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Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont une famille de protéines hautement conservée chez les eucaryotes et constituent la plus grande famille de récepteurs. Ces récepteurs sont impliqués dans presque tous les processus physiologiques, mais leur capacité à réguler un vaste éventail de processus biologiques différents fait l'objet de recherches intenses. Bien qu'ils soient classiquement considérés comme des récepteurs de la membrane plasmique, les RCPG sont présents dans tous les organites membranaires intracellulaires et certains d'entre eux ont la capacité de transduire des signaux à partir de ces organites. La signalisation d'un RCPG à partir de ces organelles intracellulaires est appelée signalisation biaisée par la localisation et cette signalisation peut avoir un résultat fonctionnel différent de celui des événements de signalisation du récepteur localisé dans la membrane plasmique. La signalisation biaisée par la localisation est un concept émergent en biologie des RCPG et peut ajouter une couche supplémentaire à la fonction du récepteur. D'autre part, avec la détection de certains RCPG à l'intérieur de différents organites, y compris le noyau, une modalité fonctionnelle non réceptrice pour les RCPG pourrait être postulée et pourrait également expliquer les divers rôles de cette famille. Cependant, cet aspect est presque entièrement inexploré. HCAR1 (GPR81), en tant que RCPG, est activé de manière endogène par le lactate et il a été démontré qu'il favorise la malignité du cancer en favorisant un niveau plus élevé de glycolyse dû à l'effet Warburg et cela par différentes voies. Son niveau d'expression est très élevé dans de nombreux cancers et présente une corrélation négative avec le pronostic du patient. Cependant, son mécanisme d'action n'est pas bien compris. Dans cette thèse, nous avons étudié la localisation nucléaire et les rôles potentiels du HCAR1 et nous avons découvert que ce récepteur est localisé à la membrane nucléaire et à l'intérieur du noyau, en plus de sa localisation à la membrane plasmique. Le HCAR1 nucléaire (N-HCAR1) est capable d'induire une signalisation intranucléaire basée sur la localisation pour induire la phosphorylation de ERK et d’AKT dans le noyau. En utilisant des approches protéomiques et génomiques, nous avons découvert que N-HCAR1 est impliqué dans plusieurs fonctions non réceptrices régulant différents processus à travers ses interactomes nucléaires. Ce regroupement nucléaire de HCAR1, en fonction de ses facteurs de liaison, favorise la traduction des protéines, la biogenèse ribosomale et la réparation des dommages à l'ADN. De manière intéressante, N-HCAR1 interagit également avec des facteurs de remodelage de la chromatine et régule directement l'expression des gènes d'après notre séquençage ChIP à l'échelle du génome. Nous avons également effectué un séquençage de l’ARN et les résultats montrent que N-HCAR1 régule l'expression d'un réseau de gènes plus large que son homologue de la membrane plasmique. Notamment, l'exclusion nucléaire de HCAR1 s'est avérée avoir le même effet que son knockdown complet sur la croissance tumorale et les métastases in vivo. Nos données révèlent une signalisation basée sur la localisation et des fonctions non canoniques pour un RCPG dans le noyau par lesquelles HCAR1 peut réguler différents processus cellulaires., G Protein-Coupled Receptors (GPCR) are a highly conserved protein family in eukaryotes through evolution and they are the largest receptor family. These receptors are virtually involved in every physiological processes, but their ability to regulate such a vast array of different biological processes is under intense investigation. Although classically considered a plasma membrane receptor, GPCRs are found in every intracellular membranous organelle and some of them are shown to have the capacity for signal transduction from those organelles. The signaling of a GPCR from these intracellular organelles is called location-biased signaling and this signaling could have a different functional output than the signaling events from the plasma membrane-localized receptor. Location-biased signaling is an emerging concept in the GPCR biology and can add an extra layer to the receptor function. On the other hand, with the detection of some GPCRs inside different organelles including the nucleus, a non-receptor functional modality for GPCRs could be postulated and could also account for the diverse roles of this family. However, this aspect is almost entirely unexplored. HCAR1 (GPR81), as a GPCR, is endogenously activated by lactate and has been shown to promote cancer malignancy via a higher level of glycolysis due to the Warburg effect, through different pathways. Its expression level is highly elevated in many cancers and negatively correlates with the patient’s prognosis. However, its mechanism of action is not well understood. In this thesis, we investigated the nuclear localization and potential roles of HCAR1 therein and we found this receptor is localized to the nuclear membrane and inside the nucleus, besides its plasma membrane localization. The Nuclear HCAR1 (N-HCAR1) is capable of inducing location-biased signaling intranuclearly to induce nuclear-ERK and AKT phosphorylation. Using proteomics and genomics approaches, we discovered that N-HCAR1 is involved in several different non-receptor functions regulating different processes through its nuclear interactomes. This nuclear pool of HCAR1, depending on its binding factors, promotes protein translation, ribosomal biogenesis, and DNA-damage repair. Interestingly, N-HCAR1 also interacts with chromatin remodeling factors and directly regulates gene expression based on our genome-wide ChIP-sequencing. We also performed RNA-seq, and the results show N-HCAR1 regulates the expression of a broader gene network than its plasma membrane counterpart. Notably, nuclear exclusion of HCAR1 proved to have the same effect as its complete knockdown on tumor growth and metastasis in vivo. Our data reveal location-biased signaling and non-canonical functions for a GPCR in the nucleus by which HCAR1 can regulate different cellular processes.

The dopamine receptor type 2 (D2R) is a G protein-coupled receptor (GPCR) specifically expressed in the central nervous system where it is largely involved in the control of several brain functions, including motivation, cognition or motor activity. Deregulations of the signaling pathways mediated by this receptor seem to be involved in the development of several psychiatric disorders such as depression, bipolar disorders, or schizophrenia. Despite their diversity, these disorders are accompanied by imbalances in lipid metabolism leading to a significant decrease in polyunsaturated fatty acid (PUFAs) levels. Although several clinical studies have reported the therapeutic potential of PUFAs supplementation for the reduction or prevention of certain psychiatric symptoms, the role of PUFAs in the alteration of dopaminergic transmission and the genesis of certain psychiatric diseases remains unknown. Thus, the hypothesis of this work is that PUFAs content in neuronal membranes expressing the D2R could influence the mechanisms of neurotransmission via a direct action on the pharmacology, the intracellular signaling, and the internalization of this receptor. In this context, the objective of this project was to evaluate the impact of membrane PUFAs on D2R internalization pathway. To unravel this, the receptor as well as all the proteins necessary to allow its internalization pathway have been expressed in mammalian cell system whose membrane PUFA composition has been enriched in a controlled manner. Lipidomic analysis confirmed the increase of PUFA content in total membranes of enriched cells. Then, Raman micro-spectroscopy was applied to determine the cellular distribution of exogenous fatty acid. Complementary techniques, confocal microscopy and time-resolved energy transfer, revealed a correlation between the membrane unsaturation level and D2R internalization efficacy. Interestingly, this correlation was not observed for another GPCR, the β2-adrenergic receptor, or by modulating the level of membrane saturated fatty acids (SFAs). Finally, TIRF microscopy was used to elucidate the impact of membrane lipid polyunsaturation on D2R membrane trafficking and β-arrestin recruitment, crucial for the initiation of D2R internalization. This study revealed a significant alteration in β-arrestin recruitment suggesting a causal link between membrane PUFAs level, β-arrestin recruitment, and D2R internalization. Thus, our data hold great promise for identifying the role of PUFAs in the genesis of psychiatric diseases., Le récepteur dopaminergique de type D2 (RD2) est un récepteur couplé à une protéine G (RCPG) majoritairement exprimé au niveau du système nerveux central où il est largement impliqué dans le contrôle de plusieurs fonctions cérébrales, dont la motivation, la cognition et la motricité fine. Des dérégulations des voies de signalisation médiées par le RD2 semblent être impliquées dans le développement de plusieurs pathologies psychiatriques telles que la dépression, les troubles bipolaires ou la schizophrénie. Bien que très différents, ces troubles ont notamment en commun une altération du métabolisme lipidique entrainant une diminution significative des taux en acides gras polyinsaturés (AGPI). Malgré le fait que plusieurs études cliniques ont rapporté le potentiel thérapeutique d’une supplémentation en AGPI pour la réduction voire la prévention de certains symptômes psychiatriques, le rôle des AGPI dans l’altération de la transmission dopaminergique et dans la genèse de certaines maladies psychiatriques demeure inconnu. Ainsi, l’hypothèse émise par notre équipe est que la composition en AGPI des membranes neuronales exprimant le RD2 pourrait influer sur les mécanismes de neurotransmission via une action directe sur la pharmacologie, la signalisation intracellulaire ainsi que l’internalisation de ce récepteur. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet de thèse était d’évaluer l’impact des AGPI membranaires sur la voie d’internalisation du RD2. Ceci a été étudié par une approche in cellulo basée sur l’utilisation d’un système cellulaire, enrichi en AGPI d’intérêt, exprimant le RD2 humain ainsi que toutes les protéines nécessaires pour mimer sa voie d’internalisation. La réalisation d’analyses lipidomiques nous a permis, dans un premier temps, de nous assurer de l’augmentation de la teneur en AGPI dans les membranes totales des cellules enrichies. Ensuite, l’imagerie Raman a permis d’identifier la distribution cellulaire des acides gras d’intérêt. L’utilisation de cette approche cellulaire ainsi que des techniques complémentaires, la microscopie confocale et le transfert d’énergie en temps résolu, a révélé une corrélation entre le taux d’insaturation membranaire et la voie d’internalisation du RD2. D’une manière intéressante, cette corrélation n’était pas observable pour un autre RCPG de la même classe, le récepteur β2-adrénergique, ou en modulant le taux des acides gras saturés (AGS) membranaires. Dans un dernier temps, la microscopie TIRF a été utilisée pour élucider l’impact de l’enrichissement membranaire en AGPI sur le trafic membranaire du RD2 ainsi que sur le recrutement membranaire d’une protéine cytosolique, la β-arrestine, indispensable pour l’initiation de l’internalisation du RD2. Cette étude a mis en évidence une altération significative au niveau du recrutement de cette protéine cytosolique. Ainsi, cette observation suggère l’existence d’un lien causal entre le taux d’insaturation membranaire, le recrutement de la β-arrestine et l’internalisation du RD2. Nos données sont très prometteuses pour l’identification du rôle des AGPI dans la genèse des maladies psychiatriques.

Type 2 diabetes (T2D) is a chronic metabolic disorder that includes monogenic forms (e.g. MODY and neonatal diabetes), in which a single mutation in only one gene is sufficient to cause the disease, and polygenic forms, in which the disease is caused by an interaction between multiple genetic and environmental factors, corresponding to the majority of cases. Whereas the investigation of the genetic etiology of monogenic forms has enabled the identification of many rare genetic variants involved in this disorder, the investigation of the polygenic forms (mainly through genome-wide association studies [GWAS]) led to the identification of frequent variants that are located in non-coding regions of the genome, and presenting with a small effect size on the disease risk, weakly explaining the heritability of the pathology. Rare variants, located in coding regions of some genes, could be associated with common T2D with a stronger effect size.By Next Generation Sequencing (NGS) performed in the context of the RaDiO project, 31 rare variants and 3 frequent variants that are heterozygous have been identified in the coding regions of the OPRD1 gene, encoding the δ opioid receptor (DOP) in a cohort of 6,971 individuals. Moreover, 105 rare heterozygous variants of the GLIS3 gene, that is a key regulator in the pancreatic β cell involved in the development of neonatal diabetes, have been identified in a cohort of 5,471 individuals.By investigating the genetic variants of OPRD1 through luciferase assays following DOP activation by the 2 DOP agonists deltorphin II and DPDPE, 7 gain-of-function (GoF) (among them the variant I52V that is frequent in the African population) and 12 rare loss-of-function (LoF) variants have been identified. In parallel, western blotting and immunofluorescence experiments showed that the rare LoF variants P14R and G36E decrease the expression and the localization of DOP, that is not located at the membrane like the wild-type DOP but retained inside the cells. Association studies performed between the clusters of rare GoF and LoF variants and various metabolic traits associated with T2D, followed by a replication in 34,812 individuals from the Accelerated Medicine Partnership T2D Knowledge Portal and 187,242 individuals from the UK Biobank highlighted opposite effects of these variants : whereas GoF variants are associated with an increase in T2D risk but with a decrease in adiposity, LoF variants are associated with a decreased T2D risk, but an increased adiposity.Finally, as OPRD1 is expressed in human pancreatic β cells, we studied its effect on insulin secretion. The stimulation of EndoCβH1 cells (that are a model of human β cell) overexpressing OPRD1 with glucose, coupled with the DOP agonist deltorphin II, inhibits insulin secretion from β cells.The investigation of rare heterozygous variants of GLIS3 through luciferase assays enabled the identification of 49 LoF variants. 18 of them have been defined as pathogenic or likely pathogenic following the application of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Association studies conducted between this cluster of 18 variants and T2D in the individuals from the RaDiO study showed that these variants are associated with an increased risk to develop T2D.By combining NGS and functional genetic experiments, 2 new genes carrying rare GoF or LoF variants have been found to be associated with common T2D during my thesis: OPRD1, presenting with opposite effects on T2D risk and adiposity and inhibiting insulin secretion, and GLIS3, that is associated with common T2D in addition to be involved in neonatal diabetes. The identification of new genes associated with common forms of T2D following this strategy would lead to a better understanding of its heritability, but could also contribute to the development of precision medicine by adapting the treatment depending of the genes that are altered., Le DT2 est une maladie métabolique chronique incluant des formes monogéniques (MODY et diabète néonatal), dans lesquelles l’atteinte d’un seul gène est suffisante pour provoquer la maladie, et polygéniques, provoquées par la combinaison de plusieurs facteurs génétiques et environnementaux, et correspondant à la majorité des cas. Alors que l’investigation de l’étiologie génétique du DT2 monogénique a permis d’identifier plusieurs variants rares impliqués dans son développement, l’investigation du DT2 polygénique, principalement par études d’association pangénomiques (GWAS), a permis d’identifier surtout des variants fréquents situés dans des régions non-codantes du génome et n’ayant qu’un faible impact sur le risque de développer la maladie, expliquant faiblement son héritabilité. Des variants rares présents dans les régions codantes de certains gènes pourraient être associés au DT2 commun avec un effet plus important.Par séquençage de nouvelle génération (NGS) mené dans le cadre du projet RaDiO, 31 variants rares et 3 variants fréquents hétérozygotes du gène OPRD1, codant le récepteur δ aux opioïdes (DOP), ont été identifiés chez 6971 individus. En parallèle, 105 variants rares hétérozygotes du gène GLIS3, un facteur de transcription jouant un rôle majeur dans la cellule β pancréatique et impliqué dans développement du diabète néonatal, ont été identifiés chez 5471 individus.L’investigation des variants du gène OPRD1 par luciférase, suite à leur stimulation avec les agonistes de DOP deltorphin II et DPDPE, a permis d’identifier 7 variants gain de fonction (GoF), comprenant le variant I52V fréquent chez les Africains, ainsi que 12 variants rares perte de fonction (LoF). En parallèle, des expériences de western blot et d’immunofluorescence ont démontré que les variants LoF P14R et G36E altèrent l’expression et la localisation du récepteur DOP, qui n’est plus situé à la membrane mais est retenu dans la cellule. Des études d’association réalisées entre les clusters de variants rares GoF et LoF et différents traits métaboliques associés au DT2 chez les 6971 individus issus de l’étude RaDiO, puis répliquées chez 34 812 individus de l’Accelerated Medicine Partnership T2D Knowledge Portal et 187 242 individus de la UK Biobank ont mis en évidence des effets opposés de ces variants : alors que les variants GoF sont associés à une augmentation du risque de DT2 mais à une diminution de l’adiposité, les variants LoF sont associés à une diminution du risque de DT2 mais une augmentation de l’adiposité. Finalement, étant donné qu’OPRD1 est exprimé dans les cellules β pancréatiques humaines, son effet sur la sécrétion d’insuline a été étudié : la stimulation de cellules β humaines EndoCβH1 surexprimant OPRD1 avec du glucose, couplé à l’agoniste de DOP deltorphin II, inhibe la sécrétion d’insuline par les cellules β.L’investigation des variants rares du gène GLIS3 par luciférase a permis d’identifier 49 variants LoF. 18 d’entre eux ont été définis comme pathogènes ou probablement pathogènes selon les critères de l’American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Les études d’association réalisées au sein de la cohorte issue de l’étude RaDiO ont mis en évidence une association entre ce cluster de variants et une augmentation du risque de DT2.La combinaison du séquençage NGS et de la génétique fonctionnelle a ainsi permis d’identifier 2 nouveaux gènes porteurs de variants GoF ou LoF associés au DT2 polygénique : le gène OPRD1 qui présente des effets opposés sur le DT2 et l’adiposité et inhibe la sécrétion d’insuline, et le gène GLIS3 qui en plus d’être associé au diabète néonatal est également associé au DT2 polygénique. Nous supposons que l’identification de nouveaux gènes associés au DT2 polygénique selon cette stratégie permettrait d’approfondir la compréhension de l’héritabilité de cette maladie, mais également d’évoluer vers une médecine de précision par adaptation du traitement des patients en fonction des gènes atteints.

Type 2 diabetes (T2D) is a chronic metabolic disorder that includes monogenic forms (e.g. MODY and neonatal diabetes), in which a single mutation in only one gene is sufficient to cause the disease, and polygenic forms, in which the disease is caused by an interaction between multiple genetic and environmental factors, corresponding to the majority of cases. Whereas the investigation of the genetic etiology of monogenic forms has enabled the identification of many rare genetic variants involved in this disorder, the investigation of the polygenic forms (mainly through genome-wide association studies [GWAS]) led to the identification of frequent variants that are located in non-coding regions of the genome, and presenting with a small effect size on the disease risk, weakly explaining the heritability of the pathology. Rare variants, located in coding regions of some genes, could be associated with common T2D with a stronger effect size.By Next Generation Sequencing (NGS) performed in the context of the RaDiO project, 31 rare variants and 3 frequent variants that are heterozygous have been identified in the coding regions of the OPRD1 gene, encoding the δ opioid receptor (DOP) in a cohort of 6,971 individuals. Moreover, 105 rare heterozygous variants of the GLIS3 gene, that is a key regulator in the pancreatic β cell involved in the development of neonatal diabetes, have been identified in a cohort of 5,471 individuals.By investigating the genetic variants of OPRD1 through luciferase assays following DOP activation by the 2 DOP agonists deltorphin II and DPDPE, 7 gain-of-function (GoF) (among them the variant I52V that is frequent in the African population) and 12 rare loss-of-function (LoF) variants have been identified. In parallel, western blotting and immunofluorescence experiments showed that the rare LoF variants P14R and G36E decrease the expression and the localization of DOP, that is not located at the membrane like the wild-type DOP but retained inside the cells. Association studies performed between the clusters of rare GoF and LoF variants and various metabolic traits associated with T2D, followed by a replication in 34,812 individuals from the Accelerated Medicine Partnership T2D Knowledge Portal and 187,242 individuals from the UK Biobank highlighted opposite effects of these variants : whereas GoF variants are associated with an increase in T2D risk but with a decrease in adiposity, LoF variants are associated with a decreased T2D risk, but an increased adiposity.Finally, as OPRD1 is expressed in human pancreatic β cells, we studied its effect on insulin secretion. The stimulation of EndoCβH1 cells (that are a model of human β cell) overexpressing OPRD1 with glucose, coupled with the DOP agonist deltorphin II, inhibits insulin secretion from β cells.The investigation of rare heterozygous variants of GLIS3 through luciferase assays enabled the identification of 49 LoF variants. 18 of them have been defined as pathogenic or likely pathogenic following the application of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Association studies conducted between this cluster of 18 variants and T2D in the individuals from the RaDiO study showed that these variants are associated with an increased risk to develop T2D.By combining NGS and functional genetic experiments, 2 new genes carrying rare GoF or LoF variants have been found to be associated with common T2D during my thesis: OPRD1, presenting with opposite effects on T2D risk and adiposity and inhibiting insulin secretion, and GLIS3, that is associated with common T2D in addition to be involved in neonatal diabetes. The identification of new genes associated with common forms of T2D following this strategy would lead to a better understanding of its heritability, but could also contribute to the development of precision medicine by adapting the treatment depending of the genes that are altered., Le DT2 est une maladie métabolique chronique incluant des formes monogéniques (MODY et diabète néonatal), dans lesquelles l’atteinte d’un seul gène est suffisante pour provoquer la maladie, et polygéniques, provoquées par la combinaison de plusieurs facteurs génétiques et environnementaux, et correspondant à la majorité des cas. Alors que l’investigation de l’étiologie génétique du DT2 monogénique a permis d’identifier plusieurs variants rares impliqués dans son développement, l’investigation du DT2 polygénique, principalement par études d’association pangénomiques (GWAS), a permis d’identifier surtout des variants fréquents situés dans des régions non-codantes du génome et n’ayant qu’un faible impact sur le risque de développer la maladie, expliquant faiblement son héritabilité. Des variants rares présents dans les régions codantes de certains gènes pourraient être associés au DT2 commun avec un effet plus important.Par séquençage de nouvelle génération (NGS) mené dans le cadre du projet RaDiO, 31 variants rares et 3 variants fréquents hétérozygotes du gène OPRD1, codant le récepteur δ aux opioïdes (DOP), ont été identifiés chez 6971 individus. En parallèle, 105 variants rares hétérozygotes du gène GLIS3, un facteur de transcription jouant un rôle majeur dans la cellule β pancréatique et impliqué dans développement du diabète néonatal, ont été identifiés chez 5471 individus.L’investigation des variants du gène OPRD1 par luciférase, suite à leur stimulation avec les agonistes de DOP deltorphin II et DPDPE, a permis d’identifier 7 variants gain de fonction (GoF), comprenant le variant I52V fréquent chez les Africains, ainsi que 12 variants rares perte de fonction (LoF). En parallèle, des expériences de western blot et d’immunofluorescence ont démontré que les variants LoF P14R et G36E altèrent l’expression et la localisation du récepteur DOP, qui n’est plus situé à la membrane mais est retenu dans la cellule. Des études d’association réalisées entre les clusters de variants rares GoF et LoF et différents traits métaboliques associés au DT2 chez les 6971 individus issus de l’étude RaDiO, puis répliquées chez 34 812 individus de l’Accelerated Medicine Partnership T2D Knowledge Portal et 187 242 individus de la UK Biobank ont mis en évidence des effets opposés de ces variants : alors que les variants GoF sont associés à une augmentation du risque de DT2 mais à une diminution de l’adiposité, les variants LoF sont associés à une diminution du risque de DT2 mais une augmentation de l’adiposité. Finalement, étant donné qu’OPRD1 est exprimé dans les cellules β pancréatiques humaines, son effet sur la sécrétion d’insuline a été étudié : la stimulation de cellules β humaines EndoCβH1 surexprimant OPRD1 avec du glucose, couplé à l’agoniste de DOP deltorphin II, inhibe la sécrétion d’insuline par les cellules β.L’investigation des variants rares du gène GLIS3 par luciférase a permis d’identifier 49 variants LoF. 18 d’entre eux ont été définis comme pathogènes ou probablement pathogènes selon les critères de l’American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Les études d’association réalisées au sein de la cohorte issue de l’étude RaDiO ont mis en évidence une association entre ce cluster de variants et une augmentation du risque de DT2.La combinaison du séquençage NGS et de la génétique fonctionnelle a ainsi permis d’identifier 2 nouveaux gènes porteurs de variants GoF ou LoF associés au DT2 polygénique : le gène OPRD1 qui présente des effets opposés sur le DT2 et l’adiposité et inhibe la sécrétion d’insuline, et le gène GLIS3 qui en plus d’être associé au diabète néonatal est également associé au DT2 polygénique. Nous supposons que l’identification de nouveaux gènes associés au DT2 polygénique selon cette stratégie permettrait d’approfondir la compréhension de l’héritabilité de cette maladie, mais également d’évoluer vers une médecine de précision par adaptation du traitement des patients en fonction des gènes atteints.

La migration cellulaire est un mécanisme important pour divers processus cellulaires tels que l’embryogenèse et la cicatrisation. De même, elle participe à des processus pathologiques notamment l’invasion des cellules malignes et la formation des métastases cancéreux. La dissémination métastatique est un processus très compliqué. L’acquisition du pouvoir migratoire invasif par la cellule maligne ainsi que son potentiel métastatique est gérée par le cytosquelette qui est dynamiquement modifié et contrôlé par des voies de signalisation intracellulaires. Cependant, la physiologie des cellules métastatiques et les cascades de signalisation qui les poussent à métastaser ne sont toujours pas comprises. Les protéines Ezrine, Radixine et Moésine (ERMs) jouent un rôle important dans l’organisation du cytosquelette au cortex cellulaire et elles sont des déterminantes clés de la migration cellulaire. Ainsi, une dérégulation à ce niveau peut conduire à une migration cellulaire aberrante. D’où l’implication des ERMs dans différents cancers agressifs et invasifs. Les ERMs sont régulées en aval de plusieurs acteurs cellulaires notamment les récepteurs membranaires. Plusieurs études ont rapporté que le récepteur au thromboxane A2 (RTXA2), un récepteur couplé à la protéine G (RCPG) favorise les métastases. Il a été décrit surtout dans le cadre de cancer du sein triple négatif (CSTN), l’un des cancers les plus mortels chez la femme. Les RCPG possèdent un rôle central dans presque toutes les fonctions physiologiques et constituent la plus grande famille des cibles médicamenteuses. D’une manière intéressante, les deux laboratoires de Dr Sébastien Carréno et Dr Michel Bouvier, ont découvert que le RTXA2 active les protéines ERMs à travers la GTPase RhoA. Dans ce projet de recherche on a identifié une nouvelle voie de signalisation liant le RTXA2 aux ERMs à travers la GTPase RhoA et la kinase SLK. Cette voie est impliquée dans la migration des cellules de cancer du sein triple négatif. Ainsi, on a pu démontrer que la moésine et la kinase SLK agissaient en aval du récepteur étudié pour favoriser la vitesse et la directionnalité de la migration des cellules de CSTN. 6 On a montré que la migration cellulaire dirigée en aval du RTXA2 est due à une polarité de la moésine au front de la migration. On a constaté aussi que la moésine est responsable d’une polarité des filaments d’actine au front de la migration suite à une activation du récepteur. Ce travail a mis en évidence une nouvelle cascade de signalisation importante pour la migration des cellules cancéreuses agressives triples négatives du sein ce que pourrait être une nouvelle cible des thérapies anti-métastatiques., Cell migration is an important mechanism for various cellular processes such as embryogenesis and cicatrization. Likewise, it controls pathological processes including the invasion of malignant cells and the formation of metastases. Metastasis is a very complicated process. The acquisition of invasive migratory power by a malignant cell as well as its metastatic potential is regulated by the cytoskeleton which is dynamically modified and controlled by intracellular signaling pathways. However, metastatic cells physiology and the cascades causing their metastases are not clear yet. Ezrin, Radixin and Moesin (ERMs) proteins have an important role in organizing the cytoskeleton at the cell cortex and they are key determinants of cell motility. Thus, a deregulation at this point may lead to an aberrant cell migration. Hence, the involvement of ERMs in various aggressive and invasive cancers. ERMs are regulated downstream of several cellular actors in particular membrane receptors. Several studies have reported that the thromboxane A2 receptor (TXA2R), a G protein coupled receptor (GPCR) promotes metastasis. It has been described especially in the context of triple negative breast cancer (TNBC), one of the deadliest cancers in women. GPCR have a central role in almost all physiological functions and constitute the largest family of drug targets. Interestingly, the two laboratories of Dr Sébastien Carréno and Dr Michel Bouvier, have discovered that the TXA2R activates ERM proteins through the GTPase RhoA. In this research project, we have identified a new signaling pathway linking the TXA2 receptor to ERMs via RhoA and the kinase SLK. This pathway is involved in the migration of triple negative breast cancer cells. Thus, we demonstrated that moesin and SLK acted downstream of the receptor to promote the speed and directionality of TNBC cells migration. We discovered that the directed cell migration downstream of TXA2R is due to a polarization of moesin at the leading edge. We also observed that moesin is responsible for actin filaments polarity at the leading edge following an activation of the receptor. So, this work has revealed a new signaling cascade important for the migration of aggressive triple negative breast cancer cells which could be a new target for anti-metastatic therapies.

Smell and taste perception consists in a chemical stimulation of transmembrane receptors lying on the surface of sensory cells located in the nasal or oral cavity. The receptors involved in olfaction and the perception of bitter, sweet and umami taste all belong to the well-studied G protein-coupled receptors (GPCR) family, yet to date their exact tridimensional structure still eludes us. In this thesis, I study the molecular structures at the frontline of chemosensory perception, namely receptors and their ligands, through a computational lens. To begin with, I expose how quantitative structure-activity relationships (QSAR) lead us to the discovery of natural semiochemicals that effectively disrupt the destructive behavior of a pest to crop plants, Spodoptera littoralis, by targeting its olfactory receptors. I then apply a similar machine learning strategy to develop an online predictive platform that estimates the relative sweetness of molecules based on their structure, resulting in the discovery of a novel sweet-tasting lignan scaffold. Finally, I make use of molecular modeling and available mutagenesis data to provide relevant three-dimensional models of bitter taste receptors, and predict molecular switches involved in ligand-sensing and receptor activation. Besides, I design a Python library that encodes interactions in molecular complexes as fingerprints for an efficient analysis of molecular dynamics trajectories, docking results and experimental structures, and showcase it on a variety of scenarios involving GPCRs. Overall, this thesis illustrates the implementation of computational strategies to gain knowledge on chemosensory perception, from taste to olfaction, at the molecular level., La perception olfactive et gustative provient d’une stimulation de nature chimique des récepteurs transmembranaires émergeants de la surface de cellules sensorielles situées dans la cavité nasale ou orale. Les récepteurs impliqués dans la perception des odeurs et des goûts amer, sucré et umami appartiennent à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Malgré une connaissance approfondie de cette famille, une définition précise de la structure tridimensionnelle des RCPG chimiosensoriels nous échappe encore à ce jour. Dans cette thèse, je mets en lumière les structures moléculaires en première ligne de la perception chimiosensorielle, à savoir les récepteurs et leurs ligands, au travers d’un microscope computationnel. Dans un premier temps, je mets en avant un cas concret d’utilisation des relations quantitatives structure à activité (QSAR) par la découverte de composés sémiochimiques naturels interférant avec le comportement destructeur d’un insecte ravageur de cultures agricoles, Spodoptera littoralis, en ciblant ses récepteurs olfactifs. Par la suite, en me basant sur une méthode d’apprentissage automatique similaire, je conçois une plateforme en ligne permettant la prédiction du pouvoir sucrant de molécules en se basant sur leur structure, ce qui nous a permis de révéler un composé sucré innovant de la famille des lignanes. Pour finir, grâce aux outils de modélisation moléculaire et aux données de mutagénèse dirigée, je construits des modèles 3D de récepteurs au goût amer afin de prédire les interrupteurs moléculaires impliqués dans la détection des ligands et l’activation de ces récepteurs. En parallèle, je développe une librairie Python qui encode les interactions de complexes moléculaires sous forme d’empreinte numérique afin d’analyser des trajectoires de dynamique moléculaire, des structures issues d’amarrage moléculaire, ou des structures expérimentales, et je mets en valeur ce logiciel dans une multitude de scenarios impliquant des RCPG. Dans l’ensemble, ces travaux de thèse illustrent la mise en œuvre de méthodes numériques pour extraire des informations sur la perception chimiosensorielle, qu’elle soit olfactive ou gustative, à l’échelle moléculaire.

The arginine-vasopressin (AVP) V2 receptor (V2R) is a G protein-coupled receptor that controls body water homeostasis. It is involved in many water balance and urine disorders. Point mutations of its gene are directly responsible for two rare genetic diseases. As such, it is a key therapeutic target. Despite important progress in understanding the molecular basis of its function, it remained for a long time refractory to structure determination. This work is thus focused on the determination of the three-dimensional (3D) V2R structure in complex with its canonical signaling partners Gs protein or βarrestin1 (βarr1) by cryo-electron microscopy (Cryo-EM). The comparison of the two active states of the V2R at an atomic level is an important step toward the understanding of the molecular mechanisms involved in its activity.We first successfully determined the AVP-V2R-Gs complex structure by using a combination of Cryo-EM, experimental NMR, and molecular dynamic simulations. This structural biology hybrid approach allowed to solve molecular details of AVP binding to V2R and of the interface of the receptor with the Gs protein signaling partner. The structure is in agreement with molecular pharmacology data accumulated over 20 years. The binding pocket is a deep cleft in the center of the seven-helix bundle. The bottom of the orthosteric crevice is mainly composed of hydrophobic residues while the entrance is more hydrophilic. The active V2R displays hallmarks of receptor activation such as a large outward movement of the transmembrane domain (TM)6 an inward movement of the TM7 and a break of the Ionic lock involving helices TM3 and TM6 (D/ERY motif). The coupling between the receptor and its Gs signaling partner is significantly tighter compared to what is observed for other class A GPCRs and interestingly, strongly dynamic, allowing us to characterize three conformational sub-states. This study goes further than a simple description of a receptor or a signaling protein complex structure. Indeed, 3D models were interpreted to understand the structural consequences of V2R mutations responsible for two rare genetic diseases. Congenital Nephrogenic Diabetes Insipidus (cNDI) is associated with V2R loss-of-function mutations whereas Nephrogenic Syndrome of Inappropriate antidiuresis (NSIAD) is associated with V2R constitutively active mutations., Le récepteur V2 (V2R) de l'arginine-vasopressine (AVP) est un récepteur couplé aux protéines G qui contrôle l'homéostasie de l'eau corporelle. Elle est impliquée dans de nombreux troubles de l'équilibre hydrique et des urines. Des mutations ponctuelles de son gène sont directement responsables de deux maladies génétiques rares. À ce titre, il s'agit d'une cible thérapeutique clé. Malgré d'importants progrès dans la compréhension des bases moléculaires de sa fonction, il est resté longtemps réfractaire à la détermination structurale. Ce travail est ainsi focalisé sur la détermination de la structure tridimensionnelle (3D) V2R en complexe avec ses partenaires de signalisation canoniques la protéine Gs ou βarrestin1 (βarr1) par cryo-microscopie électronique (Cryo-ME). La comparaison des deux états actifs du V2R au niveau atomique est une étape importante vers la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans son activité. Nous avons d'abord déterminé avec succès la structure complexe AVP-V2R-Gs en utilisant une combinaison de cryo-EM, de RMN expérimentale et de simulations de dynamique moléculaire. Cette approche hybride de biologie structurale a permis de résoudre les détails moléculaires de la liaison de l'AVP au V2R et de l'interface du récepteur avec le partenaire de signalisation de la protéine Gs. La structure est en accord avec les données de pharmacologie moléculaire accumulées sur 20 ans. La poche de liaison est une cavité au centre des sept hélices transmembranaires du V2R. Le fond de la poche de liaison orthostérique est principalement composé de résidus hydrophobes tandis que l'entrée est plus hydrophile. Le V2R actif présente des caractéristiques d'activation des récepteurs telles qu'un mouvement important du domaine transmembranaire (TM)6 vers l'extérieur , un mouvement vers l'intérieur du TM7 et une rupture du verrou ionique impliquant les hélices TM3 et TM6 (motif D/ERY). Le couplage entre le récepteur et son partenaire de signalisation Gs est significativement plus étroit que ce qui est observé pour d'autres GPCR de classe A et, fait intéressant, fortement dynamique, nous permettant de caractériser trois sous-états conformationnels. Cette étude va plus loin qu'une simple description d'une structure complexe de récepteur ou de protéine de signalisation. En effet, des modèles 3D ont été interprétés pour comprendre les conséquences structurelles des mutations du V2R responsables de deux maladies génétiques rares. Le diabète insipide néphrogénique congénital (DNIc) est associé à des mutations de perte de fonction V2R tandis que le syndrome néphrogénique d'antidiurèse inappropriée (SNAI) est associé à des mutations constitutivement actives de V2R.

Since its discovery in 1983, HIV-1 has been a major public health problem. Today, despite many effective treatments, the people infected are not cured, and the virus has still not been eradicated. To prevent the emergence of strains that are resistant to treatment or that are more aggressive in the progression of the disease, it is essential to understand the interactions of the virus with the cell it infects. Viral entry is therefore a key step in the viral cycle. It requires the recognition by the viral glycoprotein gp120 of the coreceptor, which is mainly CCR5. It is now established that HIV-1 exploits the diversity of receptor populations that exist on the surface of cells. The work presented in this thesis characterizes, at the atomic scale, the differences in conformations corresponding to the populations targeted by four different viruses. We used molecular dynamics to simulate the CCR5 coreceptor in complex with the gp120 variants. The trajectories analysis prompted us to the development of a new method, ATOLL, which is able to predict the functional properties of the ligand, here the variants of gp120, from the position of the intracellular tails of the transmembrane domains of a G-protein coupled receptor, here CCR5. We also observed that the CCR5 populations selected by the gp120 variants have specific intermolecular interaction patterns. In order to exploit these patterns for the identification by virtual screening of small molecules mimicking a given variant of gp120, we have developed a docking score method, named LID, which is able to take into account as a reference for the selection of poses the multiple structures issued by the simulations by molecular dynamics., Depuis sa découverte en 1983, Le VIH-1 constitue un problème de santé publique majeur. A ce jour, malgré de nombreux traitements efficaces, les personnes infectées ne peuvent pas guérir, et le virus n’est toujours pas éradiqué. Pour prévenir l’émergence de souches résistances aux traitement ou plus agressives dans la progression de la maladie, il est essentiel de comprendre les interactions du virus avec la cellule qu’il infecte. L’entrée virale est pour cela une étape clé du cycle viral, avec la reconnaissance par le glycoprotéine virale gp120 du corécepteur, majoritairement CCR5. Il est désormais établi que le VIH-1 exploite la diversité des populations de récepteurs à la surface des cellules. Les travaux présentés dans cette thèse caractérisent, à l’échelle atomique, les différences de conformations correspondant aux populations ciblées par quatre virus différents. Nous avons utilisé la dynamique moléculaire pour simuler la dynamique du corécepteur CCR5 lié aux variantes de la gp120. L’analyse des trajectoires a conduit au développement d’une nouvelle méthode, ATOLL, qui permet de prédire les propriétés fonctionnelles du ligand, ici les variantes de la gp120, à partir de la position de extrémités intracellulaires des domaines transmembranaire d’un récepteur couplé à une protéine G, ici le CCR5. Nous avons aussi réussi à distinguer les populations de CCR5 liées aux gp120 par des motifs d’interactions intermoléculaires spécifiques. Dans le but d’exploiter ces motifs pour l’identification par criblage virtuel des petites molécules capables d’imiter une variante donnée de la gp120, nous avons développé LID, une méthode de score de docking capable de prendre en compte les multiples structures issues des simulations par dynamique moléculaire comme référence pour la sélection de poses.

G protein-coupled receptors (GPCRs) are central actors of cell signaling. They are the target of one third of the current cellular drugs. Thus, it is crucial to understand the molecular mechanism behind G-protein dependent and independent signaling pathways. G-protein independent cell signaling is mediated by the interaction of the cytoplasmic C-termini of GPCRs with arrestin. These C-termini are intrinsically disordered regions (IDRs) and are variable in length and sequence, making their study more elusive. This interaction is regulated by the phosphorylation of GPCR C-terminal domains by specific GPCR kinases (GRKs). My thesis objectives aimed at understanding the impact of GRK phosphorylation on the conformation and the interaction of GPCR C-termini with their arrestin partner. The strategy implemented was to produce excised recombinant C-terminal domain of three well-studied GPCRs: vasopressin V2 (V2R), growth hormone secretagogue 1a (GHSR) and β2-adrenergic (β2AR) receptors. Phosphorylation by GRK2, as well as, the use of phosphomimetic variants of these GPCR C-terminal domains allowed us to study the impact of phosphorylation on their conformation and interaction with arrestin-2. Structural and functional analyses of these disordered regions were performed using complementary biophysical methods such as solution-state nuclear magnetic resonance (NMR), small angle X-ray scattering (SAXS) and fluorescence spectroscopy (FRET). My thesis work postulates for a new picture of GPCR signaling dependent of arrestine. It shows that phosphorylation by GRKs changes the conformation of the C-terminal domain of GPCRs and modulates the binding region of these domains with arrestin., Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) sont des acteurs importants de la signalisation cellulaire et représentent, à ce titre, la cible d’un tiers des médicaments mis sur le marché. Il est donc fondamental de mieux comprendre les mécanismes moléculaires associés à leurs signalisations dépendante et indépendante des protéines G. La signalisation indépendante des protéines G est médiée par l’interaction des régions C-terminales des RCPGs avec les protéines arrestines. Cependant, ces régions sont intrinsèquement désordonnées (IDR) et variables en longeur et en séquence, rendant leur étude difficile. Cette interaction fonctionnelle est modulée par la phosphorylation des domaines C-terminaux des RCPGs par des kinases spécifiques (GRKs). Cette thèse a pour objectifs de comprendre l’impact de la phosphorylation par les GRKs sur la conformation des domaines C-terminaux des RCPGs et leur interaction avec leur partenaire physiologique arrestine. La stratégie mise en place a consisté à produire des protéines recombinantes des domaines C-terminaux, sous forme isolées et solubles, de trois RCPGs (RCPG-Cter) de la classe A : les récepteurs vasopressine V2 (V2R-Cter), ghréline (GHSR-Cter) et β2-adrénergique (β2AR-Cter). La phosphorylation par GRK2 ainsi que l’utilisation de variants phosphomimétiques de ces domaines C-terminaux a permis d’étudier l’impact de la phosphorylation sur leur conformation et leur interaction avec l’arrestine-2. Les analyses structurale et fonctionnelle de ces régions désordonnées ont été effectuées par l’utilisation de méthodes biophysiques complémentaires comme la résonance magnétique nucléaire (RMN), la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) et la spectroscopie de fluorescence (FRET). Mes travaux de thèse contribuent à une nouvelle image de la signalisation des RCPGs dépendante de l’arrestine. Ils montrent que la phosphorylation par les GRKs modifie la conformation des domaines C-terminaux des RCPGs et module la région d’interaction de ces domaines avec l’arrestine.

Melanocortin 4 receptor (MC4R) is a therapeutic target for the treatment of energy homeostasis disorders. No effective treatment is currently available on the market. In this context, screening of a synthetic toxin bank resulted in 286 hits. In light of this exceptional figure, five of the most original sequences have been selected and pharmacologically characterized. N-TRTX-Preg1a from the spider Poecilotheria regalis and N-BUTX-Ptr1a from the scorpion Parabuthus transvaalicus are the first toxins agonist of the melanocortin 1 receptor (MC1R). This receptor stimulates skin pigmentation and plays a key role in preventing melanoma. Each forms a new group within its family, respectively knottin and CSαβ toxins. The study of N-CTX-Can1a and N-CTX-Mil1a, two conotoxins, was discontinued due to the complexity of their synthesis and their low affinity for MC4R. N-CTX-Ltg1a, from the cone snail Conus lithoglyphus, is a very promising toxin. It is not linked to any known toxin family and exhibits nanomolar affinity on MC4R. With four cysteines, the toxin can be oxidized into three different forms, making its study complex. We gradually simplified it to a linear peptide that is easy to produce and 3-fold more potent on MC4R than the original toxin with a 3-13-fold selectivity compared to other MCRs. Hunger-Toxin (HT1-0) antagonizes the activation of the signaling pathways Gs, G15 and β-arrestin 2 of MC4R. Structure-activity relationship studies have identified important areas in the interaction with MC4R and will be used for future peptide optimization. In the near future, the in vivo confirmation of the anorexigenic effect could thus pave the way for a new treatment of cachexia.; Le sous-type 4 des récepteurs aux mélanocortines (MC4R) est une cible thérapeutique pour le traitement des troubles de l’homéostasie énergétique. Aucun traitement efficace n’est pour l’instant sur le marché. Dans ce contexte, une banque de toxines animales synthétiques a été criblée, aboutissant à 286 hits. Au vue de ce chiffre exceptionnel, cinq des toxines les plus originales au niveau séquence ont été sélectionnées et caractérisées pharmacologiquement. N-TRTX-Preg1a de l’araignée Poecilotheria regalis et N-BUTX-Ptr1a du scorpion Parabuthus transvaalicus sont les premières toxines agonistes du sous-type 1 des récepteurs aux mélanocortines (MC1R). Ce récepteur stimule la pigmentation de la peau et joue un rôle clé dans la prévention du mélanome. Les deux toxines forment chacune un nouveau groupe au sein de leur famille de toxines, respectivement les knottin et les toxines CSαβ. L’étude des conotoxines N-CTX-Can1a et N-CTX-Mil1a, a été abandonnée du fait de la complexité de leur synthèse et de leur faible affinité. N-CTX-Ltg1a, issue du cône Conus lithoglyphus, est une toxine prometteuse. Sa séquence ne ressemble à aucune famille connue de toxine et elle présente une affinité nanomolaire sur MC4R. Avec 4 cystéines, elle peut être oxydée de trois façons différentes, rendant son étude complexe. Nous avons simplifié progressivement cette toxine pour aboutir à un peptide linéaire simple à produire et plus affin d’un facteur 3 que la toxine de départ avec une sélectivité d’un facteur 3 à 13 par rapport aux autres MCRs. La Hunger-Toxin (HT1-0) antagonise l’activation des voies de signalisation Gs, G15 et β-arrestine du MC4R. Des études de relation structure-activité ont permis de délimiter les zones importantes dans l’interaction avec MC4R et serviront à l’optimisation future du peptide. Prochainement, la confirmation in vivo de l’effet anorexigène pourrait ainsi ouvrir la voie vers un nouveau traitement de la cachexie.

Sweet, umami and bitter taste detectors are membrane receptors that belong to the family of G-protein coupled receptors (GPCRs). They are characterized by the existence of a hydrophobic transmembrane domain (TMD) and an activation mechanism that involves a heterotrimeric G protein.Human has 25 bitter taste receptors TAS2R. These receptors belong to class A GPCRs. Their architecture consists of a TMD structured in 7 a-helix which form the orthosteric binding site of bitter molecules. The umami taste receptor is a heterodimer composed of the TAS1R1 and TAS1R3 subunits, while the TAS1R2 and TAS1R3 subunits form the sweet taste receptor. Each subunits belongs to the class C GPCRs and shares a common architecture, consisting of a large extracellular N-terminal domain (NTD) connected to the TMD by a cysteine-rich region (CRR). However, the relative contribution of each subunit to the heterodimeric receptors function remains largely unknown.Because of their amphipathic nature, GPCRs are extremely difficult to study from a biochemical point of view. Characterizing their interactions and determining their structures are important issues and a real challenge for the next years. In this work, we have developed different expression systems to understand molecular mechanisms that govern receptor-ligand interactions.For the study of umami taste, the TAS1R1 and TAS1R3 NTDs were produced in E. coli bacteria as inclusion bodies and then folded in vitro. By combining biochemical approaches and functional cell assays, we have shown that inosine-5'-monophosphate (IMP), an umami flavor enhancer, binds to TAS1R3-NTD and acts synergistically with sucralose and neotame.Regarding the sweet taste receptor, the subunit (full size) of TAS1R2 was overexpressed in a tetracycline inducible cell line HEK293S. Solubilization and purification protocol allows to obtain functional TAS1R2 receptor. Far-UV circular dichroism spectroscopy analysis revealed that TAS1R2 is well folded. Multiangle light scattering coupled with gel filtration showed that TAS1R2 was predominantly present in dimeric form. Interactions with sugar ligands measured by intrinsic fluorescence revealed micromolar range affinities in agreement with cellular assays and the sweetening powers of molecules.In parallel, to study bitter receptors, we designed different TAS2R14 receptor expression vectors in order to improve receptor expression and target to the plasma membrane. We showed that use of the QBI SP163 sequence upstream of the translational initiation codon, associated with the signal peptide of the rat somatostatin 3 in the N-terminal position and the FLAG tag in the C-terminal position, increase the functional response of the receptor to bitter ligands both in terms of amplitude and sensitivity. This plasmid construct represents a promising tool to help identify some orphaned TAS2R agonists.; Les détecteurs gustatifs aux saveurs sucré, umami et amer sont des récepteurs membranaires qui appartiennent à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Ils sont caractérisés par l’existence d’un domaine transmembranaire (DTM) hydrophobe et un mécanisme d’activation qui implique une protéine G hétérotrimérique.L’homme possède 25 récepteurs à l’amer TAS2R. Ces récepteurs appartiennent à la classe A des RCPG. Leur l’architecture est constituée d’un DTM structuré en 7 hélices a qui forment le site orthostérique de liaison des molécules amères. Le récepteur au goût umami est un hétérodimère composé des sous-unités TAS1R1 et TAS1R3, alors que les sous-unités TAS1R2 et TAS1R3 s’assemblent pour composer le récepteur au goût sucré. Chacune de ces sous-unités appartient à la classe C des RCPG et partage une architecture commune, constituée d’un domaine N-terminal (DNT) extracellulaire de grande taille qui est relié au DTM par une région riche en cystéines (RRC). La contribution de chaque sous-unité au fonctionnement des récepteurs hétérodimériques demeure cependant largement inconnue.A cause de leur nature amphipathique, les RCPG constituent une famille de protéines extrêmement difficiles à étudier d’un point de vue biochimique. Caractériser leurs interactions et déterminer leurs structures sont des enjeux importants et un véritable challenge pour les années à venir. Dans ce travail, nous avons développé différents systèmes d’expression afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui gouvernent les interactions récepteur-ligand.Pour l’étude du goût umami, les DNT de TAS1R1 et TAS1R3 ont été produits en bactérie E. coli sous forme de corps d’inclusions puis repliés in vitro. En combinant des approches biochimiques et des tests cellulaires d’activité fonctionnelle, nous avons montré que l’inosine-5’-monophosphate (IMP), un exhausteur du goût umami, se lie à TAS1R3-DNT et agit en synergie avec le sucralose et le néotame.Concernant le récepteur au goût sucré, la sous-unité (taille complète) de TAS1R2 a été surexprimée dans une lignée cellulaire HEK293S inductible par la tétracycline. Un protocole de solubilisation et de purification a permis d’obtenir le récepteur TAS1R2 fonctionnel. Une analyse par dichroïsme circulaire dans l’UV lointain a révélé que TAS1R2 est bien replié. La diffusion de lumière couplée à la gel filtration a montré que TAS1R2 était présent majoritairement sous forme dimérique. Les interactions avec les ligands sucrés mesurées par fluorescence intrinsèques ont révélé des affinités de l’ordre du micromolaire en accord avec les tests d’activité cellulaires et les pouvoirs sucrants des molécules.Parallèlement, afin d’étudier les récepteurs au goût amer, nous avons conçu différents vecteurs d’expression du récepteur TAS2R14 afin d’améliorer son expression et son adressage à la membrane plasmique. Nous avons montré que l’utilisation de la séquence QBI SP163 en amont du codon initiateur de traduction, associée au peptide signal de la somatostatine 3 de rat en position N-terminale et à l’étiquette FLAG en position C-terminale, permettait d’augmenter la réponse fonctionnelle du récepteur aux ligands amers aussi bien en termes d’amplitude que de sensibilité. Cette construction plasmidique représente un outil prometteur pour aider à identifiés certains agonistes des TAS2R orphelins.

G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest class of membrane proteins in the human genome. GPCRs act as cell surface signalling proteins and respond to a variety of external signals. They play a pivotal role in many physiological functions and are therefore associated with a multitude of diseases, including cardiovascular, metabolic, neurodegenerative, psychiatric, and oncologic diseases. The 2012 noble Prize in Chemistry was awarded jointly to Robert J. Lefkowitz and Brian K. Kobilka for studies of GPCRs, highlighting the importance of this protein superfamily. GPCRs constitute also the most important family of drug targets in the human body, with 30% of current drugs acting on GPCRs. However, drug discovery targeting GPCRs remains difficult, owing to the restricted structural information on GPCRs related to the instability of these proteins when isolated from their cell membrane environments. There is also a lack of knowledge for the structural and functional consequences of the interactions of small-molecule compounds with GPCR. The aim is to develop methods to study and characterize a full GPCR solubilized in detergents or in native lipid bilayers, both in its free form and in small molecule bound forms, using liquid-state NMR experiments. The aim is to develop NMR-based approaches that will strongly impact the structure-based drug discovery process for the GPCR family; Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs), constituent la plus grande famille de protéines membranaires dans le génome humain. Les RCPGs sont des protéines de signalisation, qui exercent leur action à la surface des cellules, en réponse à une grande variété de stimuli extérieurs. Ils jouent un rôle primordial dans de nombreuses fonctions physiologiques et sont donc impliqués dans une multitude de pathologies comme les maladies cardiovasculaires, métaboliques, neurodégénératives, psychiatriques et oncologiques. L'attribution du prix Nobel de chimie 2012 aux professeurs Robert Lefkowitz et Brian Kobilka pour leurs travaux et avancées spectaculaires dans le champ de recherches des RCPGs, souligne encore leur importance. Les RCPGs constituent également la plus importante cible thérapeutique, avec 30% des médicaments actuellement disponibles sur le marché qui exercent leur action via un RCPG. Cependant, la découverte de nouveaux ligands reste un chalenge. Le but est de développer des approches basées sur la RMN à l’état liquide, qui auront un impact positif sur la recherche de ligand de RCPGs, grâce à l’étude et la caractérisation de récepteur pleine taille, solubilisés en micelles de détergents ou enchâssés en bicouches lipidiques natives

G Protein Coupled Receptors (GPCRs) constitute the largest membrane protein family represented in the human genome. Their involvement in a wide number of biological processes fully supports their study. GPCR-targeting antibodies are versatile and valuable tools, which remain scarcely available, chiefly because their generation is a challenging process. This thesis presents an alternative and innovative strategy in which recombinant Semliki Forest Virus (SFV) particles coding for the receptor of interest are used as immunogens. When applied to the human version of the Adenosine A2A receptor, this method enables to cause the receptor’s overexpression at the surface of the infected animal cells, which generates an immune response. This strategy enables to raise receptor-specific mouse polyclonal serum. It opens a new path towards the generation of monoclonal mouse antibodies. Additionally, it seems to also be a promising approach to develop nanobodies., Les Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines membranaires chez l’Homme, et leur implication dans un grand nombre de processus physiologiques justifie pleinement l’intérêt de leur étude. Les anticorps spécifiques de ces récepteurs sont des outils polyvalents à haute valeur ajoutée, qui restent toutefois encore trop rarement disponibles, notamment en raison des difficultés techniques posées par leur génération. Ce manuscrit présente la mise au point d’une méthode d’immunisation alternative et innovante, mettant en jeu des particules virales recombinantes dérivées du Virus de la Forêt de Semliki (SFV) codant pour le récepteur d’intérêt. Appliquée au récepteur de l’adénosine A2A humain, l’immunisation permet d’engendrer la surexpression de celui-ci à la surface des cellules de l’animal infecté, et de provoquer l’apparition d’une réponse immunitaire. Cette approche permet d’une part de générer un sérum polyclonal de souris spécifique au récepteur, et ouvre donc une nouvelle voie pour l’obtention d’anticorps monoclonaux murins. Elle semble d’autre part prometteuse pour la génération de nanobodies.

G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest class of membrane proteins in the human genome. GPCRs act as cell surface signalling proteins and respond to a variety of external signals. They play a pivotal role in many physiological functions and are therefore associated with a multitude of diseases, including cardiovascular, metabolic, neurodegenerative, psychiatric, and oncologic diseases. The 2012 noble Prize in Chemistry was awarded jointly to Robert J. Lefkowitz and Brian K. Kobilka for studies of GPCRs, highlighting the importance of this protein superfamily. GPCRs constitute also the most important family of drug targets in the human body, with 30% of current drugs acting on GPCRs. However, drug discovery targeting GPCRs remains difficult, owing to the restricted structural information on GPCRs related to the instability of these proteins when isolated from their cell membrane environments. There is also a lack of knowledge for the structural and functional consequences of the interactions of small-molecule compounds with GPCR. The aim is to develop methods to study and characterize a full GPCR solubilized in detergents or in native lipid bilayers, both in its free form and in small molecule bound forms, using liquid-state NMR experiments. The aim is to develop NMR-based approaches that will strongly impact the structure-based drug discovery process for the GPCR family, Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs), constituent la plus grande famille de protéines membranaires dans le génome humain. Les RCPGs sont des protéines de signalisation, qui exercent leur action à la surface des cellules, en réponse à une grande variété de stimuli extérieurs. Ils jouent un rôle primordial dans de nombreuses fonctions physiologiques et sont donc impliqués dans une multitude de pathologies comme les maladies cardiovasculaires, métaboliques, neurodégénératives, psychiatriques et oncologiques. L'attribution du prix Nobel de chimie 2012 aux professeurs Robert Lefkowitz et Brian Kobilka pour leurs travaux et avancées spectaculaires dans le champ de recherches des RCPGs, souligne encore leur importance. Les RCPGs constituent également la plus importante cible thérapeutique, avec 30% des médicaments actuellement disponibles sur le marché qui exercent leur action via un RCPG. Cependant, la découverte de nouveaux ligands reste un chalenge. Le but est de développer des approches basées sur la RMN à l’état liquide, qui auront un impact positif sur la recherche de ligand de RCPGs, grâce à l’étude et la caractérisation de récepteur pleine taille, solubilisés en micelles de détergents ou enchâssés en bicouches lipidiques natives

L'activation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) déclenche en parallèle avec le processus de signalisation une réponse de régulation. Cette réponse est initiée par la phosphorylation du récepteur suivie par le recrutement de la β-arrestine (βarr), l'internalisation du récepteur et son tri ultérieur vers la voie de dégradation ou de recyclage vers la membrane plasmique. De nombreux rapports ont signalé pour le récepteur opioïde delta (DOPr) la présence de réponses biaisées en fonction du ligand, le long des différentes étapes des cascades de signalisation et de régulation. Cette sélectivité fonctionnelle a expliqué dans certains cas la capacité différentielle de ces ligands à produire la tolérance analgésique in vivo. En effet, il a été démontré que les ligands biaisés qui activent préférentiellement la voie de signalisation par rapport à l’internalisation produisent moins de tolérance analgésique que ceux favorisant l’internalisation du récepteur. D’autre part, les mécanismes de tri post-endocytique du récepteur (recyclage ou dégradation) ont récemment constitué la pierre angulaire pour la compréhension des bases moléculaires de cette tolérance analgésique. Dans ce contexte, il a été établi que les ligands produisant le recyclage du récepteur suite à son internalisation produisent une action analgésique soutenue en les comparant à ceux envoyant le récepteur vers la voie de dégradation. Cette étude était alors réalisée dans le but ultime de mieux comprendre les déterminants moléculaires à la base de la perte de l’efficacité analgésique avec l’administration des opioïdes. Nous avons alors voulu tout d’abord évaluer comment le biais de signalisation par rapport à l’internalisation prédirait la tolérance analgésique in vivo et en second lieu nous nous sommes intéressés à décrire l’itinéraire post-endocytique du DOPr et son rôle dans la prévention de cette tolérance. Nous avons alors démontré qu’il existe un biais mesurable pour la modulation de la signalisation par rapport à l’internalisation pour certains agonistes du DOPr en utilisant les nouveaux outils pharmacologiques de quantification du biais. Ce biais mesuré au niveau des cellules HEK293 n’a pas prédit la tolérance analgésique in vivo d’autant plus que les propriétés d’internalisation du DOPr différaient entre les cellules HEK293 et les neurones, lieu biologique où les opioïdes exercent leurs fonctions analgésiques. Ceci soulève la question si le biais observé serait maintenu à travers les différents systèmes biologiques d’où l’intérêt de l’étude des mécanismes du trafic post-endocytique comme alternative pour la compréhension de cette tolérance analgésique. Ainsi, nous avons établi que le DOPr recycle des endosomes tardifs vers la membrane plasmique en passant par le réseau du trans-Golgi (TGN) en faisant intervenir la protéine X interagissant avec le gène 2 lié à l’apoptose (ALIX) et le complexe de récupération Rab9/ Protéine intéragissant avec la queue de 47kD (TIP47). L’interférence avec cet itinéraire établi a précipité la tolérance à l'analgésie, indiquant que le recyclage du récepteur tel que décrit contribue au maintien de la réponse analgésique aux agonistes du DOPr in vivo. Ces informations fournissent des éléments pertinents pour le processus de criblage de nouveaux opioïdes ayant une activité analgésique durable., Activation of G protein coupled receptors (GPCR) triggers a regulatory response in parallel with signaling processes. This response is initiated by receptor phosphorylation followed by β-arrestin (βarr) recruitment, receptor internalization, and subsequent sorting towards either the degradation pathway or recycling back to the membrane. Numerous reports have spoken of delta opioid receptor (DOPr) ligand-biased responses among signaling and regulation cascades. This functional selectivity may explain the differential profiles of these ligands to produce analgesic tolerance in vivo. Indeed, it has been shown that biased ligands that preferentially activate the signaling pathway over internalization produce less analgesic tolerance than those producing receptor internalization. On the other hand, the post-endocytic sorting mechanisms (recycling or degradation) of receptors have recently been the cornerstone for understanding the molecular basis of this analgesic tolerance. In this context, ligands producing receptor recycling following internalization have been shown to produce sustained analgesic action by comparing them to those sending the receptor to the degradation pathway. In the light of these observations, this study was conducted to better understand the molecular determinants underlying the loss of analgesic efficacy following prolonged opioid administration. We first wanted to evaluate how signaling versus internalization bias predicts analgesic tolerance in vivo, and secondly we are interested in describing the post-endocytic route of DOPr and how it prevents this tolerance. We then demonstrated that there is a measurable signaling versus internalization bias for some DOPr agonists using novel pharmacological tools for quantifying bias. This bias measured in HEK293 cells did not predict the analgesic tolerance in vivo and the DOPr internalization properties were different between HEK293 cells and neurons, where opioids exert their analgesic functions. This raises the question whether the observed bias would be maintained across the different biological systems. We were then interested to study the post-endocytic trafficking mechanisms as an alternative for understanding this analgesic tolerance. We established that the late endosome sorting mechanism involved the ALG-2-interacting Protein X (Alix) and the tail-interacting protein 47 (TIP47)/Rab9 retrieval complex, which support translocation of the receptor to the trans-Golgi network (TGN), from where it is subsequently recycled to the cell membrane. Preventing DOPr from completing this route precipitated acute analgesic tolerance, supporting the relevance of this recycling path in maintaining the analgesic response by this receptor. These results provide relevant insights for the process of screening new opioids with sustained analgesic activity.

Many studies reveal that GPCR activation does not simply involve two conformational states, one activated and the other inactivated, but a variety of these states coupled to intermediate states. By using molecular dynamics simulations and analyzing non-covalent intramolecular interactions, we studied the structural plasticity of monomeric and dimeric CCR5. By coupling our analysis with various experimental data, we identified three dimeric organizations states of the receptor and associated key motions and intramolecular interactions to free CCR5, bound to an agonist, bound to an inverse agonist and constitutively activated or inactivated by mutated residues. We have also developed a method to identify intramolecular transmembrane interactions patterns, which allow the discrimination of GPCRs activation states.; De nombreuses études des RCPGs révèlent que leur activation n’implique pas que deux états conformationnels, l’un activé et l’autre inactivé, mais une diversité plus importante de ces états, impliquant également des états intermédiaires. Nous avons utilisé la simulation par dynamique moléculaire et l’analyse des interactions intramoléculaires non-covalentes pour étudier la plasticité structurale du récepteur CCR5 sous sa forme monomérique et dimérique. En couplant notre analyse avec diverses données expérimentales, nous avons pu proposer trois architectures dimériques du récepteur et associer des mouvements et des interactions clefs aux états conformationnels de CCR5 libre, lié à un agoniste, lié à un agoniste inverse et constitutivement activé ou inactivé par mutation d’acides aminés. Nous avons également développé une méthode d’identification des motifs d’interactions intramoléculaires transmembranaires, permettant de discriminer les états d’activations des RCPGs.

In most cases, cortisol hypersecretion (Cushing’s syndrome; CS) results from ACTH-producing pituitary adenoma (Cushing’s disease). Occasionally, CS is the consequence of a unilateral adrenal adenoma or a bilateral macronodular adrenal hyperplasia (BMAH) producing cortisol. In these conditions, hypercortisolism is referred to as “ACTH-independent” owing to suppressed plasma ACTH levels. The molecular mechanisms underlying the maintenance of cortisol hypersecretion by adrenocortical adenomas and BMAHs in the absence of circulating ACTH has long remained unknown. However, major advances have been made during the past recent years in the comprehension of the pathophysiology of primary adrenal CS. Two main types of molecular defects have been shown to favor cortisol hypersecretion by adrenocortical neoplasms: somatic mutations responsible for activation of intracellular signaling pathways and abnormally expressed (or illegitimate) membrane receptors by tumor cells. In the human adrenal gland, serotonin (5-HT), released by subcapsular mast cells stimulates corticosteroid secretion through activation of its type 4 receptor (5-HT4R). The 5-HT4R is principally expressed in zona glomerulosa cells but weakly expressed in zona fasciculata cells explaining why 5-HT strongly stimulates aldosterone production. Interestingly, in primary pigmented nodular adrenocortical disease (PPNAD) cells, activation of the cAMP/PKA pathway by PRKAR1A mutations triggers upregulation of the 5-HT synthesizing enzyme tryptophan hydroxylase (TPH) type 2 together with the 5-HT4, 5-HT6 and 5-HT7 receptors, positively coupled to cAMP/PKA signaling pathway. 5-HT strongly stimulates cortisol production and inhibition of TPH reduced corticosteroidogenesis in cultured PPNAD cells. In human, cortisol secretion is normally stimulated by ACTH also through activation of the cAMP/PKA signaling pathway. Patients suffering from Cushing’s disease, paraneoplastic Cushing’s syndrome (paraCS), 21-hydroxylase deficiency or BMAH display high plasma or intraadrenal ACTH levels. In these patients, we show that chronic stimulation of cAMP/PKA pathway by ACTH induces TPH type 1 and 5-HT4/6/7 receptors overexpression in steroidogenic cells. In primary cultured adrenocortical cells originating from a patient with paraCS, 5-HT and 5-HT4/7 receptors agonists were able to activate cortisol secretion. On the other hand, the role of Wnt/-catenin signaling pathway in the emergence of illegitimate receptors is still debated. We therefore evaluated 5-HT4, 5-HT6, 5-HT7, LH/hCG and GIP receptors expression in an adrenocortical tumor with APC germline mutation and two experimental models of constitutive activation of β-catenin in adrenocortical cells, namely genetically modified mice and human transfected adrenocortical cells. Our results indicate that Wnt/-catenin pathway activation promotes significant overexpression of LH/hCG receptor in the 3 models investigated. Globally, our data show that activation of intracellular signaling pathways such as the cAMP/PKA pathway by ACTH or Wnt/-catenin by genetic mutations favors the emergence of abnormal regulatory systems in the adrenal cortex. Our results also demonstrate that intraadrenal 5-HT is involved in corticosteroids hypersecretion related to different diseases including Cushing’s disease, paraneoplastic Cushing’s syndrome, 21-hydroxylase deficiency and BMAH. TPH inhibitors may thus represent a new therapeutic approach of corticosteroid excess in patients suffering from these disorders., Dans la majorité des cas, l’hypersécrétion de cortisol résulte d’un adénome hypophysaire sécrétant de l’ACTH (maladie de Cushing). Plus rarement, le syndrome de Cushing est la conséquence d’un adénome corticosurrénalien unilatéral ou d’une hyperplasie bilatérale des surrénales (HMBS) sécrétant du cortisol. Ces deux pathologies appartiennent à la catégorie des hypercortisolismes dits ACTH-indépendants en raison des taux plasmatiques effondrés d’adrénocorticotrophine (ACTH). Les mécanismes moléculaires à l’origine de la sécrétion accrue de cortisol par ces lésions sont longtemps restés méconnus. Au cours des dernières années, des avancées considérables ont été réalisées dans la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la physiopathologie du syndrome de Cushing. Deux grands types d’anomalies paraissent impliqués dans la pathogénie de l’hypercortisolisme : des mutations germinales et somatiques activant des voies de signalisation intracellulaires et l’expression illégitime de récepteurs membranaires. Dans la surrénale humaine normale, la sérotonine (5-HT), synthétisée et libérée par les mastocytes sous-capsulaires, stimule la sécrétion des corticostéroïdes via son récepteur 5-HT4. Ce dernier est principalement localisé à la surface des cellules de la zone glomérulée mais faiblement exprimé au niveau des cellules de la zone fasciculée, expliquant l’action stimulante prédominante de la 5-HT sur la sécrétion d’aldostérone. Dans la dysplasie micronodulaire pigmentée des surrénales, l’activation de la voie AMPc/PKA par une mutation du gène PRKAR1A est responsable d’une surexpression de la tryptophane hydroxylase (TPH) de type 2, enzyme limitante de la synthèse de 5-HT, et des récepteurs sérotoninergiques 5-HT4, 5-HT6 et 5-HT7 couplés positivement à la voie AMPc/PKA dans les cellules cortisolosécrétrices. Chez l’Homme, la sécrétion de cortisol est physiologiquement stimulée par l’ACTH également via la voie AMPc/PKA. Les patients souffrant de maladie de Cushing, d’un syndrome de Cushing paranéoplasique (paraCS), d’un déficit en 21-hydroxylase ou d’HMBS présentent des taux d’ACTH plasmatique ou intrasurrénalienne élevés. Chez ces patients, nous montrons que la stimulation chronique de la voie AMPc/PKA par l’ACTH provoque une surexpression de la TPH de type 1, du récepteur eutopique 5-HT4 et des récepteurs ectopiques 5-HT6 et 5-HT7 dans les cellules stéroïdogènes. Pour l’un des patients avec paraCS, nous avons pu montrer que les cellules corticosurrénaliennes en culture sécrètent du cortisol en réponse à la 5-HT ou à des agonistes des récepteurs 5-HT4 ou 5-HT7. Par ailleurs, le rôle de la voie Wnt/-caténine dans l’apparition des récepteurs illégitimes reste controversé. Nous avons donc évalué l’expression des récepteurs 5-HT4, 5-HT6, 5-HT7, du LH-R et du GIP-R dans une tumeur corticosurrénalienne avec mutation germinale du gène APC et deux modèles d’activation constitutive de la voie Wnt/-caténine dans le cortex surrénalien, incluant des souris génétiquement modifiées et des cellules corticosurrénaliennes humaines en culture primaire. Nos résultats indiquent que l’activation de la voie Wnt/-caténine favorise une surexpression significative du LH-R dans les 3 modèles étudiés. Globalement, les données issues de notre travail montrent que l’activation de voies de signalisation intracellulaire, comme la voie AMPc/PKA par l’ACTH ou la voie Wnt/-caténine par des mutations génétiques, favorise l’émergence de systèmes de régulation surrénaliens aberrants. Ils indiquent en outre que la 5-HT intrasurrénalienne est impliquée dans l’hypersécrétion de corticostéroïdes associée à différentes pathologies incluant la maladie de Cushing et le syndrome de Cushing paranéoplasique, le bloc en 21-hydroxylase et l’HMBS. Le recours à des inhibiteurs sélectifs de la tryptophane hydroxylase pourrait donc permettre de réduire l’excès de stéroïdes chez les patients atteints de ces affections.

Overexpression of G protein-coupled receptors (GPCRs) in tumor is widely used to develop GPCR-targeting radioligands for solid tumor imaging. For example, somatostatin analogue labeled with 111Indium (111In-OctreoScan) is used for the diagnosis of neuroendocrine tumors. The vasoactive neuropeptide urotensin II (UII), which shares structural analogies with somatostatin, interacts with a single high affinity GPCR named UT. High expression of UT has been reported in several types of human solid tumors from lung, gut, prostate or breast, suggesting that UT is a valuable target to design radiolabeled UII analogues for cancer diagnosis. Two urotensinergic analogues (DOTA-UII and DOTA-urantide) both containing the DOTA chelating group capable of complexing radioactive metal isotopes have been synthetized and radiolabeled with 111Indium. Incubation of 111In-DOTA-UII in human plasma revealed that only 30% of the radioligand was degraded after a 3h incubation period. Administration of graded concentrations of both DOTA-UII and DOTA-urantide in the vicinity of HEK293 cells expressing UT induced a dose-dependent increase in cytosolic calcium concentration, with similar potency and efficacy to that obtained with UII and urantide. These results demonstrated that conjugation of DOTA in urotensinergic analogues did not affect UT activation. DOTA-UII was also able to promote UT internalization in HEK293 cells expressing UT, while DOTA-urantide was ineffective. Intravenous injection of 111In-DOTA-UII in C57BL/6 mice revealed a slight signal mostly restricted in kidney, and similar results were obtained with knock-out mice or constitutively expressing human UT mice. Finally, 111In-DOTA-UII was injected into nude mice bearing heterotopic xenografts of human A549 cells (lung adenocarcinoma) or DLD-1 cells (colorectal adenocarcinoma) both expressing functional UT. In both cases, SPECT-CT imaging showed the absence of tumor uptake and significant renal and bladder uptakes, suggesting fast tracer clearance from the organism. However, further investigations will be necessary to decrease renal clearance and to improve tumor imaging., La surexpression de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) dans certains cancers est mise à profit en médecine nucléaire pour développer des radioligands capables de diagnostiquer la présence de tumeurs. A titre d’exemple, des analogues de la somatostatine marqués à l’indium-111 (111In-OctreoScan) sont utilisés pour le diagnostic de tumeurs neuroendocrines. L’urotensine II (UII), qui présente des homologies structurales avec la somatostatine, est considérée comme le neuropeptide vasoactif le plus puissant découvert à ce jour. L’UII interagit avec un unique RCPG de très haute affinité appelé UT, classiquement couplé à la voie Gαq/PLC/IP3/Ca2+. L’UII exerce notamment des activités pro-mitotiques et chémoattractantes et une expression élevée de l'UT a été rapportée dans plusieurs types de tumeurs solides humaines provenant des poumons, de l'intestin, de la prostate ou du sein. Ces données suggèrent que l'UT pourrait être une cible prometteuse pour concevoir des analogues urotensinergiques radiomarqués à finalités diagnostiques voire thérapeutiques. Deux analogues urotensinergiques capables de lier des isotopes radioactifs (le DOTA-UII et le DOTA-urantide) ont été synthétisés et radiomarqués avec succès avec l’111In. L'incubation de l’111In-DOTA-UII dans du plasma humain a révélé que seulement 30% du radioligand étaient dégradés après 3 heures d’incubation. L'administration de concentrations croissantes de DOTA-UII et de DOTA-urantide sur des cellules HEK-293 exprimant l'UT induit une augmentation dose-dépendante de la concentration cytosolique de calcium, avec une puissance et une efficacité similaires à celles obtenues avec l'UII (EC50: 1,26 10-8 M et 2,09 10-8 M, UII et DOTA-UII, respectivement) et urantide (EC50: 1,82 10-8 M et 1,52 10-8 M, urantide et DOTA-urantide, respectivement). Alors que la fixation sur l’UT du DOTA-UII ou l’UII entraîne l'internalisation du complexe ligand-récepteur (ELISA et immunocytochimie) dans les cellules HEK-293 exprimant l'UT, l’urantide et le DOTA-urantide restent inactifs. L'injection intraveineuse de l’111In-DOTA-UII chez des souris C57BL/6 a révélé un léger signal principalement restreint dans les reins, indiquant une clairance rapide du peptide. Des résultats similaires ont été obtenus avec des souris dont le gène codant l’UT a été invalidé (mUTS2R-/-) ou des souris exprimant constitutivement la forme humaine de l’UT (mUTS2R-/- hUTS2R+/+). Enfin, l’111In-DOTA-UII a été injecté chez des souris Nudes porteuses de xénogreffes hétérotopiques de cellules humaines A549 (adénocarcinome pulmonaire) ou DLD-1 (adénocarcinome colorectal), exprimant fonctionnellement l’UT, comme nous l’avons préalablement vérifié par analyses western blot, par immunohistochimie et par des tests de migration/prolifération cellulaire. Dans les deux cas, l'imagerie TEMP/TDM n'a toutefois pas révélé de signal exploitable dans les tumeurs, suggérant que la clairance du radioligand est trop importante pour permettre l'accumulation du radiotraceur et la détection des tumeurs. L’ensemble de nos résultats démontre que la conjugaison de DOTA dans les analogues urotensinergiques n'altère pas l'activation de l'UT. Cependant, d'autres investigations sont nécessaires pour diminuer la clairance rénale et améliorer l'imagerie tumorale et ainsi permettre, à terme, de concevoir des radioligands urotensinergiques à finalités diagnostiques voire théranostiques.

La fusion des myoblastes est une étape critique dans le développement musculaire embryonnaire et lors de la régénération des muscles chez l’adulte. Les myoblastes gouvernent ce processus en établissant des contacts cellule-cellule et en fusionnant leurs membranes. Des études génétiques chez la drosophile ont permis de montrer l’importance d’activer la petite GTPase Rac. Cet événement est possible grâce à son activateur, le facteur d’échange de nucléotide de guanine Myoblast City, et sa protéine d’échafaudage ELMO. Le degré de conservation des molécules impliquées dans la fusion des myoblastes entre la drosophile et les vertébrés était inconnu. C’est alors que des équipes ont démontré que les composantes régulant le réarrangement du cytosquelette chez la drosophile étaient conservées chez les vertébrés. Ainsi Wasp, Rac et Dock180 (orthologue mammifère de Myoblast City) sont tous essentiels à la fusion des myoblastes dans les 2 systèmes. Cette machinerie est activée par des récepteurs de surface bien caractérisés chez la drosophile. Leurs équivalents demeurent inconnus chez les vertébrés. L’hypothèse pour répondre à cette question prétend que si un récepteur à la surface des myoblastes est capable d’interagir avec le complexe ELMO/DOCK alors il sera un candidat potentiel pour avoir la fonction de : régulateur de la fusion des myoblastes. Le premier objectif de la thèse est d’identifier le récepteur de surface capable de réguler la fusion des myoblastes chez les vertébrés. Comme ELMO/DOCK sont importants pour la fusion, alors ils pourront directement lier le récepteur pro-fusion. Ainsi, en utilisant ELMO comme proie, le récepteur d’adhésion couplé aux protéines G, BAI3 a été identifié. Il induit la fusion par son interaction avec le complexe intracellulaire ELMO/DOCK/Rac. L’implication de ce complexe est bien établie dans la fusion des myoblastes. Les études de pertes de fonction de BAI3 et d’ELMO dans les cellules C2C12 montrent un blocage de fusion des myoblastes sans affecter le programme de différentiation. De plus lors du développement embryonnaire, la présence de BAI3 mutant, incapable de se lier à ELMO2, inhibe complètement la fusion. En conclusion, cet objectif a permis d’identifier BAI3, son rôle dans la fusion ainsi que l’importance de son interaction avec ELMO2 pour compléter la fusion des myoblastes des vertébrés. Alors que le rôle de BAI3 est défini dans la fusion des myoblastes, le deuxième objectif vise à comprendre la régulation de BAI3. Comme la fusion des myoblastes est un processus précisément régulé, son régulateur, BAI3, doit être tout autant régulé. Étant donné que BAI3 est une RCPG alors il doit avoir de(s) ligand(s) régulant l’activation du récepteur et l’influence de ce signal sur doit se répercuter sur le recrutement d’ELMO2. Ainsi deux protéines qui régulent l’activation de BAI3 ont été identifiées. La première est la petite protéine sécrétée C1qL4 qui agit comme inhibiteur de BAI3 lors de la fusion des myoblastes. Le deuxième partenaire est le récepteur transmembranaire Stabilin-2. Ce dernier interagit avec la région extracellulaire de BAI3 et l’active. BAI3 transmet le signal en déclenchant le mécanisme canonique des RCPG ce qui permettra le recrutement du complexe ELMO/DOCK à la membrane. En conclusion, l’objet de cette thèse a permis d’identifier le premier récepteur de surface capable de réguler la fusion des myoblastes et jusque-là inconnu chez les vertébrés. De plus, le mécanisme de régulation de BAI3 a aussi été caractérisé avec la fonction inhibitrice de C1qL4 et la fonction activatrice de Stabilin-2. Ces nouveaux joueurs et ce mécanisme représentent sans doute des nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement des dystrophies musculaires., Myoblast fusion is a critical step in embryonic muscle development and muscle regeneration in adults. Myoblasts govern this process by establishing cell-cell contacts and fusing their membranes. Genetic studies in Drosophila have shown the importance of activating the small GTPase Rac. This event is possible thanks to its activator, guanine nucleotide exchange factor Myoblast City, and its scaffold protein ELMO. The degree of conservation of molecules involved in myoblast fusion between Drosophila and vertebrates was unknown. Until teams demonstrated that the components regulating the reorganization of the cytoskeleton in Drosophila were conserved in vertebrates. Thus Wasp, Rac and Dock180 (Myoblast City mammal orthologue) are all essential for the fusion of myoblasts in both systems. This machinery is activated by well-characterized surface receptors in Drosophila. Their equivalents remain unknown in vertebrates. The hypothesis to answer this question is that if a myoblast cell surface is able to interact with the ELMO / DOCK complex then it will be a potential candidate to be a regulator of myoblast fusion. The first objective of the thesis is to identify the surface receptor capable of regulating myoblast fusion in vertebrates. As ELMO / DOCK are important for fusion, then they will be able to directly bind the pro-fusion receptor. Thus, using ELMO as prey, the Adhesion G protein-coupled receptor BAI3 has been identified. It induces fusion by its interaction with the intracellular complex ELMO/DOCK/Rac. The involvement of this complex is well established in the fusion of myoblasts. Loss of Function studies of BAI3 and ELMO in C2C12 cells showed fusion blocking of myoblasts without affecting the differentiation program. Moreover, during the embryonic development, the presence of mutant BAI3, unable to bind to ELMO2, completely inhibits the fusion. In conclusion, this objective made it possible to identify BAI3, its role in fusion as well as the importance of its interaction with ELMO2 to complete the fusion of vertebrate myoblasts. While the role of BAI3 is defined in myoblast fusion, the second objective is to understand the regulation of BAI3. As myoblast fusion is a precisely regulated process, its regulator, BAI3, must be regulated as well. Since BAI3 is a GPCR then it must have ligand (s) iv regulating the activation of the receptor and the influence of this signal should affect the recruitment of ELMO2. Thus, two proteins that regulate the activation of BAI3 have been identified. The first is the small secreted protein C1qL4 that acts as an inhibitor of BAI3 during myoblast fusion. The second partner is the transmembrane receptor Stabilin-2. Thus Stabilin-2 interacts with the extracellular region of BAI3 and activates it. BAI3 transmits the signal by triggering the canonical mechanism of GPCRs which will allow the recruitment of the ELMO / DOCK complex at the membrane. In conclusion, this thesis identified the first surface receptor capable of regulating myoblast fusion, previously unknown in vertebrates. In addition, the regulatory mechanism of BAI3 was also characterized with the C1qL4 inhibitory function and the Stabilin-2 activator function. These new players and this mechanism undoubtedly represent new therapeutic avenues for the treatment of muscular dystrophies.

Overexpression of G protein-coupled receptors (GPCRs) in tumor is widely used to develop GPCR-targeting radioligands for solid tumor imaging. For example, somatostatin analogue labeled with 111Indium (111In-OctreoScan) is used for the diagnosis of neuroendocrine tumors. The vasoactive neuropeptide urotensin II (UII), which shares structural analogies with somatostatin, interacts with a single high affinity GPCR named UT. High expression of UT has been reported in several types of human solid tumors from lung, gut, prostate or breast, suggesting that UT is a valuable target to design radiolabeled UII analogues for cancer diagnosis. Two urotensinergic analogues (DOTA-UII and DOTA-urantide) both containing the DOTA chelating group capable of complexing radioactive metal isotopes have been synthetized and radiolabeled with 111Indium. Incubation of 111In-DOTA-UII in human plasma revealed that only 30% of the radioligand was degraded after a 3h incubation period. Administration of graded concentrations of both DOTA-UII and DOTA-urantide in the vicinity of HEK293 cells expressing UT induced a dose-dependent increase in cytosolic calcium concentration, with similar potency and efficacy to that obtained with UII and urantide. These results demonstrated that conjugation of DOTA in urotensinergic analogues did not affect UT activation. DOTA-UII was also able to promote UT internalization in HEK293 cells expressing UT, while DOTA-urantide was ineffective. Intravenous injection of 111In-DOTA-UII in C57BL/6 mice revealed a slight signal mostly restricted in kidney, and similar results were obtained with knock-out mice or constitutively expressing human UT mice. Finally, 111In-DOTA-UII was injected into nude mice bearing heterotopic xenografts of human A549 cells (lung adenocarcinoma) or DLD-1 cells (colorectal adenocarcinoma) both expressing functional UT. In both cases, SPECT-CT imaging showed the absence of tumor uptake and significant renal and bladder uptakes, suggesting fast tracer clearance from the organism. However, further investigations will be necessary to decrease renal clearance and to improve tumor imaging., La surexpression de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) dans certains cancers est mise à profit en médecine nucléaire pour développer des radioligands capables de diagnostiquer la présence de tumeurs. A titre d’exemple, des analogues de la somatostatine marqués à l’indium-111 (111In-OctreoScan) sont utilisés pour le diagnostic de tumeurs neuroendocrines. L’urotensine II (UII), qui présente des homologies structurales avec la somatostatine, est considérée comme le neuropeptide vasoactif le plus puissant découvert à ce jour. L’UII interagit avec un unique RCPG de très haute affinité appelé UT, classiquement couplé à la voie Gαq/PLC/IP3/Ca2+. L’UII exerce notamment des activités pro-mitotiques et chémoattractantes et une expression élevée de l'UT a été rapportée dans plusieurs types de tumeurs solides humaines provenant des poumons, de l'intestin, de la prostate ou du sein. Ces données suggèrent que l'UT pourrait être une cible prometteuse pour concevoir des analogues urotensinergiques radiomarqués à finalités diagnostiques voire thérapeutiques. Deux analogues urotensinergiques capables de lier des isotopes radioactifs (le DOTA-UII et le DOTA-urantide) ont été synthétisés et radiomarqués avec succès avec l’111In. L'incubation de l’111In-DOTA-UII dans du plasma humain a révélé que seulement 30% du radioligand étaient dégradés après 3 heures d’incubation. L'administration de concentrations croissantes de DOTA-UII et de DOTA-urantide sur des cellules HEK-293 exprimant l'UT induit une augmentation dose-dépendante de la concentration cytosolique de calcium, avec une puissance et une efficacité similaires à celles obtenues avec l'UII (EC50: 1,26 10-8 M et 2,09 10-8 M, UII et DOTA-UII, respectivement) et urantide (EC50: 1,82 10-8 M et 1,52 10-8 M, urantide et DOTA-urantide, respectivement). Alors que la fixation sur l’UT du DOTA-UII ou l’UII entraîne l'internalisation du complexe ligand-récepteur (ELISA et immunocytochimie) dans les cellules HEK-293 exprimant l'UT, l’urantide et le DOTA-urantide restent inactifs. L'injection intraveineuse de l’111In-DOTA-UII chez des souris C57BL/6 a révélé un léger signal principalement restreint dans les reins, indiquant une clairance rapide du peptide. Des résultats similaires ont été obtenus avec des souris dont le gène codant l’UT a été invalidé (mUTS2R-/-) ou des souris exprimant constitutivement la forme humaine de l’UT (mUTS2R-/- hUTS2R+/+). Enfin, l’111In-DOTA-UII a été injecté chez des souris Nudes porteuses de xénogreffes hétérotopiques de cellules humaines A549 (adénocarcinome pulmonaire) ou DLD-1 (adénocarcinome colorectal), exprimant fonctionnellement l’UT, comme nous l’avons préalablement vérifié par analyses western blot, par immunohistochimie et par des tests de migration/prolifération cellulaire. Dans les deux cas, l'imagerie TEMP/TDM n'a toutefois pas révélé de signal exploitable dans les tumeurs, suggérant que la clairance du radioligand est trop importante pour permettre l'accumulation du radiotraceur et la détection des tumeurs. L’ensemble de nos résultats démontre que la conjugaison de DOTA dans les analogues urotensinergiques n'altère pas l'activation de l'UT. Cependant, d'autres investigations sont nécessaires pour diminuer la clairance rénale et améliorer l'imagerie tumorale et ainsi permettre, à terme, de concevoir des radioligands urotensinergiques à finalités diagnostiques voire théranostiques.

Many studies reveal that GPCR activation does not simply involve two conformational states, one activated and the other inactivated, but a variety of these states coupled to intermediate states. By using molecular dynamics simulations and analyzing non-covalent intramolecular interactions, we studied the structural plasticity of monomeric and dimeric CCR5. By coupling our analysis with various experimental data, we identified three dimeric organizations states of the receptor and associated key motions and intramolecular interactions to free CCR5, bound to an agonist, bound to an inverse agonist and constitutively activated or inactivated by mutated residues. We have also developed a method to identify intramolecular transmembrane interactions patterns, which allow the discrimination of GPCRs activation states., De nombreuses études des RCPGs révèlent que leur activation n’implique pas que deux états conformationnels, l’un activé et l’autre inactivé, mais une diversité plus importante de ces états, impliquant également des états intermédiaires. Nous avons utilisé la simulation par dynamique moléculaire et l’analyse des interactions intramoléculaires non-covalentes pour étudier la plasticité structurale du récepteur CCR5 sous sa forme monomérique et dimérique. En couplant notre analyse avec diverses données expérimentales, nous avons pu proposer trois architectures dimériques du récepteur et associer des mouvements et des interactions clefs aux états conformationnels de CCR5 libre, lié à un agoniste, lié à un agoniste inverse et constitutivement activé ou inactivé par mutation d’acides aminés. Nous avons également développé une méthode d’identification des motifs d’interactions intramoléculaires transmembranaires, permettant de discriminer les états d’activations des RCPGs.

Opioid analgesics continue to be the cornerstones for treating moderate to severe pain. However, upon chronic administration, their efficiency is limited because of prominent side effects, such as tolerance and dependence. One hypothesis for the occurrence of these side effects is that the chronic stimulation of the opioid system may trigger its endogenous counterparts, anti-opioid systems, producing hyperalgesia and analgesic tolerance. Previous data from our lab and others suggest that RF-amide peptide receptors can modulate pain signalling through cross-interactions. We developed cell lines expressing fluorescent RF-amide receptors for the study of functional crosstalk and heterodimerization between RF-amide peptide receptors, i.e. GPR103 and NPFF1R. Through a productive collaboration with two teams of chemists, we identified and characterized multitarget peptidomimetic compounds that combined G protein-biased agonism and NPFFR antagonism. In accordance with in vitro results, we observed that acute subcutaneous administration of this compound produced long-lasting antinociceptive effects with less respiratory depression in mice. No hypersensitivity nor analgesic tolerance developed after chronic administration. Altogether, this molecule showed potent antinociceptive effect with limited side effects upon acute and chronic administration., Les opiacés demeurent des molécules incontournables dans le traitement des douleurs moyennes à sévères. Si leur efficacité dans le traitement de la douleur aiguë est incontestable, leur utilisation chronique est responsable de nombreux effets indésirables comprenant une hypersensibilité à la douleur et une tolérance à leurs effets analgésiques. Une partie de ces effets secondaires résulteraient de l’activation de systèmes anti-opioïdes endogènes, comme les neuropeptides RF-amide, dont des études précédentes suggèrent une complémentarité de fonctionnement dans la modulation de la douleur. Le premier axe de travail de cette thèse fut de développer les outils moléculaires afin d’étudier la possibilité d’interactions fonctionnelles et d’hétérodimérisation de ces récepteurs, en particulier GPR103 et NPFF1R. Nous avons ainsi pu générer et caractériser des lignées cellulaires exprimant les différents récepteurs à peptide RF-amide avec un fluorophore fusionné à leur extrémité amino-terminale. En parallèle, nous avons pu développer au cours d’une collaboration fructueuse avec deux équipes de chimistes un ligand à dualité d’action, agoniste opioïdergique et antagoniste des récepteurs NPFF1R et NPFF2R. Chez la souris, nous avons montré que l’administration sous-cutanée de ce composé produit une analgésie longue durée, qui n’est pas atténuée par le développement de tolérance analgésique ou d’hyperalgésie après une semaine d’administration quotidienne. Le syndrome de sevrage, précipité par la naltrexone est plus faible après l’administration chronique de ce composé qu’avec l’agoniste opioïdergique de référence. De plus, grâce à ses caractéristiques d’agoniste biaisé sur le récepteur MOR, cette molécule induit une plus faible dépression respiratoire chez la souris.

It was shown in the laboratory that CCR5 density at the surface of primary CD4+ T cells strongly determines their R5 HIV-1 productive infectability. This is due to the fact that viral envelope - CCR5 interaction triggers signals that boost the viral life cycle. Our working hypothesis was that other G-protein coupled receptors (GPCR) co-expressed with CCR5 might also modulate HIV replicative cycle. To test this hypothesis, the GPCR coexpressed with CCR5 in CD4+ T cells have been identified, and the ability of the most highly expressed of them to dimerize with CCR5 and to interfere with the infection has been determined. During this thesis, I have initiated the study of two of these GPCR, EBI2 and A2A, and participated in the study of another one, S1P1.I have shown that the presence of EBI2 or A2A that each heterodimerize with CCR5, boosts the viral production in HOS and MT4 cells, similarly to S1P1. Analyzing the stages of HIV life cycle modified by the expression and triggering of these GPCR, I unveiled that the major effect was an increase in HIV genome transcription. Furthermore, we have shown that S1P1 signaling activates the transcription factor NFKB and thereby the HIV promoter. Moreover, triggering S1P1 in an in vitro model of HIV reservoir cells results in the reversion of the viral latency. These findings suggest that S1P1 agonists might be used as latency reversing agents to purge the HIV reservoir.; Mon laboratoire d’accueil avait montré que la densité de CCR5 à la surface des cellules cibles du VIH détermine très fortement leur infectabilité par les souches virales R5, et que les signaux d’activation cellulaire induits par la fixation virale et transitant par CCR5 favorisent une infection productive des cellules primaires. L’hypothèse de notre travail était que d’autres récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) exprimés dans les lymphocytes T CD4+ CCR5+ pourraient également influer sur le cycle de réplication des virus R5. Pour tester cette hypothèse, les RCPGs co-exprimés avec CCR5 dans les cellules T CD4+ ont été identifiés, puis la capacité des plus exprimés d’entre eux à s’hétérodimériser avec CCR5 et à perturber l’infection par le VIH a été déterminée. Au cours de cette thèse, j’ai initié l’étude de deux de ces récepteurs, EBI2 et A2A, et j'ai participé à l’étude d’un troisième, S1P1.J’ai montré que la présence d’EBI2 ou d’A2A qui chacun s’hétérodimérise avec CCR5, augmente la production virale dans des cellules HOS ou MT4, comme c’est le cas pour S1P1. Étudiant les changements au niveau des étapes du cycle viral provoqués par l’expression ou la stimulation de ces RCPGS, j’ai mis en évidence que le principal effet est une augmentation de la transcription virale. De plus, nous avons montré que la signalisation via S1P1 active le facteur de transcription NFKB et par là le promoteur du VIH. De plus, la stimulation de ce récepteur dans un modèle de cellules infectées de façon latente permet la réactivation du virus. Ce résultat ouvre la possibilité de tester la capacité d’agonistes de S1P1 à éliminer les cellules servant de réservoir chez les personnes vivant avec le VIH.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the abnormal accumulation of mature B lymphocytes. Current therapies for CLL rely on using kinase inhibitors targeting B-cell receptor (BCR) pathways, but they are limited by the high level of apoptosis-resistant B-CLL cells, which results in a high frequency of patient relapse. Because current therapies fail to eradicate these apoptosis-resistant cells, it is essential to identify alternative survival pathways as novel targets for anticancer therapies. Overexpression of cell-surface G protein-coupled receptors (GPCRs) drives cell transformation, and thus plays a critical role in malignancies. In this study, we show that neurotensin receptor 2 (NTSR2), a G-protein-coupled receptor, is an essential driver of apoptosis resistance in B-CLL. NTSR2 was highly expressed and constitutively active in B-CLL cells, and its activation depended on its interaction with the tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) and the recruitment of Gi proteins, instead of its interaction with its natural ligand, neurotensin (NTS). The NTSR2-TrkB interaction acted as a conditional oncogenic driver requiring the TrkB ligand BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor), which is highly expressed in B-CLL cells, unlike its natural ligand NTS. The NTSR2-TrkB interaction activates survival signaling pathways, including the Src and AKT kinase pathways, as well as expression of the anti-apoptotic proteins Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) and Bcl-xL (B-cell lymphoma-extra large). TrkB failed to protect B-CLL cells from a drastic decrease in viability via typical apoptotic cell death when NTSR2 was down-regulated. Taken together, the results suggest that the NTSR2-TrKB interaction and the sustained activation of signaling pathways reliant on this interaction constitute an essential driving force for apoptosis evasion of B-CLL cells. Targeting NTSR2 could represent a promising strategy for treating B-CLL malignancy., La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est caractérisée par une accumulation anormale de lymphocytes B matures. Les thérapies actuelles reposent sur l'utilisation d'inhibiteurs ciblant les kinases impliquées dans la voie du récepteur des cellules B (BCR), mais elles sont limitées par le niveau élevé de résistance à l’apoptose des cellules leucémiques. En effet, celles-ci échouent à éradiquer les cellules résistantes à l'apoptose, il est donc essentiel d'identifier d'autres voies de survie comme nouvelles cibles pour les thérapies anticancéreuses. La surexpression des récepteurs de surface couplés aux protéines G (RCPGs) entraîne une transformation cellulaire et joue ainsi un rôle essentiel dans les tumeurs malignes. Dans cette étude, nous montrons que le récepteur de la neurotensine de type 2 (NTSR2), un récepteur couplé aux protéines G, est un acteur essentiel dans les mécanismes de résistance à l'apoptose dans les cellules leucémiques. Le récepteur NTSR2 est surexprimé et constitutivement actif dans les cellules leucémiques, son activation dépend de son interaction avec le récepteur TrkB (Tropomyosin-related kinase B) et du recrutement des protéines Giα à la place de son interaction avec son ligand naturel, la neurotensine (NTS). L'interaction NTSR2-TrkB agit comme un oncogène conditionnel nécessitant le BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor), le ligand de TrkB, qui est fortement exprimé dans les cellules B leucémiques, contrairement à son ligand naturel la NTS. L'interaction NTSR2-TrkB active les voies de signalisation de survie, y compris les voies de Src et Akt, ainsi que l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) et Bcl-xL (B-cell lymphoma-extra large). Néanmoins le récepteur TrkB seul ne protège pas les cellules B leucémiques d'une diminution drastique de la viabilité par apoptose lorsque NTSR2 est inactivé. L’ensemble de ces résultats suggèrent que l'interaction NTSR2-TrKB et l'activation soutenue des voies de signalisation dépendante de cette interaction constituent un mécanisme essentiel d’échappement à l'apoptose des cellules B leucémiques. Le ciblage du récepteur NTSR2 représente une stratégie prometteuse pour le traitement de cette pathologie.

Sugar overconsumption is a risk factor for pathologies such as type II diabetes or obesity. Sweeteners consumption is used to overcome this public health issue. Indeed, they have low caloric value but still preserve the pleasure of sweet taste. Currently, number of sweeteners are commercially available, but they present a bitter aftertaste or there is a debate about their safety. One aim of this work was to propose new intense sweeteners using computational modeling strategies. Through a statistical approach to predict the sweetness based on the chemical structure of already known sweeteners, new natural compounds have been identified. Furthermore, the structural study of the homology model of the sweet taste receptor provides some clues to design new sweeteners. The molecular dynamic study of a class C G-protein coupled receptor gives the first molecular hypothesis of the activation process., La consommation excessive et chronique de sucre est un facteur de risque pour l'apparition de pathologies telles que le diabète de type II ou l'obésité. Une des solutions pour répondre à cet enjeu majeur de santé publique, tout en conservant le plaisir de la saveur sucrée, consiste en l'utilisation d'édulcorants en substitution du sucre. Actuellement, un certain nombre d'édulcorants sur le marché présentent arrière-goût amer ou sont sujets à débat quant à leurs effets sur la santé. Un des objectifs de ces travaux de thèse consiste à proposer de nouveaux édulcorants grâce à des approches rationnelles in silico. Un modèle statistique a été établi sur la base des structures chimiques et a permis d'identifier de nouveaux édulcorants d'origine naturelle. Ensuite, la reconstruction par homologie du récepteur à la saveur sucrée et l'étude des sites de liaison apportent des indices, à l'échelle atomique, qui permettront d'identifier ou même de concevoir de nouveaux édulcorants. L'étude dynamique d'un récepteur de la même famille (Récepteur Couplé aux Protéines G (RCPG) de classe C) a permis d'émettre une hypothèse sur le mécanisme d'activation, phénomène important pour la compréhension de la conversion du signal chimique en signal électrique.

Les opioïdes restent encore à l’heure actuelle les composés pharmacologiques les plus efficaces pour traiter les différentes formes de douleurs, et donc fournir une analgésie thérapeutique. Cependant, l’administration répétée de ces composés entraîne des effets secondaires majeurs comme la dépression respiratoire, la tolérance, mais également, il a été montré que certains de ces opioïdes pouvaient engendrer des états proépileptiques. D’un point de vue thérapeutique, il existe donc un réel besoin pour de nouveaux et meilleurs traitements analgésiques, n’élicitant pas ces effets secondaires. Notre laboratoire étudie la signalétique des récepteurs couplés aux protéines G comme les récepteurs opioïdes et leur capacité de sélectivité fonctionnelle depuis des années, et en particulier celle du récepteur delta opioïde (DOP). En effet, celui-ci présenterait moins d’effets indésirables que le récepteur mu opioïde (MOP) qui est la cible principale des opioïdes classiques comme la morphine. Cependant, il semblerait que le DOP justement soit à l’origine des états proépileptiques précédemment décrits. Ainsi malgré la promesse initiale des agonistes delta par rapport à la diminution des effets secondaires, les effets proépileptiques de certains ont notamment contribué à une baisse d’intérêt vers le DOP et aucun de ses agonistes n’a pu passer les phases de tests cliniques. Cependant, il a été démontré que certains agonistes delta n’entraînaient pas d’effet proépileptique; tandis que d’autres oui. Comment expliquer un tel phénomène ? Ceci est la question que pose la présente recherche. Ainsi notre objectif sera d’obtenir et de comparer les signatures pharmacologiques des agonistes connus pour être proépileptiques versus ceux qui ne le sont pas ; par rapport à la transduction de signal via le récepteur delta opioïde et sa protéine G hétérotrimérique ; et par rapport à un de ses effecteurs principaux pour l’analgésie, un canal potassique rectifiant entrant. Cette comparaison se fera selon les paramètres du modèle classique de la pharmacologie, comme l’efficacité et la puissance ; mais également avec un outil plus récent appelé modèle opérationnel, utilisant des paramètres comme l’affinité et le coefficient de transduction. Pour se faire, le transfert d'énergie par résonance de bioluminescence ou BRET sera utilisé afin de caractériser les différentes voies signalétiques impliquées. Cette recherche s’inscrit dans un vaste contexte de collaboration entre différents laboratoires, et au sein de chacun d’entre eux, dans l’espoir de pouvoir synthétiser un jour, de meilleurs composés pharmacologiques, capables de cibler uniquement les voies médiatrices des effets thérapeutiques voulus, ici l’analgésie ; sans éliciter celles entraînant les effets secondaires associés, ici, les états proconvulsifs. L’aboutissement de cette recherche permettrait donc d’impacter la vie de millions de gens en souffrance, et c’est pourquoi il nous semble plus qu’important de continuer à l’entreprendre., Opioids are still nowadays the most efficacious pharmacological compounds available to treat the different types of pain, and therefore provide a therapeutic analgesia. However, repeated administration of those compounds lead to major secondary effects like respiratory depression, tolerance, but also it was shown that some opioid compounds could induce seizures. From a therapeutical point of view, there is a serious need for new and better analgesic treatments that do not elicit such adverse effects. Our lab has been studying for years the signaletics of G-protein coupled receptors like the opioid receptors, and their capacity for functional selectivity, especially more recently the one of the delta opioid receptor (DOP). Indeed, this receptor elicits fewer adverse effects compared to the mu opioid receptor (MOP) that is the main target of all clinically used opioids such as morphine. However, it seems like the DOP itself would be responsible for the pro-epileptic states previously described. Thus, despite initial promises of the delta agonists towards reducing adverse effects whilst providing analgesia, the pro-convulsive effects that some seem to elicit have induced a loss of interest towards the DOP, and so far none of its agonists have gone further than pre-clinical trials. However, it has been shown that not all of those DOP agonists had those pro-convulsive adverse effects. How to explain such a phenomenon? This is the question which the present research will be asking. Thus our goal is to obtain and compare pharmacological signatures of the agonists known for being pro-convulsive versus those that are not ; regarding the transduction of signals through the delta opioid receptor and its heterotrimeric G-Protein ; and also regarding one of its main effectors to induce analgesia, an inwardly rectifying potassium channel. This comparison will be done according to the classical parameters of pharmacology, such as efficacy and potency ; but also according to the newest operational model, with parameters such as affinity and transduction coefficients. In order to do so, bioluminescence resonance energy transfer or BRET, will be used in order to characterize and quantify the signalling pathways there implicated. This research is embedded in a vast collaboration context, in between laboratories around the world, and within those laboratories as well, in hope to be able to one day synthesize, better pharmacological compounds, capable of targeting only the pathways responsible for the desired effects, here analgesia ; without triggering the associated adverse effects, here pro-convulsive states. The culmination of this research could allow to impact the lives of millions of people throughout the world, and this is why it is more than important for us to keep on pursuing it.

The SID methodology, for Stable Isotope Dilution, is a widely applied methodology for peptides and proteins analysis in mass spectrometry, usually associated with atmospheric pressure ionisation techniques. This thesis is consequently devoted to the application of SID methodology in matrix assisted laser desorption/ionisation (MALDI) mass spectrometry to quantify receptor/ligand interaction in pharmacology. Indeed, a great number of pathologies involve membrane receptors like G protein coupled receptors (GPCR) in interaction with several ligands, frequently peptides. Particularly, the V1A receptor, is related to vasoconstriction activity of the peptide hormone AVP (arginine vasopressine) and contraction of muscular cells as well as many social behaviors. This receptor was chosen as model, requiring the chemical labelling of the ligand Homo-HO-LVA (Hydroxy Linear Vasopressin Antagonist), selected for its high affinity towards the V1A receptor in order to introduce the entity on which relies the quantification in SID/MALDI. This methodology is applied through the covalent binding of HCCA (4-hydroxy-α-cyanocinnamic acid) matrix, usually encountered in peptide analysis, to obtain the modified peptide (JMV4854) through N-terminal acylation. The objective is to take advantage of the use of both HCCA tagging and HCCE (4-hydroxy-α-cinnamic methyl ester) matrix for the specific and sensitive detection of compounds down to picomolar concentrations. Importantly, quantification with SID requires a calibration protocol and a statistical validation before pharmacological assays. This consists in the measurement of JMV4854 affinity towards V1A-R through thermodynamic experiments in order to quantify the dissociation constant (Kd) and determine afterwards constants for untagged molecules by competitive binding assays. Furthermore, a second receptor model, CCKB-R (cholecystokinine B receptor), was then studied to validate the quantification methodology. Facing the renewed interest in pharmaceutic industry of kinetic experiments for dissociation constant measurement, it would be interesting to apply this new methodology to drug discovery, representing a relevant alternative to current “gold-standard” methodologies such as radioactivity and fluorescence. A second field of research has been initiated with a covalent labelling designed to enhance peptide fragmentation for electrospray-based (ESI-MS/MS) tandem mass spectrometry measurements. Preliminary studies with the synthesis of pre-formed ions like N-terminal substitution with pyridinium entities gave very promising results opening the way of other quantification strategies.; La dilution isotopique, SID pour « Stable Isotope Dilution », est une méthode largement utilisée pour la quantification de peptides et protéines en spectrométrie de masse, généralement associée aux techniques d’ionisation ambiante. Les travaux de cette thèse sont donc consacrés à l’application de la méthodologie de la dilution isotopique (SID) en spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par une matrice (MALDI) pour la mesure d’interaction récepteur/ligand en pharmacologie. En effet, un nombre important de pathologies mettent en jeu des récepteurs membranaires tels que les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) en interaction avec différents ligands, souvent peptidiques. En particulier, le récepteur V1A est impliqué dans l’activité vasoconstrictrice de l’hormone peptidique AVP (Arginine VasoPressine) et la contraction de cellules musculaires ainsi que dans certains comportements sociaux. Ce récepteur a été choisi comme modèle d’étude nécessitant le marquage par voie chimique du ligand Homo-HO-LVA (pour « Hydroxy Linear Vasopressin Antagonist »), sélectionné pour sa forte affinité envers le récepteur V1A afin d’introduire l’entité permettant le dosage en SID/MALDI. Cette méthodologie est mise en œuvre via la génération d’une liaison covalente de la matrice HCCA (4-hydroxy-α-cyanocinnamic acid), couramment utilisée pour l’analyse peptidique pour obtenir le peptide modifié (JMV4854) par acylation en position N-terminale. Le but est alors de tirer profit de l’utilisation conjointe de ce marquage et de la matrice neutre HCCE (4-hydroxy-α-cyanocinnamate de méthyle) pour la détection spécifique et sensible de composés jusqu’à des concentrations picomolaires. L’étape stratégique de quantification par dilution isotopique nécessite un étalonnage et une validation statistique avant de pouvoir passer à l’application pharmacologique. Celle-ci consiste à mesurer l’affinité du JMV4854 pour le récepteur V1A par des expériences thermodynamiques de mesure de constantes de dissociation (Kd) afin de déterminer par la suite des constantes de dissociation de molécules non marquées via des expériences de compétition. Un second modèle de récepteur, le CCKB-R (cholecystokinine B receptor), a ensuite été étudié pour valider la méthodologie de quantification. Devant le regain d’intérêt des laboratoires pharmaceutiques pour les expériences cinétiques de mesure de constantes de dissociation, il serait intéressant d’y appliquer cette méthodologie. Celle-ci présente un potentiel intéressant en tant qu’alternative aux méthodologies actuellement incontournables que sont la radioactivité et la fluorescence. Un second d’axe d’étude a été initié avec un marquage conçu pour diriger la fragmentation de peptides pour des mesures en spectrométrie de masse en tandem par ionisation Electrospray (ESI-MS/MS). Des modifications par introduction en position N-terminale des peptides d’une charge fixe ont été envisagées. Des études préliminaires (synthèse d’ions préformés par incorporation d’une entité pyridinium) ont montré un comportement prometteur en fragmentation ouvrant de nouvelles perspectives de quantification.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) démontrent de plus en plus de capacités à activer des mécanismes jusqu’alors associés à des facteurs de transcription ou des molécules d’adhésion. En effet, de nouvelles preuves rapportent qu’ils pourraient également participer au guidage axonal qui est le mécanisme permettant aux axones de cellules nerveuses de rejoindre leur cible anatomique. Le guidage axonal se fait par l’interaction entre les molécules de guidage et une structure particulière présente à l’extrémité de l’axone, le cône de croissance. Par exemple, les RCPGs participent au guidage des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), dont les axones s’étendent de la rétine jusqu’au noyaux cérébraux associés à la vision. Cet effet est observé avec des RCPGs tels que les récepteurs aux cannabinoïdes (CB1 et CB2) et celui du lysophosphatidylinositol, le GPR55. Les RCPGs GPR91 et GPRG99, respectivement récepteurs au succinate et à l’α-cétoglutarate, se trouvent à la surface de ces CGRs, ce qui en font des candidats potentiels pouvant participer au guidage axonal. Dans ce mémoire, l’effet des ligands de ces récepteurs sur la croissance et la navigation des axones des CGRs fut analysé. L’impact produit par ces récepteurs ainsi que leurs ligands sur la morphologie des cônes de croissance fut déterminé en mesurant leur taille et le nombre de filopodes présents sur ces cônes. Pour évaluer le rôle du succinate et de l’a-cétoglutarate sur la croissance globale des axones de CGRs, la longueur totale des projections axonales d’explants rétiniens a été mesurée. L’effet de ces ligands des récepteurs GPR91 et GPR99 sur le guidage axonal a également été évalué en temps réel à l’aide d’un gradient créé par un micro injecteur placé à 45° et à 100µm du cône de croissance. La distribution in vivo des récepteurs GPR91 et GPR99 sur la rétine a été étudié à l’aide d’expériences d’immunohistochimie. Les résultats obtenus indiquent que l’ajout de 100µM de succinate produit une augmentation de la taille des cônes de croissance et du nombre de filopodes présents à leur surface. Il augmente également la croissance des axones. Ce type de réponse fut également observé lorsque les cellules furent soumises à 200µM d’α-cétoglutarate. Fait à noter, les deux récepteurs n’ont pas d’impact sur le guidage axonal. Ces résultats indiquent donc que les agonistes des récepteurs GPR91 et GPR99 augmentent la croissance des cellules ganglionnaires lorsqu’ils sont présents lors du développement. Par contre, ils n’ont pas d’influence sur la direction prise par les cônes de croissance. Ces nouvelles données sont un pas de plus dans la compréhension des mécanismes qui gèrent et participent au développement et la croissance des CGRs, ce qui pourrait donner de nouvelles cibles thérapeutique pouvant mener à la régénération de nerfs optiques endommagés., G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) show a greater role in activating mechanism usually associated to transcription factors or cell adhesion molecules. New evidence shows that some of these receptors have an impact on axon guidance, the mechanism by which neurons’ axons are able to grow from their origin and reach their anatomical target. Guidance is mediated via a structure at the tip of the axon called the growth cone, which can interact with surrounding molecules. Axons from retinal ganglion cells (RCGs) navigating from the retina to the cerebral nuclei associated with vision, are sensitive to some of the GPCR ligands. These GPCRs are the cannabinoid receptors CB1 and CB2 and the GPR55, a receptor for lysophosphatidylinositol. GPR91 and GPR99, respectively receptors for succinate and α-ketoglutarate, are expressed in RGCs making them prime candidates to have an impact on axon guidance. In this thesis, we will test the role of GPR91 and GPR99 ligands on RCG axon growth and guidance. To assess the impact of these receptors and their ligands on axon growth and guidance, first we evaluated their effects on growth cone morphology. To achieve this, we measured growth cone size and filopodia numbers, when exposed to 100 µM of succinate or 200µM of α-ketoglutarate. The effects of these ligands on axon growth were evaluated by measuring the total axon outgrowth from retinal explants. The role of GPR91 and GPR99 on growth cone turning, was determined by exposing a growing axon to a gradient of these ligands, originating from a micropipette situated 100 µm and 45° from the growth cone. The expression of these receptors in the retina was evaluated using immunohistochemistry. Results showed that the addition of 100 µM succinate induced an increase in both growth cone size and filopodia number. It also increased total axon growth. α-ketoglutarate, at a concentration of 200 µM, produced similar results. Noteworthy, both ligands had no effect on growth cone turning. In brief, these results indicate that GPR91 and GPR99 agonists induce an increase in RGC growth when present during development. They, however, have no effects on RGC growth cone turning. These new data provide a better understanding of the mechanisms controlling RGC development.

Heart failure is a public health problem with 1 million patients this year in France. This pathology is defined inability to heart pump sufficiently to maintain blood flow to meet the body's needs. This decrease is explicated by the loss of contractile function of the heart, caused by the necrosis of the contractile cells: cardiomyocytes. In this study, I was able to study the topographic and biomechanical modification of the cardiomyocyte membrane upstream of its rupture during necrosis, by technology derived from nanosciences : atomic force microscopy (AFM). My work reveals a highly structured membrane in healthy cardiomyocytes and a loss of this architecture in an early stage of the heart failure installation. In a second study I was interested in the oligomeric organization of a transmembrane receptors family , G protein-coupled receptors. These proteins are a privileged target for the pharmacological treatments on heart failure such as beta- Blockers and vasodilators. This oligomerization mechanism could be the key to the side effects associated with treatments. In order to study the oligomeric conformation, I used single molecule force spectroscopy and I reveal different oligomeric populations of these receptors on the membrane. The results showed a oligomeric populations distribution according the conditions (plasmid density coding for receptors / stimulation with synthetic or natural agonist). It is possible that there is a regulation of the signaling pathways, using the oligomerization for specific activation receptors. The possible difference in activity of each oligomeric population (monomer / dimer / tetramer / hexamer) appears to be a plausible explanation for the side effects of pharmacological agents. My thesis work allowed the discovery of a new track by an innovative technology, atomic force microscopy, in the treatment of heart failure.; L'insuffisance cardiaque est un réel problème de santé publique avec 1 millions de patients souffrant de cette pathologie cette année en France. Elle est définie incapacité de fournir un débit sanguin suffisant à l'organisme. Cette diminution de débit est traduite par la perte de fonction contractile du coeur provoqué par la nécrose des cellules responsable de cette fonction : les cardiomyocytes. Dans cette étude j'ai pu étudier les modifications topographiques et biomécaniques de la membrane du cardiomyocyte vivant en amont de sa rupture lors de la nécrose, par une technologie issue des nanosciences : la microscopie à force atomique (AFM). Mes travaux ont fait apparaitre une membrane très structurée chez le cardiomyocyte sain et une perte de cette architecture dans un temps précoce de l'installation de l'insuffisance cardiaque. L'utilisation de la microscopie électronique à transmission à montrer que les anomalies mises en évidences par AFM ont pour origine un réarrangement mitochondriale. Dans une seconde étude je me suis intéressée à l'organisation oligomérique d'une famille particulière de récepteur transmembranaire, les récepteurs couplés aux protéines G. Ces protéines sont une des cibles privilégiées pour les traitements pharmacologiques de l'insuffisance cardiaque tel que le bêta-bloquants et les vasodilatateurs. Ce mécanisme d'oligomérisation pourrait être la clef des effets secondaires liés à ces traitements. Afin d'étudier la conformation oligomérique, j'ai utilisé la spectroscopie de force à l'échelle de la molécule unique pour mettre en évidence différentes populations oligomérique de ces récepteurs sur la surface membranaire. Les résultats ont montré une distribution des populations oligomériques en fonction des conditions (densité de plasmide codants pour les récepteurs/stimulation avec agoniste synthétique ou naturel). Il est possible qu'il y ait une régulation des voies de signalisations par l'oligomérisation des récepteurs activés. La différence d'activité possible de chaque population oligomérique (monomère/dimère/tétramère/hexamère) semble être une explication plausible aux effets secondaire des agents pharmacologique. Mes travaux de thèse ont permis la mise en évidence de nouvelle piste par une technologie innovante, la microscopie à force atomique, dans le traitement de l'insuffisance cardiaqu