Phenotypics characteristics by Enterobacter cloacae controlled for the system quorum sensing

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Many bacteria present an elaborate system of communication dependent of cell density known as quorum sensing, and the knowledge of the phenotypes controlled by this mechanism may contribute for the elucidation of important processes in food microbiology. The objective of this study was to determine phenotypes regulated by quorum sensing in Enterobacter cloacae 067 isolated from cooled raw milk. Phenotypic characteristics of E. cloacae 067 wild type were compared to the transconjugant strain, that synthesizes the lactonase enzyme, which is responsible for hydrolysis of Nacylhomoserine lactones (AHLs) that are signal molecules of the quorum sensing system. Wild type and transconjugant strains of E. cloacae 067 were grown in temperatures from 4 °C until 43 °C. The optimum temperature was between 36 °C and 43 °C and the maximum population was reached at 30 °C. The optical density of transconjugant strain culture was higher (p < 0,05) than the wild type in both complex and in mineral medium which contained only one organic carbon source. The swarming motility was not verified in E. cloacae strains tested and the twitching motility was not modified in the transconjugant. Biofilms was formed in polystyrene surface and E. cloacae 067 wild type presented higher adhesion than the transconjugant strain when cultivated in Luria Bertani medium (LB), triptona, extract yeast and phosphate medium (TYEP), and in minimal medium (MMS). The addition of calcium to the TYEP medium reduced the biofilm formation by the wild type, but not in the transconjugant. In stainless steel surface, the adhesion of the wild type was approximately one logarithmic cycle higher than the transconjugant until 48 hours of incubation. After this period, differences were not detected in both microscopic observation and in the counting of adhered viable cells. The difference in adhesion of E. cloacae 067 wild type and transconjugant in polystyrene and stainless steel suggests that quorum sensing system regulates biofilm formation by this strain. Amylases, celulases, lipases and pectinases activities were not verified in the wild type and transconjugant strains of E. cloacae 067. However, the transconjugant strain was capable to use gelatin after 12 days of incubation at 30 °C. The transconjugant of E. cloacae 067 presented higher proteolytic activity in casein agar and in LB agar added of 2% (w/v) of skim milk. This strain also presented higher degree of proteolyses than the wild type. The spoilage of reconstituted 12% (w/v) skim milk and of pasteurized milk for E. cloacae 067 transconjugant occurred after 36 hours of incubation, while the milk spoilage for the wild type strain occurred only after 96 hours. These results suggest the existence of a mechanism of partial negative regulation of proteolytic activity in E. cloacae 067 for the quorum sensing system. The proteolytic activity of both strains was not detected in the zimogram azocasein gel. However, when gelatin was used as substrate, it was possible to observe proteolytic activity in protein extract of the wild type and transconjugant strains. Analysis of the free supernatant of cells, concentrated 15 turn, in SDS-PAGE exhibited higher number of extracellular protein bands produced by E. cloacae 067 wild type than the transconjugant. Therefore, this suggests that besides proteases, quorum sensing system may be involved in the regulation of other extracellular proteins. Muitas bactérias apresentam um sistema elaborado de comunicação entre células dependente de densidade celular, denominado como quorum sensing, e o conhecimento de fenótipos controlados por esse mecanismo pode contribuir para a elucidação de processos importantes na microbiologia de alimentos. O objetivo deste trabalho foi determinar fenótipos regulados por quorum sensing em Enterobacter cloacae 067, isolado de leite cru refrigerado. Foram comparadas características fenotípicas da estirpe selvagem de E. cloacae 067 com uma estirpe transconjugante, que sintetiza a enzima lactonase, responsável pela hidrólise de acil homoserina lactonas (AHLs), moléculas sinal do sistema quorum sensing. Estirpes selvagem e transconjugante de E. cloacae 067 cresceram em temperaturas de 4 °C a 43 °C, com ótimo entre 36 °C e 43 °C e a população máxima foi atingida a 30 °C. A densidade óptica das culturas da estirpe transconjugante foram maiores (p < 0,05) do que a da selvagem, tanto em meios de cultura complexos como em meios minerais, contendo uma única fonte de carbono orgânico. A motilidade por espalhamento não foi verificada nas estirpes testadas e a motilidade por contração não foi alterada no transconjugante. Biofilmes foram formados em superfície de poliestireno e a estirpe E. cloacae 067 selvagem apresentou maior adesão que a estirpe transconjugante, quando cultivada nos meios Luria Bertani (LB), triptona, extrato de levedura e fosfato (TYEP) e meio mínimo de sais (MMS). A adição de cálcio ao meio TYEP reduziu a formação de biofilmes pela estirpe selvagem, mas não na transconjugante. Em superfície de aço inoxidável a adesão da estirpe selvagem foi cerca de um ciclo logarítmico maior do que a transconjugante, por até 48 horas de incubação. Após este período, diferenças entre as estirpes não foram detectadas, tanto na observação microscópica quanto na contagem de células viáveis aderidas. A diferença na adesão de E. cloacae 067 selvagem e transconjugante em poliestireno e em aço inoxidável sugere que o sistema quorum sensing regula a formação de biofilmes nesta estirpe. Atividades das enzimas amilases, celulases, lipases e pectinases não foram verificadas nas estirpes selvagem e transconjugante de E. cloacae 067. Entretanto, o transconjugante foi capaz de liquefazer a gelatina após 12 dias de incubação a 30 °C, o que não foi observado na estirpe selvagem. O transconjugante de E. cloacae 067 também apresentou maior atividade proteolítica em ágar caseinato e em ágar LB acrescido de 2 % de leite e maior grau de proteólise do leite do que o selvagem. A coagulação do leite desnatado reconstituído a 12 % e do leite pasteurizado por E. cloacae 067 transconjugante ocorreu após 36 horas de incubação, enquanto a estirpe selvagem coagulou o leite somente após 96 horas. Estes resultados sugerem a existência de um mecanismo de regulação negativa da atividade proteolítica em E. cloacae 067 pelo sistema quorum sensing. A atividade proteolítica de ambas as estirpes avaliadas não foi detectada em zimograma contendo azocaseína como substrato. Entretanto, quando gelatina foi usada como substrato, foi possível a observação de atividade proteolítica no extrato proteico das estirpes selvagem e transconjugante no gel. A análise dos sobrenadantes livres de células e concentrados 15 vezes, em gel de poliacrilamida evidenciou maior número de bandas de proteínas extracelulares produzidas pela E. cloacae 067 selvagem do que pela transconjugante, sugerindo que o sistema quorum sensing pode estar envolvido na regulação de outras proteínas extracelulares, além de proteases.