Kinetic and thermodynamic characterization of the supramolecular structures formation: lactoferrin-phenothiazine dyes and lactoferrin-polysaccharides

A manifestação da vida é baseada principalmente no reconhecimento molecular. Consequentemente, elucidar a cinética e a termodinâmica das interações proteína-ligante é estratégico para compreensão e modulação dos sistemas biológicos. Além disso, a formação de estruturas supramoleculares é muito importante em aplicações industriais, como processos de formação e estabilização de emulsões e encapsulamento. Assim, neste trabalho avaliou-se a termodinâmica e a cinética de interação entre a lactoferrina (BLF) e dois grupos de ligantes: corantes fenotiazínicos (azul de metileno (MB) e azure A (AZA)) e polissacarídeos (carboximetilcelulose (CMC) e kappa-carragena (κCG)), combinando dados de ressonância plasmônica de superfície (SPR), calorimetria de titulação isotérmica (ITC) e espectroscopia de fluorescência (EF). O trabalho foi dividido em três artigos: no primeiro, foi feito um estudo comparativo da interação entre a BLF e os corantes MB e AZA, utilizando múltiplas técnicas (SPR, EF e ITC), visando elucidar o mecanismo de ligação desses corantes à BLF e às contribuições dos grupos CH 3 para essa interação. No segundo, investigou-se a cinética e a termodinâmica da interação BLF-CMC, utilizando EF e SPR. Por fim, no terceiro artigo foi estudado a energética e a dinâmica de formação dos complexos BLF-κCG, na ausência e presença de KCl, por meio das técnicas de EF e SPR. Acerca da interação BLF-corantes fenotiazínicos, constatou-se que apesar das semelhanças estruturais entre os corantes, os parâmetros termodinâmicos de ligação BLF-AZA foram maiores em magnitude comparados ao sistema BLF-MB. Os resultados obtidos por SPR e EF indicaram que os fatores entrópicos eram as únicas forças motrizes da interação. No entanto, a ITC mostrou que há uma forte contribuição entálpica associada à interação com a holo-BLF. Embora a formação dos complexos de transição BLF-MB e BLF-AZA a partir da associação dos ligantes livres exigiu parâmetros energéticos muito semelhantes (∆ ‡a,MB= 51,84 e ∆‡ a,AZA= 50,7 kJ mol -1 ), na dissociação estes parâmetros foram dependentes do número de grupos CH 3 na estrutura dos corantes (∆ ‡d,MB= 81,4 e ∆‡ d,AZA= 74,93 KJ mol-¹). Quanto à interação BLF-CMC, o estudo cinético sugeriu que a formação do complexo ativado a temperaturas ≤ 289,2 K foi dominada pela energia liberada pelas interações específicas entre a proteína e o polissacarídeo. Embora os dados de SPR tenham demonstrado que a formação dos complexos BLF-CMC foi conduzida entropicamente (57 ≤ ∆° ≤ 60 kJ mol-¹) os ensaios de EF revelaram valores negativos ∆° até 293,2 K e positivos em temperaturas ≥ 298,2 Ke -58 ≤ ∆° ≤ 230 KJ mol-¹. Por fim, o estudo da interação BLF-κCG mostrou que a formação do complexo foi entalpicamente dirigida (∆° = −81 kJ mol −1 ) e a comparação entre os dados termodinâmicos obtidos por SPR e EF revelou que a interação BLF-κCG ocorreu em vários sítios da BLF. Já os parâmetros cinéticos mostraram que a interação ocorreu através da formação de um complexo de transição e que esse processo foi mais rápido a partir da associação das moléculas livres. A mudança na força iônica alterou a forma como a BLF e a κCG interagem, tornando a ligação um processo de uma única etapa. Palavras-chave: Lactoferrina. Corantes fenotiazínicos. Polissacarídeos. Life manifestation is based mainly on molecular recognition. Consequently, the elucidation of the kinetics and thermodynamics of the protein-ligand interactions is strategic for the comprehension and modulation of biological systems. Besides that, the formation of supramolecular structures is very important to industrial applications, such as, formation and stabilization of emulsions, and encapsulation. Therefore, in this work, it was evaluated the thermodynamics and kinetics of the interaction between lactoferrin (BLF) and two groups of ligands: phenothiazine dyes (methylene blue (MB) and azure A (AZA)) and polysaccharides (carboxymethylcellulose (CMC) and κ-carrageenan (κCG)); combining surface plasmon resonance (SPR), isothermal titration calorimetry (ITC), and fluorescence spectroscopy (FS) data. The work was divided into three articles: in the first one, the comparative study of the interaction between the MB and AZA dyes were made, using multiple techniques (SPR, FS, and ITC), aiming the elucidation of the binding mechanism between these dyes and BLF, and contributions of the CH 3 groups to this interaction. In the second one, the kinetics and thermodynamics of the BLF-CMC interaction were investigated, using FS, and SPR. Finally, in the third article, it was studied the energetics and dynamics of the formation of BLF-κCG complexes, in the absence and presence of KCl, via FS and SPR techniques. Concerning the BLF-phenothiazine dyes interaction, it was verified that, although the similarity between the dyes structures, the thermodynamic parameters for the BLF-AZA binding was higher in magnitude when compared to the BLF-MB system. The results obtained from SPR and FS indicated the entropic factors were the only driving forces of the interaction. However, the ITC showed there is a strong enthalpic contribution associated with the interaction with the holo- BLF. Although the formation of the BLF-MB and BLF-AZA transition complexes, from the association of free ligands, requires similar energetic parameters (∆ ‡a,MB= 51,84 and ∆‡ a,AZA= 50,7 kJ mol -1 ), in the dissociation, these parameters depended on the number of CH 3 groups in the dye structure ∆ ‡d,MB= 81,4 and ∆‡ d,AZA= 74,93 KJ mol-¹). As for the BLF-CMC interaction, the kinetic study suggested the formation of the activated complex at temperatures ≤ 289.2 K was dominated by the energy released by specific interactions between the protein and polysaccharide. Although the SPR data have shown the formation of the BLF-CMC complex was entropy-driven (57 ≤ ∆° ≤ 60 kJ mol-¹), the FS assays revealed negative ∆° até 293,2 K and positive values in temperatures ≥298.2 K, and - 58 ≤ ∆° ≤ 230 KJ mol-¹. Finally, the study of the BLF-κCG interaction showed the complex formation was enthalpy-driven (∆° = −81 kJ mol −1 ) and the comparison between the thermodynamic data obtained by SPR and FS revealed the interaction occurs in various sites of BLF. While the kinetic parameters showed the interaction occurs through the formation of a transition complex and this process is faster from the association of the free molecules. The change in the ionic strength altered the way BLF and κCG interact, making the binding a one- step process. Keywords: Lactoferrin. Phenothiazine dyes. Polysaccharides.