Single Closed-Tube Nested-PCR : un nouvel outil performant pour détecter Ralstonia solanacearum

RaIstonia solanacearum est l'agent responsable du flétrissement bactérien chez 55 familles botaniques différentes, dont les solanées. Cette bactériose vasculaire, présente sur tous les continents, peut entraîner la destruction totale de la parcelle en production. Comme pour la plupart des phytobactérioses il n'existe pas de moyen de lutte curatif et les mesures prophylactiques ainsi que l'utilisation d'un matériel sain est à privilégier. Afin de répondre aux impératifs de lutte préventive, il est indispensable de disposer d'un outil de détection spécifique, sensible, utilisable pour la détection de la bactérie in planta et dans les sources potentielles de contamination, l'eau en particulier. Plusieurs outils de détection sont disponibles, mais aucun ne combine spécificité et haute sensibilité, deux pré requis indispensables. Nous avons développé une Nested-PCR à partir d'un fragment d'ADN de 282pb (1) qui amplifie spécifiquement le complexe d'espèce R. solanacearum (2). Pour limiter les risques de contaminations inhérents à une PCR en deux étapes, une Nested-PCR en un seul tube a été mise au point: Single Closed-Tube Nested-PCR (SCTN-PCR). La spécificité de cet outil moléculaire a été validée sur 16 espèces bactériennes, incluant R. pickettii, R. eutropha, Pseudomonas spp. ainsi que X. campestris pv. campestris. Quarante-quatre souches couvrant l'ensemble de la diversité génétique du complexe d'espèce R. solanacearum (dont l'agent du BDB et R. syzygii) sont diagnostiquées par SCTN-PCR. Des plants de Hawaï 7996, variété résistante à R. solanacearum, ont été inoculés par trempage des racines dans une suspension bactérienne à 107 cfu.mr-1 (souche réunionnaise JT519, phylotype I). La détection de R. solanacearum a été mise en oeuvre par différentes méthodes sur des tiges prélevées au cours du temps: détection par PCR simple (amorces Opina) ou par SCTN-PCR, directement sur broyat ou après une extraction d'ADN à l'aide d'un kit d'extraction QUIAamp (Quiagen). Des comptages sont réalisés en parallèle par étalement sur milieu semi-sélectif. La détection la plus sensible est obtenue par SCTN-PCR, avec la détection de 100,1 cfu.mr-1 dès six heures après l'inoculation, soit plus de sept jours avant l'apparition de symptômes. Cette sensibilité remarquable de l'outil a permis de regrouper plusieurs échantillons afin de répondre aux contraintes d'efficacité de la certification. R. solanacearum est détecté dans un mélange réunissant dix extraits d'ADN de tiges dès le deuxième jour après inoculation. D'autre part, un protocole de préparation d'échantillons d'eau (3) a été validé sur 12 différents types d'eaux d'irrigations à la Réunion: rivières, nappes phréatiques, retenues collinaires et bassins. La sensibilité de la SCTN-PCR a été testée sur ces eaux artificiellement contaminées de 100 à 106 cfu.ml-1. Sur les 3 répétitions effectuées pour les faibles concentrations, l'outil présenté détecte au moins un des triplicats à partir de 103 cfu.ml-1. Des populations de 10 cfu.ml-1 sont détectées, mais de façon non reproductible pour des raisons évidentes liées à l'échantillonnage. Au cours d'une première validation sur le terrain, l'outil moléculaire a détecté R. solanacearum dans deux bassins provenant de régions infestées. Des études sont en cours afin de relier seuil de détection et quantité d'inoculum nécessaire pour déclencher une épidémie, ce qui est particulièrement stratégique dans le cas des cultures de type hors-sol. SCTN-PCR est sensible, spécifique et rapide d'emploi. Les applications concernent le contrôle phytosanitaire, la certification ou l'épidémio-surveillance. Par ailleurs SCTN-PCR doit pouvoir être adapté aux besoins de certification du matériel de propagation (vitroplants, semences...) d'autres espèces hôtes de R. solanacearum. (Texte intégral)