCR primer pairs flanking the microsatellite sequence. Over the 100 pairs of primers tested on five strains, 24 produced a single polymorphic amplicon. After evaluation on 13 strains, 22 pairs of primers that could be multiplexed in three PCR reactions were validated.

International audience; no abstract

International audience; Bacterial wilt, caused by Ralstonia solancearum (Rs) (Smith) Yabuuchi et al., is one of the most important diseases of potato crops worldwide, including Madagascar. From the literature, strains of Rs phylolypes III or 1 were pathogenic to Solanaceae in the highlands potato areas (1,2). From years these strains were managed through the deployment of resistant or tolerant potato cultivars thanks to joint 30-yeaTS of collaborative research undertaken by Fifamanor (3) and CIP (4). however, since the last five years severe epidemics of bacterial will were observed in the Vakinankaratra highlands. A quest ion arises about the durability of resistant or tolerant potato varieties. It was hypothesized that (i) highly aggressive strains may have emerged from the Rs populations or ( ii ) exotic strains could have been introduced. A large survey was organized to collect strains of Rs to investigate how diverse the actual Rs population was. A first approach focused on phylotype profiling (multiplex-PCR) and phylogenetic assignation (egl sequcncing) of a limited number of strains (n=32) isolated from highly diseased potato plots. Surprisingly, this first set of Rs strains were computed phylotype IIB - I based on egl-treeing including worldwide reference sequences that covered the known diversity. This is the first report of brown rot causing strains in Madagascar. From the survey, 763 strains have been collected from symptomatic plants in main representative potato growing areas of Vakinankaratra: 132 strains were phylotype III and 631 phylotype II B-I. Phylotype III strains were associated to sites with low bacterial will incidence. In contrast., phylotype IIB-I strains were always associated with severe outbreaks and found to be distributed over almost the entire area surveyed. Population structure and evolutionary dynamics o f lineages IIB-I and III are currently investigated by improving available MLVA (multilocus VNTR analysis) schemes (5.6) and by developing a specific MLVA scheme, respectively. (Résumé d' auteur)

designed to identify 17 phylogenetic clusters of diagnostic interest, including species, phylotype or sequevar-specific probes along with control probe . Highlight was given on three ecotypes in the phylotype II: (i) Brown rot trains from sequevars IIB-1 ; (ii) Moko disease-causing srains from sequevars IIB-3 IIB-4, IIA-6 and IIA-24, that cause wilt on banana plantain, and Heliconia; and (iii) new pathogenic variants from sequevar IIB-4NPB that lacks pathogenicity to banana Cavendish but can infect many other plant species, including Cucurbitacae. As a first step, a spotted array glass slide format was chosen for its probe screening capacity, where the 100 best 50mers probes out of more than l 000 were selected on 80 strains for switching to a more convenient microarray format, based on the "Array Tube" technology from Alere Technologies, which allows micro-reactions within a vial. Several advantages to witch to this technology will be presented along with first results.

We describe the development of a microarray to identify the major pathogenic and/or genetic subgroups of Ralstonia solanacearum: selection of target sequences from ail available genomes, PCR screening. spotting and hybridization tests on glass slides (Agilent platform). These steps lead us to select optimized probes, which gave the most in formative signal. The next stage of this strategy will consider the setting up of a more portable microarray system: the Array Tube From Alere Technologies, which allows micro-reactions within a via l, based on the macroarray technology. Several advantages to switch to this techno logy will be presented along with the early first results. (Texte intégral)

International audience; Xanthomonads are plant-associated bacteria that establish neutral, commensal or pathogenic relationships with plants. The list of common characteristics shared by all members of the genus Xanthomonas is now well established based on the entire genome sequences that are currently available and that represent various species, numerous pathovars of X. axonopodis (sensu Vauterin et al., 2000), X. oryzae and X. campestris, and many strains within some pathovars. These ?-proteobacteria are motile by a single polar flagellum. Motility is an important feature involved in biofilm formation, plant colonization and hence considered as a pathogenicity factor. X. axonopodis pv. phaseoli var. fuscans (Xapf) is one of the causal agents of common bacterial blight of bean and 4834-R is a highly aggressive strain of this pathogen that was isolated from a seed-borne epidemic in France in 1998. We obtained a high quality assembled sequence of the genome of this strain with 454-Solexa and 2X Sanger sequencing. Housekeeping functions are conserved in this genome that shares core characteristics with genomes of other xanthomonads: the six secretion systems which have been described so far in Gram negative bacteria are all present, as well as their ubiquitous substrates or effectors and a rather usual number of mobile elements. Elements devoted to the adaptation to the environment constitute an important part of the genome with a chemotaxis island and dispersed MCPs, numerous two-component systems, and numerous TonB dependent transporters. Furthermore, numerous multidrug efflux systems and functions dedicated to biofilm formation that confer resistance to stresses are also present. An intriguing feature revealed by genome analysis is a long deletion of 35 genes (33 kbp) involved in flagellar biosynthesis. This deletion is replaced by an insertion sequence called ISXapf2. Genes such as flgB to flgL and fliC to fleQ which are involved in the flagellar structure (rod, P- and L-ring, hook, cap and filament) are absent in the genome of strain 4834-R that is not motile. Primers were designed to detect this deletion by PCR in a collection of more than 300 strains representing different species and pathovars of Xanthomonas, and less than 5% of the tested xanthomonads strains were found nonmotile because of a deletion in the flagellum gene cluster. We observed that half of the Xapf strains isolated from the same epidemic than strain 4834-R was non-motile and that this ratio was conserved in the strains colonizing the next bean seed generation. Isolation of such variants in a natural epidemic reveals that either flagellar motility is not a key function for fitness or that some complementation occurs within the bacterial population. (Résumé d'auteur)

Xanthomonads are plant-associated bacteria that establish neutral, commensal or pathogenic relationships with plants. The list of common characteristics shared by all members of the genus Xanthomonas is now well established based on the entire genome sequences that are currently available and that represent various species, numerous pathovars of X. axonopodis (sensu Vauterin et al., 2000), X. oryzae and X. campestris, and many strains within some pathovars. These ?-proteobacteria are motile by a single polar flagellum. Motility is an important feature involved in biofilm formation, plant colonization and hence considered as a pathogenicity factor. X. axonopodis pv. phaseoli var. fuscans (Xapf) is one of the causal agents of common bacterial blight of bean and 4834-R is a highly aggressive strain of this pathogen that was isolated from a seed-borne epidemic in France in 1998. We obtained a high quality assembled sequence of the genome of this strain with 454-Solexa and 2X Sanger sequencing. Housekeeping functions are conserved in this genome that shares core characteristics with genomes of other xanthomonads: the six secretion systems which have been described so far in Gram negative bacteria are all present, as well as their ubiquitous substrates or effectors and a rather usual number of mobile elements. Elements devoted to the adaptation to the environment constitute an important part of the genome with a chemotaxis island and dispersed MCPs, numerous two-component systems, and numerous TonB dependent transporters. Furthermore, numerous multidrug efflux systems and functions dedicated to biofilm formation that confer resistance to stresses are also present. An intriguing feature revealed by genome analysis is a long deletion of 35 genes (33 kbp) involved in flagellar biosynthesis. This deletion is replaced by an insertion sequence called ISXapf2. Genes such as flgB to flgL and fliC to fleQ which are involved in the flagellar structure (rod, P- and L-ring, hook, cap and filament) are absent in the genome of strain 4834-R that is not motile. Primers were designed to detect this deletion by PCR in a collection of more than 300 strains representing different species and pathovars of Xanthomonas, and less than 5% of the tested xanthomonads strains were found nonmotile because of a deletion in the flagellum gene cluster. We observed that half of the Xapf strains isolated from the same epidemic than strain 4834-R was non-motile and that this ratio was conserved in the strains colonizing the next bean seed generation. Isolation of such variants in a natural epidemic reveals that either flagellar motility is not a key function for fitness or that some complementation occurs within the bacterial population.

Bacterial blight of onion is an emerging disease threatening world onion production, and causing damage to other Allium crops. The causal agent, Xanthomonas axonopodis pv. allii (Xaa) has been listed on the EPPO A1 list of pests recommended for regulation as quarantine pests, since 2009. A duplex nested-PCR assay, targeting two markers specific to Xaa has been recently developed (Robène-Soustrade et al., 2010). A triplex quantitative real-time PCR assay (Taqman® technology) was developed targeting the same Xaa-specific markers and an internal control chosen in 5.8S rRNA gene from Alliaceae. Xaa strains were detected by the amplification of one or both of the two specific markers. The internal control signal validates both the extraction process and the reaction itself. Several successive steps have to be performed before detection from seed: seed maceration for 48h at 4°C, followed by homogenization of the seed macerate with a stomacher® and DNA extraction using DNeasy® Plant mini kit (Qiagen). This assay is currently being validated following the European standard EN ISO 16140: 2003 and the EPPO standard PM7/98 (1). The performance of Nested-PCR and real-time PCR assays are discussed. These PCR-based tools could be useful for the international sanitary surveillance of seed exchanges.

Xanthomonas axonopodis# pv. #dieffenbachiae# (Xad) is the etiological agent of anthurium bacterial blight. Xad is a quarantine organism in several countries and particularly in Europe where this pathogen is listed in the A2 list of the European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). A collaborative trial involving 15 European laboratories was performed to evaluate a Nested PCR assay (1) (NPCR) for the detection of Xad from anthurium samples. This collaborative study was conducted according to the ISO 16140:2003 standard "Protocol for validation of alternative methods"(3). The ISO 16140 validation protocol comprises two phases: a comparative study of methods and a collaborative trial. The comparative study was carried out in the organizing laboratory (CIRAD/LNPV Reunion Island). Methods such as the EPPO reference method for detection of Xad, the N-PCR assay, immunofluorescence (IF) and double antibody sandwich ELISA (DAS-ELISA) were compared. It was shown noticeably differences in performance between methods. The reference and N-PCR methods were the most efficient techniques, both combining a very3 good inclusivity, exclusivity, a relative accuracy above 95% and a low detection threshold (approximately 10 CFU.mL-1). The collaborative trial consisted in determining the variability of the results obtained by several different competent laboratories using identical samples and in comparing these results to those obtained with the comparative study. Four blinded samples (8 replicates/sample) were analysed by the 15 laboratories. The four samples were constituted of an anthurium extract artificially contaminated with variable concentrations of the pathotype strain (0, 104 or 105 CFU.mL-1), or with a non-target strain (107CFU.mL-1). The N-PCR assay was performed in comparison to a reference method (isolation of the bacteria on non-selective and semi-selective media followed by a serological identification by indirect ELISA) and to other methods, DASELISA and IF, all included in the EPPO standard (2). The relative accuracy, relative specificity, relative sensitivity, accordance and concordance values obtained for the N-PCR assay were 96.0%, 95.0%, 97.5%, 94.0% and 93.0% respectively. The results obtained with the N-PCR assay were significantly different from the theoretically expected results (p

La tomate et le piment sont infectés par plusieurs espèces de Xanthomonas dont certaines ont fait l'objet d'une reclassification récente, ayant abouti à la création de trois nouvelles espèces : X. euvesicatoria, X gardneri et X perforans, auxquelles s'ajoutent X. vesicatoria et X. campestris pv. raphani de description plus ancienne. X. euvesicatoria, X perforans et X vesicatoria sont considérées comme organisme de quarantaine en Europe. La caractérisation par AFLP et MLSA sur la base de quatre portions de gènes de ménage (atpD, dnaK, efp et gyrB) d'une collection mondiale de souches associées à la gale bactérienne de la tomate et du piment et d'une collection de référence comprenant l'ensemble des souches-type des espèces valides au sein du genre Xanthomonas suggère les points suivants : 1) Les espèces X alfalfae, X. euvesicatoria et X. perforans sont probablement des espèces-synonyme qui doivent être dénommées X euvesicatoria. 2) L'espèce X. gardneri est synonyme de X. cynarae. 3) Quelques souches isolées de tomate aux USA et en Zambie appartiennent à l'espèce X. campestris et sont génétiquement très proches de X. campestris pv. raphani. L'étude du pouvoir pathogène de X. gardneri et de X. cynarae sur tomate, piment et artichaut a montré que toutes les souches étudiées provoquent une réaction de type compatible sur l'ensemble des espèces étudiées. Aucune spécialisation d'hôte apparente n'a été mise en évidence. De même, les souches de X. campestris isolées de tomate sont pathogènes du radis, sans aucune différence par rapport aux souches de X. campestris pv. raphani ni dans la morphologie des symptômes produits ni dans les niveaux de population mesurés. Ceci confirme que la tomate est un hôte naturel du pathovar raphani. Ce schéma de typage est en cours d'application pour connaître la diversité de souches isolées de Solanées à graines dans la région Sud-ouest de l'Océan Indien.

Asiatic Citrus Canker disease is induced by #Xanthomonas citri# pv. #citri# (Xcc) and threatens most of Citrus species and cultivars in many citrus-producing countries. Two pathogenic variants with different host range were described within Xcc. The pathotype Xcc-A infects a wide range of citrus and some related genera, has a worldwide distribution and is a permanent threat for citriculture. In contrast, Xcc-A* is naturally restricted to two Citrus species, limes (C. aurantifolia) and alemow (C. macrophylla) in limited areas. A rapid and reliable test using molecular methods is useful for accurate identification at pathotype level of this bacterium, classified as quarantine organism. Several PCR-based diagnostic tools have been developed for the identification of Xcc. In a preliminary study, we showed a lack of specificity for most of them when assayed on a large collection of Xcc strains and non-target strains. The aim of this study was to propose a new diagnostic tool for detection and identification of pathotypes of X. citri pv. citri. A multiplex quantitative real-time PCR assay (qPCR) was developed using hydrolysis probes targeting two markers of the bacterium. PCR primers targeting genes involved in pathogenicity and/or plant interactions were designed from the complete sequence of the Xcc-pathotype A strain IAPAR 306. Their specificity was assayed on a collection of Xcc-A strains (n=21), Xcc-A* (n=14) and other genetically related Xanthomonas (n=23) (1). A specific Xcc sequence encoding a conserved hypothetical protein related to chemotaxism and a specific Xcc-A sequence in a housekeeping gene were retained for the qPCR assay. The specificity of the qPCR assay was verified on the same strains collection of Xcc strains and non-target Xanthomonas. The qPCR assay detected all the Xcc strains and identified the pathotypes from cultures and citrus plant samples artificially infected with the bacterium: a sample is tested positive for the presence of A strains if both markers are amplified. No amplification or amplification of the housekeeping gene marker alone led to a negative result for Xcc. Amplification of the Xcc-specific marker alone is the signature for A* strains. Standard curves with high correlation coefficients (R2>0,99) were obtained from 10-fold bacterial suspensions dilutions. The qPCR assay allowed the detection of 107 to 103 CFU per ml of bacterial suspension or per g of lime leaves (Citrus aurantifolia) with calculated amplification efficiencies around 90% and 80% respectively. This qPCR assay is a powerful tool that allows distinguishing pathotypes with different economic incidence. It would be useful for indexing propagation material in nurseries and for surveillance of international movement of Xanthomonas citri pv. Citri.

Le dépérissement bactérien des alliacées est provoqué par Xanthomonas axonopodis pv. allii. Cette bàctérie est transmissible par semences, et ce mode de propagation explique en partie le caractère d'émergence de la maladie au niveau mondial. Cette bactérie, actuellement absente d'Europe, est en cours d'inscription sur la liste Al d'organismes de quarantaine de l'OEPP. Afm de disposer d'un outil fiable capable de détecter spécifiquement la bactérie dans les semences d'oignon nous avons développé une Triplex PCR quantitative basée sur la technologie Tagman®. Ce test met en jeu l'amplification d'un témoin interne choisi dans le gène de la NADH deshydrogenase des alliacées et de deux marqueurs spécifiques de Xanthomonas axonopodis pv. allii. Suivant les souches, l'un ou l'autre des marqueurs ou bien les deux sont amplifiés. En jouant sur quelques mutations, ce système permet d'exclure certaines souches appartenant au même sous-groupe génétique 9.2, qui possèdent également l'un des deux marqueurs. La spécificité du test a été validée sur 80 souches de Xanthomonas axonopodis pv allii et 120 souches bactériennes non cibles (autres genres, espèces, pathovars et souches saprophytes). Nous avons pu établir des gammes d'étalonnage à fort coefficient de corrélation (r'" > 0,99) et présentant une efficacité d'amplification supérieure à 90% à partir de suspensions bactériennes (10' à 103 CFU/ml) et d'ADN extrait (20 ng à 20 pg). Une détection conjointe optimale de l'ADN bactérien et du témoin d'amplification végétal de PCR a été obtenue en broyant un macérat de semences à l'aide d'un homogénéisateur de laboratoire (Stomacher®) suivi d'une extraction à l'aide du kit DNeasy Plant minikit (Qiagen). Une phase de validation du test est en cours sur lots de semences artificiellement et naturellement contaminés. Cet outil sera utile pour une surveillance efficace de la présence de cet organisme de quarantaine dans les lots de semences au cours des échanges internationaux.

Bacterial blight of onion is a seed-borne emerging disease threatening world onion production, and causing damage to other Allium crops. Its causal agent, #Xanthomonas axonopodis pv. Allii# (Xaa) is listed in quarantine European and Mediterranean Protection Plant Organization (EPPO) A1 list since 2009. The development of a reliable tool is necessary to manage Xaa spreading via international seed trade. We developed a triplex quantitative real-time PCR capable of detecting Xaa using the Taqman® technology. This quantitative PCR targets two markers specific from Xaa (1) and an internal control chosen in NADH dehydrogenase from Alliaceae. The multiplex real-time PCR was assayed on a large collection of Xaa strains isolated worldwide and pathogenic to onion or to other Allium species. Xaa strains were detected by the amplification of one or both of the two specific markers. In case of poor or no amplification of these Xaa markers, the internal control signal validates both the extraction process and the reaction itself. Specificity was assayed on 80 Xaa strains, and 120 non target strains belonging to other #X. axonopodis# pathovars including strains from the same #X. axonopodis# subgroup 9.2 sensu Rademaker, other species, other genera, and saprophytic strains isolated from onion seed and plants. We obtained standard curves with high correlation coefficients (r2> 0,99) and amplification efficiencies of more than 90% on bacterial suspension (107 to 103 CFU/ml), and efficiencies of more than 80% from seed macerate, allowing the detection of 5.103 to 5.107 CFU/g for seed artificially inoculated with Xaa strains. We successfully detected both bacterial DNA and internal control DNA from plant by performing two successive steps: homogenization of a seed macerate with a stomacher®, followed by DNA extraction using DNeasy Plant minikit (Qiagen). We are currently validating our assay on naturally contaminated seed lots. This tool would be useful for the international sanitary surveillance of seed exchanges.

Bacterial spot of tomato and pepper (BSTP), a major problem in tropical and subtropical climates, can be caused by several #Xanthomonas genospecies#, #X. euvesicatoria#, #X. vesicatoria#, #X. perforans#, and #X. gardneri.# #X. campestris# pv. #raphani# strains primarily pathogenic to #Brassicaceae# have also been associated with outbreaks of BSTP on tomato. BSTP has been observed in the South West Indian Ocean (SWIO) region but no data is available about the status of #Xanthomonas# species associated with BSTP in this region. A total of 72 strains collected from Comoros, Madagascar, Mauritius, Réunion and the Seychelles were characterized using AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) and MLSA (MultiLocus Sequence Analysis) based on four housekeeping genes. AFLP and MLSA consistently assigned strains at the species level. All strains were unambiguously classified in one species, namely: #X. euvesicatoria#, #X. vesicatoria#, #X. perforans# and #X. gardneri#. MLSA identified two to three sequence types per genospecies. No #X. campestris# pv. #raphani# strains were identified in the collection. Most of the strains were identified as #X. euvesicatoria# (65 %). MLSA data suggested that sequence variations primarily consisted of synonymous mutations, although a recombination event spanning several hundreds nucleotides was detected for some strains of #X. euvesicatoria# on the atpD gene coding for the F1-F0-ATPase ß subunit. Pathogenicity tests were also performed with pathogenicity profiles of strains consistent with the classification in genospecies. Some pathological variations were primarily observed among strains identified as #X. euvesicatoria#. This study provides for the first time a comprehensive description of the status in the SWIO region of #Xanthomonas# species causing BSTP.

A la Réunion, 2 millions de tiges et 18 000 pots d'anthurium sont produits en moyenne chaque année. Depuis 1997, une bactérie menace la production. Un test de détection de cette bactérie, mis au point au Cirad en collaboration avec le Service de Protection des Végétaux de la Réunion, est désormais utilisé pour contrôler les plants importés et diagnostiquer cette maladie qui provoque un dépérissement de l'anthurium.

RaIstonia solanacearum est l'agent responsable du flétrissement bactérien chez 55 familles botaniques différentes, dont les solanées. Cette bactériose vasculaire, présente sur tous les continents, peut entraîner la destruction totale de la parcelle en production. Comme pour la plupart des phytobactérioses il n'existe pas de moyen de lutte curatif et les mesures prophylactiques ainsi que l'utilisation d'un matériel sain est à privilégier. Afin de répondre aux impératifs de lutte préventive, il est indispensable de disposer d'un outil de détection spécifique, sensible, utilisable pour la détection de la bactérie in planta et dans les sources potentielles de contamination, l'eau en particulier. Plusieurs outils de détection sont disponibles, mais aucun ne combine spécificité et haute sensibilité, deux pré requis indispensables. Nous avons développé une Nested-PCR à partir d'un fragment d'ADN de 282pb (1) qui amplifie spécifiquement le complexe d'espèce R. solanacearum (2). Pour limiter les risques de contaminations inhérents à une PCR en deux étapes, une Nested-PCR en un seul tube a été mise au point: Single Closed-Tube Nested-PCR (SCTN-PCR). La spécificité de cet outil moléculaire a été validée sur 16 espèces bactériennes, incluant R. pickettii, R. eutropha, Pseudomonas spp. ainsi que X. campestris pv. campestris. Quarante-quatre souches couvrant l'ensemble de la diversité génétique du complexe d'espèce R. solanacearum (dont l'agent du BDB et R. syzygii) sont diagnostiquées par SCTN-PCR. Des plants de Hawaï 7996, variété résistante à R. solanacearum, ont été inoculés par trempage des racines dans une suspension bactérienne à 107 cfu.mr-1 (souche réunionnaise JT519, phylotype I). La détection de R. solanacearum a été mise en oeuvre par différentes méthodes sur des tiges prélevées au cours du temps: détection par PCR simple (amorces Opina) ou par SCTN-PCR, directement sur broyat ou après une extraction d'ADN à l'aide d'un kit d'extraction QUIAamp (Quiagen). Des comptages sont réalisés en parallèle par étalement sur milieu semi-sélectif. La détection la plus sensible est obtenue par SCTN-PCR, avec la détection de 100,1 cfu.mr-1 dès six heures après l'inoculation, soit plus de sept jours avant l'apparition de symptômes. Cette sensibilité remarquable de l'outil a permis de regrouper plusieurs échantillons afin de répondre aux contraintes d'efficacité de la certification. R. solanacearum est détecté dans un mélange réunissant dix extraits d'ADN de tiges dès le deuxième jour après inoculation. D'autre part, un protocole de préparation d'échantillons d'eau (3) a été validé sur 12 différents types d'eaux d'irrigations à la Réunion: rivières, nappes phréatiques, retenues collinaires et bassins. La sensibilité de la SCTN-PCR a été testée sur ces eaux artificiellement contaminées de 100 à 106 cfu.ml-1. Sur les 3 répétitions effectuées pour les faibles concentrations, l'outil présenté détecte au moins un des triplicats à partir de 103 cfu.ml-1. Des populations de 10 cfu.ml-1 sont détectées, mais de façon non reproductible pour des raisons évidentes liées à l'échantillonnage. Au cours d'une première validation sur le terrain, l'outil moléculaire a détecté R. solanacearum dans deux bassins provenant de régions infestées. Des études sont en cours afin de relier seuil de détection et quantité d'inoculum nécessaire pour déclencher une épidémie, ce qui est particulièrement stratégique dans le cas des cultures de type hors-sol. SCTN-PCR est sensible, spécifique et rapide d'emploi. Les applications concernent le contrôle phytosanitaire, la certification ou l'épidémio-surveillance. Par ailleurs SCTN-PCR doit pouvoir être adapté aux besoins de certification du matériel de propagation (vitroplants, semences...) d'autres espèces hôtes de R. solanacearum. (Texte intégral)

Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae (Xad) est l'agent du dépérissement bactérien de l'anthurium, sévère maladie systémique rencontrée dans la plupart des zones de culture de cette Aracée. Les stratégies de lutte actuelles consistent essentiellement en l'application de mesures prophylactiques ainsi que l'utilisation d'un matériel sain issu de la culture in vitro. Dans une optique de certification, une nested-PCR a été développée à partir d'un fragment d'ADN isolé par RAPD-PCR (1). La protéine putative codée par ce fragment présente des homologies avec un ABC transporteur codé par wzt du cluster LPS chez Xanthomonas oryzae pv. oryzicola. Cet outil moléculaire permet le diagnostic de Xad en culture pure, et détecte la bactérie directement sur broyat de tissus végétaux infectés. Afin de déterminer la sensibilité de ce test sur extrait végétal, nous avons réalisé des inoculations de Xad sur anthurium puis nous avons analysé au cours du temps la présence de la bactérie par nested-PCR. Soixante-douze plants d'anthurium ont été infectés par aspersion de la surface foliaire à l'aide d'une suspension bactérienne à 107 cfu/ml. Un lot de 36 plants inoculés a été conservé intact pour noter l'évolution des symptômes au cours du temps. Un prélèvement de 3 feuilles a été réalisé tous les 2 jours sur deux plants choisis au hasard parmi les 36 plants restants. Les pourtours de chacune des feuilles ont été broyés dans du tampon d'extraction contenant du PVP. Sur chacun des broyats ont été réalisés une détection par nested-PCR ainsi que des étalements sur les milieux LPGA et semi-sélectif CS (2). La nested-PCR permet la détection de la bactérie dès 4 jours après inoculation, soit 12 jours avant l'apparition des premiers symptômes. Le seuil de détection par la nested-PCR se situe à 103 cfu/mI, soit 2.104 cfu/g de tissus. Afin d'appliquer ce test dans une procédure de certification, pour laquelle des regroupements d'échantillons sont nécessaires en vue de diminuer le nombre d'analyses, nous avons rajouté une étape d'enrichissement en milieu liquide de la bactérie cible avant sa détection moléculaire. Un bouillon semi sélectif contenant 5 antibiotiques a été mis au point permettant l'inhibition de la croissance de plus de 86% des bactéries saprophytes retrouvées sur anthurium. Des expériences de co-cultures ont montré que les souches susceptibles de se développer sur ce milieu n'empêchaient pas la croissance et la détection de Xad. Le taux de croissance de Xad à 28°C sur ce milieu a été déterminé afin de connaître la durée d'incubation théorique nécessaire pour obtenir une population détectable par PCR (103 cfu/ml) à partir d'une seule cellule. Ce protocole a été testé par incubation de broyats de feuilles d'anthurium en présence de différentes dilutions du pathogène et d'autres bactéries. Des comptages bactériens et des tests PCR ont permis de valider cette technique comme permettant de garantir l'absence du pathogène dans l'échantillon testé. Une étude portant sur le plan d'échantillonnage (prélèvement pour une détection optimale, regroupement des échantillons) a été réalisée. Une étude statistique a permis de déterminer le nombre de feuilles à analyser afin de pouvoir diagnostiquer la bactériose avec une probabilité de 0,99 pour une incidence de la maladie de 1%. Ce protocole a été utilisé lors de la sortie de quarantaine d'un lot de 5000 plants d'anthurium dans le cadre du transfert de la technique au Service de Protection des Végétaux. Elle a permis de déclarer ce lot indemne de la maladie. (Texte intégral)

La présente invention concerne une séquence nucleotidique présente chez toutes les souches de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae pathogènes pour I'anthurium et un procédé de dépistage de Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae utilisant cette séquence.

Background and objectives: Bacterial blight of onion (BBO), a biennial plant species, is an emerging disease now present in many onion-producing areas. The causal agent, Xanthomonas axonopodis pv. allii (Xaa), is seedborne (2). Although the importance of seedborne Xaa as an initial inoculum source associated with the early stages of epidemics has been reported (3), no study concerning the epidemiology of BBO in seed production fields was conducted. In addition, the process of contamination of onion seeds in diseased fields is not understood and has never been measured. Our objectives were to (i) describe the temporal and spatial dynamics of the disease in experimental onion seed production plots, and (ii) evaluate contamination rates of seeds from these plots. Materials and methods: Epidemic progress in experimental plots of 121 x 60 onion plants contaminated onion bulbs (random inoculation was performed on 0.27% of the plants) was monitored. This experiment was done in duplicate over two consecutive cropping seasons. Disease incidence (percentage of infected plants per plot) was monitored each two weeks. Temporal analyses were performed by nonlinear regression analysis. Logit, Gompertz, complementary log-log and Probit link function models were tested. Akaike Information Criterion was used to choose the most appropriate model. The beta-binomial parameter (tetha) and the binary form of Taylor's power law were used to assess disease aggregation in quadrats consisting of 2x4, 4x8 and 6x12 plants. Spatial patterns were also examined using semivariance analysis. Bacterial analyses of seeds were performed after harvests using both a semi-selective medium (2) and a Xaa-specific nested-PCR (1). Results and discussion: Disease progress curves differed highly between the two years (incidence ranged from 0.05 to 0.6) probably because of climatic differences between the two studied seasons: winter season and late-summer season. Gompertz and probit link function model were the most appropriate models for describing the temporal increase of incidence. Aggregation of the disease incidence was detectable in all plots tested except for one plot at one date. When aggregation was detected, it tended to be a function of disease incidence at the three quadrat sizes tested, as shown by the binary form of Taylor's power law. The exponential model was a good descriptor of the semivariograms. Spatial dependencies were different between the two years, and ranged from 1.63 m in winter to 3.99 m in late-summer. Seed contamination was associated with high disease incidence (>_0.44). (Texte intégral)

Tomato yellow leaf curl virus was introduced in Réunion island in 1997 and has become the most important viral pathogen affecting tomato crops in this area. In Réunion island, the vector Bemisia tabaci is continuously present on a large list of wild and cultivated plant species. In order to establish control measures, it is important to know the role of weeds in the conservation of the virus. About 258 specimens belonging to 37 weeds species and 19 botanical families were collected from four fields planted with tomatoes or beans showing TYLCV symptoms. Both serological (ELISA) and molecular (dot-blot, Tissue Print Hybridization, PCR) methods were assayed on each sample in order to detect TYLCV or another begomovirus. TYLCV-[RE] (confirmed by DNA sequence comparisons) was detected mainly in six weeds families: Amaranthaceae, Commelinaceae, Convolvulaceae, Euphorbiaceae, Malvaceae and Solanaceae. The three first families had never been described as natural hosts for the TYLCV and any begomoviruses. The role of these weeds as potential sources of TYLCV will be further studied via experimental transmission tests.

Le dépérissement bactérien de l'oignon s'est répandu sur pratiquement tous les continents depuis trente ans et dès les années 1980 aux Mascareignes, provoquant des dégâts importants. Les travaux récents menés par le CIRAD, en collaboration avec divers acteurs locaux et internationaux, ont permis d'identifier la bactérie Xanthomonas axonopodis pv. allii et clarifier son spectre d'hôtes. Les techniques récentes de biologie moléculaire ont servi à classer les souches mondiales et envisager un réseau d'épidémio-surveillance de cette maladie. La bactérie est présente dans les semences ; une faible proportion de graines contaminées est capable de déclencher des épidémies conséquentes. Ceci explique en grande partie l'émergence du dépérissement bactérien, probablement liée aux échanges internationaux de semences infectées. Les travaux actuels sont axés vers une meilleure compréhension du cycle biologique de l'agent pathogène et la mise au point d'un outil de détection moléculaire sensible, fiable et rapide de la bactérie pour la certification des semences.

TYLCV is one of the most damaging viruses transmitted by the whitefly Bemisia tabaci. This virus, that causes severe symptoms on tomato culture, had spread for about 10 years in several parts of the world. To date, the possible transport of the virus by the way of imported and exported tomato fruits had never been considered. In this study, we report that TYLCV is present in tomato fruits at high titre. The virus can be acquired by 5 to 15% of whiteflies that fed on tomato fruits, depending on the acquisition access period, and then be transmitted up to 8% to tomato plants. The potential risk of causing new outbreaks of TYLCV via infected tomato fruits as a virus source is discussed.

La production de tomate est sérieusement menacée à la Réunion par des maladies à bégomovirus transmises par l'aleurode Bemisia tabaci . Alors que dans les départements français d'Améri-que ce sont des bégomovirus à génome bipartite qui ont été identifiés (article paru dans Phytoma-LdV n° 556 de janvier 2003, pp. 52 à 55), à la Réunion c'est le Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) qui est pour l'instant le seul responsable des dépérissements. Des études de caractérisation moléculaire du TYLCV et de son vecteur, ont débouché sur l'hypothèse d'une introduction récente à la Réunion et d'une seule origine géographique du virus, et ont montré la prépondérance du biotype B de B. tabaci dans les bassins de production maraîchère ainsi que l'existence d'un biotype de B. tabaci endémique du sud-ouest de l'Océan Indien. Différentes stratégies de lutte ont été mises en place par les organismes de recherche, de contrôle et de développement. La stratégie de lutte comprend un appui technique auprès des agriculteurs, l'accélération des procédures de certification des plants maraîchers, l'inventaire des parasitoïdes du vecteur et leur utilisation sous abris en lutte intégrée, le renforcement des contrôles du Service de la Protection des Végétaux à l'importation et des essais de produits chimiques pour lutter contre le vecteur. Par ailleurs, quelques nouvelles variétés alliant résistance et intérêts agronomique et commercial ont déjà pu être préconisées sur l'île après quatre années d'essais menés chez les maraîchers. Néanmoins, des tests en conditions contrôlées ont montré qu'une augmentation de la pression d'inoculum entraînait une baisse de l'efficacité de ces résistances. La recherche de nouvelles sources de résistance plus efficaces ainsi que l'identification des stratégies de lutte intégrée les plus adaptées aux conditions locales restent l'enjeu des projets à venir, en collaboration inter-DOM, mais également à travers des coopérations régionales.

Le dépérissement de l'anthurium, due à la bactérie Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae (Xad), a été introduit en 1997 à la Réunion par l'intermédiaire de plants contaminés. Malgré une campagne de lutte d'éradication, la maladie est installée à la Réunion. Les récentes enquêtes montrent que le secteur professionnel reste peu touché grâce à une prise de conscience et la mise en oeuvre de moyens importants de contrôle. La vigilance doit rester cependant de rigueur. La mise à disposition à très court terme d'outils de détection moléculaire sensibles, fiables et rapides de la bactérie permet d'envisager de mettre en place des moyens d'inspection plus performants.

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