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Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias Os tumores mamários são a neoplasia mais frequente que afecta cadelas adultas. O seu diagnóstico é dificultado pela grande diversidade a nível clínico e histológico. O comportamento tumoral é muitas vezes imprevisível, devido à não existência de um comportamento padrão, associado ao tipo histológico diagnosticado. Os estudos de prognóstico são importantes, pela necessidade em melhorar o conhecimento acerca do valor prognóstico de certas características clinicopatológicas, assim como pela necessidade em investigar novos parâmetros, que possam estar relacionados com a sobrevida livre de doença (SLD) e a sobrevida total (ST). A quimioterapia clássica nem sempre é a melhor opção de tratamento para tumores de mama metastásicos. A procura de novos factores de prognóstico, que possam ser usados como potenciais alvos terapêuticos (e num futuro próximo como potenciais modalidades terapêuticas), é um assunto de extremo interesse. O objectivo fundamental da investigação apresentada nesta tese, foi a aquisição de conhecimento actualizado acerca de alguns aspectos clinicopatológicos clássicos, assim como de novos factores biológicos, potencialmente úteis como alvos terapêuticos. Capítulo 1 – Introdução geral Este capítulo está dividido em dois subcapítulos: - Introdução, com uma revisão actualizada acerca da etiologia e prognóstico dos tumores mamários da cadela. Também se fez a revisão do estado de conhecimento actual acerca das novas variáveis analisadas neste trabalho: Ciclooxigenases (um e dois); Prolactina; Hormona do Crescimento e Factor I de Crescimento Tipo insulina. - Objectivos Capítulo 2 – Expressão imunohistoquímica de Cox-1 e Cox-2 A expressão de Cox-1 e Cox-2 foi avaliada, através de métodos imunohistoquímicos, em 66 lesões mamárias e em 4 amostras de glândula mamária normal, usadas como controlo. A expressão de Cox-1 foi detectada em todas as lesões mamárias (benignas e malignas) e na glândula mamária normal. A expressão de Cox-2 foi detectada em todas as lesões mamárias, excepto nas lesões de hiperplasia ductal. A glândula mamária normal mostrou imunorreactividade focal para a Cox-2 em 2 de 4 casos. A imunoexpressão de Cox-1 foi semelhante entre tumores benignos e malignos (p=0,227). A imunoexpressão de Cox-2 foi significativamente superior nas lesões malignas comparativamente às benignas (p

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária A cistite idiopática felina (CIF) é a causa mais comum da doença do trato urinário inferior felino (DTUIF), a qual constitui um importante problema na medicina felina. Apesar dos inúmeros estudos efetuados, a etiopatogenia da CIF não é totalmente conhecida, pelo que ainda não existe um tratamento padrão amplamente aceite e eficaz no controlo das recorrências desta doença. Neste estudo, o qual decorreu entre 1 de janeiro de 2015 e 31 de julho de 2016 pretendeu-se efetuar uma revisão bibliográfica da CIF, bem como a caraterização epidemiológica e clínica dos gatos com CIF. Durante este período foram analisados 40 gatos com DTUIF. Destes, 26 (65%) apresentavam CIF, 6 (15%) tampão uretral, 5 (12%) urolitíase, 2 (5%) infeção do trato urinário (ITU) e 1 (3%) atonia vesical. Para efetuar a caraterização epidemiológica e clínica dos gatos com CIF (grupo-alvo), recolheu-se a informação relativa à raça, idade, género, estado reprodutivo, peso, condição corporal, temperamento, estilo de vida, convívio com outros animais, tipo de dieta, exposição a fatores de stresse, época sazonal do aparecimento dos sinais clínicos, historial clínico da doença, sinais clínicos, resultados dos exames complementares de diagnóstico, diagnóstico final, tratamento prescrito e evolução clínica de cada caso. Os resultados desta análise encontram-se de acordo com o descrito em vários estudos, à exceção do temperamento dos gatos, pois neste estudo, contrariamente ao descrito, verificou-se uma percentagem elevada de gatos meigos. Do total da amostra de gatos com CIF (26 gatos), a 10 (38%) institui-se um tratamento nutricional com uma ração terapêutica (Hill’s c/d Feline Urinary Stress), 2 (20%) destes gatos apresentaram recorrência da doença. A 8 (31%) gatos recomendou-se um tratamento médico com amitriptilina, dos quais 2 (25%) recidivaram. A 5 (19%) gatos prescreveu-se um tratamento nutricional com uma ração terapêutica (Hill’s c/d Feline Urinary Stress) e um suplemento nutricional (Cystaid Plus). Destes, 2 (40%) gatos apresentaram um novo episódio da CIF e a 3 (12%) gatos, institui-se um tratamento com o suplemento nutricional (Calmurofel), dos quais 1 (33%) recidivou. A análise dos resultados parece indicar que a ração Hill’s c/d Feline Urinary Stress e o suplemento Calmurofel apresentam um efeito positivo no controlo da CIF. No entanto serão necessários estudos randomizados com um maior número de casos para clarificar os nossos resultados. Feline idiopathic cystitis (FIC) is the most common cause of feline lower urinary tract disease (FLUTD), which is a major problem in feline medicine. Despite many studies performed, the etiopathogenesis of FIC is still not fully known and there’s still no widely accepted and effective standard treatment in controlling recurrences of this disease. In this study, which took place between 1 January 2015 and 31 July 2016, was performed a intented to make a literature review of FIC, as well as epidemiological and clinical characterization of the cats with FIC. During this period, 40 cats with FLUTD were analysed. Of these, 26 (65%) were diagnosed with FIC, 6 (15%) with urethral plugs, 5 (12%) with urolithiasis, 2 (5%) with urinary tract infection and 1 (3%) with atonic bladder. For epidemiological and clinical characterization of cats with FIC (target group), information concerning breed, age, gender, reproductive status, weight, body condition, temper, lifestyle, living with others animals, type of diet, exposure to stressors, seasonal time of onset of clinical signs, clinical history of disease, clinical signs, results of diagnostic tests, prescribed treatment, diagnosis and clinical evolution of each cat, it was collected. The results of this analysis are in accordance with described in several studies, except for temper of the cats. Opposed to the described on the literature, a high percentage of kind cats was found in the present study. From the total sample of cats with FIC (26 cats), a nutritional treatment with therapeutic food (Hill’s c/d Feline urinary stress) was instituted in 10 (38%) cats of which 2 (20%) had recurrence of disease. A medical treatment with amitriptyline was recommended in 8 (31%) cats of which 2 (25%) relapsed. A nutritional treatment with therapeutic food (Hill’s c/d Feline urinary stress) and a nutritional supplement (Cystaid Plus) was prescribed in 5 (19%) cats. Of these, 2 (40%) had a new episode of FIC and a treatment with nutritional supplement (calmurofel) was instituted in 3 (12%) cats of which 1 (33%) relapsed. The analysis of the results seems to indicate that the therapeutic food Hill’s c/d Feline Urinary Stress and the nutritional supplement Calmurofel might have a positive effect on FIC control. However randomized studies will be necessary to confirm our results.

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial O cancro do ovário apresenta maior taxa de mortalidade entre o grupo de neoplasias invasivas do aparelho genital feminino. Os ovários apresentam uma elevada heterogeneidade a nível celular, sendo o tecido epitelial o de maior relevância neste estudo dado os biomarcadores apresentarem especificidade para este tecido. O risco de aparecimento desta patologia é influenciada pelo período pré ou pós menopausa tal como por outros fatores etiológicos. Os biomarcadores são largamente utilizados tanto no diagnóstico como monotorização do cancro do ovário, salientando-se neste estudo o antigénio cancerígeno 125 (CA 125) e a proteína humana epididimal 4 (HE4). Sendo o CA 125 amplamente utilizado na rotina clínica e o HE4 apresentar um caracter inovador dado, ser um marcador mais recente e apresentar mais sensibilidade para esta patologia do que o CA 125, principalmente perante cancro do ovário numa fase inicial. O Risk of Ovarian Malignancy Algorithm (ROMA), correlaciona as concentrações séricas dos dois biomarcadores anteriores (HE4 e CA 125) tendo em conta a fase pré e pós menopausa. Este algoritmo apresenta uma maior especificidade e sensibilidade para o cancro do ovário do que aquando a utilização dos dois biomarcadores isolados. O objetivo de estudo foi a quantificação sérica dos biomarcadores HE4 e o CA 125 tal como o algoritmo de ROMA (algoritmo do risco de cancro do ovário) em 259 pacientes todas elas do sexo feminino, provenientes de três unidades hospitalares diferentes (Chaves, Lamego e Vila Real), através da técnica de electroquimioluminescência operada pelo analisador Cobas® série 6000 (do fabricante ROCHE) para posterior comparação dos biomarcadores mais o algoritmo ROMA em relação a maior sensibilidade e especificidade para diagnóstico desta patologia. O CA 125 e o HE4 tem um valor de referência para níveis séricos normais de ≤ 35 U/ml e ≤ 140pmol/L, respetivamente. No ROMA, para pré-menopausa considera-se como valor corte na identificação do risco associado o valor de 11,4% (alto risco ≥ 11,4%), na pós-menopausa esse valor de corte será de 29,9% (alto risco ≥ 29,9%). Obtiveram-se 24 pacientes com cancro do ovário (9,3%) sendo que, a maioria dos pacientes em estudo pertencem à unidade de Vila Real (60,2%). Tendo em conta a capacidade de diagnóstico da doença verificou-se que para os pacientes em geral e na fase de pré-menopausa o parâmetro mais sensível foi o algoritmo ROMA e mais específico o HE4. Em relação a fase pós-menopausa o mais sensível e específico foi o algoritmo ROMA e o CA 125, respetivamente. Concluindo-se que o algoritmo ROMA é o parâmetro mais aconselhado para diagnóstico de cancro do ovário, tal como referido por outros autores. Ovarian cancer has a higher mortality rate among the group of invasive cancers of the genital female apparatus. The ovaries have a high cellular heterogeneity, being the epithelial tissue the more relevant because the tumor markers are specific for this tissue. The risk of appearance of this pathology is influenced by pre or postmenopausal status such as other etiological factors. Biomarkers are widely used in the diagnosis and monitoring of ovarian cancer, with emphasis on cancer antigen 125 (CA 125) and human epididymis protein 4 (HE4). CA 125 is widely used in the clinical routine and HE4 is a novel marker because is a more recent marker and more sensitive to this pathology than CA 125 alone, especially in the early stages of ovarian cancer. The Risk of Ovarian Malignancy Algorithm (ROMA) correlates the serum concentrations of the two previous biomarkers (HE4 and CA125) taking into account the pre and postmenopausal phase. This algorithm presents a greater specificity and sensitivity for ovarian cancer than when using the two biomarkers isolated. The aim of the study was the serum quantification of HE4, CA 125 and ROMA algorithm in 259 patients, all of them female, from three different hospitals (Chaves, Lamego and Vila Real). The technique applied was electrochemiluminescence, operated by the Cobas® 6000 series analyzer (from ROCHE manufacturer) for comparison of the biomarkers and the ROMA algorithm in relation to higher sensitivity and specificity for diagnosis of this pathology. CA 125 and HE4 have a reference value for normal serum levels of ≤ 35 U / ml and ≤ 140pmol / L, respectively. In ROMA for premenopausal status it is considered as the cutoff value 11,4% (high risk ≥ 11,4%), for postmenopausal this cutoff value will be of 29,9% (high risk ≥ 29,9%). We obtained 24 patients with ovarian cancer (9,3%). The higher number of patients belongs to Vila Real hospital (60,2%). Our results reveled that for patients in general, and in pre-menopausal status the most sensitive parameter was ROME algorithm and more specific was the tumor marker HE4. For the post-menopause status the most sensitive and specificity marker was ROME algorithm and CA 125, respectively. In conclusion, ROME algorithm is the most desirable parameter for the diagnosis of ovarian cancer, as referred by others.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária Ainda muito pouca informação existe no que diz respeito aos processos de resistência à quimioterapia em medicina veterinária, e principalmente em gatas, sendo que os tumores mamários estão entre os tumores mais comuns e mais imprevisíveis ao tratamento e poderão fornecer-nos dados oncológicos de grande importância, principalmente no que diz respeito aos processos de resistência à quimioterapia e aos fatores de prognóstico, devido à sua heterogeneidade dentro do processo de carcinogénese. Como tal, o objetivo deste estudo foi precisamente analisar as características clinocopatológicas e imunoexpressão de proteínas frequentemente associadas a processos de multiresistência à quimioterapia e para isso recorremos à imunohistoquímica de forma a quantificar a expressão das proteínas glicoproteína P, LRP (em inglês Lung Resistance Protein), Metalotioneína e BCRP (em inglês breast cancer resistance protein) em 24 amostras de tumores mamários de gata. Os resultados deste estudo revelaram que a maioria das gatas (76,7%) eram Europeus comuns, e as restantes 23,3% pertenciam à raça siamesa. A média de idades em que foi diagnosticado o tumor de mama foi aos 11 anos, com uma média de 1,33 tumores por animal. Em todos os tumores analisados foi detetada expressão de pelo menos um dos marcadores (100%), e em 33,3 % dos tumores foi detetada expressão dos 4 marcadores analisados simultaneamente. Foram encontradas relações estatisticamente significativas entre a expressão da glicoproteína P e o tipo histológico (p=0,019), onde detetámos que os carcinomas sólidos e criviformes estão geralmente associados a maiores scores de expressão desta proteína. Encontrámos também associação entre a expressão da LRP e o índice mitótico (p

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária A proteinuria consiste na presença de quantidades elevadas de proteína na urina, e pode ter causas renais ou extra-renais. Em gatos, a proteinuria devida a causas renais é considerada um fator de mau prognóstico, associado a um aumento da morbilidade e da mortalidade quer em doenças renais quer em doenças não renais. Assim, é considerada um biomarcador importante em diversas doenças felinas. O linfoma é uma das neoplasias mais comuns em gatos. Um estudo recente provou que a proteinuria de magnitude moderada é frequente em cães com linfoma. No entanto, que tenhamos conhecimento, não existe informação relativa a avaliação da proteinuria no linfoma felino. Os principais objetivos deste estudo consistiram na avaliação da ocorrência de proteinuria no linfoma felino, e na determinação da magnitude da proteinuria em gatos com linfoma. Para tal compararam-se os dados de medições de rácios proteína:creatinina na urina (UPC) entre três grupos de gatos (n=26): i) animais com linfoma (n=10), ii) animais com outras neoplasias (n=10) e iii) animais saudáveis (grupo de controlo, n=6). Os gatos com linfoma apresentaram valores de rácio UPC significativamente superiores aos gatos do grupo controlo (p=0.027). Não foram encontradas diferenças com significância estatística nos valores de rácio UPC entre o grupo de animais com outras neoplasias e o grupo controlo, nem entre o grupo de animais com linfoma e o grupo de animais com outras neoplasias. Na maioria dos gatos com linfoma que apresentavam proteinuria, esta era de baixa magnitude (valores de rácio UPC entre 0,2 e 0,4). Os resultados obtidos sugerem que, em gatos, o linfoma está associado ao desenvolvimento de proteinuria de baixa magnitude. Para além disso, apontam para a necessidade da realização de novos estudos, com um maior número de casos, de forma a esclarecer qual o significado clínico da proteinuria em gatos com linfoma. Proteinuria consists in the presence of abnormal quantities of protein in the urine, which can be due to renal or extra-renal causes. In cats, proteinuria of renal origin is considered an indicator of poor prognosis, and is associated with an increased morbidity and mortality, both in renal and non-renal diseases. Consequently, proteinuria is considered an important biomarker in various feline diseases. Lymphoma is one of the most frequent neoplasias in cats. An increased incidence of proteinuria of moderate magnitude was recently reported in dogs with lymphoma. However, information about proteinuria in feline lymphoma is lacking. The main objectives of this study were to evaluate the occurrence of proteinuria in feline lymphoma, and to access the magnitude of proteinuria in cats with lymphoma. The urine protein:creatinine (UPC) ratio was measured in three groups of cats (n=26): i) cats with lymphoma (n=10), ii) cats with other types of neoplasias (n=10) and iii) apparently healthy cats (control goup, n=6). Cats with lymphoma had significantly higher values of UPC ratio than cats of the control group. No significant differences were found between the group of cats with other types of neoplasias and the control group, nor between the group of cats with lymphoma and cats with other types of neoplasias. Moreover, the proteinuria detected in the cats of the lymphoma group was of low magnitude in most cases (UPC ratio values between 0,2 and 0,4). These results suggest that proteinuria of low magnitude is frequent in cats with lymphoma. However, further studies with a larger number of cases are needed in order to clarify the clinical significance of proteinuria in cats with lymphoma.

Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica Os sarcomas felinos associados ao local de injeção (SFALI) são tumores que ocorrem em locais onde previamente foi efetuada administração medicamentosa ou vacinal. Esta neoplasia tem um elevado grau de recorrência, e apesar da existência de vários tratamentos, a taxa de sucesso terapêutico é relativamente baixa. Para além disso, os estudos existentes acerca destes tumores são escassos. Assim, torna-se necessário a realização de mais estudos com vista a encontrar potenciais alvos terapêuticos no tratamento dos SFALI. Neste trabalho, foram determinadas as expressões de Cox-2 e Ki-67 em 58 tumores, pela técnica de imunohistoquímica. Os tumores foram classificados em três graus histológicos de malignidade (GHM), tendo em conta a sua diferenciação, a presença e extensão da necrose e o índice mitótico. Outras características histopatológicas, como a presença de células gigantes e o infiltrado inflamatório linfoide foram igualmente avaliados. A expressão da Cox-2 foi avaliada através de um método semi-quantitativo, sendo considerada positiva quando mais de 10% das células tumorais apresentavam marcação positiva, independentemente da intensidade de marcação. No caso do Ki-67, a avaliação foi realizada através de um método quantitativo, determinando-se a fração de núcleos positivos num total de pelo menos 1000 células tumorais, contabilizadas em 8 a 10 campos. Quarenta e oito tumores (72%) apresentavam positividade para a Cox-2 e 28% não expressavam esta enzima (n=16). A positividade à Cox-2 apresentou associação ao grau histológico de malignidade, estando presente principalmente em tumores com GHM III (p=0.011), à presença de necrose (p=0.043) e à diferenciação, sendo os tumores menos diferenciados os mais frequentemente positivos (p=0.013). Não houve associação com a presença de células gigantes nem com o infiltrado inflamatório linfoide ou com o índice mitótico. A expressão do Ki-67 foi mais elevada em tumores com GHM II e III (p=0.032). Não houve associação com qualquer outro parâmetro histológico estudado. Assim, este estudo demonstrou expressão da Cox-2 num número considerável de casos de sarcomas associados ao local de injeção e sugere que inibidores seletivos de Cox-2 devem ser utlizados como adjuvante de tratamentos multimodais no tratamento destes tumores. Em relação ao Ki-67, este parece estar associado a uma maior agressividade tumoral, mas a sua utilização como alvo terapêutico necessita de mais estudos. Feline injection site sarcomas (FISS) are tumours that occur in places where it was previously conducted vaccine or drug administration. This neoplasia has a high degree of recurrence, and despite of the existence of several treatments, the treatment success rate is relatively low. In addition, existing studies on these tumours are scarce. Thus, it becomes necessary to carry out more studies to find potential therapeutic targets in the treatment of FISS. In this study, expression of Cox-2 and Ki-67 was determined in 58 tumours by immunohistochemistry. Tumours were classified into three degrees of histological malignancy (HGM), taking into account their differentiation, the presence and extent of necrosis and mitotic index. Other histopathological features such as the presence of giant cells and lymphocytic inflammatory infiltration were also evaluated. Cox-2 expression was measured using a semi-quantitative method and labelling was considered positive when more than 10% of tumour cells showed positive staining, regardless the staining intensity. In Ki-67 evaluation was realized by a quantitative method. Positive nuclei fractions were counted in a total of at least 1000 tumour cells in 8 to 10 fields. Forty eight tumours (72%) showed positivity for Cox-2 expression and 28% did not express this enzyme (n = 16). Cox-2 positivity was associated with the histological grade of malignancy and was present mainly in tumours with HGM III (p = 0.011), with necrosis (p = 0.043) and with differentiation, with less differentiation tumours being more frequently positive (p = 0.013). There was no association with the presence of giant cells neither with lymphocytic inflammatory infiltrate or mitotic index. Ki-67 expression was higher in tumours with HGM II and III (p = 0.032). There was no association with any other histological parameters studied. Therefore, this study has demonstrated Cox-2 expression in a considerable number of cases of feline injection site sarcoma, and suggests that Cox-2 selective inhibitors should be evaluated as an adjuvant in multimodal treatments of these tumours. Regarding to Ki-67, it appears to be associated with increased tumour aggressiveness, but its use as a therapeutic target needs further studies.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária O principal objetivo do estudo apresentado nesta dissertação de mestrado é a perceção e avaliação da importância dos vários meios de diagnóstico e sua interpretação conjunta para a correta diferenciação do tipo de tumor adrenal e, por conseguinte, estabelecimento do tratamento mais adequado. Assim, faz parte do presente trabalho uma revisão atualizada do tema e um estudo retrospetivo de quatro casos clínicos de diferentes tipos de tumor adrenal no cão. Dos quatro casos clínicos em estudo, três são referentes a um tumor adrenocortical, sendo um deles um tumor não funcional, e um referente a um tumor da medula adrenal. Cada um tem a capacidade de produzir uma doença endócrina, a qual está diretamente relacionada com o tipo de hormonas adrenais produzidas pelo tumor. Desta forma, um dos animais apresenta hiperadrenocorticismo adrenal, outro hiperaldosteronismo primário (tumor conhecido por aldosteronoma) e outro doença provocada pelo excesso de catecolamina (tumor conhecido por feocromocitoma); sendo o quarto animal assintomático. Não é apresentado nenhum caso de tumor produtor de hormonas sexuais, dada a inexistência de reportório de casos com este diagnóstico no Hospital Clínico Veterinario (onde foi realizado o estágio), muito provavelmente por ser subdiagnosticado. Desta forma, são abordadas quatro etiologias, quatro abordagens diagnósticas e quatro terapêuticas diferentes. O diagnóstico foi e deve ser baseado na história, exame físico e alterações bioquímicas, e confirmado através de técnicas de imagem, provas endócrinas e (se necessário) citologia. Como qualquer outra neoplasia, o tumor pode ainda ser classificado, quanto à sua malignidade, em adenoma ou carcinoma. No entanto, esta classificação é praticamente impossível se baseada apenas em técnicas de imagem e/ou citologia, pelo que não foi possível estabelecer em nenhum caso. O tratamento ideal é a adrenalectomia, exceto quando o diagnóstico é massa adrenal não funcional, sendo portanto indicado o acompanhamento ecográfico do tamanho da massa e realização de exames complementares com frequência ajustada às necessidades de cada animal. Contudo, nem sempre é possível estabelecer a abordagem diagnóstica e terapêutica ideal, o que está patente em todos os casos apresentados. Nos casos 1, 2 e 3 foi realizado tratamento médico e, uma vez que este não permite a cura (ao contrário da adrenalectomia), foi também feito um acompanhamento clínico dos animais. No caso 4, dado ser assintomático, foi apenas indicado o acompanhamento médico. The main objective of the study presented in this master thesis is the perception and evaluation of the importance of various means of diagnosis and their joint interpretation for the correct differentiation of adrenal tumor type and, thus, the establishment of the most appropriate treatment. Therefore, this work is comprised of an updated review of the theme in question and a retrospective study of four clinical cases of canine adrenal tumors. Of the four cases, three are adrenocortical tumors, which one of them is a non-functional tumor, and one is a tumor of the adrenal medulla. Each has the ability to produce an endocrine disease directly related to the type of adrenal hormones produced by the tumor. As such, one of the animals present adrenal dependent hyperadrenocorticism, other primary hyperaldosteronism (tumor known as aldosteronoma) and other a disease caused by excess of catecholamines (tumor known as pheochromocytoma); being the fourth case asymptomatic. The case of a tumor producer of sex hormones is not discussed in this study given the lack of known cases at the Hospital Clínico Veterenario (where the practicum was carried out), most likely for being underdiagnosed. In this manner, four etiologies, four diagnostic approaches, and four different therapies are addressed. The diagnostic was and must be based on history, physical examination and biochemical changes, and confirmed by imaging techniques, endocrine tests and (if necessary) cytology. As any other neoplasia, tumors can be further classified as adenoma or carcinoma according to their malignancy. However, this classification is practically impossible if based solely on imaging techniques and/or cytology, therefore it was not possible to confirm the malignance in any case. The ideal treatment is an adrenalectomy, except when the diagnostic is a non-functional adrenal mass; therefore, the ultrasound monitoring of the mass size and complementary exams is recommended and its frequency should be adjusted to the needs of each animal. However, it is not always possible to establish the ideal diagnostic and therapeutic approach, and the cases here presented are an example of this. In cases 1, 2, and 3 it was established a medical treatment and, since it does not provide a cure (unlike adrenalectomy), a clinical follow-up of the animals was carried out. In case 4, since it is asymptomatic, only a medical follow-up was recommended.

Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica O carcinoma de células escamosas (CCE) é uma neoplasia maligna da pele que tem a sua origem no crescimento descontrolado de células das camadas superiores da epiderme. Sendo a segunda neoplasia cutânea mais comum em cães, acredita-se que as radiações UV sejam o principal fator para o desenvolvimento desta doença, surgindo na maioria dos casos em zonas com pouco pelo e/ou com pouca ou nenhuma pigmentação. Neste estudo procedeu-se à avaliação da expressão de 3 marcadores associados a neoplasias: Epidermal Growth Factor (EGFR), Ciclooxigenase-2 (Cox-2) e Ki-67 com o objetivo de averiguar potenciais alvos terapêuticos. Neste estudo foram analisados 37 casos de CCE. As amostras foram classificadas a partir das variáveis clínicas, as características histológicas e o grau histológico de malignidade. A imunorreatividade dos marcadores Ki-67, Cox-2 e EGFR foi determinada através de métodos imunohistoquímicos. A expressão do Ki-67 foi avaliada através de método quantitativo, tendo-se selecionado hotspots com maior positividade e homogeneidade de marcação considerando-se imunorreativas quando a marcação ocorria no núcleo, independentemente da sua intensidade. Os resultados deste anticorpo foram classificados em 2 grupos (baixo e elevado) com base na média dos valores de positividade. A expressão da Cox-2 foi considerada positiva quando se observou uma coloração acastanhada no citoplasma das células. A percentagem de células positivas foi avaliada semiquantitativamente em 4 grupos para a extensão e 3 grupos quanto à intensidade de marcação. A avaliação da expressão do EGFR foi efetuada semiquantitativamente, tendo sido considerada a existência de imunorreatividade quando foi observada uma marcação acastanhada no citoplasma e na membrana citoplasmática das células, tendo sido contabilizada a marcação membranar quando esta era mais intensa que a marcação citoplasmática. A intensidade foi avaliada em 3 graus considerando-se sobre-expressão da marcação nos casos e intensidade de grau 3. Ocorreu sobre-expressão da marcação de EGFR em 43,2% dos casos, tendo esta relevância estatística quando associada à presença de êmbolos (p = 0.001) e ao grau histológico de malignidade (p = 0.004). A marcação da Cox-2 ocorreu em 97,3% dos casos, tendo sido a maioria classificada em grau 3 de intensidade e em grau 4 de extensão. Não existe relevância estatística entre a imunorreatividade e os parâmetros histológicos, tanto para a extensão, como para a intensidade (p > 0.05). Observou-se elevada marcação pelo Ki-67 em 56,8% dos casos, não existindo significância entre a imunorreatividade e os parâmetros histopatológicos (p > 0.05) à exceção da relação com o grau histológico de malignidade (p = 0.040). A associação entre a expressão imunohistoquímica dos diferentes marcadores revelou que apenas existe relevância entre a expressão do EGFR e as classes de marcação do Ki-67 (p = 0.006). Com este estudo, demonstrou-se que existem relações estatisticamente relevantes entre estes marcadores e a malignidade dos tumores. A presença do EGFR, da Cox-2 e do KI-67 em neoplasias e atendendo à sua influência na progressão da doença, revela que estes podem ser potenciais alvos terapêuticos. Para além disso, ficou demonstrada a relação entre a marcação do EGFR e a marcação do KI-67 podendo estes marcadores ser utilizados futuramente na deteção de células tumorais proliferativas. Squamous cell carcinoma (SCC) is a malignant neoplasm of the skin that originates from uncontrolled cell growth of the upper layers of the epidermis. As the second most common skin cancer in dogs, it is believed that UV radiation is the main factor for the development of this disease, which appears in most cases in areas with lack of fur and lightly or unpigmented areas. In this study we evaluated the expression of 3 markers associated with cancer: Epidermal growth factor receptor (EGFR), cyclooxygenase-2 (Cox-2) and Ki-67 in order to determine their eventual value as potential therapeutic targets. In this study, 37 cases of CCE were analyzed. Samples were classified accordingly to the clinical and histological features and the histological grade of malignancy. The immunoreactivity for Ki-67, Cox-2 and EGFR were determined by means of immunohistochemical methods. The Ki-67 expression was assessed by quantitative method, having been selected the most positive hotspots and marking homogeneity considering immunoreactive when staining occurred in the nucleus, regardless of their intensity. The results of this antibody were classified into 2 groups (low and high) based on the average of positive values. Expression of Cox-2 was considered positive if a brownish staining was observed in the cytoplasm of the cells. The percentage of positive cells was evaluated semiquantitatively in four groups concerning extent and 3 groups regarding the intensity of labeling. The assessment of EGFR expression was done semiquantitatively, having been considered the presence of immunoreactivity when a brownish staining was observed in the cytoplasm and the cytoplasmic membrane of the cells. The membrane labeling was recorded when it was more intense then the citoplasmatic labeling. The intensity was evaluated in 3 grades and over expression was considered in cases with intensity level 3. EGFR Overexpression occurred in 43.2% of cases, and it is statistically significant when associated with the presence of emboli (p = 0.001) and histological grade of malignancy (p = 0.004). Cox-2 labeling occurred in 97.3% of cases being the majority of this cases classified as intensity grade 3 and extension grade 4. No statistical significance was detected between immunoreactivity and histological parameters, both for the extension and intensity (p > 0.05). There was a high labeling for Ki-67 in 56.8% of cases, with no statistical relation between the immunoreactivity and histopathological parameters (p > 0.05) except for the association with the histological grade of malignancy (p = 0.040). The association between the immunohistochemical expression of the different markers, revealed that significance only exists between the expression of EGFR and Ki-67 labeling class (p = 0.006). With this study, it was demonstrated that there is a statistically significant relationship between these markers and malignant tumors. The presence of EGFR, Cox-2 and Ki-67 in cancer and in view of its influence on the progression of the disease, shows that they may be potential therapeutic targets. In addition, the relationship demonstrated between the labeling of EGFR and Ki-67 may be used in the future in the detection of proliferating tumor cells.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, Ciências Veterinárias O carcinoma das células de transição (CCT) é o tumor de bexiga mais comum no cão. Tem uma etiologia multifatorial e a sua sintomatologia é confundida muitas vezes com a sintomatologia de uma infeção urinária (hematúria, disúria, polaquiúria). Apesar de se poder suspeitar de CCT pelos sinais clínicos, métodos imagiológicos (ultrassonografia), ou pela citologia da urina, o diagnóstico considera-se definitivo através do estudo histopatológico. Infelizmente é considerada uma neoplasia de mau prognóstico e potencialmente incurável, pelo que existe um grande interesse em investigar novos métodos de prevenção, outros meios de diagnóstico precoce e novas modalidades de tratamento. Existem grandes semelhanças entre o CCT canino e o humano, e por isso o CCT canino torna-se num modelo que complementa o já existente modelo dos roedores, na investigação desta patologia nos humanos, pelo que tem também muito interesse em termos de medicina comparada. O presente trabalho teve como objetivos a realização de uma revisão bibliográfica atualizada do tema abordado, assim como a descrição de quatro casos clínicos de CCT no cão. Os casos abordados integram as histórias clínicas de cães diagnosticados com CCT e submetidos a diferentes tratamentos; verificando-se assim evoluções diferentes. A terapêutica mais comum passa pela administração de um AINE como o inibidor específico da cox-2, mas esta varia até ao uso de protocolos quimioterápicos com clorambucilo, mitoxantrone e vimblastina. A exposição destes casos clínicos demonstra um pouco de como os médicos veterinários lidam hoje em dia com esta neoplasia. Sem uma conclusão acerca do tipo de tratamento ideal, o que o futuro nos reserva, por enquanto, é o estudo sobre novos protocolos terapêuticos e sobre métodos de diagnóstico precoces, assim como a mentalização de médico veterinário e proprietário de que uma monitorização adequada do animal é fundamental. This tumor it’s the most common bladder tumor in dogs. It has a multifactorial etiology and its symptomatology can be frequently mistaken with an urinary infection symptomatology (hematuria, dysuria, pollakiuria). Although a CCT diagnosis can be suspected with the clinical sings, imaging (ultrasonography), or with urine cytology, the diagnosis is only definitive with histopatholy. Unfortunately, it is considered a neoplasm with a poor prognosis and potentially incurable and due to this there are ceaseless research for prevention methods, new means of premature diagnosis and treatment. There are great resemblances between canine and human TCC, and that´s why the canine TCC becomes a model that complements the already existing rodent model, in the investigation of this pathology in humans, and vice versa. The aim o the following assay was the execution of an updated bibliographic review of the addressed subject, as well as a description of four clinical cases of dogs with TCC. The addressed cases integrate several clinical histories with different type of treatments; thus verifying different evolutions. The most common therapeutics involves the administration of an NSAID as previcox, but this can vary up to the use of a chemotherapy protocol with chlorambucil, mitoxanthrone and vinblastine. The exposition of these clinical cases shows slightly the way of how the veterinary act face to this neoplasm. Without a final conclusion of the ideal type o treatment, what future waits for us is a ceaseless research for new treatments and new methods of early diagnosis, as well as the mentoring of veterinarians and owners that a properly conducted monitoring is central.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária Os tumores melanocíticos são tumores de células redondas comuns em cães, tendo apresentação e comportamento biológico variável. Podem-se localizar na cavidade oral (56%), lábios (23%), pele (11%) e dedos (8%), sendo que as outras localizações, incluindo o olho, representam apenas 2%. Algumas características clínicas e histopatológicas como o grau de pigmentação, localização (dérmica ou hipodérmica no caso de melanomas cutâneos), ulceração e dimensão contribuem significativamente para definir o prognóstico em casos de melanomas. Um dos mecanismos mais importantes implicados na regulação do crescimento das células tumorais é a resposta imunitária mediada por células. No entanto, o papel do infiltrado inflamatório nas lesões neoplásicas não é ainda totalmente compreendido devido à disparidade de resultados nos estudos já realizados. A enzima cicloxigenase-2 (COX-2) não existe nas células em condições normais, apenas quando induzida por fatores de crescimento, reacções inflamatórias, promotores tumorais e oncogenes. Assim, ocorre em condições patológicas como o cancro e é responsável pela angiogénese, metástases, pela inibição da apoptose, pela imunossupressão e pela proliferação de células neoplásicas. Desta forma, associa-se a sua presença à malignidade. Assim, neste trabalho estudou-se o significado do infiltrado linfóide por linfócitos T CD3+, tanto em número de linfócitos como no tipo de infiltrado que estes apresentam. Estudou-se ainda a presença de cicloxigenase-2 nos tecidos tumorais de forma a corroborar os resultados obtidos para o infiltrado linfocitário, uma vez que não existem estudos em número suficiente para se poder comparar e discutir os resultados obtidos. Na ausência de dados relacionados com a sobrevida dos animais que permitam fazer estudos de prognóstico, foram avaliadas características histológicas apontadas por alguns autores como associadas à agressividade dos tumores e associadas aos dados do infiltrado inflamatório e à reacção do tecido tumoral com a COX-2. O objetivo de comprovar que os linfócitos T e a cicloxigenase-2 estão presentes em tumores melanocíticos, principalmente, nos malignos, é o facto de se poderem considerar novas possibilidades terapêuticas como a utilização de anti-inflamatórios inibidores específicos da COX-2. Com o objetivo de pesquisar biomarcadores da agressividade biológica passíveis de poderem constituir novos alvos terapêuticos, estudamos por imunohistoquímica os linfócitos infiltrantes no tumor (LITs), nomeadamente os linfócitos T CD3+, e a expressão de cicloxigenase-2 (Cox-2) em 39 tumores melanocíticos caninos. O número de linfócitos T CD3+ foi superior nos melanomas do que nos melanocitomas e em tumores localizados na cavidade oral do quer nos tumores da pele. Observou-se ainda um maior número de LITs em tumores com características histológicas associadas classicamente à agressividade do tumor, como necrose, ulceração, êmbolos tumorais, atipia nuclear e o índice mitótico. Em relação à localização dos LITs, verificou-se ainda que os tumores malignos apresentam, na maior parte dos casos, um infiltrado intratumoral assim como os tumores orais. Quanto à imunoreatividade com a COX-2, esta foi mais elevada nos tumores malignos, nos tumores orais e com características histológicas de maior agressividade biológica. Os LITs e a COX-2, associam-se de forma estatisticamente significativa entre si, isto é, tumores com maior número LITs, apresentam uma maior percentagem de células positivas e com maior intensidade de marcação para a cicloxigenase-2. Uma percentagem de células marcadas pela COX-2 (p=0,002) e a intensidade de marcação (p=0,005) associaram-se a uma infiltração intratumoral. Já quando a intensidade é negativa, é mais frequente não existir infiltrado de linfócitos T CD3+. Estas associações perdem-se nos tumores malignos. Este estudo sugere que os moduladores da resposta inflamatória, incluindo os inibidores da Cox-2 poderão ter um papel importante no tratamento do melanoma canino. Melanoma is a round cell tumour with variable presentation and biological behaviour that is common in dogs. Melanomas can be found in the oral cavity (56%), lips (23%), skin (11%), digits (8%) and eye (2%). Some clinical and histological characteristics such as the degree of pigmentation, site, ulceration and size contribute to define the prognosis. One of the most important mechanisms implicated on regulating the growth of tumour cells is the immune response mediated by cells. However, the role of inflammatory infiltrate in tumours is not fully understood yet due to the contradictory results of the studies available. Cycloxigenase-2 (COX-2) is an enzyme that doesn’t exist in cells under normal conditions. It is only synthetized when stimulated by growth factors, inflammation, tumour promoters and oncogenes. Therefore, it occurs in cancer and is associated with malignancy because it is responsible for angiogenesis, metastasis, apoptosis inhibition, immunosuppression and tumour cells proliferation. The number and the type of infiltrate of T lymphocytes CD3+ were studied in this thesis as well as the presence of COX-2 on tumour tissue in order to associate the two markers since there aren’t enough studies on this matter in veterinary medicine. Since the data for survival time of the animals included in this study was unavailable, we associated some of the histological features that are known to be correlated with malignancy with the T lymphocyte infiltrate and the immunostaining for COX-2. The main goal of identifying T lymphocytes and COX-2 in melanomas is to explore new therapeutic approaches like anti-inflammatory drugs, including COX-2 specific inhibitors. 39 melanoma samples were stained by immunohistochemistry techniques to identify both T lymphocytes CD3+ and COX-2. The results of this study showed that the number of T lymphocytes CD3+ was higher in malignant oral melanoma rather than in benign cutaneous melanoma. Their number was also higher in melanomas that presented histological features that indicated malignancy such as necrosis, ulceration, intravascular tumour cells, nuclear atypia and high mitotic index. Concerning the position of the T lymphocyte CD3+ infiltrate, the results showed that malignant and oral melanoma frequently presented an intratumoral infiltrate. COX-2 stained a higher number of cells in malignant oral melanomas with histologic features that indicate malignancy. T lymphocytes CD3+ and COX-2 showed to be statistically correlated. That is when the number of T lymphocytes CD3+ was high, so was the number of tumour cells stained by COX-2 and the T lymphocyte infiltrate was intratumoral. When the staining for COX-2 was negative, the T lymphocyte CD3+ infiltrate was usually absent. These statistical associations were lost when considering just the malignant tumours. These findings show that the use of anti-inflammatory drugs should be considered as a therapeutic option for melanomas.

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial O carcinoma de células escamosas (CCE) é uma doença com origem nos queratinócitos sendo das neoplasias mais diagnosticadas em cães. É uma neoplasia localmente invasiva, mas a ocorrência de metástases tende a aparecer apenas numa fase mais tardia da doença. Manifesta-se preferencialmente em áreas de pele com pouco pelo e despigmentadas, acomete animais de ambos os sexos e com idades mais avançadas. A sua etiologia não é muito clara, no entanto, acredita-se que a radiação ultravioleta (UV) é o principal fator para o desenvolvimento desta doença. Este estudo teve como objetivo a avaliação da expressão de 3 marcadores biológicos: Ciclo-oxigenase-2 (Cox-2), Epidermal Growth Factor (EGFR) e Heat Shock Protein 90 (HSP90) em carcinomas de células escamosas de canídeos. A sua expressão foi determinada através de métodos imunohistoquímicos. No presente trabalho, foram analisados 63 tumores classificados histologicamente como carcinomas de células escamosas, dos quais 33 cutâneos e 30 orais. Os tumores foram classificados com base nas suas características clínicas e histopatológicas. A extensão de marcação de Cox-2 ocorreu em 96,9% dos carcinomas, obtendo-se associação estatística entre a sobre- expressão desta enzima e a presença de êmbolos tumorais (p=0,013), maior atipia nuclear (p=0,014), índice mitótico (p=0,007) elevado e maior grau histológico de malignidade (p=0,014). Verificou-se também associação estatística entre a sobre- expressão de Cox-2 e a localização do tumor (p=0,010), onde 62,2% das amostras pertenciam a carcinomas de células escamosas orais. A sobre- expressão de EGFR verificou-se em 42,9% amostras, revelando associação estatisticamente significativa entre a sobre- expressão de EGFR e a presença de êmbolos tumorais (p=0,031), uma maior atipia nuclear (p=0,029) e um maior grau histológico de malignidade (p=0,029). A sobre- expressão de HSP90 associou-se com a presença de êmbolos tumorais (p=0,031), uma maior atipia nuclear (p=0,044), maior índice mitótico (p=0,001) e grau histológico de malignidade mais elevado (p=0,044). Neste estudo, foi demonstrado que existe associação estatística relevante entre estes biomarcadores e as características associadas à agressividade dos tumores. Também ficou demonstrado que existe uma relação entre a expressão de Cox-2 e a expressão de EGFR (p=0,010), entre a expressão de Cox-2 e a expressão de HSP90 (p=0,012) e por fim entre a expressão de EGFR e de HSP90 (p=0,040). Em geral, sempre que um dos biomarcadores apresentava uma sobre- expressão, os restantes marcadores também exibiam uma expressão elevada. The squamous cell carcinoma (SCC) is a disease originating in keratinocytes and it’s the most frequently diagnosed cancer in dogs. It is a locally invasive cancer, but the occurrence of metastases tends to appear only at a late stage of the disease. It manifests itself preferably in depigmented skin areas with little fur, it affects animals of both genders and older ages. The etiology is unclear, however, it is believed that ultraviolet (UV) radiation is the main factor for developing this disease. This study aimed to evaluate the expression of three biomarkers: Cyclooxygenase-2 (Cox-2), Epidermal Growth Factor (EGFR) and Heat Shock Protein 90 (HSP90) in squamous cell carcinomas of canids. The expression of biomarkers was determined by immunohistochemical methods. In in this study we analyzed 63 tumors, previously classified as squamous cell carcinomas, of which 33 were cutaneous and 30 oral. The tumors were classified based on clinical and histopathological characteristics. The extension of marking of Cox-2 occurred in 96.9% of the carcinomas, obtaining statistical association between elevated expression of this enzyme and the presence of tumor emboli (p=0.013), largest nuclear atypia (p=0.014), high mitotic rate (p=0.007) and higher histologic grade of malignancy (p=0.014). There was also statistical association between overexpression of Cox-2 and the location of the tumor (p=0.010), where 62.2% of the samples belonged from oral squamous cell carcinomas. Overexpression of EGFR occurred in 42.9% of the samples, showing a statistically significant association between EGFR overexpression and the presence of tumor emboli (p=0.031) greater nuclear atypia (p=0.029) and a higher degree histological malignancy (p=0.029). The HSP90 overexpression was associated with the presence of tumor emboli (p=0.031), increased nuclear atypia (p=0.044), higher mitotic rate (p=0.001) and higher histological grade of malignancy (p=0.044). In this study, it was shown that there is significant statistical association between these biomarkers and the characteristics associated with aggressiveness of tumors. It has been shown that a relationship exists between Cox-2 expression and EGFR expression (p=0.010), between Cox-2 expression and the expression of HSP90 (p=0.012) and finally between EGFR expression and HSP90 (p=0.040). In general, whenever a biomarker had overexpression the remaining markers also showed high values.

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial O cancro da mama é a neoplasia mais frequentemente diagnosticada na mulher, nos países desenvolvidos e nos países em desenvolvimento. Esta é a neoplasia maligna mais comum no sexo feminino e a segunda causa de morte entre o mesmo. O Transforming Growth factor beta (TGFβ) e as células T reguladoras (Treg) FOXP3 estão envolvidos na carcinogénese mamária humana. Nos tumores mamários caninos, este tema ainda não se encontra bem documentado. Este estudo teve como objetivo a avaliação da expressão do TGFβ e do FOXP3 através da aplicação da técnica de imunohistoquímica numa série de carcinomas mamários; a avaliação da relação existente entre a imunoexpressão dos dois marcadores em estudo com características clínico-patológicas dos tumores incluídos na amostra e a investigação da associação entre a imunoexpressão dos marcadores nos tumores estudados. No presente estudo, identificou-se uma associação significativa entre a presença de características histopatológicas de elevada malignidade e de alta expressão do TGFβ. Os tumores com níveis mais elevados de TGFβ estavam associados a um alto índice mitótico (p=0,001), a um pleomorfismo nuclear marcado (p=0,002), a tumores indiferenciados (p

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica e Laboratorial Os tumores de mama são as neoplasias mais comuns na espécie canina, mais particularmente os tumores malignos têm vindo a aumentar consideravelmente nestes animais. Contudo, os estudos realizados nesta vertente, mostram-se ainda insuficientes para o prognóstico e posterior tratamento destas neoplasias tão agressivas. O presente estudo pretendeu estudar a expressão do c-kit, VEGF e CD31 em 81 tumores malignos da mama da cadela através de estudos de imunohistoquímica e relacionar a sua expressão com diversos parâmetros clinicopatológicos. Por conseguinte as 81 amostras foram submetidas à deteção immunohistoquimica do c-kit, VEGF e CD31, juntamente com parâmetros clínicopatológicos de agressividade do tumor. De acordo com os resultados obtidos concluímos que o c-kit apresenta relação positiva com a malignidade tumoral, bem como com parâmetros de angiogénese verificados pela expressão do VEGF e CD31. Tumores com maior expressão de c-kit apresentam fenótipos mais agressivos, nomeadamente, maior grau histológico de malignidade, presença de êmbolos vasculares e presença de metástases nos gânglios linfáticos regionais. A sobreexpressão do c-kit revelou correlação positiva com o VEGF (r = 0,322, P < 0,009) e com o CD31 (r = 0.470, P < 0,001). O grupo c-kit/angiogénese foi associado com elevado grau de malignidade (P < 0,001), presença de êmbolos intravasculares (P < 0,001) e invasão dos gânglios linfáticos (P < 0,001). Estes resultados sugerem que o c-kit pode compartilhar vias de sinalização comuns com VEGF e CD31 na progressão de CMT e pode contribuir para o aumento da angiogénese, agressividade e mau prognóstico destes tumores. The breast tumors are the most common neoplasia in canine species, mainly malignant tumors have been increasing in these animals. However, studies on this issue are still insufficient for the prognosis and subsequent treatment of these aggressive tumors. This study aimed to examine the expression of c-kit, VEGF and CD31 in 81 breast malignant tumors of the dog through immunohistochemical studies and relate their expression with various clinical-pathological parameters. Therefore 81 samples were submitted to immunohistochemical detection of c-kit, VEGF and CD31, together with clinicopathological parameters of tumor aggressiveness. According to the obtained results we conclude that c-kit has a positive relationship with tumor malignancy and parameters of angiogenesis like VEGF and CD31 expression. Tumors with greater expression of c-kit demonstrated more aggressive phenotypes, in particular, greater histological grade of malignancy, presence of neoplastic intravascular emboli and presence of metastasis in the lymph nodes. C-kit overexpression revealed a positive correlation with VEGF (r=0.322, P

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias Currently, progress in biotechnology has made available a great collection of genomic, transcriptomic, metabolomic and proteomic information on the tumour microenvironment, where cytokine and chemokine networks support interactions between cancer cells and their surrounding inflammatory landscape. Tumour-Associated Macrophages (TAMs) and Regulatory T-Lymphocytes (Tregs) have been identified as major participants in the tumour microenvironment, playing a dynamic role in the modulation of immunosuppression and supporting evasion of tumour immune surveillance. The tumour-promoting inflammatory environment is now part of the major cancer hallmarks. Our aim is to explore pathways of macrophage interaction with mammary cancer cells and seek to understand the mechanisms involved. In the first chapter we observed an association between tumour-associated macrophages and the expression of VEGF, a marker of angiogenesis, and also with several clinicopathological variables in malignant canine mammary tumours (CMT). We proceeded to further explore the interactions between macrophages and a mammary carcinoma cell line, REM 134, by performing in vitro studies of the role of CCL2/CCR2 axis in cell proliferation, and in the polarization of RAW 264.7 macrophages. Modelling 3D cultures of REM 134 cells, supplemented with conditioned media from macrophages, has allowed observation of several alterations in the expression of E-cadherin, CCR2, CSF1R, Twist1 and Tribbles1. By targeting Twist1 in RAW 264.7 macrophages, a parallel decrease was observed in STAT3 expression. Our results suggest a role for Twist1 as a mediator of interactions between mammary cancer cells and macrophages and also highlight the role of the CCL2/CCR2 axis in conditioning responses to extracellular cytokines and possibly in altering the secretome of macrophages. The composition of the inflammatory microenvironment warranted further research in models of cancer-related inflammation, therefore, on the second chapter we decided to focus on canine inflammatory mammary carcinomas (CIMC), where inflammation is seemingly implicated in the neoplastic disease. Human inflammatory breast cancer (IBC) and CIMC are the most aggressive forms of mammary cancer. The clinical course is rapid and characterized by early metastasis and short survival times. Current research aims to establish new therapeutic targets to provide better treatment options. Here, we investigated protein and gene expression levels associated with the inflammatory microenvironment, comparing with non-inflammatory CMT. RNA was extracted from 32 formalin-fixed paraffin-embedded samples of canine mammary tumours (CIMC=26; tubulopapillary carcinoma=6). The same tumour samples were processed and analysed for clinicopathological characteristics. cDNA was obtained by and qPCR performed to measure relative gene expression levels of COX-2, Tribbles1, Synuclein Gamma (SNCG), Vimentin, CCL2, VEGF, CCR2 and CSF1R. Immunohistochemical (IHC) analysis of CCR2, CSF1R and MMP-9 expression was also performed. Statistical analysis was carried out using the software SPSS (Statistical Package for the Social Sciences 17.0). Gene expression differences between CIMC and non-CIMC types were obtained for COX-2, SNCG, Tribbles1, VEGF and CSF1R. Among these biomarkers correlations were found, particularly between SNCG and Tribbles1 (R=0.512, P=0.001), but this correlation could not be observed in vitro in REM134 CMT and Lilly CIMC cell lines. In the IHC analysis, CCR2 expression demonstrated nuclear subcellular localization which was observed predominantly in CIMC tumours. Upregulation and correlation of SNCG and Tribbles1 in CIMC might be the result of cooperation between the microenvironment and cancer cells, promoting efficient metastasis formation. However, further investigation is required to support this hypothesis. In order to create a solution to target the tumour microenvironment, in the final chapter, we aimed to develop a monoclonal antibody targeting canine CCR2, a receptor involved in TAMs recruitment to the tumour microenvironment. Recently, a focus in cancer immunotherapies has been observed, whilst trying to present precision medicine alternatives to conventional cancer therapeutics. The development of monoclonal antibodies against molecular receptors involved in the main cancer pathways, led to a new generation of promising cancer treatments. Studies performed in canines, in a pre-clinical setting could significantly reduce the length of human clinical trials, owing to the availability of biologic material, a shorter life-span and the spontaneity of neoplastic lesions. TAMs were appointed as a novel therapeutic target in both human and canine cancers, due to their role in assisting angiogenesis, metastasis and invasion, and having been verified the association with a worse prognosis and clinicopathological variables of tumour aggressiveness. The possibility of hampering the recruitment of TAMs to the tumour core through the development of a monoclonal antibody against the receptor of monocyte chemotactic protein-1 (CCR2) is explored. Hereby we discussed factors in favour and against the use of adjuvant therapy with a monoclonal antibody against the CCR2 which we developed using a canine model of human breast cancer. Fundação da Ciência e Tecnologia, Ministério da Educação e Ciência, no âmbito do programa QREN - POPH

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária A radioterapia tem sido considerada a terapia de eleição para vários tumores cerebrais no cão, nomeadamente o glioma e o meningioma intracraniano. Após ter sido realizada uma revisão acerca da técnica e dos dois tipos de tumor, em particular, procedeu-se à realização de um estudo de caráter retrospetivo, com dados relativos a doentes tratados no hospital VRCC - Veterinary Referrals, no Reino Unido. Os objetivos definidos foram avaliar a eficácia desta abordagem terapêutica e procurar estabelecer associações entre várias características epidemiológicas, clínicas, diagnósticas e terapêuticas com o tipo tumoral e os tempos de sobrevivência apresentados. Assim, foram incluídos 32 cães com diagnóstico de glioma ou meningioma intracraniano, tratados com radioterapia, cujos relatórios clínicos foram analisados. Procedeu-se, ainda, ao cálculo de dois tempos de sobrevivência: o total (TST) e o pós-tratamento (TSPT), que se assumiram desde o diagnóstico ou do fim da radioterapia, respetivamente, até à morte ou final do período de estudo. Apenas 30 doentes foram considerados para os cálculos de sobrevida. O sexo e o realce pós-contraste exibiram associações estatisticamente significativas (P

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária A cetoacidose diabética (CAD) é uma complicação grave e, potencialmente fatal, da diabetes melitos, caracterizada pela tríade bioquímica de hiperglicemia, hipercetonémia e acidose metabólica. Este distúrbio metabólico resulta de deficiências absolutas ou relativas de insulina e do aumento simultâneo de hormonas diabetogénicas (especialmente glucagon), causado, muitas vezes, pela presença de doenças concorrentes. Este trabalho teve como objetivo caracterizar uma amostra de 15 animais com cetoacidose diabética, 14 cães e 1 gato, que se apresentaram ao Hospital Clínic Veterinari da Universitat Autònoma de Barcelona (HVC-UAB) e no Hospital Veterinário Central (HVC) entre 2006 e 2013 e, compara-la à literatura recolhida. As variáveis em estudo foram divididas em epidemiológicas (raça, sexo, estado reprodutivo, idade ao diagnóstico e diagnóstico prévio da diabetes), clínicas (tipo de consulta, principais motivos da consulta, sinais clínicos, número de dias de internamento, tratamento efetuado e recuperação do estado de crise cetoacidótica) e laboratoriais (alterações hematológicas, bioquímicas, eletrolíticas, gasométricas e da tira de urina). Após a análise dos resultados, na amostra da espécie canina, verificou-se que a presença de CAD foi predominante em cães de raça indeterminada e em fêmeas inteiras. O felino em estudo era um macho castrado de raça pura. O diagnóstico da CAD foi realizado em animais de idade a adulta a geriátrica. Os principais motivos de consulta e sinais clínicos envolveram a presença de vómito, apatia, Pd/Pu. As principais alterações laboratoriais incluíram hiperglicemia, aumento dos níveis da fosfatase alcalina, ureia e colesterol, hipocalemia, hipocloremia, glicosúria, cetonúria e diminuição do pH, PCO2 e HCO3-. Com a exceção de um animal, todos foram internados e sujeitos a terapia com fluidos e insulina. No tratamento destaca-se, ainda, a utilização de insulina de ação rápida e a não suplementação com bicarbonato. Conclui-se que, apesar de algumas divergências encontradas, a sintomatologia, as principais alterações laboratoriais e a abordagem terapêutica observados nos animais em estudo refletem o descrito na literatura. Diabetic ketoacidosis (DKA) is a serious and potentially fatal complication of diabetes mellitus that is characterized by the biochemical triad of hyperglycemia, hyperketonemia, and metabolic acidosis. This metabolic disorder results from relative or absolute insulin deficiencies and the simultaneous rise of counterregulatory hormones, especially glucagon, which is often caused by the presence of concurrent disorders. The aim of this work is to caracterize 15 animals with diabetic ketoacidosis, 14 dogs and 1 cat, who have presented consultation on Hospital Clínic Veterinari da Universitat Autònoma de Barcelona (HVC-UAB) e no Hospital Veterinário Central (HVC), between 2006 and 2013 and, compares them with the collected literature. The variables will be addresses in epidemiological (race, sex, reproductive status, age at diagnosis and previous diagnosis of diabetes), clinical (type and the main reasons for consultation, clinical signs, number of days of hospitalization, treatment and the recovery of the ketoacidosis crisis) and laboratorial (hematological, biochemical, electrolyte, blood gases and urine strip). After analyzing the results, in the canine specie, it was found that the presence of DKA is more likely in undetermined breeds and no castrated females. The cat included in this study was a castrated male of pure breed. The diagnosis of DKA was mostly seen in adult to geriatric-aged animals. The main reasons for consulting and clinical signs involved the presence of vomiting, apathy and Pd/Pu. The main laboratorial abnormalities included hyperglycemia, increased levels of alkaline phosphatase, urea and cholesterol, hypokalemia, hypochloremia, glycosuria, ketonuria and decreased levels of pH, PCO2 and HCO3-. With the exception of one animal, all subjects were admitted to fluid and insulin therapy. The treatment stands out the use of rapid-acting insulin and no supplementation with bicarbonate. We concluded that, despite some divergences, the symptoms, the main laboratorial findings and the therapeutic approach are in accordance with literature.

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial Em cães, os tumores melanocíticos apresentam uma biologia extremamente diversificada e o comportamento altamente agressivos. Com o objectivo de estudar o índice proliferativo nos tumores melanocíticos caninos e comparar esses índices com a localização e os critérios histopatológicos classicamente associados à agressividade, foram analisados 48 tumores melanocíticos sendo 9 melanocitomas e 39 melanomas. De cada animal foram registados os dados referentes ao animal (idade, sexo e raça) e os dados referentes ao tumor (localização e tamanho) tendo sido feita, posteriormente, uma avaliação das lesões na coloração de rotina com hematoxilina-eosina (HE), relativamente aos parâmetros histopatológicos definidos, nomeadamente o tipo de células, actividade juncional, atipia nuclear, Infiltrado linfoplasmocitário necrose, células gigantes, proliferação intraepitelial, ulceração, estroma e as células tumorais intravasculares. O índice de proliferação marcada pelo Ki-67 foi avaliado por meio da imunohistoquímica enquanto o índice mitótico foi avaliada pela coloração de HE com branqueamento da melanina. Com esse estudo pudemos verificar que o índice proliferativo, determinado pela contagem de mitoses e pela marcação imunohistoquímica pelo Ki-67 variou significativamente entre tumores melanocíticos localizados na cavidade oral e cutânea, sendo que nos melanocitomas o índice proliferativo foi menor quando comparado com os melanomas. Também o índice proliferativo mostrou uma correlação significativa com a atipia nuclear e a Infiltrado linfoplasmocitário. O Ki-67 e o índice mitótico mostraram ser estatisticamente significativos tanto nos melanomas assim como nos tumores melanocíticos no geral, com o nível de significância de P=0,026 e P=0,001 respectivamente. Sendo assim, o estudo dos índices proliferativos pode ser bastante útil para o diagnóstico dos melanomas caninos, auxiliando o médico na escolha do melhor tratamento. The melanocytic tumors in dogs present a biology extremely diversified and a highly aggressive behavior. With the aim of studying the proliferative melanocytic index tumors in canines and comparing these rates with the location and histopathological criteria classically associated with aggressiveness 48 melanocytic tumors were analyzed; 9 melanocytomas and 39 melanomas. Each one of the animals was recorded with the appropriate data regarding it (age, gender, and race) and the data regarding the tumor (location and size). These records having been previously made, an evaluation of the lesions in routine staining with hematoxylin-eosin, in relation to histopathological parameters defined, and in particular the type of cells, junctional activity, nuclear atypia, necrosis, inflammation, cell proliferation, large intraepithelial, ulceration, stroma and the intravascular tumor cells followed. The proliferation index marked by Ki-67 was evaluated by means of immunohistochemistry while the mitotic index was assessed by staining with HE bleaching of melanin. With this study we can check that the proliferative index determined by counting mitoses and the immunohistochemical staining for the Ki-67 varied significantly between melanocytic tumors located in the oral cavity and skin, being that in the melanocytomas the proliferative index was much lower when compared with the melanomas. Also, the proliferative index showed a significant correlation with the nuclear atypia and the inflammation. The Ki-67 and the mitotic index showed to be statistically significant in both melanomas as well as in the melanocytic tumors in general, with the significant level of P=0.026 and P=0.001 respectively. Thus, the study of proliferative indices can be very useful for the diagnosis of canine melanomas and assisting the physician in choosing the best treatment.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde Mastocitomas cutâneos são os tumores de pele mais comuns nos cães, podendo adquirir diferentes comportamentos biológicos, que podem ir de uma massa solitária facilmente removida cirurgicamente, a uma doença sistémica e potencialmente fatal. Estes tumores são mais comuns em animais com média de idades de 9 anos, não se observando predisposição sexual. Com o objetivo de contribuir para o conhecimento deste tipos de tumores, surgiu este trabalho que visa ajudar a conhecer melhor a linha celular de mastocitoma C2 e perceber a ação inibidora de cox-2 pela ação do fármaco, Firocoxib, inibidor da mesma. Por forma a poder ser usado como fármaco como tratamento anti-tumoral. Técnicas como citogenética e Imunohistoquímica foram usadas para um melhor conhecimento da linha e para o estudo da ação do fármaco foram usados o ensaio do MTT e do Cometa. Os nossos resultados demonstraram que se tratava de uma linha tumoral, muito positiva para a Cox-2 e que o Firocoxib pode ser uma alternativa na prevenção e na progressão tumoral, pode também ter ação quimio-preventiva. Cutaneous mast cell tumors are the most common skin tumors in dogs and can acquire different biological behaviors, which can range from a solitary mass easily surgically removed, to systemic and potentially fatal disease. These tumors are more common in animals with an average age of 9 years, was not observed sexual predisposition. In order to contribute to the knowledge of these types of tumors, did this work that aims to help better understand the mast cell tumor cell line C2 and realize the inhibitory action of COX-2 by drug action, Firocoxib, inhibitor of it. In order to be able to be used as antitumor drug as treatment. Techniques such as cytogenetics and immunohistochemistry were used to a better knowledge of the line and the pharmacological action of the study used the MTT and the Comet assay. Our results showed that it was a tumor line, very positive for Cox-2 and Firocoxib can be an alternative in the prevention and tumor progression, may also have action chemo-preventive.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária A era da quimioterapia, iniciada a meio do século passado, tem sido dominada pelo uso habitual de protocolos de quimioterapia de dose intensa, os quais se baseiam no conceito de dose máxima tolerada. Ao promoverem um equilíbrio entre a qualidade de vida do animal e o objetivo de destruir prontamente o maior número possível de células tumorais, estes protocolos ocupam ainda hoje um lugar de destaque na prática clínica diária. Contudo, aquando da entrada do novo milénio, a quimioterapia metronómica foi introduzida como uma possível alternativa à utilização de quimioterapia convencional, trazendo consigo uma considerável mudança no panorama dos tratamentos quimioterápicos. Caracterizada por uma administração diária a longo prazo de doses mais baixas de fármacos citotóxicos, esta nova modalidade tem características completamente diferentes, além de benefícios animadores. Mas qual será o seu verdadeiro lugar no arsenal da terapia quimioterápica? Terá a quimioterapia metronómica eficácia suficiente para tratar animais com cancro? Ou será apenas uma opção paliativa e mais económica? Dentro da quimioterapia metronómica, uma nova terapia antitumoral tem emergido como a forma mais recente de administração de fármacos citotóxicos. O regime chemo-switch consiste na utilização de quimioterapia metronómica como uma terapia de manutenção, no seguimento da aplicação de quimioterapia convencional. No entanto, apesar de se apresentar como uma modalidade promissora, carece ainda, à semelhança da própria quimioterapia metronómica, de validação na prática clínica. O hemangiossarcoma canino é um tumor maligno com origem nas células endoteliais vasculares, cujo prognóstico é geralmente pobre, e o tratamento permanece particularmente desafiante em oncologia veterinária, devido ao seu altíssimo índice de metastização. Foram comparadas retrospetivamente as modalidades quimioterápicas existentes até à data (metronómica, convencional e o regime de chemo-switch) para o tratamento de 29 cães com hemangiossarcoma de estadio II-III. Os cães inseridos no grupo da quimioterapia metronómica receberam o protocolo CTP, que consistiu na combinação de três fármacos (ciclofosfamida, talidomida e piroxicam); dentro do grupo da quimioterapia convencional, os animais receberam o protocolo DOX (um protocolo de quimioterapia dose-intensa composto somente por doxorrubicina), ou o protocolo ADTIC (um protocolo de quimioterapia dose-intensa que combinava doxorrubicina com dacarbazina): o grupo do chemo-switch incluiu cães tratados com um dos dois protocolos de quimioterapia dose-intensa seguido do protocolo de quimioterapia metronómica. O estadio clínico destacou-se como sendo o único factor determinante para a análise de sobrevida dos animais, mais do que a própria abordagem terapêutica. Os cães diagnosticados com hemangiossarcoma de estadio II tiveram um tempo para a progressão mediano e uma sobrevida mediana superiores àqueles com estadio III (140 dias vs. 66 dias, P

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária O cancro é uma das principais causas de morte em animais de companhia e sua prevalência continua a aumentar principalmente devido à maior esperança de vida do nossos animais de estimação, resultante de um aperfeiçoamento da medicina preventiva, terapêutica e nutrição. A ligação entre humano e animal tornou-se mais forte do que nunca, nas últimas décadas. Consequentemente, proprietários e veterinários terão de lidar mais frequentemente com a gestão de animais com doença oncológica. O objetivo deste trabalho é o de descobrir as expectativas dos proprietários de animais com doença oncológica. Esta medição será feita recorrendo a uma ferramenta de medição de qualidade do serviço designada de SERVQUAL, com a esperança que estes resultados possam dar respostas sobre as necessidades deste grupo especial de clientes. Este estudo recorreu a uma amostra de 119 clientes veterinários, 51 donos de animais com cancro e 68 donos de animais sem doença oncológica, de um Hospital Veterinário localizado no Porto, Portugal, entre 1 de Janeiro 2013 e 28 de Fevereiro 2015. Os resultados demonstraram que ambos os grupos de clientes veterinários dão preferência à dimensão Empatia da qualidade dos serviços (valor da mediana grupo Oncológico 6,80; grupo Geral 6,60). Os clientes apreciam veterinários que valorizam as opiniões dos clientes bem como hospitais veterinários que proporcionam cuidados de saúde individualizados. Para estes clientes, é essencial que os hospitais veterinários forneçam serviços com horários de trabalho alargado e que façam da sua principal missão o bem-estar dos animais de companhia. Foram encontradas ainda diferenças significativas relativas à dimensão Confiança entre os dois grupos de clientes, com um valor p= 0,045. Estas diferenças provavelmente não se devem ao acaso, mas sim porque os donos de animais com cancro têm realmente diferentes exigências em relação aos serviços veterinários. Resultados obtidos na medição da qualidade de serviços dizem-nos que muitos clientes com animais que sofrem de doença oncológica deixaram as instalações com expectativas por satisfazer, especialmente nas dimensões da Empatia (-0,016) e Fiabilidade (-0,071), concluindo assim que a insatisfação por parte dos clientes pode ainda prevalecer neste grupo. Ao determinar as percepções que os profissionais veterinários tinham àcerca das expectativas dos seu clientes, foi notável a tendência que médicos e enfermeiros veterinários tinham para sobrevalorizar a dimensão dos Tangíveis (valor da mediana 6,75), quando ambos os grupos de clientes conferiram relativamente pouca importância a esta dimensão, particularmente o grupo Oncológico (valor da mediana 6,25). Estes resultados podem levar-nos a inferir que os profissionais veterinários não estão completamente a par das necessidades dos seus clientes. Poucos estudos têm sido realizados em medicina veterinária com a intenção de descobrir as expectativas dos clientes veterinários àcerca dos serviços. Em relação aos donos de animais de estimação com doenças oncológicas, as informações sobre as suas necessidades são praticamente inexistentes. É possível que os resultados deste estudo possam dar uma direção à comunidade veterinária para uma melhor compreensão das necessidades dos clientes, elevando assim a excelência da nossa profissão aos olhos do público. Cancer is one of the primary causes of companion animal death and its prevalence continues to rise. This is mainly due to the greater lifespan of our pet, resultant of better nutrition, preventive and therapeutic medicine and likely to The Bond between human and animal that has become stronger than ever, in the past decades. Consequently, owners and veterinarians will have to deal with the management of pets with oncologic disease more often. The objective of this thesis is to study the expectations of owners that necessarily need to handle with the uncertainty of cancer on behalf of their own pets recurring to a service quality measurement tool named SERVQUAL, with hope that the results will share light on the necessities of this special group of veterinary clients. This study used a sample of 119 veterinary clients, 51 owners of pets with cancer and 68 owners of pets free from oncologic disease, from a Veterinary Hospital located in Porto, Portugal, between 1st January 2013 and 28th February 2015. The results demonstrated that both groups of clients in this facility of veterinary services preferred features from the Empathy dimension of service quality (median score for the Oncologic group 6,80 and 6,60 for the General group), by SERVQUAL’s standards. Clients value veterinarians that value their client’s opinions and ideas and hospitals that provide individual care. For these clients, it is essential veterinary hospitals to provide extended working hours and to set as their primary mission the welfare of their pets. There were significant differences regarding the Assurance dimension of quality (p-value= 0,045), when comparing Oncologic and General groups. These differences were most likely not due to random events, but because owners of pets with cancer have indeed different insights regarding veterinary services, in contrast with the remaining customers. Also, other findings determine that many clients with pets bearing oncologic disease leave veterinary healthcare facilities with expectations unmet, particularly in the Empathy (-0,016) and Reliability (-0,071) dimensions, thus concluding that client dissatisfaction might yet prevail within this group. When determining the veterinary professionals’ perceptions of their clients’ expectations, it was noticeable that the veterinarians and veterinary nurses had a tendency of overvaluing the Tangibles dimension (median score 6,75), when both client study samples gave this dimension relatively poor importance, most specially the Oncologic group (median score 6,25). This result may lead us to say that professionals are not fully aware of their clients’ requirements and concerns. Few studies have been conducted in Veterinary medicine with the intent of discovering veterinary client expectations with services and in the particular aspect of owners with oncologic pets, the information regarding their needs in veterinary health care is almost inexistent. The findings of this study will perhaps direction the veterinary community to a better understanding in our customers’ needs and concerns, elevating our professions’ excellence in the eyes of the public.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, Ciências Veterinárias O mastocitoma é uma neoplasia comum no cão, representando cerca de 7 a 21% de todas as neoplasias cutâneas e 11 a 27 % de todos os tumores malignos nesta espécie. O seu comportamento biológico é extremamente variável, podendo tratar-se de uma simples massa perfeitamente localizada ou de uma grave doença metastática. Apesar das inúmeras pesquisas efetuadas, a etiopatogenia do mastocitoma canino não se encontra totalmente esclarecida. Sabe-se no entanto que esta é provavelmente multifatorial. Ao longo dos últimos anos, vários investigadores sugeriram que as mutações no proto-oncogene c-kit, que codifica o recetor c-kit, podem estar associadas com a patogénese desta neoplasia. O fosfato de toceranib (Palladia®, Pfizer) é um inibidor da tirosina cinase administrável por via oral que exibe uma potente atividade inibidora contra os membros da split-kinase receptor family, incluindo o recetor para o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGFR), o recetor para o fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGFR) e o recetor c-kit. A sua ação sobre o mastocitoma canino foi demonstrada em vários artigos. Neste estudo realizou-se uma revisão bibliográfica atualizada sobre o mastocitoma canino, dando mais ênfase às novas técnicas terapêuticas. No entanto, o objetivo fundamental deste trabalho consistiu na análise de cinco cães com mastocitomas múltiplos de grau II e III que foram tratados com fosfato de toceranib (Palladia®). Após a análise, concluiu-se que o Palladia® tem atividade biológica contra o mastocitoma, sugerindo que a sua adição ao tratamento deste tumor pode melhorar o seu resultado global. Dogs have an unique risk of developing cutaneous mast cell tumor which account for 7% to 21% of all skin tumors and 11% to 27% of all malignant tumors in this species. Their biological behavior is extremely variable, it may be a simple mass perfectly located or a serious metastatic disease. Despite numerous researches, the etiopathogenesis of canine mast cell tumors is not fully understood. It is known however that it is probably multifactorial. Over the past few years, several investigators have suggested that mutations in proto-oncogene c-kit, encoder of the the c-kit receptor, may be associated with the pathogenesis of this cancer. The toceranib phosphate (Palladia®, Pfizer) is a tyrosine kinase inhibitor, orally bioavailable compound, which exhibits a potent inhibitory activity against members of the split-kinase receptor family, including vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), platelet derived growth factor receptor (PDGFR) and c-kit receptor. Its action on the canine mast cell tumor has been demonstrated in several articles. In this study the canine mast cell tumor was reviewed using all available literature, assuming more emphasis on the new therapeutic techniques. Nevertheless, the primary objective of this study was the analysis of five dogs with multiple mast cell tumors of grade II and III that were treated with toceranib phosphate (Palladia®). After the analysis it was concluded that the Palladia® has biologic activity against mast cell tumor, suggesting that its addition to the treatment of this tumor may improve overall outcome.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, Ciências Veterinárias Em Medicina Veterinária, o conceito de quimioterapia metronómica é ainda muito recente e os estudos disponíveis são reduzidos e preliminares. Enquanto a abordagem com quimioterapia clássica tem como finalidade administrar ao paciente a máxima dose possível, a abordagem metronómica defende uma administração usando a mínima dose necessária, com maior frequência, por períodos de tempo superiores, eliminando os longos períodos de descanso entre doses (contrariamente ao que se verifica na abordagem clássica). Acredita-se que a quimioterapia metronómica atua ao nível das células endoteliais dos neovasos formados no microambiente tumoral, inibindo a angiogénese tumoral. Para além disso, esta abordagem evidencia ainda efeitos antineoplásicos diretos e efeitos imunomodeladores seletivos ao nível dos linfócitos Treg a favor do organismo e não da neoplasia. Este trabalho apresenta como principal objetivo a descrição de três casos clínicos de animais com diagnóstico de carcinoma de células escamosas, melanoma e sarcoma nasal indiferenciado, submetidos a quimioterapia metronómica, nomeadamente a ciclofosfamida, clorambucilo, anti-inflamatórios não esteróides e toceranib fosfato (Palladia ®). Paralelamente, foi ainda propósito deste estudo uma revisão atualizada dos fundamentos teóricos e de alguns casos clínicos descritos na literatura envolvendo esta abordagem terapêutica. In Veterinary Medicine, the concept of metronomic chemotherapy is still very new and the available studies are limited and preliminary. While the classic chemotherapy approach has the purpose of administering to the patient the maximum possible dose, the metronomic approach defends the use of the minimum dose required, with more frequency, for a longer period, eliminating the long rest periods between doses (contrary to what happens in the classical approach). It is believed that metronomic chemotherapy takes action at the level of the endothelial cells of the new vessels formed in the tumor microenvironment, by inhibiting tumor angiogenesis. Furthermore, this approach also shows a direct antineoplastic effect and immunomodulatory selective effects at the level of Treg lymphocytes, for benefit of the organism and not of the neoplasia. This work has as main objetive, the description of three clinical cases of animals diagnosed with squamous cell carcinoma, melanoma and nasal undifferentiated sarcoma, subjected to metronomic chemotherapy, particularly with cyclophosphamide, chlorambucil, nonsteroidal anti-inflammatory drugs and toceranib phosphate (Palladia ®). In parallel, it was also purpose of this study, to do an updated review of theory and some clinical cases described in the literature and involving this therapeutic approach.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária A doença oncológica surge com uma crescente preocupação em Medicina Veterinária e o linfoma, ou linfossarcoma, é uma das neoplasias mais comuns no cão. Os linfomas representam um grupo variado de neoplasias que têm em comum a sua origem, nos linfócitos, e que resultam da alteração e proliferação malignas dos mesmos em órgãos linfóides sólidos. A sua etiologia é multifatorial e apesar de haver grupos etários e raças mais afetados, qualquer animal pode vir a sofrer de linfoma. Os sinais clínicos são variáveis, de acordo com o tipo anatómico de linfoma. O diagnóstico pode ser feito com métodos clássicos, como citologia ou biópsia, mas, em casos duvidosos, novas técnicas como a citometria de fluxo ganham força. O tratamento adotado é maioritariamente o quimioterápico, com possibilidade de recurso a diferentes protocolos. Este trabalho visa fazer uma revisão atualizada sobre linfoma e expôr e discutir quatro casos clínicos. Este estudo tem como objetivo avaliar os métodos de diagnóstico e o tratamento, a partir da evolução clínica dos animais em questão. The oncologic disease is a growing concern in veterinary medicine, and lymphoma, or lymphosarcoma, is one of the most common malignancies in the dog. Lymphomas are a diverse group of neoplasms whose origin is in lymphocytes and that result from their alteration and proliferation in lymphoid solid organs. Its etiology is multifactorial and despite having races and age groups who are more affected, any animal may suffer from lymphoma. Clinical signs change according to the anatomical type of lymphoma. The diagnosis can be made by using more classic methods like cytology or biopsy, but in doubtful cases, new techniques, such as flow cytometry, are gaining strength. The most used treatment is the chemotherapy, with the possibility of using different protocols. This purpose of this paper is to do an updated review on lymphoma and present and discuss four clinical cases. This study also aims to evaluate the diagnostic methods and treatment, from the clinical course of the animals involved.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, Ciências Veterinárias A doença mixomatosa da válvula mitral (DMVM) é a doença cardíaca mais comum na espécie canina, resultando na dilatação do átrio esquerdo (AE) e do ventrículo esquerdo (VE). O eletrocardiograma (ECG) pode ser utilizado como meio de diagnóstico do aumento destas câmaras. No entanto, em medicina veterinária é utilizado principalmente o sistema padrão de 6 derivações, que demonstra uma baixa sensibilidade no diagnóstico de dilatação do átrio e ventrículo esquerdos. Assim, foi objetivo deste estudo verificar se o ECG de 12 derivações representa alguma vantagem no diagnóstico destas alterações cardíacas. Neste estudo não se verificou uma diferença com significado estatístico entre o número de animais a que foi diagnosticado dilatação das câmaras cardíacas esquerdas recorrendo a qualquer um dos métodos. No entanto, o ECG de 12 derivações permitiu detetar 30 % dos animais com dilatação do AE em relação aos 15% dos detetados pelo ECG de 6 derivações e 75% dos animais com dilatação do VE recorrendo ao ECG de 12 derivações em comparação com os 50% detetados com o ECG de 6 derivações. The myxomatous mitral valve disease (MMVD) is the most common cardiac disease in the canine specie, leading to left atrium (LA) and left ventricle (LV) dilatation. The electrocardiogram (ECG) can be used to diagnose the enlargement of these chambers. However, in veterinary medicine, the 6 Lead’s ECG system is the most commonly used, presenting a low diagnostic sensibility of the LA and LV dilatation. Because of that, the purpose of this study was to verify if the 12 lead’s ECG presents any advantage in this cardiac abnormalities diagnosis. It wasn’t verified any difference with statistical meaning between the number of animals diagnosed with left chambers dilation using any of both methods. However, the 12 lead’s ECG allowed to diagnose 30% of the animals with LA dilation comparing to just 15% of those diagnosed using the 6 lead’s ECG and 75% of the animals with LV dilatation with the 12 lead’s ECG while the 6 lead’s ECG allowed to diagnose just 50%.

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica e Laboratorial Os tumores mamários são a neoplasia mais comum na cadela. O estudo das neoplasias mamárias da cadela tem um elevado interesse clínico e científico, uma vez que estas são muito semelhantes ás da espécie humana. A cadela emergiu como um bom modelo comparativo para estudar vários aspectos da carcinogénese e da evolução clínica das neoplasias em ambas as espécies. O objectivo deste trabalho foi determinar a expressão de Cox-2, da proliferação tumoral medida pelo Ki-67 e da Caspase-3 activa, por detecção imunohistoquímica, com vista à pesquisa de uma possível correlação entre estes marcadores, pela participação comum em etapas da carcinogénese. No presente estudo, a Cox-2 e o IP do Ki-67 manifestaram uma maior expressão em tumores malignos e exibiram relação estatisticamente significativa com diversas variáveis clínico-patológicas que reflectem a agressividade do tumor. A Caspase-3 activa mostrou-se superior de forma estaticamente significativa nos tumores benignos relativamente aos malignos. No grupo dos tumores malignos, observou-se uma correlação positiva estatisticamente significativa entre a expressão da Cox-2 e o IP do Ki-67 e uma correlação negativa entre a expressão do IP do Ki-67 e a Caspase-3 activa. Não se observou uma correlação entre a expressão da Cox-2 e a Caspase-3 activa. Os nossos resultados sugerem que a Cox-2 desempenha um papel importante nos TMCs e parece estar envolvida na proliferação tumoral. Neste sentido, o uso de inibidores selectivos da Cox-2 apresenta-se como uma possibilidade no tratamento dos TMC. Mammary tumours are the most common neoplasm in the female dog. The study of the female dog’ mammary neoplasm is of high clinic and scientific interest, since they’re very similar to those of the human species. The female dog became, therefore, a good comparative model to study the various aspects of carcinogenesis and the clinical evolution of both species neoplasms. The purpose of this study was to determine the expression of the cox-2, of the tumour proliferation measured by the Ki-67 and the expression of the active Caspase-3, by immunohistochemical detection, with the intention of researching a possible correlation between theses markers, since they both participate in stages of carcinogenesis. In this study, the Cox-2 and the proliferation index of Ki-67 expressed a more extensive expression on malignant tumours and displayed a more significant statistic relation with various clinicopathological variables that reflect the aggressiveness of the tumour. The active Caspase-3 proved superior in a statically significant way on benign tumours comparatively to malign tumours. In the malign tumours’ group, it was observed a statically significant positive correlation between the expression of Cox-2 and the proliferation index of Ki-67 and a negative correlation between the expression of the proliferation index of Ki-67 and the active Caspase-3. There was no significant correlation between the expression of Cox-2 and active Caspase-3. Our results suggest that the Cox-2 performs an important role on canine mammary tumours (CMTs) and seems to be involved on the tumour proliferation. The use of the Cox-2’ selective inhibitors, therefore, present themselves as a possibility to the treatment of the CMTs.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária O Sapajus flavius, também denominado como macaco-prego galego, é uma espécie de macaco capuchinho pertencente aos Primatas do Novo Mundo. Encontra-se distribuído no nordeste brasileiro, nos biomas da Floresta Atlântica e da Caatinga. Esta espécie foi inicialmente descrita por George Marcgrave, em 1648, todavia, até ao ano de 2006 não existiam exemplares em coleções científicas. Atualmente, estima-se que existam cerca de 180 indivíduos. A espécie S. flavius está incluída na lista vermelha das espécies ameaçadas de extinção da IUCN (Internacional Union for Conservation of Nature), classificada como criticamente ameaçada. Até ao momento, não foram encontrados dados referentes aos valores da proteína C- reativa e das frações da globulina alfa, beta e gama para esta espécie. Estudos relativos ao restante proteinograma e às biometrias, destes animais, são escassos. No presente trabalho, foram definidos os valores destes parâmetros em doze macacos-prego galegos, clinicamente saudáveis. Estes animais encontravam-se em cativeiro, sob a posse do Centro de Triagem de Animais Silvestres (CETAS) e do Parque Zoobotânico Arruda Câmara, João Pessoa, Paraíba (Brasil). Relativamente ao proteinograma e à proteína C-reativa, a análise comparativa entre sexos não exerceu influência significativa (p>0,05) sobre os resultados do presente estudo. Nos parâmetros biométricos, a análise comparativa entre sexos demonstrou influência significativa (p0.05). Nevertheless, in the biometric parameters the comparative analysis between sexes revealed a significant influence (p

Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária A Diabetes Mellitus é das doenças endócrinas mais frequentes nos pequenos animais. Apesar da intensa investigação desta temática, até hoje não existem estudos comparativos entre a espécie canina e felina. Tendo em conta esta lacuna, foi consultada bibliografia diversa para a realização do estudo comparativo e foram escolhidos alguns factores considerados importantes na caracterização da amostra da espécie canina (n=22) e da espécie felina (n=13), sendo eles: epidemiológicos (raça, sexo, estado reprodutivo e idade), clínicos (sinais clínicos, tratamento e estado atual) e laboratoriais (bioquímica sérica, eletrólitos, hemograma e tira reativa). Depois de analisados os resultados verificou-se que, na espécie canina, houve diferenças no estado reprodutivo; presença de polidipsia/poliúria, anorexia, vómito, respiração tipo Kussmaul e cetoacidose diabética; tipo de insulina utilizada; alterações bioquímicas (triglicéridos, colesterol, bilirrubina, creatinina e AST); alterações eletrolíticas e da tira reativa (proteinúria e hematúria). Quanto à espécie felina, verificou-se diferenças quanto ao sexo; presença de polidipsia/poliúria, perda de peso, postura plantígrada e cetoacidose diabética; tipo de insulina utilizada, alterações bioquímicas (bilirrubina, creatinina, AST e GGT), alterações eletrolíticas e da tira reativa (cetonúria e bilirrubinúria). Obtiveram-se diferenças entre as espécies relativamente ao sexo; estado reprodutivo; condição corporal; presença de sinais clínicos como polifagia e postura plantígrada; alterações no hemograma e na tira reativa (cetonúria). Conclui-se que existem diferenças estatisticamente significativas na manifestação da Diabetes Mellitus entre a espécie canina e felina. Diabetes Mellitus is the most common endocrine disease in small animals practice. Despite the intensive investigation of this issue, until today there are no comparative studies between the canine and feline species. Given this gap, diverse literature was consulted to perform the comparative study and were chosen a few factors considered important in the characterization of the canine species sample (n = 22) and feline species sample (n = 13), namely: epidemiological (race, sex, reproductive status and age), clinical (clinical signs, treatment and current status) and laboratory (serum chemistry, electrolytes, blood count and urinary test strip). After analyzing the results it was found that, in dogs, there were differences in reproductive status; presence of polydipsia/polyuria; anorexia; vomiting; Kussmaul breathing type and diabetic ketoacidosis; type of insulin used; biochemical abnormalities (triglycerides, cholesterol, bilirubin, creatinine and AST), electrolyte changes and changes of the urinary test strip (presence of proteinuria and hematuria). As regards the felines, there are differences according to gender; presence of polydipsia/polyuria; weight loss; plantigrade posture and diabetic ketoacidosis; type of insulin; biochemical changes (bilirubin, creatinine, AST and GGT), electrolyte abnormalities and changes of the urinary test strip (presence of ketonuria and bilirubinuria). We obtained differences between species in relation to sex, reproductive status, body condition, presence of clinical signs such as polyphagia and plantigrade posture, changes in blood count and changes of the urinary test strip (presence of ketonuria).condition, presence of clinical signs such as polyphagia and plantigrade posture, changes in blood count and changes of the urinary test strip (presence of ketonuria). We conclude that there are significant differences in the manifestation of diabetes mellitus between the canine and feline species.

Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária O hiperadrenocorticismo, ou síndrome de Cushing, é uma das patologias endócrinas mais comuns no paciente canino. Caracteriza-se pelo conjunto de sinais clínicos e alterações bioquímicas provocadas pelo excesso de cortisol em circulação. Existem três causas principais para o hipercortisolismo: a sobreprodução de hormona adrenocorticotrópica pela hipófise (hiperadrenocorticismo dependente da hipófise), a sobreprodução de cortisol por um tumor adrenocortical (hiperadrenocorticismo dependente da adrenal) ou a administração excessiva/prolongada de glucocorticóides (hiperadrenocorticismo iatrogénico). A suspeita de Síndrome de Cushing é baseada na história, exame físico e alterações bioquímicas e deve ser confirmada através de provas endócrinas e técnicas de imagem. O diagnóstico de hiperadrenocorticismo engloba duas etapas: a confirmação do hiperadrenocorticismo e sua caracterização quanto à origem. A modalidade de tratamento deve ser seleccionada tendo em conta a causa do hiperadrenocorticismo, a idade, o estado geral do animal e a existência de doenças concorrentes. Dependendo do caso podemos optar por tratamento cirúrgico, tratamento farmacológico ou radioterapia. O presente trabalho é um estudo retrospectivo de quatro casos clínicos de hiperadrenocorticismo. Pretende-se com este trabalho, avaliar a eficácia dos meios de diagnóstico e métodos de tratamento utilizados actualmente na prática clínica, bem como fazer uma revisão actualizada do tema em questão.