The ubiquitin/proteasome system related role of Bag-1L in breast cancer

Meme kanseri dünya çapında önemli bir sağlık sorunudur. Gelişmiş ülkelerde bile halen kanserden ölümlere neden olan en önemli kanser tiplerinden birisidir. Meme kanserinin özellikle kadınlarda görülme sıklığının artması ve tedaviye yönelik yeni yaklaşımlara olan ihtiyaç artmakta ve bu alandaki araştırmalar hız kazanmaktadır.İnsan hücrelerinde, tek bir mRNA'dan alternatif translasyonla üç fonksiyonel BAG-1 izoformları ifade edilir. Hücrede lokalizasyonları değişen üç BAG-1 izoformlarının, BAG-1S (33 kDa), BAG-M (46 kDa) ve BAG-1L (52 kDa), farklı N-terminalleri mevcuttur. BAG-1L izoformu nükleer lokalizasyon sinyaline sahiptir ve büyük oranda nükleer bir proteindir. Nükleer lokalizasyon sinyalinin bir kısmı BAG1M'nin N-terminalinde bulunur, bu yüzden BAG-1M da nükleusa göç edebilir. Nükleer lokalizasyon sinyalinin çok az kısmını içeren BAG-1S nükleusta bulunmamaktadır fakat bazı koşullar altında bu sinyalin rol oynayabileceği bildirilmiştir. Aynı mRNA üzerinde BAG-1L ve BAG-1M izoformlarının ifadesi uç CUG ve AUG kodonlarıyla başlar, oysa BAG-1S ifadesi bir iç AUG kodonuyla başlar. BAG-1 izoformlarıyla, hücrenin hayatta kalması için sinyal iletiminde hubları oluşturan aday bir proteindir. Tümör hücrelerinde BAG-1L'nin nispeten yüksek ifade seviyeleri gözlemlendiği bildirilmiştir. Hücrenin hayatta kalmasında önemli bir protein olan BAG-1, başta meme kanseri olmak üzere birçok kanser çeşidinde ifade düzeylerinin arttığı gözlenmiştir. Bu yüzden dolayı kanser oluşmasında ve gelişmesinde incelenmesi gereken bir proteindir. Adoptör işlevine sahip BAG-1, bir anti-apoptotik proteindir. Hsp70/Hsc70 şaperonları, proteazom sistemi, Bcl-2 proteini, Raf-1 kinaz, nükleer hormon reseptörleri ve DNA gibi çeşitli moleküler hedeflerle etkileşime girebilir. Bu yüzden, çok çeşitli hücresel süreçlerin düzenlenmesinde yer almaktadır.HSP70/HSP90 hücrede bolca eksprese edilen ve hücre içindeki proteinlerin doğru katlanmasında ve işlevlerini kazanmarında önemli rol oynayan moleküler şaperonlardır. HSP90, HSP-aracılı anormal proteinlerin proteazomal degradasyonunda görevli olduğu bir çok yayında gösterilmiştir. Protein katlanma süreci endoplazmik retikulumda gerçekleşir. Bu sürece ER'de bulunan ısı şoku proteinleri, lektin proteinleri, disülfit izomerazlar katılır. Protein katlanmasında proteinin stabilitesini arttıran N-glikozilasyon gerçekleşir. N-bağlı glikanlar, proteinin çözünürlüğünü arttırır ve protein katlama yollarını doğrudan etkiler. α-glukosidaz I ve α-glukosidaz II enzimleri, katlanan proteinin N-terminalinde bulunan iki glikozu uzaklaştırır. Calnexin (ER membrana bağlı) ve Calreticulin (ER lümeninde) lektin şaperonlarıdır ve protein katlanmasını destekler. ER'deki lektin şaperonları ve BiP şaperonu arasında bir bağlantı vardır. BiP, hidrofilik N-glikanların eklenmesinden önce, yeni sentezlenen proteinin hidrofobik uzantısıyla etkileşir. BiP, N-terminal yakınındaki glikan içeren glikoproteinlerin olgunlaşmasında daha az rol oynaması olasıdır, çünkü bunlar hidrofiliktir, böylece BiP'nin bağlanması önlenir ve lektin şaperonlarının bağlanması teşvik edilir. Lektin şaperonları son glikana bağlanır ve sonra katlama işlemini kontrol ederler. Buna ek olarak, lektin şaperonları oksidoredüktaz ERp57 (PDI) ile kovalent olmayan şekilde etkileşir, böylece substrat üzerinde disülfid bağlarının oluşmasını ve izomerizasyonunu tetikleyebilir. PDI, disülfid izomeraz protein ailesinin bir üyesidir ve ER lümeninde bulunur. Disülfid bağının oluşumu nedeniyle proteinlerin konformasyonel esnekliği sınırlar ve proteinlerin yapısal sertliğini arttırır. ER'deki kalite kontrol mekanizmasına rağmen, protein katlanması yetersiz olduğunda ve protein düzgün bir şekilde katlanamadığında, anormal proteinler ER'de akümüle olur. Bu nedenle, katlanamamış protein cevabı (UPR) yolağının aktivasyonu gerçekleşir. UPR sisteminin bir parçası olan ERAD yolağıyla anormal proteinlerin ER'den sitozole retrotranslasyonu meydana gelir. ERAD yolağı, seçilmiş anormal proteinlerin retrotranslokasyonuna ve ubikuitin bağımlı proteazomal degradasyonuna aracılık eden bir dizi süreçten oluşur. Substrat dislokasyonunu yönlendiren enerji, ubikuitin bağımlı heksamerik AAA+ ATPase VCP (p97) tarafından adenosin trifosfat (ATP) hidrolizinden elde edilir. VCP, ERAD dislokasyon komplekslerine çeşitli ERAD bileşenleri ile doğrudan etkileşirek dahil olur. ERAD substratının polubikuinitinasyonu, VCP ile ekstraksiyonu kolaylaştırılır ve proteazomal degradasyonu için bağlanma bölgesi olarak işlev görür. Ubikuitin, substrat üzerinde N-terminaldeki lizin tortularına kovalent olarak bağlanabilen 76 amino asitten oluşan küçük bir proteindir. Ubikuitin ilavesi, E1 ubikuitin-aktive edici enzimi, E2 ubikitin-konjuge enzimini ve ubikuitinin substrata nihai transferine aracılık eden E3 ubikitin ligazını içeren ardışık enzimatik reaksiyonlar yoluyla gerçekleşir. CHIP (E3 ligaz), yanlış katlanmış proteinleri şaperonlardan proteazomlara yönlendiren bir sistemin parçasıdır. İki modülatör, BAG-1 ve CHIP, sitosolik bozunma yollarında rol oynar, ve moleküler şaperonları, nativ olmayan polipeptidlerin katlanması ve parçalanması arasındaki karar sürecinin merkezine yerleştirir. BAG-1'in etkileşim partneri olan ubikuitin/proteazom sistemiyle yanlış katlanmış ya da katlanamamış proteinlerin degredasyonu gerçekleşir. Proteazom ile ilgili çalışmalarda, proteazom inhibisyonunun toksik etkilerine kanser hücrelerinin, normal hücrelere kıyasla daha hassas olduğu gösterilmiştir. Kanser hücrelerinin daha yüksek hassasiyetinin ardındaki mekanizma belirsiz olmasına rağmen, proliferasyonunu ve anti-apoptotik yolakları düzenlemek için proteazomu kullanma olasılıkları yüksektir. Ubikuitin/proteazom sistemine katılan BAG-1'in kanser tedavisinde hedef molekül olabileceği düşünülmektedir.Retrotranslokasyon sırasında, anormal proteinlerin proteazomal degradasyonu için ubikitinler proteinlerin tanınması için işaret olarak eklenir. Ubikuitinasyon degrede olacak proteinlerin proteazoma iletilmesi dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçte etkilidir. BAG-1L izoformunun içerdiği UBL domaininden dolayı ubikuitinin katıldığı biyolojik süreçlerde BAG-1L'nin de rol oynayabileceği düşünülmektedir.Ayrıca, araştırmacılar BAG-1'in östrojen reseptörü üzerindeki etkisini araştırmış ve BAG-1L'nin östrojene bağımlı transkripsiyonu arttırdığını, ancak BAG-1M veya BAG-1S'nin transkripsiyonu artırmadığını bulmuşlardır. Araştırmacılar BAG-1L östrojen reseptörleri ile etkileşirerek reseptör aktivitelerini arttırdını belirtmiştir. Bu çalışmada, meme kanserli (MCF-7) ve epitel hücre hatlarında (MCF-12A) ve aynı zamanda meme dokularında BAG-1L ile ilişkili komplekslerin izolasyonunu içeren proteom-merkezli bir strateji benimsedik. BAG-1L ile ilişkili komplekslere katılan proteinler, C ve N-terminal TAP-etiketli BAG-1L pürifiye proteinlerden yapılan izoform-spesifik LC-MS/MS analizi ile tanımlanmıştır. BAG-1L ile ilişkili komplekslerde yer alan proteinlerin tanımlanması, meme kanserinde BAG-1L'nin adaptör rolünü kesin olarak ortaya çıkarmaktadır. Yaptığımız kanser hücre hattı immünoblotma deneyleriyle BAG-1L'nin ERAD mekanizmasındaki proteinlerle (BiP, HSP70, PDIA3, VCP, RAD23B, CANX ve CALR) kompleks oluşturduğunu ispatladık. Meme epitel hücre hattı imünoblotlama deneyleriyle ise kanser hücre hattına kıyasla farklılıklar gözlemledik. ERAD proteinlerinden HSP90 ve CHIP'in epitel hücrelerde BAG-1L ilişkili komplekste yer almadığını belirledik. Tümörlü ve normal meme dokularıyla yaptığımız immunoblotlama deneyleriyle, tümör dokularında ERAD mekanizması proteinlerinin, HSP70, RAD23, VCP ve CHIP, ifade düzeylerinin arttığını gözlemledik. Ayrıca, yine tümörlü ve normal dokularla yaptığımız immünopresipitasyon deneyleriyle, tümörlü dokularda ERAD proteinlerinin BAG-1 ile birlikte çöktüğünü yani BAG-1 ile etkileştiğini ispatladık.Biyoinformatik araçlarla yapılan diğer analizlerle, protein kalite kontrol sistemine BAG-1L izoformunun katıldığını ve hücre içi homeostazı korumak için ERAD mekanizmasında rol oynadığını belirledik. BAG-1L izoformunun proteazomla etkileşimi zayıf bir şekilde karakterize edittik, ubikitin aracılı proteazomal bozulmada BAG-1L izoformunun rolünün ayrıntılı bir şekilde anlaşılması eksiktir. Özellikle, proteozom mekanizmasının bileşenleri olan VCP/p97 ve RAD23 ile BAG-1L'nin protein-protein etkileşimlerinin bulunması, ubikuitine bağımlı proteazomal degradasyonda BAG-1L'ın rolünün belirlenmesinde kritiktir. An anti-apoptotic protein BAG-1, with its adaptor function, can interact with a diverse array of molecular targets such as Hsp70/Hsc70 chaperones, proteasome machinery, Bcl-2, Raf-1 kinase, nuclear hormone receptors and DNA, and is found to involve in the regulation of a wide variety of cellular processes. In human cells, three functionally distinct and differentially localized BAG-1 isoforms originating from a single mRNA are expressed through alternative translation and these three isoforms include BAG-1S (33 kDa), BAG-1M (46 kDa) and BAG-1L (52 kDa), which have distinct N-terminus. BAG-1L, which possess a nuclear localization signal is a largely nuclear protein, whereas BAG-1M partitions between nucleus and cytoplasm. BAG-1 with its isoforms is a candidate protein to form hubs to transmit signals for survival. It has been reported that relatively high BAG-1L levels are observed in tumor cells.Protein folding process occurs in the endoplasmic reticulum. This folding process involves heat shock proteins, lectin proteins, disulfide isomerases present in the ER. In protein folding, N-glycosylation occurs which increases protein stability. N-linked glycans increase protein solubility and directly affect protein folding pathways. Calnexin (ER membrane bound) and Calreticulin (ER lumen) are lectin chaperones and support protein folding. Lectin chaperones connect to the last glucose and then control the folding process. In addition, lectin chaperones interact non-covalently with oxidoreductase PDI (ERp57), thus triggering disulfide bond formation and isomerization on the substrate. PDI is a member of the disulfide isomerase protein family and is found in the ER lumen. The formation of disulfide bonds limits the conformational flexibility of the proteins and increases the structural stiffness of the proteins. Despite the quality control mechanism in ER, when protein folds are inadequate and the protein can not fold properly, aberrant proteins accumulate in the ER. Therefore, the activation of the unfolded protein response (UPR) occurs. Through ERAD pathway, which is part of the UPR system, abnormal protein retrotranslation from the ER to the cytosol occurs. The ERAD pathway consists of a series of processes that mediate the retrotranslocation of selected aberrant proteins and the ubiquitin-dependent proteasomal degradation. The energy that drives substrate dislocation is derived from adenosine triphosphate (ATP) hydrolysis by the abundant, ubiquitin-dependent hexameric AAA+ ATPase VCP (p97). VCP is recruited to ERAD dislocation complexes through direct interactions with several ERAD components. ERAD substrate polyubiquitination functions as a binding site that facilitates extraction by VCP and acts as the signal for proteasomal degradation. The addition of ubiquitin occurs via sequential enzymatic reactions involving an E1 ubiquitin-activating enzyme, an E2 ubiquitin-conjugating enzyme, and an E3 ubiquitin ligase that mediates the final transfer of ubiquitin to the substrate. CHIP (E3 ligase) is part of a system that directs misfolded proteins from chaperones to proteasomes. Two modulators, BAG-1 and CHIP, have implicated in cytosolic degradation pathways,xxiiputting molecular chaperones at the center of the decision process between folding and degradation of non-native polypeptides. The ubiquitin/proteasome system, the interaction partner of BAG-1, degrades misfolded or unfolded proteins.Investigating the effect of BAG-1 on the estrogen receptor has found that BAG-1L promotes estrogen-dependent transcription but BAG-1M or BAG-1S do not increase transcription of ER. BAG-1L interacts with estrogen receptors and enhances receptors activity. Studies on proteasome have shown that toxic effects of proteasome inhibition in cancer cells are more sensitive than normal cells. Although the mechanism behind the higher susceptibility of cancer cells is not known, there is a high probability of using the proteasome to regulate proliferation and anti-apoptotic pathways. BAG-1, an adaptor protein in the ubiquitin/proteasome system, can be used as a drug target in cancer due to cell survival effect. Here, we adopted a proteome-based strategy comprising isolation of BAG-1L associated complexes from breast cancer and epithelial cell lines as well as breast tissues. Identification of the proteins involved in BAG-1L associated complexes to ultimately delineate the adaptor role of BAG-1L in breast cancer. Proteins involved in BAG-1L associated complexes were identified via LC-MS/MS analysis with an BAG-1L isoform-specific manner. Further analyses with bioinformatics tools hinted the involvement of BAG-1L isoform in protein quality control system, which includes the action of endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) mechanism to maintain intracellular homeostasis of cellular proteins. Interaction of BAG-1L isoform with the proteasome were poorly characterized, detailed understanding of the involvement of BAG-1L isoforms in the ubiquitin mediated proteasomal degradation is lacking. Determined interactions which includes specifically VCP/p97 and Rad23, components of proteasome machinery, set a critical role for BAG-1 in the ubiquitin-dependent proteasomal degradation. 90