Search

The multifunctional BAG-1 (Bcl-2 athanogene-1) protein promotes breast cancer survival through direct or indirect interaction partners. The number of the interacting partners determines its cellular role in different conditions. As well as interaction partner variability, the amount of BAG-1 protein in the cells could cause dramatic alterations. According to previous studies, while the transient silencing of Bag-1 enhanced drug-induced apoptosis, deletion of BAG-1 could induce stemness properties and Akt-mediated actin remodeling in MCF-7 breast cancer cells. Considering the heterogeneity of breast cancer and the variability of BAG-1-mediated cell response, it has become essential to determine microRNA (miRNA) functions in breast cancer depending on Bag-1 expression level. This study aims to compare microRNA expression levels in wt and Bag-1 knockout (KO) MCF-7 breast cancer cells. hsa-miR-429 was selected as a potential miRNA in BAG-1KO MCF-7 cells because of the downregulation both in bioinformatics and validation qRT-PCR assay. According to predicted mRNA targets and functional enrichment analysis the ten hub proteins that are phosphatidylinositol4,5-biphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha (PIK3CA), kinase insert domain receptor (KDR), GRB2 associated binding protein 1 (GAB1), Rac family small GTPase1 (RAC1), vascular endothelial growth factor A (VEGFA), Cbl proto-oncogene (CBL), syndecan 2 (SDC2), phospholipase C gamma 1 (PLCG1), E1A binding protein p300 (EP300), and CRK like proto-oncogene, adaptor protein (CRKL) were identified as targets of hsa-miR-429. The functional enrichment analysis showed that the most significant proteins were enriched in PI3K/Akt, focal adhesion, cytoskeleton regulation, proteoglycans in cancer, and Ras signaling pathways. It was determined that hsa-miR-429 targeted these pathways in Bag-1 deficient conditions and could be used as a potential therapeutic target in future studies. Istanbul Technical University

Bag-1 is a multifunctional protein target which has interactions with a number of cellular proteins. Therefore, Bag-1 participates in several significant biological processes such as cell proliferation, survival, and apoptosis. Elevated expression levels of Bag-1 arc associated with progression o f cancer and resistance mechanism against cancer. In our previous studies, we obtained results showing Bag-1 silencing enhancing the apoptotic potentials of cisplatin or paclitaxel through modulating PI3K/Akt/mT0R pathways in breast cancer cells, however, the function of Bag-1 knockout in these cells has not been fully explored. Here, we performed the CRISPR/Cas9 technique to knockout Bag-1 gene and successfully produced Bag-1 knockout cell line (Bag-1 KO). Sanger sequencing was used to confirm the gene knockout mediated insertions or deletions (indels) in MCF-7 cells. Correspondingly, the mRNA and protein expressions of Bag-1 were markedly reduced. We determined the effect o f Bag-1 KO on cell survival by M il and trypan blue dye exclusion assay. Alternations of total protein expression profiles between wild-type and Bag-1 KO cells were determined through pathscan analysis and immunoblotting assays. Our results showed that knockout of Bag-1 suppressed the proliferation and growth potential of MCF-7 cells by decreasing the number of colony formations. According to the immunoblotting results, knockout of Bag-1 significantly upregulated Akt phosphorylation and b-actin downregulation. We concluded that Bag-I inlluenced actin disorganization through stress-induced Akt activation and alternations on expression profiles o f focal adhesion kinases.

The multifunctional anti-apoptotic Bag-1 protein has important roles in apoptosis, proteasome-mediated degradation, transcriptional regulation, and intracellular signaling. Bag-1 promotes cell survival and proliferation, and is overexpressed in breast cancer. Therefore, Bag-1-targeted therapy might be a promising strategy to treat breast cancer. However, the effects of Bag-1 silencing in combination with conventional chemotherapeutic drugs on cell viability and major signaling pathways have not yet been fully investigated in breast cancer cells. In this study, we investigated the cytotoxic effects of Bag-1 silencing, alone and in combination with cisplatin or paclitaxel treatment, in MCF-7 breast cancer cells. Bag-1 knockdown by shRNA or siRNA transfection sensitized MCF-7 cells to apoptosis induced by cisplatin or paclitaxel. Combination of Bag-1 silencing and drug treatment more potently downregulated the pro-survival PI3K/Akt/mTOR and p44/42 mitogen activated protein kinase (MAPK) pathways, and more potently upregulated the stress-activated p38 and SAPK/JNK MAPK pathways. Bag1-silenced drug-treated cells had also highly reduced proliferative capacity, downregulated cyclin–cyclin dependent kinase complexes and upregulated tumor suppressors p21 and Rb. These results overall indicated that Bag-1 silencing enhanced cisplatin- or paclitaxel-induced cytotoxicity through multiple pathways. In conclusion, Bag-1 targeted therapy might enhance the therapeutic potential of conventional anti-cancer drugs in the treatment of breast cancer.

Bag-1, Bcl-2 associated athanogene-1, is a multifunctional protein that can regulate a wide variety of cellular processes: proliferation, cell survival, transcription, apoptosis and motility. Bag-1 interacts with various targets in the modulation of these pathways; yet molecular details of Bag-1's involvement in each cellular event are still unclear. We first showed that forced Bag-1 expression promotes cell survival and prevents drug-induced apoptosis in MCF-7 breast cancer cells. Increased mRNA expressions of c-myc protooncogene and ornithine decarboxylase (ODC), biosynthetic enzyme of polyamines, were detected in Bag-1L+ cells, and western blots against the protein product of c-Myc and ODC confirmed these findings. Once ODC, a c-Myc target, gets activated, polyamine biosynthesis increases. We observed enhanced polyamine content in the Bag-1L+ cells. On the contrary, when polyamine catabolic mechanisms were investigated, Bag-1 silencing suppressed biosynthesis of polyamines because of the downregulation of ODC and upregulation of PAO. Exposure of cells to apoptotic inducers enhances the cell death mechanism by producing toxic products such as H2O2 and aldehydes. Bag-1L+ cells prevented drug-induced PAO activation leading to a decrease in H2O2 production following cisplatin or paclitaxel treatment. In this line, our results suggested that Bag-1 indirectly affects cell survival through c-Myc activated signalling that causes elevation of ODC levels, leading to an increase of the polyamine content. Copyright (c) 2015 John Wiley & Sons, Ltd.

Heat shock protein Hsp70 is a chaperon which helps folding of other proteins. It consists of two domains: a nucleotide binding domain where ATP or ADP binds and a substrate binding domain where the protein to be folded binds [1]. In the presence of ATP, the substrate affinity of Hsp70 is low. Binding of a substrate triggers ATP hydrolysis. In ADP bound form, the substrate affinity is high [1]. The allosteric communication between the two domains is mediated by a linker. The ATPase activity is pH dependent, the optimum pH being around 7.5 [2].This study aims at understanding the role of the linker in triggering the ATP hydrolysis and the origin of the pH dependence of the reaction using molecular dynamics simulations.It is experimentally known that an Hsp70 construct containing only the nucleotide binding domain and the linker has the same ATPase rate as the full length Hsp70. Hence, in order to reduce the computational cost, simulations have been made on a truncated Hsp70 structure. Several simulations with different nucleotide states (ATP bound, ADP bound or nucleotide free)and with different starting geometries have been carried out in order to determine possible positions of the linker and its effect on the active site arrangement. Moreover, pKa values of some important residues inside or near the active site [3, 4] have been calculated via thermodynamic integration simulations.Thermodynamic integration simulations indicate that Asp194 and Asp201 have elevated pKa values, suggesting that these residues may be protonated at pH 7.5. Asp8 and Glu171 have lower pKa values, hence are probably unprotonated. Simulations with different protonation states of Asp194 and Asp201 have been carried out. It has been observed that the protonation states of these residues affect the conformational behavior of Hsp70., Isı sok proteini Hsp70 baska proteinlerin katlanmasına yardımcı olan bir saperon proteindir. ATP ya da ADP’nin bağlanabildiği bir nükleotit bağlanma domeni ve katlanacak proteinin bağlandığı bir substrat bağlanma domeni olmak üzere iki domenden olusur [1]. ATP varlığında Hsp70’in substrat ilgisi düsüktür. Substrat bağlanması ATP hidrolizini tetikler. ADP bağlı halde substrat ilgisi yüksektir [1]. Đki domen arasındaki allosterik iletisim bir bağlaç tarafından sağlanır. ATPaz aktivitesi pH bağımlıdır ve optimum pH 7.5 civarındadır [2]. Bu çalısma, ATP hidrolizinin tetiklenmesinde bağlacın rolünün ve tepkimenin pH bağımlılığının kaynağının moleküler dinamik simülasyonları yoluyla anlasılmasını hedeflemektedir. Deneysel olarak yalnızca nükleotit bağlanma domeni ve bağlacı içeren bir Hsp70 yapısının tüm dizim Hsp70 ile aynı ATPaz hızına sahip olduğu bilinmektedir. Bu yüzden, hesap zamanını azalmak amacıyla, simülasyonlar bu kısaltılmıs Hsp70 yapısı üzerinde gerçeklestirildi. Farklınükleotit bağlanma halleri (ATP bağlı, ADP bağlı, nükleotitsiz) ve farklı baslangıç geometrileri ile çok sayıda simülasyon gerçeklestirilerek bağlacın olası konumları ve bunun aktif bölge düzenlenmesine etkisi arastırıldı. Ayrıca, aktif bölge içinde ya da yakınında bulunan bazı önemli amimo asitlerin [3, 4] pKa’ları termodinamik integrasyon simülasyonları ile hesaplandı.Termodinamik integrasyon simülasyonları Asp194 ve Asp201 kalıntılarının yüksek pKa değerlerine sahip olduğunu ve pH 7.5 civarında protonlu halde bulunabileceklerini gösterdi. Asp8 ve Glu171’in pKa’larının daha düsük olduğu ve muhtemelen protonsuz halde oldukları gözlemlendi. Asp194 ve Asp201’in farklı protonlanma halleri ile simülasyonlar yapıldı. Bu kalıntıların Hsp70’in konformasyonel davranısını etkilediği görüldü.

Background: Cisplatin, a DNA damaging agent, induces apoptosis through increasing DNA fragmentation. However, identification of intrinsic resistance molecules against Cisplatin is vital to estimate the success of therapy. Bag-1 (Bcl-2-associated anthanogene) is one anti-apoptotic protein involved in drug resistance impacting on therapeutic efficiency. Elevated levels of this protein are related with increase cell proliferation rates, motility and also cancer development. For this reason, we aimed to understand the role of Bag-1 expression in Cisplatininduced apoptosis in HeLa cervix cancer cells. Cisplatin decreased cell viability in time- and dose-dependent manner in wt and Bag-1L+HeLa cells. Although, 10μM Cisplatin treatment induced cell death within 24h by activating caspases in wt cells, Bag-1L stable transfection protected cells against Cisplatin treatment. To assess the potential protective role of Bag-1, we first checked the expression profile of interacting anti-apoptotic partners of Bag-1. We found that forced Bag-1L expression prevented Cisplatin-induced apoptosis through acting on Mcl-1 expression, which was reduced after Cisplatin treatment in wt HeLa cells. This mechanism was also supported by the regulation of heat shock protein (Hsp) family members, Hsp90 and Hsp40, which were involved in the regulation Bag-1 interactome including several anti-apoptotic Bcl-2 family members and c-Raf.

The ability of hyperthermophilic archaeon, Sulfolobus solfataricus P2, to grow on organic and inorganic sulfur sources was investigated. A sulfur free mineral medium has been employed with different sources of carbon. Results showed that inorganic sulfur sources display growth curve patterns significantly different from the curves obtained with organic sulfur sources. Solfataricus has an ability to utilize DBT and its derivatives, but it lacks BT utilization. Solfataricus utilizes DBT at a rate of 1.23 μmol 2-HBP h-1 g DCW-1 even at 78 o40 C, at which DBT is known to be unstable. After enabling DBT stabilization using a two-phase culture system, stable microbial growth was achieved showing a desulfurization rate of 0.34 μM DBT g DCW-1 h-143 . Solfataricus offers beneficial properties compared to the other desulfurizing mesophilic/moderate thermophilic bacteria due to its capacity to utilize DBT and its derivatives under hyperthermophilic conditions.

One of the perspective methods for clean solid fuels production is biodesulphurization. In order to increase the effect of this approach it is necessary to apply the advantages of more informative analytical techniques. Atmospheric pressure temperature programming reduction (AP-TPR) coupled with different detection systems gave us ground to attain more satisfactory explanation of the effects of biodesulphurization on the treated solid products. Subbituminous high sulphur coal from “Pirin” basin (Bulgaria) was selected as a high sulphur containing sample. Three different types of microorganisms were chosen and maximal desulphurization of 26% was registered. The following biodesulphurization treatments were performed: three types of fungi – “Trametes Versicolor” – ATCC №200801, “Phanerochaeta Chrysosporium” – ME446, Pleurotus Sajor-Caju and Mixed Culture of bacteria – ATCC №39327. A high degree of inorganic sulphur removal (79%) was established and consecutive reduction by ~ 13% for organic sulphur (Sorg) was achieved. To follow the Sorg changes a set of different detection systems i.e. AP-TPR coupled “on-line” with mass-spectrometry (AP-TPR/MS), on-line with potentiometry (AP-TPR/pot) and by the “off-line” AP-TPR/GC/MS analysis was used. In order to reach more precise sulphur balance, oxygen bomb combustion followed by ion chromatography was used.

Protein homeostazisi, hücrenin tüm protein bakım işlemlerini kapsayan genel bir terimdir. Protein fonksiyonu doğru katlanmaya bağlı olduğundan, protein kalite kontrolü (PQC), hücrenin hayatta kalmasını sağlayan protein homeostazisinin kurulması için esastır. Salgı ve membran proteinleri, doğru katlanma için endoplazmik retikuluma (ER) yönlendirilir. Tamamen katlanmış proteinler ER'den taşınırken, yanlış katlanmış/katlanmamış proteinler ER stresine yol açarak katlanmamış protein tepkisini (UPR) aktive eder ve dislokasyon yoluyla ER'dan ayrılarak ER-ilişkili yıkım (ERAD) mekanizması aracılığıyla proteolitik yıkım için ubikitin/proteazom sistemine (UPS) hedeflenir. Poli-ubikitin zincirleriyle etiketlenen proteinler RAD23 benzeri adaptör proteinler aracılığıyla proteazoma taşındıktan sonra, poli-ubikitin zincirleri deubikitinleyici enzimler (DUB'ler) yadımıyla kesilir ve proteinler proteolitik degradasyon için proteazomun 19S düzenleyici kapak bölgesinde bulunan AAA+ ATPaz altbirimleri ve/veya VCP/p97 aracılığıyla proteazomun 20S proteolitik çekirdek bölgesine doğru çekilir ve yıkıma uğrar.Çok fonksiyonlu BAG-1 (Bcl-2 ilişkili athanogen-1) proteini, BAG ailesinin ilk keşfedilen üyesidir. Bu protein, 1995 yılında bir hormon reseptörü olan GR'nin ve anti-apoptotik Bcl-2 proteininin etkileşim partneri olarak keşfedilmiştir. Tüm BAG ailesi üyeleri, farklı protein sınıfları ile çeşitli etkileşimler sağlayan ortak karboksil ucu BAG domenleri içerirler. İnsanda BAG ailesi, işlevsel farklılıklara yol açan farklı amino ucu bölgelerine sahip altı proteinden oluşur. İnsan BAG-1 proteininin BAG-1S, BAG-1M ve BAG-1L olarak adlandırılan üç ana izoformu bulunmaktadır ve tüm izoformlar, farklı translasyon başlatma bölgelerinden başlayarak aynı mRNA transkriptinden sentezlenmektedir. BAG-1 izoformları BAG domeni ve ubikitin benzeri domenden (UbL) oluşan ortak karboksil ucu ve farklı amino ucu bölgelerine sahiptir. En büyük izoform BAG-1L bir nükleer lokalizasyon sinyaline (NLS) sahiptir, bu yüzden çoğunlukla nükleusta yer alır. Öte yandan, en küçük izoform BAG-1S sitoplazmada bulunur ve orta uzunluktaki izoform BAG-1M nükleus ve sitoplazma arasında yer değiştirir. Yine de BAG-1 izoformlarının lokalizasyonu, farklı sinyaller sonucunda değişebilir. Ek olarak, BAG-1 ifadesinin farklı tümör tiplerinde, özellikle meme kanserinde normal hücrelere kıyasla daha fazla olduğu bulunmuştur.BAG-1 çok yönlü bir etkileşim ağına sahiptir. BAG-1 etkileştiği Hsc70/Hsp70, Bcl-2, nükleer hormon reseptörleri, Raf-1, E3 ligaz CHIP ve proteazom gibi proteinler aracılığıyla; protein katlanması, protein yıkımı, hücre sağ kalımı, transkripsiyon, translasyon ve apoptoz gibi önemli hücresel mekanizmaların regülasyonuna katkı sağlar. Bununla birlikte BAG-1, Hsc70/Hsp70 şaperon sisteminin nükleotid değişim faktörlerinden (NEF) biri olduğu için, BAG-1'in hücresel mekanizmaların çoğunu Hsp70 etkileşimi aracılığıyla düzenlediği düşünülmektedir. BAG-1:Hsp70 etkileşimi, Hsp70'in ATPaz domeninin IB ve IIB alt domenleri ile BAG-1 BAG domeninin heliks 2 ve heliks 3 bölgeleri arasında gerçekleşmektedir. Diğer taraftan BAG-1'in UbL domeni aracılığıyla ubikitin/proteazom sistemi ile de etkileştiği ve böylece protein katlanması ve protein bozunması sistemleri arasında bir bağlantı sağlayarak hücre içi protein döngüsünü düzenlediği düşünülmektedir.Laboratuvarımızdaki çalışmalarda elde edilen ön bulgular, BAG-1 proteininin ERAD mekanizmasındaki proteinlerle etkileştiğini göstermiştir. Hsp70 şaperonunun da ERAD mekanizması proteinlerinden biri olduğu ve Hsc70/Hsp70 şaperon sisteminin hücre içinde aktif olarak rol aldığı göz önünde bulundurulduğunda, BAG-1 etkileşimlerinin doğrudan ya da Hsp70 üzerinden dolaylı olarak gerçekleşmesi ihtimalleri mevcuttur. Bu çalışmayla, BAG-1:Hsp70 etkileşim bölgesinde BAG domeni üzerinde yapılan nokta mutasyonlar ile etkileşimin bozulması hedeflenmiş ve bu durumun ERAD yolağında görev alan diğer BAG-1 etkileşimlerine olan etkisi hem yapısal hem de deneysel olarak incelenmiştir.Bu amaçla BAG-1:Hsp70 etkileşiminin bozulmasını sağlayacak nokta mutasyonları (BAG domeni üzerinde yer alan R205D, R206E ve R237D) belirlenmiştir. Ayrıca domen kontrolü olarak UbL domeni üzerinde I82K mutasyonu belirlenmiştir. Nokta mutasyonları, Protein Veri Bankası'ndan (PDB) elde edilen üç boyutlu BAG domeni yapısına uygulanmış ve mutasyonların BAG-1:protein etkileşimlerine olan etkisi in siliko olarak PRISM web sunucusu ve FoldX yazılımı aracılığıyla incelenmiştir. Belirlenen mutasyonlar yönlendirilmiş mutagenez yöntemiyle N-ucu TAP etiketli BAG-1S gen dizisine uygulanmış ve mutant plazmitler meme kanseri hücre hattı MCF-7 hücrelerine aktarılmıştır. TAP-etiketi saflaştırma yöntemiyle kompleks halinde saflaştırılan proteinler kütle spektrometresiyle yarı-kantitatif olarak analiz edilerek mutant BAG-1S proteinlerinin etkileşim partnerleri tanımlanmış ve komplekslerdeki proteinlerin miktarları belirlenmiştir. İn siliko analizler sonucunda, BAG domeni üzerinde yapılan nokta mutasyonlarının üçünün de (R205D, R206E, R238D) BAG-1:Hsp70 etkileşiminin stabilitesini azalttığı, öte yandan proteazomal hedeflemede görevli VCP/p97 ile olan olası etkileşimi ise bozduğu saptanmıştır. Yapılan yarı-kantitatif kütle spektrometresi analizleri sonucunda, mutant BAG-1 proteinlerinin Hsp70 şaperonuyla olan etkileşimlerinin azaldığı, buna ek olarak R205D mutasyonunun VCP/p97 etkileşimini bozarken, R206E mutasyonunun VCP/p97 etkileşimini ciddi oranda azalttığı gözlenmiştir. Bu sonuçlar doğrultusunda; yabanıl tip, BAG-1 gen ifadesi durdurulmuş, mutant ve yabanıl tip BAG-1S aşırı ifadesi sağlanmış MCF-7 meme kanseri hücrelerinin 20S ve 26S proteazom aktiviteleri incelenmiştir. Yapılan analiz sonucunda BAG-1 gen ifadesi durdurulmuş hücrelerin 20S ve 26S proteazom aktivitelerinin ciddi oranda azaldığı gözlenmiştir. Ayrıca, olası VCP/p97 etkileşimini bozan R205D ve ciddi oranda azaltan R206E mutantlarının aktarıldığı MCF-7 hücrelerinin proteazom aktivitelerinin de BAG-1 gen ifadesi durdurulmuş hücreler ile benzer bir biçimde azaldığı tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, BAG-1 proteininin ubikitin/proteazom sisteminde VCP/p97 aracılı olarak görev aldığını düşündürmüştür.Elde edilen bulgular BAG-1 proteininin ERAD mekanizmasında oluşan komplekslerde yer aldığını ve bu mekanizmada şaperonlar ve bir AAA+ ATPaz olan VCP/p97 ile kompleks oluşturarak substratların proteazoma taşınımında görev alabileceğini önermiştir. Gelecekte fonksiyon analizlerine yönelik çalışmalar ile bu çalışmadan ortaya çıkan hipotezler test edilerek araştırılacaktır. Uzun vadede hedeflenen, BAG-1:VCP/p97 etkileşiminin bozulmasını sağlayacak terapötik moleküller tasarlayarak meme kanserinde ERAD mekanizması inhibisyonuna yönelik tedaviler geliştirmektir. Proteostasis is referred to all protein maintenance processes of the cell. Since protein function emerges from the correct folding, protein quality control (PQC) is essenetial for proteostasis that results in cell survival. Secretory and membrane proteins are targeted to endoplasmic reticulum (ER) for the correct folding. Fully folded proteins are transported from the ER while misfolded/unfolded proteins are retrotranslocated from the ER and targeted to the ubiquitin/proteasome system (UPS) for proteolytic degradation through ER-associated degradation (ERAD) mechanism.Multifunctional BAG-1 protein is the first discovered member of the BAG family. It was identified as the interacting partner of GR which is an essential hormone receptor and anti-apoptotic Bcl-2 in 1995. All six BAG family members consist of common carboxy-terminal BAG domains providing diverse interactions with different protein classes and distinct amino-terminal domains that give differences in functionality. Human BAG-1 protein has three main isoforms called as BAG-1S, BAG-1M and BAG-1L. All isoforms are translated from the same mRNA transcript starting from the different translation initiation regions. BAG-1 isoforms also have common carboxy-terminal regions consisting of BAG domain and ubiquitin-like domain (UbL) and distinct amino-terminal domains leading to the different cellular localization and functions. Yet, the localization of the BAG-1 isoforms could be changed in response to different signals. In addition, BAG-1 is found to be upregulated in different tumor types.BAG-1 has a diverse network of interaction partners such as Hsc70/Hsp70, Bcl-2, NHRs, Raf-1, CHIP and 26S proteasome that implies the essential role of BAG-1 on cellular mechanisms which are protein folding, protein degradation, cell survival, transcription, translation and apoptosis. However, as BAG-1 is one of the NEFs of the Hsc70/Hsp70 chaperone system, it is thought that BAG-1 regulates most of cellular mechanisms in an Hsp70-dependent manner. The BAG-1:Hsp70 interaction occurs between the BAG domain of BAG-1 and nucleotide binding domain (NBD) of Hsp70. On the other hand, BAG-1 is thought to interact with the 26S proteasome via its UbL and therefore provides a link between the protein folding and protein degradation systems and regulates the protein turnover.Preliminary findings in our laboratory had suggested that BAG-1 interacts with proteins in the ERAD mechanism. Given that the Hsp70 chaperone is also one of the ERAD proteins and Hsp70 chaperone system is actively involved in the cell, BAG-1 interactions could occur either dependent or independent of Hsp70. The aim of this study was to investigate the effects of BAG-1:Hsp70 interaction on BAG-1 complexes in EAD mechanism and UPS.For this purpose, point mutations (R205D, R206E and R237D on the BAG domain) were determined which were thought to interrupt the BAG-1:Hsp70 interaction. I82K mutation on the UbL domain was also selected as a domain-control. The point mutations were applied to three-dimensional BAG domain structures obtained from the Protein Data Bank (PDB) and the effects of mutations on BAG-1:protein interactions were investigated in silico via PRISM web server and FoldX software. After the structural analyses, selected mutations were introduced to the N-terminus TAP-tagged BAG-1S sequence by the site directed mutagenesis approach and mutated plasmids were transfected to MCF-7 breast cancer cells. The protein complexes purified by TAP-tag purification method were semi-quantitatively analysed by mass spectrometry in order to identify the interaction partners and determine their amounts. In silico analyses revealed that, point mutations on the BAG domain decreased the stability of BAG-1:Hsp70 interaction. Moreover, BAG domain mutations disrupted the possible BAG-1:VCP/p97 interaction. After the semi-quantitative mass spectrometry analyses, it was observed that the interactions of mutant BAG-1 proteins with Hsp70 chaperone were decreased. On the other hand, R205D mutation disrupted BAG-1:VCP/p97 interaction, while R206E mutation significantly reduced BAG-1:VCP/p97 interaction. According to 20S and 26S proteasome activity measurements of wild type, BAG-1 knockout, mutant and wild type BAG-1S overexpressed MCF-7 breast cancer cells; BAG-1 knockout cells had significantly lower proteasomal activities. Furthermore, R205D and R206E mutations which disrupted/significantly reduced the possible BAG-1:VCP/p97 interaction had also been found to reduce the proteasome activity in a similar manner to the BAG-1 knockout cells.The results suggested that BAG-1 protein is involved in the ERAD mechanism by forming several complexes with chaperones and VCP/p97 which is an AAA+ ATPase and involved in proteasomal targeting. These BAG-1 complexes may participate in targeting and recruitment of the unfolded/misfolded substrates to the proteasome for degradation. Hypotheses emerged from this study will be tested by future studies on functional analyses. The long-term aim is to develop therapeutic molecules in order to disrupt BAG-1:VCP/p97 interaction for the inhibition of ERAD mechanism in breast cancer treatment. 113

Tam olarak katlanmış üç boyutlu yapı, proteinlerin işlevlerini sürdürebilmeleri için elzem bir özelliktir çünkü proteinler hemen hemen her biyolojik süreçte yer alan ve yapı olarak içsel dinamikleri olan moleküllerdir. Protein katlanmalarının tam olarak gerçekleşmediği aksi durumlarda, protein homeostazını sağlamak ve hücrede oluşabilecek zararlı durumların önüne geçebilmek için sorunlu proteinleri ortadan kaldıran moleküler kompleksler bulunur. Ayrıca, moleküler şaperonlar protein katlanmasına ek olarak oligomerik protein yapılarının oluşumunda, substratların hücre içinde taşınmasında ve geri dönüşümü olmayan agregasyon formlarının uzaklaştırılmasında görev alarak hücre içi protein döngüsüne katkıda bulunur.Isı şoku protein ailesi, daha önce tanımlandığı üzere Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100 ve küçük Hspler olmak üzere 5 alt sınıftan oluşur. Tüm bu sınıflandırmalara ek olarak, ısı şoku proteinlerinin fonksiyonel çeşitlilik açısından foldazlar, holdazlar ve disagregazlar olarak ayrılan 3 ana sınıf vardır. Holdazların en tipik ve yaygın örneği olan Hsp40, amorf agregatlar, toksik oligomerler ve amiloid fibriller gibi fonksiyonel olmayan proteinlerin oluşumuna neden olan istenmeyen molekül-içi ve moleküller arası etkileşimleri önlemek için ara ürün polipeptit zincirlerini yakalar. Hsp70, nükleotit bağlanma domeni (NBD) ve substrat bağlanma domeni (SBD) arasındaki allosterik etkileşimler sonucu holdaz ve foldaz fonksiyonları arasında geçiş yaptığı için sadece bir kategori ile ilişkilendirilemez.Isı şoku proteini 70 (Hsp70), şaperon ailesinde en çok korunan ve hücre içinde aktif olarak ifade edilen proteinlerden biridir. N-ucunda 45 kDa'lık bir nükleotit bağlanma domeni ve C-ucunda 25 kDa'lık bir substrat bağlama domeni içerir. Memelilerde, 4 farklı 70 kDa ısı şoku proteini bulunur. Bunlar çekirdek ve sitoplazmada bulunduğu kanıtlanan Hsp70 ve Hsc70, mitokondride bulunan mHsp70 ve son olarak ER'da görev alan BiP/GRP78 proteinleridir.Bir Hsp70 işlevi olarak protein katlanmasını düzenleyen allosterik modülasyon, SBD ve NBD arasındaki çift yönlü iletişime dayanır. Ayrıntılı olarak, ATP molekülünün NBD'ye bağlanması, SBD'de substrat yüksek ilgili kapalı-kapak konformasyonundan, substrat düşük ilgili açık-kapak konformasyonuna geçişini uyarır. Diğer yandan, substratın SBD'ye bağlanması, NBD bölgesinin ATPaz aktivitesini indükler. Bu arada, nükleotit değişim faktörleri (NEF'ler) ADP'nin ATP ile değiştirilmesine yardımcı olurken J proteinleri (Hsp40'ler) SBD'ye substrat getiren proteinlerdir.Proteinler, yapısal anlamda sadece statik olarak düşünüldüğünde tam anlamıyla anlaşılamaz, ancak dış ve iç etkileşime bağlı protein dinamikleri de işin içine katıldığında proteinler bir bütün olarak anlaşılabilir.Elektrosprey iyonizasyonu (ESI) ve matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu (MALDI) gibi yumuşak iyonizasyon tekniklerinin bulunması, molekül içi ve moleküller arası kovalent olmayan etkileşimleri koruyarak biyo moleküllerin gaz fazına transferine olanak sağladı. Tüm bu gelişmeler beraberinde `Özkorunum (Native) Kütle Spektrometresi` teriminin ortaya çıkmasına neden olmuştur. En basit tabiriyle, üç boyutlu yaıpılarını koruyacak şekilde iyonize olmuş moleküllerin gaz fazına geçmesi ile yapılan kütle analizidir. Bu yöntem aynı zamanda protein komplekslerinin alt birimleriyle birlikte stokiyometrik analizine ve birbirleri arasındaki etkileşimin incelenmesinde kullanılmaktadır. İyon hareketliliği kütle spektrometresi (IMMS), zayıf elektrik alanının etkisi altında gazla doldurulmuş drift tüpündeki hareketliliklerine bağlı olarak iyonları ayıran karmaşık bir analitik tekniktir. Moleküllerin drift tüp içersindeki yolculuğu süresince geçirdiği süre ölçülür ve bu süre iyon halinde hareket eden moleküllerin şekil ve büyüklüklerine bağlı olarak ortamı bufferlayan (azot, helyum vs.) gazlarla yaptıkları çarpışmalar ile belirlenir. Bu yüzden iyon hareketliliği kütle spektrometresi, kütle spektrometresine kattığı üçüncü bir boyut (kütle, yük, yapı) ile proteinlerin dinamik yapı ve davranışlarının incelenmesinin önünü açmıştır. Ayrıca, bu çalışmada da üzerinde durulan proteinlerin farklı enerji seviyelerindeki katlı konformasyonlarının tespiti de bu teknik ile yapılabilmektedir. Kütle spektrometresinde kullanılan üç öncü iyon hareketliliği kütle spektrometresi tekniği vardır. Bunlar drift-zaman iyon hareketliliği kütle spektrometresi (DTIMS), hareketli-dalga iyon hareketliliği kütle spektrometresi (TWIMS) ve asimetrik-alan iyon hareketliliği kütle spektrometresi (FAIMS)' dir.Bu çalışmada, iki domen arası köprü vazifesini gören amino asit dizisini içeren ve içermeyen iki farklı NBD'den oluşan DnaK (Hsp70 bakteriyel homoloğu) 388 ve 392 moleküllerinin pH ve kon gerilimi değişimlerine ek olarak ATP bağlanmasının yapısal dinamiklerin üzerindeki etkisinin açıklanması amaçlanmıştır. Burada iyon hareketliliği kütle spektrometresi ve özkorunum (native) kütle spektrometresi kullanılarak DnaK proteinine dışarıdan yapılan etkiler sonucu konformasyonel dağılımlarının nasıl etkilendiği araştırılmıştır.Bu çalışmada elde edilen veriler, DnaK 388 ve 392 molekülleri arasındaki temel farklılık olan NBD ve SBD domenleri arası bir nevi köprü görevi gören amino asit sekansının DnaK'nin konformasyonel dağılımlarını düzenlediğini ve NBD'nin dışarıdan yapılan müdahalelere gösterdiği davranışsal değişiminde görev aldığını göstermektedir. Fully-folded three-dimensional structure is an inevitably crucial feature for proteins to maintain their functions because proteins are structurally dynamic molecules involved in almost every biological processes. Otherwise, degradation machineries take into place to ensure protein homeostasis. Moreover, the molecular chaperones facilitate protein turnover in different ways in addition to folding, such as oligomeric assembly, transporting substrates and disposal of irreversible aggregates by degradation pathways.The family of heat-shock proteins consists of 5 subclasses which are formerly defined as Hsp60s, Hsp70s, Hsp90s, Hsp100s and small Hsps. In addition, there are 3 major classes, such as foldases, holdases and dissaggregases in terms of heat-shock protein functions. The most typical and widely-known example of holdases is Hsp40 that captures the intermediate polypeptide chains to prevent undesired intramolecular interactions leading to nonfunctional proteins like amorphous aggreagates, toxic oligomers and amyloid fibrils. The Hsp70 cannot be fitted in only one category since it switches between holdase and foldase functions based on allosteric interactions among nucleotide-binding domain (NBD) and substrate-binding domain (SBD). Heat-shock protein 70 kDa (Hsp70) is one of the most conserved and constitutively expressed protein in chaperone families, that comprises an N-terminal nucleotide-binding domain of 45 kDa and a substrate-binding domain of 25 kDa. In mammals, 4 different Hsp70s are defined that Hsp70 and Hsc70 are found in nucleus and cytoplasm; on the other hand, mHsp70 resides in mitochondrial matrix and BiP/GRP78 is localized in endoplasmic reticulum (ER). Allosteric modulation that regulates Hsp70 folding function relies on bidirectional communication between SBD and NBD. In detail, ATP or ADP binding to NBD stimulates the SBD transition from high affinity closed –lid to low affinity open-lid, respectively. On the other hand, binding of substrate to SBD induces ATPase activity of NBD domain. Meanwhile, nucleotide exchange factors (NEFs) help recycling ADP with ATP while J proteins (Hsp40s) present substrate to SBD.Proteins cannot be understood well by considering them just as a static picture, rather they should be considered as dynamic entities with external and internal interactions result in conformational changes that are crucial for their functions. In this study, we aimed to elucidate conformational dynamics of DnaK (bacterial homolog of Hsp70) 388 and 392 constructs which consist of only NBD with/without linker under pH, cone voltage and nucleotide binding perturbations. Herein, ion mobility mass spectrometry and native mass spectrometry had allowed us to survey distributions of the conformational ensembles by disturbing the natural state of DnaK externally.Preliminary data guided us to state that linker region as a major difference between DnaK 388 and 392 molecules modulates the conformational distributions and affects the behavior of NBD under different perturbations that mimic cellular conditions as well. 79

Proteinler, canlıların yaşamı açısından önemli olan makromoleküllerdendir. Proteinler çeşitli görevlere sahiptirler ve bu görevleri yerine getirebilmeleri için doğru 3-boyutlu konformasyonu kazanmaları gerekmektedir. Küçük proteinlerin bazıları başka bir proteine ihtiyaç duymadan katlanabilirken, uzun zincirli proteinler ribozomun dar yapısından dolayı ribozomun içinde katlanamazlar ve katlanabilmek için moleküler şaperon olarak adlandırılan ısı şok proteinlerine ihtiyaç duyarlar. Hatalı katlanan proteinler, diğer proteinlerin katlanmasını geciktirir ya da engellerler. DNA kontrolünde sentezlenen proteinlerin üçüncül yapılarını kazanmasını sağlamak ısı şok proteinlerinin görevidir. Hem hücre içinde hem de hücre dışında bulunabilen ısı şok proteinleri (Hsp) hücre membranlarında da gözlemlenirler. Isı şok proteinlerinin sentezi sadece normal koşullarda gerçekleşmez, aynı zamanda yüksek sıcaklık, pH değişimi, ağır metal, oksidatif ve kimyasal stres koşullarında sentezlenmeleri hızlanır. Isı şok protein çalışmaları 1960 yılının başlarında Ferruccio Ritossa'nın öncülüğünde, meyve sineği Drosophila melanogaster ile başlamıştır. Isı şok proteinleri (moleküler şaperon) ailesinden olan 70 kDa ısı şok proteinleri (Hsp70s), evrimsel açıdan yüksek derecede korunmuş proteinlerdir. Hsp70'in, bakteriden ökaryotlara kadar bütün canlı organizmalarda önemli rolleri bulunmaktadır. Yeni sentezlenen proteinlerin katlanması, proteinlerin kümeleşmesinin engellenmesi, denatürasyondan korunması, yanlış katlanmış proteinlerin yeniden katlanması, proteinlerin translokasyonlarının sağlanması, hasara uğramış proteinlerin yıkılması Hsp70 tarafından gerçekleştirilir. Katlanmamış proteinlerin hidrofobik bölgeleri açığa çıkar ve Hsp70, katlanmamış proteinlerin hidrofobik bölgelerine hidrofobik etkileşim ile bağlanarak yanlış katlanmayı engeller. Bu sayede hidrofobik etkileşimden kaynaklanan kümeleşmeler engellenmiş olur. Hsp70 hücre içerisinde edindiği görevler dışında hücre homeostazisinde de görev alır. Tüm bu görevlere bakıldığında Hsp70'in hücrenin bekçisi gibi görev aldığını görüyoruz.Proteinlerin yanlış katlanması, kümeleşmesi ya da çökmesi Alzheimer, Huntington, Parkinson, Kennedy gibi bazı nörodejeneratif hastalıklara sebep olabilir. Amiloid yapısındaki proteinler sinir sisteminde birikmeye başladıkları zaman nörodejeneratif hastalıklara sebep olduğu görülmüştür ve beta amyloid birikimini Hsp70 aktivitesinin engellediği keşfedilmiştir (Dou ve ark., 2003; Labrador-garrido ve ark., 2010). Parkinson hastalığına sebep olan α-sinüklein proteininin kümeleşmesinde Hsp70'in koruyucu olarak rol aldığı görülmüştür (Labrador-garrido ve ark., 2010). Alzheimer hastalarında yanlış katlanan tau proteinlerinin çözünürlüğü Hsp70 tarafından arttırıldığı görülmüştür (Dou ve ark., 2003). Aynı zamanda Hsp70'in apoptoz yolağında anti-apoptotik protein olarak görev alır. Çalışmamızda Escherichia coli Hsp70 homoloğu DnaK kullanıldı. DnaK amino (N) ucunda nükleotit bağlanma bölgesi (NBD) ve karboksil (C) ucunda substrat bağlanma bölgesi (SBD) olmak üzere iki temel bölgeden oluşur. Bu iki temel bölgeyi birbirine bağlayan evrensel olarak oldukça korunmuş hidrofobik bir bağlaç bulunur. N ucunda bulunan 44 kDa'lık NBD ATPaz aktivitesi gösterirken, C ucunda bulunan 25 kDa'lık SBD substrat bağlar. Kristalografik yapılarına bakıldığı zaman NBD'nin iki ana lobdan oluştuğu ve bu lobların ise iki alt bölgeye, toplamda IA, IIA, IB, IIB olmak üzere 4 alt domene ayrıldığı görülür. SBD'in kristalografik yapısı incelendiğinde α-heliks ve β-tabaka olmak üzere iki kısım görülür. β-tabakasında substrat bağlama yarığı bulunurken, α-heliks kapak görevi görür ve substrat yarığa gelip tutunduğu zaman SBD'in üzerine kapanır. NBD ve SBD arasında hidrofobik bağlacın sağladığı allosterik bir etkileşim vardır. ADP-bağlı durumda bu iki bölge birbirinden bağımsız davranırken, ATP-bağlı durumda birbirleriyle iletişime geçerek sıkı bir şekilde birbirlerine bağlanırlar. ATP-bağlı durumda NBD dengeli hale gelir, substrat bağlanma afinitesi düşer ve bu sırada SBD'in α-heliks kapak yapısı açıktır. ATP hidrolizlenip Pi ve ADP'ye dönüştüğünde substrat bağlanma afinitesinde artış gözlenir. ADP-bağlı durumda SBD'in α-heliks kapak yapısı SBD üzerine kapanır. Bu döngüye yardım eden iki çeşit ko-şaperon bulunur; ATP hidrolizini hızlandıran Hsp40 (DnaJ) ve oluşan nükleotitin değişimini sağlayan, Hsp70'i yeni döngüye hazırlayan nükleotit değişim faktörlerinden olan GrpE'dir. Gerçekleşen allosterik etkileşimde anahtar olarak rol alan bağlaç bölgesi bulunmaktadır. Bu bağlaç bölgesinin yapısı ve görevi tam olarak aydınlatılamadığı için SBD ve NBD arasındaki sinyal iletimi bilinmemektedir. DnaK392 proteininin NMR analizleri yapıldığında yapısında bulunun (388VLLL392) dizisinin NBD bölgesinin IA ve IIA lobları arasındaki yarığa bağlandığı gözlemlenmiştir (Zhuravleva and Gierasch, 2011). NMR sonuçlarında DnaK392 proteininin yapısının substrat ile indüklenmiş yabanıl tip DnaK'nin yapısına benzediği ortaya çıkmıştır. Bu sebepten dolayı araştırmalarda yabanıl tip DnaK kullanmak yerine DnaK392 proteininin kullanılması tercih edilmiştir. Swain ve arkadaşları tarafından 2007 yılında gerçekleştirilen çalışmalarda, NBD bölgesi ve 9 amino asit içeren bağlayıcı bölgenin tamamını (383GDVKDVLLL392) içeren, SBD içermeyen DnaK392 proteini kullanılmıştır. DnaK392, bağlaç bölgesinde içerdiği (388VLLL392) dizisi sayesinde substrat tarafından uyarılmış yabanıl tip DnaK'yi taklit ettiği ve benzer pH-bağımlı profil oluşturduğu görülmüştür. DnaK392 proteininin aksine bağlaç bölgesinde (388VLLL392) dizisini içermeyen DnaK388 proteininin sonuçlarını bakıldığında, ATPaz aktivitesinin peptit bağlı olmayan yabanıl tip DnaK gibi davrandığı ve pH-bağımlı profillerinin benzer olduğu görülmüştür. DnaK392 ve DnaK388 proteinlerinin incelenmesiyle (388VLLL392) dizisinin SBD ve NBD bölgeleri arasındaki sinyal iletim mekanizmasını nasıl etkilediği gözlemlenmiştir. Çalışmanın sonucuna bakıldığında hidrofobik bağlaç bölgesinin (388VLLL392) dizisini içermesi allosterik etkileşimi sağlamakta, dizinin varlığında ve yokluğunda görevlerin farklı olduğu anlaşılmaktadır.Bu çalışmada, daha önceki çalışmalarda olduğu gibi yabanıl tip DnaK392 ve DnaK388 plazmiti DnaK geni içermeyen Escherichia coli BB1553 kompetan hücrelerine transformasyon ile aktarılıp IPTG ile indükledi. Art arda gerçekleştirilen anyon değişim kromatografisi ve afinite kromatografisi ile proteinlerin saf hali elde edildi. DnaK proteininin ATP'ye bağlanma özelliği olduğu için afinite kromatografisi adımında bu özellik kullanılarak ATP-agaroz kolonu kullanıldı. Dairesel dikroizm (CD) ışığı, hem sağ hem sol dairesel polarize ışığa dönüştürülür ve proteinin peptit bağlarının ışığı emmesiyle eliptiktik değeri bulunur. CD spektroskopi kullanılarak DnaK392 ve DnaK388 proteinlerinin ikincil yapısı ve kararlılığının önceki çalışmalar ile benzerlik gösterdiği görüldü. DnaK392 ve DnaK388 için ATPaz aktivite ölçümleri yapılarak literatürde gösterilmiş olan pH'a bağımlı ATPaz aktivitesine etkilerinin olup olmadığı kanıtlanmaya çalışılmıştır. DnaK392'nin, substratla uyarılan DnaK formuna benzer bir ATPaz aktivitesine sahip olduğu bildirilmiştir. Aksine, DnaK388, uyarılmamış DnaK durumu ile benzer bir ATPase aktivitesine sahiptir. Bu çalışmada, denge durumunda (388VLLL392) dizisinin ATPaz bölgesinin farklı uyarlanabilir uyumlarını tespit etmek istiyoruz. Bu sonuca ulaşmak için doğal kütle spektrometresi ve iyon-hareketlilik kütle spektrometrisi yöntemleri kullanılmıştır.İyon-hareketlilik kütle spektrometresi (IM-MS), iyonları elektrik alanı etkisi altında kütle/yük oranlarına göre ayıran analitik tekniktir. IM-MS'de elektrik alanı iyonları hızlandırırken, taşıyıcı tampon gazı ile iyonların çarpışması hızlarını yavaşlatır. İyonların dedektöre ulaşma süreleri biyomoleküllerin büyüklükleriyle orantılı olduğu için, biyomoleküller ne kadar büyük olursa dedektöre ulaşma süreleri de o kadar fazla olur.Deneysel bulgularda, DnaK392'nin doğal kütle spektrometresi ile yük dağılımına bakıldığında pH değerinin 7.5'in altındayken DnaK392'nin en etkin yükü olan +13'ün yük durumu kayması sonucu +14 olduğu gözlemlenmiştir. DnaK392'nin aksine, pH değerinin bazikliği arttıkça DnaK388 en etkin olduğu yükünü korumuş kimyasal kayma gözlemlenmemiştir. DnaK392 ile farklı pH denemeleriyle yapılan IM-MS çalışmalarında, pH 7.5'in altındayken ağırlıklı olarak tek popülasyon gözlemlenmiş, pH 7.5'in üzerindeyken belirgin iki farklı konformasyon belirlenmiştir. DnaK388 için pH 6.5 ve 8.5 aralığında büyük konformasyonel değişikliklere neden olmadığı gözlenmiştir. Bu sonuçlar ışığında, bağlaç bölgesinde, (388VLLL392) dizisini içeren popülasyonun allosterik olarak aktif DnaK olduğu IM-MS ile gösterilmiştir. Proteins are macromolecules that are important for life. Proteins have various cellular functions, which rely on their correctly folded three-dimensional (3-D) structure. Proper folding of nascent protein chains that require assistance to get their native state is accomplished by Heat shock proteins (Hsps) also called as `molecular chaperons`. Hsps are highly conserved family of proteins from bacteria to human. They are not only expressed in normal conditions, but also are expressed in different stress conditions. They participate in numerous cellular functions, which include preventing aggregation, assisting protein folding, refolding of denatured proteins, and degradation. Hsp70s can recognize unfolded, misfolded and aggregated forms of the proteins from their exposed hydrophobic groove. There is a cycle of HSP70s sustained by the use of ATP. During this cycle client polypeptides are get folded by HSP70s successfully to their native states. Hsp70 proteins have two main domains, which are a highly conserved 44 kDa, N-terminal nucleotide binding domain (NBD) and a variable 25 kDa, C-terminal substrate binding domain (SBD). NBD comprises two main lobes and these lobs are divided into upper-lower part and right-left part. SBD consist of two parts which are α-helical lid and β-sandwich subdomain. The α-helical lid covers over the polypeptide bound state. The β-sandwich binds to substrates with a hydrophobic groove. NBD and SBD are connected to each other with a highly conserved hydrophobic linker (GDVKDVLLL). Hydrophobic linker has a critical role in allosteric mechanism of Hsp70. Two different constructs of DnaK namely, DnaK388 and DnaK392, are used to investigate the interdomain communication mechanism by Swain et al. (2007). Both residues do not contain SBD. DnaK392 contains a conserved hydrophobic 389VLLL392 sequence of the interdomain linker, while DnaK388 lacks this linker sequence. These investigations were shown with truncated DnaK constructs as presence or absence of linker. In the same study, the partial interdomain 389VLLL392 linker sequence is found as active and critical for the communication of the ATPase domain and the SBD. It is shown that the construct DnaK392 mimics very similar ATPase activity at the peptide bound state. It was reported that DnaK392 has an ATPase activity that is similar to that of the substrate-stimulated form of DnaK. On the contrary, DnaK388 has an ATPase activity that is similar to that of the unstimulated state of DnaK. In this study, we would like to detect the different adaptable conformations of the ATPase domain derived from the crucial 389VLLL392 linker in equilibrium. We studied with an NBD variant which has a partial interdomain linker sequence 388VLLL392 and with the NDB itself to investigate the arrangement of the conformational ensembles of Hsp70. These proteins are shown to be already folded after purification and they are found in APA state. It is shown by the native mass spectrometry charge state distribution. Our findings revealed that DnaK392 has a charge shift behaviour observed at +14 charge state rather than the most effective charge of +13 charge state after pH 7.5 by native mass spectrometry. Below pH 7.5 there is predominantly one population being observed; and with the pH increase, two distinct conformations of DnaK392 were determined by ion-mobility mass spectrometry. pH alterations cause subtle conformational variations for DnaK388, on the other hand, our complementary approach has shown the existence of a discrete allosterically active state of DnaK in the presence of partial linker using ion-mobility mass spectrometry. 82

Meme kanseri, dünyadaki en yaygın ikinci kanserdir ve kadınlarda en sık görülen kanserdir. Daha az gelişmiş bölgelerde, kadınlarda en sık ölüm nedeni ve akciğer kanserinden sonra daha gelişmiş bölgelerde kanser ölümünün ikinci nedenidir. Türkiye'de ise kadınlarda en sık görülen kanser yine meme kanseridir. İmmünohistokimyasal biyobelirteçler östrojen reseptörü, progesteron reseptörü, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü ve Ki-67, hastalığın durumu için tümör derecesi, boyutu ve nodal durumu kombinasyonu ile ilişkili olarak düşünülür. Günümüzde yirmiye yakın meme kanseri türü belirtilmiştir. Fakat bu çalışma için temel olarak, gen ekspresyon profillerine ve moleküler sınıflamaya dayalı olarak tanımlanmış dört alt grup seçilmiştir: Luminal A, luminal B, HER2 pozitif ve üçlü negatif meme kanser tipleri. Östrojen ve progesteron reseptörleri, hücre büyümesi ve proliferasyonunda rol alan steroid hormon reseptörleridir. PR, ligand ile aktifleşen transkripsiyon faktörüdür ve proliferatif sinyal yolağında, sinyal transdüksiyon yolunu aktive eder. Hücrede MAPK yolağının aktivasyonunu indükler. ER, PI3K / AKT sinyalini indükler ve meme kanseri hücrelerinde hücre büyümesini uyarır. Ayrıca dimerize haldeki aktifleşmiş HER2 reseptörü de RAS ve PI3K yollarını fosforile ederek alt yolaklarının aktiflenmesinde rol oynar. Çekirdekte, steroid hormon reseptörleri hormona duyarlı enhancer sekanslarını tanır ve bağlanarak hormone ilişkili transkripsiyonu artırır.Normal meme epitelyumuna kıyasla, ön-invaziv meme hastalıkları ve meme kanserinde Bcl-2 ile ilişkili anthanogen BAG-1 yaygın olarak artmaktadır. Ek olarak, Bag ailesi proteinleri, bir dizi insan kanserinde ve tümör hücre hatlarında, özellikle de lösemi, meme, prostat ve kolon kanserlerinde farklı olarak eksprese eder. BAG ailesi, çok çeşitli hedef moleküller ile etkileşime giren ve apoptozu, proliferasyonu, transkripsiyonu, metastazı, motiliteyi ve otofajiyi düzenleyen çok fonksiyonlu bir protein grubudur. BAG-1 ayrıca Bcl-2'den bağımsız anti-apoptotik etkilere sahiptir. Çok sayıda reseptör tirozin kinazına bağlanır ve apoptozun inhibisyonunda rol alır. Çalışmalar, BAG-1'in erken meme kanseri prognozunda klinik amaçlarla bir biyobelirteç olarak kabul edilebileceğini göstermektedir. Meme kanseri durumunda, BAG-1, AKT, BCL-2, B-RAF ve C-RAF, steroid hormon reseptörleri ve diğer proteinler ile etkileşime giren ısı şok protein HSP70 için bir eş-şaperondur. Öte yandan, ER fonksiyonunu düzenleyerek östrojen bağımlı transkripsiyonu arttırır. BAG-1 ve PR, ER arasındaki ilişkiler konusunda literatürdeki çalışmaların sonuçları değişkenlik göstermektedir. Bu konuyu ele almak için, BAG-1 ve BAG-1 ile ilişkili sağkalım faktörleri, laboratuvarımızda reseptör tipleri farklı meme kanseri hücre hatları ile çalışıdı. Ön çalışmalarımız bizi meme kanseri hücre sağ kalım yolağında BAG-1etkisi üzerine düşünmeye itmiştir.Alternatif translasyon mekanizması ile üretilen BAG-1'in üç izoformu, hücrede çeşitli bölgelerde lokalize haldedir. Hücre içinde farklı lokalize olabilen BAG-1 izoformları fonksiyonel olarak fark gösterir. Tek bir mRNA transkriptinden alternatif translasyon başlangıcı ile, 3 majör ve 1 minör izoform elde edilir. Bütün izoformlar BAG bölgesine sahiptir, fakat BAG-1L'de ve BAG-1M'de nükleer lokalizasyon sinyali bulunur. Böylece, BAG-1L nükleusta yer alır ve BAG-1M de çekirdeğe göç edebilir. BAG-1'in izoformları, lokalize oldukları doku ve hücrelere göre özelleştiği bilinmektedir. Hücre yolaklarınındaki rolü nedeniyle BAG-1, hücre sağkalımını düzenleyerek hastalıklar için önemli bir biyo-belirteç olarak kabul edilir.Apoptotik protein BAD'ın mitokondriyal membranda BCL-2 ve BCL-XL ile dimerize halde bulunmaktadır. Bu dimerizasyon, hücrede BAD aracılı apoptozu teşvik eder. BAD'ın, Ser112 ve Ser136 residülerinin BCL bağlama bölgesinde olduğu düşünülmektedir ve bu residülerinden fosforile olan BAD, mitokondriyal membrana BCL yoluyla bağlanamaz ve sitoplazmada kalır. Sitoplazmik BAD ise bu sayede hücre sağkalımında rolü bilinmektedir.Laboratuvarımızda yapılan önceki çalışmalarda, Bag-1 ve onun etkileşim partnerlerinin hücre sağkalımı ve apoptoz yollarında önemli rolleri olduğu gösterilmiştir. Çalışmalar, meme epitel MCF-10A, tümörijenik MCF-7 ve triple negatif MDA-MB-231 hücre hatları kullanılarak gerçekleştirildi ve p-AKT, BRAF, CRAF, BCL-2 ile BAG-1 etkileşimleri bu çalışmalarca doğrulandı. Ayrıca, etkileşim kompleksinin bir üyesi olan AKT, Ser 136 residüsünden BAD'ı fosforile ettiği, BAD'ın Ser 112 residüsünün ise p-CRAF vasıtasıyla fosforile edildiği de ekibimizin yaptığı çalışmalarca tekrarlandı. Bu iki lokasyondan birisinden fosforile olan BAD'ın, hücre sağkalımını artırmaktadır. Bu, bize meme kanseri hasta dokularında da bu yolakların doğrulamasının yapılabileceği hususunda fikir verdi. Başlangıçta, `Bu yolaklar meme kanserli hasta dokularında doğrulanabilir mi?'' ve `Hormon reseptörlerine bağlı meme kanserlerinde BAG-1 expresyonu ve ilişkili bu sağkalım yolağı reseptör bağımlı olarak değişkenlik gösterir mi?` soruları ile yola çıkıldı. Bu çalışmada, ER, PR, HER2 bağımlı meme kanserlerinde BAG-1'in ve sağ kalım yolağındaki BAD ilintili faktörlerin ekspresyon paternleri hastaşardan alınan tümörlü ve tümörsüz dokularda incelenmesi amacıyla yola çıkıldı. Bu amaca ulaşmak için BAG-1, BAD, AKT, BRAF, CRAF ve fosforile edilmiş formları ER, PR, HER2 bağımlı farklı tipteki kanser hastalarından alınan normal ve tümörlü meme dokularında araştırıldı. Eşzamanlı olarak, ortak tümör ilişkili genlerdeki mutasyon taraması için, genetic materyal eldesi aynı hastaların kan numunelerinden izole edildi. Bu çalışma, böylelikle hem protein temellli çalışma hem de genetic çalışma yapılarak iki iş akışından oluşmaktadır. Tümör doku örnekleri İstanbul Sağlık Bakanlığı Üniversitesi Ümraniye Eğitim ve Araştırma Hastanesi'nde gerçekleştirilen cerrahi işlem sonrası özel saklama solüsyonlarına alındı. Hem normal hem de tümör doku örneklerinin protein izolasyonu hemen yapıldı. Sonrasında immünoblotlama çalışmaları gerçekleştirilmek üzere protein izolasyonları soğuk zinciri bozulmadan kısa süre içerisinde gerçekleştirildi. Ayrıca immünhistokimya çalışmaları ile lokalizasyon çalışmaları yapıldı. Bu deneyleri yapmak için, dokular parafin bloklarına gömüldü. Formalin fiksasyonu yapılan dokular daha sonra ilgili antikorlarla boyanarak ışık mikroskobu altında incelendi. Öte yandan, aynı hastalardan alınan kan örneğinden izole edilen genetik materyal yoluyla major yaygın tümör baskılayıcı ve onkojenik genlerdeki varyasyonları saptamak için NGS çalışmaları gerçekleştirildi. Meme kanserinde yaygın sorumlu olan onkojen ve tümör baskılayıcı genler PCR bazlı çoğaltılarak, ve oligo dizileriyle işaretlenerek her örnek için ayrı ayrı kütüphaneler hazırlandı. Örnek bazlı kütüphaneler sonrasında birleştirilip örnek havuzu sekanslama teknolojisi kullanularak dizilendi. Dizileme cihazından alınan ham data variant çağırma uygulaması kullanılarak sıralandı ve sonrasında çeşitli databaseler ve varyant çağırma toolları kullanılarak potansiyel varyasyonu araştırmak için analiz edildi. Literatürdeki birçok küçük kohortlu çalışmalar, BAG-1'in meme kanserinde farklı sonuçları olan ekspresyonunu sergilemektedir. Araştırmacılar ve klinisyenler, nükleer BAG-1 ekspresyonu ile yüksek sitoplazmik Bag-1 arasındaki sağkalım veya ilişkinin azalması ve sağkalımın iyileştirilmesi gibi birçok farklı sonuca ulaşmışlardır. Ancak östrojen, progesteron, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü ve Bag-1 interaksiyonları önemli bir konu olarak ortaya çıkmıştır. Ayrıca, Bag-1, ER ve PR arasındaki ilişkilendirmeler de ihtilaf göstermektedir. Bazı çalışmalar Bag-1 ekspresyonu ile ER veya PR ekspresyonu arasında bir ilişki olmadığını gösterirken, diğer çalışmalar Bag-1 ve ER'nün BAG-1 ve PR ile birlikte ifade eğiliminde artış gösterdiğini ifade etmiştir. Bununla ilgili çelişkiler henüz aydınlanmamıştır. Bu çalışmada protein deneylerini yürütebilmek için 48 farklı hastadan doku örnekleri toplandı. Çalışmadaki ana bulgu, tümörlerde, BAG-1 L aşırı ifadesinin, nükleustaki BAG-1 lokalizasyonununa eşlik etmesidir. Ayrıca bu durum ER ile olan ilişki ile paraleldir.Lumainal A tipinde, BAG-1L, p-AKT ve p-BAD Ser 136 nükleusta lokalizasyonları tekrarlı çalışmalarca tümör dokularında gözlemlenmiştir. Buna bağlı olarak, muhtemel BAG-1, p-AKT, BAD/p-BAD Ser 136 üçlü kompleksinin, ER varlığında nükleer lokalize olabileceği ihtimali üzerinde yoğunlaşılmıştır. Bu bulgu ışığında BAG-1L'nin ER ile ilgili meme tümörlerinde biyobelirteç olma olasılığı üzerinde çalışmalar devam ettirilmektedir. Breast cancer is the second most common cancer in world, and by far the most frequent cancer among women. In less developed region, it is the most frequent reason of death in women, and second cause of cancer death in more developed regions after lung cancer. Besides, in Turkey the most common cancer in women is breast cancer. Immunohistochemical biomarkers oestrogen receptor, progesterone receptor, human epidermal growth factor receptor and Ki-67 are considered with the combination of tumor grade, size, and nodal status for the disease status. Presently, there are 20 major types of breast cancer. However, mainly four subgroups that has been defined clearly based on gene expression profiles and molecular classification were chosen for this study: Luminal A, luminal B, HER2 enriched and triple negative breast cancers. Estrogen and progesterone receptors are steroid hormone receptors that have roles in cell growth and proliferation. PR is ligand activated transcription factor and activate signal transduction pathway in pro-proliferative signalling. It induces the activation of MAPK signalling in cell. ER induces PI3K/AKT signalling and stimulates cell growth in breast cancer cells. Besides, activated HER2 receptor phosphorylates RAS and PI3K pathways also. In nucleus, steroid hormone receptors recognise and bind to hormone responsive enhancer sequences.Bcl-2 associated anthanogene BAG-1 is commonly increased in pre-invasive breast disease and breast cancer compared to normal breast epithelium. In addition, Bag family proteins express differentially in a range of human cancers and tumour cell lines, particularly leukaemia, breast, prostate, and colon cancers. Bag family, a multifunctional group of protein that interacts with a wide range of target molecules and regulate apoptosis, proliferation, transcription, metastasis, motility and autophagy. BAG-1 also has anti-apoptotic effects, which are independent of Bcl-2; it binds to numerous receptor tyrosine kinases and improves their ability to inhibit apoptosis. Studies show that BAG-1 can be accepted as a biomarker for clinical purposes in early breast cancer prognosis. In case of breast cancer, Bag-1 is a co-chaperone for the heat-shock protein HSP70 that interacts AKT, BCL-2, B-RAF and C-RAF, steroid hormone receptors and other proteins. In the other hand, it increases estrogen dependent transcription by regulating ER function. Reported associations between BAG-1 and PR, ER are variable. To address these issues we tried to assess the expression of BAG-1 and BAG-1 related survival factors with cell lines with breast cancer that differ from the receptor type in our laboratory.Our early studies encourage us to enlighten to find out exact role of BAG-1 in survival pathway.Three isoforms of BAG-1 that are generated by alternative translation mechanism are localized various location in the cell. Bag-1 isoforms, which can be differentially localized in the cell, are functionally distinct. Alternative translation initiation from a single mRNA transcript produces 3 major and 1 minor isoform. All isoforms have BAG domain, but nuclear localization signalling is found in BAG-1L and a part of NLS in BAG-1M. Thus, BAG-1L localizes on nucleus and BAG-1M can also be translocated to nucleus. The isoforms of BAG-1 are specialized according to the tissue and cell lines they localized. Because of the involvement in number of cellular pathways, BAG-1 is regarded as an important marker for diseases, regulating cell survival. Apoptotic protein BAD is known that reside in mitochondrial membrane with dimerized with BCL-2 and BCL-XL. This dimerization promotes BAD mediated apoptosis in cell. If BAD is phosphorylated on Ser112 and Ser136 that residues are considered to be in BCL-binding site, phosphorylated BAD unable to bind mitochondrial membrane via BCL and exist cytoplasm. Cytoplasmic BAD promotes cell survival.The previous studies in our lab demonstrated that Bag-1 and its interaction partners have impprtant roles in cell survival and apoptosis pathways. The studies were managed by using tumorigenic MCF-7 and triple-negative MDA-MB-231 and non-tumorigenic MCF-10A epithelial cell lines. In our laboratory, BAG-1 interactions with p-AKT, BRAF, CRAF, BCL-2 was verified. In further, the member of this interaction complex AKT, phosphorylates BAD at Ser 136 residue and Ser 112 residue of BAD is phosphorylated via p-CRAF. The phosphorylated BAD on these two residues promotes cell survival. This work exited us to find these pathways in breast carcinoma patients' tissue. To begin with, we think about that `Are these pathways also present in tissues from breast carcinoma patients?'' and `How is the situation in breast cancer linked to hormone receptors?'' In this study, it was intended to enlighten hormone receptor and HER2 dependent expression patterns of BAG-1 and survival factors affecting BAD in breast cancer tissues. To achieve this aim, BAG-1, BAD, AKT, BRAF, CRAF and phosphorylated forms were investigated in normal and tumor breast tissues across ER, PR, HER2 status. Simultaneously, proteomic effects if the mutation in common tumor related genes were searched to identify tumor progression for same patients' sample. This study consist of two workflow, one is conducted with tissue sample from patients. Tumor tissue samples were supplied from Univesity of Ministry of Health - Umraniye Training and Research Hospital of Istanbul. Tissues were taken from the lumpectomy, mastectomy surgeons. The fresh tissues were taken into RNA Later solution. Protein isolation of both normal and tumor tissue samples were done immediately. Immunobloting studies were done further. Besides, immunohistochemistry studies were conducted. To make this experiments, tumorous sections of tissues were embedded in paraffin blocks. Formaline fixed parafine embedded tissues then stained with interested antibodies. In the other hand, we conducted NGS study to detect major common tumor suppressor and oncogenic genes variations via the genetic material isolated from the blood sample from the same patients. We conducted to library preparation step via PCR based detection kit for our breast cancer panel. Sequencing was conducted further. Aligned fragments were then analysed to searched the potential variation by using genetic tools. Many small cohort studies in literature have measured expression of BAG-1 with different outcomes in breast cancer. Researchers and clinicians found that many different results such as association between nuclear BAG-1 expression and decreased survival or association between high cytoplasmic Bag-1 and improved survival. However the estrogen, progesterone, human epidermal growth factor receptor and Bag-1 interactions came up as an important issue. Also, described associations between Bag-1, ER and PR are different. Some studies have shown no association between Bag-1 expression and ER or PR expression while other studies have shown that Bag-1 and ER tend to co-express, as do BAG-1 and PR. There are many contradictions about it. Total forty eight tissue samples from different patients were used to make protein experiments in this study. The main finding in this study is that in tumors, BAG-1 L overexpression accompanied by BAG-1 localization in nucleus. Besides, ER positivity is parallel for this relationship. In lumainal A type, BAG-1L, p-AKT and p-BAD Ser 136 resided in nucleus. Depends on the finding, we suggested that possible BAG-1, p-AKT, BAD/p-BAD Ser 136 triple complex might be co-localized in nucleus in the condition of ER presence and BAG-1L could be the main target for the ER-related breast tumors. 76

Meme kanseri dünya çapında önemli bir sağlık sorunudur. Gelişmiş ülkelerde bile halen kanserden ölümlere neden olan en önemli kanser tiplerinden birisidir. Meme kanserinin özellikle kadınlarda görülme sıklığının artması ve tedaviye yönelik yeni yaklaşımlara olan ihtiyaç artmakta ve bu alandaki araştırmalar hız kazanmaktadır.İnsan hücrelerinde, tek bir mRNA'dan alternatif translasyonla üç fonksiyonel BAG-1 izoformları ifade edilir. Hücrede lokalizasyonları değişen üç BAG-1 izoformlarının, BAG-1S (33 kDa), BAG-M (46 kDa) ve BAG-1L (52 kDa), farklı N-terminalleri mevcuttur. BAG-1L izoformu nükleer lokalizasyon sinyaline sahiptir ve büyük oranda nükleer bir proteindir. Nükleer lokalizasyon sinyalinin bir kısmı BAG1M'nin N-terminalinde bulunur, bu yüzden BAG-1M da nükleusa göç edebilir. Nükleer lokalizasyon sinyalinin çok az kısmını içeren BAG-1S nükleusta bulunmamaktadır fakat bazı koşullar altında bu sinyalin rol oynayabileceği bildirilmiştir. Aynı mRNA üzerinde BAG-1L ve BAG-1M izoformlarının ifadesi uç CUG ve AUG kodonlarıyla başlar, oysa BAG-1S ifadesi bir iç AUG kodonuyla başlar. BAG-1 izoformlarıyla, hücrenin hayatta kalması için sinyal iletiminde hubları oluşturan aday bir proteindir. Tümör hücrelerinde BAG-1L'nin nispeten yüksek ifade seviyeleri gözlemlendiği bildirilmiştir. Hücrenin hayatta kalmasında önemli bir protein olan BAG-1, başta meme kanseri olmak üzere birçok kanser çeşidinde ifade düzeylerinin arttığı gözlenmiştir. Bu yüzden dolayı kanser oluşmasında ve gelişmesinde incelenmesi gereken bir proteindir. Adoptör işlevine sahip BAG-1, bir anti-apoptotik proteindir. Hsp70/Hsc70 şaperonları, proteazom sistemi, Bcl-2 proteini, Raf-1 kinaz, nükleer hormon reseptörleri ve DNA gibi çeşitli moleküler hedeflerle etkileşime girebilir. Bu yüzden, çok çeşitli hücresel süreçlerin düzenlenmesinde yer almaktadır.HSP70/HSP90 hücrede bolca eksprese edilen ve hücre içindeki proteinlerin doğru katlanmasında ve işlevlerini kazanmarında önemli rol oynayan moleküler şaperonlardır. HSP90, HSP-aracılı anormal proteinlerin proteazomal degradasyonunda görevli olduğu bir çok yayında gösterilmiştir. Protein katlanma süreci endoplazmik retikulumda gerçekleşir. Bu sürece ER'de bulunan ısı şoku proteinleri, lektin proteinleri, disülfit izomerazlar katılır. Protein katlanmasında proteinin stabilitesini arttıran N-glikozilasyon gerçekleşir. N-bağlı glikanlar, proteinin çözünürlüğünü arttırır ve protein katlama yollarını doğrudan etkiler. α-glukosidaz I ve α-glukosidaz II enzimleri, katlanan proteinin N-terminalinde bulunan iki glikozu uzaklaştırır. Calnexin (ER membrana bağlı) ve Calreticulin (ER lümeninde) lektin şaperonlarıdır ve protein katlanmasını destekler. ER'deki lektin şaperonları ve BiP şaperonu arasında bir bağlantı vardır. BiP, hidrofilik N-glikanların eklenmesinden önce, yeni sentezlenen proteinin hidrofobik uzantısıyla etkileşir. BiP, N-terminal yakınındaki glikan içeren glikoproteinlerin olgunlaşmasında daha az rol oynaması olasıdır, çünkü bunlar hidrofiliktir, böylece BiP'nin bağlanması önlenir ve lektin şaperonlarının bağlanması teşvik edilir. Lektin şaperonları son glikana bağlanır ve sonra katlama işlemini kontrol ederler. Buna ek olarak, lektin şaperonları oksidoredüktaz ERp57 (PDI) ile kovalent olmayan şekilde etkileşir, böylece substrat üzerinde disülfid bağlarının oluşmasını ve izomerizasyonunu tetikleyebilir. PDI, disülfid izomeraz protein ailesinin bir üyesidir ve ER lümeninde bulunur. Disülfid bağının oluşumu nedeniyle proteinlerin konformasyonel esnekliği sınırlar ve proteinlerin yapısal sertliğini arttırır. ER'deki kalite kontrol mekanizmasına rağmen, protein katlanması yetersiz olduğunda ve protein düzgün bir şekilde katlanamadığında, anormal proteinler ER'de akümüle olur. Bu nedenle, katlanamamış protein cevabı (UPR) yolağının aktivasyonu gerçekleşir. UPR sisteminin bir parçası olan ERAD yolağıyla anormal proteinlerin ER'den sitozole retrotranslasyonu meydana gelir. ERAD yolağı, seçilmiş anormal proteinlerin retrotranslokasyonuna ve ubikuitin bağımlı proteazomal degradasyonuna aracılık eden bir dizi süreçten oluşur. Substrat dislokasyonunu yönlendiren enerji, ubikuitin bağımlı heksamerik AAA+ ATPase VCP (p97) tarafından adenosin trifosfat (ATP) hidrolizinden elde edilir. VCP, ERAD dislokasyon komplekslerine çeşitli ERAD bileşenleri ile doğrudan etkileşirek dahil olur. ERAD substratının polubikuinitinasyonu, VCP ile ekstraksiyonu kolaylaştırılır ve proteazomal degradasyonu için bağlanma bölgesi olarak işlev görür. Ubikuitin, substrat üzerinde N-terminaldeki lizin tortularına kovalent olarak bağlanabilen 76 amino asitten oluşan küçük bir proteindir. Ubikuitin ilavesi, E1 ubikuitin-aktive edici enzimi, E2 ubikitin-konjuge enzimini ve ubikuitinin substrata nihai transferine aracılık eden E3 ubikitin ligazını içeren ardışık enzimatik reaksiyonlar yoluyla gerçekleşir. CHIP (E3 ligaz), yanlış katlanmış proteinleri şaperonlardan proteazomlara yönlendiren bir sistemin parçasıdır. İki modülatör, BAG-1 ve CHIP, sitosolik bozunma yollarında rol oynar, ve moleküler şaperonları, nativ olmayan polipeptidlerin katlanması ve parçalanması arasındaki karar sürecinin merkezine yerleştirir. BAG-1'in etkileşim partneri olan ubikuitin/proteazom sistemiyle yanlış katlanmış ya da katlanamamış proteinlerin degredasyonu gerçekleşir. Proteazom ile ilgili çalışmalarda, proteazom inhibisyonunun toksik etkilerine kanser hücrelerinin, normal hücrelere kıyasla daha hassas olduğu gösterilmiştir. Kanser hücrelerinin daha yüksek hassasiyetinin ardındaki mekanizma belirsiz olmasına rağmen, proliferasyonunu ve anti-apoptotik yolakları düzenlemek için proteazomu kullanma olasılıkları yüksektir. Ubikuitin/proteazom sistemine katılan BAG-1'in kanser tedavisinde hedef molekül olabileceği düşünülmektedir.Retrotranslokasyon sırasında, anormal proteinlerin proteazomal degradasyonu için ubikitinler proteinlerin tanınması için işaret olarak eklenir. Ubikuitinasyon degrede olacak proteinlerin proteazoma iletilmesi dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçte etkilidir. BAG-1L izoformunun içerdiği UBL domaininden dolayı ubikuitinin katıldığı biyolojik süreçlerde BAG-1L'nin de rol oynayabileceği düşünülmektedir.Ayrıca, araştırmacılar BAG-1'in östrojen reseptörü üzerindeki etkisini araştırmış ve BAG-1L'nin östrojene bağımlı transkripsiyonu arttırdığını, ancak BAG-1M veya BAG-1S'nin transkripsiyonu artırmadığını bulmuşlardır. Araştırmacılar BAG-1L östrojen reseptörleri ile etkileşirerek reseptör aktivitelerini arttırdını belirtmiştir. Bu çalışmada, meme kanserli (MCF-7) ve epitel hücre hatlarında (MCF-12A) ve aynı zamanda meme dokularında BAG-1L ile ilişkili komplekslerin izolasyonunu içeren proteom-merkezli bir strateji benimsedik. BAG-1L ile ilişkili komplekslere katılan proteinler, C ve N-terminal TAP-etiketli BAG-1L pürifiye proteinlerden yapılan izoform-spesifik LC-MS/MS analizi ile tanımlanmıştır. BAG-1L ile ilişkili komplekslerde yer alan proteinlerin tanımlanması, meme kanserinde BAG-1L'nin adaptör rolünü kesin olarak ortaya çıkarmaktadır. Yaptığımız kanser hücre hattı immünoblotma deneyleriyle BAG-1L'nin ERAD mekanizmasındaki proteinlerle (BiP, HSP70, PDIA3, VCP, RAD23B, CANX ve CALR) kompleks oluşturduğunu ispatladık. Meme epitel hücre hattı imünoblotlama deneyleriyle ise kanser hücre hattına kıyasla farklılıklar gözlemledik. ERAD proteinlerinden HSP90 ve CHIP'in epitel hücrelerde BAG-1L ilişkili komplekste yer almadığını belirledik. Tümörlü ve normal meme dokularıyla yaptığımız immunoblotlama deneyleriyle, tümör dokularında ERAD mekanizması proteinlerinin, HSP70, RAD23, VCP ve CHIP, ifade düzeylerinin arttığını gözlemledik. Ayrıca, yine tümörlü ve normal dokularla yaptığımız immünopresipitasyon deneyleriyle, tümörlü dokularda ERAD proteinlerinin BAG-1 ile birlikte çöktüğünü yani BAG-1 ile etkileştiğini ispatladık.Biyoinformatik araçlarla yapılan diğer analizlerle, protein kalite kontrol sistemine BAG-1L izoformunun katıldığını ve hücre içi homeostazı korumak için ERAD mekanizmasında rol oynadığını belirledik. BAG-1L izoformunun proteazomla etkileşimi zayıf bir şekilde karakterize edittik, ubikitin aracılı proteazomal bozulmada BAG-1L izoformunun rolünün ayrıntılı bir şekilde anlaşılması eksiktir. Özellikle, proteozom mekanizmasının bileşenleri olan VCP/p97 ve RAD23 ile BAG-1L'nin protein-protein etkileşimlerinin bulunması, ubikuitine bağımlı proteazomal degradasyonda BAG-1L'ın rolünün belirlenmesinde kritiktir. An anti-apoptotic protein BAG-1, with its adaptor function, can interact with a diverse array of molecular targets such as Hsp70/Hsc70 chaperones, proteasome machinery, Bcl-2, Raf-1 kinase, nuclear hormone receptors and DNA, and is found to involve in the regulation of a wide variety of cellular processes. In human cells, three functionally distinct and differentially localized BAG-1 isoforms originating from a single mRNA are expressed through alternative translation and these three isoforms include BAG-1S (33 kDa), BAG-1M (46 kDa) and BAG-1L (52 kDa), which have distinct N-terminus. BAG-1L, which possess a nuclear localization signal is a largely nuclear protein, whereas BAG-1M partitions between nucleus and cytoplasm. BAG-1 with its isoforms is a candidate protein to form hubs to transmit signals for survival. It has been reported that relatively high BAG-1L levels are observed in tumor cells.Protein folding process occurs in the endoplasmic reticulum. This folding process involves heat shock proteins, lectin proteins, disulfide isomerases present in the ER. In protein folding, N-glycosylation occurs which increases protein stability. N-linked glycans increase protein solubility and directly affect protein folding pathways. Calnexin (ER membrane bound) and Calreticulin (ER lumen) are lectin chaperones and support protein folding. Lectin chaperones connect to the last glucose and then control the folding process. In addition, lectin chaperones interact non-covalently with oxidoreductase PDI (ERp57), thus triggering disulfide bond formation and isomerization on the substrate. PDI is a member of the disulfide isomerase protein family and is found in the ER lumen. The formation of disulfide bonds limits the conformational flexibility of the proteins and increases the structural stiffness of the proteins. Despite the quality control mechanism in ER, when protein folds are inadequate and the protein can not fold properly, aberrant proteins accumulate in the ER. Therefore, the activation of the unfolded protein response (UPR) occurs. Through ERAD pathway, which is part of the UPR system, abnormal protein retrotranslation from the ER to the cytosol occurs. The ERAD pathway consists of a series of processes that mediate the retrotranslocation of selected aberrant proteins and the ubiquitin-dependent proteasomal degradation. The energy that drives substrate dislocation is derived from adenosine triphosphate (ATP) hydrolysis by the abundant, ubiquitin-dependent hexameric AAA+ ATPase VCP (p97). VCP is recruited to ERAD dislocation complexes through direct interactions with several ERAD components. ERAD substrate polyubiquitination functions as a binding site that facilitates extraction by VCP and acts as the signal for proteasomal degradation. The addition of ubiquitin occurs via sequential enzymatic reactions involving an E1 ubiquitin-activating enzyme, an E2 ubiquitin-conjugating enzyme, and an E3 ubiquitin ligase that mediates the final transfer of ubiquitin to the substrate. CHIP (E3 ligase) is part of a system that directs misfolded proteins from chaperones to proteasomes. Two modulators, BAG-1 and CHIP, have implicated in cytosolic degradation pathways,xxiiputting molecular chaperones at the center of the decision process between folding and degradation of non-native polypeptides. The ubiquitin/proteasome system, the interaction partner of BAG-1, degrades misfolded or unfolded proteins.Investigating the effect of BAG-1 on the estrogen receptor has found that BAG-1L promotes estrogen-dependent transcription but BAG-1M or BAG-1S do not increase transcription of ER. BAG-1L interacts with estrogen receptors and enhances receptors activity. Studies on proteasome have shown that toxic effects of proteasome inhibition in cancer cells are more sensitive than normal cells. Although the mechanism behind the higher susceptibility of cancer cells is not known, there is a high probability of using the proteasome to regulate proliferation and anti-apoptotic pathways. BAG-1, an adaptor protein in the ubiquitin/proteasome system, can be used as a drug target in cancer due to cell survival effect. Here, we adopted a proteome-based strategy comprising isolation of BAG-1L associated complexes from breast cancer and epithelial cell lines as well as breast tissues. Identification of the proteins involved in BAG-1L associated complexes to ultimately delineate the adaptor role of BAG-1L in breast cancer. Proteins involved in BAG-1L associated complexes were identified via LC-MS/MS analysis with an BAG-1L isoform-specific manner. Further analyses with bioinformatics tools hinted the involvement of BAG-1L isoform in protein quality control system, which includes the action of endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) mechanism to maintain intracellular homeostasis of cellular proteins. Interaction of BAG-1L isoform with the proteasome were poorly characterized, detailed understanding of the involvement of BAG-1L isoforms in the ubiquitin mediated proteasomal degradation is lacking. Determined interactions which includes specifically VCP/p97 and Rad23, components of proteasome machinery, set a critical role for BAG-1 in the ubiquitin-dependent proteasomal degradation. 90

Kanser, yirmi birinci yüzyılın dünyasında önemli bir sorundur ve refah seviyesi fark etmeksizin tüm ülkeleri etkiler. GLOBOCAN verilerine göre, 2012 yılında tüm dünyada 14.1 milyon yeni kanser vakası ve 8.2 milyon kanser kaynaklı ölüm meydana gelmiştir. İlerleyen yıllarda ise kanser insidansının ve kansere bağlı ölümlerin artış göstermesi beklenmektedir. Meme kanseri dünyada ikinci en sık görülen ve kadınlarda en sık görülen kanser türüdür. Meme kanseri her yıl 1.15 milyon yeni vakaya ve 411,000 ölüme sebep olmaktadır. Kolorektal kanseri ise dünyada üçüncü en sık saptanan malignite ve dördüncü kansere bağlı ölüm sebebidir. GLOBOCAN veri tabanına göre kolorektal kanserde, 2012 yılında 1.4 milyon yeni vaka ve yaklaşık olarak 700,000 ölüme sebep olmuştur.Hücre döngüsü, hücre büyümesini ve DNA'nın çoğalmasını düzenlemek için sıralı fazları ve kontrol noktalarını içeren bir işlemler bütünüdür. Tümör baskılayıcı genlerin ve onkogenlerin ürünleri olan ve hücre döngüsünde görev alan bazı proteinler vardır. Tümör baskılayıcı genlerdeki anormalliklerden dolayı, hasar görmüş tümör baskılayıcı proteinler hücre döngüsünü kısıtlama olan görevlerini doğru şekilde yerine getiremezler. Bunun yanı sıra, mutasyonlar sonucu aktive hale gelen onkogenler, kontrol mekanizmasının etkin olmadığı bir hücre döngüsüne sebep olur. Bozulmuş bir hücre döngüsü sonucu biriken hataların sonucunda hücreler, hücre büyümesini ve ölümünü kontrol eden sinyallere daha fazla cevap veremezler. Bu sıralı olaylar kanser hücrelerinin oluşumuna neden olurlar. Tümör baskılayıcı genler hücre döngüsünü prosesinin ve replikasyonun devamlılığyla birlikte kontrolünü sağlar. BRCA1 ve BRCA2 gibi genler ise DNA kırıklarının hatasız tamiri için kardeş kromatidi kullanan homolog rekombinasyon tamir mekanizmasında görev alan ana genlerdir. Öte yandan, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 ve EPCAM'dan oluşan mismatch tamir mekanizması yanlış nükleotid eşleşmelerini ve küçük insersiyonlarla delesyonların düzeltilmesinde görev alır. Mismach tamir mekanizmasındaki bozukluklar kanser gelişiminde önemli bir yer tutmaktadır ve herediter non-polyposis kolorektal kanser sendromu –diğer adıyla Lynch sendromu ile ilişkilendirilmektedir. Bu mekanizmadaki bozukluklar özellikle kolorektal kanser riskini arttırmakla beraber gastrik, endometriyal ve over kanserlerine de sebep olmaktadır. Ek olarak, kanser dokularında mikrosatellit instabilitenin (MSI) de görülmesinde etkilidir. MSI, birçok kanser türünde oluşabilmektedir ancak Lynch sendromu ilişkili kolorektal kanserin karakteristik özelliğidir. Kanserlerin vakalarının çoğunluğu kişilerin hayatı boyunca oluşabilecek patojenik varyantlardan kaynaklanmaktadır ama nesiller boyunca aktarılmış genetik değişimlerden dolayı oluşan kanserler kalıtsal tür olarak adlandırılmıştır. Yaklaşık olarak tüm kanser vakalarının yüzde beş ila onu kalıtsal kanser kategorisinde bulunmaktadır.Meme ve kolorektal kanserlerin insidans ve ölüm oranları göz önünde bulundurulduğunda, klinik özelliklerin ve nadir varyantların karakterize edilmesi için kalıtsal risk grubundaki hastaların germline DNA'ları çoklu gen panelleri ile yeni nesil dizileme (NGS) teknolojisi kullanılarak dizilendi.Hasta grubu 273 meme kanseri hastası ve 123 kolorektal kanseri hastasından oluşmaktadır. Kontrol grubu içinse 65 yaşından büyük ve kişisel kanser öyküsü bulunmayan 338 kişi çalışmaya dâhil edilmiştir. Kalıtsallık riskine sahip olan hastaları belirlemek için NCCN'ye ait olan kalıtsal meme ve kalıtsal kolorektal kanser kılavuzlarından faydalanıldı. Yeni nesil dizileme için üç farklı ticari kit kullanıldı. . Varyant çağırma için Sophia DDM yazılımı ile GATK analizleri kullanıldı. Analizler sonucu açığa çıkarılan varyantlar üç ticari kitte bulunan ortak 20 gene göre filtrelendi. Bu genler kalıtsal meme ve over kanser, kalıtsal non-polipozis kolorektal kanser ve bağırsak polipozis sendromlarıyla ilişkilidir. 20 genin sıralanışı şu şekildedir: APC, ATM, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CDH1, CHEK2, EPCAM, MLH1, MSH2, MUTYH, NBN, PALB2, PMS2, PTEN, RAD51C, RAD51D, STK11 ve TP53. 1000 Genom populasyon veri tabanında alel frekansı %1'in altındaki ekzonik ve splice bölgelerinde bulunan varyantlar seçilmiştir. Hastaların raporlandırılması esnasında monoallelik MUTYH patojenik varyantlar değerlendirme dışı bırakılmıştır. Patojenik/muhtemel patojenik varyantları bulunduran ve pozitif olarak değerlendirilen hastalarla sağlıklıların oranları şu şekildedir: Meme kanseri hastaları için %13.55 (n=37), kolorektal kanseri hastaları için %11.90 (n=15) ve kontroller için %4.45 (n=15). Meme kanseri hastalarının %24.18'i (n=66), kolorektal kanser hastalarının %30.95'i (n=39) ve kontrollerin %21.96'sında önemi belirsiz (VUS) varyant bulunmuştur.Hastalarda yapılan kalıtsallık riskinin tahmini sonucu meme kanseri hastalarının %72'si (n=197) yüksek risk sınıfında bulunmuştur. Kalan hastaların %28'inde ise (n=76) kalıtsallık riski daha az olarak bulunmuştur. Yüksek risk ve yüksek olmayan risk gruplarının yaş ortalamaları sırasıyla 44.9 ve 59.6 olarak tespit edilmiştir. Tüm meme kanseri hastalarında (n=273), toplamda 43 patojenik varyant bulunmuştur. Patojenik varyantların %4.76'sı BRCA1 ve BRCA2 genlerinde gözlenmiştir. Orta dereceli penetransa sahip genler (ATM, CHEK2, PALB2, NBN) %5.10 ile en fazla patojenik varyant içeren genler olarak bulunmuştur. Vaka control karşılaştırması sonucunda CHEK2 geninde bulunan patojenik varyantların anlamlı odds oranına sahip olduğu bulunmuştur (OR=3.51). Ayrıca, CHEK2 geninde bulunan bir patojenik varyantın, NM_007194(CHEK2):c.1427C>T (p.Thr476Met), meme kanseri hastalarında (n=4) ve kontrollerde (n=3) bulunduğu tespit edilmiştir. Meme kanseri hastalarında 83 (n=75) tane önemi belirsiz varyant tespit edilmiştir. Bu varyantların 72'si ise farklı varyantlar olarak tanımlanmıştır. Tüm ve farklı önemi belirsiz varyantların içinde, ATM ve BRCA2 diğer genlerden daha yüksek oranlara sahip olduğu bulunmuştur. Gen ürünü büyüklüğünün bulunan varyant sayısı üzerindeki etkisini kaldırmak için tüm ve farklı önemi belirsiz varyantlara standardizasyon uygulandı. Standardizasyon sonucunda CHEK2, MSH2, RAD51C ve MSH6 genleri amino asit başına bulunan VUS sayısı bakımından diğer genlere göre daha yüksek oranlar gösterdi. Aynı sonuçlar yüksek ve daha az kalıtsal riske sahip olan hastalarda da gözlenmiştir. RAD51C ise bir tane önemi belirsiz varyanta sahip olduğundan, CHEK2, MSH2 ve MSH6, yapılacak ileri analizlerde meme kanseri ile ilişkili genlerin belirlenmesinde gelecek vaat eden genlerdir.Kolorektal kanser grubunun %35'i (n=43) yüksek kalıtsal riske sahip olarak tanımlanmışken %65'i (n=80) daha az kalıtsal riske sahip olarak tanımlandı. Tüm kolorektal kanser hastalarında 19 patojenik variant tanımlandı. 17 tane farklı patojenik variant ve bunlardan üç tanesi ise daha önce literatürde ve veri tabanlarında gözlenmedi. Tüm patojenik varyantların %5.69'u MLH1 ve MSH2 genlerinde bulundu. Mismatch tamir genlerinden olan MLH1 (OR=19.45, p=0.0499) ve MSH2 (OR=25.11, p=0.0308) anlamlı odds oranları gösterdi. Orta dereceli penetransa sahip genlerden ATM ve CHEK2 genleri kolorektal kanserle anlamlı ilişki göstermediği bulundu. Düşük penetransa sahip genlerde patojenik varyanta saptanmamıştır. Tüm ve farklı önemi belirsiz varyantlarda ATM geninin tüm 20 genin içinde en yüksek varyant oranına sahip olduğu görüldü. Standardize edilmiş ve edilmemiş VUS sayılarının karşılaştırılması sonucunda, CHEK2 geninin birim amino asit başına en fazla VUS'a sahip olduğu bulundu.Tek nükleotid değişimlerine ve küçük insersiyon/delesyonlara ek olarak Sophia DDM yazılımı kullanılarak in silico yöntemle meme kanseri hastalarında 22, kolorektal kanseri hastalarındaysa 4 tane kopya sayısı varyantı bulunmuştur. Yine de bulunan sonuçların fonksiyonel çalışmalarla valide edilmesi gerekmektedir.Sonuç olarak bu çalışma, Türkiye'de bulunan meme ve kolorektal kanseri hastalarının incelenmesi açısından öncüdür. Elde edilen verilerle ilerleyen dönemlerde yapılacak çalışmalar Türk toplumunu daha uygun şekilde temsil edecektir. Cancer is a global burden in the twenty-first century, affects all countries regardless of income levels. According to the GLOBOCAN data, 14.1 million new cancer cases and 8.2 million cancer-related deaths occurred in 2012. In addition, increase of the cancer incidence and cancer-related deaths are expected in coming years. Breast cancer represents the second most common in the world and the most common cancer among women, accounts for 1.15 million new cases and 411,000 cancer deaths each year. Colorectal cancer is the third most commonly diagnosed malignancy and the fourth leading cause of cancer-related death in the world. The GLOBOCAN database showed that it accounted for 1.4 million new cases and approximately 700,000 deaths in 2012.The cell cycle is a process, which includes sequential phases and checkpoints in order to regulate cell growth and replication of DNA. There are some set of proteins involved in the cell division events, which are the products of tumor suppressor genes and oncogenes. Due to the abnormalities in tumor suppressor genes, defective tumor suppressor proteins malfunction to restrict cell cycle. On the other hand, activated oncogenes leads to uncontrolled cell cycle, which drives the cell cycle forward without controlling. The accumulation of mistakes during the malfunctioned cycle, the cells no longer respond to the signals that control cellular growth and death. These sequence of events cause to formation of cancer cells, which is also called carcinogenesis. Tumor suppressor genes manage fidelity of cell cycle replication process and controls. The tumor suppressor genes such as BRCA1 and BRCA2 are the major part of homologous recombination repair, which is an important mechanism using sister chromatid in order to process error-free repair of DNA double breaks. On the other hand, the mismatch repair mechanism (MMR), which consists of MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 and EPCAM, is responsible for correcting single base mismatches as well as small insertion/deletion loops of unpaired bases. Alterations in the MMR system stands in a significant place in carcinogenesis, associated with hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome, which is also known as Lynch syndrome. The MMR defects increases the risk of colorectal, gastric, endometrial and ovarian cancer, but mostly are associated with colorectal cancer. Besides, pathogenic variants in the MMR genes cause to microsatellite instability (MSI) in tumor tissues. MSI may occur in many cancer types but it is a significant marker for colorectal cancer patients with Lynch syndrome. The majority of cancer arise from pathogenic variants sustained over a lifelong but the cancer results from genetic alterations that are transmitted through generations considered as hereditary case. Approximately 5-10% of all cancer cases appear in this category.Considering that the incidence and mortality rates of colorectal and breast cancer, hereditary patients were sequenced using multigene panel testing in order to characterize clinical features and rare variants found in those patients. Apart from that, it is aimed to reveal recurrent pathogenic variants, candidate for founder pathogenic variants, by comparing the patient and control groups.Study subjects consists of 273 breast cancer patients, 123 colorectal cancer patients as well as 338 controls older than 65 years without personal cancer history. All the patients and controls were given informed consent form. The patients were grouped whether they have increased risk of breast or colorectal cancer according to NCCN guidelines for hereditary breast and hereditary colorectal cancer. For sequencing, three different commercial kits were used. Both Sophia DDM and GATK Variant Calling pipeline were used in order to call variants, and the found variants were filtered 20 cancer predisposing genes relevant with hereditary breast and ovarian cancer, HNPCC and intestinal polyposis syndrome. The 20 cancer predisposing genes are as follows: APC, ATM, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CDH1, CHEK2, EPCAM, MLH1, MSH2, MUTYH, NBN, PALB2, PMS2, PTEN, RAD51C, RAD51D, STK11 and TP53. The exonic and splice variants, which have allele frequency equal or smaller than 1% as well as no data in 1000 Genome population database were selected. Interpretation of the selected variants was done according to the ACMG guideline. During interpretation of patients, monoallelic MUTYH pathogenic variants were excluded. Positive rates for patients and controls with a pathogenic/likely pathogenic mutation(s) were as follows: 13.55% (n=37) for breast cancer group, 11.90% (n=15) for colorectal cancer group and 4.45% (n=15) for controls. Inconclusive results were found in 24.18% (n=66) for breast cancer patients, 30.95% (n=39) for colorectal cancer patients and 21.96% (n=74) for controls.The estimation of hereditary breast cancer showed that 72% (n=197) of breast cancer patients are in high risk group, whereas 28% (n=76) of the patients falls in non-high risk group. The average ages of high and non-high risk groups are 44.9 and 59.6, respectively. In all breast cancer patients (n=273), 43 (7.56%) pathogenic variants were found. 4.76% of pathogenic variants were found in BRCA1 and BRCA2. Pathogenic variants in moderate penetrance genes (ATM, CHEK2, PALB2, NBN) had the highest rate in breast cancer patients (5.10%). Case-control comparison revealed that pathogenic variants in CHEK2 have significant OR of 3.51 in breast cancer patients. Also, a recurrent pathogenic variant, NM_007194(CHEK2):c.1427C>T (p.Thr476Met), was found in both breast cancer patients (n=4) and controls (n=3). 83 VUS (n=75) were identified in breast cancer patients, and 72 of the VUS were unique. In both all and unique rare VUS, ATM (%all = 6.2, %unique = 5.1) and BRCA2 (%all = 4.4, %unique = 3.3) had higher rates than other genes in 273 breast cancer patients. To overcome with the size of gene products and their effects on variant numbers, standardization applied for both all rare and unique rare VUS numbers identified in breast cancer patients. It is found that CHEK2, MSH2, RAD51C and MSH6 had more VUS per amino acid than other genes. The same result was obtained in comparison between high risk and non-high risk patients. Since RAD51C had only one VUS, CHEK2, MSH2 and MSH6 are promising candidates for further studies associated with breast cancer.In colorectal cancer, 35% (n=43) of the patients were classified as high risk patients, whereas 65% (n=80) were non-high risk patients. In all colorectal cancer patients, 19 pathogenic variants were identified. 17 pathogenic variants were unique, and 3 of unique pathogenic variants were identified as novel. 5.69% of pathogenic variants were found in MLH1 and MSH2. Mismatch repair genes, MLH1 and MSH2 showed significant OR of 19.45 (p = 0.0499) and 25.11 (p = 0.0308), and associated with colorectal cancer. Pathogenic variants in moderate penetrance genes, ATM and CHEK2 did not show significant associations with colorectal cancer. No pathogenic variants were found in low penetrance genes. In both all and unique rare VUS, ATM (8,9%, n=11) had the highest rate among all 20 genes. Comparison of standardized and non-standardized VUS between all and unique rare VUS revealed that standardized CHEK2 had the highest number of VUS in colorectal cancer patients.In additionally, using Sophia DDM software, 22 and 4 copy number variants were identified in breast and colorectal cancer patients, respectively. Still, these variants need to be validated with functional studies.After all, this study is a pioneer to examine the hereditary breast and colorectal cancer patients in the Turkish population. With the gathered data, the future cancer studies will represent the Turkish population more precisely. 105

Proteinler, canlılar için yaşamsal açıdan önemli makromoleküllerdir.Sentezlendikten sonra fonksiyonel özelliklerini kazanmaları içinse doğru şekildekatlanmaları şarttır. Peptid zinciri sentezlenirken, üç boyutlu yapısını kazanmasısürecinde görülen ilk etkileşimler hidrofobik etkileşimlerdir. Sonrasında ise iyoniketkileşimler,van der Waals etkileşimleri, dipol-dipol etkileşimleri, hidrojen bağları ilebirlikte peptit zincirleri fonksiyonel hale geldiği üç boyutlu yapısına ulaşır. Bazıküçük proteinler bu şekilde tek başına katlanabilirken, pek çok protein katlanabilmekiçin şaperonlara ihtiyaç duyar. Proteinlerin düzgün katlanamaması ise, Alzheimer,Parkinson gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıklara sebebiyet verebilir.Şaperonlar ilk kez 1978 yılında Ron Laskey tarafından bulundu. 1987 yılında R.John Ellis tarafından yapılan çalışmalarla birlikte, bu konudaki araştırmalar hızkazandı. Eksikliklerinde nörodejeneratif hastalıkların oluştuğunun keşfedilmesi ileberaber, şaperonlar ile ilgili çalışmalar oldukça sık gündeme gelmeye başlamıştır.Şaperonlar, normal şartlarda hücrede normal seviyelerde sentezlenir. Stres koşullarıise bu durumu değiştirebilir. Şaperonlar hücrenin aşırı ısı ve pH değişimindenolumsuz etkilenmemesini sağlamanın yanında oksidatif stres ve kimyasal stres gibidurumlara karşı da hücreyi korur. Bu gibi streslere karşı hücrenin bir savunmastratejisi olarak, şaperonların ekspresyonları artar ve tehdit altında olan hücre içiyaşamsal öneme sahip enzimlerin ve diğer proteinlerin yapısının bozularakfonksiyonel olarak zarar görmeleri engellenir.Hsp70, şaperon ailesinin en bilinen ve en yaygın üyesidir. Şaperonlar evrimselsüreçte korunmuş moleküler şaperonlar arasında yer almaktadır. Bakteri, arkea veökaryotlarda olmak üzere neredeyse tüm hücrelerde bulunurlar ve hayati açıdanönemli rollere sahiptirler. Örneğin, yeni eksprese edilmiş peptit zincirlerininkatlanması, agregat oluşumunun önlenmesi ya da proteinlerin belirli organelleretranslokasyonu Hsp70 tarafından gerçekleştirilir. Hsp70, katlanacak proteininhidrofobik bölgelerine bağlanarak bu bölgelerin birbirleriyle doğru olmayan şekildeetkileşmesini önler, bu sayede proteinin yanlış katlanmasını engeller. Bu sebeptenötürü, Hsp70'in proteinlerin katlanmasında katalizör görevi görmediği, katlanmasıgereken proteinler için uygun ortam oluşturduğu düşünülmektedir.Çalışmamızda kullanılan E.coli Hsp70 homoloğu olan DnaK iki domendenoluşmaktadır. Bunlardan biri amino (N) ucunda bulunan nükleotit bağlayan veATPaz aktivitesi olan 44 kDa'lık Nükleotit Bağlanan Domen (NBD), diğeri isekarboksil (C) ucunda bulunan ve substrat bağlayan 25 kDa'lık Subsrat BağlananDomen (SBD)'dir. Bu iki domen ise oldukça korunmuş, domenler arasında bulunanhidrofobik bir bağlaç ile bağlanır. NBD ve SBD arasında allosterik bir etkileşimmevcuttur. Bu iki domen arasındaki iletişim ise domenler arasındaki bağlaçtarafından sağlanmaktadır. Her iki domende de gerçekleşen konformasyoneldeğişiklikler sonucunda, ATP bağlanması ve hidrolizi substrat affinitesinidüzenlerken, ATP hidrolizi ise substrat bağlanması ile tetiklenmektedir. Yapılankristalografi ve NMR çalışmaları sonucunda elde edilen yapılarda, ADP bağlı halde,bu iki domen ve bağlaç birbirinden ayrı şekilde gözlemlenmektedir. Bu durumdaSBD'nin substrata olan afinitesi yüksektir ve dolayısıyla SBD, katlanacak proteinüzerine kapanmış durumdadır. NBD'ye ATP bağlandığında ise, SBD açık birkonformasyonda ve bağlacı NBD'nin içlerine alacak şekilde NBD ileetkileşmektedir. Bu konformasyonda SBD'nin substrata afinitesi düşüktür vekatlanmış proteinin salınması ATP bağlı halde gerçekleştirilir. Sonrasında, SBD'yebağlanan katlanması gerekli yeni bir protein, NBD'ye bağlı halde bululanan ATP'ninhidrolizini tetikler. ATP'nin ADP'ye hidrolizi sırasında SBD katlanması gerekenproteinin üzerine kapanır, NBD ve SBD birbirinden tekrar ayrılır ve mekanizma budöngü ile devam eder. Bu döngüye koşaperonlar eşlik eder. Hsp40 ailesi ve nükleotitdeğişim ailesi bu döngüde görevli koşaperonlar olarak bilinir. Hsp40 ailesi (DnaKiçin DnaJ), ATP hidrolizini hızlandırmakla görevliyken, nükleotit değişim faktörleri(DnaK için GrpE) ise hidroliz ile oluşan nükleotiti değiştirmek ve Hsp70'yi yenidöngüye hazırlama görevindedir. Mayer ve Bukau'nun 2015 yılında yaptığı sonçalışmalar, ATP ile indüklenen substrat salınımının, substratın bağlanmasıylauyarılan ATP hidrolizine göre şaperonun aktivitesinde daha önemli bir rol oynadığınıortaya koymaktadır.2007 yılında, Swain grubu tarafından yapılan çalışmalarla, domenler arası bağlacınhidrofobik 389VLLL392 sekansının NBD ve SBD arasındaki allosterik ilişkidensorumlu olduğu bulunmuştur. Yine bu çalışmaya göre, bağlaç varlığında DnaK (1-392), substrat tarafından uyarılmış yabanıl tip DnaK gibi davranmaktadır. Yabanıltip, substrat ile uyarılmamış DnaK'nin aksine, DnaK (1-392)'nin pH bağımlı ve dahayüksek ATPase aktivitesi vardır. Diğer bir taraftan ise, bağlaç yokluğunda DnaK (1-388), substrat tarafından uyarılmamış yabanıl tip DnaK'yi taklit etmektedir.Moleküler dinamik simulasyonları, 1950 yıllarının ikinci yarısına doğru ortayaçıkmıştır. 1960'larda daha da gelişmiş ve ilk kez 1977 yılında bovin pankreatiktripsin inibitörü ile birlikte proteinler üzerinde kullanılmaya başlanmıştır. In vivo vein vitro olarak gözlemlemekte güç olabilecek bazı konularda fikir vermek içinkullanılan önemli yollardan biri haline gelmiştir. Biyokimya ve biyofizikte oldukçageniş bir uygulama alanı bulmuştur.Bu çalışma DnaK (1-392) ve (1-388) kesik yapılarında, ATP bağlı durumdakonformasyonel ve dinamiksel farklılıkları göstermeyi amaçlamanın yanısıra 226.konumdaki histidinin alanine mutasyonu halinde genel konformasyon ise de nasıl birdeğişim olduğunu moleküler dinamik analizleriyle göstermeyi amaçlamaktadır.Kesik yapılar 4JN4 kodlu PDB (protein data bank) dosyasından modifiye edilip,NAMD/CHARMM-GUİ kullanılarak 200 ns boyunca yürütülmüştür. Bu süreçteortalama karekökten sapma (RMSD) ve ortalama karekök değişimi (RMSF) gibitemel moleküler dinamik analizlerinin yanısıra, Başlıca Komponent Analizi (PCA),hedef amino asitler için zamana bağımlı uzaklık ölçümleri ve proteinin ne kadarkompakt olduğunu ölçmek amacıyla dönüş çapı (Rg) analizi yapılmıştır.Yapılan analizler sonucu bağlacın 389VLLL392 kısmının bulunmadığı DnaK (1-388)kesik yapısının, bağlacın bulunduğu DnaK (1-392) yapısına gore belirli bölgelerdedaha kapalı bir konformasyonda olduğu gözlemlenmiştir. Ayrıca bu iki yapıarasında farklı dinamikler olduğu da görülmektedir. Bir diğer önemli sonuç isebağlaç varlığında His226'nın bu dinamikte önemli bir rolü olduğu yönündedir. 226numaralı Histidinin alanine mutasyonu ile birlikte, konformasyonun daha daaçıldığı, bazı amino asitlerin de bulunduğu konumdan oldukça saptığı görülmüştür.Bunlardan önemli olarak gördüğümüz katalitik bölgede bulunan ve ATPhidrolizinden sonra fosfatı kabul eden amino asit olduğu düşünülen 199. konumdakiTreonin yakından incelendiğinde simulasyon sürecinin sonlarına doğru ATP'denaniden ve önemli ölçüde uzaklaştığı görülmüştür. Bu durumun doğurabileceğisonuçlar, araştırma grubumuza ait diğer deneysel verileri desteklemekle birlikteHistidinin Hsp70 genel dinamiği için ne kadar önemli olduğunu da göstermektedir.Uzun vadede, yapılan bu moleküler dinamik simulasyon çalışmalarının Hsp70çalışma mekanizmasını detaylı bir şekilde ortaya koyarak Hsp70 kaynaklınörodejenaratif hastalıkların tedavisine ışık tutabileceği düşünülmektedir. Hsp70s are evolutionarily highly conserved ATP-dependent molecular chaperoneswhich are ubiquitously expressed in the cell. They are found in three domains of lifeand have essential roles in cells, such as aiding proper folding of nascentpolypeptides, prevention of polypeptide chains from misfolding and translocation ofproteins across membranes. The diverse cellular functions of Hsp70s are based onthe recognition of hydrophobic sequences of client protein. Hsp70s corporate withother co-chaperones like nucleotide exchange factors and J-domain proteins.In our study, we used DnaK which is an Escherichia coli homolog of Hsp70. DnaKhave an N-terminal nucleotide-binding ATPase domain (NBD) and a C-terminalsubstrate-binding domain (SBD). These two domains are connected by a highlyconserved hydrophobic interdomain linker. There is an allosteric communicationbetween the domains via the hydrophobic linker. Substrate affinity is regulated byATP binding and hydrolysis, which results in conformational changes in bothdomains, while ATP hydrolysis is stimulated by substrate binding. In 2007, Swain etal. revealed that the conserved hydrophobic 389VLLL392 sequence of the interdomainlinker is responsible for the allosteric communication between NBD and SBD.According to this study, DnaK (1-392) behaves like the substrate-stimulated DnaKthat is pH-dependent, and shows higher activity than that of the unstimulated fulllengthprotein. In contrast, DnaK (1-388) mimics the activity of the substrate-freeform of the full-length DnaK. Which amino acids in the catalytic site are responsiblein allosteric communication and pH-dependent ATPase activity in the presence oflinker are not enlightened so far, however there are several research trying to find outthe key residues and reveal the detailed mechanism of DnaK.In this study, the effect of linker 389VLLL392 on the ATP-bound protein conformationand H226A mutation on ATP-bound DnaK's (1-392) construct were investigated byusing molecular dynamics simulations. MD simulation trajectories were analyzed byroot mean square deviation (RMSD) and, root mean square fluctuation (RMSF)analysis, also by distance measurement in a time-dependent manner and, principlecomponent analysis. From these analysis it was found that distance between thehelices which contain His226 and its neighbour helix is closer to each other in DnaK(1-388) constructs. Moreover, this study reveals that His226 contributes thestabilization of residue Thr199 which is suspicious as a phosphate acceptor after thehydrolysis of ATP. 82

BAG-1 (Bcl-2 ilişkili athanogen-1) bir çok organizmada evrimsel süreçte korunmuş olan BAG ailesine ait anti-apoptotik bir proteindir. Hücre içerisinde önemli mekanizmada görev alan BAG-1, çok fonksiyonlu adaptör protein olarak bilinir. HSP70/HSC70 ısı şoku proteinleri, E3 ubikuitin protein ligazlar, nükleer hormon reseptörleri, Raf-1 serin/treonin kinaz ailesi ve Bcl-2 proteini gibi çeşitli moleküllerle olan etkileşimler ile BAG-1 transkripsiyon, hormon aktivitesi, hücre büyümesi, hücre hareketliliği ve proliferasyonu, tümörigenez, apoptoz mekanizması ve hücre içindeki önemli sinyal yolaklarını düzenlemektedir. BAG-1'in hücrenin yaşamını sürdürmesini sağlamakta olduğu düşünülmektedir. Yapılan çalışmalar meme kanseri, kolon kanseri ve prostat kanseri başta olmak üzere çeşitli kanser türlerinde BAG-1'in yüksek oranda ifade edildiğini göstermektedir. Hücre içerisindeki fonksiyonları göz önünde bulundurulduğu zaman BAG-1'in özellikle meme kanserinin oluşum ve gelişim sürecinde BAG-1'in önemli rolü olduğu düşünülmektedir.BAG-1 proteini aynı mRNA üzerindeki farklı başlangıç bölgelerinden translasyon sonucu oluşan üç ana izoformdan oluşmaktadır. BAG-1'ın üç izoformu da C-ucunda BAG domaini ve ubikuitin benzer domaini bulundurmaktadır. İzoformlar arasındaki fark N-ucu bölgesinden kaynaklanmaktadır. En büyük izoform olan BAG-1L, N-ucunda nükleer lokalizasyon sinyaline sahiptir ve nükleusta bulunur. BAG-1S hücre içerisinde en baskın olarak bulunan ve sitoplazmada lokalize olmuş en küçük BAG-1 izoformudur. BAG-1M ise ekspresyon seviyesi BAG-1L ve BAG-1S'ye kıyasla daha az olan ve nükleer lokalizasyon sinyali bulunmamasına karşın çeşitli aracı proteinler ile hem sitoplazma hem de nükleusta lokalize olabilen BAG-1 izoformudur. İzoformların bulundukları doku ve hücreye göre özelleşebildiği bilinmekte ancak izoform spesifik çalışmalar ile her bir BAG-1 izoformun etkileştiği proteinler ve görev aldığı mekanizmalar ile ilgili detaylı bilgi bulunmamaktadır.BAG-1M'nin hem sitoplazma hem de çekirdekte bulunabilmesi, bu izoformun hem DNA hem de sitoplazmik proteinler ile etkileşerek kanser sürecinde görev alabileceğini düşündürmüştür. Bu çalışmada BAG-1M izoformunun öncelikle BAG-1'in bilinen etkileşim partnerleri ile olan etkileşiminin incelenmesi ve hücre sağkalımı üzerindeki etkisinin gösterilmesi, sonrasında ise etkileşim partnerlerinin meme kanseri ve meme epitel hücrelerinde tespit edilmesi amaçlanmıştır. Yapılan bu çalışmanın BAG-1M'nin kanserli ve meme epitel hücrelerindeki farklı etkileşimleri göstererek bu izoformun meme kanseri oluşum ve gelişim sürecindeki rolünün aydınlatılmasına katkıda bulunması hedeflenmiştir.BAG-1M'nin etkileşim partnerlerinin tespit edilebilmesi için öncelikle N-ucu TAP etiketi içeren BAG-1M dizisini içeren vektör plazmid hücrelere transfekte edilmiş, ardından TAP etiketi pürifikasyonu ile transfekte edilen hücrelerden elde edilen total protein içerisinden BAG-1M saflaştırılmıştır.xxivBAG-1M'nin hücre sağkalımındaki etkisi transfekte edilmemiş hücrelerle karşılaştırmalı olarak gösterilmiş, BAG-1M izoformunun yüksek ifadesinin hücre proliferasyonunu ve hücrelerin koloni oluşturma yatkınlığını arttırdığı hücre canlılığı testleri ile gösterilmiştir.BAG-1'in bilinen etkileşim partnerleri olan HSP-70, Bcl-2, Raf-1, Akt, Raf-1 ve Akt'ın sırasi ile 338. ve 473'üncü serinlerinden fosforillenmiş formları ile BAG-1M etkileşiminin olduğu saflaştırılan BAG-1M örneklerinde immün blotlama ile gösterilmiştir.Bilinen etkileşim partnerleri dışındaki etkileşen proteinlerin tespit edilmesi amacıyla saflaştırılan BAG-1M proteini tripsin ile peptitlerine parçalanmış ve peptit haritalama yöntemi için sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile analiz edilmiştir. Tespit edilen peptitler PLGS (Protein Lynx Global Server) kullanılarak UNIPROT veritabanı ile eşleştirilerek kimliklendirilmiş, iki biyolojik tekrarın ikişer teknik tekrarı yapılarak ortak bulunan proteinler BAG-1M etkileşim partnerleri olarak kabul edilmiştir.Sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi analizleri sonucunda tespit edilen BAG-1M etkileşim partnerlerinin hücre içerisinde dahil oldukları mekanizmalar ve protein-protein etkişim ağları sırası ile KEGG ve STRING internet ağ sunucuları kullanılarak analiz edilmiş, proteinler GO Enrichment analizi kullanılarak moleküler fonksiyonlarına göre karbon metabolizması, hücre iskeleti organizasyonu, stres yanıtı ve endoplazmik retikulumdaki protein işlenmesi olmak üzere dört kategori altında incelenmiştir. BAG-1'in endoplazmik retikulum ilişkili degradasyonda görev alabileceğinin düşünülmesinden dolayı bu çalışmada endoplazmik retikulumda protein işlenmesi kategorisine odaklanılmış, etkileşimlerin kanserli ve epitel meme hücreleri arasındaki farkları incelenmiştir.LC-MS/MS analizleri sonucunda kimliklendirilen proteinlerin doğrulanması amacı ile iki boyutlu jel elektroforezi (2-DE) yöntemi kullanılarak proteinler izoelektrik noktaları ve moleküler ağırlıklarına göre ayrılmış, jelden kesilen protein spotları MALDI-TOF analizleri ile kimliklendirilmiştir. Kütle spektrometresi ve iki boyutlu jel elektroforezi sonuçlarında ortak gelen proteinlerin BAG-1M izoformu ile etkileşimi meme kanseri ve meme epitel hücrelerinden saflaştırılan örneklerin immün blotlama analizleri ile de doğrulanmıştır.BAG-1M izoformunun etkileştiği proteinlerle oluşturduğu komplekslerin görev aldığı hücresel mekanizmaları aydınlatması amacıyla doğal formları korunarak transfekte edilen hücrelerden izole edilen ve saflaştırılan proteinlerin oluşturduğu kompleksler mavi poliakrilamid jel elektroforezi ile moleküler ağırlıklarına göre ayrılmıştır. Her bir kompleksin jelden kesilmesi, peptitlerine parçalanması ve LC-MS/MS peptit haritalaması ile kompleksteki proteinler tespit edilmiştir. Komplekslerin incelenmesi ile tespit edilen proteinlerin proteazom alt birimlerini, ubikuitinasyonda görev alan proteinleri, endoplazmik retikulumda yerleşik olan proteinleri içerdiği görülmüş, bu proteinlerin aynı komplekslerde bulunması da BAG-1M'nin endoplazmik retikulum ilişkili degradasyonda görev alabileceği düşüncesini desteklemiştir.Bu çalışmada yapılmış olan tüm deneysel çalışmalarda elde edilen sonuçlar, ısı şok proteini 90 (HSP-90), ısı şoku proteini 70 ailesi üyesi BiP (HSPA5), protein disülfid izomeraz A3 (PDIA3), geçişli endoplazmik retikulum ATPaz (VCP) ve UV eksizyon tamir proteini RAD23 homoloğu (RAD23B) gibi katlanma/yeniden katlanma mekanizmasında görevli ve ubikuitin ile ilişkili proteazomal bozunmada işlevi olan proteinlerle BAG-1M izoformunun etkileştiğini göstermiştir. Meme kanseri ve memexxvepitel hücrelerinde BAG-1M ile VCP ve BAG-1M ile RAD23B etkileşimlerinin farklılık gösterdiği immün blotlama yöntemi ile gösterilmiştir. BAG-1M izoformunun VCP ve RAD23B ile kurduğu etkileşimin sadece meme kanseri hücrelerinde görülmesi bu etkileşimlerin kanser sürecinde önemli rolü olabileceğini düşündümüştür.Yeni tespit edilen etkileşim partnerlerinin PDB veritabanında bulunan yapıları BAG-1'in BAG domaini ve ubikitin benzeri domaini ile PRIŞM web sunucusu kullanılarak incelenmiş, kurulabilecek olası kompleksler yapıları ve iki protein arasındaki enerji seviyesine göre değerlendirilmiştir. Yapısal analizler, RAD23B, VCP ve PDIA3'ün BAG-1 ile etkileşime geçebileceklerini, ancak HSP-90 ve BiP ile BAG-1 etkileşiminin BAG-1'in her iki domaininden de pek olası bulunmadığını göstermiştir.Mavi-nativ jel elektroforezi ile kimliklendirilen kompleksler incelendiğinde, HSP-70 ile HSP-90 ve BiP'in bilinen etkileşimleri, BAG-1 ile HSP70 etkileşiminin biliniyor olması ve yapısal analizlerde BAG-1M ile HSP-90 ve BAG-1M ile BiP'in etkileşiminin olası bulunmaması, bu iki protein ile BAG-1M'nin birlikteliğine HSP-70 veya başka aracı proteinlerin sebebiyet verebileceğini düşündürmüştür.Bu çalışma ile BAG-1M izoformunun doğrudan (fiziksel) veya dolaylı (fonksiyonel) olarak etkileştiği proteinler kimliklendirilmiştir. BAG-1'in rol aldığı mekanizmalar, bilinen etkileşim partnerleri ve yeni tanımlanan etkileşen proteinler göz önünde bulundurulduğunda, endoplazmik retikulumdaki yerleşik proteinlerle, ubikuitinasyon mekanizmasında görev alan proteinlerle, proteazom alt üniteleri ve şaperonlarla olan etkileşimleri BAG-1M izoformunun endoplazmik retikulum ilişkili degradasyon (ERAD) mekanizmasında fonksiyonu olabileceğini önerisini desteklemektedir.Elde edilen deneysel bulgular ve gerçekleştirilen yapısal analizler ışığında gelecekte yapılacak olan bölgesel yönlendirilmiş mutasyonlar ile tespit edilen protein etkileşimlerinin bozulmasının hücre üzerindeki etkilerinin incelenmesi, degradasyon mekanizmasında hedef alınan substratların fonksiyonel analizler ile tespit edilmesi ve in vitro yüzey analizi çalışmaları ile etkileşimlerin analiz edilmesi gibi daha detaylı çalışmaların meme kanserinde bir biyobelirteç olarak görülen BAG-1'in BAG-1M izoformuna özgü fonksiyonlarının aydınlatılmasına, yeni tespit edilen etkileşimlerin kristal yapı çalışmalarına ve kanser tedavisinde kullanılabilecek küçük molekül sentezlenmesi ile yeni terapötik ajanlar geliştirilmesine katkıda bulunabileceği düşünülmektedir. BAG-1 (Bcl-2 associated athanogene-1) is an anti-apoptotic protein which is a member of BAG family that has been evolutionary conserved in many organisms. BAG-1 is involved in important mechanisms within the cell, as a multifunctional and an adapter protein. BAG-1 functions on the regulation of transcription, hormone activity, cell proliferation, cell motility, tumorigenesis, apoptosis and various cellular signaling pathways via its interactions with heat shock proteins, E3 ligases, nuclear hormone receptors, Raf-1 serine/threonine kinase family, and Bcl-2. When the functions in the cell are taken into account, BAG-1 allows the cell to survive and is overexpressed in many types of cancer. It is thought that BAG-1 has an important role in the development of breast cancer in particular.There are three major isoforms of BAG-1 originated from alternative translation initiation sites on the same mRNA. Both of the three isoforms contain the BAG domain and ULD (ubiquitin like domain) at the C-terminus regions, the difference between the isoforms arise from the N-terminus sites. BAG-1L is the largest isoform, has the nuclear localization signal at the N-terminus and is found in the nucleus, the smallest isoform is the BAG-1S which is known as the most abundant isoform in cell and localized in the cytoplasm. BAG-1M can be found in both cytoplasm and nucleus with a variety of mediator proteins. It is known that BAG-1 isoforms can be specialized to the tissues and cells they are present in, but there is no detailed information in the literature on isoform-specific studies that lighten the proteins that each isoform interacts with and the mechanisms in which it is involved.In this study, it was aimed to detect the interaction partners of BAG-1M isoform in breast cancer and breast epithelial cells.In order to detect the interaction partners of BAG-1M, the vector plasmid that contains the N-terminus TAP-Tagged sequence of BAG-1M was used transfect cells and then BAG-1M was purified from the total protein isolated from the cells transfected. Proteins interacting with BAG-1M were first identified via LC-MS/MS (liquid chromatography-mass spectrometry) analyses for peptide mapping of the digested purified proteins. For verification of identified proteins, 2-DE performed on purified BAG-1M samples and spots of 2-dimensional gel were analyed on MALDI-TOF. For further confirmation, immunoblotting assays were applied on purified samples to check the existance of identified proteins.Pathway analysis and protein-protein interaction networks of the detected proteins were analyzed using KEGG and STRING web servers. For the classification of the identified proteins, GO Enrichment assays were used.In order to illuminate the cellular mechanisms of the complexes formed by BAG-1M and its interacting proteins, native forms of proteins were purified and complexes werexxiiseparated according to their size by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Each complex was cut from the gel, digested to peptides and analyzed on LC-MS/MS for peptide mapping to detect containing proteins.The results obtained in all experimental studies showed that the interacting proteins of BAG-1M as heat shock protein 90 (HSP-90) , heat shock protein family member BiP (HSPA5), protein disulfide isomerase family member A3 (PDIA3), transitional endoplasmic reticulum ATPase (VCP) and UV excision repair protein RAD23 homolog B (RAD23B) which function in folding/refoldig of proteins and the ubiquitin-related proteasomal degradation.Considering of the mechanisms that BAG-1 is involved, known partners and newly identified interacting proteins suggested that interacting with the proteins localized in endoplasmic reticulum, proteins functions in ubiquitination mechanism, proteasome subunits, and chaperons may be related to role of BAG-1M in endoplasmic reticulum associated degradation (ERAD).Prediction of interaction surfaces of the identified proteins with the BAG domain and ubiquitin-like domain of BAG-1 were performed using the PRISM web server and evaluated according to the energy level between two proteins. Structural analyses showed that RAD23B, VCP and PDIA3 are capable to interact with BAG-1, while HSP-90 and HSPA5 interactions were not found as have possible physical interactions.This study identified proteins that interacting with BAG-1M isoform in direct or indirect manner. More detailed studies that will be performed in the light of the experimental findings and structural analyses can contribute to the elucidation of isoform-specific functions of BAG-1, which is seen as a biomarker in breast cancer, and to the development of new therapeutic agents. 99

Meme kanseri dünya çapında önemli bir sağlık sorunudur. Gelişmiş ülkelerde bile halen kanserden ölümlere neden olan en önemli kanser tiplerinden birisidir. Meme kanserinin özellikle kadınlarda görülme sıklığının artması ve tedaviye yönelik yeni yaklaşımlara olan ihtiyaç artmakta ve bu alandaki araştırmalar hız kazanmaktadır. Meme kanseri alt tipleri anatomik gruplandırmanın yanında moleküler profillerine göre de sınıflandırılmaktadır. Kanser hücreleri normal hücrelerden farklı olarak hücre membranlarında, sitozollerinde ve çekirdeklerinde farklı oranlarda reseptörler bulundururlar. Sinyal yolaklarında görevli hormon ve benzeri moleküller bu reseptörlere bağlanarak hücrede değişimlere sebep olur. Meme kanseri hücreleri de bulundurdukları üç önemli reseptöre göre moleküler olarak sınıflandırılabilir. Bu reseptörler: östrojen reseptörü (ER), progesteron reseptörü (PR) ve HER2 (human epidermal growth factor receptor 2)'dur. Bu reseptörlerin pozitifliği hücre içindeki yüksek düzeyde ifadelerini göstermekte ve histopatolojik olarak belirlenebilmektedir. Bu reseptörlere göre sınıflandırılan alt tipler hastalığın tanısında ve tedavisinde önemli rol oynamaktadır. Ayrıca, halihazırda bu hedeflere yönelik kullanılan ilaçlar, özellikle üçlü negatiflik (triple-negative) gösteren hastalarda, ilacın etki mekanizmasına bağlı olarak direnç geliştirebilmekte ve hastalıktan kurtulma oranını düşürmektedir. Bu yüzden, hücre sağ kalımı ve tümörün ilerlemesi ile alakalı yolakların ve dolayısıyla yeni ilaç hedeflrinin aydınlatılması gerekmektedir. Bu amaçla bir çok çalışma yeni bir hedef olarak Bag-1 ve ilgili hücre sağ kalımı yolaklarına odaklanmaktadır. Bag (Bcl-2 asosiye athano gen) protein ailesi birçok organizma arasında evrimsel olarak süregelmiştir. Bu ailenin üyeleri hücrede gerçekleşen süreçleri pozitif veya negatif yönde kontrol ederek veya normal ve stres koşulları altında diğer proteinlerle kompleksler oluşturarak homestazinin korunmasını sağlar. Bag-1 ise bu ailenin çok fonksiyonlu anti-apoptotik olma özelliğine sahip en önemli üyesidir. Bu proteinin, tek mRNA'dan alternatif translasyonla üretilen değişik izoformları vardır. Bu izoformlar, belirli hedef molekülleriyle etkileşerek karsinogenez, farklılaşma, motilite, çoğalma, hücre sağ kalımı, apoptoz ve transkripsiyon gibi hücredeki birçok süreci regüle ederek kritik rol oynarlar. Bag-1 izoformlarından S formu sitozolde, L formu nükleer lokalizasyon sinyali sayesinde nükleusta, M ise her ikisinde bulunma özelliğine sahiptir. Bulundukları yerlerde, sinyal yolaklarındaki kinazlar: Raf, Akt ve benzeri proteinler başta olmak üzere nükleer hormon reseptörleri ile de etkileşimleri bilinmektedir. xxiv Bag-1'ın C-Raf veya Bcl-2 ile etkileşimi hücrenin kaderini belirleyen ana mekanizmalardandır. Bag-1 proteininin, kanser gelişimini C-Raf fosforilasyonu ile aktive eden MAP kinaz yolağının önemli bir üyesi olan Raf-1 (C-Raf) ile etkileştiği çalışmalarla gösterilmştir. Raf ailesinin diğer bir üyesi B-Raf ile de etkileştiği ve özellikle stres koşulları altında C-Raf/B-Raf ile dönüşümlü ve birlikte etkileşerek hücre sağ kalımı yolağında önemli rol oynadığı bilinmektedir. Ayrıca, Bag-1S izoformunun sitozolde lokalize olduğu ve hücrede anti-apoptotik bir etkiye sahip olduğu da kanıtlanmıştır. Bundan başka, Akt yolağı da hücre sağ kalımı mekanizmalarında PI3K yolağında önemli aktör olarak kendini göstermektedir. Akt hücre içerisinde bir çok sinyal molekülü tarafından aktive edilse de özellikle yapısal olarak aktif olan HER2 reseptörü Akt'ın aşırı aktivasyonuna neden olmaktadır. Fosforillenmiş Akt proteininin aşırı aktiflenmesiyle, Bad'ın Serine 136 konumundan fosforilasyonu aşırı tetiklenmekte ve fosforillenmiş Bad'ın Bcl-XL etkileşiminin bozulması sonucu apoptotik yolak inhibe olmaktadır. Laboratuvarımızda daha önce MCF-7 (tümörijenik), MDA-MB-231 (tümörijenik) ve MCF-10A (tümörijenik olmayan) epitel hücre hatlarıyla yapılan hücre kültürü çalışmalarında, Bag-1'ın ve etkileşim partnerlerinin hücre sağ kalımı ve apoptotik yolaklarda önemli rol oynadığı gösterilmiştir. Bu doğrultuda, özellikle ilaç direnci gelişmesi meme kanserli hastalarda sağ kalım oranını düşürdüğünden, yeni bir hedef olarak Bag-1 belki de bu ilaca cevapsızlık mekanizmalarında önemli bir noktada yer alıyor olabilir. Bu çalışmada ise, Bag-1'ın hücre sağ kalımındaki rolünü meme kanserli hastalardan alınan taze normal ve tümörlü doku örnekleriyle karşılaştırmalı olarak araştırmak için, Bag-1 proteininin B-Raf, C-Raf, Akt etkileşim partnerleri, ekspresyon seviyeleri ve fosforilasyon durumları immün blotlama ve immünçökeltme yöntemleriyle gerçekleştirilmiştir. Bunun yanında, Bad fosforilasyonu ve 14-3-3 seviyeleri de göz önüne alınarak araştırılmıştır. Sonuç olarak, elde edilen deneysel sonuçlara göre, aynı hastadan alınan kanserli ve normal doku örnekleri karşılaştırıldığında genellikle Bag1 izoformlarında artış gözlenmiştir. Bunun dışında, hormon pozitif, üçlü-negatif, üçlüpozitif ve diğer tip dokularda B-Raf, C-Raf ve Akt ifade ve fosforilasyon seviyeleri incelenerek ER, PR ve HER2 durumlarına göre Bag-1 ile olan ilişkisi değerlendirilmiştir. Ser136 fosforilasyonu bulunan Bad, tümör örneklerinde dramatik bir şekilde artmasıyla birlikte Bag-1 ekspresyonunun yanında Akt, C-Raf ve B-Raf ifadesi ve fosforilasyonlarında önemli bir artış gözlemlenmiştir. Öte yandan, 14-3-3 seviyesi istatistiksel olarak önemli olmasa da tüm hastalar göz önüne alındığında normalden tümöre artış Bad fosforilasyonuyla korelasyon göstermektedir. Bag-1 immünçökeltme deneyleri sonucunda yapılan blotlama analizleriyle, interaksiyon partnerleri olan C-Raf, B-Raf and Akt proteinlerinin fosforile formları araştırılmış, normal ve tümör örnekleri arasındaki farklar gösterilmiştir. Sonuç olarak, tümörleşme durumunda Bag-1/Raf/Akt kompleksinin oluşabileceği meme kanseri olgularında gösterilmiştir. Ayrıca, immunohistokimya sonuçları da tümörlü dokularda özellikle sitozolde p-C-Raf ve p-B-Raf yüksek ifadesi ve lokalizasyonunu, p-Bad (Ser136)'ın ise hem sitoplazmik hem de nükleer yoğunluğunu kanıtlamaktadır. Meme kanseri olgularındaki ER, PR and HER2 reseptörlerinin aşırı ifadesine bağlı olarak, bu bulgular Bag-1'ın hücre sağ kalım ve ölüm eksenindeki rolünün altını çizmektedir. Bu doğrultuda, Bag-1'in PI3K/Akt ve MAPK yolakları arasındaki iletişimini bu yolaklardaki önemli partnerlerle etkileşerek kontrol ettiği kanısına varılmıştır. Geniş çerçevede bakıldığında, bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, meme kanserindeki hücre sağ kalım mekanizmalarının aydınlatılmasına ve yeni ilaç hedeflerine odaklanarak, yeni terapötik yaklaşımların ortaya çıkmasına katkıda bulunacaktır. Breast cancer is a significant health problem all over the world. In developed countries, it maintains one of the most prevalent causes of cancer death. Due to its high occurence rate among women, breast cancer is a popular field of interest for investigation and treatment. In addition to anatomic subtypes of breast cancer, these cells are grouped according to their molecular profiles. Cancer cells have receptors on their cell membrane and in their cytosol and nucleus which are different from normal cells. Signaling messengers, such as hormones, bind to these receptors, and lead to changes in the cell. Breast cancer cells could be classified by three important receptors including estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), and HER2 (human epidermal growth factor receptor 2). Overexpression of these receptors represents their overexpression in a cell and it can be histopathologically evaluated. Subgroups of breast cancer types affect the diagnosis and prognosis of disease. Besides, the efficiacy of currently used drugs varies between types. Especially in triple-negative patients, drug resistance is very common and consequently the survival rate is lower. Therefore, all these issues require the clarification of new drug targets and pathways in cell survival and tumor progression. In order to reveal new drug targets, researchers focus on Bag-1 related cell survival pathways. Bag (Bcl-2-associated athanogene) protein family is evolutionally maintained among most organisms. The members of this family control homeostasis in cell by regulating molecular processes in a positive and negative manner by forming complexes with other proteins under normal and stress conditions. Bag-1 is a significant member of this family which is a multi-functional anti-apoptotic protein and it has different alternatively translated isoforms from a single mRNA. These isoforms have many critical roles in the cell through interactions with target molecules to regulate carcinogenesis, differentiation, motility, proliferation, cell survival, apoptosis and transcription. Bag-1S isoform is located in cytosol, Bag-1L is found in nucleus due to its nuclear localization signal and Bag-1M is found in both locations. These isoforms interact with kinases such as Raf and Akt in signaling pathways, in addition to nuclear hormone receptors. It has been shown that Bag-1 interacts with Raf-1 (C-Raf) which is a member of MAP kinase pathway that is important in cancer. Once C-Raf is fully activated, it triggers most of the downstream proteins like Bad and 14-3-3 to promote histone phosphorylation and oncogenic transcription. Also, it is known that Bag-1S isoform localizes in cytosol and has an anti-apoptotic effect in a cell. Bag-1 interactions with C-Raf, B-Raf, Akt, Hsp70 and/or Bcl-2 are main mechanisms that determine cell fate. Akt is another vital player in cell survival mechanisms, mainly in association with PI3K pathway. It could be activated by different cell signaling molecules in a cell but especially the signal from the constitutively active HER2 receptor leads to its overactivation. It is also known that phosphorylated Akt gets activated and triggers the Bad phosphorylation at site S136, and leads to inhibition of apoptosis. In our previous studies, it has been shown that Bag-1 and its interaction partners have critical roles in cell survival and apoptosis pathways in MCF-7 (tumorigenic), triplenegative MDA-MB-231 (tumorigenic) and MCF-10A (non-tumorigenic) epithelial cell lines. Since, drug resistance reduces the possibility of survival in breast cancer patients, Bag-1 might be an important player in drug response mechanism. In this study, to investigate the role of Bag-1 in cell survival pathway in healthy and tumor tissues from patients with breast carcinoma. Relative expression levels and interactions of Bag-1 and its partners including B-Raf, C-Raf, Akt proteins have been carried out by western blotting and immunoprecipitation. In this regard, Bad phosphorylation and 14-3-3 levels have been also considered. According to comparative experiments between normal and tumor tissues from same breast cancer patient, elevation of Bag-1 isoforms was obtained. Besides, in hormone positive, triple-negative, triple-positive and other type of tissues, expression and phosphorylation of B-Raf, C-Raf and Akt were revealed. In addition, Bad phosphorylation (Ser136) is dramatically increased in tumor tissues in correlation with the high expression of Bag-1, p-Akt, p-C-Raf and p-B-Raf. On the other hand, 14-3-3 levels did not show statistically significant increase suggesting that it has ubiquitous expression in the cell. However, when the results of all patients are came into account, its elevation from normal to tumor tissues is correlated with Bad phosphorylation. In Bag-1 immunoprecipitation experiments, phosphorylated forms of interaction partners which are C-Raf, B-Raf and Akt were viewed with western blot and interaction levels between normal and tumor state were observed. Thus, it might be claimed that the Bag-1/Raf/Akt complex is formed in the breast carcinoma cases. Also, the immunochemistry results might be the evidence of especially p-C-Raf, p-B-Raf overexpression in cytoplam of tumor cells with the high phosphorylation of Bad at the same cytosolic compartements in addition to its increased nuclear localization. In terms of ER, PR and HER2 receptor overexpressions in breast cancer cases, these findings highlight the role of Bag-1 on the axis of cell survival and death in breast cancer. Especially, interconnection between PI3K/Akt and MAPK pathways might be regulated with Bag-1 and its interaction with the players of these survival pathways. In the large frame, the outputs obtained from this study would potentially lead to the elucidation of cell survival mechanisms in human breast cancer and new therapeutic approaches could be defined via focusing on new drug targets. 93

BAG (Bcl-2 ilişkili athanogen) ailesi, maya, bitki ve hayvanlarada korunmuş olan ve apoptoz, tümorigenez, sinyalleşme, hücre üremesi ve otofaji gibi hücredeki pek çok önemli mekanizmada rol oynayan, çok fonksiyonlu proteinlerden oluşur. Hsp70/Hsc70 gibi hem normal hem stres altındaki koşullarda hücre dengesinde etkili moleküler şaperonlar ile etkileşimde bulunmaları, bu protein ailesini oldukça önemli kılmaktadır.BAG-1 anti-apoptotik proteini, ısı şok proteinleri, moleküler şaperonlar, sinyal molekülleri ve diğer anti-apoptotik etkenler ile etkileşime giren, BAG ailesinin önemli bir üyesidir. BAG-1'in bilinen ana üç izoformu, BAG-1L, BAG-1M ve BAG- 1S bulundukları dokulara ve hücrelere göre özelleşmiştir. Transkripsiyon, apoptoz, hücre proliferasyonu, hormon aktivitesi ve hücre migrasyonu gibi pek çok hücresel yolakta oynadığı roller sebebiyle BAG-1, hücrenin yaşamını devam ettirmesini sağlayan önemli bir protein olarak görülmektedir. Meme kanseri başta olmak üzere bir çok kanser tipinde anlatımı düzeyine yüksek oranda rastlanılmaktadır. Bu nedenle kanser oluşum ve gelişim mekanizmalarında incelenmesi kayda değer bir proteindir.Organizma içinde homestasiyi sağlamak açısından önemli bir mekanizma olan apoptoz, dış uyaranlara bağlı olarak hücrenin programlı ölümünü sağlar ve morfolojik değişikliklere yol açar. Hücrede apoptoz mekanizması, ekstrinsik ve intrinsik yolak olmak üzere iki farklı şekilde çalışabilir. Ekstrinsik yani dış etkenlere bağlı yolakta hücre membranında bulunan Fas reseptörüne Fas ligandının bağlanmasıyla başlayan ölüm sinyali hücre içerisinde kaspaz-8'in aktivasyonu ile devam eder ve mitokondriden pro-apoptotik faktörlerin salınması gerçekleşir. İntrinsik yani içsel yolakta ise mitokondri membranının geçirgenliğine bağlı olarak mitokondriden sitokrom-c salınımı ile başlayan ve apoptozom oluşumu ile devam eden bir apoptotik mekanizma mevcuttur. Sitokrom-c salınımı hücre içerisinde mitokondri üzerinde bulunan pro-apoptotik ve anti-apoptotik proteinler arasındaki dengenin bozulması nedeniyle gerçekleşmektedir. Bu dengenin bozulmasında pek çok etken rol oynamaktadır. Öte yandan bu proteinler, Bcl-2 protein ailesi üyesi olup pro-apoptotik olarak Bax, BAK, BAD, anti-apoptotik olarak ise Bcl-2 ve Bcl-xL'dir.BAG-1, Bcl-2 ile olan etkileşiminden dolayı apoptotik yolaklardaki etkenlerden biri olarak görülmektedir. BAG-1'in major rollerinden biri pro-apoptotik faktörlerin örneğin sitokrom-c'nin mitokondriden salınımını engellemektir. Ayrıca BAG-1'in laboratuvarımızda gerçekleştirilen önceki deneyler sonucunda, Akt, c-Raf, Hsp70 ve birkaç protein ile birlikte bir kompleks oluşturarak Bad'ın fosforillenmesini sağlayarak hücre sağkalımına neden olduğu ortaya çıkarılmıştır.Öte yandan, hücrenin stres ortamına uyum sağlayarak homeostaziyi sağlamasında görev alan mekanizmalardan biri otofajidir. Otofaji kelime anlamı olarak hücrenin kendi kendini yemesi anlamına gelmekle beraber hücre farklılaşması, yaşlanma, metabolizmanın regülasyonu ve hücre ölümünde de rol almaktadır. Ayrıca yapılan son çalışmalar ile kanser ve nörodejeneratif hastalıkların oluşmasına neden olan etkenler arasında gösterilmektedir. Atg (otofaji ilişkili gen) protein ailesi ve Beclin 1 otofaji mekanizmasının başlangıcı, devam ettirilmesi ve sonlandırılmasında rol alan önemli proteinlerdir.Beclin 1, Bcl-2'nin interaksiyon partneri olarak keşfedilmiş olup tümörigenez başta olmak üzere pek çok mekanizmada görev almaktadır. Bcl-2 protein ailesine özelleşmiş olan BH3 domanine bulunduran Beclin 1, Bcl-2 dışında bir diğer aile üyesi olan Bcl-xL ile de etkileşime sahiptir. Beclin 1'in Bcl-2 veya Bcl-xL ile olan etkileşimin farklı etkenlerden dolayı bozulması sonucunda hücre apoptoz ve otofaji mekanizmaları arasında bir seçim yaparak canlılığını devam ettirmekte veya ölüm yolunu seçerek canlılığına son vermektedir.Bu çalışmada, Bcl-2 ile ilişkisi olduğu bilinen BAG-1'in Beclin 1 ve Bcl-2 arasındaki etkileşim ve bu etkileşim sonucu hücrenin apoptoz-otofaji mekanizmaları arasındaki seçimindeki rolünün anlaşılması hedeflenmiştir. Bu amaç ile BAG-1 anlatımı arttırılmış ve azaltılmış MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde öncelikli olarak BAG-1 izoformlarının varlığı immunblotlama ile gösterilmiştir. Ardından BAG-1 anlatımına bağlı olarak Beclin 1 anlatım düzeyinde herhangi bir değişiklik olup olmadığı incelenmiştir. Kayda değer bir değişiklik gözlenmemiş ve bu nedenle Beclin'in fosforilasyon düzeyindeki olası farklılığın tespiti için immunblotlama deneyi gerçekleştirilmiştir. Beclin fosforilasyonunun seviyesi BAG-1 anlatımı azaltılmış hücrelerde kontrol hücrelerine kıyasla artmış olarak gözlemlenmiştir.Ayrıca, Beclin 1 ve Bcl-2 arasındaki etkileşimde BAG-1'in bulunma olasılığı göz önünde bulundurularak öncelikli olarak immunçökeltme deneyleri yapılmıştır. Bu deneylerde Beclin 1 ile doyurulmuş IgG boncuk kullanılarak BAG-1 varlığı tespit edilmiştir. Gözlemlenen bu etkileşimin lokasyon açısından incelenebilmesi amacı ile immunsitokimya deneyi gerçekleştirilmiştir. Bu etkileşimin Bcl-2'nin köprü görevi yaparak direkt veya indirekt olduğunu gösterebilmek için PRISM programı kullanılarak olası interaksiyonlar incelenmiştir. Bu interaksiyonlar günümüzde bulunan PDB bilgileri ışığında tam olarak gösterilememiş olup proteinlerin tüm yapısal modellemeleri yapıldığı takdirde gösterilecektir.BAG-1'in Bcl-2 ile etkileşimi nedeniyle otofaji mekanizması üzerindeki herhangi bir etkisi olup olmadığını gösterebilmek amacı ile BAG-1 anlatım düzeyi arttırılmış ve azaltılmış MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde otofajik regülasyonda görev alan proteinlerin anlatım düzeyi kontrol edilmiştir. Aynı zamanda, otofaji inhibitörü 3-MA kullanılarak BAG-1'in de ilişkili olduğu proteinlerden biri olan Akt'ın anlatım düzeyi ve Bad'ın fosforilasyonuna olan etkisi MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde incelenmiştir. Laboratuvarımızda daha önceden gerçekleştirilen deneylerde, BAG-1'in de içerisinde bulunduğu Bad fosforilasyonuna neden olan kompleksteki kinazlardan hangisinin tam olarak Bad fosforilasyonunu gerçekleştirdiği bulunamamıştır. Ancak bu çalışmada kullanılan 3- MA ve GW-5074 inhibitörleri çalışmaları ile Bad fosforilasyonunun kinaz özelliği bulunan Akt proteininin gerçekleştirdiği gösterilmiştir.Bu çalışma ile, ortak interaksiyon partnerleri bulunan (Bcl-2) ve etkileşimleri bilinmeyen anti apoptotik özelliğe sahip BAG-1 ve Beclin 1 arasındaki ilişki incelenmiştir. Bu olası etkileşim, hücre sinyal yolaklarında büyük bir role sahip olan apoptoz ve otofaji mekanizmalarını etkilemekte olup hücrenin sağkalımı veya ölümü seçeceği yolda önemli bir role sahip olabilir. BAG-1 gerek Bcl-2 interaksiyonu ile sahip olduğu anti-apoptotik özelliği ile gerek Beclin 1 gerçekleştirdiği olası etkileşim sonucunda hücre sağkalımında kritik bir protein olabileceğini bu çalışma ile göstermiş olduk. BAG-1 proteini daha detaylı çalışılması gereken ve özellikle meme kanserinde yüksek bir biyomarkör değeri taşıyan bir protein olup detaylı bir şekilde çalışılması gerekmektedir. BAG (Bcl-2 associated athanogene) family belongs to a group of multifunctional proteins conserved in yeasts, plants and animals and has significant roles in crucial metabolic pathways such as apoptosis, tumourigenesis, signaling, cell proliferation, and autophagy.BAG-1 is a member of BAG family proteins and known as an anti-apoptotic protein. BAG-1 has three major isoforms including BAG-1L, BAG-1M ve BAG-1S that are translated owing to the use of alternative translation start sites. BAG-1 localizes in different parts of cells and interacts with several molecular targets. Thereby, BAG-1 modulates important regulatory pathways including transcription, apoptosis, cell proliferation, hormone action, cell migration with its interaction partners.Apoptosis, which is an important mechanism for maintaining homeostasis, induces morphological changes and programmed cell death due to external stimuli. Apoptosis takes place through two major mechanisms, which are extrinsic and intrinsic pathways. Extrinsic pathway is activated by binding of Fas ligand to Fas receptor on the cell membrane, followed by activation of caspase-8 and release of pro-apoptotic factors from the mitochondria. Intrinsic pathway is activated by release of cytochrome-c from mitochondria due to membrane permeability, followed by apoptosome formation. Cytochrome-c release occurs due to the imbalance between pro-apoptotic and anti-apoptotic proteins on the mitochondria. There are many factors influencing this imbalance. These proteins include pro-apoptotic Bcl-2 members Bax, BAK, BAD, and anti-apoptotic Bcl-2 and Bcl-xL.BAG-1 is accepted as a factor in apoptotic pathways due to its interaction with Bcl-2. One of the major roles of BAG-1 is to prevent the release of pro-apoptotic factors such as cytochrome-c from the mitochondria. Furthermore, by forming a complex consisting of Akt, c-Raf, Hsp70 and several proteins leads to Bad phosphorylation and induces cell survival.In addition, autophagy is one of the mechanisms for adaptating to stress conditions and maintaining homeostasis. Autophagy means `self-eating`, and has roles in cell differentiation, aging, regulation of metabolism, and cell death. Moreover, it has been shown to involved in development of cancer and neurodegenerative diseases. Atg family proteins and Beclin 1 are important proteins involved in autophagy mechanism.Beclin 1, which is discovered as Bcl-2 partner, has roles in many mechanisms, especially in tumourigenesis. Beclin 1 has BH3 domain, which is specific to Bcl-2 protein family, and interacts also with Bcl-xL. Cells make a decision between apoptosis and autophagy due to disrupted interaction between Beclin 1 and Bcl-2 or Bcl-xL.The aim of this study is to investigate the interaction of BAG-1, with Beclin 1 and Bcl-2, and its role on balance between apoptosis and autophagy. To this end, in BAG-1 overexpressed and silenced breast cancer cells, BAG-1 isoforms were investigated. Then, Beclin 1 expression and phosphorylation levels were checked upon altered BAG-1 expression. Beclin 1 phosphorylation levels were decreased in Bag-1 silenced MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells.Besides, to understand whether BAG-1 and Bcl-2 interact, immunoprecipitation assays were carried out by using IgG beads. BAG-1 isoforms and Beclin 1 were observed together. Besides, probable interaction of BAG-1 and Beclin 1 was predicted via PRISM server. The BH3 domain of Beclin 1 and BAG domain of BAG-1 interacted.To figure out the possible role of BAG-1 in autophagic regulation, Atg proteins expression levels were examined by immunoblotting. Also, breast cancer cells treated with autophagy inhibitor 3-MA and c-Raf inihibitor GW-5074 then, Akt and Bad expression and phosphorylation levels were analyzed. C-Raf inhibitor did not result in a change in the phosphorylation level of Bad. However, phosphorylation level of Bad was decreased under 3-MA treatment although BAG-1 overexpression. As a result, Akt might be the kinase in the complex, where BAG-1 is involved and phosphorylate Bad to induce cell survival.As a conclusion, BAG-1 might be interacting with Beclin 1. By this study, it is highlighted that BAG-1 might have a role in autophagic regulation mechanism which contents Akt pathway in cell survival. BAG-1 is a remarkable protein - as a potential biomarker especially in molecular mechanisms underlying breast cancer and further - studies are required to understand the role of BAG-1 in breast cancer. 82

Karaciğerde fibroz kronik hasara cevap olarak meydana gelen yara iyileşme sürecine bağlı gelişerek karaciğerde aşırı ekstrasellüler matriks ve hasarlı doku birikimine sebep olur. Karaciğerde oluşan bu hasarlı doku birikimi, organın kasılma hareketlerine bağlı olarak kan akışını engeller. Bu durum da, progresif karaciğer hasarına ve fibrozun son aşaması olan sirozu takiben karaciğer yetmezliği, portal hipertansiyon ve hepatoselüler karsinoma (HCC) gibi daha vahim sonuçlara yol açabilir. Fibroz, kronik karaciğer hastalıklarının (viral hepatit, alkole bağlı ya da alkolden bağımsız steatohepatit, toksik karaciğer hasarı, otoimmün hastalıklar ve bazı genetik hastalıklar) en belirgin sonucudur. Karaciğer fibrozu genellikle progresif lineer bir olay olarak değerlendirilse de klinik çalışmalar fibroz gelişiminin her zaman sabit bir hızla ve doğrusal bir patern ile meydana gelmediğini göstermektedir. Karaciğer fibrozunun etiyolojisine bakılmaksızın kimi insanlarda hızlı bir şekilde siroz gelişimi gözlenirken kimilerinde fibroz oluşumu çok yavaş gerçekleşmekte ya da hiç gerçekleşmemektedir. Bu durumu sadece çevresel koşullara bağlamak mümkün değildir. Özellikle Hepatit B enfeksiyonunda klinik sonuç (kronik aktif hepatit, inaktif hepatit, fibroz gelişimi, siroz oluşumu vb.) virüsün replikasyon durumuna ve konağın virüse verdiği immün yanıta göre değişkenlik göstermektedir. Kronik hepatit B hastalarının hangisinde hızlı bir şekilde fibroz veya siroz gelişiminin meydana geleceğinin tahmin edilmesi son derece önem teşkil etmekte olup fibroz gelişiminde rol alan hücresel yolakların iyi bir şekilde tanımlanmasını gerektirmektedir. Bu tez çalışması, Hepatit B virüsü (HBV) ile enfekte hastalarda fibroz gelişimine odaklanarak kronik hepatit B'nin nedenlerini ve sonuçlarını kapsayan, birbirleriyle bağlantılı iki bölümden oluşmaktadır. Tezin ilk bölümü HBV enfeksiyonunda karaciğer fibrozu gelişimi ile ilişkili yolakların proteomik yöntemler aracığıyla belirlenmesini içermektedir. Tezin ikinci bölümü ise konağın immün profili ve kronik hepatit B'de görülen farklı klinik sonuçlar (aktif ya da inaktif hastalık seyri, siroz, virolojik alevlenme vb.) arasındaki ilişkiyi araştırmaktadır. Tezin ilk bölümünde, HBV ile enfekte 47 hastanın (F1: n = 7, F2: n = 20, F3: n = 12, F4: n = 3, F5: n = 2, F6: n = 3) doku örneklerinin iki boyutlu diferans jel elektroforezi (2D-DIGE) yöntemi kullanılarak proteomik taraması gerçekleştirilmiştir. Bu yöntem, tek bir jelde birçok protein örneğinin analizini sağlayarak daha doğru ve hassas proteomik kantitasyon sağlamaktadır. İki boyutlu jel elektroforezi (2-DE) binlerce proteini 2 boyutta öncelikle izoelektrik noktalarına, ardından kütlelerine göre ayrıştırabilen oldukça yüksek çözünürlüğe sahip bir yöntemdir. 2D-DIGE ise bu yöntemin daha gelişmiş bir versiyonu olup tek bir jelde birden çok örneğin incelenmesine izin vermektedir. Bunu sağlayan, her bir protein örneğinin yapısal olarak aynı fakat spektral özellikleri farklı olan floroforlarla (Cy2, Cy3, Cy5) kovalentxxivmodifikasyonunun gerçekleşmesidir. Her bir jelde Cy3 ve Cy5 floroforlarıyla etiketlenmiş 2 örnek ve çalışmadaki tüm örneklerden eşit miktarda barındıran Cy2 ile etiketlenmiş bir dahili standart incelenir. Böylece hem yapılacak olan jel sayısı azaltılır, hem de dahili kontrol sayesinde jeller arası varyasyonlar azaltılarak daha doğru ve hassas proteomik kantitasyon yapılabilir. 2D-DIGE deneyleri sonucunda tespit edilen farklı fibrotik düzeylerin proteomik profili student's T-test (tek değişkenli analiz) ile analiz edilerek anlamlı bulunan protein spotları (p < 0.05) jelden kesilerek kütle spektrometresi ile bu spotların ait olduğu protein sekansları tespit edilmiş ve belirlenen proteinler immün-blotlama ile de doğrulanmıştır. Belirlenen proteinlerin fonksiyonel ilişkileri ve ekspresyon profilleri EnrichNet uygulamaları ve String veribankası kullanılarak belirlenmiştir. Doku örneklerinde, farklı fibrotik düzeylerde değişim gösteren proteinler şunlardır: keratin 5 (KRT5), aneksin A4 (ANX A4), apolipoprotein A1 (APOA1), immünoglobin kappa zinciri C bölgesi (IGKC), aldehit dehidrojenaz 2 (ALDH2), alkol dehidrojenaz 1 (ADH1A1), fenazin biyosentez-benzeri domen içeren protein (PBLD), transferrin (TRFE), glutamat dehidrojenaz 1 (DHE3), piruvat kinaz PKM (KPYM), peroksiredoksin 3 (PRDX3), gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH). EnrichNet uygulaması üzerinden yapılan Reactome ve KEGG veribankası analizleri ile String analizleri çalışmaları sonucunda platelet atılımı, glikoliz ve HDL bağımlı lipid transport yolaklarının HBV kaynaklı karaciğer fibrozunda etkili olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, literatür araştırmalarının da etkisiyle HBx proteinin bir etkileşim partneri olan hipoksiya ile tetiklenen HIF-1α proteinin glikoliz yolağındaki değişimlerden ve fibrozda görülen mitokondriyal hasardan sorumlu olabileceği kanısına varılmıştır.Tezin ikinci bölümü, konağın HBV enfeksiyonuna immün cevabının incelenmesini içermektedir. Bu amaç doğrultusunda insan lökosit antijenleri (HLA) DQB1 ile DRB1 allellerinin kronik hepatit B enfeksiyonu ile ilişkisi araştırılmış ve HLA-DQB1 allellerinin genetik olarak düşük bariyerli ilaçlarla HBV tedavisinde virolojik alevlenmeye etkisi incelenmiştir. Oral yollu antiviral ilaçlarla kronik hepatit B tedavisi oldukça uzun bir süreçtir. Bu tedavi sürecinde, özellikle de virüsün tek bir nükleotid mutasyonu ile direnç kazanabileceği düşük bariyerli ilaçlar kullanılıyorsa, antiviral direnç çok önemli bir husustur. Konak immünitesinin de bu antiviral direnç kazanma mekanizmasında önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Bahsi geçen bu ilaç direncinin ilk klinik işareti ise tıp terminolojisinde `virologic breakthrough` olarak geçen viral alevlenmedir. Konak immünitesinin çok önemli bir parçası olan İnsan lökosit antijenleri (Human Leukocyte Antigens = HLA) kompleksi, 6. kromozom üzerinde, kısa kolda (6 p23.1) 6 Megabaz (Mb) yer işgal eden bir gen grubudur. HLA gen ürünleri, bağışıklık sistemi yanıtının özgüllüğünü, organ naklinde doku uyumunu ve bazı otoimmün hastalıklara yakalanma riskini belirlerler. En çok bilinen genler HLA sınıf I ve HLA sınıf II gen kompleksleridir ve insan genomunda en polimorfik olan bölgedendirler. HLA sınıf II genlerinden sentezlenen majör MHC sınıf II molekülleri olan HLA-DP, HLA-DQ ve HLA-DR'de peptid bağlayan bölgede, hem alfa hem de beta alt ünitesinde değişkenlik gözlenir. HLA-DP alfa zinciri HLA-DPA lokusundan, HLA-DP beta zinciri HLA-DPB lokusundan, HLA-DQ alfa zinciri HLA-DQA lokusundan, HLA-DQ beta zinciri HLA-DQB lokusundan, HLA-DR alfa zinciri HLA-DRA lokusundan, HLA-DR'nin 4 farklı beta zinciri HLA-DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 lokuslarından kodlanır. HLA sınıf I moleküllerleri tümör immünolojisinde, hücre-içi patojenlere karşı yanıtta rol alırken HLA sınıf II molekülleri çoğunlukla antijen sunan hücreler tarafından eksprese edilirler ve antijen sunan hücrelerin, hücre dışına saçılmış peptitleri fagosite ederek ya da dendritik hücrelerde olduğu gibi, stres altındaki hücrelerin prezente ettiği hücre içi peptitleri CD+ T lenfositlere sunarak,xxvkazanılmış bağışıklık yanıtının başlamasına sebep olurlar. Bu bölümde de ilk olarak HLA-DQB1 allellerinin virolojik alevlenme olaylarına etkisini incelenmiştir. Bu doğrultuda 198 kronik hepatit B hastasının HLA-DQB1 alleleri sekans-spesifik primer-polimeraz zincir reaksiyonu (SSP-PCR) yöntemi ile genotiplendirilerek DQB1 allelerinin virolojik alevlenme gösteren ve göstermeyen gruplar arası dağılımı analiz edilmiştir. Sonuç olarak, DQB1*05:03 allelinin virolojik alevlenme göstermeyen grupta daha sık görüldüğü (28.4% vs 12.4%, p = 0.006) tespit edilmiştir. Tek değişkenli analizler sonucunda da HBeAg seropozitivitesi (p < 0.001), siroz gözlenmeme durumu (p = 0.007), genç yaş (p = 0.002) ve tedavi öncesi yüksek logDNA miktarlarının (p < 0.001) virolojik alevlenme olayları ile ilişkili olduğu gözlenmiştir. Fakat çok değişkenli analizler sonucunda sadece logDNA (p < 0.001) ve DQB1*05:03 allelinin (p = 0.02) virolojik alevlenme olayları ile anlamlı ilişkisi olduğu gösterilmiştir. Son olarak da konak immün profilinin kronik hepatit B enfeksiyonun klinik sonuçlarına etkisi incelenmiştir. Bu doğrultuda, 355 kronik hepatit B hastasının HLA-DQB1 ve DRB1 alleleri SSP-PCR yöntemi ile genotiplendirilerek sirozlu hasta grubu ile kronik aktif hepatit B hasta grubu arasında allellerin dağılımı analiz edilmiştir. Çalışma sonucunda 355 hastada en sık rastlanan HLA DQB1 alleli olarak DQB1*03:01 (48.2%) ve en sık rastlanan HLA DRB1 alleli olarak HLA DRB1*13/14 (51.8%) tesptit edilmiştir. HLA-DQB1*05:01 alleli kronik aktif hepatit B hastalrında inaktif hastalara nazaran daha sık gözlenmektedir (27% vs 9.1%, p = 0.002, pc = 0.026). HLA-DRB1*07 alleli ise sirozlu hastalarda sirozsuz hastalara nazaran daha nadir gözlenmektedir (3.4% vs 16%, p = 0.002, pc = 0.022). Bunun dışında ileri yaş (p < 0.001) ve erkek cinsiyeti (p = 0.008) siroz varlığını etkileyen diğer etmenler olarak gözlenmiştir. Çok değişkenli lojistik analizler sonucunda, DRB1*07 halen sirozun negatif yönlü bir prediktörü olarak görülmektedir (p = 0.015). Biyoinformatik analizler de DRB1*07 allelindeki aminoasit değişimlerinin T-hücresi tanıma bölgesinde değişimlere yol açarak hipoimmün bir profile yol açabileceğini göstermektedir.Sonuç olarak, tezin proteomik kısmındaki çalışmalar platelet atılımı, glikoliz ve HDL-bağımlı lipid transportu yolaklarının HBV ile enfekte hastalarda fibroz gelişimi ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Ayrıca, tezin genomik bölümündeki çalışmalar da HLA alleleri düzeyinde incelenen konak immünitesinin hem oral antiviral ilaçlarla tedavi sırasında meydana gelebilecek virolojik alevlenme olaylarına etkisi olduğunu hem de hepatit B enfeksiyonu sonucundaki klinik tabloya (hastalığın gelişimi, siroz gözlenmesi vb) etki ettiğini göstermektedir. Bu sonuçlar doğrultusunda, tez çalışması bir bütün olarak platelet atılımı, glikoliz ve HDL-bağımlı lipid transportu yolaklarında meydana gelen proteomik değişimlerin ve hastaların HLA profillerinin HBV ile enfekte hastalarda siroz oluşumunda etkili olduğunu göstermektedir. Bu bağlamda yapılan tez çalışması, farklı fibroz düzeylerini doku örnekleri düzeyinde inceleyen ilk çalışma olarak bu alanda yapılacak olan diğer çalışmalara ışık tutacaktır. Bu öncü çalışma sonucunda belirlenen yolaklar, daha ileri çalışmalarla incelenerek HBV hastalarında fibrozun önlenmesi için tasarlanacak yeni tedaviler için ve de fibroz düzeylerinin invasif olmayan yöntemlerle teşhis edilebilmesi için tespit edilecek biyobelirteçler için önemli bir hedef teşkil edecektir. Liver fibrosis is a common outcome of chronic Hepatitis B virus infection, which will progress into cirrhosis, the major cause of morbidity and mortality in chronic HBV, and eventually hepatocellular carcinoma (HCC) if not treated at earlier stages. To estimate which patient with chronic hepatitis B will develop rapidly fibrosis or cirrhosis is yet a thorny issue and requires a vast recognition of cellular pathways involved in fibrosis. This thesis consists of two related chapters about causes and consequences of Chronic Hepatitis B (CHB) and especially focuses liver fibrogenesis in HBV infected patients. The first chapter of the thesis includes proteomic approaches for investigating cellular pathways associated with liver fibrosis in HBV infection. The second chapter of this thesis involves genomic approaches for investigating the association between host's immune profile and outcomes of CHB such as active or inactive disease, cirrhosis, viral breakthrough. In the first chapter of the thesis, tissue samples from 47 HBV infected patients (F1: n = 7, F2: n = 20, F3: n = 12, F4: n = 3, F5: n = 2, F6: n = 3) were enrolled for two dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) proteomic screening. Proteomic profiles were analyzed between different fibrotic stages by univariate analysis (p

BAG-1, Bcl-2 asosiye athano gen (Bag)-ailesine mensup bir proteindir. Bu aile üyelerinde başka moleküllerle etkileşimde görevli olan 'BAG domeni' ortaktır. Her üye farklı amino uçlarına sahip olduğu için proteinlerle etkileşimi ve yolaklardaki etkisi farklılık gösterir. BAG protein ailesi apoptozdan tümör oluşumuna kadar birçok farklı mekanizmada görev almaktadır. İnsanlarda BAG protein ailesi içerisinde BAG-1 (izoformlarıyla), BAG-2, BAG-3, BAG-4, BAG-5 ve BAG-6 proteinleri bulunur. BAG-1 proteini proliferasyon, sağ-kalım, transkripsiyon, apoptoz, metastaz ve motilite gibi birçok hücresel mekanizmada, Bcl-2, nüklear reseptörler, Hsp70/Hsc70, Raf-1, Rb, Proteazom, GADD34 ve HGFR gibi birçok molekül ile etkileşerek görev alır. BAG-1 geni, insanda 9. kromozomun 12. bantında yer almaktadır ve 7 ekzona sahip 3885 bazlık bir mRNA tarafından kodlar. Bu mRNA'dan alternatif translasyon mekanizması ile amino uçları farklı birden fazla BAG-1 izoformu sentezlenir. İnsanda toplam dört tane BAG-1 izoformu bulunmaktadır. BAG-1S, AUG kodonundan, daha büyük moleküler kütleye sahip olan BAG-1L ve BAG-1M proteinleri ise daha yukarıda kalan sırasıyla, CUG ve AUG kodonlarından sentezlenir. Dördüncü izoform 29 kDa ağırlığına sahiptir ve hücre içi miktarı diğer üç izoforma göre oldukça düşüktür. Bütün izoformlarda, C-ucundaki BAG domeni (BD)'ye ek olarak ubikuitin-benzeri (ULD) domeni bulunmaktadır. Yapılan çalışmalar ışığında henüz ULD domeninin fonksiyonu kesin olarak aydınlatılamamıştır; fakat evrimsel olarak korunduğu ve stres toleransında görev aldığı düşünülmektedir. BAG-1L nükleusa lokalize olmasını sağlayan nüklear lokalizasyon sinyali (NLS) taşımaktadır. BAG-1S NLS içermez ve sitoplazmada bulunur. BAG-1M nüklear lokalizasyon sinyalinin bir parçasını taşır ve bu da BAG-1M'nin sitoplazma ve nükleusda birlikte bulunmasını açıklamaktadır. BAG-1 izoformlarının hücre tiplerine göre farklı anlatım düzeyleri gösterdikleri bilinmektedir. Hücrede en fazla bulunan izoform BAG-1L'dir sonra BAG-1M ve BAG-1S en az bulunan ise minor izoformudur. Ayrıca, bazı tümörlü hücrelerde BAG-1L'nin anlatımının en yüksek olduğu bilinmektedir.BAG-1; proliferasyon, sağ-kalım, transkripsiyon, apoptoz, metastaz ve motilite gibi birçok hücresel mekanizmada rol almaktadır. Bcl-2, nüklear reseptörler, Hsp70/Hsc70, Raf-1, Rb, Proteazom, GADD34 ve HGFR gibi birçok hedef molekül ile etkileşime geçer. BAG-1 izoformları, hücre homeostazını Hsp70/Hsc70 şaperon sistemiyle etkileşerek veya bu şaperon sistemiyle etkileşmeden düzenler. BAG domeini, BAG-1'ın ısı şok proteinleri Hsp70 ve Hsc70 ile etkileşim kurmasında aracı olur. Bu etkileşim, denatüre substrat proteinlerin katlanmasına yardımcı olarak hücrenin stres koşulları ile baş edebilmesini sağlar. BAG domeninin, ısı şok proteinlerin ATPaz domenine bağlanarak, substrat proteinleri ile olan bağlanma ve ayrılma kinetiklerini kontrol ettiği ve şaperonun aktivitesini artırdığı düşünülmektedir. BAG domeninin etkileşim halinde olduğu moleküllerden biri de serin/treonin protein kinaz Raf-1'dır. Bu etkileşim BAG-1'in hücre sağkalımı ve apoptoz dengesinde önemli olduğunu göstermektedir ki hücrenin normal ve stres halleri arasındaki dengesinin yönü BAG-1'e, Hsp70 ya da Raf-1'in yarışmalı bağlanmasına bağlıdır. Yapılan çalışmalar, BAG-1'in Raf-1 ile direkt etkileşime geçerek Raf-1'i aktive ettiğini ve hücreyi sağkalıma yönlendirdiğini işaret etmektedir. BAG-1'nın diğer etkileşim partneri ise Bcl-2'dir. BAG-1, Bcl-2'nin aktivitesini arttırır ve mitokondrideki Bcl-2 lokalizasyonunu destekler. Mitokondrideki bu artış, Bcl-2'nin apoptotik Bad proteini tarafından inhibisyonunu önler ve böylece, serbest Bcl-2, apoptotik Bax proteinine bağlanarak heterodimer oluşturur böylece Bax'ın mitokondriye girişini engeller ve apoptozu önler. BAG-1'nın diğer etkileşim partnerleri proteozomal degradasyon için proteinleri işaretlemede görevli CHIP ve SIAH proteinleridir.Kanserli hücrelerde BAG-1 anlatım seviyesinin arttığı bilinmektedir, BAG-1'in etkileştiği partnerler irdelendiğinde hücrenin sağkalıma yönlendirilmesinde BAG-1'in önemli bir role sahip olduğu düşünülmektedir. Kanserli hücrelerde BAG-1 anlatımı ve klinik önemi ile ilgili birçok çalışma bulunmaktadır ve bu çalışmalar özellikle meme kanseri üzerine yoğunlaşmıştır. Bilindiği gibi meme kanseri dünya çapında kadınlarda en sık görülen kanser çeşitidir. Bu nedenle meme kanserinde, erken teşhis ve yeni biyomarkırların keşfi hala önemini korumaktadır. BAG-1 proteinin meme kanserinde anlatımının arttığı ve hastaların sağkalım oranında etkisinin olduğu çeşitli çalışmalar ile gösterilmiştir ancak BAG-1'in hangi moleküler yolaklarda yer aldığı tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu noktada, BAG-1'in hangi yolaklarda ve nasıl görev aldığı merak konusudur ve aydınlatılması önem teşkil etmektedir.Bu çalışmanın amacı, BAG-1 ekspresyonundan etkilenen proteinleri ve kanser yol izlerini keşfetmektir. Bu doğrultuda MCF-7 hücresine ait protein ekpresyon profili, total proteinleri izoelektrik noktasına ve moleküler ağırlığına göre ayıran iki boyutlu jel elektroforez tekniğini kullanılarak analiz edilmiştir. MCF-7 hücrelerinde BAG-1 bağlantılı moleküler yolakları tespit etmek amacı ile öncelikle, MCF-7 hücreleri Bag-1 cDNA'sını içeren plasmid ile transfekte edildi sonra BAG-1'in aşırı ifade edildiği hücrelerden ve kontrol grubu olarak anılan transfekte edilmemiş hücrelerden total protein izolasyonu gerçekleştirildi ve bu örneklere immun-blotlama tekniği uygulandı. İki farklı protein örneği için 3 replika olacak şekilde iki boyutlu jel elektroforez uygulandı. İkinci adım olarak, MCF-7 meme epitel hücrelerinde, aşırı BAG-1 ekspresyonuna bağlı olarak farklı ekspres edilmiş proteinleri belirleyebilmek için, PDQuest Advanced 8.0.1 programı kullanılarak jeller analiz edildi. Analiz sonucunda, BAG-1'in aşırı ifade olduğu MCF-7 meme epitel hücrelerinde, 26 proteinin ifade farklılığı gösterdiği tespit eilmiştir. Üçüncü adım olarak, proteinlerin kesin olarak belirlenebilmesi için, jel üzerindeki spotlar kesilip kütle spektrometrisi yöntemi ile incelenmiştir. Kütle spektrometresinden gelen sonuçlar doğrultusunda ERp57 (Endoplazmik retikulum protein 57) ve ERp29 (Endoplazmik retikulum protein 29) proteinlerinin anlatımının, BAG-1'in aşırı ifade edildiği hücrelerde kontrol grubuna kıyasla kayda değer bir şekilde arttığı bulunmuştur. ERp57/PDIA3 (57 kDa) protein disülfit izomeraz (PDI) ailesine ait bir proteindir. ERp57'nin PDI ile %56 benzerlik gösterdiği ve %29 amino asitin aynı olduğu bilinmektedir. ERp57'nin sinyal peptiti olan 24 amino asit dışında 481 amino asitten oluştuğu bilinmektedir. ERp57'nin ilk olarak glikoz tükendiğinde K12 hücrelerinde aşırı ifade edildiği bilinmektedir ve bu durum başka hücre tiplerinde başka stres şartları için onaylanmıştır. Stres şartlarına bağlı olarak ERp57 anlatım seviyesindeki değişim tam olarak aydınlatılmamıştır; lakin, anlatımının, katlanmamış protein cevabına (UPR) karşılık olarak arttığı bilinmektedir.ERp29, PDI-benzeri endoplazmik retikulumda (ER) bulunan bir proteindir. Bu protein 261 amino asitten oluşmaktadır ve çoğunlukla salgılayıcı dokularda bulunmaktadır. Hücre UPR'a gittiğinde üretim seviyesi yükselmektedir ve hücre korumasında görev almaktadır. ERp29 gen promotoru ER-stres cevap elementi (CCACG) promotor bölgesinde taşımamaktadır ve bu transkripsiyonunun ER-stres ile tamamen etkileşmediğini gösterir. Bir başka çalışmaya göre, ERp29'un tümörü baskılayıcı bir fonksiyona sahip olduğu tahmin edilmektedir. ERp29 proteinin bazı primer kanser tiplerinde fazla ekspres edildiği bilinmektedir; fakat çelişkili sonuçlar nedeniyle ERp29'un tümör oluşumundaki fonksiyonu tam olarak çözülememiştir. Örneğin, invazif olmayan MCF-7 meme hücrelerinde ERp29 ekspresyonu inhibe edildiğinde tümör oluşumunun düştüğü; fakat, bir başka çalışmada tümör oluşumunu bastırdığı gözlemlenmiştir.BAG-1 aşırı ekspresyonuna bağlı olarak bu proteinlerinin seviyesinin artışı Western blot tekniği ile onaylanmıştır. BAG-1 anti-apoptotik bir protein olduğu için, farklı ekspres olmuş proteinlerin meme kanserinde gelişmiş sağ-kalım ile ilgili olabileceği kanısına varılmıştır. BAG-1 is an anti-apoptotic protein, which belongs to BAG family. These proteins serve several functions including apoptosis, cell survival, cell motility and tumorigenesis. In human, there are six BAG-family members, which are BAG1 (and its isoforms), BAG-2, BAG-3, BAG-4, BAG-5, and BAG-6. Bag-1 gene consists of 7 exons and is located on chromosome 9. There are different isoforms of BAG-1, such as BAG-1S, M, L and a minor isoform. These isoforms are produced by alternative translation from a single mRNA. While BAG-1S initiates at an internal AUG codon, the translation of the larger BAG-1L and BAG-1M proteins initiate at the upstream CUG and AUG codons, respectively.BAG-1's diverse functions include; proliferation, survival, transcription, apoptosis, metastasis, and motility, which are investigated in many cancer studies. There are several studies highlighting the expression and clinical significance of BAG-1 in cancer, and these studies mostly focus on breast cancer. As known, breast cancer is the most common type of cancer in women worldwide so improvements of early and precise detection maintain its importance. For this reason, in this study, we aim to reveal cell survival related pathways in breast tumorigenesis by using BAG-1 as an anti-apoptotic modulator in the cell. To do that, we overexpressed BAG-1 in MCF-7 breast cancer cell line and using proteomic approaches, we compared the expression profiles of BAG-1 overexpressed cells with untreated MCF-7 cells. Our results showed that the intracellular amount of two endoplasmic reticulum proteins, PDIA3 and ERp29, are upregulated in BAG-1 overexpressed MCF-7 cells. Western blot analysis was used to confirm the expression levels of these proteins upon BAG-1 overexpression. Moreover, the presence of ER stress was controlled utilizing western blot for PDI protein. We observed that PDI protein level increases when BAG-1 is upregulated in the cell. This study proposed that BAG-1 protein may be an important ER stress factor inducing cell survival. 128

BAG-1 (Bcl-2-assosiye protein) ilk olarak 1995 yılında, apoptozu önleyici BCL-2 proteininin etkileşim partnerleri araştırılırken iki ayrı çalışma grubu tarafından keşfedilmiştir. Ardından, detaylı bir şekilde araştırılmaya başlanan BAG-1 proteininin çeşitli izoformlara sahip olduğu ve BCL-2 apoptoz düzenleyicisi, HSC70/HSP70 ısı şok proteinleri, nükleer hormon reseptörleri, DNA, ubikuitinlenme/proteazom mekanizması, RAF-1 kinaz gibi birçok hücresel hedefi olduğu bulunmuştur. Etkileştiği hücresel komponentlerden de anlaşıldığı üzere BAG-1 proteini apoptoz, transkripsiyon, proliferasyon ve sinyal yolakları gibi pek çok hücresel yanıtta etki göstermektedir. BAG-1 geni tek bir mRNA molekülü üzerinde yer alan alternatif translasyon başlama bölgeleri sayesinde üç temel izoform protein kodlamaktadır: BAG-1S (36 kDa), BAG-1M (46 kDa) ve BAG-1L (50kDa). Bunların yanısıra, 29 kDa'luk minör BAG-1 izoformu da mevcuttur. BAG-1 izoformlarının sahip oldukları farklı amino uçları, hücre içi lokalizasyonlarında belirleyici özellik taşımaktadır. BAG-1L proteini taşıdığı nükleer lokalizasyon sinyal sekansı sayesinde genellikle çekirdekte yer alırken, bu sinyal sekansını taşımayan BAG-1S izoformu sitoplazmada lokalize olmaktadır. BAG-1M proteini ise nükleer sinyal sekansının bir kısmını içermekte ve hem sitoplazmada hem de çekirdekte bulunabilmektedir. Bahsi geçen alternatif varyantların farklı bölgelerde lokalize olması, bu proteinlerin işlevsel farklılıklarına bir açıklama getirebilmektedir. Örneğin, yalnızca BAG-1L izoformu nükleer hormon reseptörleri, östrojen reseptörleri ve androjen reseptörleriyle etkileşerek onların transkripsiyonel aktivitelerini arttırabilmektedir. Bu izoformlar, BAG-1'in hücresel etkilerine aracılık etmede oldukça önemli görev üstlenen `BAG` domeninin yer aldığı ortak bir karboksi ucuna sahiptir. Bahsi geçen `BAG` domeni, BAG-1 proteinin HSC70/HSP70 ısı şok proteinleriyle, RAF-1 serin-treonin protein kinaz, Bcl-2 ve hepatosit büyüme faktörü (HGF) reseptörü ile olan etkileşimlerine aracılık etmektedir. Bütün Bag-1 izoformlarının Bag domenine sahip olmalarının yanında, ortak olarak ubikuitin-benzeri domeni (ULD) içerdikleri de bilinmektedir. ULD domeninin görevi net olarak bilinmese de evrimsel olarak korunmuşluğu ve proteozom sistemi ile olan ilişkisi, bu domenin stres toleransı için gerekli olduğuna işaret etmektedir. BAG-1 ULD, BAG-1'in proteozom ile etkileşmesi için gereklidir. Yakınlarda yapılan bir çalışmada ise, BAG-1'in spesifik proteinlerin yıkımı esnasında şaperon ve proteazomun işlevlerini koordine ederek etkidiği görülmüştür. Farklı BAG-1 izoformlarının farklı anti-apoptotik fonksiyonlar göstermesi, N-terminallerinin fonksiyonları için önemli olduğunu göstermektedir. Önceki çalışmalarda gösterildiği üzere, amino ucu BAG-1'in hormon reseptörlerine, transkripsiyon faktörlerine, belli DNA promotörlerine bağlanması için önemlidir. BAG-1'in N-ucunda bir hekzapeptit tekrar bölgesi bulunmaktadır. BAG-1L ve BAG-1M'de bu tekrar bölgesinin tamamı bulunurken, BAG-1M'de yalnızca bir parçası bulunmakta; ancak BAG-1 minör izoformunda bu bölge bulunmamaktadır. Hekzapeptit tekrar bölgesinin görevi bilinmemesine rağmen, BAG-1'in anti-apoptotik fonksiyonu ile ilişkili olduğu düşünülebilir. Çünkü, tekrar bölgesinin tamamını içeren BAG-1L ve BAG-1M izoformları güçlü anti-apoptotik etkiye sahiptir. Bu bölgenin silinmesi, proteinin stabilitesini büyük oranda bozmaktadır.Çoğu malignant kanser türünde olduğu gibi, meme kanserinde de apoptotik sinyal yolakları düzensiz işlemektedir. Bu bağlamda, araştırmacılar tarafından yapılan birçok klinik çalışma, BAG-1 proteininin potansiyel prognostik veya öngörücü markör olarak üstlendiği rolü açıklamaya çalışmıştır. Bu çalışmaları desteleyen in vitro ve klinik çalışmalardan elde edilen bir bulguya göre, BAG-1 ifadesi normal meme epitel hücrelerine kıyasla meme kanseri hücrelerinde artış göstermektedir.BAG-1 proteinin çok çeşitli hücresel işlevlere sahip olduğu bilinmekle birlikte, söz konusu fonksiyonların altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında sahip olunan bilgiler oldukça azdır. Çoğu proteinin bir ya da birden fazla protein kompleksinin bir parçası olduğu göz önünde bulundurulduğunda, proteinler aracılığıyla gerçekleşen biyolojik proseslerin anlaşılmasında protein-protein etkileşimlerinin bilgisine sahip olmak çok büyük önem taşır. BAG-1'in birçok görevi yerine getirdiği bilinmesine rağmen, yalnızca birkaç etkileşim partneri bilinmektedir. Çok çeşitli biyolojik işlevleri yerine getirmesi, yukarıda da bahsedildiği üzere etkileşim partnerlerinin çeşitliliğini akla getirmektedir. Daha önceki sonuçlarımıza göre, MCF-7 hücreleri ile yapılan çalışmalarda, BAG-1 proteini aşırı ifade ettirilmiş ve RAF-MEK-ERK sinyal yolağında rol alan proteinlerin seviyeleri incelenmiştir. BAG-1 aşırı ifadesi sonucunda, B-RAF, C-RAF, ERK1/2, MEK1/2 and fosfo-MEK1/2 (Ser221) proteinlerinin ifadesinde artış gözlenmiştir. B-RAF-AKT etkileşiminin hücre çoğalmasını teşvik ettiği ve hücre ölümünü engellediği bilindiğinden, fosfo-AKT (Ser473) protein ifadesi de kontrol edilmiş ve artan BAG-1'in ifadesi ile birlikte fosfo-AKT (Ser473) protein seviyesinin de arttığı görülmüştür. Yapılan immunositokimya ve immünoçöktürme çalışmaları sonucunda, BAG-1'in B-RAF, fosfo-AKT (Ser473), BCL-2, HSP70 ve C-RAF ile birlikte bulunduğu sonucu ortaya çıkarılmıştır. Yaptığı çalışmalarla BAG-1 ve AKT arasındaki olası etkileşimi ortaya çıkaran Demir, S., BAG-1'in aşırı ifade ettirildiği MCF-7 hücrelerinde hücre ölümünü önleyen ve sağkalımı sağlayan pro-apoptotik BAD'ın Ser136 bölgesinden yabanıl tip hücrelere göre daha çok fosforile olduğunu gözlemlenmiştir. Literatürde, BAD'ın nöronal hücrelerde temel olarak AKT kinaz tarafından fosforillenmekte ve B-RAF ve C-RAF tarafından da aktive edilmekte olduğunun bilinmesinin yanında, başka bir çalışmada da BAG-1'in AKT, B-RAF, BCL-2 ve HSP70 ile bir arada bulunduğu bir kompleksin BAD'ı fosforile ederek hücre sağkalımına neden olduğu bulunmuştur. BCL-2 ailesinin pro-apoptotik üyelerinden biri olan BAD, aynı ailenin BCL-2, BCL-xL gibi sağkalım öncesi (prosurvival) elemanlarına bağlanıp onların etkilerini baskılayarak hücreyi apoptoza teşvik etmektedir. Ancak Ser136 bölgesinden fosforillenen BAD, sitozolde yer alan 14-3-3 proteinin bir hedefi olarak tanınıp kesilmekte (sequester) ve böylece BAD, mitokondri zarında yer alan BCL-2 veya BCL-xL ile etkileşememektedir. Bu çalışmalar ışığında, BAG-1'in C-RAF, B-RAF, HSP70, fosfo-AKT (Ser473) ve BCL-2 ile birlikte bulunduğu kompleksin, hücre apoptozunu önlemek için BAD'I Ser136 bölgesinden fosforillediği fikri öne sürülmüştür. Demir'in çalışmalarında, AKT kinazın BAG-1'in hücre sağkalımındaki anti-apoptotik işleyişi ile ilgili olabileceğini göstermesine dayanarak, bu tez kapsamında BAG-1, ana hücre sağkalımı yolaklarından biri olan (PI3K)/AKT/rapamisinin memeli hedefi (mTOR) yolağında araştırılmıştır. Son yıllarda tümör oluşumu sırasında değişen majör sinyal yolakları araştırılırken, bahsi geçen AKT kinazın apoptoz, proliferasyon, farklılaşma, metabolizma gibi pek çok hücresel prosesin önemli bir düzenleyicisi olduğu ortaya çıkmıştır. Bu sinyal yolağının bozulmasının çeşitli kanser tiplerinde sıkça gözlenmesi de AKT'ın tümör gelişminde önemli bir rolü olduğuna işaret etmektedir. AKT'ın C-RAF ile olan etkileşiminin MAPK yolağını aktifleştirdiği bilinmekle birlikte, MCF-7 hücrelerinde BAD fosforilasyonu sırasında oluşan komplekste, BAG-1 ile C-RAF'ın birlikte bulunduğu gösterilmiştir. Yine büyümeyi destekleyen bir yolak olan mTOR yolağının da AKT aracılığıyla aktifleştiğinin bilinmesi, bu çalışmanın da konusu olarak, BAG-1'in sağkalım öncesi etkilerinin AKT üzerinden mTOR yolağıyla sağlanıp sağlamadığı sorusunu akla getirmiş; mTORC1 yolağının rapamisin ile susturulduğu durumda, AKT ve BAG-1'in birbirini protein ifadesi derecesinde nasıl etkilediğinin anlaşılması hedeflenmiştir. PI3K-AKT-mTOR sinyal yolağının hücre içi ve hücre dışı sinyaller aracılığıyla hücre metabolizmasını, büyümeyi, proliferasyonu ve sağkalımı kontrol ettiği bilinmektedir. Bu yolağın aktivasyonunun çoğu tümör çeşidinin oluşmasına katkı sağlaması, PI3K, fosfainozitid-bağımlı kinaz 1 (PDK-1), AKT (Serin/treonin protein kinaz B), mTOR gibi bu yolakta yer alan elemanları kanser tedavisi için potansiyel hedefler olarak da sunmaktadır.Ölümsüzleştirilmiş memeli epitelyal MCF-10A hücre hattı, insan meme adenokarsinoma MCF-7 hücre hattı ve insan meme adenokarsinoma MDA-MB-231 hücre hattı bu çalışmada kullanılan hücreler olarak seçilmiştir. mTORC1 yolağı, 10 nM rapamisin ile başarıyla baskılanmıştır. Bu adımda, hücre canlılık testi için MTT analizi yapılmış, yolağın susup susmadığı fosfo-mTOR (Ser2448) ve mTORC1 yolağının altında bulunan fosfo-p70 S6K (Thr389) protein ifadelerindeki azalışla test edilmiştir. Western blot analizleri, zamana bağlı (1, 3 6, 9, 12, 24 saat) rapamisin uygulanıp total protein ekstratları kullanılarak yapılmıştır. mTORC1 yolağının susturulması, otofajiyi tetiklediğinden, belirlenen zaman aralıklarında hücrelerin otofajik aktivitesinin artıp artmadığı, Beclin-1 ve LC-3II/LC-3I otofajik belirteçlerin protein ekspresyon seviyelerindeki değişimin Western blot ile analiz edilmesiyle belirlenmiştir. LC-3II/LC-3I değişim oranı MCF-7 hücrelerinde dokuzuncu ve yirmi dördüncü saatte önemli ölçüde artarken, MDA-MB-231 hücrelerinde dokuzuncu saatte benzer artış saptanmıştır. MCF-10A hücrelerinde BAG-1 ifadesinin ilk saatte yaklaşık üç kat artış gösterdiği gözlenmiştir. MCF-7 hücrelerinde ise BAG-1 ifadesi üçüncü saatte kadar dereceli bir şekilde yaklaşık üç kat artış göstermiş, daha sonra deneyin son saatine kadar yine dereceli olarak azalarak kontrol örneğiyle benzer seviyeye ulaşmıştır. Bunun yanı sıra, MDA-MB-231 hücreleri yirmi dördüncü saate kadar dereceli olarak artış göstermiştir. MDA-MB-231 ve MCF-7 hücre hatlarındaki BAG-1 ifadesindeki zamana bağlı değişim, total C-RAF protein ifadesi ile neredeyse aynı oranda değişmiştir. Diğer yandan, total AKT protein seviyelerindeki değişim için, MCF-10A hücrelerinde birinci ve sonuncu saatlerde artış gözlenirken, MCF-7 hücrelerinde yirmi dördüncü saate kadar dereceli olarak azalma tespit edilmiştir. MDA-MB-231 hücrelerinde ise, total AKT seviyesi iki kat artış göstermiş olup, bu durum on ikinci saate kadar stabilitesini korumuştur. Bununla birlikte, fosfo-AKT (Ser473) protein ifadesindeki değişim incelendiğinde, MCF-10A hücreleride rapamisin uygulamasının ilk saatinde ani bir artış görülmüş, MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde ise dokuzuncu saatte önemli derecede artış gözlenmiştir. Bu sonuçlar göz önünde bulundurulduğunda, BAG-1, AKT ve fosfo-AKT (Ser473) protein ifadelerinin MCF-10A, MCF-7 ve MDA-MB-231 hücre hatlarında zamana bağlı rapamisin uygulaması ile farklı şekillerde değiştiği ve AKT ile BAG-1 arasındaki etkileşimin hücrelerdeki otofajik aktiviteyle de ilgili olabileceği ortaya çıkarılmıştır. Anti-apoptotic protein BAG-1 (BCL-2-associated athanogene) is usually found as overexpressed in several tumorous cancer tissues and plays crucial roles in cellular mechanisms. BAG-1 is a multifunctional protein that is involved in cell proliferation, cell motility, survival, apoptosis, transcription, differantiation and tumorigenesis through the interaction of various cellular proteins. In the nucleus, BAG-1 interacts with different kinds of nuclear hormone receptors and prevents apoptosis induced by hormones. However, in cytosol, BAG-1 is known to interact with heat shock proteins, BCL-2 (on inner cell membranes), and RAF-1 serine/threonine kinase while it also has ability to interact with cytosolic domain of growth factor receptors (like HGF, PDGF) on outer membrane, saving cells from cell death induced by growth factor receptors. There are three major isoforms of BAG-1 in human cells: BAG-1L, BAG-1M and BAG-1S. Differential expression of these isoforms when BAG-1 overexpressed can be used as stage-specific prognostic/predictive biomarker or in treatment of several malignancies. BAG-1 isoforms are found in different compartments in cell in different cellular stress conditions. In addition to this, a variety of interaction partners of BAG-1 in response to stress conditions make BAG-1 to be found in different functional complexes. Although it was demonstrated that BAG-1 prevents apoptotic activity by its direct interaction with BCL-2, the exact molecular mechanism of its anti-apoptotic function has not been fully clarified yet.In the previous studies of our group, Demir, S. studied BAG-1 in RAF-MEK-ERK signaling cascade. He found that protein expression levels of C-RAF, phospho-C-RAF (Ser388), B-RAF, ERK1/2, MEK1/2 and phospho-MEK1/2 (Ser221) that are involved in MAPK pathway were paralelly elevated with transient BAG-1 overexpression in MCF-7 cell line. Since the interaction between B-RAF and AKT was known to promote cell survival and protection against cell death, he also checked phospho-AKT (Ser473) protein expression which found to be increased with the expanded BAG-1 levels. Furthermore, when he investigated BAG-1 with co-immunoprecipitation and immunocytochemistry studies, he showed that BAG-1 was co-existed with B-RAF, phospho-AKT (Ser473), BCL-2, HSP70 and C-RAF which leads cell proliferation and survival by activating phosphorylation cascade in the beginning of MAPK pathway. When Demir indicated the possible relation between BAG-1 and AKT, he detected that pro-apoptotic protein, phospho-BAD (Ser136) level, which prevents cell death and induces cell survival, was also higher in BAG-1-overexpressed cells than that of wild type MCF-7 cells. Phosphorylation of BAD was known to be primarily provided by AKT, but also by B-RAF and C-RAF in neural cells and BAG-1 in a complex with AKT, B-RAF, BCL-2 and HSP-70 was demonstrated to cause phosphorylation of BAD at Ser136 residue and led cell survival in another study. In the light of the studies in literature and his results, it was suggested that BAG-1 was involved in the complex that is formed by C-RAF, B-RAF, HSP70, phospho-AKT and BCL-2 in order to phosphorylate BAD at Serine 136 for the prevention of apoptosis. Due to the fact that AKT was shown to be involved in the functioning of BAG-1 in cell survival, in the context of this thesis, BAG-1 protein was investigated in one of the major survival pathways, PI3K-AKT-mTOR pathway. In this study, the interplay between AKT and BAG-1 and survival effects of BAG-1 through AKT were aimed to be investigated through suppression of mTORC1 (Mammalian Target of Rapamycin Complex 1) in MCF-10A immortalized non-tumorigenic human breast epithelial cell line, MCF-7 human breast adenocarcinoma cell line, and MDA-MB-231 human adenocarcinoma cell line. mTORC1 pathway was successfully suppressed with 10 nM rapamycin, which was detected by dose-dependent MTT assays. Western blot analysis was done with total protein extracts from the cells that were treated by rapamycin in a time-dependent manner (1 hr, 3 hr, 6 hr, 9 hr, 12 hr, 24 hr). Suppression of the mTOR pathway was achieved in the first hour of rapamycin treatment and checked by the change in phospho-p70 S6K (Thr389) downstream target of the pathway and in phospho-mTOR (Ser2448) protein expression level. Since blocking of mTORC1 induces autophagy, we checked autophagic markers with the time-dependent rapamycin treatment. LC-3II/LC3-I conversion rate was significantly high within the nineth and twentyfourth hour of rapamycin treatment in MCF-7 and in the nineth hour in MDA-MB-231 cells. This result was also supported by the slightly increased Beclin-1 expression, which is an early autophagy marker. BAG-1 protein expression was upregulated almost three-fold in the first hour in MCF-10A. In addition, in MCF-7 cells BAG-1 gradually increased up to three-fold until three hours and gradually started to decrease around the level of control sample at the end of the twentyfourth hour whereas MDA-MB-231 cells showed gradually increased BAG-1 pattern until the end of the experiment. BAG-1 expression pattern of MCF-7 and MDA-MB-231 cells was similar to that of total CRAF expression pattern. On the other hand, total AKT protein expression level increased in the first and twenthfourth in MCF-10A and gradually decreased to the end of the rapamycin treatment in MCF-7 cells, whereas increased almost two-fold and stable up to twelfth hour when compared to that of control sample. However, phospho-AKT (Ser473) protein level immediately increased in the first hours of the treatment in MCF-10A cells and highly increased up to nineth hour in MCF-7 and MDA-MB-231 cells by rapamycin treatment. Together with these result, our studies suggested that BAG-1 showed different expression patterns with differential AKT and phospho-AKT (Ser473) expression levels between MCF-10A, MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines with the time-dependent rapamycin treatment. Also, the interplay between AKT and BAG-1 might be changed depending on the autophagic activity in the cells. 112

Çevresel stres faktörleri arasında kuraklık tarımda en şiddetli etkiye sahip olan faktörler arasındadır ve buna bağlı olarak kuraklık stresi altında verimi arttırmak tarımda en önemli hedeflerden biri haline gelmiştir. Kuraklık ya da su yetersizliği bitkinin hücresel metabolizmasını doğrudan etkiler. Büyüme indisinde ve böylece verimde ciddi bir azalmaya yol açar. Pek çok çalışma, kuraklık stresine cevap sürecinde hücrede karmaşık bir ağın varlığını vurgulamıştır. Protein ekspresyonundaki değişiklikler bu ağda esas rolü üstlenmektedir. Tarımsal verim artışının sağlanmasında ana strateji, kuraklık altında verimin sürdürülebilmesi için gereken özelliklerin bir araya getirilmesi ve en etkili genlerin ve dolayısıyla proteinlerin, verim potansiyeli üzerinde zararlı etkileri olmadan elit genotiplerde biriktirilmesidir. Bu yaklaşım, kurak çevrede stabil kalabilen ve yüksek verim potansiyeli sunabilen yeni bitki varyetelerinin geliştirilmesine olanak tanıyacaktır. Bitkilerde kuraklık stresine cevap mekanizmasının aydınlatılabilmesi için transkriptom düzeyinde çok sayıda araştırma gerçekleştirilmiştir. Ancak mRNA seviyesindeki değişiklikler transkripsiyon ve translasyon sonrası modifikasyonlara bağlı olarak, her zaman protein seviyesiyle korelasyon göstermemektedir. Bu nedenle transkriptom çalışmaları, stres cevabına ilişkin ağın anlaşılmasında yetersiz kalmaktadır. Dolayısıyla kuraklık stresine ilişkin mekanizmaların aydınlatılabilmesi için proteom düzeyinde bilgiye ihtiyaç vardır.Akdeniz ve Ortadoğu bölgesi yerel bitkisi olan Brachypodium distachyon, buğday, arpa, yulaf ve çavdar gibi beslenmede temel öneme sahip tahılların da içinde bulunduğu çim ailesinin (Poaceae) bir üyesidir. Brachypodium distachyon, kompakt bir genoma sahip olma (272 Mb), 5 çift kromozom (2n=10), kısa yaşam döngüsü (~12 hafta), kolay gen aktarımı, kendi kendine döllenmesi ve basit büyüme koşulları gibi özellikleri ile model organizma olmak için gereken bütün vasıflara sahiptir. Model bitki özellikleri ve önemli tahıllar ile yakın akrabalığı, Brachypodium distachyon'u tüm serin iklim tahıl türlerinin, özellikle de hububatların geliştirilmesi için dikkat çekici bir model bitki haline getirmektedir. Ayrıca, yabani bir tür olan Brachypodium distachyon'un kuraklık stresine cevapta fizyolojik olarak geniş varyasyon gösterdiği bilinmektedir ve bu çeşitlilik stres koşulları altında ifade edilen yeni genlerin, dolayısı ile çeşitli proteinlerin bulunabilmesine olanak sağlayacaktır. Brachypodium distachyon'un süregelen transkriptomik analizleri mevcuttur ancak yukarıda belirtildiği gibi transkriptomdaki değişiklikler proteom seviyesindeki sonuçları her zaman birebir yansıtmadığından, proteomun incelenmesine yönelik analizlerin gerekliliği bu bitki için de söz konusudur.Proteinler sinyalizasyonun ve biyokimyasal yolakların önemli bileşenleridir, bu nedenle protein seviyesindeki çalışmalar bitkilerin büyüme, gelişme ve çevreyle etkileşimlerinin altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılması için gereklilik arz etmektektedir. Örnek hazırlama, yüksek çözünürlüklü protein ayrıştırma, protein karakterizasyonu için MS yazılımı ve donanımı ve biyoinformatik araçlardaki gelişmelere büyük ölçüde bağlı olarak bitki proteom çalışmalarında son yıllarda büyük bir ilerleme kaydedilmiştir. Bitki proteomu çalışmalarında amaç protein türlerinin kataloglanması ile sınırlı değildir, fonksiyonel biyoloji altında proteinlerin kalitatif ve kantitatif analizlerini de kapsar. Proteomik çalışmalardan elde edilen zengin verisetleri protein kimliği, miktarı, hücredeki lokalizasyonu, proteinin post-translasyonel modifikasyonu, protein-protein etkileşimleri ve kompleks proteomun oluşumunu kapsar. Bitki proteomik çalışmalarının sistem biyolojisiyle bütünleşmesi pek çok moleküler mekanizmanın anlaşılmasına öncülük edecek ve sonunda bitki verimi, gıda ve savunma için önemli olan süreçlerin mühendisliğini sağlayacaktır. Bu çalışmada, Brachypodium distachyon bireylerinin zamana bağlı kuraklık uygulamasına maruz bırakılmasının ardından (4, 8 ve 12 günlük kuraklık uygulaması), protein repertuarında meydana gelen değişiklikler belirlenmiştir. Söz konusu amaç için, iki boyutlu jel elektroforezi (2D-DIGE) ve kütle spektrometrisine (MS) dayalı proteomik yaklaşım gerçekleştirilmiştir. Elde edilen proteom verilerinin karşılaştırılması sonucunda kuraklığa bağlı farklı düzeylerde anlatım gösteren proteinlerin varlığı saptanmıştır. Otuz yedi protein spotu kuraklık koşulu altında anlamlı varyasyon göstermiştir. Kütle spektrometresi ile tanımlanan on üç protein fonksiyonlarına göre sınıflandırılmış ve Brachypodium distachyon'un kuraklığa cevap mekanizmasındaki rol ve ilişkileri tartışılmıştır. Kuraklık stresine cevap olarak çakışan metabolizmaların varlığı belirlenmiştir. Çalışmanın neticesinde tespit edilen proteinler kuraklığa tolerans gösteren bitkilerin belirlenebilmesi için biyomarkör olma potansiyeli teşkil etmektedir. Ayrıca, belirlenen proteinler Brachypodium distachyon'un yakın akrabalık gösterdiği tahıllarda (buğday, arpa, yulaf, çavdar vb.) kuraklık stresine direnç geliştirilmesi çalışmalarına katkıda bulunacaktır. Among the environmental stress factors, drought is the one that has the most severe effect on agricultural production. Hence, improving the yield under drought stress is one of the most important challenges in agriculture. Drought or water deficit has a direct impact on the cellular metabolism of plant. This impact significantly reduces the growth index and crop yield.A number of studies highlighted the existence of a complex network in the cell upon drought stress. Changes in protein expression play the major role in this complex network. The main strategy to improve crop yield is to integrate all the properties that are required to sustain yield under drought stress and accumulate the most powerful genes and proteins in elite genotypes without any harmful effect on the potential crop yield. This approach will provide the improvement of new plant cultivars that are stable and exhibit high yield potential under drought conditions. In plants, there are number of studies on transcriptome level to elucidate the mechanisms underlying stress response. However, alterations in mRNA levels do not always correlate well with protein levels in the cell due to the post-transcriptional and post-translational modifications. Therefore, transcriptome studies are insufficient for understanding the complex network of stress response, causing a lack of knowledge for the enlightenment of the mechanisms related to stress response. Brachypodium distachyon, model plant for monocot species, exhibits a close relationship to agriculturally and economically important crops. It is also known that Brachypodium distachyon displays high variation in the response against drought stress. This variation will potentially lead to identify new stress-responsive genes and thus proteins. Ongoing transcriptomic analyses in Brachypodium distachyon are available. However, requirement of proteomic analyses is an emerging subject for this plant species.In this study, changes in protein repertoire of Brachypodium distachyon leaves after exposing individuals to time-dependent drought stress (4, 8 and 12 day application of drought) were described. Based on two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE), constructed with 3 replicates, and combined mass spectrometry (MS) experiments, a proteomic approach was carried out for this purpose. The comparison of the resulting proteomic data highlighted differentially expressed proteins (DEPs) upon drought stress. 37 differentially expressed proteins were detected via statistical evaluation of relative spot densities and among these one, thirteen DEPs were identified by MS and classified according to their functions. The role and relation of DEPs in drought response of Brachypodium distachyon were discussed. The biological functions of DEPs included roles in photosynthesis, protein folding, antioxidant mechanism and metabolic processes. It has been highlighted that there is a significant degree of overlapping between metabolic alterations induced by drought stress. The identified proteins in this study could serve as potential biomarkers for the selection of drought-tolerant Brachypodium distachyon plants as well as its relatives like wheat, barley and rye. Furthermore, identified proteins will contribute on the studies on development of drought-resistant crop species such as wheat, oat and barley, which are close relatives of Brachypodium distachyon. 83

Fosil kayıtlarına göre Funguslar 1.5 milyar yıl önce diğer yaşam formlarından ayrılmış ve büyük ihtimal ile Kambriyen Dönemi'nden beri Dünya üzerinde kolonize olmuş durumdadırlar. Fungusların Dünya üzerindeki varoluşları insan türünün yeryüzü üzerindeki evriminden çok daha uzun bir döneme işaret etmektedir.`Mikoloji` terimi kökenini Yunanca mantar anlamına gelen `mykes` kelimesinden alır ve funguslar üzerine çalışan yaşam bilimini niteler. Genel olarak mantarlar, organik moleküllerin ayrıştırılmasını ve besinlerin ekosisteme geri dönüşümünü sağlayarak yaşamın sürekliliğini sağlamaktadırlar. Fungusların ayrıştırıcı ve geri dönüştürücü özelliği `Mikoremediasyon` terimini ortaya çıkarmıştır.Artan insan popülasyonu ve kapitalist dünya ekonomisinin bilinçsiz tüketimi desteklemesi, yaşadığımız çevrenin ve doğal kaynakların sentetik bileşiklerle kirlenmesine ve bunun gün geçtikçe dünya çapında büyük bir probleme dönüşmesine sebep olmaktadır. Biosferde doğal olarak meydana gelmeyen bu sentetik bileşikler `ksenobiyotik` olarak adlandırılır. Sentetik bileşiklerin büyük bir kısmı doğal mikroflora ve fauna tarafından kolayca parçalanamazlar. Endüstriyel ve çevre biyoteknolojisindeki biyolojik yaklaşımlar; atık üretimin azaltılması, atıkların temizlenmesi, daha az zararlı, kullanılabilir ve kolay bozunur formlara dönüştürülmesi gibi `çevreci teknolojiler`i temel alır. Bahsi geçen çevreci yaklaşımlar canlılardaki metabolik yollarının kullanımına odaklanır. Bu biyolojik yöntemlerden biri de fungal remediasyon olarak bilinen mikoremediasyon yöntemidir. Mantarlar ve diğer funguslar çok sayıda atığın/kirleticinin ayrıştırılmasında ya da parçalanmasında görev alan enzimatik mekanizmalardır. Bazitli fungusların biyoremediasyon aracı olarak kullanımı ise gün geçtikte popülerlik kazanmaktadır.Filamentli funguslar bir ağacın dallarını andıran yapıları ile üzerinde büyüyüp geliştikleri substratı salgıladıkları hücre dışı sindirim enzimleri ile sindiren, potensiyel olarak iyi birer ayrıştırma ajanıdır. Odunsu dokuların hücre duvarlarında bulunan lignini parçalayabilme özelliğine sahip enzimatik özellikleri ile beyaz çürükçül mantarlar tüm fungus türleri arasında odunsu yapıları parçalayan ve/veya çürüten funguslar olarak bilinirler. Beyaz çürükçül mantarların çoklu aromatik hidrokarbonları, klorlu aromatik hidrokarbonları, polisiklik aromatikleri, poliklorlu bifenilleri, poliklorlu dibenzo(p)dioksinleri, pestisitleri, insektitistleri ve bazı azo boyalarını parçaladığı bilinmekte ve bu fungus türleri aynı zamanda toksik organik bileşiklerin parçalanması sonucu ortaya çıkan ağır metallerin biyolojik birikimlerinde ve kirlenmiş toprakların mineralleştirilmesi ya da nitratlaştırılması amacıyla da kullanılmaktadır. Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius, Pleurotus tuber-regium, Lentinus squarrosulus ve benzeri beyaz çürükçül funguslar bu zamana dek biyoremediasyon araştırmalarında kullanılmış türlerdir. Beyaz çürükçül mantarlar kirlenmiş toprakların biyoremediasyonunda; madenleştirmeyi, biyolojik bozunumu, dönüştürümü, eş metabolizmayı içeren ve biyoakümülasyon olarak bilinen ağır metallerin biyolojik birikiminde kullanılır. Ağır metaller yer kabuğunu doğal bileşenleridir. Biyolojik ve ısı etkisiyle bozunur olmayan yapıları çevrede birikmelerine ve ağır metal kirliliğe sebep olur. Ağır metaller genellikle yoğunluğu 5'ten büyük, organizmalar üzerinde toksik etki gösteren yaklaşık olarak 65 metalik elementi kapsayan bir grup olarak tanımlanır.Çevrede bulunan ağır metaller, fungal hücre dışı enzimlerle direkt olarak etkileşim halindedir. Çevreden alınan ağır metaler beyaz çürükçül mantarların miselerinde birikir. Ağır metaller genel olarak enzimatik reaksiyonların inhibitörleridir. Metal iyonları hücre içerisine girdiğinde hücre dışı enzimlerin üretimini transkripsiyonel (yazılım) ve tranlasyonel (çevirimsel) düzeylerde etkiler. Esansiyel ağır metallerin düşük konsantrasyonları aynı zamanda lignolitik (lignin parçalayıcı) enzim sistemlerinin gelişimi için gereklidir.1996 yılında U.S EPA tarafından yayınlanan raporda kirlenmiş alanlarda bulunan ağır metallerin bulunma miktarını Pb, Cr, As, Zn, Cd, Cu and Hg şeklinde sıralanmıştır. Biyolojik birikim ve biyoartış ile ürün veriminin azalmasına sebep olduğundan topraktaki metallerin miktarı önem taşımaktadır. Toprakta bulunan ağır metaller aynı zamanda yer üstü ve yeraltı su kaynakları için risk arz etmektedir.Kadmiyum, civa ve kurşun, organizmalar üzerinde tanımlanmış herhangi bir esansiyel rolü olmayan en zehirli üç ağır metaldir. Kadmiyumun toksisitesi, bitkiler ve hayvanlar için esansiyel bir mikroelement olan çinkoya olan benzerliğinden kaynaklanmaktadır. Kadmiyum ve kurşun genellikle Cd/Pb içeren pillerin, çeşitli elektronik eşyaların, kabloların ve benzeri ürünlerin üretiminde kullanılan ağır metallerdir ve bu ürünlerin geri dönüşümlerinin/geri kazanaımlarının sağlanmaması, evsel atıklarla birlikte çöplerde bulunması kadmiyum ve kurşun kirliliğine sebep olur. Civa kirliği ise daha çok kömür yanması sonucu ortaya çıkmaktadır. Bu çalışma; kurşun , kadmiyum ve civa ile üç farklı konsantrasyonda yapay olarak kirletilmiş topraktan, istiridye mantarı olarak bilinen Pleurotus ostreatus'u kullanılarak iki farklı inkübasyon dilimi için, ağır metallerin farklı zaman dilimlerindeki biyolojik birikimlerini araştırmak üzere planlanmıştır. Deney sonunda toprak ve misel örnekleri ayrı ayrı paketlenerek Bureau Veritas Mineral Laboratuvarları'na gönderilmiş ve analizleri yaptırılmıştır. Ağır metaller ICP-MS cihazı ile tayin edilmiştir. Toprakta hali hazırda kalan ve miseller tarafından biriktirilen ağır metal konsantrasyonları belirlenmiştir. Misele akümüle olan Pb, Cd, Hg inkübasyon süresinin uzamasıyla artmıştır. SET II'ye ait misellere akümüle olan kurşun, kadmiyum ve civa konsantrasyonları SET I'e ait misel örneklerine nazaran daha yüksektir.SET I misellerinde kurşunun artan konsantrasyonla birlikte miselde biriken Pb konsantrasyonu azalma gösterirken, SET II misellerinde kurşunun misele akümüle olan konsantrasyonu, artan kurşun konsantrasyonu ile birlikte önemli bir değişiklik göstermemiştir. SET I ve SET II içerisinde 2.5, 5 ve 10 ppm olarak artan Pb konsantrasyonları ile kurşunun bioakümülayon yüzdesinin azaldığı gözlemlenmiştir. Kadmiyumun SET I ve SET II de artan kadmiyum konsantrasyonlarına karşı cevabı ilginç bir tablo sergilemiştir. SET I ve SET II içersinde artan konsantrasyonla birlikte kadmiyumun miselde tayin edilen konsantrasyonu artarken, hem SET I hem de SET II için 2.5, 5 ve 10 ppm konsantrasyonlarında Cd bioakümülasyon yüzdesi İçerik I> İçerik III> İçerik II şeklindedir. Bioakümülasyon yüzdeleri incelenen ağır metaller içerisinde civa SET I ve SET II için en yüksek bioakümülasyon yüzdesini göstermiştir. 10 ppmlik civa konsansantrasyonu için SET I'de 54 % ve SET II'de 85 % bioakümülasyon yüzdesi hesaplanmıştır. Buna göre her iki inkübasyon süresi için misel tarafından en çok akümüle edilen ağır metalin civa olduğu, kurşunun ise en az akümüle edildiği belirlenmiştir. Misel örneklerine akümüle olan kurşun, kadmiyum ve civa konsantrasyonları çoktan aza sırasıyla Hg> Cd> Pb şeklindedir. According to fossil records, fungi diverged from other life around 1.5 billion years ago and probably fungi colonised on Earth during the Cambrien, which is long before human beings evolved on it. The term `mycology` is derived from Greek word `mykes`, meaning mushroom which is a branch of life science that refers the study of fungi. In general, mushrooms are responsible for decomposing of organic molecules to provide continuance of life by recycling organic wastes and returning of nutrients back into the ecosystem. These features of fungi reveal a term called as `mycoremediation`.Increasing human population and supporting unconscious consumerism by a politics of capitalist world economy caused the pollution of the environment with synthetic compounds which has become a major problem all around the world. These synthetic compounds are called as xenobiotics which do not occur naturally in the biosphere so are not easily degraded by the natural microflora and fauna. Biological approaches based on the environmental biotechnology are focusing on the development of `environmentalist technologies`. Further, these clean technologies focus on the use of metabolic pathways of organisms for the remediation of waste. One such biological method is mycoremediation (fungal remediation). The mushrooms and other fungi act as enzymatic machinery for degradation of a wide variety of waste/pollutant. However mushrooms, basidiomycetous fungi, are becoming more popular nowadays for remediation purposes as a bioremediation tool. The white rot fungi in all the fungi species, are known to degrade polyaromatic hydrocarbons (PAHs), chlorinated aromatic hydrocarbons (CAHs), polycyclic aromatics, polychlorinated biphenyls, polychlorinated dibenzo(p)dioxins, the pesticides and some azo dyes. White-rot fungi are also used in bioremediation of polluted soils and accumulation of heavy metals and involved in mineralization, biodeterioration, biodegradation, transformation and co-metabolism. Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius, Pleurotus tuber-regium, Lentinus squarrosulus etc. are white-rot fungi, so far used in bioremediation researches. Heavy metals are natural constituents of the earth crust. Their non- biodegradable, non-thermodegradable features contribute to environmental pollution mainly and show toxic effects on organisms. The most common heavy metals found at contaminated sites, in order of abundance are Pb, Cr, As, Zn, Cd, Cu and Hg. Those metals are important since they are capable of decreasing crop production due to the risk of bioaccumulation and biomagnification in the food chain. There is also the risk of superficial and groundwater contamination.Cadmium, mercury and lead can describe as three big poisinous metals which are not known essential role for living organisms. Cadmiums chemical similarity to Zn which is an essential micronutrient for plants and animals, probably responsible of its toxicity. Mercury, Hg, is the only liquid metal at standard temperature, and major source of Hg contamination is caused by coal combustion. Mostly Pb contamination in nature arises during the improper disposal of Pb storage batteries.The aim of this study is to remediate contaminated soils from three most toxic heavy metals using Pleurotus ostreatus mycelium. Soil and mycelium heavy metal analysis were performed by Bureau Veritas Mineral Laboratories, in Canada. Soil Pb and Cd analyses were performed using ICP-MS analysis. In this study, bioaccumulation percentage of was studied with three different concentration of Pb, Cd and Hg for two different incubation period. The results showed that bioaccumulation percentage increased by incubation period for lead, cadmium and mercury. While SET I mycelium analyses showed that increasing concentration of lead caused a decrease for its bioaccumulation, in SET II bioaccumulated concentration of Pb did not showed a significant difference for all concentrations. According to bioaccumulation percentage calculations for Pb, it showed a decrease in order of 2.5 ppm, 5 ppm and 10 ppm. Cadmium showed the lowest bioaccumulation percentage in Content 2, comparison to Content 1 and Content 3, both SET I and SET II.Heavy metal analyses of mycelium samples showed that the most bioaccumulated heavy metal by Pleurotus ostreatus was mercury. The mycelium samples belonged to 10 ppm mercury contained soil samples showed 54 % Hg bioaccumulation and 85 %, in SET I and SET II, respectively. The heavy metals which were used in this experiment in order of bioaccumulation percentages were Hg > Cd> Pb. 124

Proteinler DNA kontrolünde sentezlenen makromoleküllerdir. Proteinler foksiyonel özelliklerini gerçekleştirmek için özel 3-boyutlu yapısını kazanması gerekir. Proteinlerin bu 3-boyutlu yapılarını elde etmelerine katlanma denir. Christian Anfinsen yaptığı çalışmalarla proteinlerin elde edeceği 3-boyutlu yapı onların monomerleri olan amino asitlerinde saklı olduğunu göstermiştir. Bu çalışmaları doğrultusunda Christian Anfinsen, 1972 yılında nobel ödülü almıştır. Bazı küçük yapılı proteinlerin katlanması kendi kendine gerçekleşmesine rağmen; bir çok proteinin, hücre içinde katlanması kendi kendine gerçekleşemez. Protein katlanmasına yardımcı, protein yapılı moleküllere şaperon adı verilmektedir. Bu yardımcı proteinlerin, protin katlanması için gerekli olduğu 1989 yılında Arthur Horwich ve Ulrich Hartl tarafından yapılan iki ayrı çalışma ile gösterilmiştir ve bu tarihe kadar farz edilen proteinlerin hücre içerisinde kendi kendine katlandığı hipotezi çürütülmüştür. Yaklaşık son 25 senedir süre gelen çalışmalar, şaperonların proteinlerin 3 boyutlu yapılarının kazanılmasına nasıl yardımcı olduğu, bu proteinlerin hatalı katlanmalarını nasıl engellediği, bu proteinlerin moleküler mekanizmasının ne olduğu gibi sorulara cevap vermeyi amaçlamaktadır. Şaperonlar bakterilerden ökaryotlara kadar bütün organizmalarda korunmuş proteinlerdir. Şaperonlar normal koşullarda hücrede normal seviyede sentezlenmesine rağmen pH değişimi, sıcaklık değişimleri, oksidatif ve kimyasal stres durumlarında sentezlenmeleri önemli miktarda artar. Bu gibi olumsuz koşullarda hücre içinde sayıca artan şaperonlar, protein moleküllerinin yapısının bozularak fonksiyonlarının kaybolmalarını engeller. Böylece bu proteinler, diğer proteinlerin yanlış katlanmasından dolayı neden oldukları Alzheimer, Parkinson gibi hastalıkların oluşmasını engellemede önemli rol oynarlar. Günümüzde bu hastalıkların şaperon proteinler kullanılarak tedavi edilmesine yönelik çalışmalar gündeme gelmektedir.Hücre içerisinde bir çok şaperon protein ailesi olmasına karşın, Hsp70 en yaygın şaperonlardan olup, hemen hemen bütün organizmalarda bulunur. Hsp70 şaperon proteinleri hücrede protein katlanması, proteinlerin belli organellere taşınması, hatalı katlanmış proteinlerin tekrardan doğru katlanması gibi hücrede çok önemli görevleri vardır. Hsp70 proteini, protein katlanma reaksiyonunu katalizlemez, ancak hidrofobik bölgelere bağlanarak, bu bölgelerin uygunsuz bir biçimde birbirleriyle etkileşime girip, proteinin yanlış katlanmasını engeller. Proteinlerin hidrofobik bölgeleri ile kovalent olmayan etkileşimler gerçekleştirerek, hatalı katlanmaya neden olan bu bölgelerin istemsiz şekilde bir araya gelmesini engeller. Ancak Hsp70 proteininin bu işlemi nasıl gerçekleştirdiği, protin katlanma yolaklarında nasıl bir rol oynadığı günümüzde hala tam olarak aydınlatılamamıştır. Hsp70 proteinleri 44 kDa'lık N-terminal nükleotit bağlanma domainine (NBD) ve 25 kDa'lık C-ucu substrat bağlanma domainine (SBD) sahiptir. Bu iki domain birbirine çok korunmuş olan hidrofobik linker ile bağlanır. Nükleotit bağlanma bölgesine nükleotit bağlı bulunmaması veya ADP bağlı bulunması durumunda, iki domain birbirinden ayrı proteinler gibi hareket eder iken, nükleotit bağlanma bölgesine ATP'nin bağlanması iki domain birbiriyle etkileşmesine neden olur. Bu etkileşmiş yapıya, ''alosterik aktif'' konformasyon denir. Bu konformasyonda substrat bağlanma bölgesinin, subdtrata bağlanma afinitesi alosterik aktif olmayan konformasyona göre daha düşüktük. Daha sonra substrat bağlanma bölgesine bağlanan substrat, ATP'nin hidrolizini tetikler ve ATP hidrolizi sonucunda iki domain birbirimden ayrılır. Bu mekanizmada rol oynayan iki farklı koşaperon vardır. Bunlardan ilki Hsp40 protein ailesidir ve ATP hidrolizini hızlandırır, diğeri ise nükleotit değişim ailesi olan GrpE'dir. İki domain arasındaki bu allosterik ilişkinin, bağlaçın hidrofobik bir bölgesi olan 389VLLL392 sekansları tarafından sağlandığı önceki çalışmalarda açık bir şekilde gösterilmiştir. Çalışmalar tam protein için substrat varlığındakine benzer aktivite nukleotit bağlanma domain ve bağlacın 389VLLL392 bölgesine sahip olan eksik proteinde gözlemlemişlerdir. Aynı zamanda sadece nükleotit bağlanma bölgesine sahip olan ancak baglaca sahip olmayan eksik proteinin ATP hidroliz aktivitesi Hsp70 proteinin substrat yokluğundaki aktivitesini yansıtmaktadır. Nukleotit bağlanma domaine ek olarak bağlacın olması durumunda pH bağımlı ve baglaç olmayan yapıya göre çok daha yüksek ATP hidrolizi aktivitesi gözlenmektedir. Şu ana kadar süre gelen yapısal ve biyofizik çalışmalar mekanizma hakkında birçok sonuç ortaya koymasına rağmen, Hsp70'in çalışma mekanizmasını tam olarak açıklamaya yetmemiştir. Yapılan çalışmada E. coli Hsp70'i olan DnaK kullanılarak, katalilitik bölgede, ATP hidrolizide görev aldığı düşünülen amino asitlere mutasyonlar yapılarak bağlaç varlığında pH bağımlı, arttırılmış aktivitede görev alan amino asitler roller açıklanmaya çalışılmıştır. pH bağımlı aktiviteden sorumlu olduğu düşünülen E171, D194 ve D201 asidik amino asitleri nokta mutasyonu ile alanine çevrilerek, aktivitenin değişimi, ATP'ye bağlanmadaki farklılıklar, ADP salımındaki değişimler ve yapısal etkilenme ayrı ayrı incelenmiştir. Aynı incelemeler ve mutayonlar bağlaç içermeyen ATPaz domainine de uygulanmıştır. Böylece mutasyonların ve bağlaç mekanizma üzerindeki etkisi incelenmiştir. Bu incelemeler sonucunda, bağlaç varlığında bağlaç yokluğuna göre, proteinin katalizleme mekanizmasının farklı olabileceğini açıkça ortaya koymaktadır. Bağlaç varlığında ADP salımının reaksiyonun fizyolojik pH'da hız kısıtlayıcı reaksiyon olduğu açıkça gösterilmiştir. Fakat bağlaç yokluğunda ve uç pH değerlerinde hız kısıtlayıcı reaksiyonun ADP salımı olmadığı gözlemlenmiştir. Sonuç olarak, bu amino asitlerin hidrofobik korunmuş bağlaç varlığında ya da yokluğunda farklı görevleri olduğu gözlemlenmiştir. Bağlaç varlığında, E171 amino asitinin ve D201 amino asitinin katalitik aktivitede direk olarak görev alması ya da bunlardan birinin görev alarak, diğerinin ATP hidrolizinde görev alan amino asiti konumlandırmasının olası olduğu gösterilmiştir. Bağlaç yokluğunda ise yabanıl proteine göre bu amino asitlerin mutasyonu aktivitelerinin artmasına neden olmasına rağmen, ATP'ye olan bağlanma afinitelerinde herhangi bir değişiklik gözlemlenmemiştir. Bağlaç yokluğunda mutasyonun aktivite artışına sebep olması, bağlaç varlığında ise bu mutasyonlarının birinin varlığında aktvitenin tamamen yok olması; bu amino asitlerin, bağlaç içeren yapıda katalitik aktivitede çok önemli rol oynarken, linker yokluğunda böyle bir rollerinin olmadığını göstermektedir.ATPaz domainin bağlaç içermeyen yapısında düşük seviyede ve pH'ya bağımlı olmayan aktivite gözlemlenmesine rağmen ATPaz domaininin bağlaçlı yapısında pH 7.5 civarında pik yapan; asidik ve bazik bölgede azalan bir pH bağımlı aktivite gözlemlenmiştir. D194 amino asitini alanine çevrilerek yapılan ATPaz reaksiyonu hız ölçümleri bazik bölgede pH bağımlılığa neden olan amino asitin D194 olduğu açıkça göstermiştir. Bu sonuç önceki yapılan moleküler dinamik sonuçlarıyla da uyum göstermiştir. O çalışmalar, D194 amino asitinin yüksek pH değerlerine kadar protonlu kaldığını ve daha sonra protonunu kaybettiğini söylemektedir. Bunun sonucu olarak D194 amino asitinin mutasyonlu halinde alkali taraftaki aktivite azalmasının ortadan kalkması beklenen bir sonuçtur. Ayrıca yabanıl ATPaz domaininde yüksek pH'da D194'ün protonunu kaybetmesinden dolayı ADP salım hızı artmasına rağmen D194A mutasyonunda herhangi bir artış gözlemlenmemiştir. Bu da katalitik bölgede D194'ün karboksilli ucunda oluşacak eksi yükün ADP çıkışını hızlandırdığı, bu eksi yükün kaldırılmasının ise çıkışa herhangi bir etki yapmadığını açıkça ortaya koymaktadır. Ancak bu mutasyonun diğer pH'larda ATPaz hızını değiştirmemesi, D194'ün E171 ve D201'den farklı olarak ATP'nin kimyasal olarak parçalanmasınında bir rol oynamadığını, ancak ATP'nin ve ADP'nin konumlandırılmasında görev aldığını yapılan ATP afinite deneyleri ve ADP çıkış hızı ölçümleri açıkça göstermektedir.Ayrıca tripsin enzimi ile yapılan yapısal analiz çalışmalarında, E171A mutasyonunun yapıyı, diğer mutasyonlara göre çok daha fazla bozduğu ve proteinin ATP'yi konumlandırmasını zorlaştırdığını göstermektedir. D201A mutasyonunun ise yapıda fazla bir değişikliğe neden olmadığı gösterilmiştir. Hsp70 is a highly conserved molecular chaperone that plays significant roles in variety of cellular activities, such as de novo folding of newly synthesized proteins, refolding of misfolded proteins, protein trafficking and translocation to organelles. DnaK, Escherichia coli homolog of Hsp70 molecular chaperone, consists of two domains; an N-terminal ATPase domain (NBD) and a C-terminal substrate-binding domain (SBD), which are connected by a highly conserved hydrophobic linker. Conformational changes brought about by substrate binding to SBD causes NBD to adopt a conformation for efficient ATP hydrolysis and in the reverse direction ATP binding allows fast on and off rates for the substrate. Previous studies showed that allosteric communication between two domains of DnaK is provided by the conserved 389VLLL392 sequence on the linker region. In the presence of linker, DnaK(1-392), pH- dependent higher ATPase rates are observed, which mimics the substrate-stimulated activity of the full-length protein, whereas in the absence of linker, DnaK(1-388), behaves similar to the substrate-free unstimulated-form of the full-length. However, it has still not been revealed which amino acids are important in the allosteric mechanism underlying the linker induced conformational rearrangements in the ATPase domain. In this study, combined with previous molecular dynamic simulations, we found that the pH-dependent ATPase activity upon linker binding could be related to the well-identified catalytic residues, E171, D194 and D201, which participate in the correct localization of the Mg2+ ion. Further pH-dependent ATPase activity measurements revealed that the alkaline arm of the bell-shaped activity is caused by almost 5 pH units increased pKa, which is observed for D194 than to that of the expected pKa of Asp, upon its substitution with alanine, alkaline site of the bell shape was completely lost. In addition, when we mutated E171 or D201 to alanine, we observed that the linker-bound form of the ATPase domain did not reveal any pH-dependence. We think that linker-bound state of the ATPase domain experiences a pH-dependent ATPase activity due to a proton transfer reaction taking place during catalytic activity and this is only occurring with linker tucking onto the ATPase domain. In addition to ATPase activity measurements, ADP-dissociation, ATP affinity and trypsin digestion measurements were performed to provide evidence for the pH-dependent ATPase activity. 71

Kronik Hepatit B hastalığı evrensel bir sağlık problemidir. Hepatit B hastalığına sebep olan Hepatit B virüsünün, tüm dünyada 2 milyardan fazla kişiyi enfekte ettiği bilinmektedir. 400 milyondan fazla kişi ise kronik olarak hepatit B taşıyıcısıdır ve bu taşıyıcılık, kronik hepatit başta olmak üzere, karaciğer kanseri ve karaciğer sirozunun oluşmasına sebep olabilmektedir. Yıllık olarak bakıldığında tüm dünyada, 2 milyon kişinin bu virüsten dolayı hayatlarını kaybettiği kayıtlara geçmektedir. Türkiye'de ise yaklaşık 3 milyon kişinin bu hastalıkla mücadele ettiği biliniyor.Hepatit B virüsü küçük bir DNA virüsüdür ve yaklaşık olarak 3200 baz çiftine sahiptirler. Hepatit B virüsü Hepadonovirus ailesinin bir üyesidir ve kısmi olarak çift sarmallı, dairesel DNA içerir.Genom üzerinde 4 tane protein kodlayacak nükleik asit dizisi vardır. Bunlar S, C, X ve P bölgeleri olarak adlandırılan yüzey, kor, X ve polimeraz proteinleridir. C geni, HBcAg proteinlerini kodlar ve bu kor nükleokapsid oluşumuna sebep olan yapısal proteinleri içerir. Bu proteinler HBeAg antijenine translasyon sonrası dönüşür. S genini içeren Pre S1 ve Pre S2 yüzey proteinleri HBsAg anijenlerini kodlar. P geni DNA polimerazı kodlayan protein, ters transkripsiyon aktivitesine sahiptir ve son olarak X geni hücrenin potansiyel transaktivatörüdür. X geninin görevi ise tamamen bilinmemektedir. Genom üzerinde, 6 başlangıç kodonu, 4 promotör ve 2 tane hızlandırıcı element bulunmaktadır.Hepatit B virüsünün tüm genomik sekansının üzerinde 8 genotipi tanımlanmıştır ve bunlar A'dan H'ye kadar düzenlenmiştir. Bağlantılı olarak, HBV'nin alt tipleri (adw, adr, ayw ve ayr) de mevcuttur. A'dan H'ye düzenlenen bu 8 genotip farklı coğrafik bölgelerde yayılım göstermiştir.Hepatit B virüsü konak hücreye invaze olduğu zaman, hücre yüzeyine bağlanır ve bu hücreye kendi zarf proteinleri yardımıyla girer. Virüs, hücrenin plazma membranından nükleusa taşınır. Bu şekilde nükleusa giren virüs kısmen sirküler formdan sirküler DNA (cccDNA) formuna dönüşerek öncül RNA ve haberci RNA'ya kalıp oluşturur. Virüsün negatif zinciri neredeyse tamamen halkasal yapıda olmasına rağmen, pozitif zincirin uzunluğu daha kısadır. Negatif zincir virüsün yapısal proteinlerini kodlarken, pozitif zincir bazı yapısal proteinleri kodlar. Translasyon sonucu oluşan viral proteinler nükleokapsid içinde toplanır ve paketlenir. Daha sonra yeni hepatositleri işgal etmek üzere sitoplazmadan salınır.Hayatı tehdit eden bu virüsün bulaşma yolları şu şekildedir: Enfekte olmuş kan temasları, korunmasız olarak yapılan cinsel aktivite, organ nakilleri, yatay olarak meydana gelen bulaşma, hastane yaralanmaları ve intravenöz ilaç kullanımı olarak özetlenebilir. Ayrıca bu hastalık anneden bebeğe doğum esnasında da geçebilir. Yapılan çalışmalar, hepatit B virüs enfeksiyonunun progresyonunda sadece viral genotip ve vireminin değil, aynı zamanda konak genetik faktorlerinin de oldukça önemli rol oynadığını göstermiştir. Aynı zamanda, hem hücresel hem de hümoral immün yanıtın virüsün eredike edilmesi için gerekli olduğu birçok deneysel çalışmada gösterilmektedir.Temel olarak kronik hepatit B hastalığının tedavisinin amacı, viral replikasyonu baskılamak ve geri dönülemez karaciğer zararlarını en aza indirgemektir. Öte yandan, uzun süreli tedavinin amacı ise virüsü elimine ederek hastalığın progresyonunu önlemek. İnterferon ve lamuvidin kronik Hepatit B hastalığının tedavisinde kullanılan yaygın ajanlardır. Tedavide kullanılan diğer ajanlar ise adefovir dipivoksil (ADV), tenofovir disoproksil fumarat (TDF), entecavir (ETV) and telbivudin(LdT)dir.Kromozomun 6p21.3 bölgesinde yer alan yüksek derecede polimorfik insan lökosit antijen (HLA) geni immün yanıtla çok yakından ilişkilidir.Ayrıca bu polimorfik bölge inflamasyondan, enfeksiyondan ve otoimmüniteden de sorumludur.Genomun tarandığı (genome wide association-GWA) çalışmalar kromozomun 6p21 noktasının yakınında bulunan insan lökosit antijende ki, binlerce tek nükleotid polimorfizmini ortaya çıkartmıştır. Daha önceki çalışmalara göre HLA lokusunda bulunan ve kronik HBV, HCV, hepatik fibroz ve gelişen karaciğer kanserhücreleriyle bağlantılı olabilen aday tek nükleotid polimorfizmleri belirlenmiştir. Genomun tarandığı çalışmalarda HLA-DPB1 gen bölgesinin Hepatit B hastalığı ile ilişkili olabileceği üzerine veriler elde edilmiştir. Bu bölgenin polimorfik bir bölge olmasından dolayı Hepatit B hastalarında hastalık direncine bakarak DPB1 allel tayini yapmak ve elde edilecek verilere göre allellerin hastalık için direnç ya da yatkınlıklarını incelemek bu çalışmanın temel amacıdır.Biz bu çalışma ile Türk populasyonunda, Hepatit B hastalığının immün yanıtta önemli bir rol oynayan HLA sınıf II bölgesi genlerinden HLA-DPB1 polimorfizmleri ile ilişkisini araştırarak, aday alellerin ve koruyucu alellerin belirlenmesini hedefledik.Bu çalışma 94 hasta içermektedir. Bu hastalar Göztepe Eğitim ve Araştırma Hastanesi'nde hepatoloji kliniğinden takipli hastalardır. Yaş ve cinsiyetle eşleşmiş 85 HBsAg negatif, anti- HBs pozitif ve anti-Hbc IgG spontan serokonverted pozitif hastalar katılmıştır. Yerel etik kurulu onayı alınmştır. Kan örneklerinden genomik DNA izolasyonu sonucu HLA-DPB1 bölgesine spesifik primerler ile istenilen bölge polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmıştır. Bu çalışmanın ardından PZR-RFLP (Restriction Fragmen Length Polimorpism) metodu uygulanarak restriksiyon enzimi ile kesim gerçekleştirilir. Bu çalışmada 9 farklı restriksiyon endonukleaz kullanılmıştır: Bunlar, Bsp12861, FokI, DdeI, BsaJI, BssHII, Cfrl31, RsaI, EcoNI ve AvaII'dir. Restriksiyon enzim kesiminden sonra kesim bölgeleri incelenerek, allel tayini yapılmıştır.Çalışmaya 94 kronik hepatit B hastası (Grup A) alınmıtır. Bu hastalar Göztepe EAH karaciğer hastalıkları polikliniğinde kayıtlı 6 aydan uzun süredir serum HBsAg (hepatit B yüzey antijeni) pozitif olan hastalardır. Hastaların ortalama yaşı 47,9±14,7 dir. Hastaların %61.7'si (n=58) erkek, %75,5 (n=71) HBeAg (hepatit B early antigen) negatiftir. Hastaların %57,4(n=54) 'e karaciğer biopsisi yapılmıştır, Biyopsi yapılan hastalarda HAI (hepatik aktivite skoru) 6,5 ±3,3 Fibroz skoru 2±1,5 dir. Hastaların %21,3'ünde (n=20) karaciğer sirozu mevcuttur, %83'ü(n=78) hepatit B'ye yönelik tedavi almaktadırlar. Ortalama serum ALT düzeyleri 102,1±113, AST 70±96 dir. Hastaların ortalama izlem süreleri 76 ±52 aydır.Kontrol grubu olarak (Grup B) hepatit B geçirmiş, spontan HBsAg serokonversiyonu olmuş sağlıklı kişiler alınmıştır (HBsAg negatif, Anti HBs pozitif, Anti HBcIgG pozitif). Kontrol grubunda erkek oranı %54 yaş ortalaması 54±13.Hastalıkla ilişkili olduğu düşünülen daha önce yapılmış çalışmalardan, Türk ve Alman populasyonlarından oluşan tarihsel kontrol (Grup C) olarak adlandırılan çalışma grubunu inceledik. Bu çalışma grubu Hepatit B hastalığıyla ilintili olan populasyonlarda HLA-DPB1 frekansını karşılaştırmak için kullanıldı.Analizi yapılan 19 DPB1 alelinde, DPB1*15:01 aleli, kontrol grubunda hepatit B'ye sahip olan hastalara göre daha fazla gözlemlenmiştir. DPB1*02:01 ve DPB1*10:01 ise kontrol grubunda fazla görülen diğer alellerdir. Bu iki alel Bonferoni düzeltmesinden sonra önemini kaybetmiştir. Sadece DPB1*15:01 aleli p

Bcl-2 asosiye athano gen (Bag) ailesi (Yunanca ölüm karşıtı athanostan) proteinleri anti-apoptotik Bcl-2 proteini ile ko-immunopresipitasyon sonucu bulunmuşlardır. Bag genleri evrimsel olarak korunmuştur ve mayalarda, bitkilerde ve hayvanlarda homologları mevcuttur. Bag ailesi üyeleri iki farklı yolla hücre homeostazını kontrol eder: (1) Hem pozitif hem negatif şekilde Hsp70/Hsc70 moleküler şaperon sisteminin çalışma döngüsünü regüle ederek hücrenin yaşamsal faaliyetlerini normal ve stres koşullarında sürdürmesine katkıda bulunur. Buna spesifik bir örnek, hücrenin normal ve stres halleri arasındaki dengesinin yönünün Bag-1'e Hsp70 ya da Raf-1'in yarışmalı bağlanması sonucu sağlanması ile verilebilir. (2) Apoptoz, tümör oluşumu, nöronal farklılaşma ve hücre döngüsü gibi birçok fizyolojik süreci kontrol eden transkripsiyon faktörleri ve reseptörler ile Hsp70/Hsc70 sisteminden bağımsız olarak kompleksler oluşturur.Bag ailesi üyelerinin, insanlarda, kanser, AIDS ve Parkinson gibi kompleks hastalıklarda normal hücrelere kıyasla ekspresyon düzeylerinde ve hücre içi lokalizasyonlarında değişiklikler gözlenmektedir. Dolayısıyla, bu tip hastalıkları tahlil etmede Bag proteinlerinin hücre içi ekspresyonlarını ve lokalizasyonlarını incelemeye yönelik çalışmalardan yararlanılabilir. Örneğin, kanserli meme hücrelerinde yapılan çalışmalarla Bag-1 ekspresyonunun, hastalığın seyrinin izlenmesinde prognostik bir markör olarak kullanılabileceği gösterilmiştir.Hücrelerde Bag-1 izoformlarinin ekspresyon düzeyleri farklılık göstermektedir. Bu izoformlar hücrelerde bulunma sıklıklarına göre Bag-1S, Bag-1L ve Bag-1M olarak sıralanabilir. Buna rağmen tümörlü hücrelerde ekspresyon düzeyi en yüksek olan Bag-1L izoformudur. Bunun nedeni ise Bag-1L'nin nüklear lokalizasyonuna bağlı olarak transkripsiyon faktörlerinin aktivitesini yönlendirmesi ve böylece hücre proliferasyonunu dolaylı yoldantetiklemesi olabilir. Bag-1 izoformlarinin hücrelerde daha önce yapılmış çalışmalar sonucu belirlenmiş etkileşim partnerleri; Bcl-2, Raf-1, Hsc70/Hsp70 sistemi,nükleer hormon reseptörleri (NHR), ubikuitin/proteozom mekanizması ve DNA'dır.Bu etkileşimlerle Bag-1 izoformları, hücre büyümesi için kritik sinyal iletimi, proliferasyon, transkripsiyon gibi hücresel mekanizmalardan, hücre hareketi ve apoptoza varana kadar normal, malignan ve stres altında bulunan hücreler için önemli kontrol yolaklarında görev lmaktadır.Bag-1 izoformları, Hsp70/Hsc70 sistemini hem pozitif hem de negatif yönde kontrol ederek sırasıyla hücrelerin efektif bir şekilde protein üretebilmesi sonucu hücre büyümesine ya da hücrelerin protein üretiminin yavaşlaması sonucu hücre ölümüne yol açabilir. Fakat bu kritik ayarlamada, henüz Bag-1'lerin Hsp70/Hsc70 sistemine tam olarak moleküler düzeyde nasıl bir kontrol mekanizması ile etkide bulunduğu net olarak bilinmemektedir. Kritik yolakların aydınlatılması yolunda literatürde yer alan örnekler aşağıda özetlenmektedir.Bag-1'in Hsc70 ile etkileşimi sonucu Bcl-2 ile bir kompleks oluşturduğu gözlemlenmiştir. Anti-apoptotik Bcl-2 ile Bag-1'in etkileşimi, öncelikle Bag-1'in C-Raf (Raf-1) serin/treonin kinazı ile kompleks oluşturması sonucu gerçekleşir. Bunun sonucunda hücrenin yaşam ya da ölüm kaderini belirleyecek etkileşimlerin tetiklendiği ortaya çıkartılmıştır.Bu çalışmayla amaçlanan, MCF-7 meme kanseri hücre hattında Bag-1-ilişkili sağkalım mekanizmasının moleküler detaylarının aydınlatılmasıdır. Bu amaç doğrultusunda Bag-1'in ekspresyon seviyeleri değiştirilmiş ve hücreye etkisi incelenmiştir. Bcl-2 associated athanogene family (athano = against death in Greek) proteins are discovered by co-immunoprecipitation with Bcl-2 anti-apoptotic protein. Bag genes are evolutionally conserved and their homologues exist in yeasts, plants and animals. Bag family members control the cell homeostais in two different ways: (1) They contribute to maintain cell's vital activity under normal and stress conditions via regulating both positively and negatively the cycle of Hsp70/Hsc70 molecular chaperone system. As a specific example, the direction of the cell balance under normal and stress conditions are maintained by competitive binding of Hsp70 or Raf-1 to Bag-1. (2) They form complexes with transcription factors and nuclear hormone receptors which are controlling various physiological processes such as apoptosis, tumorigenesis, neural differentiation and cell cycle independent from Hsp70/Hsc70 system. Expression levels and intracellular localization of Bag-1 family members differ in human in some complex diseases such as AIDS and Parkinson Disease in comparison with normal cells. For instance, the studies on breast cancer cells showed that Bag-1 expression can be used as a prognostic marker to monitor the disease progression. Recently, it is postulated that high Bag-1 expression is also a prognostic marker for colon cancer. Bag-1 isoforms appear to be differently localized in the cells. Main Bag-1 isoforms which are observed in humans are Bag-1S (36 kDa), Bag-1M (46 kDa) and Bag-1L (50 kDa). There is also another isoform of Bag-1, 29 kDa, however, since it is very scarce in the cell and thus is not consistently detected. Bag-1 isoforms are produced by alternative translation initiation of single mRNA transcript; thereby they differ in their N-terminus related to translation initiation. All of Bag-1 isoforms commonly include ubiquitin-like domain (ULD) and Bag domain (BD) in their C-terminus. Even though ULD domain function is not known clearly its evolutional conservation and relations with proteosom machinary indicates that ULD is necessary for stress tolerance. Bag-1L is localized in nucleus by means of its nuclear localization signal (NLS). NLS does not exist in Bag-1M which is cytosolic but can be translocated to nucleus via only companion proteins and Bag-1S which always presents in cytosol. N-terminus of Bag-1L and Bag-1M consist of eight TXSEEX repeats. It is shown that these repeats have a role in DNA binding and transcription activation depending on their nuclear localizations. Having less repeat sequences, Bag-1S is the shortest isoform in the cells.Bag-1 has many critical roles in the cell through its interactions with certain target molecules to regulate carcinogenesis, differentiation, motility, proliferation, cell survival, apoptosis and transcription. Nuclear hormone receptors, Siah, CHIP, HGF receptor, Hsp70/Hsc70 complex, Bcl-2, and C-Raf (Raf-1) are known interacting partners of Bag-1. Cell survival and apoptosis are the two major pathways that Bag-1 is involved in. Bag-1 interactions with C-Raf or Bcl-2 are main mechanism that determine cell fate. Through these interactions Bag-1 helps to regulate the balance between cell death and cell survival. Although Bag-1 involvement in a great number of mechnanisms is known, the molecular details of these mechanisms and crosstalk between the pathways are not clear yet. The exact mechanism by which BAG1 inhibit apoptosis is unknown.In this study, we aim to understand how Bag1's expression level affect Raf1 signaling proteins and some anti-and pro-apoptotic proteins that Bag-1 found to be influencing 84

Günümüzde petrol ve kömür gibi fosil yakıtlar oldukça geniş kulanım alanlarına sahiptir. Fosil yakıt kullanımına dayalı olarak enerji üreten termik santraller, endüstriyel faaliyetler, ısınma amaçlı kullanılan fosil yakıtlar SOx, NOx ve hidrokarbon bileşiklerinin salınımına neden olmaktadır. Bu bileşikler atmosferde taşınarak çeşitli kimyasal reaksiyonlara girer ve sülfürik asit (H2SO4) ve nitrik asit (HNO3) bileşiklerinin oluşumuna neden olurlar. Bu asit bileşikleri yağmur sularıyla birleşerek asit yağmuru şeklinde yeryüzüne ulaşır. Asit yağmurları toprak ve göl sularının asidik hale gelmesine neden olarak bu ekosistemler üzerinde olumsuz etki göstermektedir. En yaygın atmosfere salınan bileşik kükürt dioksit (SO2) gazıdır ve salınımının yaklaşık olarak %80'i fosil yakıtların yanmasından kaynaklanmaktadır. Fosil yakıtlarda kükürt, organik ve inorganik formlarda bulunmaktadır. İnorganik kükürt bileşikleri sülfit veya sülfat halinde bulunurken, organik kükürt bileşikleri tiyofenler, merkaptanlar, tiyoeterler, ditiyoeterler ve dibenzotiyofenler olarak bulunurlar. Bu tür bağlı kükürdü gidermek için çeşitli fiziksel veya kimyasal işlemler gerekir. İnorganik kükürt fiziksel yöntemlerle giderilebilmesine karşın organik kükürdün uzaklaştırılması oldukça zordur ve fiziksel yöntemler bu konuda yetersizkalmaktadır. Günümüzde bu amaçla kimyasal yöntemler (hidrodesülfürizasyon (HDS), kimyasal oksidasyon vb.) yaygın bir biçimde kullanılmaktadır. Ancak yüksek sıcaklık ve basınç gerektiren bu işlemler (örn: HDS için 300oC sıcaklık ve 107 Pa basınç) hem yüksek maliyetli hem de istenmeyen zararlı yan ürünlerin oluşmasına neden olduğundan daha ekonomik ve verimli bir yöntem olan mikrobiyal desulfürizasyon çalışmaları hız kazanmıştır.Mikroorganizmaların veya enzimlerin kullanıldığı mikrobiyal desülfürizasyon işlemi, termokimyasal yöntemlere göre daha düşük sıcaklık ve basınçta gerçekleşmesi ve çok yüksek reaksiyon spesifitesine sahip olması bakımından oldukça etkili bir alternatif olarak görülmektedir. Biyodesülfürizasyon (BDS) çalışmalarında model olarak heterosiklik kükürt bileşikleri, özellikle desülfürizasyonu çok zor olan dibenzotiyofen (DBT) ve alkillenmiş dibenzotiyonfenler (Cx-DBT), kullanılmaktadır (Matsui ve diğerleri). Mikroorganizmalar bu bileşikleri çeşitli metabolik yollarla kullanmaktadır. Bunlar bileşiklerin kısmen oksidize edildiği ve suda çözünebilen ara ürünlerin oluştuğu ya da C-S bağının hedef alındığı metabolik yollardır. Bunlardan en çok tercih edileni yakıtın termal değerinde azalmaya neden olmayan C-S bağ kırılması yolu dolayısıyla bu bağa spesifik mikroorganizmaların kullanımıdır. 4S yolağı olarak bilinen DBT'nin kükürt-spesifik bağ kırılması ile sonuçlanan reaksiyonda son ürün olarak kükürtsüz bileşik 2-hydroxybiphenyl (HBP) ve sülfit/ sülfat oluşmaktadır. DBT biyodesülfürizasyonu yapabilen ve 4S metabolik yolunu kullanan mikroorganizmalara örnek olarak; mezofilik bakteriler: Rhodococcus sp. IGTS8; Rhodococcus erythropolis H-2; Corynebacterium sp.; Bacillus subtilis WU-S2B ve termofilik olarak Mycobacterium pheli WU-F1 verilebilir. Bu bakteriler DBT desülfürizasyonundan sorumlu dszABC operonu ve dszD genlerini bulundurular. Her bir gen ürünü 4S yolağında spesifik bir role sahiptir: DszC bir flavomonooksijenaz olup DBT'nin DBT-sülfon'a oksidasyonundan sorumludur. Bu reaksiyon bir diğer flavomonooksijenaz olan DszA ile 2-HBP-sülfinat bileşiğine dönüştürülür. Son olarak DszB proteini ile sülfinat grubu 2-HBP-sülfinat bileşiğinden uzaklaştırılarak son ürün 2-HBP olarak ortama verilir. Bir oksidareduktaz olan DszD ise DszC ve DszA proteinlerinin aktivitelerine etki eder.Bahsedilen desülfürizasyon genlerine ek olarak termofilik bakterilerde bulunan ve ilk olarak Paenibacillus sp. A11-2'ten izole edilen tdsABC genleri dszABC genleri ile sırasıyla 73%, 61% ve 52% homoloji göstermektedir. Mezofilik ve termofilik mikroorganizmaların DBT desülfürizasyon aktiviteleri sırasıyla 30oC ve 50oC civarı sıcaklık değerlerinde en yüksek değere sahip olması nedeniyle hidrodesülfürizasyon sonrası kükürt giderimi için kullanıldıklarında ekstra bir soğutma işlemi gerekmektedir. Bu nedenle, hipertermofilik mikrobiyal desülfürizasyonun kullanılması soğutma işleminden tasarruf edilmesinin yanı sıra ham petrolün vizkozitesini düşürerek biyodesülfürizasyon işlemini kolaylaştırmaktadır.Hipertermofiller genellikle volkanik bölgelerden izole edilmekte ve çoğunlukla 60oC üzeri sıcaklıklarda etkin büyüme gösteren mikroorganizmalardır. Hipertermoasidofilik bir arkea olan Sulfolobus solfataricus P2, 80-85°C arası sıcaklıkta ve pH 2-4 aralığında optimum büyüme koşulları gösteren ekstrem bir mikroorganizmadır.Bu çalışmada çeşitli organik ve inorganik kükürt bileşiklerinin Sulfolobus solfataricus P2 büyümesi üzerine etkileri ve kullanılma düzeyleri belirlenmiştir. Bu amaçla kükürtsüz ve karbon kaynağının glikoz olarak belirlendiği besiyeri ortamı geliştirilmiştir. Ayrıca bu organizmanın DBT desülfürizasyonunda hangi yolağı kullandığı ve bu yolakta sorumlu olan genler belirlenmeye çalışılmıştır.SFM besiyerinde tek sınırlayıcı faktör olarak kükürt kaynakları kullanılmıştır. Bu amaçla en etkili kükürtsüz büyüme koşulları optimize edilmiştir. Uygun karbon kaynağının belirlenmesi amacıyla son konsantrasyonları 2 g.L-1 olacak şekilde arabinoz, glikoz, mannitol ve etanol kullanılmıştır. En etkili karbon kaynağının glikoz olarak belirlenmesinin ardından glikozun 2, 5, 10, 15 and 20 g L-1 konsantrasyonları kullanılarak optimum glikoz konsantrasyonu belirlenmiştir. Hücre kültürü işlemleri 78oC sıcaklıkta, 160-rpm'de ve 250 ml'lik erlen içerisinde 100 ml besiyeri olacak şekilde yakalaşık olarak 300-350 saat sürdürülmüştür. SFM besiyerinde tek sınırlayıcı faktör olarak kükürt kaynakları kullanılmıştır. Bu amaçla en etkili kükürtsüz büyüme koşulları optimize edilmeye çalışılmıştır. Uygun karbon kaynağının belirlenmesi amacıyla 2 g.L-1 olacak şekilde arabinoz, glikoz, mannitol ve etanol kullanılmıştır. En etkili karbon kaynağının glikoz olarak belirlenmesinin ardından optimal konsantrasyonu bulunmuştur. Hücre konsantrasyonları spektrofotometrik, hücre sayımı ve hücre kuru ağırlığı ölçülerek hesaplanmıştır.Arkeal büyüme üzerine kükürt kaynaklarının etkisini belirlemek amacıyla çeşitli organik ve inorganik kükürt bileşikleri kullanılmış ve bunlara ait büyüme eğrileri elde edilmiştir. Organik kükürt olarak DBT, DBT-sülfon, 4,6-dimetildibenzotiyofen ve benzotiyofen (BT), inorganik kükürt kaynağı olarak elemental kükürt, sodyum sülfit, sodyum sülfat, potasyum persülfat ve potasyum disülfit 0,3 mM konsantrasyonda ve SFM besiyerinde kullanılmıştır. Kükürt kaynaklarının büyüme üzerine etkilerini karşılaştırmak için mikroorganizmalar aynı konsantrasyonda glikoz içeren SFM besiyerinde büyütülmüştür. DBT desülfürizasyon deneyleri için ayrıca DBT'nin farklı konsantrasyonları minimal besiyerine uygulanmıştır. Organik kükürt tüketim miktarları ve ürün oluşumları gaz kromatografi cihazı ile ölçülmüştür. Ayrıca DBT son ürünü olan HBP ölçümü gibbs reaksiyonu ile doğrulanmıştır.Deneysel sonuçlar doğrultursunda en etkili karbon kaynağı olarak glikoz elde edilmiş ve optimum konsantrasyonu 20 g.L-1 olarak belirlenmiştir. Öte yandan, ortamda arabinoz, mannitol ve etanol varlığı hücre büyümesi üzerine önemli ölçüde etki göstermemiştir. Organik kükürt kaynaklarının hücre büyümesi üzerine olumsuz etkileri olması nedeyile bütün kükürt kaynakları ortama belirli hücre konsantrasyonuna erişildikten sonra eklenmiştir. SFM besiyerine uygulanan kükürt kaynaklarından DBT-sülfon ve 4,6-DMDBT büyüme üzerine olumlu etki göstermiş; BT eklenmesi öncelikle hücre büyümesini durdurmuş sonrasında hücre ölümüne neden olmuştur. DBT ise eklendiği andan itibaren büyümeyi durdurucu etki göstermiştir. Kükürt içermeyen besiyeri ile karşılaştırıldığında 4,6-DMDBT ile 2.5 kat, DBT sülfon ile 1.4 kat fazla maksimum hücre yoğunluğu elde edilmiştir. İnorganik kükürt eklenmesi ile hücre büyümesi 4 kata kadar artış göstermiştir. Sodyum sülfit, sodyum sülfat, potasyum persülfat ve potasyum disülfit içeren ortamlarda maksimum hücre büyümesine ulaşıldıktan sonra durağan bir faz gözlenmemiş ve ani bir hücre ölümü gözlenmiştir. Elementel kükür içeren besiyerinde ise logaritmik fazdan sonra uzun bir durağan faza geçiş elde edilmiştir.SFM besiyerinden elde edilen sonuçlar doğrultusunda daha etkili bir desülfürizasyon ve büyüme ortamının belirlenmesi amacıyla besiyerinde bir takım değişiklikler yapılarak yeni bir minimal besiyeri elde edilmiştir. %0.15 oranında maya özütü eklenmesi ve mineral kaynaklarında yapılan değişiklik ile optimal koşul elde edildiklen sonra organik kükürt bileşiklerinin desülfürizasyon miktarları ölçülmüştür. Minimal besiyeri kullanılarak DBT'nin tüketildiği gözlenmiştir. 0.1 mM DBT kullanılarak elde edilen büyüme grafiğine göre maksimum hücre yoğunluğu DBT içermeyen besiyerine göre daha fazla olmuş ve artan DBT konsantrasyonları ile maksimum hücre konsantrasyonları ters orantı göstermiştir. Sonuçlar ayrıca DBT'nin %89'unun ilk 16.5 saatte kullanıldığı ve buna karşılık gelen desülfürizasyon aktivitesinin 1.23 µmol 2-HBP sa-1 g hücre kuru ağırlığı-1 olduğu bulunmuştur. DBT ile yapılan desülfürizasyon çalışmaları sonucu son ürün olarak 2-HBP çıkışı gözlenmiş ve S. solfataricus P2'nin 4S yolağını kullanarak DBT desülfürizasyonu yapabileceği sonucu düşünülmüştür. Bu nedenle DBT desülfürizasyonunda rol alan genlerin belirlenmesi yoluna gidilmiştir. 4S yolağında rol oynayan genler (dszA, dszB, dszC ve dszD genleri) biyoinformatik çalışmalarıyla Sulfolobus sulfataricus P2 genomunda aranmıştır. Elde edilen sonuçlara göre aday bir dszD geni belirlenerek (sso2055) bu genin karakterizasyonu yapılmıştır. Öncelikle ilgili 3 boyutlu yapı I-TASSER algoritması kullanılarak modellenmiştir. Elde edilen yapı dszD proteini ile yüksek benzerlik göstermişti. İlgili gen ekspresyon vektörüne aktarılarak Escherichia coli'de ifade edilmiş ve SSO2055 proteininin purifikasyonu yapılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre ilgili proteinin bir NADH-FMN oksidoreduktaz olduğu belirlenmiştir. 2-HBP veriminin arttırılması amacıyla sso2055 geni maltoz promotoru içeren bir vektöre aktarıldı. Bu şekilde S. solfataricus'a aktarılan vektör vasıtasıyla olası dszD üretimi arttırlarak 2-HBP üretiminin arttırılması amaçlanmıştır. Sulfur oxides emission upon fossil fuels combustion have been considered as a major cause of environmental pollution and acid rain. The conventional hydrodesulfurization (HDS) carried out with chemical catalysis at extremely high temperature (290-450oC) and pressure (1-20 mPa) is the current method for sulfur removal in fossil fuels, but it is not effective to remove heterocyclic organosulfur compounds such as dibenzothiophene (DBT) and substituted DBTs from the fuels. To overcome this problem biological desulfurization (BDS) has been proposed as an attractive alternative or complementary method regarding such heterocyclic organosulfur compounds for its low cost, mild reaction conditions and greater reaction specificity.The organism used in this study for BDS experiments is Sulfolobus solfataricus P2. The ability of the hyperthermophilic archaeon, Sulfolobus solfataricus P2, to grow on organic and inorganic sulfur sources such as dibenzothiophene (DBT), DBT-sulfone, BT, 4,6-dimethyldibenzothiophene, sodium sulfite, potassium disulfite, sodium sulfate, potassium persulfate and elemental sulfur were investigated. A sulfur free mineral medium has been employed and supplemented with different sources of carbon; glucose, arabinose, mannitol and ethanol, as well as different glucose concentrations (2, 5, 10, 15 and 20 g.L-1), to investigate the optimal sulfur free condition for the growth. Specific growth rate was increased and the length of the lag phase was markedly shortened when 20 g.L-1 glucose was employed as a sole source of carbon. Results showed that inorganic sulfur sources display a growth curve pattern significantly different from the curves obtained with organic sulfur sources. S. solfataricus P2 has an ability to utilize DBT and its derivatives, but it lacks BT utilization. When, biodesulfurization of 0.1 mM DBT was investigated in a minimal medium at 78oC, it was found that 88.5% of DBT was consumed by the microorganism and maximum desulfurization rate was obtained as 1.23 µmol 2-HBP h-1 g DCW-1 growing cells within 16.5 h. Isolation and characterization of a flavin reductase homolog gene from S. solfataricus enabled us to further study its contribution to biodesulfurization using recombinant technologies.Therefore, S. solfataricus P2 offers beneficial properties than other desulfurizing mesophilic and/or moderate thermophilic bacteria in the biodesulfurization process of fossil fuels due to its capacity to effectively utilize DBT and its derivatives at hyperthermophilic conditions by the cleavage of carbon-sulfur bond, without lowering the calorific value of fossil fuels. 125

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013, Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2013, Et, içerdiği amino asitler, vitaminler, yağ ve özellikle hayvansal protein ile insan sağlığı için vazgeçilmez bir besin kaynağıdır. Türkiye İstatistik Kurumu’nun (TUIK) 2012 verilerine göre; Türkiye’de yıllık kişi başına tüketilen et miktarı 12 kg’dır. Yine TUIK’in sonuçlarına göre, Avrupa ülkelerinde kişi başına tüketilen et miktarı 30 kg iken Amerika Birleşik Devletlerinde bu sayı 60 kg’a kadar çıkmaktadır. Bu veriler, Türkiye’de et tüketiminin son derece az olduğunu göstermektedir.Artan insan popülasyonu ve et ürünlerinin maliyetlerinin yüksek olması et tüketim oranını her yıl azaltmaktadır. Bu yüzden et üreticileri, fiyatları düşürmek için farklı et türlerini (at, esek, domuz, hindi, ve tavuk) karıştırmaya başlamıştır. Benzer pigmentasyona sahip et türleri (dana ve at, tavuk ve domuz gibi) dondurulduktan sonra veya işlenmiş et ürünlerinde kullanıldıklarında tüketici tarafından algılanması neredeyse imkansız hale gelir. Bu nedenle, köfte, salam, sosis, sucuk gibi ürünlerde sahteciliklerin yapılması oldukça kolaydır. 2013 yılından önceki Türk Gıda Kodeksi’ne göre, et üreticilerinin karıştırdığı hayvan türlerini, ürünlerin etiketlerinde bildirmesi koşuluyla karma et uygulamasına izin verilmekteydi. Ancak, Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı yaptığı çalışmalar sonucunda, piyasada bulunan bir çok ürünün etiketinde, içerdiği hayvan türünün belirtilmediğini tespit etmiştir. Bu durum, 2013 yılında revize edilen Türk Gıda Kodeksi’nde karma et uygulamasının tamamen yasaklanmasına neden olmuştur. Et tür tayini analizlerinde en sık kullanılan yöntemler, protein ve nükleik asit tabanlıdır. Fakat, ısıl işleme maruz kalan ürünlerin protein yapıları bozulduğundan, protein tabanlı yöntemlerin et tür tayini için yetersiz kaldığı bildirilmiştir. DNA tabanlı yöntemlerin, protein tabanlı yöntemlere göre daha avantajlı olduğu düşünülmektedir. DNA molekülü sıcaklığa dayanıklı bir moleküldür, tüm hücrelerde aynı özelligi gösterir ve ayrıca tür hakkında daha fazla bilgi sağlar. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) tabanlı metotlar, belli bir hayvan türüne ait özgü DNA sekansını çoğaltma gücüne sahiptir. Diğer taraftan, konvensiyonel PZR ile kantitatif sonuçlar elde edilemez ve jel elektroforezi gibi PZR sonrası adımlar gerektirdiği için zaman alıcı bir yöntemdir. Kantitatif eş zamanlı PZR (quantitative Real Time PCR- qPCR), hem kalitatif hem de kantitatif sonuçlar sağlar. Bu teknikte, hedef genin çoğalması, floresans işaretleyiciler kullanılarak eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Et tür tayini çalışmalarında, Sybr Green ve oligonükleotit problar en çok kullanılan işaretleyicilerdir. Sybr Green belli bir konsantrasyonun üstünde kullanıldığında PZR reaksiyonunu inhibe edebilir ve ayrıca çoklu hedefleri tespit etmek için uygun değildir. Bu yüzden, yüksek maliyetli olmalarına rağmen oligonükleotit problar en çok tercih edilen işaretleyicilerdir. Alternatif olarak, Yüksek Çözünürlükte Erime xxiv (HRM) boyaları, erime eğrisi analizlerinde, DNA denatürasyonu ile birlikte çok daha ayırt edilebilir sinyal değişimlerine neden oldukları için tercih edilmektedirler. HRM boyaları sadece çift zincirli DNAya bağlanır, bu da boya molekülünü erime sırasında tek zincirli DNAya yeniden bağlanmasını önler ve üstün erime eğrisi çözünürlüğü sağlar. SYBR Green boyalarının aksine, HRM boyaları yüksek konsantrasyonlarda kullanılabilir, çünkü HRM boyaları DNA polimerazı ve PZR reaksiyonunu inhibe etmezler. Ayrıca HRM boyaları Sybr Green ile karşılaştırıldığında hidrojen bağlarına 4 kat daha fazla bağlanır. Bu tezin amacı; et ürünlerinin içerisine karıştırılan farklı et türlerinin (sığır, tavuk, hindi,at, eşek ve domuz) kalitatif olarak varlığını hızlı, güvenilir ve ekonomik bir biçimde tespit edilebilmesi için qPCR tabanlı bir sistem geliştirmektir. Bu çalışmada ilk olarak, 20 dakikadan az bir sürede tamamlanabilen, enzim içermeyen bir DNA izolasyon metodolojisi geliştirilmiştir. Geliştirilen metodoloji, boncuk ile parçalama ve silika kolon yöntemine dayalıdır. Bu metodolojide, hekzadesiltrimetilamonyum bromür (CTAB), guanidin tiyosiyanat ve boncuk ile parçalama uygulaması kullanılmıştır. Guanidin tiyosiyanat ve boncuk ile parçalama uygulaması hücreleri parçalamak için kullanılmıştır. Ayrıca guanidin tiyosiyanat DNA bağlanmasında ve PZR inhibitorlerinin uzaklaştırmasında rol oynar. DNA izolasyon sonuçlarına göre, geliştirilen DNA izolasyon metodolojisi kullanılarak elde edilen DNAların saflıkları ve konsantrasyonları ulaşılmak istenen aralıklarda elde edilmiştir: sırasıyla 1.6-2 ve 50-1000 ng/μl. Elde edilen DNAların kalitesi, qPCR’da bu DNAların 200 nanogramının kalıp DNA olarak kullanılmasıyla sınanmıştır. Elde edilen eşik döngü sayılarının 20’nin altında elde edilmesi, elde edilen DNAların PZR çoğalması için uygun olduğunu kanıtlamıştır. Piyasada mevcut ticari DNA izolasyon kitleri, zaman alıcı reaksiyonlara dayalıdır ve DNA izolasyon işlemi en az 1.5 saat sürmektedir. Bu çalışmada, enzimatik adımlar içermeyen bir DNA izolasyon protokolü geliştirilmiştir. DNA izolatları, sadece fiziksel ve kimyasal hücre parçalamasıyla elde edilmiştir. Bu da, toplam analiz süresinin (20 dakikadan az) ve DNA izolasyonun maliyetini önemli ölçüde azaltmıştır. Bu zamana kadar yapılan çalışmalarda, genellikle 12S rRNA, sitokrom b geni ve 16S rRNA gibi evrensel mitokondriyal genler, et türüne özgü prop dizaynı için hedef olarak seçilmişlerdir. Bu durum, özgüllük problemlerine neden olabilmektedir. Mitokondriyal genler son derece korunmuş genlerdir, bu yüzden at ve eşek gibi aynı cinse ait türler arasında ayrım yapmak zordur. Daha özgül sonuçlar elde etmek için, bu çalışmada her bir hayvan türü için yüksek derecede değişken gen bölgelerin çoğaltılmasına odaklanılmıştır. Bu yaklaşım sayesinde, özgül olmayan çoğalmalar önlenmiş ve validasyon çalışmaları için iş akışı kolaylaştırılmıştır. Bu çalışmada geliştirilen qPCR metodolojisi, tekli ve çoklu DNA tiplerini hedef alacak şekilde dizayn edilmiştir. Bu metodoloji sayesinde, tek bir HRM boyası (EvaGreen) kullanılarak, farklı PZR ürünlerinin, erime sıcaklığı (Tm) farklılıklarına göre çoklu tespit yapılmıştır. Referans et örneklerinin qPCR sonuçlarına göre; hedefe özgü erime sıcaklıkları at için 82.02 ± 0.29˚C, domuz için 84.3˚C ± 0.32˚C, eşek için 78.80 ± 0.38˚C, hindi için 84.86 ± 0.29˚C, tavuk için 81.91 ± 0.34˚C ve sığır için 86.96 ± 0.31˚C olarak belirlenmiştir. Hindi/sığır, tavuk/sığır, tavuk/hindi, domuz/eşek, eşek/at, domuz/at ikili karışımlarının qPCR denemelerinde ve hindi/tavuk/sığır, domuz/eşek/at üçlü qPCR denemelerinde, istenilen hedeflere özgü olan birden fazla erime sıcaklığı tespit edilmiştir. xxv Tespit limitini (Limit of Detection –LOD) belirlemek için; 10 gramlık et karışımları hazırlanmıştır. Sırasıyla hedeflenenler hayvan eti, sığır eti ile karıştırılmıştır. Sığır etiyle karıştırılan her hayvan türü , karışımda 1 – 100 kopya gen sayısı bulunduracak şekilde karışımlar yapılmıştır. Sığır etinin 1 gramında tespit limiti; tavuk için 4 gen kopya sayısı; hindi için 3 gen kopya sayısı; at , eşek ve domuz için ise 1 kopya gen sayısı olarak belirlenmiştir. Bununla birlikte, standart et karışımları akredite referans laboratuvarlar tarafından hazırlanmadığı için, gerçek LOD’nin kabaca tahmini yapabilmek için bu çalışmalar yürütülmüştür. Türkiye gıda piyasasına sunulması planlanan çiğ ve işlenmiş et ürünleri geliştirilen yöntemle başarıyla analiz edilmiştir. Numuneler akredite gıda kontrol laboratuvarları tarafından sağlanmıştır. Analiz edilen numune tipleri köfte, döner, sucuk, salam ve sosis gibi işlenmiş ürünler ve bir et üretim tesisinin üretim tezgahlarından alınan sürüntü numuneleridir. Analiz edilen toplam 83 örnekten; 24 tanesinin tavuk eti, 9 tanesinin hindi eti ve 1 tanesin domuz eti içerdiği tespit edilmiştir. Sonuçların doğruluğu, DNA sekanslama yöntemi kullanılarak onaylanmıştır. Geliştirilmiş olan bu yöntemin, mevcut PZR tabanlı yöntemlere göre en az iki kat daha hızlı olduğu ve 75 dakika içinde hassas sonuçlar verebildiği kanıtlanmıştır. Et türü tayini için kullanılan mevcut qPCR tabanlı yöntemler yüksek zaman ve maliyet gerektirmektedir. Bunun temel nedeni DNA ekstraksiyonu ve qPCR adımlarındaki uzun inkübasyon süreleri ve yüksek sarf maliyetleridir. Bu çalışmada bu sorunlara çözüm getirmek için yeni bir sistem geliştirilmiştir. Bu sistemin başarısının altında enzim içermeyen DNA protokolü ve tek HRM boyası ile yapılan çoklu hedef tespiti yatmaktadır. Bu çalışmada ilk defa, farklı hayvan türlerinden çoğaltılmış üç farklı hedef DNA qPCR’da tek bir boya kullanılarak, Tm’lerindeki farktan faydalanılarak ayırt ve tespit edilebilmiştir. Elde edilen sonuçlar geliştirilen yöntemin 75 dakikadan kısa bir sürede hassas sonuçlar verebileceğini göstermiştir. Böylelikle mevcut PCR tabanlı et türü tayin yöntemlerine nazaran en az 2 kat daha hızlı sonuç elde edilebilmiştir. Bu çalışmada geliştirilen qPCR’a dayalı metodoloji, ısıl işlem görmüş et karışımlarında at, eşek, domuz, tavuk ve hindi etlerinin hızlı ve rutin tespitleri için potansiyel bir moleküler araç olarak kullanılabilir. Türe özgü primerlerin kullanılması, bu metodu çiğ ve işlenmiş etlerin tespitinde son derece hassas kılmaktadır. Diğer taraftan, geliştirilen bu metodolojinin, akredite gıda kontrol labaratuvarları tarafından hazırlanan referans örnekler kullanılarak validasyonu yapılmalıdır., Meat contains amino acids, vitamins, fat and especially animal proteins, which are extremely important for human health. According to data from Turkish Statistical Institute (TUIK) meat consumption per capita in Turkey was 12 kg in 2012. The meat consumption per capita in United States of America (U.S.A.) and European Union (EU) are approximately 60 kg and 30 kg, respectively. These data show that; meat consumption in Turkey is lower than EU and U.S.A. Increasing human population and the cost of meat products have resulted in gradual decreases in meat consumption over the years. So that, the manufacturers started to mix different meat types (horse, donkey, pig, turkey and chicken) to reduce the costs. If the food is frozen and processed, it becomes impossible for consumer to differentiate the meat type which has similar pigmentation (beef- horse, chicken-pork, etc.). Therefore, forgery is commonly encountered within the production of meatball, sausage and salami. According to the Turkish Food Regulations before 2013, mixed meat application is permitted as long as the producers state the mixed meat types on the label. On the other hand, the Ministry of Food, Agriculture and Livestock has determined undeclared mixed meat applications in the Turkish Food Market. This has led to the new regulations in 2013, which strictly prohibited the mixed meat application. Protein and nucleic acid-based methods have been commonly used for meat species identification. The protein-based methods have been reported to be inadequate for the meat species identification since the protein structures deformed in thermally processed foods. DNA based methods have been considered to be more advantageous than the protein based methods. DNA is thermo-stable, shows the same features in all cells and provides more information about the species. Polymerase chain reaction (PCR) based methods have a power of amplifying a specific DNA molecule that belongs to a certain animal species. On the other hand, the conventional PCR cannot provide quantitative results and the post PCR steps such as gel electrophoresis make it time consuming. Quantitative Real Time PCR (qPCR) can provide both qualitative and quantitative results for meat type identification. In this technique, amplification of the target gene can be monitored online by the use of fluorescent reporters. The most commonly used reporters in meat type detection are Sybr Green dye and the oligonucleotide probes. Sybr Green can inhibit PCR reactions if used above a certain concentration and it cannot be used for detection of the multiple targets. This is why the oligonucleotide probes are the most frequently used reporters despite of their high costs. As an alternative, High Resolution Melting (HRM) dyes are preferred for use xx with melting curve assays due to the more discrete signal change occurring upon DNA denaturation. HRM dyes only bind to double stranded DNA that prevents the dye molecule from redistribution during melting and provides superior melt curve resolution. Unlike SYBR Green dye, HRM dyes can be used at high concentrations because they do not inhibit DNA polymerases and PCR reaction. HRM dyes great ability to bind the hydrogen bond almost 4 times more than SYBR Green. The aim of this study, develop a quick, reliable and low-cost qPCR based methodology to qualitatively detect different meat species (cattle, chicken, turkey, horse, donkey and pig) in food products. Firstly in this study, an enzyme free DNA extraction methodology which can be completed in less than 20 minutes was developed. The developed methodology was based on bead beating treatment and silica column method. In this methodology, hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), Guanidinium thiocyanate and bead beating were used to disrupt the cells. Guanidinium thiocyanate also acted in PCR inhibitor removal and DNA binding. The results showed that the purities and concentrations of the DNA extracts obtained using the developed DNA extraction methodology were in the desirable ranges: 1.6-2 and 50-1000 ng/μl, respectively. The obtained DNA qualities were also assessed by using 200 ng of the template DNAs in qPCR. The obtained threshold cycle numbers were less than 20, which implied that the obtained DNAs were suitable for PCR amplification. The current commercially available DNA extraction kits are based on time-consuming reactions that are completed in at least 1.5 hours. In this study, we have developed a DNA extraction protocol, which does not include enzymatic steps. The DNA extracts were obtained via only the physical and the chemical cell disruption. This has significantly decreased the total time (less than 20 minutes) and the cost of the DNA extraction. Universal mitochondrial DNA sequences such as; 12S rRNA, cytochrome b and 16S rRNA genes have generally been chosen as the target for meat type specific probe design. This has led to specifity problems in the detections. Mitochondrial genes are highly conserved so that differentiation is difficult between the species that belongs to the same genus such as; horse and donkey. To obtain more specific results, we concentrated on the amplification of highly variable gene regions for the each animal type. This approach prevented the non-specific amplifications and led to easier workflow for the validation studies. The qPCR methodology was designed to target both single and multiple DNA types. The multiple detection was based on melting temperature (Tm) differences of the different PCR amplification products with a single HRM dye (EvaGreen). The qPCR trials on the reference meat samples showed that the target specific melting peaks can be obtained at 82.02 ± 0.29˚C for horse, 84.3˚C ± 0.32˚C for pig, 78.80 ± 0.38˚C for donkey, 84.86 ± 0.29˚C for turkey, 81.91 ± 0.34˚C for chicken and 86.96 ± 0.31˚C for cattle. Q-PCR trials on the binary mixtures of turkey/cattle, chicken/cattle, turkey/chicken, pig/donkey, donkey/horse and horse/pig and triple mixtures of turkey/chicken/cattle and pig/donkey/horse resulted in multiple melting peaks that are specific to the intended targets. To obtain the limit of detection (LOD), 10 g standard meat mixtures that contain 1-100 copies of the additive meat type DNA were prepared. The LODs were 4 chicken copies/gr cattle sample, 3 turkey gene copies/gr cattle sample, 1 horse gene copy/gr cattle sample, 1 donkey gene copy/gr cattle sample and 1 pig gene copy/gr cattle sample. xxi On the other hand, since the standard meat mixtures were not obtained from an acredited reference laboratory, the detected LODs were rough estimations of the real LODs. Commercial samples which are intended to be introduced to the Turkish food market were screened. The commercial samples were obtained from acredited food laboratories. The sample types were sucuk, doner kebap, beef sausage, beef salami and the swab samples from meat production benches. 24 chicken, 9 turkey and 1 pig meat positive samples were detected among the 83 screened samples. The results were also confirmed via the DNA sequencing of PCR products. The currently available qPCR based meat type identification methodologies are time and money consuming. The main reasons behind these are the long incubation times and high costs of the available DNA extraction and the multiplex qPCR methodologies. In this study, a new system was developed to overcome these problems. This was achieved via an enzyme free DNA extraction methodology and a multiplex qPCR using a single HRM dye. For the first time, this study introduced discrimination of three different qPCR amplicons from various animal specific gene products based on the differences in Tms. The overall results proved that the developed method could give sensitive results in less than 75 minutes, which is at least two times faster than the currently available PCR-based methods for meat type detection. The qPCR based methodology developed in this study is a potential molecular tool that can be used in rapid and routine detection of horse, donkey, pig, chicken and turkey meats present in heat treated meat mixtures. The use of species-specific primers makes the method very sensitive for determination in raw and processed meats. On the other hand, the methodology must be validated using the reference samples prepared by reference accredited food control laboratories., Yüksek Lisans, M.Sc.

Çok fonksiyonlu apoptoz karşıtı Bag-1 proteini (Bcl-2 assosiye gen) hücre içerisinde önemli fonksiyonları olan nuclearhormone reseptörleri, Bcl-2 proteini, Hsp70/ Hsc70 ısı şok proten ailesi, büyüme hormone reseptörleri, Raf-1 serin/treoninkinaz ailesi gibi birçok molekül ile etkileşimde bulunmaktadır. Bu nedenle, Bag-1 hücre büyümesini ve proliferasyonunu, hücre sinyal yolaklarını ve apoptoz mekanizmasını düzenlemede rol almaktadır. Bag-1 proteinin hücre içerisinde farklı yerlede lokalize olan 3 izoformu bulunmaktadır. Bag-1L izoformu 50 kDa olup, nüklear lokalizasyon sinyali (NLS) sayesinde nukleusta konumlanmaktadır. Bag-1M izoformu 46 kDa olup nukleus ve sitoplazma arasında konumlanmaktadır. Bag-1S ise 36 kDa olup sitoplazmada lokalize olmuştur.Birçok kanser çeşidinde Bag-1?ın ekspresyon seviyesinde artış görülmektedir. Bu artış, Bag-1?ın etkileşimde bulunduğu moleküller ile gerçekleşmekte ve en önemli etkileşimini Bcl-2 ve Hsp70 ile göstermektedir. Bu sayede Bag-1 çeşitli stres faktörleri karşısında hücrelerin sağ kalımını arttırıcı etki göstermektedir. Kanser tedavilerinde klasik kemoterapötik ilaç uygulamaları uzun süredir kullanılmaktadır ancak kanser gelişiminde rol oynayan bazı genlerin geçici olarak susturulması ve protein ekspresyon seviyelerinin azaltılması ile hücreleri ölüme götürmeyi hedeflemek yeni uygulamalardan biridir. Bu yöntem ile hem ilaçların yan etkilerini azaltılmakta hem de hücrelerin ilaçlara karşı oluşturduğu resistans mekanizması ortadan kaldırılmaktadır. Bu nedenle çalışmamızda, Bag-1?ın geçici olarak susturulmasının MCF-7 hücrelerinde sisplatin ya da paklitaksel ile tetiklenenapoptotik mekanizmadaki rolü araştırılmıştır.Öncelikle zamana bağlı sisplatin ya da paklitaksel uygulamasının MCF-7 hücrelerinin sağ kalımını azalttığı MTT Hücre canlılığı testi ile gösterilmiştir. Her iki ilacın da Bag-1 ekspresyonunu azalttığı immünoblotlama ile gösterilmiştir. Bag-1?ın geçici olarak susturulmasının tüm izoformlar üzerinde etkili olduğu ve susturulmayı takiben uygulanan sisplatin ya da paklitakselin Bag-1 ekspresyonunu oldukça azalttığı immunoblotlama ile gösterilmiştir. Bunun yanında, Bag-1 siRNA uygulaması ile birlikte sisplatin ya da paklitakselin tetiklediği apoptozda, hücrelerin morfolojik olarak gösterdiği değişiklikler gösterilmiştir. Apoptozun önemli göstergelerinden olan DNA kırıklarının oluşumu, nüklear kondensasyon, mitokondri membran permeabilitesindeki azalma ya da apoptotik ve lizozomik vesiküllerin oluşumu PI, DiOC6, AO/EB ve DAPI boyaması ile gösterilmiştir. Pro-apoptotik ve anti-apoptotik Bcl-2 ailesi proteinlerinin ekspresyon seviyelerindeki değişiklik sisplatin ya da paklitaksel uygulanan MCF-7 normal ve Bag-1 susturulmuş hücrelerde immünoblotlama ile gösterilmiş ve pro-apoptotik Bcl-2 ailesi proteinlerinin ekspresyon seviyelerinde artış gözlenirken, anti-apoptotik Bcl-2 ailesi proteinlerinin ekspresyon seviyelerinde azalma gözlenmiştir. Çoğu kanser tipinde mutasyona sahip olan tümör supressör p53 proteininin ve p53?ün hedef genlerinin ürünleri olan Puma ve Noxa proteinlerinin ekspresyon seviyelerindeki değişiklik Bag-1?ın susturulduğu hücrelerde cisplatin ya da paclitaxel varlığında çalışılmıştır. Bunun yanında akım sitometrisi ile Bag-1?ın hücre siklusu üzerindeki etkisi araştırılmış ve Bag-1 susturulmasını takiben uygulanan ilaçların apoptoz göstergesi olan sub-G1 fazında artışa neden olduğu gösterilmiştir. Hücre siklusunda önemli görevleri olan siklinler ve sikline bağlı kinaz proteinlerinin ekspresyon seviyelerindeki değişiklik incelenmiştir. Kullanılan cisplatin ya da paclitakselin, çeşitli kanser tiplerinde G2/M fazında hücre döngüsünde tutuklanmaya sebep oldukları bilinmektedir ancak Bag-1 siRNA hücre döngüsünde meydana gelen değişiklikler daha önce araştırılmadığı için, bu çalışmanın amaçlarından birisi olmuştur. Apoptoz yolağının en önemli parametrelerinden birisi olan kaspazların aktif hale gelmesi ve kaspaz yolağını aktive etmeleri cisplatin ya da paclitaksel uygulanan Bag-1 susturulmuş ve doğal tip hücrelerde zamana bağlı olarak araştırılmıştır. Zamana bağlı ilaç uygulamaları ile kaspazların kesilmiş formlarında artış gözlemlenmiş ve Bag-1 siRNA varlığında bu kesilmiş formların ekspresyon seviyelerinde artış gözlemlenmiştir. Bag-1?ın ekspresyon seviyesindeki değişimin hücrelerin büyümesi, canlılığı, proliferasyonu ve apoptoz mekanizması üzerinde farklı etkilere sahip olduğunun doğrulanması amacı ile Bag-1?ın geçici olarak susturulmasının yanında Bag-1L genine sahip plazmid vektör transfeksiyonu ile MCF-7 hücrelerinde Bag-1?ın stabil olarak ekspresyonu arttırılmıştır. Bag-1ın ekspresyon seviyesindeki artışın hücrelerin sağ kalımında ve proliferasyonunda artışa neden olduğu belirlenmiş ve ekspresyon seviyesindeki bu artışın sisplatinya dapaklitaksel uygulamalarına karşı koruma meydana immünoblotlama ile gösterilmiştir.Bag-1 proteinin sisplatin ya da paklitaksel ile tetiklenen apoptoz mekanizmasındaki rolü Polyamin metabolizması ile ilişkilendirilerek araştırılmıştır. Hücrelerin canlılığının korunma, çoğalma ve büyüme mekanizmalarında rol oynayan poliaminleramin türevli organik bileşiklerdir. Birçok farklı kanser tipinde hücre içi poliamin miktarlarında artış gözlemlenmiştir. Putresin, spermidin ve spermin bu mekanizmalarda görev alan önemli poliaminlerdendir ve biyosentezleriOrnitinDekarboksilaz (ODC) enzimi ile kontrol edilirken, katabolik yolakları Poliaminoksidaz (PAO) ve Spermidin/spermin-N1-asetiltransferaz (SSAT) enzimi ile kontrol edilmektedir. Bag-1 aşırı ekspresyonuna sahip hücrelerde normal hücrelere kıyasla ODC ekspresyonu artış gösterirken, Bag-1?ın susturulmasının da katabolik enzimlerden PAO ve SSAT ekspresyonunda artışa sebep olduğu immunoblotlama ile belirlenmiştir. Poliamin yolağının yan ürünleri olarak açığa çıkan Reaktif Oksijen Türleri (ROS), Bag-1?ın susturulması ile artış göstermektedir. Özetle, bu çalışmanın en önemli amacı Bag-1?ın susturulmasını takiben uygulanan ilaçlar varlığında tetiklenen apoptotik mekanizmasının farklı parametreler ile gösterilmesidir. Bunun için kullanılan parametler, apoptozun hangi yoldan ilerlediği, bunun için hangi protein ya da protein ailelerine bağlı kaldığını açığa çıkarmaktadır. Kanser hücrelerinin apoptoza yönelmesinde ilaç uygulamalarının yan etkilerini ortadan kaldırmaya yönelik olarak geliştirilen yeni çalışmalarda Bag-1 siRNA? nın potansiyel kullanımını arttırmak amaçlanmaktadır. The multifunctional anti-apoptotic Bag-1 (Bcl-2 athanogene) protein has several interaction partners, such as nuclear hormone receptors, anti-apoptotic Bcl-2 protein, Hsp70/Hsc70 heat shock protein family, growth hormone receptors, Raf-1 serine threonine kinase family, that have important roles in cell involving the regulation of cell survival, cell proliferation, cell signalling and apoptosis. Bag-1 protein consists of three different isoforms produced by alternative translation from the same mRNA. Bag-1L (50 kDa) is the least expressed isoform of Bag-1 and localized in the nucleus due to its Nuclear Localization Signal (NLS). Bag-1M (46 kDa) partitions betweenthe nucleus and the cytoplasm.Bag-1S (36 kDa) is the most expressed isoform of Bag-1 localized in the cytoplasm. Elevated levels of Bag-1 expression were observed in various cancer cells, thereby, linking the overexpression of Bag-1 with the development of cancer. The most striking interactions of Bag-1 are with Bcl-2 and Hsp 70. These interactions of Bag-1 can enhance the survival potential of cancer cells against stress conditions. Classical chemotherapeutic drugs has been used for many years for the treatment of various cancer types, but the downregulation of some genes that have roles in cancer development represents a new approach to enhance the cell death mechanism. By this way, the side effects of drugs or resistance to drugs can be minimized. With this motivation, we decided to examine the effects of Bag-1 silencing in cisplatin or paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 cells.We determined that cisplatin and paclitaxel decreased the cell viability of MCF-7 cells in a time and dose dependent manner, as confirmed with the MTT cell viability assay. Therefore, both drugs were used to induce apoptosis in MCF-7 cells. We showed that silencing of Bag-1 was effective to downregulate all Bag-1 isoforms, and cisplatin or paclitaxel treatment following Bag-1 silencing abolished the Bag-1 expression whichwas investigated by immunoblotting analysis. We determined the effect of cisplatin or paclitaxel and/or Bag-1 silencing in cell proliferation or cell death mechnanisms of MCF-7 cells by trypan blue dye exclusion assay and apoptotic cell death Elisa assay. The most important features of apoptosis are DNA fragmentation, nuclear condensation, cell shrinkage, mitochondrial membrane permeabilization loss andmembrane blebbing. We observed these signs of apoptosis in cisplatin or paclitaxel and/or Bag-1 siRNA treated MCF-7 cells by propidium iodide (PI), DiOC6, acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) and DAPI staining. The role of Bag-1 silencing in cisplatin or paclitaxel-induced apoptosis was investigated by comparing the expression levels of anti-apoptotic and pro-apoptotic Bcl-2 family members usingimmnublotting assay. It was observed that each drug was effective to downregulate the anti-apoptotic Bcl-2 family members (Bcl-2 and Bcl-xL) and upregulate the pro-apoptotic Bax, Bak, Bid, Bad, Noxa and Puma expression, and silencing of Bag-1 enhanced these effects. Cell cycle machinery was analyzed by flow cytometer to observe the apoptotic functions of drugs and/or Bag-1 siRNA and it was found that Bag-1 silencing caused the accumulation of sub-G1 phase which is indicative of apoptosis.To confirm that Bag-1 expression level was important for cell proliferation, cell survival or apoptotic mechanism, MCF-7 cells were transfected with human specific Bag-1L plasmid and stable colonies were selected. We examined that Bag-1L overexpression upregulated Bag-1 isoforms, enhanced the cell proliferation potential and decreased the apoptotic potential of both drugs was investigated by immunoblotting and cell death Elisa assay. The functional role of Bag-1 in cisplatin or paclitaxel-induced apoptosis in association with polyamine signaling pathway was investigated in polyamine (PA) metabolism. Elevated intracellular polyamines are generally proposed as a final consequence of deregulated polyamine metabolism in cancer cells. Polyamines; putrescine, spermidine and spermine, are regulated by the biosyntheticornithine decarboxylase (ODC) enzyme and catabolic polyamine oxidase (PAO) and Spermidine/spermine-N1-acetyltransferase (SSAT) enzymes. However, overexpression of Bag-1 led to upregulation of ODC levels, silencing of Bag-1 caused the upregulation of PAO and SSAT levels. In addition, silencing of Bag-1 increased the generation of byproducts of PA metabolism, Reactive Oxygen Species (ROS), on during cisplatin or paclitaxel-induced apoptosis. 130

Genetik mühendisliği teknikleri ile modifiye edilen veya üretilen besin bitkileri geleneksel olarak genetiği değiştirilmiş (GD) bitkiler veya genetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO) olarak isimlendirilir. Genetiği değiştirilmiş bitkilerin ekim alanları 1996 yılından 2012 yılına 100 kat artarak, GD bitkileri yakın tarihimizin en hızlı uyum sağlanan ürün teknolojisi haline getirmiştir. Farklı kurumsal yapıların ve araştırmacıların çalışmaları incelendiğinde genetiği değiştirilmiş organizmaların insan sağlığı ve çevre üzerine riskleri ile ilgili farklı sonuçların ortaya konulduğu görülmektedir. GD bitki ve ürün çeşitlerinin varlığının ve miktarının izlenmesi ve doğrulanması için düzenleme ihtiyacı GD bitki ve ürünlerin dünya çapında marketlerde görülmesi ile artmıştır. Bu nedenle, bitki ve bitki ürünlerinde GDO çeşitlerinin tespiti için güvenilir, hızlı ve düşük maliyetli methodların geliştirilmesine ihtiyaç vardır.GDO analizinde ilk adım genellikle GDO' larda bulunan promotör veya terminatörler bölgelerinin taranmasıdır. GDO pozitif olarak tespit edilen örnekler üzerinde daha sonra kalitatif ve kantitatif olay spesifik ileri analizler pozitif tespitin kontaminasyondan kaynaklanmadığından emin olunması için gerçekleştirilmelidir. Bu durum GD ürünlerin etiketlenmesi için tanımlanmış eşik seviyelerinin olduğu ülkelerde de ciddi bir öneme sahiptir.Eş zamanlı PZR GDO tespiti ve kantifikasyonu için en yaygın kullanılan tekniktir. Bu teknik ile hedef genin çoğalması, floresan boyalar kullanılarak eş zamanlı olarak görüntülenebilir. En sık kullanılan floresan boyalar oligonükleotid problar, yüksek çözünürlükte erime boyaları ve DNA bağlama boyalarıdır. En spesifik tespit sadece hedef dizilerine bağlanan oligonükleotid problar kullanılarak yapılabilir. Bu nedenle yüksek maliyetli olmalarına rağmen oligonükleotit problar en çok tercih edilen floresan boyalardır. DNA bağlama boyaları ve yüksek çözünürlükte erime boyaları çift iplikli DNA molekülüne bağlanırlar. DNA bağlama boyaları belli bir konsantrasyonun üstünde kullanıldığında PZR `ı inhibe edebililir. Yüksek çözünürlükte erime boyalarının minimum PZR inhibisyon etkisi vardır. Ayrıca yüksek çözünürlükte erime boyaları DNA bağlama boyaları ile karşılaştırıldığında hidrojen bağlarına 4 kat daha fazla bağlanır ve üstün erime eğrisi çözünürlüğü elde edilir.Eş zamanlı PZR ile GDO tespitinde en çok hedeflenen diziler karnabahar mozaik virüse ait 35S promotörü (p35S); karnabahar mozaik virüse ait 35S terminatorü (t35S); figwort mozaik virüse ait 35S promotörü (FMV); Agrobacterium tumefacien?e ait nopalin sentaz geni terminatörü (tNOS), nopalin sentaz promotörü (pNOS) ve 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate sentaz (epsps) geni; Streptomyces hygroscopicus?a ait bar geni (BAR); Streptomyces viridochromogenes?a ait phosphinotricin-Nacetyltransferases (pat) genleridir.Bu çalışmada, GDO' lu bitkilerin %99 'undan fazlasının içerdiği karnabahar mozaik virüse ait 35S promotörü (p35S); figwort mozaik virüse ait 35S promotörü (pFMV); Agrobacterium tumefacien?e ait nopalin sentaz geni terminatörü (tNOS) dizilerinin aynı anda tespiti için tek bir yüksek çözünürlükte erime (HRM) boyası kullanılarak çoklu eş zamanlı PZR methodu geliştirildi. Farklı PZR ürünleri arasındaki ayrım hedef DNA' ların erime sıcaklıkları farklılıklarına dayalı olarak yapılmıştır. Ayrıca, bu elementlerin taranması için gerekli olan toplam analiz süresini kısaltmak için enzim içermeyen DNA ekstraksiyon yöntemi geliştirildi. PZR tabanlı metodolojilerde hassas ve etkili sonuçlar elde etmek için yüksek kaliteli DNA gereklidir. Bu çalışmada, yüksek miktarda ve kalitede DNA elde etmek için soya ve mısır örnekleri üzerinde 5 farklı silika kolon tabanlı DNA ekstraksiyon protokolleri denenmiştir. Protokollerin üçü enzimatik adımlara dayanırken diğer 2 protokol ise tamamen kimyasal ve fiziksel hücre parçalama yöntemine dayanmaktaydı. Yöntemlerin hepsinde guanidin tiyosiyanat PZR inhibitörü inaktivasyonu ve DNA bağlanması için bir kaotropik ajan olarak kullanılmıştır. GDO tespiti için mevcut DNA ekstraksiyon metodolojileri en az 1,5 ?g DNA ve 1.6 ve 2.0 arasında A260/280 oranı ile sonuçlanmalıdır. Tüm geliştirilmiş methodlardan elde edilen DNA ekstraktların A260/280 oranı istenilen aralıkta elde edildi. Tüm protokoller ile minimum limitden en azından 10 kat daha fazla olan 15 ?g? dan daha fazla DNA elde edildi. DNA konsantrasyonu açısından en iyi sonuçları boncukla homojenizasyon ve hekzasetiltrimetil amonyum bromür (STAB) muamelesi içeren protokollerden elde edilmiştir.Proteinler 280 nm? de absorbladığı için A260/A280 oranı DNA ektraktlarındaki proteinlerin varlığının hesaplanmasında kullanılır. Diğer taraftan, karbonhidratlar, fenoller, aromatik bileşikler ve ağır metaller gibi diğer tip PZR inhibitörlerinin varlığı da PZR sonuçlarını etkileyebilir. Karşılaştırmalı olarak eş zamanlı PZR verimliliğine farklı protokoller ile elde edilen DNA kalitesinin etkisini değerlendirmek için her protokolden aynı miktarda DNA kullanılarak eş zamanlı PZR gerçekleştirildi. Eş zamanlı PZR çalışmalarında genel bitki kloroplast DNA' sını hedefleyen PZR primerleri kullanıldı. DNA konsantrasyonu ve saflığı farklı protokollerden elde edilen tüm seyreltilmiş DNA' lar için aynı olması nedeniyle elde edilen Ct değerleri PZR inhibitörlerinin varlığına işaret etmiştir. Tüm DNA örnekleri bitki kloroplast DNA' sına spesifik erime sıcaklığında pik vermiştir. Boncuk ile homojenizasyon ve STAB muamelesini içeren protokoller ile elde edilen DNA' lardan elde edilen eşik döngüsü değerleri diğer protokollere göre yaklaşık olarak 2 döngü daha düşük olarak bulunmuştur. Bu durum PZR inhibitörlerinin elimine edilmesinde bu iki protokolün daha başarılı olduğunu gösterdi. Bu iki protokol arasındaki fark proteinaz K muamelesi adımının dahil edilmesidir. DNA izolasyonu için gerekli olan maliyet ve toplam süreyi azal°ak amacıyla proteinaz K içermeyen protokol seçildi. FMV, NOS, 35S pozitif referans gıda örnekleri akredite gıda kontrol laboratuarları tarafından temin edilmiştir. FMV, NOS, 35S pozitif gıda örneklerinden çıkarılan DNA? lar hedef spesifik primer çiftleri kullanılarak çoğaltıldı. Amplifikasyon döngülerinden sonra erime eğrisi analizi gerçekleştirildi ve hedeflenen PZR ürünlerinin Tm' leri hesaplandı. Hedef spesifik erime pikleri NOS spesifik reaksiyon için 73 ± 0.38?C' de, FMV spesifik reaksiyon için 80?C ± 0.28?C' de, 35S spesifik reaksiyon için 82.26 ± 0.29?C' de ve bitki kloroplast DNA' sına specifik reaksiyon için 82 ± 0.33?C' de elde edildi. Genellikle aynı amplikon için Evagreen kullanılarak yapılan eş zamalı PZR ile elde edilen erime sıcaklıkları 0.5 ve 1 ?C arasında değişebileceği kabul edilmektedir. Bu çalışmada elde edilen standart sapmalar 0.4? C ?den daha düşük bulunmuştur. Ayrıca, bütün Evagreen eş zamanlı PZR reaksiyonları önemli ek amplifikasyon ürünleri olmadan tek bir spesifik sinyal üretmiştir.Eş zamanlı PZR kantifikasyon standatları referans örneklerin purifiye edilmiş PZR ürünleri kullanılarak hazırlandı. Seri dilüsyonlar hedeflenen genin 100-1010 kopyasını içeren standart örnekler hazırlanması için yapıldı. Tespit limitini elde etmek için gr örnek başına 1-100 kopya 35S ve NOS içeren soya örnekleri ve gr örnek başına 1-100 kopya FMV içeren mısır örneği hazırlandı. 35S, FMV, NOS hedefli methodolojiler için tespit limiti 1 gen kopya/gr gıda örneği olarak bulunmuştur. Ancak bu çalışmada standart karışımlar referans gıda kontrol laboratuvarından elde edilmediği için methodların tespit limitleri geçek tespit limitlerinin sadece kaba tahminleridir. 35S, NOS ve FMV kalıplarının DNA karışımı primerlerin spesifikliğini test etmek için hazırlanmıştır. DNA karışımı her spesifik primer çifti ile eş zamanlı PZR ile çoğaltıldı. Eş zamanlı PZR reaksiyonlarının spesifikliği tüm amplifiye PZR ürünlerinin sekanslanması ile incelenmiştir. Sonuçlar çoğaltılmış dizilerin amaçlanan hedeflere en az %99 benzer olduğunu göstermiştir.İlk olarak dubleks eş zamanlı PZR denemeleri her farklı DNA kalıplarının aynı miktarda eklenmesi ile gerçekleştirildi. Dubleks reaksiyonlarda daha fazla PZR ürünleri ile sonuçlanan daha fazla tercih edilen DNA kalıpları erime eğrisi analizi ile tespit edildi. FMV kalıplarından reaksiyonlarda daha fazla PZR ürünü elde edildi. 35S kalıpları ise 35S ve NOS kalıpları içeren PZR' larda daha fazla tercih edildi. Dubleks PZR' larda farklı ilk örnek miktarının etkisini belirlemek için sadece tek bir tip Tm piki elde edene kadar çalışmalara devam edildi. Genel sonuçlar iki farklı Tm piki 1/100 rölatif kalıp konsantrasyonları altında elde edilemezken iki farklı Tm piki 1/100 rölatif kalıp konsantrasyonları üzerindeki her hedef için elde edilebildiği gösterildi. Başarılı ikili karışım denemelerinden sonra her bir referans örnekten 1000 kopya kullanılarak üçlü karışım hazırlandı. Üç primer çiftinin çoklu eşmanalı PZR' da beraber çalışabildiğini göstermek ve spesifik olmayan PZR ürünü veya primer dimeri oluşturmadığını göstermek için üçlü eş zamanlı PZR çalışmaları gerçekleştirildi. Üçlü kombinasyonlar referans örneklerin 1/1/1 röfatif kopya sayısı oranına uygulanmıştır. NOS, FMV ve 35S spesifik çoklu eş zamanlı PZR 3 farklı erime piki elde edilmesi ile sonuçlandı. NOS, FMV ve 35S hedeflerine karşılık gelen erime pikleri sırasıyla 73.04±0.13?C, 80.21±0.10?C ve 82.15±0.08?C' de gözlenmiştir. Çoklu reaksiyonlarda ek amplifikasyon gözlenmemiştir.Bitki DNA' ları her zaman GDO tarama reaksiyonlarda baskın hedef olacağından, bitki DNA' ları FMV, 35S ve NOS hedeflerinin tespit hassasiyetini artırmak için ikili ve üçlü DNA karışımlarına dahil edilmemiştir. Bitki spesifik eş zamanlı PZR' lar GDO taraması reaksiyonlarında pozitif PZR amplifikasyon kontrolü olarak kullanılmıştır.Daha önce akredite gıda kontrol laboratuvarları tarafından analiz edilen ham ve işlenmiş gıda örnekleri geliştirilen metodoloji kullanılarak tekrar analiz edildi. Köfte, soya yağı, soya unu, mısır, mısır yağı, don yağı, kedi ve köpek mamaları, çikolata, baklava ve ekmek çeşitlerini içeren toplam 96 örnek analiz edildi. Sonuçlarımız akredite gıda kontrol laboratuvarlarında elde edilen sonuçlar ile %100 uygumludur. Bu çalışma tek bir yüksek çözünürlükte erime boyası kullanılarak 35S, NOS ve FMV bölgelerinin eş zamanlı çoklu tespitinin mümkün olduğunu göstermiştir. Ayrıca enzimatik olmayan hücre parçalama yöntemlerini kullanarak yüksek kalitede DNA elde edilmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir. Food plants that are being produced or modified by genetic engineering techniques are conventionally named as genetically modified (GM) crops or genetically modified organisms (GMOs). The investigations have revealed different results on the risks of GMOs on human health and the environment. The regulatory need to monitor and verify the presence and the amount of GM varieties in crops and products has increased with the release of GM crops and products in the markets worldwide. Therefore, there is a need to develop reliable, quick and cost-effective methods for the detection of GM varieties in crops and their products.Screening for the GMO promoters or terminators is usually the first step for GMO analysis. The subsequent event specific qualitative and quantitative GMO analyses must be carried on the GMO positive samples to ensure that the detected GMOs were not originated from the contaminations. This has a substantial importance in countries where the quantitative threshold levels were defined for labeling of the GM products.In this study, we developed a multiplex QPCR methodology using a single high resolution melting dye to simultaneously detect Cauliflower Mosaic Virus 35S (35S) promoter, Agrobacterium tumefaciens Nopalin Synthase (NOS) terminator and Figworth mosaic virus 35S (FMV) promoter, which are contained in more than 99% of the GMO events. Discrimination between the different PCR products was based on the differences in melting temperatures of the target DNAs. We also developed an enzyme free DNA extraction methodology for food samples to shorten the total analysis time necessary for the screening of these elements. High quality DNA is necessary to obtain sensitive and efficient results in PCR based methodologies. In this study, we tried 5 different silica column based DNA extraction protocols on soybean and maize samples to obtain DNA with high quantity and quality. Three of the protocols were based on enzymatic steps whereas the other two methods were completely based on the chemical and physical cell disruption methodologies. In all of the methodologies, guanidium thiocyanate was used for PCR inhibitor inactivation and as a catastrophic agent for DNA binding.The current methodologies of DNA extraction for GMO detection must result in at least 1.5 ?g DNA with A260/280 ratios between 1.6 and 2.0. A260/280 ratios of DNA extracts from all of the developed methods were in the desired range. All of the protocols were resulted in DNA amounts higher than 15 ?g DNA, which is at least 10x higher than the minimal limit. The best results in terms of DNA concentration were obtained from the protocols that include bead beating and CTAB treatment. Since proteins absorb at 280 nm, the ratio A260/280 is used to estimate the presence of the proteins in DNA extracts. On the other hand, the presence of other types of PCR inhibitors such as carbohydrates, phenols, aromatic compounds and heavy metals may also affect the PCR results. To comparatively evaluate effect of the DNA quality obtained by different protocols on the QPCR efficiency, the same amount of template DNAs were used in QPCR. The universal plant chloroplast DNA targeted PCR primers were used in real time PCR trials. The obtained Ct values indicated the presence of PCR inhibitors because DNA concentrations and purities were the same for all the diluted templates obtained from different protocols. All of the templates were resulted in plant chloroplast DNA specific melting temperatures (Tm). Threshold cycle (Ct) values obtained using the protocols that include bead beating and CTAB treatment were approximately 2 cycles lower than the other protocols. This showed that these two protocols were more successful in eliminating the PCR inhibitors. The difference between these two protocols was the inclusion of proteinase K treatment step. To reduce the cost and total time necessary for the DNA isolation, we chose the protocol without proteinase K treatment.FMV, NOS, 35S positive reference food samples were supplied by the accredited food control laboratories. Extracted DNAs from FMV, NOS, 35S positive food samples were amplified by using the target specific primer pairs. Melting curve analysis was performed after the amplification cycles and Tm of the targeted PCR products were calculated. The target specific melting peaks were obtained at 73 ± 0.38?C for NOS, 80?C ± 0.28?C for FMV, 82.26 ± 0.29?C for 35S and 82 ± 0.33?C for plant specific reactions. It is generally accepted that the Tm obtained with Evagreen QPCR could vary between 0.5 and 1 ?C for the same amplicon. In this study, the standard deviations were lower than 0.4 ?C. In addition, all of the Evagreen QPCR reactions generated a single specific signal without major additional amplification products.QPCR quantification standards were prepared using the purified PCR products from the reference samples. Serial dilutions were done to obtain standard samples containing 100-1010 copies of the targeted gene. In order to obtain the limit of detection (LOD), soybean samples that contain 1-100 copies of 35S and NOS per gr of the sample, and maize samples that contain 1-100 copies of FMV per gr of the sample were prepared. The limits of detection were 1 gene copy/gr food sample for the 35S, NOS and FMV targeted methodologies. On the other hand, since the standard mixtures were not obtained from a reference food control laboratory, the detected LODs were rough estimations of the real LODs.A DNA mixture of the 35S, NOS, FMV genes were prepared to test the specificity of the primers. The DNA mixture was amplified via QPCR with each specific primer pair. The specificity of the QPCR reactions was examined via sequencing of the each amplified PCR product. The results showed that the amplified sequences have at least 99% similarity to the intended targets.The same amounts of the different DNA templates were added to the initial duplex QPCRs trials. Favored DNA templates, which resulted in more abundant PCR products in duplex reactions, were determined via melting curve analysis. The FMV templates resulted in more PCR products. The 35S templates were favored in PCRs that contained the 35S and NOS templates. The subsequent trials were carried out till only one type of Tm peak was obtained to determine the effect of different initial template amounts on the duplex QPCRs. The overall results showed that; two different Tm peaks were not obtained under 1/100 relative template concentrations but two different Tm peaks were obtained for each target above 1/100 relative template concentrations.After the successful binary mixture trials, triple mixture was prepared using 1000 copies of the each reference sample. Triplex QPCR trials were carried out to show that 3 primer pairs can work together in the multiplex QPCR and do not form non-specific PCR products or primer dimers. The triple combinations were applied to 1/1/1 relative copy number ratios of the reference samples. The NOS, FMV and 35S specific multiplex QPCR resulted in 3 different melting peaks. The melting peak corresponding to NOS, FMV and 35S targets were observed at 73.04±0.13?C, 80.21±0.10?C and 82.15±0.08?C, respectively. No additional amplification was observed in the multiplex reactions. Since plant DNAs will always be the dominant target in GMO screening reactions, plants DNAs were not included in the binary and triple DNA mixtures to increase the detection sensitivities of the FMV, 35S and NOS targets. Plant specific QPCRs were carried out in GMO screening reactions as a positive PCR amplification control.The raw and processed food samples, which were already analyzed by the accredited food control laboratories, were re-analyzed using the developed methodology. Total of 96 samples that include meatballs, soybean oil, soybean meal, corn, corn oil, tallow oil, cat and dog foods, chocolate, baklava and bread varieties were analyzed. Our results were in 100% accordance with the results obtained by the accredited food control laboratories.This study showed that multiple detection of 35S, NOS and FMV is possible using a single HRM dye. We also showed that it is possible to extract high quality DNA by using non-enzymatic cell disruption methodologies. 101

Arkeadan ökaryotlara kadar bütün organizmalar kendi içsel dengelerini korumak için pH, sıcaklık değişimleri, oksidatif ve kimyasal stresler gibi çevresel durumlara cevap verirler. Bu tür durumlarda, belli bir grup proteinin ifadesi artarak bu içsel dengeyi sağlar. Bu proteinlere moleküler şaperon adı verilmektedir. Moleküler şaperonların hücre içerisinde vazgeçilmez görevleri vardır; yeni sentezlenen proteinlerin işlenmesi, proteinlerin organel membranlarından geçirilmesi, oligomerik proteinlerin alt birimlerine ayrılması, proteozom sisteminin asiste edilmesi ve bazı transkripsiyon faktörlerinin aktivitesinin düzenlenmesi gibi.Hsp70 proteinleri en yaygın bulunan proteinlerden olup bütün organizmaların sitoplazmasında ve ökaryotların neredeyse bütün organellerinde (endoplazmik retikulum, mitokondri, kloroplast vb...) bulunur. Hsp70 proteinleri görevlerini gerçekleştirirlerken ATP?yi döngüler halinde kullanırlar ve substrat bağlama bölgeleri ile substrata bağlanırlar. Burada substrat olarak belirtilen amino asit sekanslarındaki kısa hidrofobik bölgelerdir. Hsp70?ler diğer moleküler şaperonlar ile birlikte doğru katlanmamış, bozulmuş veya sentezlenmekte olan proteinlerin doğru katlanma yollarına yönlenmesini sağlarlar. Enzimlerde olduğu gibi doğru katlanma reaksiyonunu hızlandırmazlar. Yaptıkları tek şey bu hidrofobik bölgelerin istenmeyen bir şekilde birbirleri ile ilişki kurmasını engellemektir.Hsp70 proteinleri 44 kDa?lık N-terminal nükleotid bağlama domeni (NBD), 25 kDa?lık C-terminal substrat bağlama domeni (SBD) ve bu domenleri birbirine bağlayan oldukça korunmuş, kısmen hidrofobik bir bağlaçtan oluşur. SBD substrat moleküllerine afinite gösterirken; NBD, SBD?nin substrata olan ilgisini bağlaç aracılığıyla kontrol eder. Oluşturulan farklı nükleotit bağlı konformasyonlar farklı substrat afinitesine sahip olmaktadır. NBD?ye ATP bağlandığında bağlaç bölgesi NBD?nin lobları arasındaki hidrofobik yarığa girer ve iki domenin yapışık olmasını sağlar. Bu durumda SBD?nin kapağı açılır ve substrat afinitesi düşer. Diğer bir deyişle substrat bağlanma/ayrılma (kon/off) kinetiği artar. ATP?nin ADP?ye hidrolizi ise hidrofobik yarığın kapanmasına ve iki domenin ayrılmasına neden olur. SBD?nin kapağı kapanır ve substrat afinitesi artar. Yani substrat bağlanma/ayrılma kinetiği azalır. NBD?nin farklı nükleotit durumlarıyla SBD?yi kontrol etmesinin yanı sıra; SBD?ye substrat bağlanması da NBD?nin ATPaz hızını arttırmaktadır. Domenler arası kurulan bu karşılıklı, allosterik kominikasyonda, evrimsel olarak oldukça korunmuş 388VLLL392 bağlaç sekansının önemli bir rol aldığı bilinmektedir. Kesilmiş DnaK proteinleri, 389VLLL392 sekansını içeren [DnaK(1-392)] ve içermeyen [DnaK(1-388)], ile yapılan ATPaz ölçümleri bu rolün önemini açıkça göstermiştir. 389VLLL392 sekansını içermeyen NBD, tam dizilim DnaK?nın [DnaK(1-638)] ortamda susbtrat bulunmadığında gösterdiği aktiviteye benzer bir eğriye sahip olurken; 389VLLL392 sekansını içeren NBD, tam dizilim DnaK?nın substrat ile stimüle olmuş pH bağımlı aktivitesine benzer bir aktivite sergilemektedir. NBD de kendi içerisinde I ve II olmak üzere iki loba ve her lob da A ve B olmak üzere iki altdomene ayrılır. Lob-I ve lob-II arasında nükleotit bağlama bölgesini sararken, IA ve IIA altdomenleri arasında hidrofobik bağlaç bağlanma yarığı oluşur. Nükleotit bağlanma bölgesinde ADP bağlı durumda: E267, K270 ve S274 nükleotitin adenozin kısmıyla; G442?nin amid grubu ?-fosfat ile; ve T11, T12 ve N15?in omurga ve yan zinciri ß-fosfat ile ilişki halindedir. Ayrıca D8, D194 ve E171 magnezyum iyonunun ilk koordinasyon kabuğundaki sular ile ilişkilidir. Bu ilişkiler proteinin ADP?ye olan ilgisini büyük ölçüde belirlemektedir ve katalitik aktivitede önemli olabilirler. Bir önceki paragrafta da belirtildiği gibi farklı nükleotit bağlı durumlar farklı NBD konformasyonlarına neden olmaktadır. ATP bağlı NBD?de loblar arası etkileşimler daha fazladır ve nükleotit bağlanma bölgesi kapalıdır. İki lob birbirine ATP?nin yarattığı köprü ile bağlıdır. ATP hidrolizi gerçekleştiğinde ise bu köprü kırılır ve IIB altdomeni 200?lik bir açı ile döner. Böylece açık NBD konformasyonu oluşturulmuş olur. NBD açık konformasyona sahip olduğunda (Nükleotitsiz ve ADP bağlı konformasyon) IA ve IIA altdomeni arasında bulunan hidrofobik bağlaç bağlanma bölgesi kapalıdır. NBD kapalı konformasyona sahip olduğunda (ATP bağlı konformasyon) ise bu bölge açıktır ve domenler arası etkileşime izin verir. Sonuç olarak NBD?ye bağlanan nükleotit NBD?nin içsel konformasyonunu belirleyerek DnaK?nın substrat bağlama döngülerini gerçekleştirmesini sağlar. NBD?de gerçekleşen ATP hidroliz reaksiyonunun ise tam olarak nasıl gerçekleştiği bilinmemektedir. Bu konuda ATP hidroliz mekanizması bilinen proteinlere dayanarak çeşitli hipotezler ortaya atılmıştır ama henüz hiçbiri kesin olarak ispatlanamamıştır.SBD ise ß altdomeni ve ? altdomeni olmak üzere iki parçadan oluşur. ß altdomeni substratın bağlanmasına yataklık ederken (L1,2 ve L3,4 bölgelerinin arası), ? altdomeni bir kapak görevi görerek hidrofobik substratın üzerine kapanır (heliks A ve B) ve substratın hidrofilik ortamdan uzaklaştırılmasını sağlar. Heliks B ile ß altdomeni arasındaki bağlantı bir tuz köprüsü ve L3,4 ve L5,6 bölgeleri ile yapılan iki hidrojen bağı sayesinde kurulur. Heliks A ve B?nin aksine ? altdomenini oluşturan diğer helikslerin (C-terminal ucundaki C, D ve E heliksleri) rolü net bir şekilde anlaşılamasa da, yüksek sıcaklıklarda bu helikslerin ? altdomenini stabilize ettiği bulunmuştur.Bütün bu verilere rağmen Hsp70?lerin çalışma mekanizması şu ana kadar kesin bir biçimde ortaya koyulamasa da, allosterik ilişkiyi gösteren sonuçlar açıktır. Bunlara ek olarak yukarıda da belirtildiği gibi NBD?de gerçekleşen ATP hidrolizi reaksiyonunun da tam olarak nasıl gerçekleştiği bilinmemektedir. Daha önce yapılan çalışmalarda hidrolizde önemli olabilecek bazı amino asitlere dikkat çekilmiştir. Fakat yine de tatmin edici sonuçlar elde edilememiştir. Bu çalışmalardan biri T199?u bir otofosrilasyon bölgesi olarak belirtmekte ve T199?u olmazsa olmaz bir amino asit olarak tanımlamaktadır. Fakat daha sonra kesilmiş NBD ile yapılan deneylerde bu amino asitin ATP hidrolizi için vazgeçilmez olmadığı ortaya koyulmuştur. Başka bir çalışma proton kabul edicisi olarak aktif bölgede bulunan bazı asidik amino asitlere dikkat çekmiştir. E171, D201, D8 ve D194?ün mutasyonunun yapıldığı bu çalışmada ise ATP hidrolizinde sadece tek bir amino asitin proton kabul edicisi olarak görev almayabileceği ihtimali ortaya atılmıştır. Yine başka bir çalışmada K70 üzerine dikkatler çekilerek, bu amino asitin saldıracak nükleofil için bir pozisyonlandırıcı olabileceği ihtimali üzerinde durulmuştur.Biz de bu çalışmada yukarıda sözü edilen kesilmiş DnaK parçalarını kullandık. Bu projede aktivitenin pH bağımlılığından sorumlu olan amino asitleri araştırmak için, şüphelendiğimiz amino asitleri (D194 ve D201) site-directed mutagenez yöntemi ile alanin amino asitine çevirdik. Yaptığımız ATPaz aktivite, ADP-çıkış hızı ve stabilite deneyleri ile bu amino asitlerin aktivitede nasıl etkilere sahip olduğuna dair güçlü veriler elde etmiş bulunmaktayız. Deneysel çalışmalarımıza ek olarak yaptığımız hesapsal çalışmalar da elde ettiğimiz deneysel verileri desteklemektedir. Daha önceki çalışmalar ve bulunan kristal yapılar, D194?ün Mg2+?iyonunun ilk koordinasyon kabuğundaki sular ile etkileşerek, proteinin ATP afinitesini belirlediğini göstermiştir. Bizim çalışmalarımızda da, bu çalışmalarla tutarlı olarak, sözü edilen etkileşimlerin kaybolması sonucu nükleotit afinitesinin oldukça kaybolduğu bulunmuştur. Ayrıca hesapsal olarak bulunan pKa değerleri ile de D194?ün protonasyon durumunun proteinin aktivitesi için önemli olabileceği sonucu ortaya çıkmaktadır. Çalışmalarımızla D201 amino asitinin de bağlaç ile tetiklenen aktivitede sinyalizasyon yolağı üzerinde önemli bir role sahip olabileceği bulunmuştur. pH bağımlı deney sonuçlarımızla birlikte, stabilite ölçümlerimiz de bu sonucu desteklemektedir. Hsp70 proteins have essential roles in cells such as de novo folding of newly synthesized proteins, refolding or ubiquitination of denatured proteins, protein trafficking and translocation through membranes. In this project, we analyzed Escherichia coli DnaK which is the most investigated Hsp70 homolog. DnaK is comprised of an N-terminal nucleotide binding domain (NBD), a C-terminal substrate-binding domain (SBD) and a partially conserved hydrophobic linker that connects the domains. NBD is composed of two lobes (I and II) harboring the bound nucleotide and the lobes are also divided into two subdomains A and B. SBD is composed of an ?-helical lid and a ß-sandwich domain. It is clearly known that SBD has affinity to bind hydrophobic amino acid stretches in de novo or partially unfolded protein sequences. Its activity prevents the formation of unwanted inter and intra molecular hydrophobic interactions of proteins. NBD in the meantime can hydrolyze ATP molecules in order to control the activity of SBD. ATP binding to NBD causes the two domains to be docked, leading to the opening of the ?-helical lid. In this state, the affinity for substrate is low and the kon/off rate is high. On the other hand, in the ADP bound state two domains become separated and act like irrelevant beads bound with a flexible string. In this state, affinity for the substrate is high and kon/off rate is low as a result of the closure of the lid. Not only the nucleotide states of NBD controls the activity of SBD, but also binding of substrate enhances the ATPase rate indicating a reciprocal communication between the domains. Several studies showed that the communication is provided via the partially hydrophobic linker containing 389VLLL392 sequence. Investigations done with truncated DnaK constructs showed that presence or absence of this sequence as in the case of [DnaK(1-392)] and [DnaK(1-388)], respectively has specific features compared to that of the full-length protein [DnaK(1-638)]. It is proposed that the shorter construct has similar activity profile with the activity of the full-length protein in the absence of substrate which is at basal levels while the linker containing construct mimics the pH dependent activity of the substrate stimulated full-length protein. In this project we also used these constructs to investigate the allosteric signaling pathway in NBD. Here, we investigated residues D194 and D201 for the pH dependence of NBD and mutated them to alanine to see the effects of these residues. In addition to ATPase, ADP-dissociation and stability measurements, we also made molecular dynamic simulations to investigate the importance of D194 and D201. Our experimental data provide us strong evidence showing a relation of these residues with pH dependence, also pKa calculations using thermodynamic integration method supported our experimental data. 74

Et, içerdiği amino asitler, vitaminler, yağ ve özellikle hayvansal protein ile insan sağlığı için vazgeçilmez bir besin kaynağıdır. Türkiye İstatistik Kurumu?nun (TUIK) 2012 verilerine göre; Türkiye?de yıllık kişi başına tüketilen et miktarı 12 kg?dır. Yine TUIK?in sonuçlarına göre, Avrupa ülkelerinde kişi başına tüketilen et miktarı 30 kg iken Amerika Birleşik Devletlerinde bu sayı 60 kg?a kadar çıkmaktadır. Bu veriler, Türkiye?de et tüketiminin son derece az olduğunu göstermektedir.Artan insan popülasyonu ve et ürünlerinin maliyetlerinin yüksek olması et tüketim oranını her yıl azaltmaktadır. Bu yüzden et üreticileri, fiyatları düşürmek için farklı et türlerini (at, esek, domuz, hindi, ve tavuk) karıştırmaya başlamıştır. Benzer pigmentasyona sahip et türleri (dana ve at, tavuk ve domuz gibi) dondurulduktan sonra veya işlenmiş et ürünlerinde kullanıldıklarında tüketici tarafından algılanması neredeyse imkansız hale gelir. Bu nedenle, köfte, salam, sosis, sucuk gibi ürünlerde sahteciliklerin yapılması oldukça kolaydır.2013 yılından önceki Türk Gıda Kodeksi?ne göre, et üreticilerinin karıştırdığı hayvan türlerini, ürünlerin etiketlerinde bildirmesi koşuluyla karma et uygulamasına izin verilmekteydi. Ancak, Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı yaptığı çalışmalar sonucunda, piyasada bulunan bir çok ürünün etiketinde, içerdiği hayvan türünün belirtilmediğini tespit etmiştir. Bu durum, 2013 yılında revize edilen Türk Gıda Kodeksi?nde karma et uygulamasının tamamen yasaklanmasına neden olmuştur.Et tür tayini analizlerinde en sık kullanılan yöntemler, protein ve nükleik asit tabanlıdır. Fakat, ısıl işleme maruz kalan ürünlerin protein yapıları bozulduğundan, protein tabanlı yöntemlerin et tür tayini için yetersiz kaldığı bildirilmiştir.DNA tabanlı yöntemlerin, protein tabanlı yöntemlere göre daha avantajlı olduğu düşünülmektedir. DNA molekülü sıcaklığa dayanıklı bir moleküldür, tüm hücrelerde aynı özelligi gösterir ve ayrıca tür hakkında daha fazla bilgi sağlar. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) tabanlı metotlar, belli bir hayvan türüne ait özgü DNA sekansını çoğaltma gücüne sahiptir. Diğer taraftan, konvensiyonel PZR ile kantitatif sonuçlar elde edilemez ve jel elektroforezi gibi PZR sonrası adımlar gerektirdiği için zaman alıcı bir yöntemdir.Kantitatif eş zamanlı PZR (quantitative Real Time PCR- qPCR), hem kalitatif hem de kantitatif sonuçlar sağlar. Bu teknikte, hedef genin çoğalması, floresans işaretleyiciler kullanılarak eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Et tür tayini çalışmalarında, Sybr Green ve oligonükleotit problar en çok kullanılan işaretleyicilerdir. Sybr Green belli bir konsantrasyonun üstünde kullanıldığında PZR reaksiyonunu inhibe edebilir ve ayrıca çoklu hedefleri tespit etmek için uygun değildir. Bu yüzden, yüksek maliyetli olmalarına rağmen oligonükleotit problar en çok tercih edilen işaretleyicilerdir. Alternatif olarak, Yüksek Çözünürlükte Erime(HRM) boyaları, erime eğrisi analizlerinde, DNA denatürasyonu ile birlikte çok daha ayırt edilebilir sinyal değişimlerine neden oldukları için tercih edilmektedirler. HRM boyaları sadece çift zincirli DNAya bağlanır, bu da boya molekülünü erime sırasında tek zincirli DNAya yeniden bağlanmasını önler ve üstün erime eğrisi çözünürlüğü sağlar. SYBR Green boyalarının aksine, HRM boyaları yüksek konsantrasyonlarda kullanılabilir, çünkü HRM boyaları DNA polimerazı ve PZR reaksiyonunu inhibe etmezler. Ayrıca HRM boyaları Sybr Green ile karşılaştırıldığında hidrojen bağlarına 4 kat daha fazla bağlanır.Bu tezin amacı; et ürünlerinin içerisine karıştırılan farklı et türlerinin (sığır, tavuk, hindi,at, eşek ve domuz) kalitatif olarak varlığını hızlı, güvenilir ve ekonomik bir biçimde tespit edilebilmesi için qPCR tabanlı bir sistem geliştirmektir. Bu çalışmada ilk olarak, 20 dakikadan az bir sürede tamamlanabilen, enzim içermeyen bir DNA izolasyon metodolojisi geliştirilmiştir. Geliştirilen metodoloji, boncuk ile parçalama ve silika kolon yöntemine dayalıdır. Bu metodolojide, hekzadesiltrimetilamonyum bromür (CTAB), guanidin tiyosiyanat ve boncuk ile parçalama uygulaması kullanılmıştır. Guanidin tiyosiyanat ve boncuk ile parçalama uygulaması hücreleri parçalamak için kullanılmıştır. Ayrıca guanidin tiyosiyanat DNA bağlanmasında ve PZR inhibitorlerinin uzaklaştırmasında rol oynar.DNA izolasyon sonuçlarına göre, geliştirilen DNA izolasyon metodolojisi kullanılarak elde edilen DNAların saflıkları ve konsantrasyonları ulaşılmak istenen aralıklarda elde edilmiştir: sırasıyla 1.6-2 ve 50-1000 ng/?l. Elde edilen DNAların kalitesi, qPCR?da bu DNAların 200 nanogramının kalıp DNA olarak kullanılmasıyla sınanmıştır. Elde edilen eşik döngü sayılarının 20?nin altında elde edilmesi, elde edilen DNAların PZR çoğalması için uygun olduğunu kanıtlamıştır. Piyasada mevcut ticari DNA izolasyon kitleri, zaman alıcı reaksiyonlara dayalıdır ve DNA izolasyon işlemi en az 1.5 saat sürmektedir. Bu çalışmada, enzimatik adımlar içermeyen bir DNA izolasyon protokolü geliştirilmiştir. DNA izolatları, sadece fiziksel ve kimyasal hücre parçalamasıyla elde edilmiştir. Bu da, toplam analiz süresinin (20 dakikadan az) ve DNA izolasyonun maliyetini önemli ölçüde azaltmıştır.Bu zamana kadar yapılan çalışmalarda, genellikle 12S rRNA, sitokrom b geni ve 16S rRNA gibi evrensel mitokondriyal genler, et türüne özgü prop dizaynı için hedef olarak seçilmişlerdir. Bu durum, özgüllük problemlerine neden olabilmektedir. Mitokondriyal genler son derece korunmuş genlerdir, bu yüzden at ve eşek gibi aynı cinse ait türler arasında ayrım yapmak zordur. Daha özgül sonuçlar elde etmek için, bu çalışmada her bir hayvan türü için yüksek derecede değişken gen bölgelerin çoğaltılmasına odaklanılmıştır. Bu yaklaşım sayesinde, özgül olmayan çoğalmalar önlenmiş ve validasyon çalışmaları için iş akışı kolaylaştırılmıştır.Bu çalışmada geliştirilen qPCR metodolojisi, tekli ve çoklu DNA tiplerini hedef alacak şekilde dizayn edilmiştir. Bu metodoloji sayesinde, tek bir HRM boyası (EvaGreen) kullanılarak, farklı PZR ürünlerinin, erime sıcaklığı (Tm) farklılıklarına göre çoklu tespit yapılmıştır. Referans et örneklerinin qPCR sonuçlarına göre; hedefe özgü erime sıcaklıkları at için 82.02 ± 0.29?C, domuz için 84.3?C ± 0.32?C, eşek için 78.80 ± 0.38?C, hindi için 84.86 ± 0.29?C, tavuk için 81.91 ± 0.34?C ve sığır için 86.96 ± 0.31?C olarak belirlenmiştir. Hindi/sığır, tavuk/sığır, tavuk/hindi, domuz/eşek, eşek/at, domuz/at ikili karışımlarının qPCR denemelerinde ve hindi/tavuk/sığır, domuz/eşek/at üçlü qPCR denemelerinde, istenilen hedeflere özgü olan birden fazla erime sıcaklığı tespit edilmiştir.Tespit limitini (Limit of Detection ?LOD) belirlemek için; 10 gramlık et karışımları hazırlanmıştır. Sırasıyla hedeflenenler hayvan eti, sığır eti ile karıştırılmıştır. Sığır etiyle karıştırılan her hayvan türü , karışımda 1 ? 100 kopya gen sayısı bulunduracak şekilde karışımlar yapılmıştır. Sığır etinin 1 gramında tespit limiti; tavuk için 4 gen kopya sayısı; hindi için 3 gen kopya sayısı; at , eşek ve domuz için ise 1 kopya gen sayısı olarak belirlenmiştir. Bununla birlikte, standart et karışımları akredite referans laboratuvarlar tarafından hazırlanmadığı için, gerçek LOD?nin kabaca tahmini yapabilmek için bu çalışmalar yürütülmüştür.Türkiye gıda piyasasına sunulması planlanan çiğ ve işlenmiş et ürünleri geliştirilen yöntemle başarıyla analiz edilmiştir. Numuneler akredite gıda kontrol laboratuvarları tarafından sağlanmıştır. Analiz edilen numune tipleri köfte, döner, sucuk, salam ve sosis gibi işlenmiş ürünler ve bir et üretim tesisinin üretim tezgahlarından alınan sürüntü numuneleridir. Analiz edilen toplam 83 örnekten; 24 tanesinin tavuk eti, 9 tanesinin hindi eti ve 1 tanesin domuz eti içerdiği tespit edilmiştir. Sonuçların doğruluğu, DNA sekanslama yöntemi kullanılarak onaylanmıştır. Geliştirilmiş olan bu yöntemin, mevcut PZR tabanlı yöntemlere göre en az iki kat daha hızlı olduğu ve 75 dakika içinde hassas sonuçlar verebildiği kanıtlanmıştır.Et türü tayini için kullanılan mevcut qPCR tabanlı yöntemler yüksek zaman ve maliyet gerektirmektedir. Bunun temel nedeni DNA ekstraksiyonu ve qPCR adımlarındaki uzun inkübasyon süreleri ve yüksek sarf maliyetleridir. Bu çalışmada bu sorunlara çözüm getirmek için yeni bir sistem geliştirilmiştir. Bu sistemin başarısının altında enzim içermeyen DNA protokolü ve tek HRM boyası ile yapılan çoklu hedef tespiti yatmaktadır. Bu çalışmada ilk defa, farklı hayvan türlerinden çoğaltılmış üç farklı hedef DNA qPCR?da tek bir boya kullanılarak, Tm?lerindeki farktan faydalanılarak ayırt ve tespit edilebilmiştir. Elde edilen sonuçlar geliştirilen yöntemin 75 dakikadan kısa bir sürede hassas sonuçlar verebileceğini göstermiştir. Böylelikle mevcut PCR tabanlı et türü tayin yöntemlerine nazaran en az 2 kat daha hızlı sonuç elde edilebilmiştir.Bu çalışmada geliştirilen qPCR?a dayalı metodoloji, ısıl işlem görmüş et karışımlarında at, eşek, domuz, tavuk ve hindi etlerinin hızlı ve rutin tespitleri için potansiyel bir moleküler araç olarak kullanılabilir. Türe özgü primerlerin kullanılması, bu metodu çiğ ve işlenmiş etlerin tespitinde son derece hassas kılmaktadır. Diğer taraftan, geliştirilen bu metodolojinin, akredite gıda kontrol labaratuvarları tarafından Meat contains amino acids, vitamins, fat and especially animal proteins, which are extremely important for human health. According to data from Turkish Statistical Institute (TUIK) meat consumption per capita in Turkey was 12 kg in 2012. The meat consumption per capita in United States of America (U.S.A.) and European Union (EU) are approximately 60 kg and 30 kg, respectively. These data show that; meat consumption in Turkey is lower than EU and U.S.A. Increasing human population and the cost of meat products have resulted in gradual decreases in meat consumption over the years. So that, the manufacturers started to mix different meat types (horse, donkey, pig, turkey and chicken) to reduce the costs. If the food is frozen and processed, it becomes impossible for consumer to differentiate the meat type which has similar pigmentation (beef- horse, chicken-pork, etc.). Therefore, forgery is commonly encountered within the production of meatball, sausage and salami.According to the Turkish Food Regulations before 2013, mixed meat application is permitted as long as the producers state the mixed meat types on the label. On the other hand, the Ministry of Food, Agriculture and Livestock has determined undeclared mixed meat applications in the Turkish Food Market. This has led to the new regulations in 2013, which strictly prohibited the mixed meat application.Protein and nucleic acid-based methods have been commonly used for meat species identification. The protein-based methods have been reported to be inadequate for the meat species identification since the protein structures deformed in thermally processed foods.DNA based methods have been considered to be more advantageous than the protein based methods. DNA is thermo-stable, shows the same features in all cells and provides more information about the species. Polymerase chain reaction (PCR) based methods have a power of amplifying a specific DNA molecule that belongs to a certain animal species. On the other hand, the conventional PCR cannot provide quantitative results and the post PCR steps such as gel electrophoresis make it time consuming.Quantitative Real Time PCR (qPCR) can provide both qualitative and quantitative results for meat type identification. In this technique, amplification of the target gene can be monitored online by the use of fluorescent reporters. The most commonly used reporters in meat type detection are Sybr Green dye and the oligonucleotide probes. Sybr Green can inhibit PCR reactions if used above a certain concentration and it cannot be used for detection of the multiple targets. This is why the oligonucleotide probes are the most frequently used reporters despite of their high costs. As an alternative, High Resolution Melting (HRM) dyes are preferred for use with melting curve assays due to the more discrete signal change occurring upon DNA denaturation. HRM dyes only bind to double stranded DNA that prevents the dye molecule from redistribution during melting and provides superior melt curve resolution. Unlike SYBR Green dye, HRM dyes can be used at high concentrations because they do not inhibit DNA polymerases and PCR reaction. HRM dyes great ability to bind the hydrogen bond almost 4 times more than SYBR Green.The aim of this study, develop a quick, reliable and low-cost qPCR based methodology to qualitatively detect different meat species (cattle, chicken, turkey, horse, donkey and pig) in food products. Firstly in this study, an enzyme free DNA extraction methodology which can be completed in less than 20 minutes was developed. The developed methodology was based on bead beating treatment and silica column method. In this methodology, hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), Guanidinium thiocyanate and bead beating were used to disrupt the cells. Guanidinium thiocyanate also acted in PCR inhibitor removal and DNA binding.The results showed that the purities and concentrations of the DNA extracts obtained using the developed DNA extraction methodology were in the desirable ranges: 1.6-2 and 50-1000 ng/?l, respectively. The obtained DNA qualities were also assessed by using 200 ng of the template DNAs in qPCR. The obtained threshold cycle numbers were less than 20, which implied that the obtained DNAs were suitable for PCR amplification. The current commercially available DNA extraction kits are based on time-consuming reactions that are completed in at least 1.5 hours. In this study, we have developed a DNA extraction protocol, which does not include enzymatic steps. The DNA extracts were obtained via only the physical and the chemical cell disruption. This has significantly decreased the total time (less than 20 minutes) and the cost of the DNA extraction.Universal mitochondrial DNA sequences such as; 12S rRNA, cytochrome b and 16S rRNA genes have generally been chosen as the target for meat type specific probe design. This has led to specifity problems in the detections. Mitochondrial genes are highly conserved so that differentiation is difficult between the species that belongs to the same genus such as; horse and donkey. To obtain more specific results, we concentrated on the amplification of highly variable gene regions for the each animal type. This approach prevented the non-specific amplifications and led to easier workflow for the validation studies.The qPCR methodology was designed to target both single and multiple DNA types. The multiple detection was based on melting temperature (Tm) differences of the different PCR amplification products with a single HRM dye (EvaGreen). The qPCR trials on the reference meat samples showed that the target specific melting peaks can be obtained at 82.02 ± 0.29?C for horse, 84.3?C ± 0.32?C for pig, 78.80 ± 0.38?C for donkey, 84.86 ± 0.29?C for turkey, 81.91 ± 0.34?C for chicken and 86.96 ± 0.31?C for cattle. Q-PCR trials on the binary mixtures of turkey/cattle, chicken/cattle, turkey/chicken, pig/donkey, donkey/horse and horse/pig and triple mixtures of turkey/chicken/cattle and pig/donkey/horse resulted in multiple melting peaks that are specific to the intended targets.To obtain the limit of detection (LOD), 10 g standard meat mixtures that contain 1-100 copies of the additive meat type DNA were prepared. The LODs were 4 chicken copies/gr cattle sample, 3 turkey gene copies/gr cattle sample, 1 horse gene copy/gr cattle sample, 1 donkey gene copy/gr cattle sample and 1 pig gene copy/gr cattle sample.On the other hand, since the standard meat mixtures were not obtained from an acredited reference laboratory, the detected LODs were rough estimations of the real LODs.Commercial samples which are intended to be introduced to the Turkish food market were screened. The commercial samples were obtained from acredited food laboratories. The sample types were sucuk, doner kebap, beef sausage, beef salami and the swab samples from meat production benches. 24 chicken, 9 turkey and 1 pig meat positive samples were detected among the 83 screened samples. The results were also confirmed via the DNA sequencing of PCR products.The currently available qPCR based meat type identification methodologies are time and money consuming. The main reasons behind these are the long incubation times and high costs of the available DNA extraction and the multiplex qPCR methodologies. In this study, a new system was developed to overcome these problems. This was achieved via an enzyme free DNA extraction methodology and a multiplex qPCR using a single HRM dye. For the first time, this study introduced discrimination of three different qPCR amplicons from various animal specific gene products based on the differences in Tms. The overall results proved that the developed method could give sensitive results in less than 75 minutes, which is at least two times faster than the currently available PCR-based methods for meat type detection.The qPCR based methodology developed in this study is a potential molecular tool that can be used in rapid and routine detection of horse, donkey, pig, chicken and turkey meats present in heat treated meat mixtures. The use of species-specific primers makes the method very sensitive for determination in raw and processed meats. On the other hand, the methodology must be validated using the reference samples prepared by reference accredited food control laboratories. 99

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2013, Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2013, Genetik mühendisliği teknikleri ile modifiye edilen veya üretilen besin bitkileri geleneksel olarak genetiği değiştirilmiş (GD) bitkiler veya genetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO) olarak isimlendirilir. Genetiği değiştirilmiş bitkilerin ekim alanları 1996 yılından 2012 yılına 100 kat artarak, GD bitkileri yakın tarihimizin en hızlı uyum sağlanan ürün teknolojisi haline getirmiştir. Farklı kurumsal yapıların ve araştırmacıların çalışmaları incelendiğinde genetiği değiştirilmiş organizmaların insan sağlığı ve çevre üzerine riskleri ile ilgili farklı sonuçların ortaya konulduğu görülmektedir. GD bitki ve ürün çeşitlerinin varlığının ve miktarının izlenmesi ve doğrulanması için düzenleme ihtiyacı GD bitki ve ürünlerin dünya çapında marketlerde görülmesi ile artmıştır. Bu nedenle, bitki ve bitki ürünlerinde GDO çeşitlerinin tespiti için güvenilir, hızlı ve düşük maliyetli methodların geliştirilmesine ihtiyaç vardır. GDO analizinde ilk adım genellikle GDO larda bulunan promotör veya terminatörler bölgelerinin taranmasıdır. GDO pozitif olarak tespit edilen örnekler üzerinde daha sonra kalitatif ve kantitatif olay spesifik ileri analizler pozitif tespitin kontaminasyondan kaynaklanmadığından emin olunması için gerçekleştirilmelidir. Bu durum GD ürünlerin etiketlenmesi için tanımlanmış eşik seviyelerinin olduğu ülkelerde de ciddi bir öneme sahiptir. Eş zamanlı PZR GDO tespiti ve kantifikasyonu için en yaygın kullanılan tekniktir. Bu teknik ile hedef genin çoğalması, floresan boyalar kullanılarak eş zamanlı olarak görüntülenebilir. En sık kullanılan floresan boyalar oligonükleotid problar, yüksek çözünürlükte erime boyaları ve DNA bağlama boyalarıdır. En spesifik tespit sadece hedef dizilerine bağlanan oligonükleotid problar kullanılarak yapılabilir. Bu nedenle yüksek maliyetli olmalarına rağmen oligonükleotit problar en çok tercih edilen floresan boyalardır. DNA bağlama boyaları ve yüksek çözünürlükte erime boyaları çift iplikli DNA molekülüne bağlanırlar. DNA bağlama boyaları belli bir konsantrasyonun üstünde kullanıldığında PZR ‘ı inhibe edebililir. Yüksek çözünürlükte erime boyalarının minimum PZR inhibisyon etkisi vardır. Ayrıca yüksek çözünürlükte erime boyaları DNA bağlama boyaları ile karşılaştırıldığında hidrojen bağlarına 4 kat daha fazla bağlanır ve üstün erime eğrisi çözünürlüğü elde edilir. Eş zamanlı PZR ile GDO tespitinde en çok hedeflenen diziler karnabahar mozaik virüse ait 35S promotörü (p35S); karnabahar mozaik virüse ait 35S terminatorü (t35S); figwort mozaik virüse ait 35S promotörü (FMV); Agrobacterium tumefacien’e ait nopalin sentaz geni terminatörü (tNOS), nopalin sentaz promotörü (pNOS) ve 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate sentaz (epsps) geni; Streptomyces hygroscopicus’a ait bar geni (BAR); Streptomyces viridochromogenes’a ait phosphinotricin-Nacetyltransferases (pat) genleridir. Bu çalışmada, GDO lu bitkilerin %99 undan fazlasının içerdiği karnabahar mozaik virüse ait 35S promotörü (p35S); figwort mozaik virüse ait 35S promotörü (pFMV); Agrobacterium tumefacien’e ait nopalin sentaz geni terminatörü (tNOS) dizilerinin aynı anda tespiti için tek bir yüksek çözünürlükte erime (HRM) boyası kullanılarak çoklu eş zamanlı PZR methodu geliştirildi. Farklı PZR ürünleri arasındaki ayrım hedef DNA ların erime sıcaklıkları farklılıklarına dayalı olarak yapılmıştır. Ayrıca, bu elementlerin taranması için gerekli olan toplam analiz süresini kısaltmak için enzim içermeyen DNA ekstraksiyon yöntemi geliştirildi. PZR tabanlı metodolojilerde hassas ve etkili sonuçlar elde etmek için yüksek kaliteli DNA gereklidir. Bu çalışmada, yüksek miktarda ve kalitede DNA elde etmek için soya ve mısır örnekleri üzerinde 5 farklı silika kolon tabanlı DNA ekstraksiyon protokolleri denenmiştir. Protokollerin üçü enzimatik adımlara dayanırken diğer 2 protokol ise tamamen kimyasal ve fiziksel hücre parçalama yöntemine dayanmaktaydı. Yöntemlerin hepsinde guanidin tiyosiyanat PZR inhibitörü inaktivasyonu ve DNA bağlanması için bir kaotropik ajan olarak kullanılmıştır. GDO tespiti için mevcut DNA ekstraksiyon metodolojileri en az 1,5 μg DNA ve 1.6 ve 2.0 arasında A260/280 oranı ile sonuçlanmalıdır. Tüm geliştirilmiş methodlardan elde edilen DNA ekstraktların A260/280 oranı istenilen aralıkta elde edildi. Tüm protokoller ile minimum limitden en azından 10 kat daha fazla olan 15 μg’ dan daha fazla DNA elde edildi. DNA konsantrasyonu açısından en iyi sonuçları boncukla homojenizasyon ve hekzasetiltrimetil amonyum bromür (STAB) muamelesi içeren protokollerden elde edilmiştir. Proteinler 280 nm’ de absorbladığı için A260/A280 oranı DNA ektraktlarındaki proteinlerin varlığının hesaplanmasında kullanılır. Diğer taraftan, karbonhidratlar, fenoller, aromatik bileşikler ve ağır metaller gibi diğer tip PZR inhibitörlerinin varlığı da PZR sonuçlarını etkileyebilir. Karşılaştırmalı olarak eş zamanlı PZR verimliliğine farklı protokoller ile elde edilen DNA kalitesinin etkisini değerlendirmek için her protokolden aynı miktarda DNA kullanılarak eş zamanlı PZR gerçekleştirildi. Eş zamanlı PZR çalışmalarında genel bitki kloroplast DNA sını hedefleyen PZR primerleri kullanıldı. DNA konsantrasyonu ve saflığı farklı protokollerden elde edilen tüm seyreltilmiş DNA lar için aynı olması nedeniyle elde edilen Ct değerleri PZR inhibitörlerinin varlığına işaret etmiştir. Tüm DNA örnekleri bitki kloroplast DNA sına spesifik erime sıcaklığında pik vermiştir. Boncuk ile homojenizasyon ve STAB muamelesini içeren protokoller ile elde edilen DNA lardan elde edilen eşik döngüsü değerleri diğer protokollere göre yaklaşık olarak 2 döngü daha düşük olarak bulunmuştur. Bu durum PZR inhibitörlerinin elimine edilmesinde bu iki protokolün daha başarılı olduğunu gösterdi. Bu iki protokol arasındaki fark proteinaz K muamelesi adımının dahil edilmesidir. DNA izolasyonu için gerekli olan maliyet ve toplam süreyi azal°ak amacıyla proteinaz K içermeyen protokol seçildi. FMV, NOS, 35S pozitif referans gıda örnekleri akredite gıda kontrol laboratuarları tarafından temin edilmiştir. FMV, NOS, 35S pozitif gıda örneklerinden çıkarılan DNA’ lar hedef spesifik primer çiftleri kullanılarak çoğaltıldı. Amplifikasyon döngülerinden sonra erime eğrisi analizi gerçekleştirildi ve hedeflenen PZR ürünlerinin Tm leri hesaplandı. Hedef spesifik erime pikleri NOS spesifik reaksiyon için 73 ± 0.38˚C de, FMV spesifik reaksiyon için 80˚C ± 0.28˚C de, 35S spesifik reaksiyon için 82.26 ± 0.29˚C de ve bitki kloroplast DNA sına specifik reaksiyon için 82 ± 0.33˚C de elde edildi. Genellikle aynı amplikon için Evagreen kullanılarak yapılan eş zamalı PZR ile elde edilen erime sıcaklıkları 0.5 ve 1 ˚C arasında değişebileceği kabul edilmektedir. Bu çalışmada elde edilen standart sapmalar 0.4˚ C ’den daha düşük bulunmuştur. Ayrıca, bütün Evagreen eş zamanlı PZR reaksiyonları önemli ek amplifikasyon ürünleri olmadan tek bir spesifik sinyal üretmiştir. Eş zamanlı PZR kantifikasyon standatları referans örneklerin purifiye edilmiş PZR ürünleri kullanılarak hazırlandı. Seri dilüsyonlar hedeflenen genin 100-1010 kopyasını içeren standart örnekler hazırlanması için yapıldı. Tespit limitini elde etmek için gr örnek başına 1-100 kopya 35S ve NOS içeren soya örnekleri ve gr örnek başına 1-100 kopya FMV içeren mısır örneği hazırlandı. 35S, FMV, NOS hedefli methodolojiler için tespit limiti 1 gen kopya/gr gıda örneği olarak bulunmuştur. Ancak bu çalışmada standart karışımlar referans gıda kontrol laboratuvarından elde edilmediği için methodların tespit limitleri geçek tespit limitlerinin sadece kaba tahminleridir. 35S, NOS ve FMV kalıplarının DNA karışımı primerlerin spesifikliğini test etmek için hazırlanmıştır. DNA karışımı her spesifik primer çifti ile eş zamanlı PZR ile çoğaltıldı. Eş zamanlı PZR reaksiyonlarının spesifikliği tüm amplifiye PZR ürünlerinin sekanslanması ile incelenmiştir. Sonuçlar çoğaltılmış dizilerin amaçlanan hedeflere en az %99 benzer olduğunu göstermiştir. İlk olarak dubleks eş zamanlı PZR denemeleri her farklı DNA kalıplarının aynı miktarda eklenmesi ile gerçekleştirildi. Dubleks reaksiyonlarda daha fazla PZR ürünleri ile sonuçlanan daha fazla tercih edilen DNA kalıpları erime eğrisi analizi ile tespit edildi. FMV kalıplarından reaksiyonlarda daha fazla PZR ürünü elde edildi. 35S kalıpları ise 35S ve NOS kalıpları içeren PZR larda daha fazla tercih edildi. Dubleks PZR larda farklı ilk örnek miktarının etkisini belirlemek için sadece tek bir tip Tm piki elde edene kadar çalışmalara devam edildi. Genel sonuçlar iki farklı Tm piki 1/100 rölatif kalıp konsantrasyonları altında elde edilemezken iki farklı Tm piki 1/100 rölatif kalıp konsantrasyonları üzerindeki her hedef için elde edilebildiği gösterildi. Başarılı ikili karışım denemelerinden sonra her bir referans örnekten 1000 kopya kullanılarak üçlü karışım hazırlandı. Üç primer çiftinin çoklu eşmanalı PZR da beraber çalışabildiğini göstermek ve spesifik olmayan PZR ürünü veya primer dimeri oluşturmadığını göstermek için üçlü eş zamanlı PZR çalışmaları gerçekleştirildi. Üçlü kombinasyonlar referans örneklerin 1/1/1 röfatif kopya sayısı oranına uygulanmıştır. NOS, FMV ve 35S spesifik çoklu eş zamanlı PZR 3 farklı erime piki elde edilmesi ile sonuçlandı. NOS, FMV ve 35S hedeflerine karşılık gelen erime pikleri sırasıyla 73.04±0.13˚C, 80.21±0.10˚C ve 82.15±0.08˚C de gözlenmiştir. Çoklu reaksiyonlarda ek amplifikasyon gözlenmemiştir. Bitki DNA ları her zaman GDO tarama reaksiyonlarda baskın hedef olacağından, bitki DNA ları FMV, 35S ve NOS hedeflerinin tespit hassasiyetini artırmak için ikili ve üçlü DNA karışımlarına dahil edilmemiştir. Bitki spesifik eş zamanlı PZR lar GDO taraması reaksiyonlarında pozitif PZR amplifikasyon kontrolü olarak kullanılmıştır. Daha önce akredite gıda kontrol laboratuvarları tarafından analiz edilen ham ve işlenmiş gıda örnekleri geliştirilen metodoloji kullanılarak tekrar analiz edildi. Köfte, soya yağı, soya unu, mısır, mısır yağı, don yağı, kedi ve köpek mamaları, çikolata, baklava ve ekmek çeşitlerini içeren toplam 96 örnek analiz edildi. Sonuçlarımız akredite gıda kontrol laboratuvarlarında elde edilen sonuçlar ile %100 uygumludur. Bu çalışma tek bir yüksek çözünürlükte erime boyası kullanılarak 35S, NOS ve FMV bölgelerinin eş zamanlı çoklu tespitinin mümkün olduğunu göstermiştir. Ayrıca enzimatik olmayan hücre parçalama yöntemlerini kullanarak yüksek kalitede DNA elde edilmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir., Food plants that are being produced or modified by genetic engineering techniques are conventionally named as genetically modified (GM) crops or genetically modified organisms (GMOs). The investigations have revealed different results on the risks of GMOs on human health and the environment. The regulatory need to monitor and verify the presence and the amount of GM varieties in crops and products has increased with the release of GM crops and products in the markets worldwide. Therefore, there is a need to develop reliable, quick and cost-effective methods for the detection of GM varieties in crops and their products. Screening for the GMO promoters or terminators is usually the first step for GMO analysis. The subsequent event specific qualitative and quantitative GMO analyses must be carried on the GMO positive samples to ensure that the detected GMOs were not originated from the contaminations. This has a substantial importance in countries where the quantitative threshold levels were defined for labeling of the GM products. In this study, we developed a multiplex QPCR methodology using a single high resolution melting dye to simultaneously detect Cauliflower Mosaic Virus 35S (35S) promoter, Agrobacterium tumefaciens Nopalin Synthase (NOS) terminator and Figworth mosaic virus 35S (FMV) promoter, which are contained in more than 99% of the GMO events. Discrimination between the different PCR products was based on the differences in melting temperatures of the target DNAs. We also developed an enzyme free DNA extraction methodology for food samples to shorten the total analysis time necessary for the screening of these elements. High quality DNA is necessary to obtain sensitive and efficient results in PCR based methodologies. In this study, we tried 5 different silica column based DNA extraction protocols on soybean and maize samples to obtain DNA with high quantity and quality. Three of the protocols were based on enzymatic steps whereas the other two methods were completely based on the chemical and physical cell disruption methodologies. In all of the methodologies, guanidium thiocyanate was used for PCR inhibitor inactivation and as a catastrophic agent for DNA binding. The current methodologies of DNA extraction for GMO detection must result in at least 1.5 μg DNA with A260/280 ratios between 1.6 and 2.0. A260/280 ratios of DNA extracts from all of the developed methods were in the desired range. All of the protocols were resulted in DNA amounts higher than 15 μg DNA, which is at least 10x higher than the minimal limit. The best results in terms of DNA concentration were obtained from the protocols that include bead beating and CTAB treatment. Since proteins absorb at 280 nm, the ratio A260/280 is used to estimate the presence of the proteins in DNA extracts. On the other hand, the presence of other types of PCR inhibitors such as carbohydrates, phenols, aromatic compounds and heavy metals may also affect the PCR results. To comparatively evaluate effect of the DNA quality obtained by different protocols on the QPCR efficiency, the same amount of template DNAs were used in QPCR. The universal plant chloroplast DNA targeted PCR primers were used in real time PCR trials. The obtained Ct values indicated the presence of PCR inhibitors because DNA concentrations and purities were the same for all the diluted templates obtained from different protocols. All of the templates were resulted in plant chloroplast DNA specific melting temperatures (Tm). Threshold cycle (Ct) values obtained using the protocols that include bead beating and CTAB treatment were approximately 2 cycles lower than the other protocols. This showed that these two protocols were more successful in eliminating the PCR inhibitors. The difference between these two protocols was the inclusion of proteinase K treatment step. To reduce the cost and total time necessary for the DNA isolation, we chose the protocol without proteinase K treatment. FMV, NOS, 35S positive reference food samples were supplied by the accredited food control laboratories. Extracted DNAs from FMV, NOS, 35S positive food samples were amplified by using the target specific primer pairs. Melting curve analysis was performed after the amplification cycles and Tm of the targeted PCR products were calculated. The target specific melting peaks were obtained at 73 ± 0.38˚C for NOS, 80˚C ± 0.28˚C for FMV, 82.26 ± 0.29˚C for 35S and 82 ± 0.33˚C for plant specific reactions. It is generally accepted that the Tm obtained with Evagreen QPCR could vary between 0.5 and 1 ˚C for the same amplicon. In this study, the standard deviations were lower than 0.4 ˚C. In addition, all of the Evagreen QPCR reactions generated a single specific signal without major additional amplification products. QPCR quantification standards were prepared using the purified PCR products from the reference samples. Serial dilutions were done to obtain standard samples containing 100-1010 copies of the targeted gene. In order to obtain the limit of detection (LOD), soybean samples that contain 1-100 copies of 35S and NOS per gr of the sample, and maize samples that contain 1-100 copies of FMV per gr of the sample were prepared. The limits of detection were 1 gene copy/gr food sample for the 35S, NOS and FMV targeted methodologies. On the other hand, since the standard mixtures were not obtained from a reference food control laboratory, the detected LODs were rough estimations of the real LODs. A DNA mixture of the 35S, NOS, FMV genes were prepared to test the specificity of the primers. The DNA mixture was amplified via QPCR with each specific primer pair. The specificity of the QPCR reactions was examined via sequencing of the each amplified PCR product. The results showed that the amplified sequences have at least 99% similarity to the intended targets. The same amounts of the different DNA templates were added to the initial duplex QPCRs trials. Favored DNA templates, which resulted in more abundant PCR products in duplex reactions, were determined via melting curve analysis. The FMV templates resulted in more PCR products. The 35S templates were favored in PCRs that contained the 35S and NOS templates. The subsequent trials were carried out till only one type of Tm peak was obtained to determine the effect of different initial template amounts on the duplex QPCRs. The overall results showed that; two different Tm peaks were not obtained under 1/100 relative template concentrations but two different Tm peaks were obtained for each target above 1/100 relative template concentrations. After the successful binary mixture trials, triple mixture was prepared using 1000 copies of the each reference sample. Triplex QPCR trials were carried out to show that 3 primer pairs can work together in the multiplex QPCR and do not form non-specific PCR products or primer dimers. The triple combinations were applied to 1/1/1 relative copy number ratios of the reference samples. The NOS, FMV and 35S specific multiplex QPCR resulted in 3 different melting peaks. The melting peak corresponding to NOS, FMV and 35S targets were observed at 73.04±0.13˚C, 80.21±0.10˚C and 82.15±0.08˚C, respectively. No additional amplification was observed in the multiplex reactions. Since plant DNAs will always be the dominant target in GMO screening reactions, plants DNAs were not included in the binary and triple DNA mixtures to increase the detection sensitivities of the FMV, 35S and NOS targets. Plant specific QPCRs were carried out in GMO screening reactions as a positive PCR amplification control. The raw and processed food samples, which were already analyzed by the accredited food control laboratories, were re-analyzed using the developed methodology. Total of 96 samples that include meatballs, soybean oil, soybean meal, corn, corn oil, tallow oil, cat and dog foods, chocolate, baklava and bread varieties were analyzed. Our results were in 100% accordance with the results obtained by the accredited food control laboratories. This study showed that multiple detection of 35S, NOS and FMV is possible using a single HRM dye. We also showed that it is possible to extract high quality DNA by using non-enzymatic cell disruption methodologies., Yüksek Lisans, M.Sc.

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012, Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2012, Bcl-2 asosiye athano gen (Bag) ailesi (Yunanca ölüm karşıtı athanostan) proteinleri anti-apoptotik Bcl-2 proteini ile ko-immunopresipitasyon sonucu bulunmuşlardır. Bag genleri evrimsel olarak korunmuştur ve mayalarda, bitkilerde ve hayvanlarda homologları mevcuttur. Bag ailesi üyeleri iki farklı yolla hücre homeostazını kontrol eder: (1) Hem pozitif hem negatif şekilde Hsp70/Hsc70 moleküler şaperon sisteminin çalışma döngüsünü regüle ederek hücrenin yaşamsal faaliyetlerini normal ve stres koşullarında sürdürmesine katkıda bulunur. Buna spesifik bir örnek, hücrenin normal ve stres halleri arasındaki dengesinin yönünün Bag-1’e Hsp70 ya da Raf-1’in yarışmalı bağlanması sonucu sağlanması ile verilebilir. (2) Apoptoz, tümör oluşumu, nöronal farklılaşma ve hücre döngüsü gibi birçok fizyolojik süreci kontrol eden transkripsiyon faktörleri ve reseptörler ile Hsp70/Hsc70 sisteminden bağımsız olarak kompleksler oluşturur. Bag ailesi üyelerinin, insanlarda, kanser, AIDS ve Parkinson gibi kompleks hastalıklarda normal hücrelere kıyasla ekspresyon düzeylerinde ve hücre içi lokalizasyonlarında değişiklikler gözlenmektedir. Dolayısıyla, bu tip hastalıkları tahlil etmede Bag proteinlerinin hücre içi ekspresyonlarını ve lokalizasyonlarını incelemeye yönelik çalışmalardan yararlanılabilir. Örneğin, kanserli meme hücrelerinde yapılan çalışmalarla Bag-1 ekspresyonunun, hastalığın seyrinin izlenmesinde prognostik bir markör olarak kullanılabileceği gösterilmiştir. Belirlenmiş Bag proteinleri Bag-1 (RAP46/HAP46), Bag-2, Bag-3 (CAIR-1/Bis), Bag-4 (SODD), Bag-5 ve Bag-6 (BAT3/Scythe) olup hepsi C-terminus yakınında BAG domen (BD) ifadesine sahiptir. Bag proteinlerinin genellikle N terminuslarında farklılık göstermesi her bir Bag ailesi üyesinin çeşitli proteinler, yolaklar ve/veya lokalizasyonlara göre spesifite göstermesini sağlar. Hücrelerde Bag-1 izoformlarinin ekspresyon düzeyleri farklılık göstermektedir. Bu izoformlar hücrelerde bulunma sıklıklarına göre Bag-1S, Bag-1L ve Bag-1M olarak sıralanabilir. Buna rağmen tümörlü hücrelerde ekspresyon düzeyi en yüksek olan Bag-1L izoformudur. Bunun nedeni ise Bag-1L’nin nüklear lokalizasyonuna bağlı olarak transkripsiyon faktörlerinin aktivitesini yönlendirmesi ve böylece hücre proliferasyonunu dolaylı yoldan tetiklemesi olabilir. Bag-1 izoformlarının hücrelerde daha önce yapılmış çalışmalar sonucu belirlenmiş etkileşim partnerleri; Bcl-2, Raf-1, Hsc70/Hsp70 sistemi, nükleer hormon reseptörleri (NHR), ubikuitin/proteozom mekanizması ve DNA dır. Bu etkileşimlerle Bag-1 izoformları, hücre büyümesi için kritik sinyal iletimi, proliferasyon, transkripsiyon gibi hücresel mekanizmalardan, hücre hareketi ve apoptoza varana kadar normal, malignan ve stres altında bulunan hücreler için önemli kontrol yolaklarında görev almaktadır. Bag-1 izoformlarinin belirtilmiş olan geniş perspektifli bu hücresel aktiviteleri genel olarak Bag ailesi üyeleri için tanımlandığı gibi iki farklı şekilde kontrol ettiği literatürde yer almaktadır: (1) Hsp70/Hsc70 sistemi ile etkileşim yoluyla, (2) nüklear hormon reseptörlerine (NHR) bağlanmasıyla. Bag-1 izoformlarinin Hsp70/Hsc70 moleküler şaperon sistemi ile etkileşiminde BAG domenleri Hsc70’in ATPaz domeninine bağlanır, konformasyonel değişiklikler yaratarak ADP’nin ATP ile değişimine etkide bulunur ve sonuçta bu şaperonların peptit bağlayan domenlerinin substrat proteinleri ile olan bağlanma/ayrılma kinetiklerini regüle eder. Bu şekilde bozunmuş hedef proteinin yeniden katlanıp katlanmayacağı kontrol edilmiş olur. Bag-1 izoformları, Hsp70/Hsc70 sistemini hem pozitif hem de negatif yönde kontrol ederek sırasıyla hücrelerin efektif bir şekilde protein üretebilmesi sonucu hücre büyümesine ya da hücrelerin protein üretiminin yavaşlaması sonucu hücre ölümüne yol açabilir. Fakat bu kritik ayarlamada, henüz Bag-1’lerin Hsp70/Hsc70 sistemine tam olarak moleküler düzeyde nasıl bir kontrol mekanizması ile etkide bulunduğu net olarak bilinmemektedir. Şu ana kadar yapılmış bu konudaki çalışmalar tutarsız sonuçlar ortaya koymaktadır. Bazı çalışmalar Bag-1M’nin Hsp70/Hsc70 sistemine bağlanması sonucu oluşan konformasyonel değişikliğin ADP’nin ATP ile değişimine imkan vermeyerek protein katlanmasını engelleyici özellik gösterdiği yönündedir. Bunun yanı sıra, bir çalışmada Bag-1S’nin protein katlanmasına pozitif yönde bir etki göstermesine karşın daha sonra yapılan bir çalışmayla negatif yönde bir etkide bulunduğu ortaya çıkartılmıştır. Bu konudaki belirsizlikler, Bag-1 izoformlarının Hsp70/Hsc70 sistemi üzerinden hücre yaşamındaki etkilerinin anlaşılmasını güçleştirmektedir. Bu durumla ilgili çeşitli hipotezler ortaya atılmış ve bunları destekleyici bazı sonuçlara ulaşılmıştır. Kritik yolakların aydınlatılması yolunda literatürde yer alan örnekler aşağıda özetlenmektedir. Bag-1’in Hsc70 ile etkileşimi sonucu Bcl-2 ile bir kompleks oluşturduğu gözlemlenmiştir. Anti-apoptotik Bcl-2 ile Bag-1’in etkileşimi, öncelikle Bag-1’in C-Raf (Raf-1) serin/treonin kinazı ile kompleks oluşturması sonucu gerçekleşir. Bunun sonucunda hücrenin yaşam ya da ölüm kaderini belirleyecek etkileşimlerin tetiklendiği ortaya çıkartılmıştır. Bag-1/C-Raf kompleksinin apoptoz öncüsü Bad (pro-apoptotik) proteinini fosforilasyonu sonucu, halihazırda hücrede bulunan Bcl-2’nin anti-apoptotik etkisini baskılayan Bcl-2/Bad etkileşimlerinin bozulabileceği ve böylelikle Bcl-2’lerin serbest kalarak apoptoz öncüsü Bax’in dimer oluşturmasını engellemesiyle hücrenin yaşamasının sağlandığı düşünülmektedir. Bu çalışmayla amaçlanan, MCF-7 meme kanseri hücre hattında Bag-1-ilişkili sağkalım mekanizmasının moleküler detaylarının aydınlatılmasıdır. Bu amaç doğrultusunda Bag-1’in ekspresyon seviyeleri değiştirilmiş ve hücreye etkisi incelenmiştir. Bag-1’in aşırı ekspesyonunu sağlama amacı ile TAP-tag içeren Bag-1’in ekspresyonunu arttıran plazmit; Bag-1’i susturmak için ise Bag-1’e özgü siRNA kullanılmıştır. Bag-1’in ekspesyonundaki değişikler western blotlama ile doğrulanmıştır. Bag-1’in aşırı ifadesinin hücre canlılığına yaptığı pozitif etkiler XTT hücre canlılığı ve tripan mavisi sağkalım deneyleri ile gösterilmiştir. Bag-1’in aşırı ifadesinin MCF-7 meme kanseri hücrelerinde sağkalımı arttırdığı gösterildikten sonra sağkalım yolağında görev yapan proteinlerin ekspresyonunun Bag-1 ekspresynundaki değişimlerle birlikte nasıl etkilendiği western blotlama ile araştırılmıştır. Western blot analizi sonuçları önemli MAP (mitogen-activated protein) kinazlar olan B-Raf ve C-Raf ekpresyonlarının Bag-1 aşırı ifadesi ile arrtığını göstermiştir. Ayrıca B-Raf’ın Serin 445, C-Raf’ın Serin 338 ve 289/296/301, Akt’nin Serin 473 bakiyelerinden fosfoslanma seviyelerinin ve Hsp70 expresyonunun da Bag-1 aşırı ekspesyonu ile arttığı, Bag-1’in susturulması ile azaldığı da western blotlama ile gözlemlenmiştir. Bag-1’ın hücre sağkalımını tetiklediği gösterildikten sonra Raf-Erk-MEK sinyal yolağının alt akışında bulunan proteinlerin de (Erk ve MEK) ekspresyonunu arttırdığı gösterilmiştir. Östrojen bağımlı meme kanseri hücrelerinde Bag-1’in bu sağkalım kompleksindeki etkileşim partnerlerini incelemek için ko-immünopresipitasyon yapılmıştır. Bag-1, fosforlanmış Akt, B-Raf, C-Raf, Bcl-2 ve Hsp70’in oluşturduğu bir kompleksin hücrede sağkalım mekanizmasını tetiklediği gösterilmiştir. Bag-1’in hücre içinde forforlanmış Akt, B-Raf, Bcl-2, Hsp70 ve C-Raf ile birlikte lokalize olduğu immüno hücre boyaması ile ispatlanmıştır. Daha önce sinir hücreleri (birincil hücre hattı) ile yapılan bir çalışmada Bag-1-ilişkili sağkalım kompleksine C-Raf’ın dahil olmadığı bulunmuştur., Bcl-2 associated athanogene family (athano = against death in Greek) proteins are discovered by co-immunoprecipitation with Bcl-2 anti-apoptotic protein. Bag genes are evolutionally conserved and their homologes exist in yeasts, plants and animals. Bag family members control the cell homeostais in two different ways: (1) They contribute to maintain cell’s vital activity under normal and stress conditions via regulating both positively and negatively the cycle of Hsp70/Hsc70 molecular chaperone system. For instance, the direction of the cell balance under normal and stress conditions are maintained by competitive binding of Hsp70 or Raf-1 to Bag-1. (2) They form complexes with transcription factors and nuclear hormone receptors, which are controlling various physiological processes such as apoptosis, tumorigenesis, neural differentiation and cell cycle independent from Hsp70/Hsc70 system. Bag-1 isoforms are produced by the alternative translation initiation of single mRNA transcript; thereby they differ in their N-terminus related to translation initiation. Bag-1 isoforms appear to be differently localized in the cells. Main Bag-1 isoforms which are observed in humans are Bag-1S (36 kDa), Bag-1M (46 kDa) and Bag-1L (50 kDa). There is also another isoform of Bag-1, 29 kDa, however, it is very scarce in the cell, and thus is not consistently detected. All of Bag-1 isoforms commonly contain both the ubiquitin-like domain (ULD) and Bag domain (BD) in their C-terminus. Even though ULD domain function is not clearly known, its evolutionary conservation and its relations with proteosome machinery indicate that ULD is necessary for stress tolerance. Bag-1L is localized in nucleus by means of its nuclear localization signal (NLS). NLS does not exist in Bag-1M, which is known to be cytosolic but some studies revealed Bag-1M translocation to nucleus via companion proteins, Bag-1S, on the other hand, always presents in cytosol. N-terminus of Bag-1L and Bag-1M consist of eight TXSEEX repeats. It is shown that these repeats have a role in DNA binding and transcription activation depending on their nuclear localizations. Having less repeat sequences, Bag-1S is the shortest isoform in the cells. Bag-1 has many critical roles in the cell through its interactions with certain target molecules to regulate carcinogenesis, differentiation, motility, proliferation, cell survival, apoptosis and transcription. Nuclear hormone receptors, Siah, CHIP, HGF receptor, Hsp70/Hsc70 complex, Bcl-2, and C-Raf (Raf-1) are known interacting partners of Bag-1. Cell survival and apoptosis are the two major pathways that Bag-1 is involved in. Bag-1 interactions with C-Raf or Bcl-2 are main mechanism that determine cell fate. Through these interactions Bag-1 gets invoved in the regulation the balance between cell death and cell survival. Although Bag-1 involvement in different mechanisms is known, the molecular details of these mechanisms and crosstalk between the pathways are not clear yet. In this study, we aimed to elucidate the molecular mechanism of Bag-1-associated cell survival in MCF-7 breast cancer cell line. To understand Bag-1’s influence on cell survival, we altered expression levels of Bag-1 in MCF-7 cells. TAP tagged-Bag-1 overexpressing plasmid was used for enhencement of Bag-1 level, and Bag-1 specific siRNA transfection was applied for down regulation of Bag-1. XTT cell proliferation assay and tryphan blue dye exclusion assay were performed to explain Bag-1’s effect on cellular level. Western blot analysis was used for checking expression levels of proteins that take part in cell survival and signaling pathways to investigate changes in the expression after Bag-1 overexpression or silencing. To deduce molecular details of Bag-1-related cell survival we checked interaction partners of Bag-1 during cell survival using co-immunoprecipitation. We also did immunocytochemistry to demonstrate subcellular co-localization of Bag-1 with its interaction partners from the cell survival complex. Our results showed that C-Raf is involved in the complex that is formed by B-Raf, Hsp70, phospho-Akt and Bcl-2 in order to phosphorylate Bad at serine 136 residue for the prevention of apoptosis., Yüksek Lisans, M.Sc.

Bu çalışmada, Hsp70'in iki bölge arasındaki sinyal iletim mekanizmasının moleküler temellerinin aydınlanmasını sağlamaya yönelik derin bir bakış açısı kazanılması amaç edinilmiştir. Bu bakımdan, DnaK(1-388) kullanılarak ATPaz allosterik mekanizmasında kritik öneme sahip olduğu düşünülen birçok amino asit ile mutasyon analizleri yapılmıştır. Bu mutasyon analizleri için seçilen residüler, ATPaz bölgesinin nükleotid bağlanma bölgesine yakın His226, Thr225, Asp85, Arg71 ve bu bölgeden biraz uzak olan His295'dir. Deneysel sonuçlarda, D85A ve R71A mutantlarının ATPaz aktivitelerinde yabanıl tip DnaK(1-388)'e kıyasla yüksek oranda artışa sebep oldukları gözlenmiştir. Bu sonuçlar, Asp85 ve Arg71 residülerinin ATPaz aktivitesinin düzenlenmesinde baskılayıcı etkilerinin olduğunu göstermektedir. Bunun yanında, H226A, H226F ve T225A mutantlarınınn pH aktivite profillerinin yabanıl tip DnaK(1-388)'e benzer olması bu mutasyonların ATPaz mekanizmasında bir etkilerinin olmadığını düşündürtmüştür. Bunların dışında, D85E ve H295D mutantları yabanıl tipten farklı bir pH aktivite profili sergilemiş ve DnaK(1-392)'ye benzer olarak pH 7.5 civarında bir aktivite artışı göstermişlerdir. Bu sonuçlar, bu mutantların DnaK(1-392)'ye benzer bir konformasyon gösterip, DnaK(1-392)'den kıyasla daha az da olsa ATPaz aktivitesinin stimülasyonunda etkilerinin olduğunu düşündürtmüştür. ATPaz aktivite deneyleri dışında mutasyonların neden olduğu ikincil yapısal değişiklikleri gözlemlemek için yapılan denatüre edici olmayan jellerde D85E ve H295D mutantlarının ATP varlığında benzer oligomerizasyon göstermeleri DnaK(1-388)'de bağlaç olmamasından dolayı IA ve IIA alt bölgeler arasındaki hidrofobik bölgesinin ATP-bağlı haldeyken açık olması sayesinde eksi yüklü residüler ile etkileşime girerek oligomerizasyona yol açtığını düşündürtmüştür. In this study, we aimed to understand allosteric mechanism underlying the linkerbinding effects to the ATPase domain by pinpointing the critical residues that arepresent in DnaK(1-388). In this regard, mutagenesis was performed on these residuesand pH-dependent ATPase assays were done to understand the roles of these residues inthe pH-dependent ATPase activity. When pH-activity profiles of Thr225 and His226replacements were compared to that of the ATPase constructs, we found that mutationsof these sites did not alter the ATPase mechanism and we revealed that the activitymechanism of the ATPase domain is different for linkerless version, DnaK(1-388),compared to DnaK(1-392). On the other hand, we found that replacement of Asp85 andArg71 cause 16 fold increase in the ATPase rate indicating these residues haverepressive effects on the modulation of ATPase activity in the linkerless version,DnaK(1-388). In this study, His295 was also investigated for its possible effect on the pH-dependent ATPase activity. We observed similar shift in the pH activity profiles ofH295D and D85E mutantsas observed in the DnaK(1-392) may indicating thesemutations can stimulate ATPase to a lesser extend than DnaK(1-392). In addition, tounderstand the structural effects of mutations we also did native gel electrophoresis andobserved similar oligomerizations for D85E and H295D suggesting that linker bindingcleft is exposed in the DnaK(1-388) in ATP-bound state and interact with negativeresidues. 87

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012, Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2012, Bu çalışmada, Hsp70’in iki bölge arasındaki sinyal iletim mekanizmasının moleküler temellerinin aydınlanmasını sağlamaya yönelik derin bir bakış açısı kazanılması amaç edinilmiştir. Bu bakımdan, DnaK(1-388) kullanılarak ATPaz allosterik mekanizmasında kritik öneme sahip olduğu düşünülen birçok amino asit ile mutasyon analizleri yapılmıştır. Bu mutasyon analizleri için seçilen residüler, ATPaz bölgesinin nükleotid bağlanma bölgesine yakın His226, Thr225, Asp85, Arg71 ve bu bölgeden biraz uzak olan His295’dir. Deneysel sonuçlarda, D85A ve R71A mutantlarının ATPaz aktivitelerinde yabanıl tip DnaK(1-388)’e kıyasla yüksek oranda artışa sebep oldukları gözlenmiştir. Bu sonuçlar, Asp85 ve Arg71 residülerinin ATPaz aktivitesinin düzenlenmesinde baskılayıcı etkilerinin olduğunu göstermektedir. Bunun yanında, H226A, H226F ve T225A mutantlarınınn pH aktivite profillerinin yabanıl tip DnaK(1-388)’e benzer olması bu mutasyonların ATPaz mekanizmasında bir etkilerinin olmadığını düşündürtmüştür. Bunların dışında, D85E ve H295D mutantları yabanıl tipten farklı bir pH aktivite profili sergilemiş ve DnaK(1-392)’ye benzer olarak pH 7.5 civarında bir aktivite artışı göstermişlerdir. Bu sonuçlar, bu mutantların DnaK(1-392)’ye benzer bir konformasyon gösterip, DnaK(1-392)’den kıyasla daha az da olsa ATPaz aktivitesinin stimülasyonunda etkilerinin olduğunu düşündürtmüştür. ATPaz aktivite deneyleri dışında mutasyonların neden olduğu ikincil yapısal değişiklikleri gözlemlemek için yapılan denatüre edici olmayan jellerde D85E ve H295D mutantlarının ATP varlığında benzer oligomerizasyon göstermeleri DnaK(1-388)’de bağlaç olmamasından dolayı IA ve IIA alt bölgeler arasındaki hidrofobik bölgesinin ATP-bağlı haldeyken açık olması sayesinde eksi yüklü residüler ile etkileşime girerek oligomerizasyona yol açtığını düşündürtmüştür., In this study, we aimed to understand allosteric mechanism underlying the linker binding effects to the ATPase domain by pinpointing the critical residues that are present in DnaK(1-388). In this regard, mutagenesis was performed on these residues and pH-dependent ATPase assays were done to understand the roles of these residues in the pH-dependent ATPase activity. When pH-activity profiles of Thr225 and His226 replacements were compared to that of the ATPase constructs, we found that mutations of these sites did not alter the ATPase mechanism and we revealed that the activity mechanism of the ATPase domain is different for linkerless version, DnaK(1-388), compared to DnaK(1-392). On the other hand, we found that replacement of Asp85 and Arg71 cause 16 fold increase in the ATPase rate indicating these residues have repressive effects on the modulation of ATPase activity in the linkerless version, DnaK(1-388). In this study, His295 was also investigated for its possible effect on the pH- dependent ATPase activity. We observed similar shift in the pH activity profiles of H295D and D85E mutantsas observed in the DnaK(1-392) may indicating these mutations can stimulate ATPase to a lesser extend than DnaK(1-392). In addition, to understand the structural effects of mutations we also did native gel electrophoresis and observed similar oligomerizations for D85E and H295D suggesting that linker binding cleft is exposed in the DnaK(1-388) in ATP-bound state and interact with negative residues., Yüksek Lisans, M.Sc.

Bcl-2 asosiye athano gen (Bag) ailesi (Yunanca ölüm karşıtı athanostan) proteinleri anti-apoptotik Bcl-2 proteini ile ko-immunopresipitasyon sonucu bulunmuşlardır.Belirlenmiş Bag proteinleri Bag-1 (RAP46/HAP46), Bag-2, Bag-3 (CAIR-1/Bis), Bag-4 (SODD), Bag-5 ve Bag-6 (BAT3/Scythe) olup hepsi C-terminus yakınında BAG domen (BD) ifadesine sahiptir. Bag proteinlerinin genellikle N terminuslarında farklılık göstermesi her bir Bag ailesi üyesinin çeşitli proteinler, yolaklar ve/veya lokalizasyonlara göre spesifite göstermesini sağlar. Hücrelerde Bag-1 izoformlarinin ekspresyon düzeyleri farklılık göstermektedir. Bu izoformlar hücrelerde bulunma sıklıklarına göre Bag-1S, Bag-1L ve Bag-1M olarak sıralanabilir. Buna rağmen tümörlü hücrelerde ekspresyon düzeyi en yüksek olan Bag-1L izoformudur. Bunun nedeni ise Bag-1L'nin nüklear lokalizasyonuna bağlı olarak transkripsiyon faktörlerinin aktivitesini yönlendirmesi ve böylece hücre proliferasyonunu dolaylı yoldan tetiklemesi olabilir.Bu çalışmayla amaçlanan, MCF-7 meme kanseri hücre hattında Bag-1-ilişkili sağkalım mekanizmasının moleküler detaylarının aydınlatılmasıdır. Bu amaç doğrultusunda Bag-1'in ekspresyon seviyeleri değiştirilmiş ve hücreye etkisi incelenmiştir. Bag-1'in aşırı ekspesyonunu sağlama amacı ile TAP-tag içeren Bag-1'in ekspresyonunu arttıran plazmit; Bag-1'i susturmak için ise Bag-1'e özgü siRNA kullanılmıştır. Bag-1'in ekspesyonundaki değişikler western blotlama ile doğrulanmıştır. Bag-1'in aşırı ifadesinin hücre canlılığına yaptığı pozitif etkiler XTT hücre canlılığı ve tripan mavisi sağkalım deneyleri ile gösterilmiştir. Bag-1'in aşırı ifadesinin MCF-7 meme kanseri hücrelerinde sağkalımı arttırdığı gösterildikten sonra sağkalım yolağında görev yapan proteinlerin ekspresyonunun Bag-1 ekspresynundaki değişimlerle birlikte nasıl etkilendiği western blotlama ile araştırılmıştır. Western blot analizi sonuçları önemli MAP (mitogen-activated protein) kinazlar olan B-Raf ve C-Raf ekpresyonlarının Bag-1 aşırı ifadesi ile arrtığını göstermiştir. Ayrıca B-Raf'ın Serin 445, C-Raf'ın Serin 338 ve 289/296/301, Akt'nin Serin 473 bakiyelerinden fosfoslanma seviyelerinin ve Hsp70 expresyonunun da Bag-1 aşırı ekspesyonu ile arttığı, Bag-1'in susturulması ile azaldığı da western blotlama ile gözlemlenmiştir. Bag-1'ın hücre sağkalımını tetiklediği gösterildikten sonra Raf-Erk-MEK sinyal yolağının alt akışında bulunan proteinlerin de (Erk ve MEK) ekspresyonunu arttırdığı gösterilmiştir.Östrojen bağımlı meme kanseri hücrelerinde Bag-1'in bu sağkalım kompleksindeki etkileşim partnerlerini incelemek için ko-immünopresipitasyon yapılmıştır. Bag-1, fosforlanmış Akt, B-Raf, C-Raf, Bcl-2 ve Hsp70'in oluşturduğu bir kompleksin hücrede sağkalım mekanizmasını tetiklediği gösterilmiştir. Bag-1'in hücre içinde forforlanmış Akt, B-Raf, Bcl-2, Hsp70 ve C-Raf ile birlikte lokalize olduğu immüno hücre boyaması ile ispatlanmıştır. Daha önce sinir hücreleri (birincil hücre hattı) ile yapılan bir çalışmada Bag-1-ilişkili sağkalım kompleksine C-Raf'ın dahil olmadığı bulunmuştur. Bcl-2 associated athanogene family (athano = against death in Greek) proteins are discovered by co-immunoprecipitation with Bcl-2 anti-apoptotic protein. Bag genes are evolutionally conserved and their homologes exist in yeasts, plants and animals. Bag family members control the cell homeostais in two different ways: (1) They contribute to maintain cell?s vital activity under normal and stress conditions via regulating both positively and negatively the cycle of Hsp70/Hsc70 molecular chaperone system. Bag-1 isoforms appear to be differently localized in the cells. Main Bag-1 isoforms which are observed in humans are Bag-1S (36 kDa), Bag-1M (46 kDa) and Bag-1L (50 kDa). There is also another isoform of Bag-1, 29 kDa, however, it is very scarce in the cell, and thus is not consistently detected. Cell survival and apoptosis are the two major pathways that Bag-1 is involved in. Bag-1 interactions with C-Raf or Bcl-2 are main mechanism that determine cell fate. Through these interactions Bag-1 gets invoved in the regulation the balance between cell death and cell survival. Although Bag-1 involvement in different mechanisms is known, the molecular details of these mechanisms and crosstalk between the pathways are not clear yet.In this study, we aimed to elucidate the molecular mechanism of Bag-1-associated cell survival in MCF-7 breast cancer cell line. To understand Bag-1?s influence on cell survival, we altered expression levels of Bag-1 in MCF-7 cells. TAP tagged-Bag-1 overexpressing plasmid was used for enhencement of Bag-1 level, and Bag-1 specific siRNA transfection was applied for down regulation of Bag-1. XTT cell proliferation assay and tryphan blue dye exclusion assay were performed to explain Bag-1?s effect on cellular level. Western blot analysis was used for checking expression levels of proteins that take part in cell survival and signaling pathways to investigate changes in the expression after Bag-1 overexpression or silencing. To deduce molecular details of Bag-1-related cell survival we checked interaction partners of Bag-1 during cell survival using co-immunoprecipitation. We also did immunocytochemistry to demonstrate subcellular co-localization of Bag-1 with its interaction partners from the cell survival complex. Our results showed that C-Raf is involved in the complex that is formed by B-Raf, Hsp70, phospho-Akt and Bcl-2 in order to phosphorylate Bad at serine 136 residue for the prevention of apoptosis. 93

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012, Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2012, 70 kDa ısı şoku proteinleri (Hsp70) yeni sentezlenen proteinlere bağlanarak onları agregasyon ve denatürasyondan koruyan proteinlerdir. Ayrıca yanlış katlanmış proteinlerin yeniden katlanmasında ve protein translokasyonunda görev alırlar. Stres koşullarında, örneğin; artan sıcaklık, ağır metal ve oksitleyici içeren çevre koşullarında, anlatımları indüklenir. Echerichia coli Hsp70 homoloğu DnaK 44 kDa boyutunda ATPaz bölgesi ve 25 kDa boyutunda substrat-bağlanma bölgesi içerir. Bu iki parçanın birbirleri ile etkileşimi ATP hidrolizi kontrolünde gerçekleşir. ATP bağlanmasıyla substratın bağlanıp ayrılma hızında artış gözlenir ve substrata olan affinite azalır. ATP’nin ADP’ye hidroliziyle, substratın bağlanıp ayrılma hızı azalır ve substrat affinitesi artar. Bu döngünün kontrolünde hidrofobik, esnek ve evrimsel süreçte korunmuş bağlayıcı bölgenin rolü büyüktür. Daha önce yapılmış olan bilimsel çalışmalar kesilmiş, ATPaz bölgesi ve bağlayıcı bölgenin tamamını içeren DnaK(1-392)’nin tam dizim substrat-stimüle DnaK gibi davrandığını göstermiştir. Bu bilgiyi kullanarak, DnaK(1-392) proteininde bazı residüleri mutasyona uğratarak allosterik mekanizmayı anlamaya çalıştık. 226. pozisyondaki histidin mutasyonunda pH 5.5 ila 8.5 aralığında ATPaz hızının 3-kat arttığı gözlendi. 225. pozisyonundaki treonin mutasyonunda da benzer sonuçlar bulundu. Bu sonuçlar H226 ve T225 residülerinin ATPaz bölgesinin açılıp kapanmasında önemli olduğunu gösterdi. 85. pozisyondaki aspartik asit mutasyonunda pH’ya bağlı ATPaz aktivitesinde önemli bir düşüş gözlendi. Bağlayıcı tarafından stimüle edilmiş ATPaz aktivitesinin kaybolması, D85 residüsünün allosterik bir bölge olduğunu gösterdi. Sonuç olarak, bu çalışmada T225 ve H226’nın ATPaz mekanizması için önemli olduğu ve D85’in ATPaz aktivasyonu için kritik olduğu bulundu, Hsp70 chaperones play important roles in cells including protein folding, trafficking, degradation. DnaK is an Echerichia coli Hsp70 homolog comprising a 44 kDa ATPase domain and a 25 kDa substrate-binding domain. DnaK has two nucleotide substrate-affinity states: In the ATP-bound state, substrate binding and release occur rapidly with low substrate-affinity, whereas in the ADP-bound state, slower substrate binding and release kinetics are observed with high substrate-affinity. Communication between the two domains is essential for chaperone function and is mediated via a conserved, flexible, hydrophobic linker region. Previous studies showed that truncated DnaK(1-392), containing the ATPase domain and the entire linker region, mimics the substrate-stimulated form of full-length DnaK. Using this knowledge, we aimed to understand the allosteric mechanism underlying the substrate binding effects to the ATPase domain by pinpointing the putative residues that are present in this path using DnaK(1-392). We found that replacement mutations of histidine at position 226 caused 3-fold enhancement in the ATPase rates for pH values between 5.5 to 8.5. A similar result was obtained for threonine 225 replacement mutation. These results suggest that H226 and T225 sites are important for the opening and closing of the ATPase domain. Replacement of D85 caused a dramatic loss of pH-dependence of ATPase activity. This result suggests that linker stimulated ATPase activity was lost by this mutation, revealing D85 as an allosteric site. Overall, our study revealed T225 and H226 as important sites in the ATPase mechanism, and D85 as a critical point for ATPase activation at the linker stimulated form., Yüksek Lisans, M.Sc.