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A manifestação da vida é baseada principalmente no reconhecimento molecular. Consequentemente, elucidar a cinética e a termodinâmica das interações proteína-ligante é estratégico para compreensão e modulação dos sistemas biológicos. Além disso, a formação de estruturas supramoleculares é muito importante em aplicações industriais, como processos de formação e estabilização de emulsões e encapsulamento. Assim, neste trabalho avaliou-se a termodinâmica e a cinética de interação entre a lactoferrina (BLF) e dois grupos de ligantes: corantes fenotiazínicos (azul de metileno (MB) e azure A (AZA)) e polissacarídeos (carboximetilcelulose (CMC) e kappa-carragena (κCG)), combinando dados de ressonância plasmônica de superfície (SPR), calorimetria de titulação isotérmica (ITC) e espectroscopia de fluorescência (EF). O trabalho foi dividido em três artigos: no primeiro, foi feito um estudo comparativo da interação entre a BLF e os corantes MB e AZA, utilizando múltiplas técnicas (SPR, EF e ITC), visando elucidar o mecanismo de ligação desses corantes à BLF e às contribuições dos grupos CH 3 para essa interação. No segundo, investigou-se a cinética e a termodinâmica da interação BLF-CMC, utilizando EF e SPR. Por fim, no terceiro artigo foi estudado a energética e a dinâmica de formação dos complexos BLF-κCG, na ausência e presença de KCl, por meio das técnicas de EF e SPR. Acerca da interação BLF-corantes fenotiazínicos, constatou-se que apesar das semelhanças estruturais entre os corantes, os parâmetros termodinâmicos de ligação BLF-AZA foram maiores em magnitude comparados ao sistema BLF-MB. Os resultados obtidos por SPR e EF indicaram que os fatores entrópicos eram as únicas forças motrizes da interação. No entanto, a ITC mostrou que há uma forte contribuição entálpica associada à interação com a holo-BLF. Embora a formação dos complexos de transição BLF-MB e BLF-AZA a partir da associação dos ligantes livres exigiu parâmetros energéticos muito semelhantes (∆ ‡a,MB= 51,84 e ∆‡ a,AZA= 50,7 kJ mol -1 ), na dissociação estes parâmetros foram dependentes do número de grupos CH 3 na estrutura dos corantes (∆ ‡d,MB= 81,4 e ∆‡ d,AZA= 74,93 KJ mol-¹). Quanto à interação BLF-CMC, o estudo cinético sugeriu que a formação do complexo ativado a temperaturas ≤ 289,2 K foi dominada pela energia liberada pelas interações específicas entre a proteína e o polissacarídeo. Embora os dados de SPR tenham demonstrado que a formação dos complexos BLF-CMC foi conduzida entropicamente (57 ≤ ∆° ≤ 60 kJ mol-¹) os ensaios de EF revelaram valores negativos ∆° até 293,2 K e positivos em temperaturas ≥ 298,2 Ke -58 ≤ ∆° ≤ 230 KJ mol-¹. Por fim, o estudo da interação BLF-κCG mostrou que a formação do complexo foi entalpicamente dirigida (∆° = −81 kJ mol −1 ) e a comparação entre os dados termodinâmicos obtidos por SPR e EF revelou que a interação BLF-κCG ocorreu em vários sítios da BLF. Já os parâmetros cinéticos mostraram que a interação ocorreu através da formação de um complexo de transição e que esse processo foi mais rápido a partir da associação das moléculas livres. A mudança na força iônica alterou a forma como a BLF e a κCG interagem, tornando a ligação um processo de uma única etapa. Palavras-chave: Lactoferrina. Corantes fenotiazínicos. Polissacarídeos. Life manifestation is based mainly on molecular recognition. Consequently, the elucidation of the kinetics and thermodynamics of the protein-ligand interactions is strategic for the comprehension and modulation of biological systems. Besides that, the formation of supramolecular structures is very important to industrial applications, such as, formation and stabilization of emulsions, and encapsulation. Therefore, in this work, it was evaluated the thermodynamics and kinetics of the interaction between lactoferrin (BLF) and two groups of ligands: phenothiazine dyes (methylene blue (MB) and azure A (AZA)) and polysaccharides (carboxymethylcellulose (CMC) and κ-carrageenan (κCG)); combining surface plasmon resonance (SPR), isothermal titration calorimetry (ITC), and fluorescence spectroscopy (FS) data. The work was divided into three articles: in the first one, the comparative study of the interaction between the MB and AZA dyes were made, using multiple techniques (SPR, FS, and ITC), aiming the elucidation of the binding mechanism between these dyes and BLF, and contributions of the CH 3 groups to this interaction. In the second one, the kinetics and thermodynamics of the BLF-CMC interaction were investigated, using FS, and SPR. Finally, in the third article, it was studied the energetics and dynamics of the formation of BLF-κCG complexes, in the absence and presence of KCl, via FS and SPR techniques. Concerning the BLF-phenothiazine dyes interaction, it was verified that, although the similarity between the dyes structures, the thermodynamic parameters for the BLF-AZA binding was higher in magnitude when compared to the BLF-MB system. The results obtained from SPR and FS indicated the entropic factors were the only driving forces of the interaction. However, the ITC showed there is a strong enthalpic contribution associated with the interaction with the holo- BLF. Although the formation of the BLF-MB and BLF-AZA transition complexes, from the association of free ligands, requires similar energetic parameters (∆ ‡a,MB= 51,84 and ∆‡ a,AZA= 50,7 kJ mol -1 ), in the dissociation, these parameters depended on the number of CH 3 groups in the dye structure ∆ ‡d,MB= 81,4 and ∆‡ d,AZA= 74,93 KJ mol-¹). As for the BLF-CMC interaction, the kinetic study suggested the formation of the activated complex at temperatures ≤ 289.2 K was dominated by the energy released by specific interactions between the protein and polysaccharide. Although the SPR data have shown the formation of the BLF-CMC complex was entropy-driven (57 ≤ ∆° ≤ 60 kJ mol-¹), the FS assays revealed negative ∆° até 293,2 K and positive values in temperatures ≥298.2 K, and - 58 ≤ ∆° ≤ 230 KJ mol-¹. Finally, the study of the BLF-κCG interaction showed the complex formation was enthalpy-driven (∆° = −81 kJ mol −1 ) and the comparison between the thermodynamic data obtained by SPR and FS revealed the interaction occurs in various sites of BLF. While the kinetic parameters showed the interaction occurs through the formation of a transition complex and this process is faster from the association of the free molecules. The change in the ionic strength altered the way BLF and κCG interact, making the binding a one- step process. Keywords: Lactoferrin. Phenothiazine dyes. Polysaccharides.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Sistemas aquosos bifásicos (SABs) têm provado ser um método eficiente e ambientalmente seguro para a extração de muitas espécies químicas. No entanto, a termodinâmica de partição de solutos nesses sistemas ainda é pouco compreendida. Há poucos estudos que trazem um enfoque termodinâmico que contribua para compreensão das forças motrizes que regem o processo de transferência de solutos em SABs. Uma abordagem estratégica para estudar as forças que determinam a partição é a utilização de compostos químicos com estruturas químicas semelhantes, como sondas moleculares, para através da termodinâmica compreender a relação existente entre a estrutura e a partição destes compostos. O azul de metileno (AM), azure A (AZA), azure B (AZB) e acetato de tionina (AT) são corantes catiônicos que apresentam o mesmo grupo central fenotiazínico, se diferenciando apenas no número de substituintes metila. Essas características podem fornecer informações úteis sobre os fatores que governam a partição destes compostos em SABs. Neste trabalho, um estudo termodinâmico completo do comportamento de partição dos corantes (MB), (AZB), (AZA) e (TA) foi investigado utilizando os SABs: PEO 1500+MgSO 4 +H 2 O; PEO 1500+Na 2 SO 4 +H 2 O; PEO1500+Li 2 SO 4 +H 2 O. Os parâmetros termodinâmicos de transferência, tais como a variação da energia livre de Gibbs padrão de transferência ), a variação da entalpia padrão de transferência ( padrão de transferência ) e a variação da entropia ), e sua dependência com a estrutura do corante, natureza do eletrólito e comprimento da linha de amarração (CLA) foram avaliados. Além disso, as energias entálpicas de interação corante-PEO e corante-SAL foram determinadas. Pela primeira vez, foi descoberto que cátions se concentram preferencialmente na fase enriquecida em polímero dos SABs, com valores de K entre 6,16 e 225, 60 e valores de compreendidos entre -4,16 kJ mol -1 a -13,47 kJ mol -1 . O processo de transferência dos corantes fenotiazínicos foi entalpicamente dirigido, -11,40 kJ mol -1 < < -51,24 kJ mol -1 , resultante das interações específicas atrativas corante-PEO e interações repulsivas corante-Sal, e ocorreram mesmo com um decréscimo entrópico do sistema (-4.93 kJ mol -1 K -1 < < -38.78 kJ mol -1 K -1 ). A diferença na estrutura química dos corantes teve um efeito pouco pronunciado sobre os valores das energias entálpicas de interação corante-PEO e corante-Sal, mostrando que essa interação é promovida principalmente pelo anel condensado do corante. Também foi observado que o processo de partição dos corantes fenotiazínicos é dependente da linha de amarração e natureza do ânion, entretanto pouco influenciado pela natureza do cátion. Aqueous two-phase systems (ATPSs) have proven to be an efficient and environmentally safe method for extraction of chemical species. However, the solutes partition phenomenon in these systems is still little understood. There are few studies carrying a thermodynamic focus that contributes for the understanding of the driving forces governing solute transfer in ATPSs. A strategic approach for studying it is to use chemical compounds with similar chemical structures, as molecular probes, for comprehending thermodynamically the relationship between the structures and partition these compounds. The methylene blue (MB), azure A (AZA), azure B (AZB) and thionine acetate (TA) are cationic dyes that have the same phenothiazine core group and differ only in the number of methyl substituents. These characteristics may provide useful information about the factors that govern the partition process of these compounds in ATPSs. In this paper, the thermodynamic partition behavior of MB, AZA, AZB and TA dyes was investigated using the following ATPSs: PEO 1500 + MgSO 4 + H 2 O; PEO 1500 + Na 2 SO 4 + H 2 O; PEO1500 + Li 2 SO 4 + H 2 O. Standard transfer parameters such as free energy change of transfer ( transfer ( ), entropy change of transfer ), enthalpy change of ) and its dependence on the dye structure, electrolyte nature and tie line length (TLL) were evaluated. Besides, the dye- PEO enthalpy energy interaction and dye-salt interaction were determined. For the first time cations were discovered to concentrate in the polymer enriched phase, with K values ranging from 6.16 to 225.60, and values ranging from 4.16 to -13.47 kJ mol -1 . The transfer process of phenothiazine dyes was enthalpy driven, with -11.40 kJ mol -1 < < -51.24 kJ mol -1 , resulting from specific attractive dye-PEO interactions and repulsive dye-salt interactions, occurring even with a system entropy decrease (-4.93 kJ mol -1 K -1 < < -38.78 kJ mol -1 K -1 ). The dyes chemical structure differences had insignificant effect on the dye-PEO and dye-salt enthalpy interaction energy values, showing that interactions in these systems are mainly promoted by the dye condensed ring. It was also observed that the phenothiazine dyes partition process is dependent of tie line and nature of the anion, however, little influenced by the cation nature.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A organização, estabilidade e viabilidade funcional das proteínas para as células vivas baseiam- se em um delicado equilíbrio entre o dobramento espontâneo e a montagem de suas moléculas componentes. Uma compreensão e quantificação das interações proteína-surfactante são importantes tanto para o planejamento racional de novos sistemas supramoleculares, incluindo materiais inteligentes, quanto para o desenvolvimento de novos agentes biologicamente ativos. Neste trabalho em um primeiro momento avaliamos a interação proteína-surfactante por meio da determinação completa de todos os parâmetros termodinâmicos e cinéticos associados a interação entre Lactoferrina bovina (bLF) e o surfactante não-iônico Brij58 pela técnica de ressonância plasmônica de superfície (RPS). O complexo de transição [bLF-Brij58] ‡ foi completamente caracterizado, bem como o processo de interação entre as moléculas bLF e Brij58 até o complexo termodinamicamente estável [bLF-Brij58]º. As constantes cinéticas de associação (k a ≈ 10 3 M -1 s -1 ) e dissociação (k d ≈ 10 -3 s -1 ) foram proporcionais e inversas proporcionais ao aumento de temperatura, respectivamente. [bLF-Brij58] ‡ formado a partir da associação de moléculas livres de bLF e Brij58 ocorre com uma barreira energética quase igual ao aumento de entalpia (E act-ass = 29,22 KJ mol -1 , ΔH ‡ass = 26,74 KJ mol -1 , TΔS ‡ass = -24,56 KJ mol -1 e ΔG ‡ass = 51,31 KJ mol -1 ) enquanto formado a partir de [bLF-Brij58]° a barreira energética (E act-diss = -5,96 KJ mol -1 , ΔH ‡diss = -8,44 KJ mol -1 , TΔS ‡diss = -93,35 KJ mol -1 e ΔG ‡diss = 84,91 KJ mol -1 ) é dominada pela perda de entropia. A formação de [LF-Brij58]° foi conduzida entropicamente (TΔS° = 65,46 KJ mol -1 e ΔH° = 33,74 KJ mol -1 ), mostrando que a interação hidrofóbica tem papel fundamental na interação entre bLF e Brij58. Posteriormente avaliamos a mesma interação sob diferentes condições de pH e força iônica, obtendo os parâmetros termodinâmicos por calorimetria de titulação isotérmica e informações sobre as condições térmicas de desdobramento da proteína por calorimetria diferencial de varredura. Aqui, Brij58 interagiu de forma independente com lóbulo complexado por ferro (hLF) e com o lóbulo sem ferro (aLF). As constantes de ligação a pH 7,4 para a interação entre Brij58 com hLF e aLF foram da ordem de grandeza de ≈ 10 7 L mol -1 . Os valores negativos de ° int e° int indicaram que foram formadas ligações de hidrogênio e interações van der Waals formadas durante o processo. A pH 7,4 a formação dos complexos [hLF-Brij58]° e [aLF- Brij58]° foram diminuídos à medida que aumentou a força iônica. A pH 7,4 o aumento da força iônica promoveu a desnaturação das estruturas nativas hLF e aLF. A pH 12 o aumento da força iônica embora não tenha afetado as aLF estruturas nativas promoveu a captura dos íons férricos presentes em hLF interrompendo a interação com Brij58 após 75 mM de NaSCN concentração. Portanto, o sal NaSCN agiu como estabilizador térmico para hLF e desestabilizador térmico para aLF. Esses resultados ampliam a compreensão sobre os mecanismos de interações entre surfactantes não iônicos e proteínas globulares fornecendo informações importantes para posterior aplicações tecnológicas. Palavras-chave: Estrutura molecular. Química supramolecular. Proteínas. Agentes ativos de superfície. Termodinâmica. The organization, stability and functional viability of proteins for living cells are based on a delicate balance between spontaneous folding and assembly of their component molecules. Understanding and quantifying protein-surfactant interactions are important both for the rational design of new supramolecular systems, including intelligent materials, and for the development of new biologically active agents. In this work we firstly evaluated the protein- surfactant interaction through the complete determination of all thermodynamic and kinetic parameters associated with the interaction between Bovine Lactoferrin (bLF) and non-ionic surfactant Brij58 by surface plasmon resonance technique. The transition complex [bLF- Brij58] ‡ has been fully characterized, as well as the process of interaction between bLF and Brij58 molecules to the thermodynamically stable complex [bLF-Brij58]°. The kinetic constants of association (k a ≈ 10 3 M -1 s -1 ) and dissociation (k d ≈ 10 -3 s -1 ) were proportional and inverse proportional to the temperature increase, respectively. [bLF-Brij58] ‡ formed from the association of free molecules of bLF and Brij58 occurs with an energy barrier almost equal to the increase in enthalpy (E act-ass = 29.22 KJ mol -1 , ΔH ‡ass = 26.74 KJ mol -1 , TΔS ‡ass = -24.56 KJ mol -1 , and ΔG ‡ass = 51.31 KJ mol -1 ) whereas formed from [bLF-Brij58]° the energy barrier (E act- diss = -5.96 KJ mol -1 , ΔH ‡diss = -8.44 KJ mol -1 , TΔS ‡diss = -93.35 KJ mol -1 , and ΔG ‡diss = 84.91 KJ mol -1 ) is dominated by entropy loss. [LF-Brij58]° formation was entropically conducted (TΔS° = 65.46 KJ mol -1 and ΔH° = 33.74 KJ mol -1 ), showing that hydrophobic interaction plays a fundamental role in the interaction between bLF and Brij58. Afterwards we evaluated the same interaction under different conditions of pH and ionic strength, obtaining the thermodynamic parameters by isothermal titration calorimetry and information about the thermal unfolding conditions of the protein by scanning differential calorimetry. Here, Brij58 interacted independently with iron-complexed lobe (hLF) and iron-free lobe (aLF). At pH 7.4 binding constants for the interaction between Brij58 with hLF and aLF were on the order of ≈ 10 7 . ° int and ° int negative values indicated that hydrogen bonds and van der Waals interactions were formed during the process. At pH 7.4, the increase in ionic strength promotedthe denaturation of native hLF and aLF structures. At pH 12, the increase in ionic strength, although it did not affect the aLF native structures, promoted the capture of ferric ions present in hLF, interrupting the interaction with Brij58 after 75 mM of NaSCN concentration. Therefore the NaSCN salt acted as a thermal stabilizer for hLF and a thermal destabilizer for aLF. These results broaden the understanding of the interaction mechanisms between nonionic surfactants and globular proteins providing important information for further technological application. Keywords: Molecular structure. Supramolecular Chemistry. Proteins. Surface active agents. Thermodynamics.

Nos últimos anos, aumentou o uso de várias moléculas de corante orgânico para fins clínicos e médicos, como Auramina O, os corantes fenotiazínicos Azure A (AZA) e azul B (AZB) e os corantes fenilmetanos violeta de metila (B, 2B, 6B e 10B). Sabe-se que suas funções e toxicidade podem ser alteradas por interações com proteínas. No entanto, não há informações cinéticas ou termodinâmicas sobre as interações da albumina sérica bovina (BSA) com corantes fenotiazínicos e da lactoferrina bovina (BLF) com fenilmetanos. Neste trabalho, a ressonância plasmônica de superfície foi utilizada para determinar as constantes cinéticas e termodinâmicas da formação de BSA-fenotiazina e BLF-fenilmetanos a pH 7,4. A BSA interagiu com os corantes fenotiazínicos (AZA e AZB) para formar complexos termodinamicamente estáveis com constantes de binding (K b ) de 2,1 × 10 4 e 2,39 × 10 4 M -1 , respectivamente, a 298,15 K), em pH 7,4. No entanto, a força motriz para a formação dos complexos de corantes BSA-fenotiazina era dependente da temperatura. Para temperaturas ≤ 16 °C, a formação do complexo ativado (ΔH ǂ a,12°C,AZA = -310,57 kJ mol -1 and ΔH ǂ a,12 °C,AZB = - 256.37 kJ mol -1 ) e termodinamicamente estável (ΔH° 12 °C,AZA = -314.56 kJ mol -1 e ΔH° 12° C,AZB = -265.73 kJ mol -1 ) e os complexos de corantes BSA foram conduzidos pela entalpia, enquanto para temperaturas ≥ 20°C, pela entropia, (TΔS ǂ a,28°C,AZA = 207.49 kJ mol -1 and TΔS ǂ a,28°C,AZB = 190.69 kJ mol -1 ; TΔS° d , 28°C,AZA = 277.50 kJ mol -1 and TΔS° d , 28°C,AZB = 257.26 kJ mol -1 ), o que indicou processos de compensação iso- cinética e de iso-equilíbrio. O sinal negativo de ΔG° revela que, no equilíbrio termodinâmico, a formação do complexo BLF-PhM é mais estável do que as moléculas livres de BLF e PhM em solução. O aumento do número de grupos metil na estrutura PhM causa um aumento nas taxas de associação e dissociação e K b . O mesmo foi observado quando se comparam os corantes MVB e MV6B: a presença de carga no MV6B promoveu o aumento da taxa de associação e constante de ligação. Por outro lado, o aumento do grupo fenil (dois a três anéis) causa uma diminuição nosvalores de K b . Valores positivos de ΔH° e ΔS° indicaram que as interações hidrofóbicas são fundamentais para estabilizar o complexo BLF-PhM. Nossos resultados ajudam a elucidar a dinâmica molecular da interação entre proteínas e corantes e as aplicações médicas e farmacêuticas dos corantes de fenotiazina e fenilmetanos. Palavras-chave: Interação plasmônica de superfície. intermolecular. Proteína. Corante. Ressonância In recent years, the use of various organic dye molecules has increased for clinical and medical purposes, such as Auramine O, the phenothiazine Azure A (AZA) and blue B (AZB) dyes and the methyl violet phenylmethanes dyes (B, 2B, 6B and 10B). It is known that their functions and toxicity may be altered by protein interactions. However, there is no kinetic or thermodynamic information on the interactions of bovine serum albumin (BSA) with phenothiazine dyes and bovine lactoferrin (BLF) with phenylmethanes. In this work, surface plasmon resonance was used to determine the energy and molecular efficiency of the formation of BSA-phenothiazine and BLF- phenylmethanes at pH 7.4. BSA interacted with phenothiazine dyes (AZA and AZB) to form thermodynamically stable complexes (K b of 2,1 × 10 4 and 2,39 × 10 4 M -1 , respectively, at 298.15 K) at pH 7.4. At temperature 16 °C, activity formation (ΔH ǂ a12°C,AZA = -310.57 kJ mol -1 and ΔH ǂ a,12°C,AZB = -256.37 kJ mol -1 ) and thermodynamically stable (ΔH° 12°C,AZA = -314.56 kJ mol -1 and ΔH° 12°C,AZB = -265.73 kJ mol -1 ) of BSA dye complexes were examined by enthalpy, while at temperatures ≥ 20 °C, by entropy, was the main parameter that guided the investigation (TΔS ǂ a,28°C,AZA = 207.49 kJ mol -1 and TΔS ǂ a,28°C,AZB = 190.69 kJ mol -1 ; TΔS° d , 28°C,AZA = 277.50 kJ mol -1 and TΔS° d , 28°C,AZB = 257.26 kJ mol -1 ), indicating iso-kinetic and iso-equilibrium compensation processes. The negative ΔG° sign revealed that in thermodynamic equilibrium, the formation of the BLF-PhM complex is more stable than the free molecules of BLF and PhM in solution. Increasing the number of methyl groups in the PhM structure causes an increase in association and dissociation rates and binding constant (K b ). The same was observed when comparing the methyl violet B (MVB) and methyl violet 6B (MV6B) dyes, in that the presence of specific loads in the MV6B structure promoted the increase of association rate and binding constant. On the other hand, the increase in the number of phenyl groups (two to three rings) causes a decrease in K b values. The positive values of ΔH° and ΔS° indicated that hydrophobicinteractions are fundamental to stabilize the BLF-PhM complex. Our results help elucidating the molecular dynamics of protein-dye interactions and the medical and pharmaceutical applications of phenothiazine and phenylmethane dyes. Keywords: Intermolecular interaction. Protein. Dye. Surface plasmonic resonance.