Atpase domain of DnaK, Escherichia coli Hsp70 molecular chaperone, experiences pH-dependent atpase activity upon linker binding

Proteinler DNA kontrolünde sentezlenen makromoleküllerdir. Proteinler foksiyonel özelliklerini gerçekleştirmek için özel 3-boyutlu yapısını kazanması gerekir. Proteinlerin bu 3-boyutlu yapılarını elde etmelerine katlanma denir. Christian Anfinsen yaptığı çalışmalarla proteinlerin elde edeceği 3-boyutlu yapı onların monomerleri olan amino asitlerinde saklı olduğunu göstermiştir. Bu çalışmaları doğrultusunda Christian Anfinsen, 1972 yılında nobel ödülü almıştır. Bazı küçük yapılı proteinlerin katlanması kendi kendine gerçekleşmesine rağmen; bir çok proteinin, hücre içinde katlanması kendi kendine gerçekleşemez. Protein katlanmasına yardımcı, protein yapılı moleküllere şaperon adı verilmektedir. Bu yardımcı proteinlerin, protin katlanması için gerekli olduğu 1989 yılında Arthur Horwich ve Ulrich Hartl tarafından yapılan iki ayrı çalışma ile gösterilmiştir ve bu tarihe kadar farz edilen proteinlerin hücre içerisinde kendi kendine katlandığı hipotezi çürütülmüştür. Yaklaşık son 25 senedir süre gelen çalışmalar, şaperonların proteinlerin 3 boyutlu yapılarının kazanılmasına nasıl yardımcı olduğu, bu proteinlerin hatalı katlanmalarını nasıl engellediği, bu proteinlerin moleküler mekanizmasının ne olduğu gibi sorulara cevap vermeyi amaçlamaktadır. Şaperonlar bakterilerden ökaryotlara kadar bütün organizmalarda korunmuş proteinlerdir. Şaperonlar normal koşullarda hücrede normal seviyede sentezlenmesine rağmen pH değişimi, sıcaklık değişimleri, oksidatif ve kimyasal stres durumlarında sentezlenmeleri önemli miktarda artar. Bu gibi olumsuz koşullarda hücre içinde sayıca artan şaperonlar, protein moleküllerinin yapısının bozularak fonksiyonlarının kaybolmalarını engeller. Böylece bu proteinler, diğer proteinlerin yanlış katlanmasından dolayı neden oldukları Alzheimer, Parkinson gibi hastalıkların oluşmasını engellemede önemli rol oynarlar. Günümüzde bu hastalıkların şaperon proteinler kullanılarak tedavi edilmesine yönelik çalışmalar gündeme gelmektedir.Hücre içerisinde bir çok şaperon protein ailesi olmasına karşın, Hsp70 en yaygın şaperonlardan olup, hemen hemen bütün organizmalarda bulunur. Hsp70 şaperon proteinleri hücrede protein katlanması, proteinlerin belli organellere taşınması, hatalı katlanmış proteinlerin tekrardan doğru katlanması gibi hücrede çok önemli görevleri vardır. Hsp70 proteini, protein katlanma reaksiyonunu katalizlemez, ancak hidrofobik bölgelere bağlanarak, bu bölgelerin uygunsuz bir biçimde birbirleriyle etkileşime girip, proteinin yanlış katlanmasını engeller. Proteinlerin hidrofobik bölgeleri ile kovalent olmayan etkileşimler gerçekleştirerek, hatalı katlanmaya neden olan bu bölgelerin istemsiz şekilde bir araya gelmesini engeller. Ancak Hsp70 proteininin bu işlemi nasıl gerçekleştirdiği, protin katlanma yolaklarında nasıl bir rol oynadığı günümüzde hala tam olarak aydınlatılamamıştır. Hsp70 proteinleri 44 kDa'lık N-terminal nükleotit bağlanma domainine (NBD) ve 25 kDa'lık C-ucu substrat bağlanma domainine (SBD) sahiptir. Bu iki domain birbirine çok korunmuş olan hidrofobik linker ile bağlanır. Nükleotit bağlanma bölgesine nükleotit bağlı bulunmaması veya ADP bağlı bulunması durumunda, iki domain birbirinden ayrı proteinler gibi hareket eder iken, nükleotit bağlanma bölgesine ATP'nin bağlanması iki domain birbiriyle etkileşmesine neden olur. Bu etkileşmiş yapıya, ''alosterik aktif'' konformasyon denir. Bu konformasyonda substrat bağlanma bölgesinin, subdtrata bağlanma afinitesi alosterik aktif olmayan konformasyona göre daha düşüktük. Daha sonra substrat bağlanma bölgesine bağlanan substrat, ATP'nin hidrolizini tetikler ve ATP hidrolizi sonucunda iki domain birbirimden ayrılır. Bu mekanizmada rol oynayan iki farklı koşaperon vardır. Bunlardan ilki Hsp40 protein ailesidir ve ATP hidrolizini hızlandırır, diğeri ise nükleotit değişim ailesi olan GrpE'dir. İki domain arasındaki bu allosterik ilişkinin, bağlaçın hidrofobik bir bölgesi olan 389VLLL392 sekansları tarafından sağlandığı önceki çalışmalarda açık bir şekilde gösterilmiştir. Çalışmalar tam protein için substrat varlığındakine benzer aktivite nukleotit bağlanma domain ve bağlacın 389VLLL392 bölgesine sahip olan eksik proteinde gözlemlemişlerdir. Aynı zamanda sadece nükleotit bağlanma bölgesine sahip olan ancak baglaca sahip olmayan eksik proteinin ATP hidroliz aktivitesi Hsp70 proteinin substrat yokluğundaki aktivitesini yansıtmaktadır. Nukleotit bağlanma domaine ek olarak bağlacın olması durumunda pH bağımlı ve baglaç olmayan yapıya göre çok daha yüksek ATP hidrolizi aktivitesi gözlenmektedir. Şu ana kadar süre gelen yapısal ve biyofizik çalışmalar mekanizma hakkında birçok sonuç ortaya koymasına rağmen, Hsp70'in çalışma mekanizmasını tam olarak açıklamaya yetmemiştir. Yapılan çalışmada E. coli Hsp70'i olan DnaK kullanılarak, katalilitik bölgede, ATP hidrolizide görev aldığı düşünülen amino asitlere mutasyonlar yapılarak bağlaç varlığında pH bağımlı, arttırılmış aktivitede görev alan amino asitler roller açıklanmaya çalışılmıştır. pH bağımlı aktiviteden sorumlu olduğu düşünülen E171, D194 ve D201 asidik amino asitleri nokta mutasyonu ile alanine çevrilerek, aktivitenin değişimi, ATP'ye bağlanmadaki farklılıklar, ADP salımındaki değişimler ve yapısal etkilenme ayrı ayrı incelenmiştir. Aynı incelemeler ve mutayonlar bağlaç içermeyen ATPaz domainine de uygulanmıştır. Böylece mutasyonların ve bağlaç mekanizma üzerindeki etkisi incelenmiştir. Bu incelemeler sonucunda, bağlaç varlığında bağlaç yokluğuna göre, proteinin katalizleme mekanizmasının farklı olabileceğini açıkça ortaya koymaktadır. Bağlaç varlığında ADP salımının reaksiyonun fizyolojik pH'da hız kısıtlayıcı reaksiyon olduğu açıkça gösterilmiştir. Fakat bağlaç yokluğunda ve uç pH değerlerinde hız kısıtlayıcı reaksiyonun ADP salımı olmadığı gözlemlenmiştir. Sonuç olarak, bu amino asitlerin hidrofobik korunmuş bağlaç varlığında ya da yokluğunda farklı görevleri olduğu gözlemlenmiştir. Bağlaç varlığında, E171 amino asitinin ve D201 amino asitinin katalitik aktivitede direk olarak görev alması ya da bunlardan birinin görev alarak, diğerinin ATP hidrolizinde görev alan amino asiti konumlandırmasının olası olduğu gösterilmiştir. Bağlaç yokluğunda ise yabanıl proteine göre bu amino asitlerin mutasyonu aktivitelerinin artmasına neden olmasına rağmen, ATP'ye olan bağlanma afinitelerinde herhangi bir değişiklik gözlemlenmemiştir. Bağlaç yokluğunda mutasyonun aktivite artışına sebep olması, bağlaç varlığında ise bu mutasyonlarının birinin varlığında aktvitenin tamamen yok olması; bu amino asitlerin, bağlaç içeren yapıda katalitik aktivitede çok önemli rol oynarken, linker yokluğunda böyle bir rollerinin olmadığını göstermektedir.ATPaz domainin bağlaç içermeyen yapısında düşük seviyede ve pH'ya bağımlı olmayan aktivite gözlemlenmesine rağmen ATPaz domaininin bağlaçlı yapısında pH 7.5 civarında pik yapan; asidik ve bazik bölgede azalan bir pH bağımlı aktivite gözlemlenmiştir. D194 amino asitini alanine çevrilerek yapılan ATPaz reaksiyonu hız ölçümleri bazik bölgede pH bağımlılığa neden olan amino asitin D194 olduğu açıkça göstermiştir. Bu sonuç önceki yapılan moleküler dinamik sonuçlarıyla da uyum göstermiştir. O çalışmalar, D194 amino asitinin yüksek pH değerlerine kadar protonlu kaldığını ve daha sonra protonunu kaybettiğini söylemektedir. Bunun sonucu olarak D194 amino asitinin mutasyonlu halinde alkali taraftaki aktivite azalmasının ortadan kalkması beklenen bir sonuçtur. Ayrıca yabanıl ATPaz domaininde yüksek pH'da D194'ün protonunu kaybetmesinden dolayı ADP salım hızı artmasına rağmen D194A mutasyonunda herhangi bir artış gözlemlenmemiştir. Bu da katalitik bölgede D194'ün karboksilli ucunda oluşacak eksi yükün ADP çıkışını hızlandırdığı, bu eksi yükün kaldırılmasının ise çıkışa herhangi bir etki yapmadığını açıkça ortaya koymaktadır. Ancak bu mutasyonun diğer pH'larda ATPaz hızını değiştirmemesi, D194'ün E171 ve D201'den farklı olarak ATP'nin kimyasal olarak parçalanmasınında bir rol oynamadığını, ancak ATP'nin ve ADP'nin konumlandırılmasında görev aldığını yapılan ATP afinite deneyleri ve ADP çıkış hızı ölçümleri açıkça göstermektedir.Ayrıca tripsin enzimi ile yapılan yapısal analiz çalışmalarında, E171A mutasyonunun yapıyı, diğer mutasyonlara göre çok daha fazla bozduğu ve proteinin ATP'yi konumlandırmasını zorlaştırdığını göstermektedir. D201A mutasyonunun ise yapıda fazla bir değişikliğe neden olmadığı gösterilmiştir. Hsp70 is a highly conserved molecular chaperone that plays significant roles in variety of cellular activities, such as de novo folding of newly synthesized proteins, refolding of misfolded proteins, protein trafficking and translocation to organelles. DnaK, Escherichia coli homolog of Hsp70 molecular chaperone, consists of two domains; an N-terminal ATPase domain (NBD) and a C-terminal substrate-binding domain (SBD), which are connected by a highly conserved hydrophobic linker. Conformational changes brought about by substrate binding to SBD causes NBD to adopt a conformation for efficient ATP hydrolysis and in the reverse direction ATP binding allows fast on and off rates for the substrate. Previous studies showed that allosteric communication between two domains of DnaK is provided by the conserved 389VLLL392 sequence on the linker region. In the presence of linker, DnaK(1-392), pH- dependent higher ATPase rates are observed, which mimics the substrate-stimulated activity of the full-length protein, whereas in the absence of linker, DnaK(1-388), behaves similar to the substrate-free unstimulated-form of the full-length. However, it has still not been revealed which amino acids are important in the allosteric mechanism underlying the linker induced conformational rearrangements in the ATPase domain. In this study, combined with previous molecular dynamic simulations, we found that the pH-dependent ATPase activity upon linker binding could be related to the well-identified catalytic residues, E171, D194 and D201, which participate in the correct localization of the Mg2+ ion. Further pH-dependent ATPase activity measurements revealed that the alkaline arm of the bell-shaped activity is caused by almost 5 pH units increased pKa, which is observed for D194 than to that of the expected pKa of Asp, upon its substitution with alanine, alkaline site of the bell shape was completely lost. In addition, when we mutated E171 or D201 to alanine, we observed that the linker-bound form of the ATPase domain did not reveal any pH-dependence. We think that linker-bound state of the ATPase domain experiences a pH-dependent ATPase activity due to a proton transfer reaction taking place during catalytic activity and this is only occurring with linker tucking onto the ATPase domain. In addition to ATPase activity measurements, ADP-dissociation, ATP affinity and trypsin digestion measurements were performed to provide evidence for the pH-dependent ATPase activity. 71