Pesquisa de biomarcadores tumorais com potencial terapêutico em tumores melanocíticos do cão: expressão de linfócitos T e cicloxigenase-2

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária Os tumores melanocíticos são tumores de células redondas comuns em cães, tendo apresentação e comportamento biológico variável. Podem-se localizar na cavidade oral (56%), lábios (23%), pele (11%) e dedos (8%), sendo que as outras localizações, incluindo o olho, representam apenas 2%. Algumas características clínicas e histopatológicas como o grau de pigmentação, localização (dérmica ou hipodérmica no caso de melanomas cutâneos), ulceração e dimensão contribuem significativamente para definir o prognóstico em casos de melanomas. Um dos mecanismos mais importantes implicados na regulação do crescimento das células tumorais é a resposta imunitária mediada por células. No entanto, o papel do infiltrado inflamatório nas lesões neoplásicas não é ainda totalmente compreendido devido à disparidade de resultados nos estudos já realizados. A enzima cicloxigenase-2 (COX-2) não existe nas células em condições normais, apenas quando induzida por fatores de crescimento, reacções inflamatórias, promotores tumorais e oncogenes. Assim, ocorre em condições patológicas como o cancro e é responsável pela angiogénese, metástases, pela inibição da apoptose, pela imunossupressão e pela proliferação de células neoplásicas. Desta forma, associa-se a sua presença à malignidade. Assim, neste trabalho estudou-se o significado do infiltrado linfóide por linfócitos T CD3+, tanto em número de linfócitos como no tipo de infiltrado que estes apresentam. Estudou-se ainda a presença de cicloxigenase-2 nos tecidos tumorais de forma a corroborar os resultados obtidos para o infiltrado linfocitário, uma vez que não existem estudos em número suficiente para se poder comparar e discutir os resultados obtidos. Na ausência de dados relacionados com a sobrevida dos animais que permitam fazer estudos de prognóstico, foram avaliadas características histológicas apontadas por alguns autores como associadas à agressividade dos tumores e associadas aos dados do infiltrado inflamatório e à reacção do tecido tumoral com a COX-2. O objetivo de comprovar que os linfócitos T e a cicloxigenase-2 estão presentes em tumores melanocíticos, principalmente, nos malignos, é o facto de se poderem considerar novas possibilidades terapêuticas como a utilização de anti-inflamatórios inibidores específicos da COX-2. Com o objetivo de pesquisar biomarcadores da agressividade biológica passíveis de poderem constituir novos alvos terapêuticos, estudamos por imunohistoquímica os linfócitos infiltrantes no tumor (LITs), nomeadamente os linfócitos T CD3+, e a expressão de cicloxigenase-2 (Cox-2) em 39 tumores melanocíticos caninos. O número de linfócitos T CD3+ foi superior nos melanomas do que nos melanocitomas e em tumores localizados na cavidade oral do quer nos tumores da pele. Observou-se ainda um maior número de LITs em tumores com características histológicas associadas classicamente à agressividade do tumor, como necrose, ulceração, êmbolos tumorais, atipia nuclear e o índice mitótico. Em relação à localização dos LITs, verificou-se ainda que os tumores malignos apresentam, na maior parte dos casos, um infiltrado intratumoral assim como os tumores orais. Quanto à imunoreatividade com a COX-2, esta foi mais elevada nos tumores malignos, nos tumores orais e com características histológicas de maior agressividade biológica. Os LITs e a COX-2, associam-se de forma estatisticamente significativa entre si, isto é, tumores com maior número LITs, apresentam uma maior percentagem de células positivas e com maior intensidade de marcação para a cicloxigenase-2. Uma percentagem de células marcadas pela COX-2 (p=0,002) e a intensidade de marcação (p=0,005) associaram-se a uma infiltração intratumoral. Já quando a intensidade é negativa, é mais frequente não existir infiltrado de linfócitos T CD3+. Estas associações perdem-se nos tumores malignos. Este estudo sugere que os moduladores da resposta inflamatória, incluindo os inibidores da Cox-2 poderão ter um papel importante no tratamento do melanoma canino. Melanoma is a round cell tumour with variable presentation and biological behaviour that is common in dogs. Melanomas can be found in the oral cavity (56%), lips (23%), skin (11%), digits (8%) and eye (2%). Some clinical and histological characteristics such as the degree of pigmentation, site, ulceration and size contribute to define the prognosis. One of the most important mechanisms implicated on regulating the growth of tumour cells is the immune response mediated by cells. However, the role of inflammatory infiltrate in tumours is not fully understood yet due to the contradictory results of the studies available. Cycloxigenase-2 (COX-2) is an enzyme that doesn’t exist in cells under normal conditions. It is only synthetized when stimulated by growth factors, inflammation, tumour promoters and oncogenes. Therefore, it occurs in cancer and is associated with malignancy because it is responsible for angiogenesis, metastasis, apoptosis inhibition, immunosuppression and tumour cells proliferation. The number and the type of infiltrate of T lymphocytes CD3+ were studied in this thesis as well as the presence of COX-2 on tumour tissue in order to associate the two markers since there aren’t enough studies on this matter in veterinary medicine. Since the data for survival time of the animals included in this study was unavailable, we associated some of the histological features that are known to be correlated with malignancy with the T lymphocyte infiltrate and the immunostaining for COX-2. The main goal of identifying T lymphocytes and COX-2 in melanomas is to explore new therapeutic approaches like anti-inflammatory drugs, including COX-2 specific inhibitors. 39 melanoma samples were stained by immunohistochemistry techniques to identify both T lymphocytes CD3+ and COX-2. The results of this study showed that the number of T lymphocytes CD3+ was higher in malignant oral melanoma rather than in benign cutaneous melanoma. Their number was also higher in melanomas that presented histological features that indicated malignancy such as necrosis, ulceration, intravascular tumour cells, nuclear atypia and high mitotic index. Concerning the position of the T lymphocyte CD3+ infiltrate, the results showed that malignant and oral melanoma frequently presented an intratumoral infiltrate. COX-2 stained a higher number of cells in malignant oral melanomas with histologic features that indicate malignancy. T lymphocytes CD3+ and COX-2 showed to be statistically correlated. That is when the number of T lymphocytes CD3+ was high, so was the number of tumour cells stained by COX-2 and the T lymphocyte infiltrate was intratumoral. When the staining for COX-2 was negative, the T lymphocyte CD3+ infiltrate was usually absent. These statistical associations were lost when considering just the malignant tumours. These findings show that the use of anti-inflammatory drugs should be considered as a therapeutic option for melanomas.