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At the cellular level, the integration of endogenous and exogenous signals and the resulting adaptive response enable cells to make decisions which are necessary for the functions and survival of organisms. Studying these decision-making processes at the single cell level has highlighted the functional role of gene expression variability, particularly during differentiation. In parallel, the literature also describes the existence of transcriptional memory between sister cells during divisions. Thus, understanding how the variability of gene expression, required for differentiation, and transcriptional memory combine and propagate over cell generations is a real challenge.In the first part of my thesis, I developed experimental and computational methods to analyse and compare the transcriptomes of sisters and cousin-cells (avian primary erythrocyte progenitors) maintained in a self-renewal or differentiation state. My work showed that in both states, sister-cells have more similar transcriptomes compared to unrelated cells. Furthermore, differentiating sister-cells are further apart than self-renewing sister-cells, and this sister-to-sister difference is enven more pronouced after a second division. Thus, transcriptional memory is gradually erased as differentiation proceeds. This erasure may be related to the increased gene variability observed at the beginning of the differentiation process. In the second part of my thesis, I molecularly characterised the point of irreversible commitment of erythrocyte progenitors differentiation. This single-cell study showed that committed progenitors induced to differentiate are able to phenotypically revert up to this crucial point; moreover, they return to a transcriptomic state almost identical to that of undifferentiated cells, highlighting a molecular plasticity during erythrocyte differentiation., A l’échelle cellulaire, l'intégration des signaux endogènes et exogènes et la réponse adaptée qui en découle permettent aux cellules de prendre les décisions nécessaires aux fonctions et à la survie des organismes. L’étude de ces processus décisionnels investiguée à l’échelle de la cellule unique a mis en évidence le rôle fonctionnel de la variabilité de l’expression génique notamment au cours de la différenciation. Parallèlement, est aussi décrit dans la littérature, l’existence d’une mémoire transcriptionnelle entre cellules sœurs au cours des divisions. Ainsi, comprendre comment la variabilité de l'expression génique nécessaire à la différenciation et la mémoire transcriptionnelle se combinent et se propagent au cours des générations cellulaires est un véritable défi. Dans la première partie de ma thèse, j’ai ainsi développé des méthodes expérimentales et computationnelles pour analyser et comparer les transcriptomes de cellules sœurs et cousines (progéniteurs érythrocytaires primaires aviaires) maintenues en état d’auto-renouvellement ou de différenciation. Mes travaux ont montré que dans les deux états, les cellules sœurs ont des transcriptomes plus proches entre elles comparés à des cellules non-apparentées. De plus, les cellules sœurs en cours de différenciation sont plus éloignées les unes des autres que les cellules sœurs qui s'autorenouvellent, et cette différence entre sœurs est encore plus prononcée après une deuxième division. Ainsi, la mémoire transcriptionnelle s'efface progressivement au fur et à mesure de la différenciation. Cet effacement peut être lié à l'augmentation de la variabilité génétique observée au début du processus de différenciation. Dans la seconde partie de ma thèse, j’ai caractérisé moléculairement le point d’engagement irréversible en différenciation de ces progéniteurs érythrocytaires. Cette étude menée à l’échelle de la cellule unique a permis de montrer que les progéniteurs engagés en différenciation sont capables de réverter phénotypiquement jusqu’à ce point crucial ; de plus, ils retrouvent un état transcriptomique quasiment identique à celui de cellules indifférenciées, mettant en lumière une plasticité moléculaire lors de la différenciation érythrocytaire.

Dynamic models are essential tools for exploring regulatory mechanisms in biology. This thesis was guided by the need expressed in oncology and developmental biology to automatically infer Boolean networks reproducing cellular differentiation processes.By considering observations and knowledge that the modelers have at their disposal, this thesis presents an approach that allows to model the richness of this cellular behavior by inferring all the compatible Boolean networks at that scale of the regulatory networks commonly considered in biology.To develop this method, three main contributions are presented.The first contribution is a formal framework of the properties of data collected to study cellular differentiation. This framework allows reasoning about the desired dynamic properties within Boolean networks to be consistent with this cellular behavior.The second contribution concerns the encoding of the model inference problem as a Boolean satisfiability problem whose solutions are the Boolean networks compatible with the biological data. For this, constraints on the dynamics of Boolean networks corresponding to the previously formalized properties have been implemented in logic programming.The last contribution was to apply to real biological problems the model inference method, named BoNesis, which was developed thanks to the constraints. These applications showed the benefit of inferring a set of models for the process analysis and illustrated the modeling methodology, from the preparation of biological data to the analysis of the inferred models.; Les modèles dynamiques sont des outils importants pour l'exploration des mécanismes de régulation en biologie.Les travaux de cette thèse sont guidés par le besoin exprimé en biologie du développement et en cancérologie d'inférer automatiquement des réseaux booléens reproduisant des processus de différenciation cellulaire.En considérant les observations et les connaissances que les modélisateurs ont à disposition, ce mémoire de thèse présente une approche qui permet de modéliser la richesse de ce comportement cellulaire en inférant l’ensemble des réseaux booléens compatibles tout en passant à l’échelle des réseaux de régulation couramment considérés en biologie.Afin de développer cette méthode, les travaux présentés se décomposent en trois contributions principales.La première contribution est la proposition d'un cadre formel sur les propriétés des données collectées pour étudier la différenciation cellulaire. Ce cadre permet de raisonner sur les propriétés dynamiques souhaitées au sein des réseaux booléens pour qu’ils soient compatibles avec ce comportement cellulaire.La deuxième contribution porte sur l'encodage du problème d’inférence de modèles comme un problème de satisfiabilité booléenne dont les solutions sont les réseaux booléens compatibles avec les données biologiques. Pour cela, des contraintes sur la dynamique des réseaux booléens correspondant aux propriétés précédemment formalisées ont été implémentées en programmation logique.La dernière contribution est l’application à des problématiques biologiques réelles de la méthode d’inférence de modèles, nommée BoNesis, qui a été développée grâce aux contraintes créées. Ces applications ont montré l’apport de l’inférence d’ensemble de modèles pour l’analyse de processus et illustré la méthodologie de modélisation, de la préparation des données biologiques à l’analyse des modèles inférés.

Le but de notre étude visait à déterminer si les matrices ECM (extracellular matrix) préparés à partir d'un modèle vertébré (Axolotl) capables de régénérer ses tissus suite à une blessure sont plus efficaces pour stimuler les réponses régénératives chez les animaux non régénérant (par exemple les mammifères). Nous avons testé la capacité de matrice ECM axolotl à améliorer la guérison des plaies cutanées dans des souris et nous les avons comparés à une matrice disponible commercialement (échafaudage Symbios PerioDerm) pour leur efficacité à favoriser la guérison des plaies. Des lésions d'excision ont été créées sur le dos de souris et les animaux ont été regroupés dans différents groupes; a-) ECM de peau axolotl décellularisée (groupe Axolotl), b-) matrice de derme acellulaire Symbios Perioderm (groupe PerioDerm), c-) grillage en titane (groupe témoin); respectivement. Les tissus des plaies ont été récoltés à des moments précis : 7 jours et 30 jours après la blessure pour évaluer la guérison des plaies. La guérison des blessures ayant reçu les différentes matrices a été comparées entre elles en utilisant le test de transillumination et des analyses histologiques. Les résultats indiquent que la ECM de peau d’axolotl décellularisée est bien tolérée par les souris, car aucun rejet n'a été observé. Le groupe qui a reçu l'ECM de la peau axolotl décellularisé a démontré une réépithélialisation, une densité cellulaire, une teneur en collagène (avec une organisation similaire à un tissu intact) et une vascularisation (angiogenèse) élevées par rapport aux groupes PerioDerm et témoins. La présence de follicules pileux était également observé dans le groupe axolotl (qui n'est pas présent dans PerioDerm et groupes de contrôle). Sur la base de nos résultats, l'hypothèse de base semble être correcte en ce qu'une matrice ECM provenant d'un régénérateur puissant semble favoriser la guérison plus efficacement chez les animaux normalement non régénérants. Cependant, des recherches supplémentaires devront être menées pour confirmer ces résultats., The aim of our study sought to determine whether ECM scaffolds prepared from a vertebrate model (Axolotl) capable of regenerating tissues following injury are more effective at stimulating regenerative responses in non-regenerating animals (e.g., mammals). We tested the ability of axolotl decellularized ECM scaffolds to improve skin wound healing in mammalian models and compare the axolotl skin ECM scaffold to a commercially available one (Symbios PerioDerm scaffold) for efficiency in promoting wound healing. Excisional lesions were created on the back of mice, and animals in different groups were treated by; a-) decellularized axolotl skin ECM (Axolotl group), b-) Symbios Perioderm acellular dermis scaffold (PerioDerm group), d-) Titanized mesh only (Control group); respectively. Wound tissues were harvested at time points: 7- and 30-days post-wounding to assess the scaffolds impact on wound healing. Wound healing was compared between the Axolotl, PerioDerm and Control groups using transillumination test and histological analyses, Results indicate that the decellularized axolotl skin ECM is well tolerated by mammalian models, as no immune rejection was observed. The axolotl group that received the decellularized Axolotl Skin ECM demonstrated high reepithelialization, cellular density, collagen content (in a porous pattern similar to intact skin), vascularization (angiogenesis) compared to PerioDerm and control groups. The presence of hair follicles was also observed in the axolotl group (which is not present in PerioDerm and control groups). Based on our results, the basic hypothesis appears to be correct in that an ECM scaffold from a strong regenerator seems to promote healing more efficiently in non-regenerating animals. However, further research should be conducted to confirm these findings.

Durant l’hématopoïèse, les cellules souches hématopoïétiques peuvent soit s’autorenouveler soit se différencier dans les divers types de cellules matures constituant le système hématopoïétique. Un des modèles prédominants sur le développement du système hématopoïétique postule une différenciation par étape des différentes lignées le constituant. Ce modèle débute avec les cellules souches hématopoïétiques qui donnent naissance à des précurseurs multipotents qui peuvent à leur tour se différencier en précurseurs dédiées à la lignée lymphoïde ou myéloïde. Bien que la dernière décennie ait apporté de nombreuses connaissances sur les principales signalétiques transcriptionnelles impliquées dans le développement hématopoïétique, le détail des mécanismes moléculaires en jeu expliquant comment les cellules souches hématopoïétiques sont initialement amorcées puis complètement engagées vers une voie de différenciation reste toujours à élucider. Le travail de notre laboratoire indique que l’assemblage combinatoire du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF est un élément clé parmi les mécanismes épigénétiques qui gouvernent le destin cellulaire et notamment la famille de sous-unités Smarcd qui comporte 3 membre alternatifs Smarcd1/2/3. Des analyses du transcriptome par séquençage haut débit ont montré que l’expression de la sous-unité Smarcd1 du complexe est élevée dans le compartiment des cellules souches, les précurseurs multipotents et les progénitures lymphoïdes tandis que la sous-unité Smarcd2 est principalement exprimée dans les précurseurs myéloïdes. En utilisant des modèles de délétion conditionnelle dans des modèles murins, nous avons démontré que Smarcd1 et Smarcd2 jouent des rôles critiques et lignés spécifiques durant l’hématopoïèse. Dans un premier temps, nous avons pu montrer que Smarcd1 collabore avec le facteur de transcription de la famille bHLH E2A pour spécifier le destin lymphoïde des précurseurs multipotents et qu’elle est donc absolument essentielle pour la lymphopoïèse. Notre travail sur les mécanismes moléculaires en jeu a pu montrer que Smarcd1 interagit directement avec E2A et est nécessaire pour l’accessibilité de la chromatine sur un ensemble de régions enrichies avec les modifications d’histones H3K27ac/H3K3me1 qui marquent des régions activatrices (« enhancer ») impliquées dans l’activation d’une signature lymphoïde dans les précurseurs multipotents. Le blocage de l’interaction entre Smarcd1 et E2A inhibe l’amorce de cette signature lymphoïde et bloque l’émergence de précurseurs destinés à la voie lymphocytaire. Concernant la fonction de Smarcd2, nous avons pu montrer que cette sous-unité est absolument nécessaire pour la granulopoïèse. Les souris ayant subi une délétion génétique de Smarcd2 deviennent très rapidement neutropéniques. Ce phénotype découle d'un blocage au stade de différenciation myélocyte/métamyélocyte, tandis que les autres lignées hématopoïétiques restent non affectées par la délétion. Nous avons pu identifier le facteur de transcription C/ebpƐ comme un partenaire essentiel de Smarcd2 qui interagit avec le complexe SWI/SNF sur les promoteurs de gènes de granules secondaires afin d’en activer la transcription. Les analyses du transcriptome que nous avons effectué lorsque l’interaction de Smarcd2 et C/ebpƐ est interrompue dans des précurseurs de granulocytes ont montré une diminution de l’expression des gènes de granules secondaires liée à une maturation incomplète des granulocytes menant au développement d’un syndrome de myélodysplasie au court du temps., During hematopoiesis, hematopoietic stem cells (HSCs) either selfrenew or differentiate into all mature blood cell types through successive rounds of binary cell fate decisions. The prevailing model of hematopoiesis predicts a step-by-step model of lineage differentiation in which HSCs first give rise to multipotent progenitors that subsequently differentiate into myeloid and lymphoid restricted progenitors. Although key transcriptional pathways controlling hematopoietic development are beginning to be deciphered, detailed molecular mechanisms explaining how HSCs and progenitors are initially primed and then commit to the different hematopoietic cell lineages are lacking. Work from our laboratory indicates that combinatorial assembly of the mammalian SWI/SNF (mSWI/SNF) chromatin remodeling complex is a key epigenetic mechanism that governs cell fate decisions. Transcriptomics analyses revealed that expression of the Smarcd1 subunit is enriched in hematopoietic stem/progenitors and early lymphoid cells, while Smarcd2 is mainly expressed in myeloid progenitors. Using conditional knock-out mouse models, we demonstrated that Smarcd1 and Smarcd2 subunits perform critical and lineage-specific roles during hematopoiesis. First, we found that Smarcd1 collaborates with the bHLH transcription factor E2A to specify lymphoid cell fate during hematopoiesis and, therefore, is absolutely required for lymphopoiesis. Mechanistically, we showed that Smarcd1 physically interacts with E2A and is required for chromatin accessibility of a set of H3K27ac/H3K4me1-enriched enhancers that coordinate activation of the early lymphoid signature in hematopoietic stem cells. Impairing the interaction between Smarcd1 and E2A inhibits lymphoid lineage determination and the emergence of lymphoid-primed multipotent progenitors. Conversely, we showed that Smarcd2 is absolutely required for granulopoiesis. Smarcd2-deficient mice quickly become neutropenic due to a XIII block at the myelocyte/metamyelocyte stage of granulocyte maturation while other lineages remain unaffected. We discovered that Smarcd2 interacts with the transcription factor C/ebpε to recruit the mSWI/SNF complex on the promoter of secondary granule genes, thus inducing their transcriptional activation. As shown by transcriptomic analysis, impairing this interaction results in decreased expression of secondary granule genes, improper granulopoietic maturation, and development of a myelodysplastic-like syndrome over time. Altogether, this work identifies the Smarcd1 and Smarcd2 subunits of SWI/SNF complexes as master chromatin remodelers allowing the recruitment of lineage-specific transcription factors at key regulatory loci controlling lymphoid lineage priming and granulocyte development, respectively. More globally, these studies highlight that combinatorial assembly of alternative subunits of mSWI/SNF complexes is a key epigenetic mechanism controlling cell fate decisions during hematopoiesis.

Au pic de la réponse effectrice des LT CD8, on retrouve deux sous-populations, soit les effecteurs à demi-vie courte (SLEC) ou les effecteurs précurseurs de cellules mémoires (MPEC). La phase de contraction de la réponse effectrice implique l’apoptose des SLEC et la survie des MPEC, qui se différencient en cellules mémoires pour protéger contre une réinfection. La voie Notch est impliquée dans les choix de différenciation binaire et l’interaction ligand-récepteur mène au clivage du domaine intracellulaire de Notch (NICD), qui migrera au noyau afin d'induire l’expression de gènes cibles. Dans un modèle où l’expression des récepteurs Notch1 et Notch2 est absente uniquement dans les LT CD8 (N1N2∆/∆), le laboratoire a démontré que l’absence du signal Notch favorisait la différenciation en MPEC et affectait l’expression de 217 gènes. Cette étude visait à 1) identifier les gènes cibles de Notch contrôlant la différenciation SLEC-MPEC, et 2) évaluer si l’absence du signal Notch permet un meilleur contrôle tumoral par les LT CD8. Nous avons priorisé les 217 gènes en fonction de différents critères et identifié Il2ra comme une cible importante en aval de la voie Notch. Toutefois, nous avons établis que lors d’une infection aiguë, la surexpression rétrovirale de Il2ra dans les LT CD8 N1N2∆/∆ n’influençait pas la différenciation SLEC-MPEC. Nous avons également déterminé qu’une thérapie adoptive de LT CD8 N1N2∆/∆ limitait le contrôle de la croissance tumorale et impliquait une diminution des fonctions effectrices des LT CD8 N1N2∆/∆, qui étaient moins terminalement différenciés. Une meilleure compréhension du rôle de Notch dans la réponse des LT CD8 permettra de développer de nouvelles stratégies de vaccination et de traitement du cancer., In response to acute infections, effector CD8 T cells differentiate into short-lived effector cells (SLECs) and memory precursor effector cells (MPECs) capable of generating long-lived memory CD8 T cells. The Notch signaling pathway is a key regulator of cell fate decision. Following ligand- receptor interaction, the Notch intracellular domain (NICD) is cleaved and migrates to the nucleus in order to induce the expression of target genes. In a model in which Notch1 and Notch2 expression is inhibited only in mature CD8 T cells, our team has established that Notch deficiency favors MPEC differentiation in CD8 T cells and influences the expression of 217 gens. This study aims to: 1) identify target genes of the Notch pathway regulating SLEC-MPEC differentiation, 2) evaluate if Notch deficiency can augment tumor control by CD8 T cells. We have prioritized the list of genes differentially expressed in the absence of Notch signaling according to various criteria. We hence identified Il2ra as a target gene, but during an acute infection, overexpression of Il2ra in Notch deficient CD8 T cell was insufficient to modulate SLEC-MPEC differentiation. In addition, we have established that adoptive therapy with Notch deficient CD8 T cell impaired tumor control and implicated a diminution of effector function in Notch deficient CD8 T cell, which were less terminally differentiated. A better understanding of Notch signaling pathway’s role in the CD8 T cell response will allow for improvement of vaccinal strategies and cancer treatment.

RATIONALE - Somatic embryogenesis (SE) is one of the most promising processes for large-scale dissemination of elite varieties. However, whatever the species considered, SE research still remains essentially empirical resulting in many drawbacks to fulfil market demands, especially due to an overall slow technical progress over the last 20 years. Knowledge about the molecular events involved in the key steps of the SE process is urgently needed to pilot the optimization of SE protocols. In this study, we took advantage of the latest metabolomics technologies and applied them to one of the most advanced and reliable large-scale SE processes, the one developed for coffee. METHODS - Sampling covered 15 key developmental stages. Five independent leaf introductions were carried out with more than 4,000 leaf explants and a total of 25 independent cell lines. All obtained cell lines were high-yielding and time-synchronized during embryo regeneration enabling a successful sampling. Primary metabolites, secondary metabolites and phytohormones were quantified using GC-MS, HPLC and UPLC- MS/MS respectively. A robust statistical method was used to identify metabolic pathway changes associated with the main developmental phases and phase switches. Histological analysis and cell imaging were also required to characterize developmental stages and associate metabolic profiles with cell structure organization. Lastly, comparing Arabica embryogenic and non-embryogenic calli enabled the identification of metabolic markers of the embryogenic capacity. RESULTS - Statistical analysis performed on 104 metabolites revealed that massive re-configuration of metabolic pathways induced SE. During initial dedifferentiation, a sharp decrease in phenolic compounds and caffeine levels was observed while auxins, cytokinins and ethylene levels were at their highest. Totipotency reached its highest expression during the callus stages when a shut-off in hormonal and metabolic pathways related to sugar and energetic substance hydrolysis was evidenced. Abscisic acid, leucine, maltotriose, myo-inositol, proline, tricarboxylic acid cycle metabolites and zeatin appeared as key metabolic markers of the embryogenic capacity. Combining metabolomics with multiphoton microscopy led to the identification of chlorogenic acids as markers of embryo redifferentiation. CONCLUSIONS & PERSPECTIVES - The present analysis shows that metabolite fingerprints are signatures of cell fate and represent a starting point for optimizing SE protocols in a rational way. These findings should be informative and useful to a wide range of plant species, offering unprecedented perspectives in plant micropropagation.

Objectives: to investigate the specificity, clinical implication and prognostic value of MRI adipocytic maturation (MAM) in myxoid/round cells liposarcomas (MRC-LPS) treated with neoadjuvant chemotherapy (NAC). Methods: of the 89 patients diagnosed with MRC-LPS at our sarcoma reference center between 2008 and 2018, 28 were included as they were treated with NAC, surgery and radiotherapy. All patients underwent contrast-enhanced MRIs at baseline and late evaluation. A control cohort of 13 high-grade pleomorphic and dedifferentiated LPS with same inclusion criteria was used to evaluate the specificity of MAM in MRC-LPS. Two radiologists analysed the occurrence of MAM, changes in the tumor architecture, shape and surrounding tissues during NAC. Pathological features of tumor samples were reviewed and correlated with MRI. Metastatic relapse-free survival (MFS) was estimated with Kaplan-Meier curves and Cox models. Associations between prognostic T1-based delta-radiomics features (RF) and MAM were investigated with Student t-test. Results: MAM was more frequent in MRC-LPS (p=0.045) and not specific of any type of chemotherapy (p=0.7). Regarding MRC-LPS, 14 out of 28 patients (50%) demonstrated MAM. Eight patients showed metastatic relapses. MAM was not associated with MFS (p=0.9). MAM correlated strongly with the percentage of histological adipocytic differentiation on surgical specimen (p, Objectifs : étudier la spécificité, l’implication clinique et la valeur pronostique de la maturation adipocytique en IRM (MAM) dans les liposarcomes myxoïdes / à cellules rondes (M/RC-LPS) traités par chimiothérapie néo-adjuvante (NAC). Matériel et méthode : sur les 89 patients diagnostiqués de MRC-LPS dans notre centre de référence de sarcome entre 2008 et 2018, 28 ont été traités par NAC, chirurgie et radiothérapie et inclus. Tous les patients ont bénéficié d’IRM injectées au diagnostic et dans leur suivi tardif. Une cohorte témoin de 13 LPS pléomorphiques et dédifférenciés de haute grade avec les mêmes critères d’inclusion a été utilisée pour évaluer la spécificité de MAM dans MRC-LPS. Deux radiologues ont analysé l’occurrence de la MAM, les changements dans l’architecture de tumeur, la forme et les tissus environnants pendant la NAC. Les données anatomo-pathologiques des échantillons tumoraux ont été relues et corrélées avec l’IRM. La survie sans rechute métastatique (MFS) a été estimée avec les courbes Kaplan-Meier et les modèles de Cox. Les corrélations entre les caractéristiques pronostiques de delta-radiomics (RF) et la MAM ont été étudiées avec le t-test de Student. Résultats : la MAM était plus fréquente dans MRC-LPS (p=0,045) et n’était pas spécifique d’un type de chimiothérapie (p=0,7). En ce qui concerne les MRC-LPS, 14 patients sur 28 (50 %) ont présenté une MAM. Huit patients ont présenté des rechutes métastatiques. La MAM n’a pas été associé à la MFS (p=0,9). La MAM a été fortement corrélée avec le pourcentage de différenciation adipocytique histologique sur la pièce chirurgicale (p

Flow cytometry and autoradiography are extensively used for the evaluation of the number of cells in S-phase in order to study the proliferative activity within tissues and organs. The recent development of a monoclonal antibody against 5-bromo-2’deoxyuridine (BrdUrd), a nonradioactive thymidine analogue that is incorporated within DNA-synthetizing cells, allows the immunochemical detection of proliferating cells. The use of this antibody allows an immunocytochemical detection of proliferating cells «in situ» on tissue sections.We have applied this new technique for the identification of proliferating cells within the tooth and other organs of rat mouth during development. We believe that this technique, for its precision and simplicity, may be a powerful tool for studying the citokinetic and the differentiation of normal and neoplastic cells within the mouth as well as in other districts of the body., Afin d’évaluer avec précision la prolifération cellulaire dans un tissu ou un organe, on emploie couramment la cytofluorimétrie en flux ainsi que les techniques autoradiographiques, qui permettent d’obtenir des informations sur le nombre de cellules en phase S et par conséquent en prolifération.Récemment, de nouvelles techniques non autoradiographiques ont été mises au point pour l’identification des cellules en prolifération. Ces techniques exploitent l’incorporation de la 5-bromo-2’déoxyuridine (BrdUrd), analogue de la thymidine, dans le DNA en voie de duplication. Ces techniques utilisent un anticorps monoclonal dirigé contre la BrdUrd pour évaluer l’incorporation de cette dernière dans les cellules en phase S. L’emploi de cet anticorps en immunocytochimie permet une facile identification «in situ», sur des coupes de tissu, des cellules en prolifération.Nous avons utilisé ce procédé immunocytochimique pour repérer et identifier les cellules en prolifération dans la dent et dans d’autres organes de la cavité buccale du rat nouveau-né, organes qui sont donc encore en cours de développement. Nous estimons que la technique utilisée dans cette recherche peut constituer, par sa précision et sa simplicité, un instrument valable pour l’étude de la prolifération cellulaire ainsi que de la différenciation cellulaire dans les tissus de la dent et de la cavité buccale, aussi bien dans le domaine de l’organogenèse que dans celui de la pathologie tumorale.

International audience; Vitamin A (retinol) is a micronutrient critical for cell proliferation and differentiation. In adults, vitamin A and metabolites such as retinoic acid (RA) play major roles in vision, immune and brain functions and tissue remodelling and metabolism. This review presents the physiological interactions of retinoids and endocrine tissues and hormonal systems. Two endocrine systems have been particularly studied. In the pituitary, retinoids target the corticotrophs with a possible therapeutic use in corticotropinomas. In the thyroid, retinoids interfere with iodine metabolism and vitamin A deficiency aggravates thyroid dysfunction caused by iodine-deficient diets. Retinoids use in thyroid cancer appears less promising than expected. Recent and still controversial studies investigated the relations between retinoids and metabolic syndrome. Indeed, retinoids contribute to pancreatic development and modify fat and glucose metabolism. However, more detailed studies are needed before planning any therapeutic use. Finally, retinoids probably play more minor roles in adrenal and gonads development and function apart from their major effects on spermatogenesis.

Chromatin-based mechanisms are pivotal regulators of transcriptional patterns that are central to cell fate determination, organogenesis and development in multicellular organisms. The activity of Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) is involved in the maintenance of transcriptional gene repression by catalysing the trimethylation of histone H3 on lysine 27 at specific loci, and is a conserved modulator of developmental programs.To reveal the extent to which PRC2 shapes transcriptional decisions during cell fate specification, I have characterized the epigenome organization of a single cell type from the root stem cell niche (SCN). Quantitative integration of (epi)-genomic data revealed three main chromatin states that correlate with distinct gene expression levels as well as patterns along the differentiation gradient. These results indicate that PRC2 activity over specific genes within the SCN regulates their timing of expression in daughter cells, at successive differentiation stages.In addition, functional studies of PRC2 catalytic subunit homologues support the notion that distinct PRC2 complexes with different compositions cooperate to fine-tune the transcriptional regulation of key regulatory genes during root development. Taken together, this work highlights the importance of PRC2-regulated chromatin states in shaping expression patterns along a differentiation gradient. They also pinpoint the potential of such epigenetic studies in predicting, from an initial chromatin state, the timing of gene transcriptional activation in subsequent differentiation stages., La régulation de l’expression des gènes par la voie des mécanismes chromatiniennes sont critiques dans la modulation et la stabilisation de l’expression des programmes génétiques, essentielles pour l’organogenèse et le développement. Le complexe répresseur Polycomb 2 (PRC2) catalyse le triple méthylation de la lysine 27 de l’histone H3 auprès des gènes cibles. Ceci est un régulateur des programmes du développement, globalement conservé chez les eucaryotes multicellulaires. Afin de déterminer l’implication de PRC2 au cours des transitions de l’identité cellulaire, j’ai caractérisé le paysage chromatinien d’un type cellulaire unique de la niche des cellules souches racinaire. L’intégration quantitative des données épigénomique a révélé trois types chromatiniens qui corrèlent avec des niveaux d’activité transcriptionnelle, ainsi que des profils d’expression bien distincts, au cours de la différentiation cellulaire. Ces données suggèrent que la régulation par PRC2 est importante pour maintenir le contrôle temporel des gènes pendant l’avancé de la différentiation cellulaire. De plus, j’ai effectué des études fonctionnelles sur deux homologues de la sous unité catalytique de PRC2 qui indique que au moins deux complexes PRC2 de composition diffèrent peuvent coopérer afin de moduler finement la régulation des gènes clés du développement. En conclusion, le travail mené souligne l’importance de PRC2 dans le contrôle précis des profils d’expression des gènes, et aussi la capacité des données épigénétique d’un état précoce de différentiation de prédire l’activité transcriptionnelle dans les étapes plus tardives.

Neurodegenerative diseases are characterized by oxidative stress associated with mitochondrial damages leading to neuronal cell death. To mitigate these damages and promote neuronal cytoprotection and neurogenesis, endogenous (Neuropeptide: octadecaneuropeptide (ODN)) or exogenous (Polyphenols: resveratrol (RSV) and apigenin (API)) natural neurotrophic factors could be used as therapeutic agents to promote neuronal differentiation of immature and pluripotent stem cells. ODN is a peptide produced by astrocytes and known as a powerful neuroprotective agent. It is therefore of interest of studying its effects on the mobilization of calcium, its ability to protect neuronal cells against apoptosis death caused by hydrogen peroxide (H2O2) and evaluate its ability to stimulate neurogenesis by promoting neuronal differentiation. The effects of polyphenols (RSV, API), major compounds of the Mediterranean diet, on neurogenesis were also evaluated.The cytoprotective and/or differentiating properties of ODN (10-16 -10-8 M) and polyphenols (RSV: 6.25 -50 μM, API: 6.25 -50 μM) were mainly studied on murine N2a neuroblastoma cells but also on other murine (BV-2, C6) and human (SK-N-BE, CCF-STTG1) nerve lines. Cytoprotection was measured by various viability tests (FDA, MTT, DiOC6(3), propidium iodide). Differentiation was morphologically evaluated by the presence of neurites (axons and dendrites) and visualized by different microscopical techniques. Retinoic acid (RA: 6.25-50 μM) was used as a positive inductor of differentiation. The signaling pathways involved in neuronal differentiation have been characterized. We also studied the effect of ODN (10-14 M, 48 h) on the morphology, topography and activity of mitochondria and peroxisome during differentiation. These two organelles are involved in the metabolism of lipids (fatty acids, cholesterol).The results obtained show that ODN is able to promote the survival of N2a cells cultured under the conditions of acute oxidative stress induced by H2O2. In addition, ODN as well as polyphenols (RSV and API), which lack intrinsic cytotoxic effects, stimulate neurite outgrowth, indicating that they exert pro-differentiating neurotrophic effects. This effect of ODN involves activation of its metabotropic receptor associated with intracellular transduction pathways PKA, PKC and MAPK / ERKs. In addition, ODN stimulates the biogenesis of mitochondria and peroxisomes, essential organelles in axonal activity (axonal transport and renewal). The study of signaling pathways demonstrate that the trophic effects of RSV and API involve the activation of PKC, PKA and MAPK / ERK transduction pathways.Based on these results, the ODN release could be an endogenous protective mechanism in response to oxidative attacks and process of neurodegeneration, preventing cell death and promoting neuronal cell differentiation. Our work also highlights for the first time that polyphenols, in addition to their antioxidant activity, stimulate the formation, maturation and elongation of neurites of undifferentiated N2a cells. All of this work indicates that ODN neuropeptide and polyphenols (RSV and API) are potent neurotrophic agents. These molecules and/or their synthetic analogues may have pharmacological interest for treating neurodegenerative diseases by promoting neuroprotection, neuro-repair and neurogenesis., Les maladies neurodégénératives sont caractérisées par un stress oxydatif associé à des dommages mitochondriaux aboutissant à la mort des cellules neuronales. Pour atténuer ces dommages et favoriser la cytoprotection neuronale ainsi que la neurogenèse, des facteurs neurotrophiques naturels de type endogènes (Neuropeptide : octadécaneuropeptide (ODN)) ou exogènes (Polyphénols : resvératrol (RSV) et apigénine (API)) pourraient être utilisés comme agents thérapeutiques permettant de favoriser la différenciation neuronale des cellules souches immatures et pluripotentes. L’ODN est un peptide produit par les astrocytes et connu comme agent neuroprotecteur puissant d’où l’intérêt d’étudier ses effets sur la mobilisation du calcium, sa capacité à protéger les cellules neuronales contre la mort par apoptose générée par le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et d’évaluer son pouvoir à stimuler la neurogenèse en favorisant la différenciation neuronale. Les effets des polyphénols (RSV, API), composés majeurs du régime méditerranéen, sur la neurogenèse ont été également évalués.Les propriétés cytoprotectrices et/ou différenciatrices de l’ODN (10-16 -10-8 M) et des polyphénols (RSV : 6.25 -50 µM ; API : 6.25 -50 µM) ont été essentiellement étudiées sur des cellules de neuroblastomes murins N2a mais aussi sur d’autres lignées nerveuses murines (BV-2, C6) et humaines (SK-N-BE ; CCF-STTG1). La cytoprotection a été mesurée par différents tests de viabilité (FDA, MTT, DiOC6(3), iodure de propidium). La différenciation a été évaluée morphologiquement par la présence de neurites (axones et dendrites) visualisés grâce à différentes techniques de microscopie. L’acide rétinoïque (AR : 6.25 -50 µM) a été utilisé comme contrôle positif d’induction de différenciation. Les voies de signalisation impliquées dans la différenciation neuronale ont été caractérisées. Nous avons aussi étudié l’effet de l’ODN (10-14 M, 48 h) sur la morphologie, la topographie et l’activité des mitochondries et des peroxysomes au cours de la différenciation. Ces deux organites sont impliqués dans le métabolisme des lipides (acides gras, cholestérol).Les résultats obtenus montrent que l’ODN est capable de promouvoir la survie des cellules N2a cultivées en condition de stress oxydatif aigue induit par le H2O2. De plus, l’ODN ainsi que les polyphénols RSV et l’API, qui sont dépourvus d’effet cytotoxique intrinsèque stimulent la croissance des neurites indiquant qu’ils exercent des effets neurotrophiques pro-différenciateurs. Cet effet de l’ODN met en jeu l’activation de son récepteur métabotropique associé aux voies de transduction intracellulaire PKA, PKC ainsi que MAPK / ERKs. De plus, l’ODN stimule la biogenèse des mitochondries et des peroxysomes, organites essentiels dans l’activité axonale (transport axonal et renouvellement). L’étude des voies de signalisation démontre que les effets trophiques du RSV et API mettent en jeu l’activation des voies de transduction de la PKC, PKA ainsi que celle des MAPK / ERKs.Sur la base de ces résultats, la libération d’ODN pourrait être un mécanisme endogène de protection en réponse aux attaques oxydatives et au processus de neurodégénérescence, empêchant la mort cellulaire et favorisant la différenciation des cellules neuronales. Nos travaux mettent aussi en évidence pour la première fois que les polyphénols en plus de leur action antioxydante stimulent la formation, la maturation et l’élongation des neurites des cellules N2a non différenciées. L’ensemble de ces travaux indique que le neuropeptide ODN et les polyphénols RSV et API sont de puissants agents neurotrophiques. Ces molécules présentent donc un intérêt pharmacologique en vue de leur utilisation et/ou de leurs analogues synthétiques pour traiter des maladies neurodégénératives en favorisant la neuroprotection, la neuro-réparation et la neurogenèse.

An approach to regenerative nervous system medicine is to develop biological substitutes with restorative function using stem cells and biomaterials that can be coated with extracellular matrix molecules. We have developed pharmacologically active microcarriers, PAMs. These are PLGA based, biodegradable and biocompatible polymeric microspheres (MS) coated with adhesion molecules that provide 3-dimensional support for cells. The microcarriers thus associated with the stem cells make it possible, after implantation, to increase the survival and maintain the state of differentiation of the cells they carry, reinforcing their tissue repair effects. These PAMs can also release encapsulated growth factors and to enhance the release of encapsulated proteins a new polymer combination: PLGA-Poloxamer188 (P188) -PLGA has been developed in our laboratory. It has also been shown that PLGA-P188-PLGA PAMs functionalized with fibronectin and poly-Dlysineinduce better proliferation of mesenchymal stem cells than PLGA PAMs. These cells are very widely used in regenerative medicine because they are easy to collect, found in the bone marrow, and able to differentiate towards the chondrogenic lineage, osteogenic and under certain conditions,neuronal. We are working with a subpopulation of these cells called MIAMI cells (marrow isolated adult multilineage inducible) that engage in neuronal cell differentiation after treatment with 2growth factors (EGF / bFGF) and on a laminin matrix support. Recently, it has been demonstrated that the physicochemical properties of polymeric supports also regulate the behavior of stem cells (adhesion, survival and differentiation). The objective of this study is to study the effect of physicochemical and mechanical properties of surfaces i) MS on laminin and poly-D-lysineadsorption and ii) PAMs on adhesion and neuronal differentiation of MIAMI cells. We have shown that the presence of the hydrophilic "poloxamer 188" block in the PLGA-P188-PLGA polymer composition decreases the adsorption of adhesion molecules by forming a layer on these surfaces.On PLGA PAMs, the adhesion molecules adsorb well regardless of the overall charge of the molecules. These two PAMs have a positive overall charge and allow the attachment of cells to their surface. However, in short-term cell adhesion is stronger on PLGA PAMs compared to PLGA-P188-PLGA PAMs, but in the long-term the cells eventually adhere to both supports. PLGA-P188-PLGAhas a high free surface energy and these PAMs have a less rigid surface than PLGA PAMs. Our results suggest that these surface characteristics allow cells to adhere despite the low amount of laminin on these supports. In the long-term the cells exhibit the same behavior whatever the type of PAMs. They differentiate into neuronal cells expressing mature neuron markers such as the neurofilament-M and we find the same number of cells adhered to their surface. Furthermore, we have shown that cells are able to secrete extracellular matrix molecules in the same way on both types of PAMs, probably explaining the similarity of the behavior in long-term.; Une approche de la médecine régénérative du système nerveux consiste à développer des substituts biologiques avec une fonction réparatrice en utilisant des cellules souches et des biomatériaux qui peuvent être recouverts des molécules de la matrice extracellulaire. Nous avons ainsi développé des microcarriers pharmacologiquements actifs, MPA. Ce sont des microsphères (MS) polymériques à base de PLGA, biodégradables et biocompatibles, recouvertes des molécules d’adhérence qui fournissent un support en 3-dimensions aux cellules. Les microcarriers ainsi associés aux cellules souches permettent, après implantation, d’augmenter la survie et de maintenir l’état de différenciation des cellules qu’ils portent,renforçant leurs effets de réparation tissulaire. Ces MPA peuvent également libérer des facteurs de croissance encapsulés et afin d’améliorer le relargage de protéines encapsulées une nouvelle combinaison de polymère : PLGA-Poloxamer188 (P188) -PLGA a été développé dans notre laboratoire. Il a aussi été montré que les MPA de PLGA-P188-PLGA fonctionnalisées avec de la fibronectine et poly-D-lysine induisaient une meilleure prolifération de cellules souches mésenchymateuses que les MPA de PLGA.Ces cellules sont très largement utilisées en médecine régénérative car elles sont faciles à prélever, se trouvant dans la moelle osseuse, et capables de se différencier vers le lignage chondrogénique, ostéogénique et dans certaines conditions, neuronale. Nous travaillons avec une sous population de ces cellules appelées cellules MIAMI (marrow isolated adult multilineage inducible) qui s’engagent vers une différenciation en cellule neuronale après un traitement avec 2 facteurs de croissance (EGF/ bFGF) et sur un support matriciel de laminine. Dernièrement, il a été mis en évidence que les propriétés physicochimiques des supports polymériques régissent également le comportement des cellules souches(adhésion, survie et différenciation). L’objectif de cette étude est d’étudier l’effet des propriétés physicochimiques et mécaniques des surfaces i) des MS sur l’adsorption de laminine et poly-D-lysine et ii) des MPA sur l’adhérence et la différenciation neuronale des cellules MIAMI. Nous avons montré que la présence du bloc hydrophile « poloxamère 188 » dans la composition du polymère PLGA-P188-PLGAdiminue l’adsorption de molécules d’adhérence en formant une couche sur ces surfaces. Sur les MPA de PLGA, les molécules d’adhérence s’adsorbent bien quelle que soit la charge globale des molécules. Cesdeux MPA ont une charge globale positive et permettent l’attachement de cellules à leur surface. Cependant, l’adhérence à court terme de cellules est plus forte sur les MPA de PLGA comparé aux MPA de PLGA-P188-PLGA mais à la longue les cellules finissent par adhérer aux deux supports. Le PLGAP188-PLGA présente une forte énergie libre de surface et ces MPA présentent une surface moins rigide que les MPA de PLGA. Nos résultats suggèrent que ces caractéristiques de surface permettent aux cellules d’adhérer malgré la faible quantité de laminine sur ces supports. A long terme les cellules présentent le même comportement quel que soit le type du support. Elles se différencient en cellule de type neuronal exprimant des marqueurs de neurone mature comme le neurofilament et nous trouvons le même nombre de cellules adhérées à leur surface. En outre, nous avons montré que les cellules sont capables de sécréter de la même manière des molécules de la matrice extracellulaire sur les deux types de MPA expliquant probablement la similitude de comportement à long terme.

The upper airway epithelium, which is mainly composed of multiciliated, goblet, club and basal cells, ensures proper mucociliary function and can regenerate in response to assaults. In chronic airway diseases, defective repair leads to tissue remodeling. Delineating key drivers of differentiation dynamics can help understand how normal or pathological regeneration occurs. Using single-cell transcriptomics and lineage inference, we have unraveled trajectories from basal to luminal cells, providing novel markers for specific populations. We report that: (1) a precursor subgroup of multiciliated cells, which we have entitled deuterosomal cells, is defined by specific markers, such as DEUP1, FOXN4, YPEL1, HES6 and CDC20B; (2) goblet cells can be precursors of multiciliated cells, thus explaining the presence of hybrid cells that co-express markers of goblet and multiciliated cells; and (3) a repertoire of molecules involved in the regeneration process, such as keratins or components of the Notch, Wnt or BMP/TGFβ pathways, can be identified. Confirmation of our results on fresh human and pig airway samples, and on mouse tracheal cells, extend and confirm our conclusions regarding the molecular and cellular choreography at work during mucociliary epithelial differentiation., Highlighted Article: Single-cell RNAseq data in fresh human airway epithelial tissues and air liquid cultures identifies novel cell populations and offers new insights into the molecular mechanisms occurring during mucociliary epithelium regeneration.

Conifer trees possess a typical anatomical tree-ring structure characterized by a transition from large and thin-walled earlywood tracheids to narrow and thick-walled latewood tracheids. However, little is known on how this characteristic structure is maintained across contrasting environmental conditions, due to its crucial role to ensure sap ascent and mechanical support. In this study, we monitored weekly wood cell formation for up to 7 years in two temperate conifer species (i.e., Picea abies (L.) Karst and Larix decidua Mill.) across an 8°C thermal gradient from 800 to 2,200 m a.s.l. in central Europe to investigate the impact of air temperature on rate and duration of wood cell formation. Results indicated that towards colder sites, forming tracheids compensate a decreased rate of differentiation (cell enlarging and wall thickening) by an extended duration, except for the last cells of the latewood in the wall-thickening phase. This compensation allows conifer trees to mitigate the influence of air temperature on the final tree-ring structure, with important implications for the functioning and resilience of the xylem to varying environmental conditions. The disappearing compensation in the thickening latewood cells might also explain the higher climatic sensitivity usually found in maximum latewood density.

Infection of an organism by a pathogen triggers the activation of the CD8 T-cells and the initiation of the immune response. The result is a complex program of proliferation and differentiation of the CD8 T-cells, controlled by the evolution of their molecular content. In this manuscript, we present two mathematical models of the CD8 T-cell response. The first one is presented as an impulsive differential equation by which we study the effect of unequal molecular partitioning at cell division on the regulation of molecular heterogeneity. The second one is an agent-based-model that couples the description of a discrete population of CD8 T-cells and that of their molecular content. This model can reproduce the different typical phases of the CD8 T-cell response at both the cellular and the molecular scales. These two studies support the hypothesis that the cell dynamics observed in vivo is a consequence of the molecular heterogeneity structuring the CD8 T-cell population.; L’infection d’un organisme par un agent pathogène déclenche l’activation des lymphocytes T-CD8 et l’initiation de la réponse immunitaire. Il s’ensuit un programme complexe de prolifération et de différenciation des lymphocytes T-CD8, contrôlé par l’évolution de leur contenu moléculaire. Dans ce manuscrit, nous présentons deux modèles mathématiques de la réponse T-CD8. Le premier se présente comme une équation différentielle à impulsions grâce à laquelle nous étudions l’effet du partage inégal des protéines lors des divisions cellulaires sur la régulation de l’hétérogénéité moléculaire. Le second est un modèle à base d’agents couplant la description d’une population discrète de lymphocytes T-CD8 à celle du contenu moléculaire de ces derniers. Ce modèle s’avère capable de reproduire les différentes phases caractéristiques de la réponse T-CD8 aux échelle cellulaire et moléculaire. Ces deux travaux supportent l’hypothèse que la dynamique cellulaire observée in vivo est le reflet de l’hétérogénéité moléculaire qui structure la population de lymphocytes T-CD8.

A common challenge in avian cell biology is the generation of differentiated cell-lines, especially in the keratinocyte lineage. Only a few avian cell-lines are available and very few of them show an interesting differentiation profile. During the last decade, mammalian embryonic stem cell-lines were shown to differentiate into almost all lineages, including keratinocytes. Although chicken embryonic stem cells had been obtained in the 1990s, few differentiation studies toward the ectodermal lineage were reported. Consequently, we explored the differentiation of chicken embryonic stem cells toward the keratinocyte lineage by using a combination of stromal induction, ascorbic acid, BMP4 and chicken serum. During the induction period, we observed a downregulation of pluripotency markers and an upregulation of epidermal markers. Three homogenous cell populations were derived, which were morphologically similar to chicken primary keratinocytes, displaying intracellular lipid droplets in almost every pavimentous cell. These cells could be serially passaged without alteration of their morphology and showed gene and protein expression profiles of epidermal markers similar to chicken primary keratinocytes. These cells represent an alternative to the isolation of chicken primary keratinocytes, being less cumbersome to handle and reducing the number of experimental animals used for the preparation of primary cells.

Calcium phosphates such as β-TCP have been used for decades as synthetic bone substitutes. Its good chemical properties and its similar behavior to that of the bone in vivo and in vitro can be enhanced by the chosen shaping method. It is nowadays largely accepted that an optimized porous architecture will have a positive impact on the material's bioactivity. This study aims at studying the links between a porous architecture and cell proliferation and differentiation. β-TCP was manufactured by aqueous precipitation. Synthesis parameters were optimized in order to get a product complying with ISO 13779 and 13175 requirements. Three shaping methods were chosen for their ability to generate original structures. The impregnation of a polymeric scaffold yields a network of interconnected spherical pores (PS), stereolithography yields a network of interconnected cubical pores (3D) and ice templating yields a network of parallel ellipsoidal channel-like structure (CO). Two different trends emerged from the human mesenchymal stem cell culture: PS and 3D favored cell proliferation whereas CO promoted cell penetration and alkaline phosphatase activity. The latter is stimulated by β-TCP and this ability is enhanced by freeze casting. This could be explained by the state of cell differentiation: cells on CO samples seem to be far more differentiated than the other ones. However the study of key genes expression is needed to confirm this hypothesis., Les phosphates de calcium tels que le β-TCP sont utilisés depuis des décennies comme substitut osseux synthétique. Leurs bonnes propriétés chimiques et leur comportement analogue au tissu osseux in vivo et in vitro peuvent être améliorés par la technique de mise en forme employée. Il est aujourd'hui largement admis qu'une architecture poreuse optimisée aura un impact positif sur la bioactivité du matériau. Cette étude vise à étudier les liens existant entre une structure macroporeuse en β-TCP et la prolifération et différenciation cellulaire. Le β-TCP est fabriqué par précipitation aqueuse. Les paramètres de synthèse sont optimisés afin d'avoir un produit répondant aux normes ISO 13175 et 13779. Trois méthodes de mise en forme ont été choisies pour leur aptitude à générer une macroporosité originale. L'imprégnation d'une structure polymérique par une suspension génère un réseau de pores sphériques (PS), la stéréolithographie génère des pores cubiques interconnectés (3D) et la congélation orientée produit un réseau de pores tubulaires ellipsoïdaux parallèles au sens de la congélation (CO). Deux tendances émergent des cultures de cellules souches mésenchymateuses humaines: PS et 3D favorisent la prolifération alors que CO favorise la pénétration cellulaire et l'activité de la phosphatase alcaline. Cette dernière est favorisée par le β-TCP et cette aptitude est améliorée par la congélation orientée. Cela pourrait s'expliquer par l'état d'avancement de la différenciation cellulaire: les cellules sur les échantillons CO semblent être à un stade de différenciation plus avancé. Des essais complémentaires sur l'expression de gènes clés sont en cours pour vérifier cette hypothèse.

DNA methylation can serve to control diverse phenomena in eukaryotes and prokaryotes, including gene regulation leading to cell differentiation. In bacteria, DNA methylomes (i.e., methylation state of each base of the whole genome) have been described for several species, but methylome profile variation during the lifecycle has rarely been studied, and only in a few model organisms. Moreover, major phenotypic changes have been reported in several bacterial strains with a deregulated methyltransferase, but the corresponding methylome has rarely been described. Here we report the first methylome description of an entomopathogenic bacterium, Photorhabdus luminescens. Eight motifs displaying a high rate of methylation (>94%) were identified. The methylome was strikingly stable over course of growth, but also in a subpopulation responsible for a critical step in the bacterium’s lifecycle: successful survival and proliferation in insects. The rare unmethylated GATC motifs were preferentially located in putative promoter regions, and most of them were methylated after Dam methyltransferase overexpression, suggesting that DNA methylation is involved in gene regulation. Our findings bring key insight into bacterial methylomes and encourage further research to decipher the role of loci protected from DNA methylation in gene regulation.

The glufosinate-ammonium (GLA) is an organophosphorus herbicide commonly used in agriculture. Many cases of intentional ingestions have highlighted its neurotoxicity. However, its effects on neurodevelopment are not well studied. Indeed, the brain is an important target of GLA due to its structural homology with glutamate, the main excitatory neurotransmitter of the central nervous system. Our previous data are shown that a perinatal exposure to low doses of GLA induces disturbances in neurogenesis and in neuroblasts migration from the subventricular zone to the olfactory bulbs. These changes are associated with the development of autism spectrum disorders in the offspring. My thesis is in the continuity of his work and addresses the cellular and molecular aspects involved in early exposure to GLA. Since we are continuously exposed to pesticides, but also to their metabolites, I studied in parallel the effects of the main metabolite of GLA, the 4 methylphosphinyl-2-oxo-butanoic acid (PPO).The first work of my thesis was to develop an in vitro protocol for the primary culture of neural stem cells from the subventricular zone of mice, for the analysis of the neurotoxic effects of GLA and PPO. The results of the first study of my thesis showed an induction of related oxidative stress involving the glutamatergic system, and associated with a disruption of calcium homeostasis. Since neural stem cells are sensitive to the effects of oxidative stress, in a second study, I studied the impact of these effects on the cellular differentiation mechanisms of neural stem cells. My results indicated a significant effect of exposure to GLA and PPO on the formation and maintenance of the subventricular neurogenic niche in vitro. GLA and PPO interfere with the formation of ependyma and induce a disruption in the neuroglial differentiation of neural stem cells, without influencing their growth or proliferation capacity.All these data highlight on the interest of studying the cellular and molecular mechanisms linked to the neurotoxicity of the active substances of pesticides, the metabolites of these same pesticides, but also the mixtures of active substances and metabolites to which we are continuously exposed in our environment., Le glufosinate d’ammonium (GLA) est un herbicide organophosphoré couramment utilisé en agriculture. De nombreux cas d’ingestions intentionnelles ont mis en évidence sa neurotoxicité. Cependant, ses effets sur le neurodéveloppement ne sont peu étudiés. En effet, le cerveau est une cible importante du GLA en raison de son homologie de structure avec le glutamate, principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central. Des résultats précédents du laboratoire ont permis de montrer qu’une exposition périnatale à de faibles doses de GLA induisait des perturbations de la neurogenèse et de la migration des neuroblastes au niveau de la zone sous ventriculaire vers les bulbes olfactifs. Ces modifications sont associées à l’apparition de troubles du spectre autistique dans la descendance. Ma thèse s’inscrit dans la continuité de ses travaux en abordant les aspects cellulaires et moléculaires mis en jeux lors d’une exposition précoce au GLA. Etant donné que dans la vie de tous les jours, nous sommes continuellement exposés aux pesticides mais également à leurs métabolites, j’ai étudié en parallèle les effets du principal métabolite du GLA, l’acide 4-méthylphosphinyl-2-oxo-butanoïque (PPO).Le premier travail de ma thèse a été de développer un protocole in vitro de culture primaire de cellules souches neurales issues de la zone sous-ventriculaire de souris pour l’analyse des effets neurotoxiques du GLA et du PPO. Les résultats de la première étude de ma thèse montrent une induction d’un stress oxydatif lié impliquant le système glutamatergique et associé à une perturbation de l’homéostasie calcique. Etant donné que les cellules souches neurales sont sensibles aux effets d’un stress oxydatif, dans une seconde étude, j’ai étudié l’impact de ces effets sur les mécanismes de différenciation cellulaire des cellules souches neurales. Mes résultats indiquent un effet significatif d’une exposition au GLA et au PPO sur la formation et le maintien de la niche neurogénique sous-ventriculaire in vitro. Le GLA et le PPO interfèrent avec la formation de l’épithélium épendymaire et induisent une perturbation dans la différenciation neurogliale des cellules souches neurales, sans influencer leur capacité de croissance ou de prolifération.L’ensemble des données de cette thèse mettent l’accent sur l’intérêt d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires liés à la neurotoxicité des substances actives des pesticides, des métabolites de ces mêmes pesticides, mais également des mélanges substances actives-métabolites auxquels nous sommes continuellement exposés dans notre environnement.

International audience; Skin is constantly exposed to environmental factors such as pollutants, chemicals and ultra violet radiation (UV), which can induce premature skin aging and increase the risk of skin cancer. One strategy to reduce the effect of oxidative stress produced by environmental exposure is the application of antioxidant molecules. Among the endogenous antioxidants, selenoproteins play a key role in antioxidant defense and in maintaining a reduced cellular environment. Selenium, essential for the activity of selenoproteins, is a trace element that is not synthesized by organisms and must be supplied by diet or supplementation. The aim of this study is to evaluate the effect of Selenium supplementation on skin aging, especially on keratinocytes, the main cells of the epidermis. Our results demonstrate for the first time to our knowledge, the major role of Selenium on the replicative life span of keratinocytes and on aging skin. Selenium protects keratinocyte stem cells (KSCs) against senescence via preservation of their stemness phenotype through adhesion to the basement membrane. Additionally, Selenium supplementation maintains the homeostasis of skin during chronological aging in our senescent skin equivalent model. Controlled supplementation with Selenium could be a new strategy to protect skin against aging.

International audience; G protein-coupled receptors (GPCRs) exert their physiological function by transducing a complex signaling network that coordinates gene expression and dictates the phenotype of highly differentiated cells. Much is known about the gene networks they transcriptionally regulate upon ligand exposure in a process that takes hours before a new protein is synthesized. However, far less is known about GPCR impact on the translational machinery and subsequent mRNA translation, although this gene regulation level alters the cell phenotype in a strikingly different timescale. In fact, mRNA translation is an early response kinetically connected to signaling events, hence it leads to the synthesis of a new protein within minutes following receptor activation. By these means, mRNA translation is responsive to subtle variations of the extracellular environment. In addition, when restricted to cell subcellular compartments, local mRNA translation contributes to cell micro-specialization, as observed in synaptic plasticity or in cell migration. The mechanisms that control where in the cell an mRNA is translated are starting to be deciphered. But how an extracellular signal triggers such local translation still deserves extensive investigations. With the advent of high-throughput data acquisition, it now becomes possible to review the current knowledge on the translatome that some GPCRs regulate, and how this information can be used to explore GPCR-controlled local translation of mRNAs.

International audience; L’exposition aux polluants de l’environnement est un problème majeur de santé publique. De nombreuses molécules font ainsi l’objet de surveillance par les organismes de santé du fait de conséquences, supposées ou avérées, sur l’organisme. La dioxine présente dans la fumée de cigarette ou des gaz d’échappements des véhicules, est classée comme substance cancérogène par l’organisation mondiale de la santé. De nombreuses publications ont mis en avant les conséquences de l’exposition à la dioxine sur la santé humaine, et la différenciation cellulaire, notamment des cellules souches (1-3). La propagation, le renouvellement et la différenciation des cellules souches est très finement régulé. Les cellules souches, contrairement aux autres cellules de l'orga-nisme, ont la capacité de se renouveler ‘virtuellement’ à l'infini, et de pouvoir se différencier, dans un environnement approprié, en tout type cellulaire.Les deux articles sélectionnés dans cette note étudient l’effet de l’activation du récepteur aux hydrocarbures aromatiques AHR* sur la capacité de différenciation de cellules souches embryonnaires in vitro, et sur les cellules souches de l'épithélium intestinal chez la souris adulte. Dans ces deux cas (in vivo et in vitro), la modulation de l’activité d’AHR conduit à une altération de la diffé-renciation des cellules. Le rôle régulateur de la dioxine serait dû à une altération de l'expression de certains gènes associés au caractère ‘souche’.Ces deux études mettent donc une nouvelle fois en avant l'effet toxique de la dioxine, et propose un rôle direct de cette dernière, via son récepteur AHR, sur la fonction des cellules souches embryonnaires et intestinales adultes.

Epigenetics : a reading of the genome through stable / temporary / inheritable modifications Epigenetics refers to molecular processes checking the reading of the genome. These processes, including DNA methylation, the histone post translational modifications, as well as small and long non coding ARN, constitute the epigenetic machinery and participate to nuclear architecture. Stable, flexible, and quickly variable, the epigenetic status of cell nucleus is dynamic. After the fertilization, the parental genomes undergo epigenetic reprogramming, orchestrating the gene expression essential to the embryonic development. During the embryo development, the waves of cellular differentiation involved in organogenesis, come along with the implementation of cell-specific epigenome. Its stability is insured by the heritability of the epigenetic marks through the mitosis (and meiosis). It provides the maintenance of cell function associated with the stability of gene expression profile. Flexibility and/or reversibility of these marks take place in answer to diverse environmental changes. The importance of these processes is suggested by fetal programming, underlined the impact of in utero life on adult health and diseases. In order to exemplify these concepts, we will analyze the role played by the epigenetic programming during the spermatogenesis. Thus, epigenetics acts such as cell memory and origin of diversity between the individuals., L’épigénétique se réfère à un ensemble de processus moléculaires contrôlant le fonctionnement du génome. Ces processus, mettant en jeu la méthylation de l’ADN, les modifications post-traductionnelles des histones, de petits et grands ARN non codants, constituent la machinerie épigénétique et participent à l’architecture nucléaire. Stable mais aussi flexible, et variant rapidement, le statut epigénétique du noyau cellulaire est dynamique. Dès la fécondation, les patrimoines génétiques parentaux subissent une reprogrammation épigénétique orchestrant l’expression génique indispensable au développement embryonnaire. Au cours du développement, les vagues de différenciation cellulaire, nécessaires à l’organogénèse, s’accompagnent de la mise en place d’épigénomes cellulaires spécifiques dont la stabilité est assurée par l’héritabilité des marques épigénétiques à travers la mitose (voire la méiose). Ceci garantit le maintien de la fonction cellulaire de par la stabilité du profil de gènes exprimés. Flexibilité et/ou réversibilité de ces marques peuvent intervenir en réponse à divers changements environnementaux. Cette caractéristique prend toute sa dimension dans les processus de programmation foetale, soulignant l’empreinte de la vie in utero sur le devenir de la descendance. Afin d’illustrer l’ensemble de ces notions, nous prendrons divers exemples de biologie du développement avec une attention particulière concernant la place de la programmation épigénétique au cours de la spermatogenèse. L’épigénétique peut être considérée comme mémoire cellulaire et source de diversité entre les individus., Jammes Hélène. Épigénétique : une lecture du génome via des modifications stables / transitoires et transmissibles . In: Bulletin de l'Académie Vétérinaire de France tome 167 n°2, 2014. pp. 109-118.

Les vents violents, tels qu’observés lors de tempêtes, représentent un risque majeurpour la stabilité mécanique des arbres et peuvent avoir un effet dévastateur sur les forêts. Les recherches des dernières décennies ont montré que les sollicitations récurrentes par les vents courants constitueraient un facteur d’acclimatation à des évènements extrêmes. Or, les scenarii envisagés dans le cadre des changements climatiques globaux prévoient une augmentation de la fréquence des tempêtes en Europe occidentale, tandis que la vitesse des vents courants diminuerait. Afin d’aider les propriétaires forestiers dans leurs choix de gestion, il apparaît pertinent de mieux évaluer la capacité future des arbres à acclimater leurs structures en réponse aux flexions répétées lesquelles constituent la composante majeur du vent. Cette acclimatation pourrait impliquer des modifications quantitatives et qualitatives de la production du bois. Il apparaît alors nécessaire d'acquérir une meilleure compréhension de l’effet des sollicitations mécaniques sur l'activité du tissu à l’origine du bois - le cambium - et sur la différenciation des cellules du bois.Ici, nous présentons une analyse des conséquences morphologiques et anatomiques de flexions unidirectionnelles, répétées et d’intensité contrôlée (mimant l’effet du vent) sur de jeunes tiges de peuplier. L’une des originalités de ce travail réside dans la prise en compte de la répartition spatiale inégale des variables physiques sur la section transversale de la tige.Tandis que la croissance secondaire semble ne pas dépendre pas du type de contrainte appliqué (tension ou compression des tissus), la différenciation du bois semble être modulée différentiellement selon les contraintes mécaniques. Le bois produit sous contraintes transitoires de tension semble présenter des similitudes avec le bois de tension produit chez les feuillus sous l’effet du stimulus gravité. L’acclimatation au vent du peuplier pourrait donc impliquer la mise en place d’un bois modifié (ou bois de réaction) permettant un ajustement de ses propriétés mécaniques. L’identification d’acteurs moléculaires impliqués dans ces réponses est en cours et pourrait à plus long terme aider à l’établissement de stratégies de sélection.

Supplementary information available online at http://jeb.biologists.org/lookup/doi/10.1242/jeb.154484.supplemental; In fish, data on microRNAs (miRNAs) involved in myogenesis are scarce. In order to identify miRNAs involved in satellite cell differentiation, we used a methionine depletion/replenishment protocol to synchronize myogenic cell differentiation. Our results validated that methionine removal (72 h) from the medium strongly decreased and expression, indicating differentiation arrest. In contrast, methionine replenishment rescued expression of and , showing a resumption of differentiation. We performed a miRNA array analysis of myogenic cells under three conditions: presence of methionine for 72 h (control), absence of methionine for 72 h (Meth-) and absence of methionine for 48 h followed by 24 h of methionine replenishment (Meth-/+). A clustering analysis identified three clusters: cluster I corresponds to miRNA upregulated only in Meth-/+ conditions; cluster II corresponds to miRNA downregulated only in Meth-/+ conditions; cluster III corresponds to miRNAs with high expression in control, low expression in Meth- conditions and intermediate expression after methionine replenishment (Meth-/+). Cluster III was very interesting because it fitted with the data obtained for and (supporting an involvement in differentiation) and contained seven miRNAs with muscle-related function (e.g. miR-133a) and one (miR-210) with unknown function. Based on our previously published miRNA repertoire ( Juanchich et al., 2016), we confirmed miR-133a was expressed only in white muscle and showed that miR-210 had strong expression in white muscle. We also showed that miR-210 expression was upregulated during differentiation of satellite cells, suggesting that miR-210 was potentially involved in the differentiation of satellite cells.

DNA double-strand breaks (DSBs) are critical DNA lesions, which threaten genome stability and cell survival. DSBs are directly induced by ionizing radiation (IR) and radiomimetic agents, including the cytolethal distending toxin (CDT). This bacterial genotoxin harbors a unique DNase-I-like endonuclease activity. Here we studied the role of DSBs induced by CDT and IR as a trigger of autophagy, which is a cellular degradation process involved in cell homeostasis, genome protection and cancer. The regulatory mechanisms of DSB-induced autophagy were analyzed, focusing on the ATM-p53-mediated DNA damage response and AKT signaling in colorectal cancer cells. We show that treatment of cells with CDT or IR increased the levels of the autophagy marker LC3B-II. Consistently, an enhanced formation of autophagosomes and a decrease of the autophagy substrate p62 were observed. Both CDT and IR concomitantly suppressed mTOR signaling and stimulated the autophagic flux. DSBs were demonstrated as the primary trigger of autophagy using a DNase I-defective CDT mutant, which neither induced DSBs nor autophagy. Genetic abrogation of p53 and inhibition of ATM signaling impaired the autophagic flux as revealed by LC3B-II accumulation and reduced formation of autophagic vesicles. Blocking of DSB-induced apoptotic cell death by the pan-caspase inhibitor Z-VAD stimulated autophagy. In line with this, pharmacological inhibition of autophagy increased cell death, while ATG5 knockdown did not affect cell death after DSB induction. Interestingly, both IR and CDT caused AKT activation, which repressed DSB-triggered autophagy independent of the cellular DNA-PK status. Further knockdown and pharmacological inhibitor experiments provided evidence that the negative autophagy regulation was largely attributable to AKT2. Finally, we show that upregulation of CDT-induced autophagy upon AKT inhibition resulted in lower apoptosis and increased cell viability. Collectively, the findings demonstrate that DSBs trigger pro-survival autophagy in an ATM- and p53-dependent manner, which is curtailed by AKT2 signaling.

The number of root cortex cell layers varies among plants, and many species have several cortical cell layers. We recently demonstrated that the two rice orthologs of the Arabidopsis SHR gene, OsSHR1 and OsSHR2, could complement the A. thaliana shr mutant. Moreover, OsSHR1 and OsSHR2 expression in A. thaliana roots induced the formation of extra root cortical cell layers. In this article, we demonstrate that the overexpression of AtSHR and OsSHR2 in rice roots leads to plants with wide and short roots that contain a high number of extra cortical cell layers. We hypothesize that SHR genes share a conserved function in the control of cortical cell layer division and the number of ground tissue cell layers in land plants.

International audience; In response to the presence of compatible rhizobium bacteria, legumes form symbiotic organs called nodules on their roots. These nodules house nitrogen-fixing bacteroids that are a differentiated form of the rhizobium bacteria. In some legumes, the bacteroid differentiation comprises a dramatic cell enlargement, polyploidization, and other morphological changes. Here, we demonstrate that a peptidoglycan-modifying enzyme in Bradyrhizobium strains, a DD-carboxypeptidase that contains a peptidoglycan-binding SPOR domain, is essential for normal bacteroid differentiation in Aeschynomene species. The corresponding mutants formed bacteroids that are malformed and hypertrophied. However, in soybean, a plant that does not induce morphological differentiation of its symbiont, the mutation does not affect the bacteroids. Remarkably, the mutation also leads to necrosis in a large fraction of the Aeschynomene nodules, indicating that a normally formed peptidoglycan layer is essential for avoiding the induction of plant immune responses by the invading bacteria. In addition to exopolysaccharides, capsular polysaccharides, and lipopolysaccharides, whose role during symbiosis is well defined, our work demonstrates an essential role in symbiosis for yet another rhizobial envelope component, the peptidoglycan layer.

Article en "Free Access"; International audience; Age-related osteoporosis is accompanied by an increase in marrow adiposity and a reduction in serum insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and the binding proteins that stabilize IGF-1. To determine the relationship between these proteins and bone marrow adiposity, we evaluated the adipogenic potential of marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs) from mice with decreased serum IGF-1 due to knockdown of IGF-1 production by the liver or knock-out of the binding proteins. We employed 10-16-week-old, liver-specific IGF-1-deficient, IGFBP-3 knock-out (BP3KO) and acid-labile subunit knock-out (ALSKO) mice. We found that expression of the late adipocyte differentiation marker peroxisome proliferator-activated receptor gamma was increased in marrow isolated from ALSKO mice. When induced with adipogenic media, MSC cultures from ALSKO mice revealed a significantly greater number of differentiated adipocytes compared with controls. MSCs from ALSKO mice also exhibited decreased alkaline-phosphatase positive colony size in cultures that were stimulated with osteoblast differentiation media. These osteoblast-like cells from ALSKO mice failed to induce osteoclastogenesis of control cells in co-culture assays, indicating that impairment of IGF-1 complex formation with ALS in bone marrow alters cell fate, leading to increased adipogenesis.

Transposable elements are driving forces for establishing genetic innovations such as transcriptional regulatory networks in eukaryotic genomes. Here, we describe a silencer situated in the last 300 bp of the Mos1 transposase open reading frame (ORF) which functions in vertebrate and arthropod cells. Functional silencers are also found at similar locations within three other animal mariner elements, i.e. IS630-Tc1-mariner (ITm) DD34D elements, Himar1, Hsmar1 and Mcmar1. These silencers are able to impact eukaryotic promoters monitoring strong, moderate or low expression as well as those of mariner elements located upstream of the transposase ORF. We report that the silencing involves at least two transcription factors (TFs) that are conserved within animal species, NFAT-5 and Alx1. These cooperatively act with YY1 to trigger the silencing activity. Four other housekeeping transcription factors (TFs), neuron restrictive silencer factor (NRSF), GAGA factor (GAF) and GTGT factor (GTF), were also found to have binding sites within mariner silencers but their impact in modulating the silencer activity remains to be further specified. Interestingly, an NRSF binding site was found to overlap a 30 bp motif coding a highly conserved PHxxYSPDLAPxD peptide in mariner transposases. We also present experimental evidence that silencing is mainly achieved by co-opting the host Polycomb Repressive Complex 2 pathway. However, we observe that when PRC2 is impaired another host silencing pathway potentially takes over to maintain weak silencer activity. Mariner silencers harbour features of Polycomb Response Elements, which are probably a way for mariner elements to self-repress their transcription and mobility in somatic and germinal cells when the required TFs are expressed. At the evolutionary scale, mariner elements, through their exaptation, might have been a source of silencers playing a role in the chromatin configuration in eukaryotic genomes., Author Summary Transposons are mobile DNA sequences that have long co-evolved with the genome of their hosts. Consequently, they are involved in the generation of mutations, as well as the creation of genes and regulatory networks. Controlling the transposon activity, and consequently its negative effects on both the host soma and germ line, is a challenge for the survival of both the host and the transposon. To silence transposons, hosts often use defence mechanisms involving DNA methylation and RNA interference pathways. Here we show that mariner transposons can self-regulate their activity by using a silencer element located in their DNA sequence. The silencer element interferes with host housekeeping protein transcription factors involved in the polycomb silencing pathways. As the regulation of chromatin configuration by polycomb is an important regulator of animal development, our findings open the possibility that mariner silencers might have been exapted during animal evolution to participate in certain regulation pathways of their hosts. Since some of the TFs involved in mariner silencer activity play a role at different stages of nervous system development and neuron differentiation, it might be possible that mariner transposons can be active during some steps of cell differentiation. Interestingly, mariner transposons (i.e. IS630-Tc1-mariner (ITm) DD34D transposons) have so far only been found in genomes of animals having a nervous system.

CMML is a hematologic malignancy characterized by a persistent monocytosis (> 1.10^9/ L) and an abnormal presence of immature granulocytes in the blood of patients. Currently, there is no targeted therapy for this disease, so there is a real need to better understand the mechanisms leading to monocytosis in order to establish new therapeutic strategies and propose targeted treatments for CMML patients. From primary human monocytes, stimulated by CSF-1 to induce their differentiation into macrophages, we found that autophagy is induced during this process and is required for proper macrophagic differentiation. Then we were able to show that AMPK kinase (AMPK) is required for the induction of autophagy and therefore macrophage differentiation. We also found that the P2RY6 purinergic receptor via the CSF-1R stimulation, activate the PLCβ3-CaMKKβ-AMPK-ULK1 axis leading to the induction of autophagy, which is necessary for the macrophagic differentiation. Finally, in CMML context, where the macrophagic differentiation is impaired, we confirmed that the presence of immature granulocytes is responsible for the inhibition of AMPK P2RY6-axis. In this context, we observed that the addition of agonists P2RY6 is first capable of re-inducing the expression of AMPK and then restoring the macrophagic differentiation. All of these results emphasize the importance of autophagy induction during macrophage differentiation of monocytes and highlight the P2RY6 AMPK-axis as a potential therapeutic target in the treatment of CMML.; La LMMC est une hémopathie est caractérisée par une monocytose persistante (>1.10^9/L) ainsi que par la présence anormale de granulocytes immatures dans le sang des patients. Actuellement, il n’existe aucun traitement ciblé, il est donc essentiel de mieux caractériser et de comprendre les mécanismes qui causent cette monocytose afin d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques et de proposer des traitements ciblés. A partir de monocytes primaires humain stimulés par du CSF-1, nous avons observé que l’autophagie, est induite et qu’elle est dépendante des protéines Beclin1, ATG5, ATG7 et ULK1. Cette autophagie est également nécessaire à la différenciation macrophagique. Nous avons déterminé que l’AMP kinase (AMPK), est nécessaire à l’induction de l’autophagie et par conséquent à la différenciation macrophagique. Nous avons également découvert que le récepteur purinergique P2RY6 via la stimulation du CSF-1R active l’axe PLCβ3-CaMKKβ-AMPK-ULK1 conduisant à l’induction de l’autophagie nécessaire à la différenciation macrophagique. Enfin, dans le cadre de la LMMC, où la différenciation macrophagique est altérée, nous avons confirmé que la présence de granulocytes immatures est responsable de l’inhibition de l’axe P2RY6-AMPK. Dans ce contexte, nous avons observé que l’ajout d’agonistes du P2RY6 est capable d’une part de réinduire l’expression de l’AMPK et d’autre part de restaurer la différenciation macrophagique. L’ensemble de ces résultats souligne l’importance de l’induction du processus autophagique au cours de la différenciation macrophagique des monocytes mais également désigne l’axe P2RY6-AMPK comme cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la LMMC.

National audience

CMML is a hematologic malignancy characterized by a persistent monocytosis (> 1.10^9/ L) and an abnormal presence of immature granulocytes in the blood of patients. Currently, there is no targeted therapy for this disease, so there is a real need to better understand the mechanisms leading to monocytosis in order to establish new therapeutic strategies and propose targeted treatments for CMML patients. From primary human monocytes, stimulated by CSF-1 to induce their differentiation into macrophages, we found that autophagy is induced during this process and is required for proper macrophagic differentiation. Then we were able to show that AMPK kinase (AMPK) is required for the induction of autophagy and therefore macrophage differentiation. We also found that the P2RY6 purinergic receptor via the CSF-1R stimulation, activate the PLCβ3-CaMKKβ-AMPK-ULK1 axis leading to the induction of autophagy, which is necessary for the macrophagic differentiation. Finally, in CMML context, where the macrophagic differentiation is impaired, we confirmed that the presence of immature granulocytes is responsible for the inhibition of AMPK P2RY6-axis. In this context, we observed that the addition of agonists P2RY6 is first capable of re-inducing the expression of AMPK and then restoring the macrophagic differentiation. All of these results emphasize the importance of autophagy induction during macrophage differentiation of monocytes and highlight the P2RY6 AMPK-axis as a potential therapeutic target in the treatment of CMML., La LMMC est une hémopathie est caractérisée par une monocytose persistante (>1.10^9/L) ainsi que par la présence anormale de granulocytes immatures dans le sang des patients. Actuellement, il n’existe aucun traitement ciblé, il est donc essentiel de mieux caractériser et de comprendre les mécanismes qui causent cette monocytose afin d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques et de proposer des traitements ciblés. A partir de monocytes primaires humain stimulés par du CSF-1, nous avons observé que l’autophagie, est induite et qu’elle est dépendante des protéines Beclin1, ATG5, ATG7 et ULK1. Cette autophagie est également nécessaire à la différenciation macrophagique. Nous avons déterminé que l’AMP kinase (AMPK), est nécessaire à l’induction de l’autophagie et par conséquent à la différenciation macrophagique. Nous avons également découvert que le récepteur purinergique P2RY6 via la stimulation du CSF-1R active l’axe PLCβ3-CaMKKβ-AMPK-ULK1 conduisant à l’induction de l’autophagie nécessaire à la différenciation macrophagique. Enfin, dans le cadre de la LMMC, où la différenciation macrophagique est altérée, nous avons confirmé que la présence de granulocytes immatures est responsable de l’inhibition de l’axe P2RY6-AMPK. Dans ce contexte, nous avons observé que l’ajout d’agonistes du P2RY6 est capable d’une part de réinduire l’expression de l’AMPK et d’autre part de restaurer la différenciation macrophagique. L’ensemble de ces résultats souligne l’importance de l’induction du processus autophagique au cours de la différenciation macrophagique des monocytes mais également désigne l’axe P2RY6-AMPK comme cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la LMMC.

The enterohormone glucagon-like peptide-1 (GLP-1) is required to amplify glucose-induced insulin secretion that facilitates peripheral glucose utilisation. Alteration in GLP-1 secretion during obesity has been reported but is still controversial. Due to the high adaptability of intestinal cells to environmental changes, we hypothesised that the density of GLP-1-producing cells could be modified by nutritional factors to prevent the deterioration of metabolic condition in obesity. We quantified L-cell density in jejunum samples collected during Roux-en-Y gastric bypass in forty-nine severely obese subjects analysed according to their fat consumption. In mice, we deciphered the mechanisms by which a high-fat diet (HFD) makes an impact on enteroendocrine cell density and function. L-cell density in the jejunum was higher in obese subjects consuming > 30 % fat compared with low fat eaters. Mice fed a HFD for 8 weeks displayed an increase in GLP-1-positive cells in the jejunum and colon accordingly to GLP-1 secretion. The regulation by the HFD appears specific to GLP-1-producing cells, as the number of PYY (peptide YY)-positive cells remained unchanged. Moreover, genetically obese ob/ob mice did not show alteration of GLP-1-positive cell density in the jejunum or colon, suggesting that obesity per se is not sufficient to trigger the mechanism. The higher L-cell density in HFD-fed mice involved a rise in L-cell terminal differentiation as witnessed by the increased expression of transcription factors downstream of neurogenin3 (Ngn3). We suggest that the observed increase in GLP-1-positive cell density triggered by high fat consumption in humans and mice might favour insulin secretion and therefore constitute an adaptive response of the intestine to balance diet-induced insulin resistance.