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Este documento corresponde al Trabajo de Titulación de la Maestría en Educación mención en Educación Inclusiva, Modalidad Portafolio. El programa de Maestría en Educación mención Educación Inclusiva plantea dentro de su perfil de egreso la formación de profesionales competentes en su formación teórica; sensibles, creativos y reflexivos frente a la diversidad de los estudiantes, sus familias, y necesidades; conocedores del contexto ecuatoriano y de las políticas que favorecen la atención a la diversidad. El portafolio se define como una colección de evidencias sistemática y organizada que se utiliza para monitorear el desarrollo de conocimientos, habilidades y actitudes (competencia) en un área específica (Takona, 2003). El portafolio con fines académicos tiene el propósito de demostrar el desarrollo de competencias profesionales mediante la sistematización de evidencias de aprendizaje, y la reflexión y análisis de las teorías vinculadas a la educación inclusiva y su impacto en la práctica profesional. El presente portafolio se compone de un ensayo reflexivo - argumentativo y diferentes evidencias de aprendizaje, trabajos orientados a fortalecer los aprendizajes generales de tipo cognitivo, procedimental y actitudinal de la Maestría y al desarrollo de competencias de la formación disciplinar (perfil de egreso). Enlace E-portafolio: https://sites.google.com/d/1AfZwReHV7W0chmENPOPh1ZAEjekVLbgJ/p/14ehRlzDS-JBXsuJjOJouOx39aMTaG5rc/edit Guayaquil Máster en Educación mención en Educación Inclusiva

The objective of this study was to determine the effects of coating nanoparticles of titanium dioxide (TiO2 NPs) and irradiation -UV on plates of titanium (Ti) for the adhesion and proliferation of human gingival fibroblasts (HGF). A total of 15 Ti plates were divided into three groups (n = 5); (i) control Ti, (ii) experimental: Ti+TiO2 NPs, (iii) experimental: Ti+TiO2 NPs+UV. The plates were analyzed with atomic force microscopy (AFM) and the roughness (Ra and Rmax) was determined. UV irradiation was performed for 20 min. HGF were subcultured in DMEM+10 % fetal bovine serum (FBS) at 37 °C with 5 % CO2. 2x106 cells/mL were inoculated on the plates and incubated for 1 h and washed with phosphate buffer saline (PBS). In the case of cell proliferation, cells were incubated for further 24 h more. Cell viability was determined with the MTT method, the formazan was dissolved with dimethylsulfoxide (DMSO) and analyzed at 540 nm. Experiments were performed of three independent experiments and data were analyzed by Kruskall-Wallis and multiple comparison of Mann-Whitney test. The surface topography of samples corresponded as follow: Ti (Ra= 0,492 µm y Rms= 0.640 µm), Ti+NPs TiO2, (Ra= 0.55 µm y Rms= 0.714 µm), respectively. The coating with TiO2 NPs significantly (p

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Bacteria have a communication system among cells, dependent on cellular density, called quorum sensing. Knowledge of phenotypes controlled by this system, such as production of hydrolytic enzymes which result in food spoilage, biofilm formation and mechanisms of pathogenicity will contribute to elucidate important processes in food microbiology and development of control strategies for pathogenic and spoilage microorganisms. The aim of this study was to determine the phenotypes regulated by quorum sensing in Aeromonas hydrophila isolated from cooled raw milk. Phenotypic characteristics, such as production of the hydrolytic enzymes, motility, biofilm formation and protein profile of A. hydrophila ATCC 7966 and Embrapa 029 wild-type strains, and acyl homoserine lactones (AHLs)-deficient mutant were compared. A. hydrophila QS mutants were constructed using a site-directed mutagenesis strategy. The ahyI gene was interrupted by gentamicin 3-acetyltransferase gene using the suicide vector pKNG101. Mutant bacteria 029-8, 029-14 and 029-21 showed the quorum sensing system compromised and they were not able to produce detectable AHL by the Chromobacterium violaceum CV026. However, A. hydrophila mutants showed intact ahyI and ahyR when analyzed by PCR. By RT-PCR technique, A. hydrophila mutant strain QS 029-14 was unable to transcribe ahyI and ahyR genes, which proved the inability to produce the regulatory protein response (AhyR) and AHL synthase (AhyI). These mutants lost the capacity to hydrolyze gelatin and showed losses or reduction of proteolytic activity. Swimming motility and β-hemolysis activity were observed in wild-type strain while these characteristics were absent in A. hydrophila QS 029-14. This leads to the indication that these features are under regulation of quorum sensing system. Both wild-type and mutant strains showed amylase and lipase activities. A. hydrophila wild-type and its mutant strain QS 029-14 were able to adhere on stainless steel coupons immersed in TYEP broth. The mutant strain QS 029-14 showed a lower adhesion which was verified by both the viable sessile cells counts and microscopic analysis of the coupons. This result strongly indicates the role of quorum sensing mechanism in the regulation of biofilm formation in this species. Polyacrylamide gel analysis of cell-free supernatants and intracellular proteins showed a differential expression of intracellular and extracellular proteins produced by A. hydrophila ATCC 7966 and Embrapa 029 wild-type strains and A. hydrophila 029-14 mutant strain. These data leads to the indication that quorum sensing system might be involved in the regulation of some extracellular and intracellular proteins. The mass spectrometry analysis and sequencing of the amino-terminal region of the protein band present in the extracellular supernatant of the mutant strain QS 029-14 suggest an increased expression of ABC-type transporter. These results suggest that the quorum sensing system or the factor or factors related to the transcription of genes ahyI and ahyR regulate the expression of genes responsible for the proteolytic activity, β-hemolysis, motility and biofilm formation in A. hydrophila. As bactérias apresentam um sistema elaborado de comunicação entre células dependente de densidade celular, denominado quorum sensing. O conhecimento de fenótipos controlados por esse sistema, como a produção de enzimas hidrolíticas que resultam na deterioração de alimentos, formação de biofilmes e mecanismos de patogenicidade podem contribuir para a elucidação de processos importantes na microbiologia de alimentos e permitir a elaboração de estratégias de controle de patógenos e deterioradores. O objetivo deste trabalho foi determinar fenótipos regulados por quorum sensing em Aeromonas hydrophila, isolada de leite cru refrigerado. Foram comparadas características fenotípicas, como produção de enzimas hidrolíticas, motilidade, formação de biofilmes e perfil protéico das estirpes selvagens Embrapa 029 e ATCC 7966 de A. hydrophila mutantes incapazes de sintetizar homoserina lactonas aciladas (AHLs), moléculas sinal do sistema quorum sensing. Os mutantes de A. hydrophila foram construídos utilizando a estratégia de mutação sítio dirigida, pela interrupção do gene ahyI com o gene que codifica gentamicina-3-acetiltransferase, utilizando o vetor suicida pKNG101. Os mutantes 029-8, 029-14 e 029-21, comprovadamente apresentaram o sistema quorum sensing comprometido e não foram capazes de produzir AHL detectáveis pelo biomonitor Chromobacterium violaceum CV026. Entretanto, estes mutantes apresentaram os genes ahyI e ahyR intactos quando analisados por PCR. Pela técnica de RT-PCR foi constatado que A. hydrophila QS 029-14 foi incapaz de transcrever os genes ahyR e ahyI, o que comprovou a incapacidade de produzir a proteína reguladora de resposta (AhyR) e a sintase de AHL (AhyI). Estes mutantes perderam a capacidade de hidrolisar gelatina e apresentaram perda ou redução da atividade de hidrólise de caseína. A atividade de β-hemólise e a motilidade tipo swimming, comumente observada na estirpe selvagem, não foram observadas no mutante A. hydrophila QS 029-14, o que indica que estas características estão sob regulação do quorum sensing. As estirpes selvagens e mutantes apresentaram atividades das enzimas amilase e lipases. Estirpes selvagens e o mutante QS 029-14 de A. hydrophila foram capazes de aderir aos cupons de aço inoxidável imersos em meio TYEP. Entretanto, menor adesão do mutante QS 029-14 foi verificada tanto pela contagem de células sésseis viáveis como pela observação microscópica dos cupons. Este resultado reforça as evidências do envolvimento do mecanismo de quorum sensing na regulação da formação de biofilmes nesta espécie. A análise dos sobrenadantes livres de células e de proteínas intracelulares, em gel de poliacrilamida 12 %, evidenciou a expressão diferencial de proteínas extracelulares e intracelulares produzidas pelas estirpes A. hydrophila Embrapa 029, ATCC 7966 e A. hydrophila mutante QS 029-14, sugerindo que o sistema quorum sensing pode estar envolvido na regulação de algumas proteínas extracelulares e intracelulares. A análise de espectrometria de massa e sequenciamento da região amino-terminal de uma banda de proteína presente no sobrenadante extracelular da estirpe mutante QS 029-14 sugerem uma maior expressão de transportador ABC nesta estirpe. Os resultados sugerem que o sistema quorum sensing ou o fator ou fatores que regulam a transcrição dos genes ahyI e ahyR regulam a expressão de genes responsáveis pela atividade proteolítica, β-hemólise, motilidade, formação de biofilmes e possivelmente de transportadores de membrana em A. hydrophila.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Many bacteria present an elaborate system of communication dependent of cell density known as quorum sensing, and the knowledge of the phenotypes controlled by this mechanism may contribute for the elucidation of important processes in food microbiology. The objective of this study was to determine phenotypes regulated by quorum sensing in Enterobacter cloacae 067 isolated from cooled raw milk. Phenotypic characteristics of E. cloacae 067 wild type were compared to the transconjugant strain, that synthesizes the lactonase enzyme, which is responsible for hydrolysis of Nacylhomoserine lactones (AHLs) that are signal molecules of the quorum sensing system. Wild type and transconjugant strains of E. cloacae 067 were grown in temperatures from 4 °C until 43 °C. The optimum temperature was between 36 °C and 43 °C and the maximum population was reached at 30 °C. The optical density of transconjugant strain culture was higher (p < 0,05) than the wild type in both complex and in mineral medium which contained only one organic carbon source. The swarming motility was not verified in E. cloacae strains tested and the twitching motility was not modified in the transconjugant. Biofilms was formed in polystyrene surface and E. cloacae 067 wild type presented higher adhesion than the transconjugant strain when cultivated in Luria Bertani medium (LB), triptona, extract yeast and phosphate medium (TYEP), and in minimal medium (MMS). The addition of calcium to the TYEP medium reduced the biofilm formation by the wild type, but not in the transconjugant. In stainless steel surface, the adhesion of the wild type was approximately one logarithmic cycle higher than the transconjugant until 48 hours of incubation. After this period, differences were not detected in both microscopic observation and in the counting of adhered viable cells. The difference in adhesion of E. cloacae 067 wild type and transconjugant in polystyrene and stainless steel suggests that quorum sensing system regulates biofilm formation by this strain. Amylases, celulases, lipases and pectinases activities were not verified in the wild type and transconjugant strains of E. cloacae 067. However, the transconjugant strain was capable to use gelatin after 12 days of incubation at 30 °C. The transconjugant of E. cloacae 067 presented higher proteolytic activity in casein agar and in LB agar added of 2% (w/v) of skim milk. This strain also presented higher degree of proteolyses than the wild type. The spoilage of reconstituted 12% (w/v) skim milk and of pasteurized milk for E. cloacae 067 transconjugant occurred after 36 hours of incubation, while the milk spoilage for the wild type strain occurred only after 96 hours. These results suggest the existence of a mechanism of partial negative regulation of proteolytic activity in E. cloacae 067 for the quorum sensing system. The proteolytic activity of both strains was not detected in the zimogram azocasein gel. However, when gelatin was used as substrate, it was possible to observe proteolytic activity in protein extract of the wild type and transconjugant strains. Analysis of the free supernatant of cells, concentrated 15 turn, in SDS-PAGE exhibited higher number of extracellular protein bands produced by E. cloacae 067 wild type than the transconjugant. Therefore, this suggests that besides proteases, quorum sensing system may be involved in the regulation of other extracellular proteins. Muitas bactérias apresentam um sistema elaborado de comunicação entre células dependente de densidade celular, denominado como quorum sensing, e o conhecimento de fenótipos controlados por esse mecanismo pode contribuir para a elucidação de processos importantes na microbiologia de alimentos. O objetivo deste trabalho foi determinar fenótipos regulados por quorum sensing em Enterobacter cloacae 067, isolado de leite cru refrigerado. Foram comparadas características fenotípicas da estirpe selvagem de E. cloacae 067 com uma estirpe transconjugante, que sintetiza a enzima lactonase, responsável pela hidrólise de acil homoserina lactonas (AHLs), moléculas sinal do sistema quorum sensing. Estirpes selvagem e transconjugante de E. cloacae 067 cresceram em temperaturas de 4 °C a 43 °C, com ótimo entre 36 °C e 43 °C e a população máxima foi atingida a 30 °C. A densidade óptica das culturas da estirpe transconjugante foram maiores (p < 0,05) do que a da selvagem, tanto em meios de cultura complexos como em meios minerais, contendo uma única fonte de carbono orgânico. A motilidade por espalhamento não foi verificada nas estirpes testadas e a motilidade por contração não foi alterada no transconjugante. Biofilmes foram formados em superfície de poliestireno e a estirpe E. cloacae 067 selvagem apresentou maior adesão que a estirpe transconjugante, quando cultivada nos meios Luria Bertani (LB), triptona, extrato de levedura e fosfato (TYEP) e meio mínimo de sais (MMS). A adição de cálcio ao meio TYEP reduziu a formação de biofilmes pela estirpe selvagem, mas não na transconjugante. Em superfície de aço inoxidável a adesão da estirpe selvagem foi cerca de um ciclo logarítmico maior do que a transconjugante, por até 48 horas de incubação. Após este período, diferenças entre as estirpes não foram detectadas, tanto na observação microscópica quanto na contagem de células viáveis aderidas. A diferença na adesão de E. cloacae 067 selvagem e transconjugante em poliestireno e em aço inoxidável sugere que o sistema quorum sensing regula a formação de biofilmes nesta estirpe. Atividades das enzimas amilases, celulases, lipases e pectinases não foram verificadas nas estirpes selvagem e transconjugante de E. cloacae 067. Entretanto, o transconjugante foi capaz de liquefazer a gelatina após 12 dias de incubação a 30 °C, o que não foi observado na estirpe selvagem. O transconjugante de E. cloacae 067 também apresentou maior atividade proteolítica em ágar caseinato e em ágar LB acrescido de 2 % de leite e maior grau de proteólise do leite do que o selvagem. A coagulação do leite desnatado reconstituído a 12 % e do leite pasteurizado por E. cloacae 067 transconjugante ocorreu após 36 horas de incubação, enquanto a estirpe selvagem coagulou o leite somente após 96 horas. Estes resultados sugerem a existência de um mecanismo de regulação negativa da atividade proteolítica em E. cloacae 067 pelo sistema quorum sensing. A atividade proteolítica de ambas as estirpes avaliadas não foi detectada em zimograma contendo azocaseína como substrato. Entretanto, quando gelatina foi usada como substrato, foi possível a observação de atividade proteolítica no extrato proteico das estirpes selvagem e transconjugante no gel. A análise dos sobrenadantes livres de células e concentrados 15 vezes, em gel de poliacrilamida evidenciou maior número de bandas de proteínas extracelulares produzidas pela E. cloacae 067 selvagem do que pela transconjugante, sugerindo que o sistema quorum sensing pode estar envolvido na regulação de outras proteínas extracelulares, além de proteases.