Determination of the kinetics and thermodynamics of the formation of protein-surfactant supramolecular structures

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A organização, estabilidade e viabilidade funcional das proteínas para as células vivas baseiam- se em um delicado equilíbrio entre o dobramento espontâneo e a montagem de suas moléculas componentes. Uma compreensão e quantificação das interações proteína-surfactante são importantes tanto para o planejamento racional de novos sistemas supramoleculares, incluindo materiais inteligentes, quanto para o desenvolvimento de novos agentes biologicamente ativos. Neste trabalho em um primeiro momento avaliamos a interação proteína-surfactante por meio da determinação completa de todos os parâmetros termodinâmicos e cinéticos associados a interação entre Lactoferrina bovina (bLF) e o surfactante não-iônico Brij58 pela técnica de ressonância plasmônica de superfície (RPS). O complexo de transição [bLF-Brij58] ‡ foi completamente caracterizado, bem como o processo de interação entre as moléculas bLF e Brij58 até o complexo termodinamicamente estável [bLF-Brij58]º. As constantes cinéticas de associação (k a ≈ 10 3 M -1 s -1 ) e dissociação (k d ≈ 10 -3 s -1 ) foram proporcionais e inversas proporcionais ao aumento de temperatura, respectivamente. [bLF-Brij58] ‡ formado a partir da associação de moléculas livres de bLF e Brij58 ocorre com uma barreira energética quase igual ao aumento de entalpia (E act-ass = 29,22 KJ mol -1 , ΔH ‡ass = 26,74 KJ mol -1 , TΔS ‡ass = -24,56 KJ mol -1 e ΔG ‡ass = 51,31 KJ mol -1 ) enquanto formado a partir de [bLF-Brij58]° a barreira energética (E act-diss = -5,96 KJ mol -1 , ΔH ‡diss = -8,44 KJ mol -1 , TΔS ‡diss = -93,35 KJ mol -1 e ΔG ‡diss = 84,91 KJ mol -1 ) é dominada pela perda de entropia. A formação de [LF-Brij58]° foi conduzida entropicamente (TΔS° = 65,46 KJ mol -1 e ΔH° = 33,74 KJ mol -1 ), mostrando que a interação hidrofóbica tem papel fundamental na interação entre bLF e Brij58. Posteriormente avaliamos a mesma interação sob diferentes condições de pH e força iônica, obtendo os parâmetros termodinâmicos por calorimetria de titulação isotérmica e informações sobre as condições térmicas de desdobramento da proteína por calorimetria diferencial de varredura. Aqui, Brij58 interagiu de forma independente com lóbulo complexado por ferro (hLF) e com o lóbulo sem ferro (aLF). As constantes de ligação a pH 7,4 para a interação entre Brij58 com hLF e aLF foram da ordem de grandeza de ≈ 10 7 L mol -1 . Os valores negativos de ° int e° int indicaram que foram formadas ligações de hidrogênio e interações van der Waals formadas durante o processo. A pH 7,4 a formação dos complexos [hLF-Brij58]° e [aLF- Brij58]° foram diminuídos à medida que aumentou a força iônica. A pH 7,4 o aumento da força iônica promoveu a desnaturação das estruturas nativas hLF e aLF. A pH 12 o aumento da força iônica embora não tenha afetado as aLF estruturas nativas promoveu a captura dos íons férricos presentes em hLF interrompendo a interação com Brij58 após 75 mM de NaSCN concentração. Portanto, o sal NaSCN agiu como estabilizador térmico para hLF e desestabilizador térmico para aLF. Esses resultados ampliam a compreensão sobre os mecanismos de interações entre surfactantes não iônicos e proteínas globulares fornecendo informações importantes para posterior aplicações tecnológicas. Palavras-chave: Estrutura molecular. Química supramolecular. Proteínas. Agentes ativos de superfície. Termodinâmica. The organization, stability and functional viability of proteins for living cells are based on a delicate balance between spontaneous folding and assembly of their component molecules. Understanding and quantifying protein-surfactant interactions are important both for the rational design of new supramolecular systems, including intelligent materials, and for the development of new biologically active agents. In this work we firstly evaluated the protein- surfactant interaction through the complete determination of all thermodynamic and kinetic parameters associated with the interaction between Bovine Lactoferrin (bLF) and non-ionic surfactant Brij58 by surface plasmon resonance technique. The transition complex [bLF- Brij58] ‡ has been fully characterized, as well as the process of interaction between bLF and Brij58 molecules to the thermodynamically stable complex [bLF-Brij58]°. The kinetic constants of association (k a ≈ 10 3 M -1 s -1 ) and dissociation (k d ≈ 10 -3 s -1 ) were proportional and inverse proportional to the temperature increase, respectively. [bLF-Brij58] ‡ formed from the association of free molecules of bLF and Brij58 occurs with an energy barrier almost equal to the increase in enthalpy (E act-ass = 29.22 KJ mol -1 , ΔH ‡ass = 26.74 KJ mol -1 , TΔS ‡ass = -24.56 KJ mol -1 , and ΔG ‡ass = 51.31 KJ mol -1 ) whereas formed from [bLF-Brij58]° the energy barrier (E act- diss = -5.96 KJ mol -1 , ΔH ‡diss = -8.44 KJ mol -1 , TΔS ‡diss = -93.35 KJ mol -1 , and ΔG ‡diss = 84.91 KJ mol -1 ) is dominated by entropy loss. [LF-Brij58]° formation was entropically conducted (TΔS° = 65.46 KJ mol -1 and ΔH° = 33.74 KJ mol -1 ), showing that hydrophobic interaction plays a fundamental role in the interaction between bLF and Brij58. Afterwards we evaluated the same interaction under different conditions of pH and ionic strength, obtaining the thermodynamic parameters by isothermal titration calorimetry and information about the thermal unfolding conditions of the protein by scanning differential calorimetry. Here, Brij58 interacted independently with iron-complexed lobe (hLF) and iron-free lobe (aLF). At pH 7.4 binding constants for the interaction between Brij58 with hLF and aLF were on the order of ≈ 10 7 . ° int and ° int negative values indicated that hydrogen bonds and van der Waals interactions were formed during the process. At pH 7.4, the increase in ionic strength promotedthe denaturation of native hLF and aLF structures. At pH 12, the increase in ionic strength, although it did not affect the aLF native structures, promoted the capture of ferric ions present in hLF, interrupting the interaction with Brij58 after 75 mM of NaSCN concentration. Therefore the NaSCN salt acted as a thermal stabilizer for hLF and a thermal destabilizer for aLF. These results broaden the understanding of the interaction mechanisms between nonionic surfactants and globular proteins providing important information for further technological application. Keywords: Molecular structure. Supramolecular Chemistry. Proteins. Surface active agents. Thermodynamics.