Search

Ovaj diplomski rad sastoji se od istraživačkoga i metodičkog dijela. U istraživačkom dijelu opisana je priprava O-metiloksima kinuklidin-3-ona klasičnom sintezom te primjenom mehanokemije i mikrovalnog zračenja. Spoj je pripravljen reakcijom hidrokloridnih soli kinuklidin-3-ona i metoksiamina bez dodatka baze. Kvaternizacijom kinuklidinskog dušikova atoma pripravljenog Ometiloksima s metil-jodidom, benzil-bromidom te različito supstituiranim benzil-bromidima (nitro skupine i atomi halogena u meta i para položaju) pripravljena je serija od 10 novih kvaternih derivata kinuklidin-3-on-O-metiloksima. Reakcije su praćene spektroskopijom ATR. Pripravljenim spojevima koji do sada nisu opisani u literaturi, određeno je talište te su strukture dobivenih spojeva potvrđene spektrometrijom masa, infracrvenom spektroskopijom, te 1D i 2D spektroskopijom NMR. Cilj metodičkog dijela rada je potaknuti nastavnike kemije na kreativnost u nastavi temeljenoj na učenju otkrivanjem unutar koncepta Enzimi. Navedena tema je izborni sadržaj u novom kurikulumu Kemije četvrtoga razreda gimnazije. Osmišljen je pokus na temelju kojega su oblikovani metodičkodidaktički materijali za jedan 90-minutni nastavni sat. Pri tome su postavljeni odgojno-obrazovni ciljevi temeljeni na prethodnim učeničkim znanjima, vještinama i sposobnostima. This thesis consists of a research and methodological part. The research part describes the preparation of O-methyloxime of quinuclidin-3-one by classical synthesis and the application of mechanochemistry and microwave radiation. The compound was prepared by the reaction of hydrochloride salts of quinuclidin-3-one and methoxyamine without the addition of a base. By quaternization of the quinuclidine nitrogen atom of prepared O-methyloxime with methyl iodide, benzyl bromide and differently substituted benzyl bromides (nitro groups and halogen atoms in the meta and para positions), a series of 10 new quaternary derivatives of quinuclidine-3-one-O-methyloxime was prepared. The reactions were monitored by ATR spectroscopy. The melting points of the prepared compounds, which have not been described in the literature so far, was determined, and the structures of the obtained compounds were confirmed by mass spectrometry, infrared spectroscopy, and 1D and 2D NMR spectroscopy. The goal of the methodological part of thesis is to encourage chemistry teachers to be creative in teaching based on learning through discovery within the concept of Enzymes. The mentioned topic is an optional content in the new chemistry curriculum of the fourth grade of high school. An experiment was designed on the basis of which methodological and didactic materials were designed for one 90-minute lesson. In doing so, educational goals were set based on previous student knowledge, skills and abilities.

Biotehnologija je vrlo stara tehnologija. Čovječanstvo ju koristi značajno dulje od razdoblja kada ju je počelo razumijevati. Od 19. stoljeća kada je otkriveno da se fermentacija odvija zbog enzima koji se nalaze u stanicama mikroorganizama, pa sve do danas, napravljeni su značajni iskoraci u razumijevanju procesa i svega što se događa u mikroorganizmima, ali i u razvoju naprednih tehnologija i tehnikama koje su omogućile dobivanje biokatalizatora s unaprjeđenim svojstvima i u velikim količinama1. Priroda je od davnina uspješna u razvoju procesa na visokoj skali kojima rješava određene izazove u prirodi i kao takva nam može služiti kao nepresušan izvor inspiracije. Kao primjer možemo navesti fotosintezu kojom priroda neutralizira CO2 stvarajući kisik. Ipak, aktivnost u tehnosferi je prevelika, pa količina otpada i stakleničkih plinova koje čovječanstvo generira rastu. Stoga priroda treba našu pomoć kroz razvoj tehnologija s minimalnim negativnim učinkom na okoliš. Osim što se danas radi na razvoju enzima za razgradnju plastike, gdje je zabilježen značajan napredak, mnogo je i svijetlih primjera zamjene tradicionalnih kemijskih procesa biokatalitičkim procesima u industriji, a i novih procesa koji uključuju sintezu korisnih kemikalija poput lijekova (slika 1), polimera i biogoriva. Ovi su procesi bolji za okoliš, ekonomski su isplativi i troše manje energije jer se odvijaju pri blagim reakcijskim uvjetima. Strategija biogospodarstva EU2 jasno definira smjerove razvoja biotehnologije, a jedan od njih uključuje osnaživanje i uvećanje procesa u bio- sektoru. Također, prema Planu strateških inovacija i istraživanja3 smatra se da bioindustrija treba raditi na inovativnim i obećavajućim tehnologijama i dizati ju na industrijsku razinu. Među tehnologijama se navode i industrijska biotehnologija i biokataliza. Slika 1 Shematski prikaz biokatalize. 1 Editorial, Nature Catalysis 3 (2020) 179-180 2 European Commission, Directorate-General for Research and Innovation, A sustainable bioeconomy for Europe: strengthening the connection between economy, society and the environment: updated bioeconomy strategy, Publications Office, 2018, https://data.europa.eu/doi/10.2777/792130 3 European Commission, Directorate-General for Research and Innovation, Strategic Research and Innovation Agenda (SRIA) of the European Open Science Cloud (EOSC), Publications Office of the European Union, 2022, https://data.europa.eu/doi/10.2777/935288

Enzimi su biološki katalizatori koji u posebno definiranim uvjetima ubrzavaju biokemijske reakcije u živim organizmima. Upravo u tu skupinu organskih makromolekula ubrajamo i proteaze. Prilikom izrade ovog rada, u eksperimentalnom dijelu su korištene tri komercijalne proteaze: Alkalaza, Novozyme 37071 i Novo-Pro D. Proteaze su korištene s ciljem hidrolize proteina u otpadu ljuski kozica. Provedbom te reakcije uklanjaju se proteini što predstavlja jedan od koraka koji bi omogućio izdvajanje preostalih korisnih spojeva koji u prirodi često dolaze zajedno. Ovaj način izdvajanja ima brojne prednosti u usporedbi s drugim poznatim metodama. Rezultati ukazuju na to da su enzimi bili vrlo efikasni u provođenju proteolitičke reakcije te se osobito iskazao biokatalizator Novo-Pro D. Enzymes are biological catalysts that accelerate biochemical reactions in organisms under specifically required conditions. Proteases also belong to the group of organic macromolecules called enzymes. Three commercial proteases were used in the experimental work in the laboratory: Alcalase, Novozyme 37071 and Novo-Pro D. The proteases were used to hydrolyze proteins found in shrimp waste. Protein hydrolysis removes the proteins, which is one of the steps that would allow the extraction of the remaining beneficial compounds that often occur together in nature. This type of extraction has many advantages over other methods that can be used. The results show that the proteases used for the experiments were very efficient in performing the proteolytic reaction, with Novo-Pro D being the most efficient.

U današnje vrijeme sve više se koristi plastika u svakodnevnom životu, a odbačena plastika predstavlja prijetnju okolišu. Degradacijom plastike u okolišu nastaju sitne čestice plastike, koje se nazivaju mikroplastika. Za razgradnju mikroplastike potrebno je nekoliko desetljeća. Procesi recikliranja i spaljivanja ne predstavljaju održiva rješenja za zbrinjavanje plastičnog otpada, stoga je potreban razvoj novih tehnologija za upravljanje otpadom. U usporedbi s drugim procesima razgradnje, biorazgradnja se smatra učinkovitim procesom razgradnje mikroplastike. Proces biorazgradnje je ekološki prihvatljiv i ekonomski isplativ. Biorazgradnja sintetičkih polimera je vrlo spor proces koji uključuje djelovanje okolišnih čimbenika i mikrobnih vrsta. Pri biorazgradnji mikroplastike, mikroorganizmi poput gljiva imaju važnu ulogu, oni izlučuju enzime, kao što su peroksidaza i lakaza, koji dodatno pospješuju razgradnju. Poznato je nekoliko rodova gljiva, koje imaju sposobnost biorazgradnje mikroplastike, a to su: Aspergiluss, Penicillium, Fusarium, itd. Prema nekim istraživanjima razgradnja mikroplastike je učinkovitija kada su fotodegradacijski i termodegradacijski procesi uključeni istovremeno u proces biorazgradnje. U ovom radu dati će se pregledni dio o vrstama plastike, fizikalno-kemijskim i biološkim procesima biorazgradnje mikroplastike. Nowadays, more and more plastic is used in everyday life, and discarded plastic poses a threat to the environment. When plastic decomposes in the environment, it produces small plastic particles called microplastics. It takes several decades for microplastics to break down. Recycling and incineration are not sustainable solutions for managing plastic waste, so the development of new waste management and remediation technologies is needed. Compared to other degradation processes, biodegradation is effective and best method for degrading plastics because it does not cause pollution and is cost effective. Biodegradation of synthetic plastics is a very slow process in which environmental factors and the action of microbial species also play a role. Fungi play an important role in the biodegradation of microplastics as they secrete degradative enzymes such as peroxidases and laccases that can cause effective degradation. Some known species that show effective degradation of microplastics are Aspergillus, Pencillium, Fusarium, etc. Some studies state that the degradation of plastics was more effective when photodegradation and oxidative mechanisms were simultaneously involved in biodegradation. This study will provide an overview of the types of plastics and the abiotic and biotic processes of microplastic biodegradation.

Neke namirnice sadrže komponente koje mogu stupati u interakcije s brojnim lijekovima i na taj način pojačati ili smanjiti intenzitet djelovanja tih lijekova, samim time i utjecati na efikasnost terapije. Za metabolizam lijekova zaslužni su enzimi (CYP3A4, CYP1A2, glutation S transferaza) i transportni proteini (P-glikoprotein). Komponente hrane koje utječu na farmakokinetiku lijekova, inhibiraju ili induciraju navedene enzime i transportne proteine. Namirnice koje su bogate kompleksnim fitokemikalijama (sok od grejpa, kantarion i povrće) imaju veliki potencijal stvaranja ovakvih interakcija, stoga je nakon konzumacije ovakvih namirnica potrebna konzultacija s liječnikom te potencijalna prilagodba doze lijeka. Some foods contain components that can interact with many medications and may thus increase or decrease the intensity of action of these drugs, and therapy efficacy. Enzymes (CYP3A4, CYP1A2, glutathione S-transferase) and transport proteins (P-glycoprotein) are responsible for drug metabolism. Food components that affect the pharmacokinetics of drugs inhibit or induce these enzymes and transport proteins. Foods rich in complex phytochemicals (grapefruit juice, St. John's wort, and vegetables) have a great potential to create these interactions, so after consuming such foods consultation with physician and a potential dose adjustment might be neccesary affect.

Ovaj završni rad bavi se testiranjem metode bukalnog brisa kao neinvazivne toksikološke metode. Zagađenje okoliša antropogenim utjecajem sve je veće stoga je i veća pažnja usmjerena na istraživanje utjecaja zagađenja na organizme i okoliš. Novijim istraživanjima nastoji se što manje je moguće zadirati u prirodu i na bilo koji način ju degradirati što daje na važnosti ovakvim metodama. One imaju sve širu primjenu u višim skupinama kralježnjaka (sisavci), ali na razini herpetofaune nisu još istražene. Tijekom istraživanja ulovljeno je 16 jedinki guštera (pet Lacerta agilis te 11 Podarcis muralis) kojima su uzeti brisevi. Uzorci su obrađeni i određivana je količina proteina. S obzirom na dobivene vrlo niske vrijednosti koncentracije proteina, enzimska aktivnost nije određivana. Metoda se pokazala nepouzdanom jer mala kolebanja u količini uzorka znatno utječu na rezultat. Uz to, kvalitetno uzimanje briseva gušterima je teško provedivo zbog nemogućnosti okretanja štapića kako bi se mogla uzet potrebna količina uzorka.

Biofarmaceutika je brzo rastuće područje unutar kojeg se provode istraživanja i koriste stanične linije, mikroorganizmi i njihovi proizvodi za terapijsku primjenu. Enzimi su izvanredni biokatalizatori koji ubrzavaju biokemijske reakcije. Posjeduju nekoliko specifičnih značajki kao što su velik katalitički potencijal, velika specifičnost za supstrat, kao i pH i temperaturni optimumi njihove katalitičke aktivnosti. Zbog ovih izvanrednih svojstava pronalaze različite kliničke primjene i sve se više koriste za liječenje širokog spektra bolesti, samostalno ili u kombinaciji s drugim terapijama, te čine važnu podskupinu modernih biofarmaceutika. Terapijska primjena enzima uključuje protuupalne agense, enzibiotike, fibrinolitičke agense, agense protiv tumora, probavne terapijske enzime, kao i enzime za rijetke bolesti. Razvoj novih terapijskih enzima kao i nadogradnja i poboljšanja postojećih primjenom proteinskog inženjerstva su prioritet. Izolaciju, regulaciju, proizvodnju i primjenu enzima kao biofarmaceutika treba unaprijediti do maksimalnog potencijala kako bi se iskoristile njihove prednosti u odnosu na kemijska terapijska sredstva u liječenju različitih bolesti.

Lignocelulozna biomasa je važan obnovljivi izvor energije i koristi se kao sirovina u proizvodnji biogoriva druge generacije. Zbog vrlo složene strukture, učinkovita enzimska hidroliza lignoceluloznebiomase je ključni izazov današnjice. Litička polisaharidna monooksigenaza (LPMO) je nedavno otkrivena vrsta enzima koji sadrže bakar, a imaju značajnu ulogu u oksidativnoj razgradnji netopivih biljnih polisaharida i topivih oligosaharida. Stoga je prepoznat kao jedan od bitnih enzima u održivoj pretvorbi lignocelulozne biomase, a važnost ovog enzima potvrđena je brojnim istraživanjima. Nakon reduktivne aktivacije, LPMO cijepa supstrat i potiče razgradnju biomase hidrolitičkim enzimima. U ovom preglednom radu, opisana je uloga LPMO u razgradnji lignocelulozne biomase s naglaskom na strukturu LPMO i mehanizma djelovanja LPMO na celuloznim supstratima.

Kratki opis radionica – upoznavanje s enzimima i enzimskom kinetikom te računalnim simulacijama (računalnim pokusima) ispitivanje parametara koji utječu na enzimsku kinetiku. Gradivo je prilagođeno srednjoj školi.

Ester hydrolysis is of wide biomedical interest, ranging from the environmentally friendly synthesis of pharmaceuticals to the development of biomaterials. Existing peptide-based catalysts exhibit low catalytic efficiency compared to natural enzymes, which is due to the conformational heterogeneity of peptides. Moreover, the correlation between the primary sequence and the catalytic function is not yet well understood. First, we statistically analyzed 22 enzymes that use unique triad mechanisms to perform ester hydrolysis (EC 3.1). We extended this analysis to 974 homologues to verify the identified microenvironment motifs. The goal was to identify sequence-level patterns that will better inform the creation of short peptides that contain important information for catalysis based on the catalytic triad, oxyanion holes, and microenvironments of triad residues. The results showed highly conserved catalytic sites with distinct positional patterns, chemical microenvironments conducive to catalysis, and revealed variations in the composition of catalytic sites that could be useful for the design of minimalistic catalysts. Linear and cyclic peptides were then synthesized and their ability to catalyze pNPA hydrolysis was tested. Control over the catalytic performance of peptides was achieved through modifications at the sequence level and by varying the chemical environment.

U ovom radu provedena je imobilizacija enzima DERA na mezoporoznu siliku MCF funkcionaliziranu s (3– aminopropil)trimetoskisilanom u svrhu povećanja njegove stabilnosti u reakciji dvostruke aldolne adicije acetaldehida i kloroacetaldehida pri čemu nastaje prekursor u proizvodnji statina. Određivao se utjecaj procesa aktivacije nosioca na uspješnost imobilizacije korištenjem različitih aktivacijskih agenasa pri različitim koncentracijama: benzokinon (1, 5, 3 i 4, 5 mM), sukcinski anhidrid (5, 10 i 15 %) i glutaraldehid (10, 15 i 20 %). Najviša vrijednost parametara uspješnosti imobilizacije je zabilježena korištenjem 10 % sukcinskog anhidrida te je nosioc u daljnjim ispitivanjima aktiviran na taj način. Ispitan je utjecaj pH u području 6-8, te temperature u području 20-35°C na proces imobilizacije. Kao optimalni uvjeti su se pokazali pH 6 i temperatura od 30 °C. Pri tim uvjetima je provedena imobilizacija enzima te je praćena njegova aktivnost kroz pet ciklusa u reakciji sinteze bočnog lanca statina. Rezultati su pokazali kako imobilizirani enzim zadržava 43 % svoje aktivnosti nakon petog ciklusa dok je kod slobodnog enzima prisutan potpuni gubitak aktivnosti već nakon drugog ciklusa.

Inovativni postupci proizvodnje hrane i njihova mogućnost primjene u proizvodnji ulja od velikog su interesa uljarske industrije. Iako se danas nove tehnologije poput ubrzanog toplinskog tretmana ili ultrazvuka najčešće koriste kako bi se inaktivirali enzimi i mikroorganizmi, moguće je primjenom određenih procesnih parametara i aktivirati enzime. Enzimi ploda masline ključni su faktori u proizvodnji djevičanskog maslinovog ulja visoke nutritivne i senzorske vrijednosti i zato je provedeno istraživanje utjecaja ubrzanog toplinskog tretmana i ultrazvuka visoke snage na aktivnost enzima ploda masline preko komercijalno dostupnih β-glukozidaze i lipoksigenaze. Ispitani su parametri vremena, temperature (u rasponu 15-40⁰C) i procesni parametri ultrazvuka (vrijeme tretiranja i snage ultrazvuka) nakon kojih je simuliran postupak miješenja od 30 minuta na 25°C. Enzimu β-glukozidazi odgovaraju uvjeti povišene temperature od 40⁰C i duže vrijeme reakcije od 60 minuta, dok lipoksigenazi za maksimalnu aktivnost odgovaraju temperature od 25⁰C i 30 minuta reakcije. Upravo zbog toga se veća aktivnost β-glukozidaze postiže pri većim snagama ultrazvuka, a lipoksigenaza postiže najveću aktivnost pri vrlo maloj snazi ultrazvuka od svega 20 % kapaciteta snage. Innovative food production processes and their potential application in oil production are of great interest to the oil industry. Although today new technologies such as rapid thermal treatment or ultrasound are most commonly used to inactivate enzymes and microorganisms, it is also possible to activate enzymes by applying certain process parameters. Olive fruit enzymes are key factors in the production of virgin olive oil with high nutritional and sensory value. Therefore, a study was conducted on the effects of rapid thermal treatment and high power ultrasound on olive fruit enzyme activity by commercial β-glucosidase and lipoxygenase. The parameters of time, temperature (in the range of 15-40⁰C) and process parameters of ultrasound (treatment time and power of ultrasound) were studied, after which the malaxation procedure of 30 minutes at 25°C was simulated. The enzyme β-glucosidase corresponds to the conditions of increased temperature of 40⁰C and longer reaction time of 60 minutes, while lipoxygenase for maximum activity corresponds to temperatures of 25⁰C and 30 minutes reaction time. This is the reason why higher β-glucosidase activity is achieved at higher ultrasound powers and lipoxygenase achieves the highest activity at a very low ultrasound power of only 20% of the power capacity.

Enzimi su građevni dio života, i kataliziraju reakcije koje bi inače bile prespore (ako bi se uopće događale). Razvoj tehnologije otvorio je vrata manipulaciji tih biokatalizatora, a u ovom radu se istražuje način i opseg te manipulacije. Pokušat će se odgovoriti na pitanje ima li biokatalitički pristup potencijala biti rješenje antropogenih onečišćenja poput plastične polucije, i zagađenja otpadom od agresivnih industrijskih oksidansa i drugih reagensa. Na početku opisana je metoda genetskog sklapanja (engl. genetic fusion), te potanko istraženi enzimski sklopovi nikotinamid adenin dinukleotid oksidaze i alkohol dehidrogenaze (NOXADH) koji su pokazali povećanu aktivnost ADH jedinice uslijed povećane dostupnosti kofaktora potrebnog za reakciju.Ti NOX-ADH sklopovi su zadržali enantioselektivnost, dokazujući kako sklapanje nije imalo utjecaja na smatanje i aktivnost zasebnih domena. Kao druga metoda priprave sintetskih enzima razmatrani su metalni afinitetni privjesci koji omogućavaju izmjenu funkcije privjeska i/ili enzima.Na enzim papain vezani su metalni afinitetni privjesci (engl. metal affinity label, mAL) koji provode hidrogeniranje ketona. Slobodni, u reakciji tvore racemat, dok u ansamblu s enzimom pokazuju enantioselektivnost. Za kraj poglavlja o metodama ukratko je opisana usmjerena evolucija, kao alternativni pristup pripravi biokatalizatora sa specifičnim djelovanjem. U zadnjem dijelu opisana je PETaza, enzim iz porodice kutinaza, te ispitana njena djelotvornost razgradnje polietilen tereftelata (PET) i polietilen furanoata (PEF). Pripravljeni mutant je pokazao veću katalitičku moć od enzima divljeg tipa. Autori su zaključili kako metodu treba poboljšati kako bi bila industrijski iskoristiva, no pokazuje potencijala. Finalno, zaključeno je kako sintetska biokataliza, iako mlado polje sa svojim manama i ograničenjima, ima potencijala promijeniti načine na koje provodimo trenutne postupke i omogućiti provedbu sasvim novih reakcija i postupaka poput razgradnje PET-a, PEF-a, i drugih aromatskih poliestera.

Plastika je materijal koji je vrlo koristan i ima široku primjenu, ali njezina sve veća proizvodnja i nepravilno odlaganje dovelo je do velikog zagađenja kopna, oceana i rijeka. Jedno od ekološki prihvatljivih rješenja ovog problema moglo bi biti korištenje bakterija koje razgrađuju plastiku. Otkrivene su mnoge takve bakterijske vrste te su one, njihovi enzimi i poznati mehanizmi razgradnje opisani u ovom radu. Također su opisani i načini na koje bi se navedene bakterije i njihovi enzimi mogli u budućnosti koristiti u svrhu recikliranja plastičnog otpada. Kako bi to bilo moguće ostvariti, potrebno je provesti još mnoga istraživanja usmjerena prema pronalaženju novih bakterija i enzima te genetičkoj modifikaciji već poznatih enzima u svrhu proizvodnje njihovih visoko aktivnih varijanti koje bi se mogle koristiti u recikliranju i razgradnji velike količine plastike. Plastic is a material that is very useful and has wide applications, but its increasing production and improper disposal has led to great pollution of land, oceans, and rivers. One of the environmentally friendly solutions to this problem could be to use plastic-degrading bacteria. A large number of such bacterial species have been discovered and they, their enzymes and known degradation mechanisms are described in this paper. Ways in which these bacteria and their enzymes could be used in the future for the purpose of recycling plastic waste are also described. In order to achieve this, much more research needs to be directed towards finding new bacteria and enzymes and genetically modifying already known enzymes for the purpose of producing their highly active variants and using them in recycling and degrading large amounts of plastic.

Biološki sustavi iznimno su kompleksni, što ih istovremeno čini zanimljivima, ali i zahtjevnima za proučavanje. Kako bi objasnili pojedina neočekivana eksperimentalna opažanja, znanstvenici su se okrenuli kvantnoj mehanici i njezinoj potencijalnoj uključenosti u biološke procese. Mnogo je procesa za koje se pretpostavlja da kvantni efekti imaju presudnu ulogu u njihovu odvijanju, poput fotosinteze, magnetorecepcije i olfakcije. Enzimska kataliza iznimno je važna za sve žive sustave na Zemlji, stoga je dan osvrt na potencijalnu ulogu kvantno-mehaničkog tuneliranja u mehanizmu enzimske katalize. Tuneliranje je neobičan kvantni efekt koji omogućuje prolazak čestice kroz klasično zabranjene barijere. S obzirom na sve dokaze i kritike, važnost tuneliranja u enzimima još nije jednoznačno potvrđena. Međutim, nesumnjivo je da će kvantno-biološka istraživanja dovesti do novog razumijevanja i pogleda na život. Biological systems are incredibly complex, and that makes them very interesting, but also very challenging to study. To explain certain unexpected experimental results, scientists have taken quantum mechanics into account, and investigated its potential role in biological processes. There are many processes, including photosynthesis, magnetoreception and olfaction, which are thought to have key contributions from quantum effects. Enzyme catalysis is incredibly important for all living systems on Earth, hence the focus of this review is on the potential role of quantum tunnelling in mechanisms of enzyme catalysis. Quantum tunnelling is a peculiar quantum effect that enables a particle to pass through classically forbidden barriers. Considering all of the evidence and critiques, the importance of quantum tunnelling in enzymes still hasn’t been unambiguously confirmed. Nonetheless, there is no doubt that the research made in the growing field of quantum biology will lead to a new understanding of life.

Enzimi su biološki katalizatori koji su prisutni u živim stanicama i neophodni su za život kakav poznajemo. Reakcije u kojima su prisutni enzimi potrebno je dobro istražiti i okarakterizirati kako bi se mogle provoditi u industrijskim mjerilima. Prednost uporabe enzima u biokatalitičkim reakcijima leži u činjenici da su djelotvnorni i pri vrlo blagim uvjetima, puno blažim od kemijskih katalizatora. Potrebno je obratiti pažnju i na aktivnost enzima u različitim reakcijskim uvjetima (temperatura, koncentracija supstrata, pH, zasićenost kisikom) jer optimizacijom reakcijskih uvjeta omogućujemo maksimalan prinos željenog produkta i smanjenje nastanka neželjenog ili štetnog nusprodukta. Fluorirani aromatski spojevi su iznimno važni u farmaceutskoj industriji kao prekursori i kao građevni blokovi. Bitno je da takvi spojevi budu optički čisti jer je poznato da dva enantiomera mogu imati znatno različita svojstva i biološko djelovanje, često štetno i toksično. Jedna od metoda sinteze takvih spojeva uključuje korištenje enzima halogenhidrin-dehalogenaze (HHDH). U ovom radu proučavana je reakcija otvaranja epoksidnog prstena, fluoriranog derivata stiren oksida uz azid kao nukleofil prilikom čega nastaje fluorirani azidoalkohol. Reakcija je katalizirana enzimom HHDH (C-tip) koji je poznat i pod nazivom HheC-W249P. Cilj ovog rada bio je validirati matematički model biokatalitičke sinteze (R)-2-azido-1-(4-trifluorometil-fenil)-etanola u šaržnom reaktoru. Model je uspješno validiran provedbom reakcije u pet različitih kotlastih reaktora s različitim početnim uvjetima u reaktoru. Uzorci reakcijske smjese su analizirani na tekućinskom kromatografu visoke djelotvornosti. Praćena je i stabilnost enzima pri različitim uvjetima prilikom čega je pokazano da početni uvjeti u reaktoru ne utječu značajno na stabilnost enzima. Stabilnost enzima se pratila spektrofotometrijskom metodom. Enzymes are biological catalysts that are present in living cells and are necessary for life as we know it. Reactions in which enzymes are present need to be well investigated and characterized in order to be carried out on an industrial scale. The advantage of using enzymes in biocatalytic reactions lies in the fact that they are effective even under very mild conditions, much milder than catalysts of chemical reactions. It is necessary to pay attention to the activity of enzymes in different reaction conditions (temperature, substrate concentration, pH, oxygen saturation) because by optimizing the reaction conditions we enable maximum yield of the desired product and reduction of unwanted or harmful by-products. Fluorinated aromatic compounds are extremely important in the pharmaceutical industry as precursors and as building blocks. It is important that such compounds be optically pure because it is known that the two enantiomers can have significantly different properties and biological effect, often harmful and toxic. One of the methods of synthesis of such compounds is the use of the enzyme halohydrin-dehalogenase (HHDH). In this paper, the reaction of opening an epoxy ring, a fluorinated derivative of styrene oxide with an azide as a nucleophile, during which a fluorinated azidoalcohol is formed, was studied. The reaction is catalyzed by the HHDH (C-type) enzyme also known as HheC-W249P. The aim of this work was to validate a mathematical model of biocatalytic synthesis of (R)-2-azido-1-(4-trifluoromethyl-phenyl)-ethanol in a batch reactor. The model was successfully validated by carrying out the reaction in five different batch reactors with different initial conditions in the reactor. Samples of the reaction mixture were analyzed on a high performance liquid chromatograph. The stability of the enzyme under different conditions was also monitored, and it was shown that the initial conditions in the reactor did not significantly affect the stability of the enzyme. Enzyme stability was monitored by spectrophotometric method.

Termofilni mikroorganizmi rastu pri temperaturama iznad 40°C, a njihov najdragocjeniji proizvod jesu termostabilni enzimi koji su na tim temperaturama i dalje aktivni. Zbog te činjenice njihova je uloga u zaštiti okoliša veoma šarolika. Koriste se u procesima proizvodnje biogoriva, gdje se biokemijskim reakcijama dobivaju bioetanol te vodik kao alternativa kemijskim reakcijama. Osim toga, njihovi enzimi imaju značajnu ulogu u industrijskim procesima proizvodnje deterdženata i papira, te u prehrambenoj i tekstilnoj industriji. Enzimi su biorazgradivi i kao takvi bolje rješenje od štetnih kemikalija koje se uobičajeno koriste u tim procesima. Kompostiranje i bioremedijacija predstavljaju važne postupke u zaštiti okoliša koji ne bi bili mogući bez termofilnih mikroorganizama. U procesu kompostiranja imaju zadaću razgradnje biorazgradivog otpada pri povišenoj temperaturi s ciljem stvaranja komposta. Neki termofili dugotrajnim izlaganjem stekli su prirodnu otpornost na pesticide, teške metale, naftne ugljikovodike i tekstilne boje te imaju sposobnost biosorpcije ili bioakumulacije koju možemo iskoristiti za sanaciju onečišćenih područja tom vrstom onečišćenja. Thermophilic microorganisms grow at temperatures above 40°C. Their most valuable product is thermostable enzymes, which are still active at these high temperatures. Due to this fact, their role in environmental protection is very broad. They are used in biofuel production, where hydrogen and bioethanol are produced by biochemical reactions as an alternative to chemical reactions. Enzymes also play an important role in industrial production processes of paper and detergents, as well as in the food and textile industries. Since enzymes are biodegradable, they are a better solution than harmful chemicals that are traditionally used. Composting and bioremediation are important processes in environmental protection that would not be possible without thermophiles. In the composting process, they degrade biodegradable waste at elevated temperatures to produce compost. Through long-term exposure, some thermophiles have acquired a natural resistance to pesticides, heavy metals, textile dyes, and petroleum hydrocarbons, giving them the ability to biosorb or bioaccumulate, which we can use to remediate this type of pollution.

Ovaj diplomski rad sastoji se od dva dijela: istraživačkog i metodičkog. U istraživačkom dijelu rada pročišćene su tri varijante enzima adenilosukcinat-sintetaze (AdSS) iz bakterije Helicobacter pylori: AdSS obilježen histidinskim privjeskom, AdSS kojem je aspartat 12 zamijenjen alaninom i AdSS kojem je aspartat 12 zamijenjen asparaginom. Za pročišćavanje su korištene kromatografija ionske izmjene, afinitetna kromatografija i gel filtracija. Proteinima su potom mjerene specifične aktivnosti, a za obiljeţen AdSS određeni su kinetički parametri uz promjenjivu koncentraciju iona Mg2+ koristeći Michaelis-Menten model enzimske kinetike. Konačno, ispitan je utjecaj različitih iona metala na aktivnost obilježenog AdSS. U metodiĉkom dijelu rada pod naslovom „Priča o želatini i voću“ izrađena je metodičkodidaktička priprema za učenike četvrtog razreda gimnazije. Metodička priprema temeljena je na obrazovnim ishodima, najčešćim učeničkim krivim shvaćanjima i na uvodu u relevantnu literaturu. Pripremljeni materijal namijenjen je obrazovnoj strategiji učenja otkrivanjem. This Diploma thesis consists of two parts: the research and methodological part. In the experimental part of diploma work, three variants of enzyme adenylosuccinate synthetase (AdSS) from bacterium Helicobacter pylori were purified: AdSS with histidine tag, AdSS with aspartate 12 changed to alanine and AdSS with aspartate 12 changed to asparagine. Ion exchange, affinity and gel filtration chromatographies were used for purification. Specific activity was measured for each enzyme variant, and for tagged AdSS kinetic parameters were also determined, by changing Mg2+ ions concentration, and using Michaelis-Menten model of enzyme kinetics. Finally, the effect of different metal ions on tagged AdSS activity was investigated. In the methodological part under the title “The story of gelatin and fruit” a didacticmethodological preparation was made for fourth grade high school students. The methodological preparation is based on the educational outcomes, common misconceptions held by students and with an insight in a revelant literature. The prepared material is intended for educational strategy of learning by discovery.

Ovaj diplomski rad sastoji se od dva dijela: istraživačkog i metodičkog. U istraživačkom dijelu rada pročišćene su tri varijante enzima adenilosukcinat-sintetaze (AdSS) iz bakterije Helicobacter pylori: AdSS obilježen histidinskim privjeskom, AdSS kojem je aspartat 12 zamijenjen alaninom i AdSS kojem je aspartat 12 zamijenjen asparaginom. Za pročišćavanje su korištene kromatografija ionske izmjene, afinitetna kromatografija i gel filtracija. Proteinima su potom mjerene specifične aktivnosti, a za obilježen AdSS određeni su kinetički parametri uz promjenjivu koncentraciju iona Mg2+ koristeći Michaelis-Menten model enzimske kinetike. Konačno, ispitan je utjecaj različitih iona metala na aktivnost obilježenog AdSS. U metodičkom dijelu rada pod naslovom „Priča o želatini i voću“ izrađena je metodičko-didaktička priprema za učenike četvrtog razreda gimnazije. Metodička priprema temeljena je na obrazovnim ishodima, najčešćim učeničkim krivim shvaćanjima i na uvodu u relevantnu literaturu. Pripremljeni materijal namijenjen je obrazovnoj strategiji učenja otkrivanjem.

Enzimi su proteini čija je osnovna zadaća ubrzavanje biokemijskih reakcija od kojih je svaka katalizirana jedinstvenim enzimom. Proteaze su jedna od najvažnijih skupina enzima, a njihova primjena svakodnevno raste u industriji. Razlog tome je ekonomska isplativost u vidu niskih troškova proizvodnje i male potrošnje energije, visokih prinosa i jednostavnosti genetičkih modifikacija. U ovom radu je ispitana učinkovitost enzima u hidrolizi proteina iz otpada kozica primjenom šest komercijalnih proteaza: Alkalaza, Neutraza, Esperaza, Flavourzyme, Novozyme i Novo- ProD. Svi navedeni enzimi su pokazali uspješnost u razgradnji proteina. Utvrđeno je kako su provedbom hidrolize i pri manjim koncentracijama enzima konverzije gotovo jednako visoke u većini slučajeva, osim kod Neutraze gdje je konverzija nešto niža. Kod većine enzima su visoke konverzije postignute već u prvom satu, što kod Neutraze nije slučaj budući da je konverzija postupno rasla. Po završetku hidrolize proteina Alkalaza, Flavourzyme i Novo-ProD pokazali su najveće stabilnosti pri koncentraciji enzima od 0, 5 U/10 mg, stoga su odabrani za provedbu hidrolize proteina u ponovljivom reaktoru sa 6 ciklusa. Pritom su Alkalaza i Novo-ProD pokazali zadovoljavajuće rezultate u smislu visokih konverzija te aktivnosti nakon zadnjeg ciklusa.

Polietilenimin (PEI) sintetski je kationski polimer čija funkcionalnost i reaktivnost potječu od činjenice da se radi o polimeru koji sadrži primarne, sekundarne i tercijarne skupine amina. Zbog ovakve građe, PEI ima veliku gustoću naboja što omogućuje postizanje jednakog učinka imobilizacije enzima uz manju količinu polimera, a da pri tome ne dođe do aglomeracije enzima. Ovaj je polimer fleksibilan i jednostavan za uporabu, pristupačne je cijene te omogućuje dodatnu uštedu zbog mogućnosti ponovne uporabe enzima nakon imobilizacije. PEI koristi se u brojne svrhe, primjerice kao ljepilo za imobilizaciju enzima i ko-imobilizaciju višeslojnih enzima, kao sredstvo za imobilizaciju enkapsuliranjem te za pripremanje imobilizacijskih podloga. Svojstva polietilenimina, načini njegova dobivanja i primjeri uporabe u industriji bit će detaljnije prikazani u nastavku ovoga završnog rada. Polyethylenimine (PEI) is a synthetic cationic polymer whose functionality and reactivity arise from the fact that it contains primary, secondary and tertiary amino groups. Due to such structure, PEI has a high charge density which enables an effective enzyme immobilization with a smaller amount of polymer, while disabling enzyme agglomeration. This polymer is flexible, easy to use and it is affordable which allows additional savings due to the possibility of immobilized enzyme reuse. PEI is used for many purposes, e.g. as an immobilization glue, for co-immobilization of enzyme multilayers, for enzyme encapsulation and for preparation of immobilization supports. PEI properties, methods of its production, as well as some of the examples of its use in industry will be presented in this undergraduate thesis.

Enzimi su biokatalizatori prisutni u mikroorganizmima, a djeluju poput anorganskih katalizatora. Njihova uporaba osigurava niz prednosti, poput odvijanja reakcija u blažim uvjetima te smanjenje nastanka štetnih nusprodukata. Halogenhidrin-dehalogenaze su enzimi koji kataliziraju reakciju dehalogenacije haloalkohola uz stvaranje epoksida, kao i reverzibilnu reakciju, reakciju otvaranja epoksidnog prstena s nukleofilima. U ovom je radu ispitana reakcija otvaranja epoksidnog prstena 2-(4-trifluormetil)fenil oksirana, kataliziranu C tipom halogenhidrin-dehalogenaze HheC-W249P uz natrijev cijanid kao nukleofil, u kotlastom reaktoru i mikroreaktoru. Reakcija je praćena uporabom HPLC analize, a aktivnost enzima je praćena spektrofotometrijski. Osim reakcije otvaranja epoksidnog prstena, istraživane su i reakcija hidrolize epoksida i kemijska reakcija otvaranja epoksidnog prstena. Reakciju je moguće provesti i u kotlastom reaktoru i u mikroreaktoru. U kotlastom reaktoru količina nastalog produkta se povećava s vremenom odvijanja reakcije. U mikroreaktoru, najviše produkta nastane pri najvećem vremenu zadržavanja, ali tada se epoksid troši i sporednim reakcijama. Brzina deaktivacije enzima se povećava porastom prostornog vremena zadržavanja. Enzymes are biocatalysts present in microorganisms and act like inorganic catalysts. Their usage provides a number of benefits, such as reactions in milder conditions and a reduction in occurence of harmful by.products. Halohydrin dehalogenases are enzymes that catalyze dehalogenation od haloalcohols to form epoxides, as well as the reversible reaction, the ring-opening reaction with nucleophiles. In this work, the ring-opening reaction of 2-(4-trifluormethyl)phenyl oxirane with sodium cyanide as nucleophile, catalyzed by C-type halohydrin dehalogenase HheC-W249P, in batch reactor and microreactor,was investigated. The reaction was monitored using HPLC analysis and the enzyme activity was monitored spectrofotometrically. In addition to epoxy ring-opening reaction, the hydrolysis reaction of epoxide and the chemical ring opening reaction of epoxide were also tested. The reaction can be carried out in both the batch reactor and the microreactor. In the batch reactor, the amount of the product formed increases with the reaction time. In the microreactor, the highest amount of product formed was observed at highest retention time, but then the epoxide is consumed in side reactions. Also, enzyme deactivation rate increases with increase of retention times in the microreactor.

Cilj ovog završnog rada bio je pobliže opisati i objasniti kovalentnu imobilizaciju enzima. Kovalentna imobilizacija je ireverzibilna metoda imobilizacije koja omogućava nastajanje jake i stabilne veze između enzima i nosača. Prednost kovalentne imobilizacije u odnosu na reverzibilne metode je sprječavanje curenja enzima s nosača tijekom imobilizacije, a glavna mana ove vrste imobilizacije je najčešće niža aktivnost imobiliziranog enzima u odnosu na slobodni enzim. Primjenom kovalentno imobiliziranih enzima u nekom proizvodnom procesu troškovi proizvodnje se mogu smanjiti jer se ovako imobilizirani enzimi mogu višestruko koristiti. The aim of this undergraduate thesis was to describe and explain the covalent immobilization of enzymes. Covalent immobilization is an irreversible method of enzyme immobilization where strong and stable bond between the enzyme and the carrier is formed. The major advantage of covalent immobilization is lack of enzyme leakage from the carrier, while main disadvantage the lower activity of the immobilized enzyme compared to the free enzyme. By the use of covalently immobilized enzymes, production costs can be reduced because covalently immobilized enzymes can be reused.

U voću i povrću enzimi su prisutni kao autohtoni ili nativni (prisutni u stanicama voća i povrća) i mikrobni enzimi (nalaze se na površini sirovina). Enzimi sudjeluju u procesima metabolizma svježeg voća i povrća, ali vrlo je važno i njihovo poželjno i nepoželjno djelovanje tijekom prerade voća i povrća. Njihova uloga usmjerena je ponajprije na povećanje iskorištenja na sirovini, kao i postizanje određenih svojstava proizvoda. U radu je opisano podrijetlo i uloga enzima, te njihov utjecaj na parametre kvalitete proizvoda, kao što su boja, aroma i tekstura proizvoda. Također je obuhvaćen pregled utjecaja tzv. novih tehnologija na inaktivaciju enzima u voću i povrću. Navedena je i primjena komercijalnih enzima, koja je neophodna u nekim tehnologijama prerade voća i povrća. Enzymes are present in fruits and vegetables as autochthonous or native (present in fruit and vegetable cells) and microbial enzymes (found on the surface of raw materials). Enzymes are involved in the metabolic processes of fresh fruits and vegetables, but their desirable and undesirable action during the processing of fruits and vegetables is also very important. Their role is primarily aimed at increasing the yield on raw materials, as well as achieving certain product properties. The paper describes the origin and role of enzymes, and their influence on product quality parameters, such as colour, flavour and texture of products. The paper also includes an overview of the impact of the so-called new technologies for inactivation enzymes in fruits and vegetables. The application of commercial enzymes, which is necessary in some technologies for processing fruits and vegetables, is also mentioned.

Cilj ovog rada bio je odrediti udio eteričnog ulja i fenolni sastav ekstrakta lista ružmarina nakon vodene destilacije po Clavengeru. Vodenoj destilaciji po Clavengeru prethodili su predtretmani: ekstrakcija refluksiranjem, ekstrakcija refluksiranjem potpomognuta enzimima te ultrazvučna ekstrakcija s ili bez dodatka enzima. Uz eterično ulje dobiveni su nusprodukti (vodeni ekstrakt i hidrolat) koji u svom sastavu sadrže fenolne spojeve. Biljni ostaci podvrgnuti su ekstrakciji potpomognutoj ultrazvukom primjenom otapala različite polarnosti (etanol-voda (1:1), metanol-voda (1:1) i etanol-metanol-voda (1:1:1)). Najveći udio eteričnog ulja (1 mL/100 g) dobiven je uz predtretman ekstrakcije potpomognute ultrazvukom i dodatak enzima ksilanaze. Najveći maseni udio ukupnih fenolnih spojeva određen je u vodenim ekstraktima ružmarina (44,02 ± 5,38 mg GAE g-1), dok je najveći udio ukupnih fenolnih spojeva u hidrolatu (0,2 mg GAE g-1) određen ekstrakcijom potpomognutom ultrazvukom. Pri ekstrakciji fenolnih spojeva iz biljnog ostatka važan je izbor otapala te primijenjeni predtretmani, a najveći prinosi fenolnih spojeva dobivaju se primjenom otapala etanol-voda (1:1) i prethodnim tretmanom enzimom ksilanazom. The aim of this study was to determine the yield of essential oil and phenolic composition of rosemary leaves extract after Clavenger hydro-distillation. Clavenger hydro-distillation was preceded by refluxing or ultrasound-assisted extraction with or without the addition of an enzyme. By-products (aqueous extract and hydrolate) containe phenolic compounds in their composition. Plant residues were subjected to ultrasound-assisted extraction using solvents of different polarity (ethanol-water (1:1), methanol-water (1:1) and ethanol-methanol-water (1:1:1)). The highest yield of essential oil (1 mL/100g) was obtained by ultrasound pre-treatment and addition of xylanase enzyme. The highest mass fraction of total phenolic compounds in aqueous extracts (44,02 ± 5,38 mg GAE g-1) was obtained by refluxing, while the highest fraction of total phenolic compounds in the hydrolate (0,2 mg GAE g-1) was obtained with ultrasound-assisted extraction. In the extraction of phenolic compounds the choice of solvent and the applied pretreatments are shown to be important factors. The highest proportion of phenolic compounds was extracted using the ethanol-water solvent (1:1) and the xylanase enzyme.

Cilj ovog rada bio je odrediti optimalne parametre za provođenje predtretmana enzimima (ksilanaza) te njegov utjecaj na udio eteričnog ulja kadulje i lovora nakon vodene destilacije po Clavengeru. U prvom dijelu rada ispitivao se utjecaj pH-vrijednosti otapala, koncentracije enzima i vremena trajanja reakcije na aktivnost ksilanaze pri 40 °C. Utvrđeno je da optimalni uvjeti podrazumijevaju upotrebu pufera 2 (pH = 6,5), masenu koncentraciju enzima od 0,20 mg mL-1 te vrijeme provođenja enzimske reakcije u trajanju od 4 sata. U drugom dijelu rada istraživan je utjecaj ekstrakcije potpomognute enzimima te ekstrakcije potpomognute ultrazvukom (50 W, 10 minuta) uz dodatak enzima kao predtretmana na udio eteričnog ulja nakon vodene destilacije. Kod obje biljke je najveći ekstrakcijski kapacitet postignut primjenom ekstrakcije potpomognute enzimima kao predtretmana, dok ekstrakcija potpomognuta ultrazvukom uz dodatak enzima nije značajno doprinijela povećanju udjela ekstrahiranog eteričnog ulja. Zaključno, ekstrakcija potpomognuta enzimima kao predtretmana vodenoj destilaciji po Clavengeru bi se u budućnosti mogla koristiti kao ekološki prihvatljiva metoda za izdvajanje eteričnog ulja iz listova lovora i kadulje. The aim of this study was to determine optimal parameters for enzyme-assisted extraction (xylanase) and its impact on the content of sage and bay laurel essential oils after Clavenger hydrodistillation. Firstly, influence of solvent type, enzyme concentration and time of reaction on the xylanase activity at 40 °C was tested. It was found that the optimal parameters include the usage of buffer 2 (pH = 6,5), mass concentration of 0,20 mg mL-1 and reaction time of 4 hours. Secondly, influence of enzyme-assisted extraction and ultrasound-assisted extraction (50 W, 10 minutes) with the addition of enzymes on the essential oil yield after Clavenger hydrodistillation was tested. The highest extraction capacity was observed using enzyme-assisted extraction as pretreatment, while ultrasound-assisted extraction with the addition of the enzymes hasn't significantly contributed to the increase of the essential oil yield. In conclusion, pretreatment with enzyme-assisted extraction prior to the Clavenger hydrodistillation could be used as a green extraction method for bay laurel and sage essential oils.

The application of enzymes in chemical synthesis, due to the recent advances, has a strong impact in multiple industries, especially the pharmaceutical industry. Namely, the use of enzymes shows remarkable advantages over classical chemical catalysis and therefore it is considered a ‘green’ solution. By using novel techniques, it is possible to tailor the enzymes to adapt them for a given process. Today, several pharmaceutical companies are successfully producing valuable precursors for the production of active pharmaceutical ingredients using enzymes, some of them being statin precursors. Statins are hypolipidemics, drugs used for the prevention of cardiovascular diseases and lowering cholesterol concentration in blood. Due to challenges in the chemical synthesis of statin intermediates, the production of statin intermediates using enzyme-catalysed reactions shows some notable advantages. Therefore, research and development laboratories, combined with reaction engineering techniques, have shifted their focus towards applying biochemical catalysis for the production of statin intermediates. This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License., Napredak tehnologije usko je vezan uz primjenu enzima u kemijskoj sintezi. Biokataliza ima velik utjecaj na različite industrije a među njima se posebno ističe farmaceutska industrija. Primjena enzima pokazuje značajne prednosti u usporedbi s tehnikama klasične kemijske sinteze te se smatra i ‘zelenim’ rješenjem. Primjenjujući nove dostupne tehnike i tehnologije, enzime je moguće u potpunosti prilagoditi zahtjevima određenog procesa. Danas je poznato nekoliko farmaceutskih tvrtki koje uz pomoć enzima uspješno proizvode vrijedne intermedijare za proizvodnju aktivnih farmaceutskih spojeva, a u njih se ubrajaju i prekursori statina. Statini su hipolipidemici, lijekovi koji se upotrebljavaju za prevenciju kardiovaskularnih bolesti te za snižavanje koncentracije kolesterola u krvi. Metoda klasične kemijske sinteze intermedijara statina vrlo je zahtjevna te stoga njihova proizvodnja primjenom enzimski kataliziranih reakcija ima značajne prednosti. Iz tog razloga za proizvodnju intermedijara statina istraživanje i razvoj uz primjenu reakcijskog inženjerstva sve se više usmjeravaju prema primjeni biokatalize. Ovo djelo je dano na korištenje pod licencom Creative Commons Imenovanje 4.0 međunarodna.