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Short chain fatty acids (SCFAs) are metabolites produced mainly by the gut microbiota with a known role in immune regulation. Acetate, the major SCFA, is described to disseminate to distal organs such as the lungs. Moreover, the literature supports that acetate modulates inflammation and improves bacterial clearance. Our group has previously demonstrated that acetate improves Streptococcus pneumoniae clearance in the context of a secondary post-viral infection. This protection is mediated by alveolar macrophages, the first line of pulmonary immune defense. Thus, our aim was to evaluate the effect of acetate on the killing ability of alveolar macrophages and to delineate the mechanisms involved in this response. Here we show that acetate supplementation in drinking water modulated the secretion of host defense proteins by murine pulmonary cells and led to reduced S. pneumoniae loads in the lungs. To understand the mechanisms of bacterial clearance, alveolar macrophages were used. Transcriptomic analysis (RNAseq) revealed that acetate induced a specific signature of host defense in S. pneumoniae conditioned macrophages. This associates with the improved killing ability of acetate treated macrophages mediated by nitric oxide (NO) production. Increased NO concentration triggered by acetate was dependent on augmentation of IL-1β levels. Surprisingly, IL-1β production led by acetate was neither dependent on its cell surface receptor (Free-Fatty Acid Receptor 2), nor on the enzymes responsible for its metabolism (Acetyl-CoA Synthetase 1 and 2). Alternatively, acetate enhanced the glycolytic profile of macrophages resulting in greater HIF-1α activity which culminated in higher transcription of IL-1β. Moreover, the increased secretion of IL-1β triggered by acetate relied on NLRP3 inflammasome activation. In conclusion, we unravel a new mechanism of bacterial killing by acetate-activated macrophages. We show that acetate increased IL-1β production and secretion in a mechanism dependent on the axis glycolysis/HIF-1α and NLRP3, respectively. Consequently, higher levels of IL-1β resulted in augmented NO production and improved killing ability of alveolar macrophages., Les acides gras à chaîne courte (AGCC) sont des métabolites produits principalement par le microbiote intestinal. Ils jouent un rôle important dans la régulation des réponses immunitaires et inflammatoires. L'acétate, le principal AGCC, est décrit pour disséminer dans l’organisme et réguler la fonction d’organes distaux tels que les poumons. Des travaux récents indiquent une fonction dans le contrôle des agents pathogènes, notamment d’origine bactérienne. Notre groupe a précédemment démontré que l'acétate augmente l’élimination de Streptococcus pneumoniae dans le cadre d'une infection secondaire post-virale. Cette protection est médiée par les macrophages alvéolaires, la première ligne de défense pulmonaire. Ainsi, notre objectif était d'évaluer l'effet de l'acétate sur l’activité bactéricide des macrophages alvéolaires et d’identifier les mécanismes impliqués dans cette réponse. Nous montrons ici que la supplémentation en acétate dans l'eau de boisson module la sécrétion de protéines de défense par les cellules pulmonaires murines et conduit à une réduction de la charge de S. pneumoniae. Nous montrons par analyse transcriptomique (RNAseq) que l’acétate induit une signature spécifique de défense de l’hôte au sein des macrophages alvéolaires conditionnés en présence de S. pneumoniae. Cet effet s’accompagne par l’augmentation de l’activité bactéricide des macrophages mediée pour l'oxyde nitrique (NO). L’augmentation de NO induit par acétate dépendait de l'augmentation des niveaux d'IL-1β. De manière surprenante, la production d'IL-1β déclenchée par l'acétate est indépendante de son récepteur de surface (Free-Fatty Acid Receptor 2) et des enzymes responsables de son métabolisme (Acetyl-CoA Synthetases 1/2). En contrepartie, l'acétate a modulé le profil glycolytique des macrophages induisant l’activation de HIF-1α, qui aboutit à la transcription de l’IL-1β. De plus, l'augmentation de la sécrétion de l’IL-1β déclenchée par l'acétate reposait sur l'activation de l'inflammasome NLRP3. En conclusion, nous avons identifié un nouveau mécanisme conduisant à l’élimination des bactéries par les macrophages alvéolaires traité avec l’acétate. L'acétate augmente la production et la sécrétion d'IL-1β selon un mécanisme dépendant de l'axe glycolyse/HIF-1α et de NLRP3, respectivement. Par conséquent, des niveaux plus élevés d'IL-1β conduit à une augmentation de la production de NO et une meilleure activité bactéricide des macrophages.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico A tripsina bovina possui seis isoformas, sendo a α-tripsina e a β-tripsina bem caracterizadas em meio aquoso. Algumas diferenças estão bem estabelecidas como a massa molecular, o número de cadeias peptídicas e o perfil de atividade enzimática. Neste trabalho, as isoformas α- e β-tripsina foram comparadas com relação às suas atividades, estrutura e propriedades termodinâmicas no sistema orgânico-aquoso. Os solventes orgânicos polares testados foram metanol, etanol e n-propanol. A atividade enzimática, as mudanças conformacionais e estruturais, a organização supramolecular e a estabilidade termodinâmica foram avaliadas por diferentes técnicas espectroscópicas (UV, CD e DLS) e calorimétricas. Os resultados comparativos mostraram que as alterações induzidas por cada solvente na estrutura e atividade da mesma isoforma de tripsina ocorrem em diferentes concentrações. A isoforma β-tripsina apresentou atividade amidásica superior na presença dos solventes orgânicos testados, sendo os melhores resultados encontrados no etanol. Não foi encontrada redução do conteúdo das estruturas secundárias estruturadas em ambas as isoformas, mas a isoforma β-tripsina sofreu maior grau de rearranjo. A adição de concentração crescente de solvente orgânico causa redistribuição no arranjo supramolecular de ambas as isoformas, com a formação de aglomerados até 60% (v/v). Já em 80% (v/v) de etanol foram observados comportamentos distintos entre as isoformas: enquanto a β-tripsina forma aglomerados reversíveis, a ɑ-tripsina forma agregados insolúveis. O uso de diferentes concentrações de solventes orgânicos revelou um processo de desnaturação mais cooperativo para β-tripsina e um estado nativo menos estável para ɑ-tripsina. Os estudos termodinâmicos comprovaram as previsões feitas com os resultados espectroscópicos e mostraram que a conformação da β-tripsina foi mais resistente às diferentes concentrações de etanol, porém apresentou diferenças conformacionais mais acentuadas quando comparados os resultados entre meio aquoso e meio aquo-orgânico. Já a ɑ-tripsina apresentou menor estabilidade conformacional, representada por reduções gradativas dos parâmetros termodinâmicos até 60% (v/v). Bovine trypsin has six isoforms, being the α-trypsin and β-trypsin isoforms well characterized in aqueous media. Some differences are well established as the molecular weight, the number of peptide chains and enzyme activity profile. In this work, the α- and β-trypsin isoforms were compared concerning their activities, structure, and thermodynamics properties in the aqueous-organic system. The organic polar solvents tested were methanol, ethanol, and n-propanol. Enzyme activity, conformational change, secondary structure, supramolecular organization, and thermodynamics were evaluated by different spectroscopic (UV, CD, and DLS) and calorimetric techniques. The comparative results showed that the changes induced by each solvent on the structure and activity of the same trypsin isoform occur at different concentrations. The β-trypsin isoform showed superior amidase activity in the presence of the tested organic solvents. Better results for enzyme activity are found in ethanol. No statistically significant losses were found in the content of defined secondary structures for both isoforms, but the β-trypsin isoform suffered more rearrangement. The addition of increasing concentration of organic solvent causes redistribution in the supramolecular arrangement of both isoforms, with the formation of agglomerates in 60% (v/v). In 80% (v/v) of ethanol were observed distinct behavior between the isoforms: the β-trypsin formed reversible agglomerates while the ɑ-trypsin formed insoluble aggregates. The use of different organic solvent concentrations revealed a more cooperative denaturation process for β-trypsin and a less stable native state for ɑ-trypsin. The thermodynamic studies have proved all the predictions done with the spectroscopic data and showed that the β-trypsin conformation was more resistant to the different ethanol concentrations. However, it presented more accentuated conformational differences when compared the results between aqueous and aqueous-organic media. On the other hand, the ɑ-trypsin had lower conformational stability, represented by gradual reductions in thermodynamic parameters up to 60% (v/v).

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A tolerância imunológica é um dos fenômenos pelos quais o organismo consegue tolerar autoantígenos ao invés de reagir de forma inflamatória contra eles. A tolerância oral (TO) é um mecanismo análogo à autotolerância e é definida como a supressão de respostas imunes humorais e celulares contra antígenos específicos, gerada pela administração prévia desses antígenos por via oral. A TO tem um grande potencial terapêutico para doenças inflamatórias intestinais, hipersensibilidades alimentares e doenças autoimunes, porém ainda existem algumas dificuldades para sua implementação na prática clínica tais como doses ideiais e redução da sua eficácia após a sensibilização. Para resolver essas dificuldades, é importante encontrarmos protocolos otimizados para potencializarmos a indução de TO pela ação de agentes adjuvantes como a Lactococcus lactis. O efeito adjuvante da L. lactis NCDO2118 na inibição de doenças inflamatórias tem sido estudado em alguns modelos pelo nosso grupo de pesquisa e por colaboradores, como encefalomielite autoimune experimental (EAE), artrite, colite e mesmo na inflamação induzida pela infecção por Leishmania quando esta bactéria é administrada juntamente com a proteína HSP65 e em modelo de GVHD quando ela é administrada juntamente com um aloantígeno. O objetivo do presente estudo foi avaliar os componentes da L.lactis envolvidos no efeito adjuvante da administração de L. lactis associada à ovalbumina (OVA) na indução de tolerância oral em camundongos C57BL/6. Usamos um protocolo subotimo de TO. Camundongos que ingeriram OVA associada à L. lactis NCDO2118 por via oral apresentaram níveis mais baixos de IgG1 e IgE anti-OVA no soro; frequência aumentada de células dendríticas tolerogênicas (CD11c+CD11b-CD103+), de macrófagos residentes CX3CR1+, de células Treg (CD4+LAP+) e de ILC2 na mucosa intestinal e nos linfonodos mesentéricos (MLNs) proximais. Observamos alteração no perfil da microbiota e de seus metabólitos produzidos no lumen intestinal, principalmente um aumento na produção de lactato, um ácido orgânico produzido em grande quantidade pela L. lactis. Sinergicamente houve um aumento na expressão de receptores de lactato no intestino, tais como GPR31 e principalmente GPR81 que, quando inibido por seu antagonista, gerou perda da TO. Em modelo de alergia alimentar à OVA, a L. lactis reduziu o número de eosinófilos melhorando parâmetros inflamatórios da doença. Concluímos que a L. lactis NCDO2118 desencadeou modulação da microbiota intestinal e mecanismos imunes inatos que melhoram a indução de TO a OVA, o que a torna essa bactéria um excelente adjuvante desse fenômeno.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A Hipótese da Higiene postula que a estimulação do sistema imune por uma infecção parasitária protege o hospedeiro do desenvolvimento de desordens atópicas e inflamatórias. Nos últimos anos tem-se estudado a influência de parasitos em doenças imunometabólicas, como obesidade. Isto porque o benefício da infecção advém da capacidade de modular o sistema imune o que garante não só a permanência do parasito como também diminui respostas inflamatórias no hospedeiro. O presente estudo objetivou investigar a influência da infecção por Heligmosomoides polygyrus, um helminto de roedores, nos estágios iniciais do desenvolvimento de obesidade e das suas consequências metabólicas. Camundongos C57BL/6 machos, livres de patógenos específicos, foram submetidos à dieta controle ou indutora de obesidade, por cinco semanas, na presença ou não de infecção. Foram analisados: ganho de peso, ingestão calórica, desenvolvimento de alterações metabólicas, inflamação e perfil de células inflamatórias no tecido adiposo. Apesar de não haver diferença na ingestão calórica entre os animais submetidos à dieta hiperlipídica, a presença da infecção foi capaz de prevenir o ganho exacerbado de peso. Este efeito não ocorre devido a espoliação do parasito já que não houve diferença de peso entre os grupos infectado e não infectado que receberam dieta controle. Além disso, a infecção foi capaz de melhorar a resposta à insulina, o acúmulo de gordura no fígado, o nível de triglicerídeos e colesterol HDL. Observamos aumento de parâmetros reguladores da inflamação, associada à obesidade, como IL10, adiponectina, e células Th2 e Tregs, bem como diminuição de Th1 e Th17. Estes efeitos estiveram associados à capacidade da infecção de modular o fenótipo das células Tregs induzindo a expressão de marcadores relacionados a produção de TGF-ß (LAP) e também a ativação celular (Ox40), além de proteger a perda de funcionalidade das Tregs, induzida pela dieta hiperlipídica. The Hygiene Hypothesis postulates that the immune system stimulation by parasitic infection can protect the host from developing atopic and inflammatory disorders. In the past few years the parasite influence in the development of immunometabolic diseases, such as obesity, has been a topic of interest within the scientific community. The beneficial effect of the infection occurs due to its capacity to modulate the immune system that enables the survival of the parasite in the host, but also modulates inflammatory responses. The present study aimed to verify the influence of the infection by Heligmosomoides polygyrus, a murine parasite, in early stages of obesity development and its metabolic consequences. C57BL/6 male mice, specific pathogen free, were fed control or high fat diet, for five weeks, in the presence or not of helminth infection. Weight gain, caloric intake, development of metabolic disorders, inflammation and cellular migration to the adipose tissue were evaluated. Even though no changes were observed in the caloric intake between animals fed with high fat diet, the presence of infection was able to prevent the exacerbated weight gain. This effect did not occur because of host spoliation by the parasite since there was no difference between groups infected and non-infected that received control diet. Also, the infection improved the response to insulin, fat accumulation in the liver and serum levels of triglycerides and HDL cholesterol. We could observe increase in regulatory mechanisms against obesity-associated inflammation like IL10, adiponectin, Th2 and Tregs cells, and a reduction in Th1 and Th17 infiltration in adipose tissue. These effects seemed to be associated with the ability of the infection to modulate Tregs numbers and phenotype, promoting the expression of cell surface markers associated with TGF- ß production (LAP), and cell activation (Ox40), and also by protecting the loss of function by these cells, induced by the high fat diet.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O mosquito Aedes aegypti é responsável por transmitir aos humanos as principais arboviroses de importância médica, como o vírus Zika (ZIKV). Estratégias para bloquear a transmissão destes vírus por interferência direta no inseto vetor podem ser uma forma importante de conter as infecções por ZIKV. Compreender o padrão de replicação e o tropismo do vírus no vetor pode facilitar a identificação de tecidos-chave para a replicação viral e auxiliar na elucidação de alvos para bloquear a competência vetorial do mosquito. Nesse estudo buscamos entender como ocorre o ciclo de infecção e o padrão de replicação do ZIKV em mosquitos Ae. aegypti, utilizando ensaios de microscopia. Desafiamos oralmente mosquitos Ae. aegypti em camundongos AG129 infectados com ZIKV e verificamos o estado de infecção e a carga viral da carcaça e do intestino médio dissecado dos mosquitos por qPCR. Após a confirmação da infecção, procedemos à avaliação da cinética e do tropismo viral para os tecidos do mosquito. Para isso, padronizamos uma estratégia de inclusão de mosquitos em parafina que foi feita em amostras coletadas nos dias 4, 8 e 14 pós-desafio oral em camundongos. Em seguida, realizamos a imunomarcação utilizando anticorpos anti-dsRNA (RNA de dupla fita), um intermediário da replicação viral, nas secções dos mosquitos, as quais foram submetidas à microscopia de fluorescência e confocal. A marcação para replicação viral foi positiva para os seguintes órgãos e tecidos do mosquito ao longo ciclo de infecção: intestino médio, corpo gorduroso, gânglio abdominal, glândula salivar e sistema nervoso central. As analises sugerem que a disseminação sistêmica do ZIKV é provavelmente condicionada ao tempo de infecção do mosquito e alcança os órgãos secundários ao intestino de maneira ascendente a anatomia do vetor. Apresentamos que a replicação viral acontece de maneira polarizada na porção apical do epitélio intestinal, apontando um potencial microambiente para a formação de fabricas viral do intestino do mosquito. Dessa forma, fornecemos informações sobre tropismo viral e a dinâmica de replicação do ZIKV em mosquitos em laboratório, estabelecendo os primeiros passos para a caracterização do ciclo de infecção do ZIKV no vetor Ae. aegypti.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O intestino é a principal superfície de absorção dietética, e os compartimentos imunológicos associados à mucosa intestinal possuem uma complexa rede de mecanismos tolerogênicos capazes de interagir constante e simultaneamente com nutrientes e com a microbiota sem desencadear processos patológicos. Os nutrientes da dieta são peças-chave para a diferenciação de células na mucosa e para integridade da barreira intestinal. Adotar hábitos alimentares ricos em gorduras e alimentos refinados, escassos em carboidratos complexos e fibras, favorecem o desenvolvimento de doenças crônicas não-transmissíveis e o agravamento de doenças inflamatórias intestinais. Baseados nestas evidências, procuramos esclarecer como as alterações metabólicas induzidas por bebida açucarada interferem no sistema imune de mucosa intestinal e na susceptibilidade à mucosite. Camundongos C57BL/6 ou C57BL/6-GFP-knock-in FoxP3 foram alimentados com dieta AIN93G e receberam água ou bebida açucarada contendo 25% de uma mistura de glicose e frutose na proporção 45:55, respectivamente. Após 8 semanas de consumo contínuo de bebida açucarada houve aumento do consumo calórico total, o que foi capaz de desencadear alterações corporais e metabólicas relacionadas à síndrome metabólica. Tais alterações incluem o aumento de glicemia, glicosúria e hemoglobina glicada, modificações no perfil lipídico sanguíneo, bem como o acúmulo de tecido adiposo e a degeneração hepática. Foi identificado na análise histológica e por citometria de fluxo a inflamação do tecido adiposo do grupo bebida açucarada, caracterizada por leucócitos ao redor dos adipócitos hipertrofiados e aumento na frequência de células TCD4+RORγT+, relacionadas ao perfil TH17, e frequência reduzida de células T reguladoras FoxP3+. Além disso, a análise histológica do íleo de camundongos que consumiram carboidratos simples em excesso, mostrou achatamento dos vilos e redução do número de células caliciformes. Ao analisar a frequência celular no linfonodo responsável por drenar a porção distal do intestino delgado, houve maior frequência de células TH17 e menor frequência de células T reguladoras FoxP3+. Porém, essa inflamação não foi suficiente para piorar a mucosite causada pelo 5-FU. Sendo assim, foi identificado síndrome metabólica associada à inflamação subclínica na porção mais distal do intestino delgado de camundongos que consumiram a bebida açucarada cronicamente. The intestine is the main surface for dietary absorption, and the immune compartments associated with it have a complex network of tolerogenic mechanisms capable of interacting constantly and simultaneously with nutrients and the microbiota without triggering pathological processes. Dietary nutrients are key to the differentiation of cells in the intestinal mucosa and to the integrity of the intestinal barrier. Eating habits related to high fat and refined food intake, as well as to low complex carbohydrates and fiber intake, favor the development of chronic non-communicable diseases and the worsening of inflammatory bowel diseases. Based on this evidence, we sought to clarify how the metabolic changes induced by sugary drinks interfere with the gut immune system and with the susceptibility to mucositis. C57BL/6 or C57BL/6-GFP-knock-in FoxP3 mice were fed with AIN93G diet and given water or a sugar-sweetened beverage containing 25% of a glucose and fructose mixture in a 45:55 ratio, respectively. After 8 weeks of continuous ingestion of the sugar-sweetened beverage, there was an increase in total calorie intake, which was able to cause body composition and metabolic changes related to metabolic syndrome. Such changes included elevated blood glucose, glycosuria and glycated hemoglobin, alteration in blood lipid profile, as well as adipose tissue accumulation and liver degeneration. Adipose tissue inflammation in the sugar-sweetened beverage group was identified by histological and flow cytometry analysis, which showed the presence of leukocytes around hypertrophied adipocytes and increased frequency of TCD4+RORγT+ cells, related to the TH17 profile, as well as reduced frequency of FoxP3+ regulatory T cells. Moreover, histological analysis of the ileum of mice that consumed excessive simple carbohydrates showed flattening of the villi and reduced numbers of goblet cells. When the cell frequency of the lymph node responsible for draining the distal portion of the small intestine was analyzed, a higher frequency of TH17 cells and a lower frequency of FoxP3+ regulatory T cells was observed. However, this inflammation was not enough to worsen mucositis caused by 5-FU. Therefore, metabolic syndrome associated with subclinical inflammation was identified in the distal portion of the small intestine of mice that chronically ingested the sugar-sweetened beverage.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O câncer de mama é a principal causa de morte em mulheres no mundo e sua incidência aumenta a cada ano. Condições genéticas e ambientais dão suporte para o surgimento de carcinomas com graus de agressividade e processos tumorogênicos distintos. Apesar de ser o câncer mais estudado no mundo, protocolos terapêuticos ainda não são eficientes para conter o número de mortes atuais. A heterogeneidade de tumores sólidos e o estudo in vitro entre linhagens normais e metastáticas dificultam a compreensão do processo carcinogênico e tumorigênico por não conseguirem responder por completo os circuitos celulares que sustem o surgimento e a evolução tumorigênicas das células tumorais. A avaliação de contextos comuns e distintos entre as várias fase da evolução do tumor pode trazer luz a esse processo e subsidiar a construção de medidas diagnósticas e terapêuticas mais eficientes. Utilizando o estudo de linhagens celulares em diferentes estágios tumorigênicos (MCF-10A: origem não tumoral; MGSO-3 e MACL-1: origem de tumor primário; MDA-231-MD: origem metastática), o objetivo desse trabalho foi caracterizar condições que demonstrassem diferenças e semelhanças nos estágios de evolução tumoral através da análise proteômica. Foram identificadas e quantificadas 3.008 proteínas, das quais, após análise estatística com P < 0,05 e fold-change de 1,3, caracterizamos 1.709 proteínas em todas as linhagens celulares. As análises dos gráficos de PCA e do heat map evidenciaram a distinção das linhagens com relação ao seu estágio tumorigênico. Na análise de ontologia gênica, várias vias de sinalização se mostraram alteradas, com enfoque, nesse trabalho, para vias de metabolismo energético, alterações do citoesqueleto e do ciclo celular. Com relação ao metabolismo celular, linhagens tumorais de sítios primários e metastático possuem perfil de regulação distinto, com o catabolismo aeróbico ativo nas células MGSO-3 e MACL-1 e anaeróbico na célula MDA-231-MD. Em conjunto, células tumorais não possuem vias lipolíticas para produção energética, principalmente via β oxidação. Além da via anaeróbica, a linhagem metastática utiliza vias não canônicas para obtenção de energia, como turnover do citoesqueleto de actina. Vias metabólicas correlacionam-se com vias apoptóticas dependentes de mitocôndrias, com vias de BAX e BcL ativas nas linhagens tumorais de origem primária e inativadas pela ação da proteína 14-3-3ε nas linhagens tumorais de origem metastática. Além disso, a densidade de mitocôndrias também está diminuída nas células MGSO-3 e MACL-1 e aumentada na célula MDA-231-MD em comparação a célula MCF-10A. Com relação ao ciclo celular, as linhagens de sítio primário tem suas vias controladas ação do proteassoma 26s, o que não ocorre com a linhagem de sítio metastático. Já a arquitetura do citoesqueleto nas células MGSO-3 e MACL-1 apresentam uma desregulação das suas vias de controle, o que não acontece na célula MDA-231-MD, com processos biológicos de regulação semelhante à célula MCF-10A. Todos os resultados apresentados corroboram para a importância da questão tumorogênica como base da compreensão dos circuitos proteicos que determinam o estabelecimento, sobrevida e maturação de células tumorais e podem subsidiar estudos sobre alvos diagnósticos e terapêuticos mais eficientes. Breast cancer is the leading cause of deaths in women worldwide. Genetic and environmental conditions support the outbreak of carcinomas with varying degrees of aggressiveness and tumorogenesis, leading to the cell transformation to primary cancer cells. Such factors can also give rise to metastasis. Even though breast cancer is one of the most studied type of cancer, yet pharmacological and therapeutic treatments are not efficient to reduce death rate. The ways to study breast cancer are through fragments of solid tumors removed in surgical procedures or in vitro studies using cell lines, though both strategies have limitations. For example, fragment of solid tumor is composed by several cell populations, which leads to high heterogeneity. On the other hand, in vitro studies usually are based on metastatic tumor lines, reflecting only the end of the tumor development process. The main objective of this work was to evaluate the proteome profile of breast cancer cell lines at different tumorigenic stages to better understand the molecular mechanisms underlying the tumorigenic process. Through the comparative analysis of the proteomes of MCF-10A (non-tumor origin), MGSO-3 and MACL-1 (primary tumor origin), and MDA-231-MD (metastatic origin) cell lines, we evaluated the functional state of each cell profile. In total, we identified and quantified 3,008 proteins and 1,709 regulated proteins (P < 0.05 and fold-change = 1.3). The PCA analysis and heat map showed a correlation between tumorigenic profile and proteome profile. Besides, the Venn diagrams demonstrated that similar tumorigenic profiles also shared higher number of proteins. Through gene ontology analysis, several positive and negative regulated biological processes were found across the cell lines. Similar biological processes were grouped into large clusters. In this work, we focused our analyses in terms related to energy metabolism, alterations in the cell cycle, and alterations in the cytoskeleton. Concerning energy metabolism, the tumor cell lines showed downregulation of lipid biosynthesis and the metastatic cell (MDA-231-MD) was the only one showing upregulation of β-oxidation. On the other hand, proteins related with the carbohydrate metabolism were mainly upregulated in the primary cells (MGSO-3 and MACL-1) and downregulated in the metastatic cell, mainly the proteins associated with the aerobic phase. These results are in line with an aerobic metabolism for the primary tumor lines and anaerobic metabolism for the metastatic one. This metabolic dichotomy seems to reflect on mitochondrial activity, as the primary tumor cells had lower mitochondrial density compared with the normal and metastatic cell lines. Furthermore, regulation profile of proteins associated with the mitochondrial BAX-dependent apoptotic pathways suggest that the primary cells are more prone for apoptosis compared with metastatic and normal cells. Regarding the cell cycle, the tumor cell lines have the highest number of upregulated processes. Besides, primary tumor cells seem to have upregulated biological processes related to the 26s proteasome, which is responsible for controlling oxidative processes and signaling pathways, mainly on the MACL-1. Regarding the cytoskeleton, the MDA-231-MD was the only tumor cell line to show upregulated biological processes, mainly related to cell adhesion mechanisms. Moreover, some upregulated proteins associated with cytoskeleton were also related with the glycolytic pathway, demonstrating that the role of cytoskeleton proteins are not only structural and for defense, but also for the survival of the metastatic tumor cell. All the results presented here are important for the better understanding of the molecular grounds of breast cancer tumorigenesis.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior INCT – Instituto nacional de ciência e tecnologia (Antigo Instituto do Milênio) FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo A malária é uma doença causada pelo Plasmodium spp e afeta milhões de pessoas todos os anos. A resposta imune exacerbada do hospedeiro desencadeia grande produção de citocinas inflamatórias, como IL-1β e TNFα, contribuindo para o aparecimento dos sintomas da doença. Durante a malária murina, embora haja ativação de caspase-11, a via não canônica de ativação do inflamassoma parece não contribuir para a patogênese da doença, enquanto a caspase-1 desempenha papel importante na produção de IL-1β. Nossos resultados mostram que há ativação de caspase-8 em monócitos do baço de camundongos infectados e a caspase-8 participa da produção de IL-1β e TNFα. Além disso, camundongos Ripk3/Casp8-/- são parcialmente resistentes ao modelo de infecção e desafio com LPS e à malária cerebral experimental, enquanto os camundongos Ripk3/Casp8/1/11-/- e Ripk3/Casp8/Gsdmd-/- são altamente em ambos os modelos. Esses resultados demonstram um papel complementar da caspase-8, porém independente à função do inflamassoma, para mediar a patogênese da malária. Além disso, pacientes infectados por P. falciparum ou P. vivax possuem GSDMD ativa e ativação de caspase-4 e -8 em monócitos. Assim, esse trabalho sugere a importância da caspase-8 durante a malária e seu potencial como possível alvo de intervenção terapêutica. Malaria is a disease caused by Plasmodium spp. parasites which affects millions of people every year. Exacerbated immune response by the host triggers a large production of inflammatory cytokines such as IL-1β and TNFα, contributing to the symptoms of the disease. During mouse malaria, although there is caspase-11 activation, the non-canonical pathway of inflammasome does not seem to contribute to the pathogenesis of the disease, whereas caspase-1 plays an important role on IL-1β production. Caspase-8 is cleaved in splenic monocytes from infected mice and caspase-8 participates in IL-1β and TNFα production. Moreover, Ripk3/Casp8-/- mice are partially resistant to infection followed by LPS challenge and experimental cerebral malaria and Ripk3/Casp8/1/11-/- e Ripk3/Casp8/Gsdmd-/- mice highly resistant in both models. These results demonstrate a complementary, but independent, role of caspase-8 and inflammasomes in mediating malaria pathogenesis. Besides, P. vivax and P. falciparum infected patients display active GSDMD, caspase-4 and caspase-8 in monocytes. In conclusion, the present work suggests the importance of caspase-8 during malaria and its potential role as a possible therapeutical target.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Myocardial infarction (MI) is the irreversible injury of the myocardium caused by prolonged myocardial ischemia and is a major cause of heart failure and eventual death among ischemic patients. The current trend of mortality due to MI and shortcomings of available therapeutics informed the need for an alternative remedy that could make the heart more resistant to infarction. Andrographolide is the principal compound in Andrographis paniculata, an indigenous plant commonly included in herbal concoction indicated for cardiovascular diseases and chest pains. Therefore, the present study assessed the protective potentials of andrographolide against isoproterenol-induced myocardial infarction in rats. Animals were randomly divided into four groups: Control (Ctr) group received 0.9 % saline solution once daily for 21 days, Isoproterenol (Iso) group received 0.9 % saline solution once daily for 19 days followed by 80 mg/kg/day of isoproterenol hydrochloride solution on day 20 and 21, Andrographolide (Andro) group received 20 mg/kg/day of andrographolide for 21 days, and Andrographolide plus Isoproterenol (Andro + Iso) group received 20 mg/kg/day of andrographolide for 21 days with co-administration of 80 mg/kg/day of isoproterenol hydrochloride solution on day 20 and 21. At the end of all treatments, cardiac-specific parameters that define cardiac health and MI were evaluated in all groups. Likewise, the mechanical and electrical profiles that shapes the functions of the heart were assessed in cardiomyocytes isolated from each group using standard assay methods. In addition, effects of Andro on these mechanical and electrical profiles were further substantiated with in-vitro tests and compared to standard drug of MI. Iso caused: ST-segment elevation and significant (p

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico A disfunção endotelial é uma condição crônica, que se inicia com o estresse oxidativo em resposta ao componente lisofosfatidilcolina (LPC), presente na LDL oxidada (LDLox), sendo este um evento chave para a geração de uma resposta inflamatória podendo culminar no desenvolvimento da aterosclerose e suas complicações. É reconhecido o papel fundamental das óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e neuronal (nNOS) na manutenção da homeostase vascular. E que seu desacoplamento, está intimamente ligado à evolução clínica da disfunção endotelial. Na busca por novas substancias que possam atuar na prevenção ou tratamento das comorbidades cardiovasculares, os estudos envolvendo componentes dietéticos tem se destacado. O butirato é produzido pelo organismo pela fermentação bacteriana de fibras no cólon e constitui a principal fonte energética para os colonócitos. Vários estudos nos últimos anos tem mostrado que o butirato possui efeitos anti-inflamatórios, anti-oxidantes, anti-aterogenicos, dentre outros efeitos. Uma vez que a disfunção endotelial é o evento inicial chave para o desenvolvimento de comorbidades cardiovasculares graves, e que o butirato possui propriedades que o tornam um excelente candidato para o estudo do seu efeito sobre a disfunção endotelial. O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos do butirato de sódio sobre a disfunção endotelial causada pela LPC. Para isso foram utilizados camundongos machos C57BL6/J, com 10-12 semanas de idade, os animais foram eutanasiados e sua aorta torácica foi dividida em anéis e montados em um banho de órgãos para a avaliação da reatividade vascular. Os resultados mostraram que o butirato, em sua menor concentração de teste, foi capaz de melhorar a disfunção endotelial causada por LPC e que esse efeito se deu pela ação de nNOS presente no endotélio. Foram realizados, também, estudos in vitro de citometria de fluxo e western blot com células endoteliais (EA.Hy926) pré tratadas com LPC e depois expostas a concentrações de butirato, e em seguida, estimuladas com ACh. O tratamento com butirato levou ao aumento na produção de NO, e na diminuição de peróxido de hidrogênio (H2O2) e anion superóxido (O-2). O presente trabalho mostrou pela primeira vez que o tratamento com butirato de sódio foi capaz de reverter a disfunção endotelial causada por LPC por aumento de NO via normalização da atividade de nNOS, diminuição de ROS e pela regularização da atividade de ERK1/2. Os resultados mostram que o tratamento com butirato de sódio impede a resposta disfuncional mediada por LPC. Endothelial dysfunction is a chronic condition, which begins with oxidative stress in response to the lysophosphatidylcholine (LPC) component, present in oxidized LDL (LDLox), which is a key event for the generation of an inflammatory response that may culminate in the development of atherosclerosis and its complications. The fundamental role of endothelial (eNOS) and neuronal (nNOS) nitric oxide synthases in maintaining vascular homeostasis is recognized and that its decoupling is closely linked to the clinical evolution of endothelial dysfunction. In the search for new substances that can act in the prevention or treatment of cardiovascular comorbidities, studies involving dietary components have stood out. Butyrate is produced by the body through bacterial fermentation of fibers in the colon and is the main energy source for colonocytes. Several studies in recent years have shown that butyrate has anti-inflammatory, anti-oxidant, anti-atherogenic effects, among other effects. Since endothelial dysfunction is the key initial event for the development of severe cardiovascular comorbidities, and butyrate has properties that make it an excellent candidate for studying its effect on endothelial dysfunction. The aim of this work was to evaluate the effects of sodium butyrate on endothelial dysfunction caused by PCL. For this purpose, male C57BL6 / J mice, aged 10-12 weeks, were euthanized and their thoracic aorta was divided into rings and mounted in an organ bath to assess vascular reactivity. The results showed that butyrate, at its lowest test concentration, was able to improve endothelial dysfunction caused by LPC and that this effect was due to the action of nNOS present in the endothelium. Flow cytometry and western blot studies were also carried out with endothelial cells (EA.Hy926) pre-treated with LPC and then exposed to butyrate concentrations, and then stimulated with ACh. The treatment with butyrate led to an increase in NO production, and a decrease in hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide anion (O2-). The present study showed for the first time that treatment with sodium butyrate was able to reverse the endothelial dysfunction caused by LPC by increasing NO via normalization of nNOS activity, decreasing ROS and by regularizing the ERK1 / 2 activity. The results show that treatment with sodium butyrate prevents the dysfunctional response mediated by LPC.

Em grande parte das infecções parasitárias, existe uma relação dinâmica entre o agente etiológico e o sistema imunológico do hospedeiro, cujo equilíbrio, se alterado, pode influenciar o prognóstico da doença. Na infecção malárica, o Plasmodium spp. desencadeia a produção de altos níveis de citocinas inflamatórias que são essenciais para o controle do parasito, mas também são responsáveis pelos sintomas da doença. Nosso grupo demonstrou que os monócitos desempenham um papel importante na proteção contra o P. vivax, constituindo uma importante fonte de citocinas inflamatórias e de espécies reativas de oxigênio. A fim de modular a inflamação, citocinas anti-inflamatórias também são produzidas. Estudos sugerem que as diferentes apresentações clínicas dos pacientes com malária causada pelo P. vivax estão fortemente associadas a um desequilíbrio no balanço entre citocinas inflamatórias e anti-inflamatórias. Apesas dos avanços no entendimento acerca dos mecanismos protetores e imunopatológicos, pouco é sabido em relação a manutenção desse equilíbrio durante a malária. O presente estudo demonstrou que durante a infecção pelo P. vivax, há uma reprogramação no metabolismo dos monócitos e a mitocôndria desempenha um papel central nesse fenômeno. Essa transição consiste em um aumento da captação de glicose, bem como na produção de ATP via glicólise. Essas alterações estão associadas a aumento no potencial de membrana mitocondrial, favorecendo a produção de mROS. Esse mecanismo pode estar envolvido no controle do parasito, visto que a mitocôndria é capaz de migrar para o fagolisossomo contendo o Pv-RET e produzir mROS. Por outro lado, os monócitos também atuam na modulação dessa resposta inflamatória. Essas células expressam níveis mais altos de ectonucleotidases em relação aos demais leucócitos, indicando um importante papel na modulação do ATP extracelular e consequentemente, na produção de adenosina. Apesar dos níveis plasmáticos de adenosina terem diminuído em pacientes com malária aguda causada pelo P. vivax, os mesmos pacientes exibem uma expressão aumentada de receptores purinérgicos P1 nas subpopulações de monócitos. Ademais, a adenosina aumenta a produção de IL-10 e diminui a de TNF pelos monócitos, sendo esse efeito completamente abolido com o bloqueio do receptor A2A. Em conjunto, nossos dados demonstram que os monócitos têm um papel duplo durante a malária causada pelo P. vivax, tentando simultaneamente controlar a infecção e a potencial resposta inflamatória deletéria. In most parasitic infections, there is a relationship between the etiologic agent and the host's immune system, whose balance, if altered, can influence the host’s susceptibility and, therefore, the prognosis of the disease. During malaria, Plasmodium spp. triggers the production of high levels of inflammatory cytokines that are both essential for the control of the parasite and responsible for the symptoms observed during the disease. Our group demonstrated that monocytes play an important role in host defense against Plasmodium vivax infection and represent the main source of inflammatory cytokines and reactive oxygen species. In order to modulate inflammation, anti-inflammatory cytokines, such as IL-10, are also produced. Studies suggested that different clinical presentations of malaria are strongly associated with an imbalance in inflammatory and anti-inflammatory cytokines production. Based on that, despite advances in our understanding of the involvement of protective and immunopathological immunity, little is known about maintaining this balance during malaria. The present study demonstrates that during P. vivax infection monocyte metabolism is altered with mitochondria playing a major function in this switch. This transition involves a reprograming in monocyte metabolism in which the cells increase glucose uptake and produce ATP via glycolysis instead of via oxidative phosphorylation (OXPHOS). Morevover, the above changes are associated with altered mitochondrial membrane potential leading to an increase in mROS instead of ATP production, which can be involved in parasite control since these organells are able to migrate to the phagolysosome containing the Pv-RET and produced mROS. On the other hand, monocytes also participate in the modulation of this inflammatory response during malaria. They express higher levels of ectonucleotidases than other leukocytes, indicating their important role in extracellular ATP modulation and consequently in adenosine production. Despite plasmatic levels of adenosine were decreased in patients experiencing acute malaria caused by P. vivax, the same patients display an increased expression of P1 purinergic receptors on monocyte subsets. In addition, adenosine increases IL-10 and decreases TNF production by monocytes. Importantly, this effect was completely abolished with the blockage of A2a receptor. All together our data show that monocytes have a dual role during malaria caused by P. vivax, simultaneously attempting to control the infection and the potential deleterious inflammatory response.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O Toxoplasma gondii, causador da toxoplasmose, é um parasito intracelular obrigatório com grande capacidade de invadir as células hospedeiras e de evadir suas defesas. Dentro do hospedeiro, o parasito pode estimular a ativação de mecanismos antimicrobianos, como a produção de óxido nítrico (NO) e de espécies reativas de oxigênio (ROS). Muitos trabalhos vêm tentando elucidar o papel das ROS durante à infecção pelo T. gondii, porém os dados mostram-se inconclusivos. A fim de entender a importância das ROS na infecção in vivo pelo T. gondii, acompanhamos durante 15 dias, camundongos nocautes na produção de superóxido via NOX2 (PHOX KO) e camundongos selvagens (C57BL/6 WT) infectados com 10 cistos da cepa Me49 (tipo II) por via intragástrica. Nossos resultados mostraram que os camundongos WT e PHOX KO infectados com 10 cistos da cepa Me49 de T. gondii não apresentaram mortalidade durante o período de infecção avaliado. Apesar disso, os camundongos WT apresentaram notáveis características de caquexia a partir do nono dia de infecção, que foram confirmadas através dos elevados níveis de citocinas pró-inflamatórias (TNF e IFN-γ), NO e da elevada perda de peso em comparação aos camundongos PHOX KO. Mostramos também que a presença da NOX2 ativa em camundongos WT infectados pelo T. gondii promoveu maior dano tecidual e maiores níveis de inflamação no fígado, que foram comprovados através dos níveis elevados de peroxidação lipídica (dano oxidativo) e de enzimas hepáticas (dano hepático) nesses camundongos. Esses dados foram reforçados através da análise histopatológica do fígado, que mostrou dano tecidual nos camundongos WT em todos os tempos de infecção avaliados com a presença de infiltrado de células inflamatórias e focos de necrose. No intestino, principal porta de entrada do parasito a outros órgãos, não observamos diferenças nos níveis de peroxidação lipídica entre os grupos de camundongos infectados devido à ausência do parasito no período de infecção avaliado. Ao associar o dano tecidual (presente em maior intensidade nos camundongos WT) à provável produção de ROS em resposta a infecção, não observamos diferenças entre os grupos de camundongos infectados. Também não observamos diferenças nos níveis de enzimas antioxidantes (SOD e catalase) no fígado e no intestino dos grupos de camundongos infectados que poderiam explicar os baixos níveis de ROS encontrados nesses camundongos. Nossos resultados indicam que as ROS não estão envolvidas na eliminação do parasito durante a infecção pelo T. gondii. De maneira surpreendente, o estresse oxidativo contribui no desenvolvimento de diversas consequências negativas para o hospedeiro infectado, já que esse estresse oxidativo não é capaz de eliminar o parasito, conforme mostramos em nossos resultados. Toxoplasma gondii, which causes toxoplasmosis, is an obligate intracellular parasite with great ability to invade host cells and evade their defenses. Within the host, the parasite can stimulate activation of antimicrobial mechanisms, such as production of nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS). Many studies have been trying to elucidate the role of ROS during T. gondii infection, but the data are inconclusive. In order to understand the importance of ROS in T. gondii infection in vivo, we monitored for 15 days knockout mice producing NOX2 superoxide (PHOX KO) and wild type mice (C57BL/6 WT) infected with 10 cysts of T. gondii Me49 strain. (type II) intragastrically. Our results showed that WT and PHOX KO mice infected with 10 cysts of the T. gondii Me49 strain did not show mortality during the evaluated period of infection. Nevertheless, WT mice showed remarkable cachexia characteristics from the ninth day of infection, which were confirmed by high levels of pro-inflammatory cytokines (TNF and IFN-γ), NO and high weight loss compared to PHOX KO mice. We also noted that the presence of active NOX2 in T. gondii-infected WT mice promoted greater tissue damage and higher levels of inflammation in liver, which were confirmed by elevated levels of lipid peroxidation (oxidative damage) and liver enzymes (liver damage) in these mice. These data were reinforced by histopathological analysis of the liver, which showed tissue damage in WT mice at all times of infection verified by the presence of inflammatory cell infiltrate and necrosis focus. In the intestine, the parasite's main gateway to other organs, we did not observe differences in lipid peroxidation levels between groups of infected mice due to absence of parasites during the period of infection evaluated. When associating tissue damage (present in higher intensity in WT mice) with the probable production of ROS in response to infection, we did not observe differences between groups of infected mice. We also did not observe differences in the levels of antioxidant enzymes (SOD and catalase) in the liver or the intestine of the infected groups that could explain the low levels of ROS found in these mice. Our results indicate that ROS are not involved in parasite elimination during T. gondii infection. Surprisingly, oxidative stress contributes to the development of several negative consequences for the infected host, since this oxidative stress is not able to eliminate the parasite as we show in our results.

Voltage-gated sodium (NaV) channels play crucial roles in a range of (patho)physiological processes. Much interest has arisen within the pharmaceutical industry to pursue these channels as analgesic targets following the overwhelming evidence that NaV channel subtypes NaV1.7- NaV1.9 are involved in nociception (Ahern et al., 2016; Luiz and Wood, 2016). More recently, also NaV1.1, NaV1.3 and NaV1.6 have been identified to be involved in pain pathways. Venom-derived disulphide-rich peptide toxins (1580 amino acids), isolated from spiders and cone snails, have been used extensively as probes to investigate these channels and have attracted much interest as drug leads for pharmaceutical development (Schroeder et al., 2012; Saez et al., 2010). However, few peptide drug leads have made it as drugs due to unfavourable physiochemical attributes including poor in vivo pharmacokinetics, rapid proteolytic cleavage and limited oral bioavailability. This project aims to bridge the gap in the development pipeline between drug leads and drugs candidates by downsizing these larger venom-derived NaV inhibitors into smaller, drug-like molecules. As a first step, we searched the venom of the spider Phoneutria nigriventer for promising NaV channel ligands. A first toxin sparking our interest was the toxin PnTx2-1. Based on the in vivo tests in mice and the sequence identity with PnTx2-5 and PnTx2-6, this peptide is classified as a NaV channel toxin. However, it has never been tested on any NaV channel isoform. Therefore, in this study the NaV channel subtype selectivity and species specificity of PnTx2-1 are investigated. We performed an in-depth functional characterization of the NaV channel modulating properties of PnTx2-1. Furthermore, analysis of the activity of PnTx2-1 on NaV1.5 reveals that this Phoneutria toxin modulates the cardiac NaV channel in a bifunctional manner, resulting in an alteration of the inactivation process and a reduction of the sodium peak current. The obtained results allowed to conclude that PnTx2-1 is an interesting insecticidal peptide but 5 it does not represent a promising lead compound for the development of novel NaV channel ligands with therapeutic potential. Another toxin potentially interesting as a NaV channel modulating ligand is the toxin PnTx1. PnTx1 was found to be the most interesting NaV channel toxin, considering its action in NaVs related to pain (Silva et al., 2012a). Following identification of common sequence motifs from NaV inhibitors PnTx1 (Diniz et al., 2006a) (78 residues, 14 cysteine) and -conotoxin KIIIA (Bulaj et al., 2005) (16 residue, 6 cysteine) from cone snail Conus kinoshitai, we have produced the smallest cyclic peptide-based NaV channel inhibitor known to date (10 residues, 2 cysteines) with demonstrated subtype selectivity across NaV channel subtypes including NaV1.7 and NaV1.9 (Luiz and Wood, 2016). The methodology used in this project, involved a two-pronged approach that incorporates sophisticated peptide engineering carrying out several rounds of small cyclic peptide design to aid in the determination of what drives subtype selectivity and molecular interactions of these downsized inhibitors across NaV subtypes. This allowed us to design small, stable and novel NaV probes with high subtype selectivity and potency coupled with improved biopharmaceutical properties, rendering these peptides suitable as analgesic drug candidates.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O presente trabalho se alinha aos estudos epistemológicos do ensino científico, cuja concepção de aprendizagem se projeta para além do produto, ou seja, da formação conceitual e considera também os processos e as práticas científicas. Tendo em vista uma educação em Imunologia para a formação profissional dentro dos cursos de Ciências Biológicas e da Saúde, nós argumentamos a favor da tomada de elementos da epistemologia da Imunologia como ferramenta de ensino e aprendizagem. Assim, nós planejamos uma sequência didática investigativa que promova oportunidades para os estudantes vivenciarem dois desses aspectos: experimentação e abstração. Nossa atividade traz a análise de dados experimentais obtidos de uma técnica típica da Imunologia, “o ensaio para a avaliação da fixação do complemento”, como pré-requisito para a resolução do problema de investigação. Nosso objetivo é verificar quais elementos da prática científica da Imunologia são apropriados pelos estudantes durante a realização da atividade. Mais especificamente, desejávamos compreender como os discursos são construídos epistemologicamente no ambiente de aprendizagem, o quanto isso se assemelha ao desejado pela cultura científica e o que precisamos acessar para melhorar a qualidade epistêmica desses discursos. Para isso, nós analisamos quais são as práticas epistêmicas mobilizadas pelos estudantes durante a formulação de argumentos escritos nos relatórios científicos produzidos durante a execução da investigação. A nossa ferramenta de análise de argumentos foi construída a partir da descrita em Kelly e Takao (em Epistemic levels in argument: An analysis of university oceanography students' use of evidence in writing. Science Education, 86(3), 314-342) e nos permitiu avaliar o status epistêmico das afirmações dos estudantes. Como resultado, nós observamos que os estudantes aderem às convenções de gênero da escrita científica, quando constroem sentenças que relacionam as observações experimentais particulares com as asserções teóricas de maior generalidade. Entretanto, nossas análises apontam para dificuldades dos estudantes em utilizar no texto escrito as evidências obtidas das inscrições não-verbais. Isso sugere que é necessário um maior número de atividades ativas que propiciem a compreensão da forma como os dados são amarrados no texto e da relevância do uso de dados para a retórica científica. Além disso, nós observamos que em alguns relatórios as conclusões não perpassam uma resposta ao problema de investigação, sugerindo que a recuperação dos elementos motivadores da investigação também é um movimento sofisticado que deve ser motivado dentro do treinamento na escrita científica. Nossos achados reforçam a importância de se trabalhar a abstração dentro de sequências didáticas que visem uma formação para a aquisição de competências científicas dentro da Imunologia This work aligns with epistemological studies of science education, whose conception of learning has shifted from learning as a product (conceptual understanding) to learning as scientific processes and practices. Based on the educational goals for professional training in Immunology within Biological Sciences and Health courses, we propose taking into account elements of the epistemology of Immunology as teaching and learning tools. Thus, we devised a didactic investigative sequence that provides experience for students in two of these aspects: experimentation and abstraction. Our activity engaged students in the analysis of experimental data obtained from a typical Immunology technique, "the complement fixation assay", as a prerequisite for the inquiry-problem solving. Our aim was to determine which elements of the scientific practice of Immunology are used by students during the activity. More specifically, we wanted to understand how discourses are constructed epistemologically in the learning environment, how much they resemble those desired by scientific culture and what we need to access in order to improve the epistemic quality of these discourses. To that end, we analyzed the epistemic practices used by students during the construction of written arguments in the scientific reports produced during the investigation. Our tool for argument analysis was developed from one described by Kelly and Takao (in Epistemic levels in argument: An analysis of university oceanography students' use of evidence in writing, Science Education, 86 (3), 314-342), which allowed us to evaluate the epistemic status of students’ statements. As a result, we observed that students adhered to the genre conventions of scientific writing when constructing sentences that relate to particular experimental observations to more general theoretical assertions. However, our analysis points to students' difficulties in using evidence obtained from non-verbal inscriptions while producing the written text. This suggests a need for a greater number of active-learning activities to provide instruction for how data are tied to the text and about the relevance of the data to scientific rhetoric. In addition, we noted that in some reports the conclusions do mention a response to the research problem, suggesting that reconsidering the steps that make up the experiment is also a sophisticated epistemology that should be encouraged in scientific writing training. Our findings reinforce the importance of improving abstraction-skills within active-learning activities in Immunology science education.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico O tecido linfoide associado à mucosa intestinal enfrenta o desafio de tolerar antígenos da dieta e da microbiota enquanto exclui ou elimina os patógenos gastrointestinais. Interações não reguladas entre os antígenos luminais e essas células imunes no intestino podem levar a doenças graves, como alergia alimentar, doença celíaca e doenças inflamatórias intestinais (IBD). Este estudo abordou como as respostas imunes nos diferentes microambientes do intestino bem como os seus sensores afetam a homeostase intestinal. Descrevemos aqui duas maneiras distintas pelas quais o sistema imune mantém a homeostase intestinal: através da compartimentalização das respostas imunes específicas em microambiente intestinais distintos, e por sensores imunológicos capazes de detectar componentes presentes no ambiente intestinal. Demonstramos que os linfonodos mesentéricos (mLNs) são imunologicamente únicos de acordo com o segmento intestinal funcional que eles drenam. As assinaturas gênicas de células estromais e dendríticas, bem como a polarização de células T contra o mesmo antígeno luminal diferiram entre mLNs ao longo do intestino, sendo os mLNs que drenam do intestino delgado proximal mais tolerogênicos e os mLNs distais ambientes mais pró-inflamatórios. Essa dicotomia compartimentalizada pode ser perturbada por infecção duodenal, remoção cirúrgica de mLNs distais selecionados ou liberação de antígeno ectópico, impactando as respostas imunes. Com relação à percepção dos ambientes intestinais, mostramos que o STING, sensor de dinucleotídeos cíclicos e adaptador de receptores de DNA intracelular, é ativado também por produtos liberados pela microbiota. A ausência de STING leva a defeitos em mecanismos de proteção da mucosa intestinal, como menor produção de muco e níveis de IgA secretória, frequências alteradas de IELs e ILCs além de impactar a composição da microbiota intestinal para um perfil mais pró-inflamatório. O STING é ainda importante para desenvolvimento e função de células Treg, sendo os camundongos STING-/- mais susceptíveis à colite e infeção bacteriana entérica. Dessa forma, distúrbios dos microambientes intestinais bem como a ausência de sensores desses ambientes, como o STING, influenciam as respostas imunes nesses locais e podem levar a condições inflamatórias e susceptibilidades a doenças. The gut-associated lymphoid tissue faces the challenge of tolerating foreign nutrients and the symbiotic microbiome while excluding or eliminating gastrointestinal pathogens. Unregulated interactions between luminal antigens and the immune cells at the intestinal mucosa can lead to severe diseases such as food allergy, Celiac disease and inflammatory bowel diseases. This study addressed how immune responses in different gut microenvironments as well as their sensors affect intestinal homeostasis. We observed that the maintenance of intestinal homeostasis can be achieved in at least two different ways: through the compartmentalization of the specific immune responses to each distinct intestinal microenvironment, and by the immunological sensors of the components present in the intestinal environment. Herein we report that mesenteric lymph nodes (mLNs) are immunologically unique according to the functional gut segment they drain. Stromal and dendritic cell gene signatures as well as adaptive T cell polarization against the same luminal antigen differed between mLNs along the intestine, the proximal small intestine–draining mLNs preferentially giving rise to tolerogenic and the distal mLNs to pro-inflammatory T cell responses. This compartmentalized dichotomy could be perturbed by duodenal infection, surgical removal of select distal mLNs or ectopic antigen delivery, impacting immune responses. Regarding the perception of the intestinal environment, we show that STING, a cyclic dinucleotide sensor and adaptor molecule for intracellular DNA receptors, is also activated by microbiota products. The absence of STING leads to defective protective mechanisms of intestinal mucosa, such as lower mucus production and secretory IgA levels, altered frequencies of IELs and ILCs, besides impacting the composition of the intestinal microbiota toward a more pro-inflammatory profile. STING is also important for the development and function of Treg cells, being STING-/- mice more susceptible to colitis and enteric bacterial infection. Therefore, disorders of the intestinal microenvironments as well as the absence of these environments’ sensors, in this case of STING, influence the immune responses in these places and can lead to inflammatory conditions and higher susceptibility to diseases.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Outra Agência Lunatina-1 é um peptídeo composto por 13 resíduos de aminoácidos que foi isolado a partir do veneno do escorpião peruano Hadruroides lunatus. Neste estudo, o peptídeo sintético apresentou atividade frente a diferentes linhagens celulares tumorais, como HL60, MDA-MB-231 e MCF-7. Para as células HL60, uma linhagem de leucemia humana pró-mielocítica, foi observado que Lunatina-1 induziu apoptose pela ativação das vias extrínseca e intrínseca, observado pela ativação das caspases 3, 8 e 9. Também foi observado um aumento significativo na produção de ROS e perda parcial do potencial de membrana mitocondrial. Alterações morfológicas como condensação e fragmentação nuclear, fragmentação de DNA, exposição de fosfatidilserina também foram constatadas. Além disso, foi verificada a internalização do peptídeo Lunatina-1 e a identificação de resíduos importantes para a atividade da Lunatina-1 por meio de Alanina-Scan. Lunatina-1 também foi avaliada em células de adecarcinoma mamário humano, MCF-7 e MDA-MB-231, assim como a toxicidade para células HepG2, HEK-293 e LUHMES. Ao contrário do observado para a linhagem HL60, Lunatina-1 induziu morte celular por alteração na permeabilidade da membrana plasmática na linhagem MDA-MB-231. Um novo peptídeo desenhado a partir da similaridade entre as sequências da Lunatina-1 e da caspase-3, denominado L1C3, também apresentou ativividade citotóxica frente a diversas linhagens. Estudos de internalização relacionados ao novo peptídeo também foram realizados. Em conclusão, foram identificados dois peptídeos, Lunatina-1 e L1C3, com potencial antitumoral contra leucemia e câncer de mama, servindo como protótipos para o desenvolvimento de novos fármacos Lunatin-1 is a 13mer peptide isolated from the peruvian scorpion Hadruroides lunatus venom. In this study, the synthetic peptide exhibited activity against different tumor cell lines, such as HL60, MDA-MB-231 e MCF-7. In HL60 cells, a promyelocytic leukemia cell line, was observed that Lunatin-1 induced apoptosis by extrinsic and intrinsic pathways, due to activation of caspases 3, 8 and 9. We also observed a significant increase in ROS production and mitochondrial membrane potential loss. Morphological changes such as nuclear condensation and fragmentation, DNA fragmentation, and phosphatidylserine exposure were also observed. In addition, Lunatin-1 peptide was internalized and important amino acids residues were identified by Alanine-Scan. Lunatin-1 also was evaluated in human mammary adenocarcinoma cells, MDA-MB-231 and MCF-7, and your cytotoxicity in the HepG2, HEK-293 and LUHMES cells. In contrast to the HL60 cells, Lunatin-1 induced cell death by permeability changes of plasma membrane in the MDA-MB-231 cells. A new peptide designed from the similarity between the sequences of Lunatin-1 and caspase-3, denominated L1C3, also showed antitumor /cytotoxic activity against several cell lines. Internalization studies related to the new peptide were also performed. In conclusion, two peptides were identified, Lunatin-1 and L1C3, with antitumor potential against leukemia and breast cancer, as prototypes for the development of new drugs.

A relação do consumo excessivo de sódio com desenvolvimento de doenças cardiovasculares já foi amplamente relatada. No entanto, alguns estudos recentes mostraram efeitos da dieta rica em sal (NaCl) na ativação de células Th17 e no aumento da severidade de doenças autoimunes. No presente estudo, mostramos que o consumo de dieta rica em sal (HSD) por camundongos C57BL/6 levou à inflamação no cólon associada à produção de IL-23, recrutamento de neutrófilos e aumento da frequência de células da resposta imune inata, innate lymphoyd cells do tipo 3 (ILC 3), produtoras de IL-17. Além disso, nosso estudo demonstrou que a inflamação no cólon não foi observada quando a dieta rica em sal foi administrada em camundongos que não possuíam o gene que codificava a citocina IL-17 (IL-17-/-) mas estava presente, ainda que em menor grau, em camundongos que não possuíam o gene que codificava as enzimas de recombinação gênica de linfócitos (RAG-/-). Estes dados sugerem que os efeitos inflamatórios da dieta rica em sal foram dependentes de IL-17 mas apenas parcialmente dependentes de linfócitos diferenciados em Th17. A expressão de SGK1, quinase envolvida na homeostase do sódio, não teve produção aumentada após o consumo de dieta rica em sal nos tempos testados. Além de observar alteração na mucosa do cólon de camundondos, investigamos também se a dieta rica em sal teria efeito em dois modelos de colite experimental: a colite induzida por sulfato de sódio dextrano (DSS) e na colite induzida por 2,4,6-ácido trinitrobenzenosulfonico (TNBS). Observamos que a doença foi exacerbada em ambos modelos pelo consumo da HSD e a piora estava associada ao aumento da frequência de células RORgt+CD4+ e de netrófilos na lâmina própria do cólon. Com isso, nossos resultados sugerem que o consumo de uma dieta rica em sal foi suficiente para levar à inflamação na mucosa do cólon de camundongos C57BL/6, além de exacerbar a colite em camundongos por meio de um mecanismo dependente da produção de IL-17 e apenas parcialmente dependente de células T. Excess intake of sodium is often associated with high risk for cardiovascular disease. More recently, some studies on the effects of high salt diets have also demonstrated that they are able to activate Th17 cells and increase severity of autoimmune diseases. In the present study, we showed that consumption of high salt diet (HSD) by mice triggered a gut inflammatory reaction associated with IL-23 production, recruitment of neutrophils and increased frequency of the IL-17producing type 3 innate lymphoid cells in the colon. Moreover, gut inflammation was not observed in IL-17-/- mice but it was present, although at lower grade, in RAG-/- mice suggesting that the inflammatory effects of high salt diet was dependent on IL17 but only partially on Th17 cells. Expression of SGK1, a kinase involved in sodium homeostasis, was not increased upon HSD ingestion at any of the time points tested. Colitis induced by oral administration of either dextran sodium sulfate (DSS) or 2,4,6trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) was exacerbated by HSD consumption and this effect was associated with increased frequencies of RORgt+ CD4+ T cells and neutrophils in the colon. Therefore, our results suggest that consumption of high-salt diet per se was able to trigger a mild inflammation in the colon and also to exacerbate colitis in mice by a mechanism dependent on IL-17 production but only partially dependent on Th17 cells.

A interrupção da tradução em eucariotos por mRNAs desprovidos de códons de terminação, ou contendo códons raros, ou ainda que sofreram clivagem acidental, é capaz de recrutar aos ribossomos sequestrados o complexo RQC, responsável pela ubiquitinação do polipeptídeo defeituoso recém-sintetizado, marcando-o para a degradação proteassomal. Em Saccharomyces cerevisiae, a ausência da proteína ubiquitina ligase E3 Ltn1p promove a formação de agregados proteicos a partir dos polipeptídeos defeituosos não-degradados pela atividade da proteína Tae2p. Através do uso de repórteres que promovem a interrupção traducional, identificamos que a agregação de polipeptídeos sintetizados por mRNAs contendo códons raros necessita da atividade de Hel2p, uma proteína associada ao ribossomo. Curiosamente, Hel2p também parece estar relacionada com a degradação desses polipeptídeos defeituosos recém-sintetizados a partir de mRNAs que sofrem clivagem acidental em sua região codificante. Além disso, verificamos que a proteína Rqc1p promove grande sensibilidade à higromicina B, antibiótico aminoglicosídico que promove frameshifting tradicional. Em conjunto, nossos dados abrem a possibilidade de execução de um estudo mais aprofundado sobre os mecanismos de geração de agregados proteicos em decorrência de defeitos da tradução, que podem estar relacionados à ocorrência de doenças neurodegenerativas Translational arrest in eukaryotes promoted by mRNAs lacking stop-codons, or harboring rare codons, or those which undergo accidental cleavage, is capable of recruiting the RQC (Ribosome Quality Control) complex towards ribosomes. The RQC complex is responsible for the ubiquitination of the newly-synthesized, defective polypeptides, marking them for proteasomal degradation. In S. cerevisiae, the absence of the ubiquitin ligase E3 Ltn1p promotes the formation of protein aggregates from non-degraded defective polypeptides due to the activity of Tae2p. Using reporters that promote translational arrest, we observed that the aggregation of polypeptides synthesized from mRNAs containing rare codons requires the activity of Hel2p, a ribosome-associated protein. Interestingly, Hel2p also appears to be related to the degradation of newly-synthesized defective polypeptides from mRNAs that undergo accidental cleavage inside their coding region. In addition, we verified that the Rqc1p protein promotes high sensitivity to hygromycin B, an aminoglycoside that promotes translational frameshifting. Altogether, our data open the possibility of carrying out a more detailed study on the mechanisms of generation of protein aggregates as a result of translation defects, which may be related to neurodegenerative diseases

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Acidentes com animais peçonhentos são um problema de saúde de pública no Brasil, sendo a aranha-marrom a segunda maior causadora de tais acidentes. O envenenamento acidental causado pela picada da aranha marrom gera efeitos dermonecróticos que podem ser seguidos de manifestações sistêmicas. Ainda que estas manifestações sistêmicas ocorram em uma parcela pequena dos casos, esta pode ser fatal. A produção de antivenenos para o tratamento de tais acidentes é dependente de uma variedade de experimentos animais, desde a extração do veneno das aranhas, à produção do antiveneno em cavalos, e até à avaliação in vivo do potencial neutralizante destes antivenenos, que é feita em coelhos. O presente trabalho apresenta tentativas de minimizar e otimizar experimentos com animais na produção de antivenenos com duas abordagens. A primeira se baseia na construção e produção de uma proteína quimérica, a Lil, contendo epitopos imunodominantes, previamente mapeados, da principal proteína do veneno de Loxosceles, a Esfingomielinase D. A proteína quimérica Lil contém epitopos encontrados nas Esfingomielinases D das três principais espécies brasileiras. Esta proteína se mostrou capaz de produzir anticorpos com o potencial de neutralizar parcialmente os efeitos tóxicos do veneno de Loxosceles intermedia, em um modelo animal. Por esta razão, de modo a reduzir o uso de aranhas e otimizar a vida útil dos cavalos produtores de antiveneno, a proteína Lil se mostrou um candidato promissor para uso em processos de imunização. A segunda abordagem foi a elaboração de um teste in vitro para a discriminação de soros com alto e baixo potencial neutralizante. A Smase I de Loxosceles laeta se mostrou capaz de discriminar a potência neutralizante dos soros de alta e baixa potência avaliados, em um teste de ELISA. Então, é sugerida a utilização deste teste como uma alternativa aos protocolos in vivo que utilizam coelhos. Accidents with venomous animmals represent a health issue in Brazil, and the brown spider’s accidents are pointed out as the second most frequent ones. The accidental envenomation by brown spiders (Loxosceles sp.) cause a strong local dermonecrotic effect which can be followed by systemic manifestations, and even though the systemic loxoscelism occurs in a small portion of the cases, it can be fatal. The production of antivenoms for the treatments of such accidents relies on a variety of animal experiments, from the spider venom extraction to the production of antivenom in horses and its in vivo neutralizing potency evaluation, which is performed in rabbits. In the present work, there is an attempt to reduce and optimize animal experiments with two different approaches. The first approach relies in the construction and production of a chimeric protein, named Lil, containing immunodominant epitopes that were previously mapped from the main protein of the Loxosceles venom, the Sphingomyelinase D. The Lil protein contains epitopes from Sphinomyelinases D of the three main species found in Brazil. The Lil protein was found capable of inducing antibodies with the potential to partialy neutralize the toxic effects of Loxosceles intermedia venom in an animal model. Therefore, in order to reduce spider usage and to provide a less harmfull life to the horses used for immunization we suggest the Lil protein as a potential candidate to replace the venom usage in the antivenom production protocols. The second approach was to elaborate an in vitro test for the distinction of high and low potency sera. The Loxosceles laeta Smase I was able to correctly diagnose the neutralizing potency of the evaluated sera, in an ELISA test. Thus, we suggest the use of such test as means to discriminate the neutralizing potency of the antiloxosceles sera as an alternative to the in vivo protocols relying on rabbits.

O Hipocampo é uma estrutura altamente relacionada à formação e resgate da memória. A neurofisiologia aponta grandes evidências para existência de uma segregação espaço temporal de microcircuitos nessa região e um dinamismo quanto à atividade regido por eventos de plasticidade sináptica. A partir da neurobiologia computacional, é possível combinar parâmetros eletrofisiológicos e anatômicos à estudos comportamentais e modelos matemáticos capazes de elucidar novos caminhos em busca do conhecimento do funcionamento do cérebro. Em nosso trabalho nos baseamos na hipótese de segregação de microcircuitos da região CA1 do Hipocampo para procurar diferenças na susceptibilidade de vias a se potencializarem frente à estimulação de alta frequência. Encontramos padrões de geração de LTP que sugerem uma susceptibilidade intrínseca de potencialização da via ativada, quando estimulamos em uma posição fixa e registramos em posição variada, que independe de valores basais de fEPSP e da distância da posição de registro. Ao aplicarmos três estímulos tetânicos sequencias em intervalos de 15 minutos não encontramos padrões plausíveis que se encaixem em um cenário homogêneo de populações neuronais. Futuras análises permitirão estudar esse fenômeno, que a princípio sugere uma possível segregação espaço-temporal de vias, quanto à susceptibilidade de potencialização evocada por TBS na região dorsal de CA1 do Hipocampo Hippocampus is highly correlated with memory formation and rescue. Neurophysiogy shows great evidences for the existence of a spatio-temporal segregation of microcircuits in this region a dynamism regarding its activity dictated by synaptic plasticity events. By computational neurobiology, it is possible to combine electrophysiological and anatomical partterns to behavioral studies and mathematical models that are able to elucidate new directions on the way for the knowledge of brains physiology. In our study we based on the hypothesis of microcircuits segregation on CA1 region of Hippocampus to look for differences in the susceptibility of microcircuits to potentiate in front of high frequency stimulation. We found patterns of LTP that suggest an intrinsic susceptibility of potentiation of the activated microcircuit, when we stimulate in a fixed position and register in a varied position, that is independent of basal values of fEPSP and the distance of the registration position. By three consecutive tetanic stimuli, with 15 minutes intervals, we did not find plausible patterns that fit into a homogeneous setting of neuronal populations. Future analyzes will allow the study of this phenomenon, which at first suggests a possible space-time segregation of microcircuits regarding its susceptibility of potentiation evoked by TBS in the dorsal CA1 region of Hippocampus

FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais O câncer de mama é a principal neoplasia entre as mulheres, totalizando os maiores índices de incidência e mortalidade em todo o mundo. Devido a sua grande importância na saúde pública mundial, a busca por novas formas de diagnóstico e de terapias mais eficientes contra esta patologia se tornou objeto de estudo de diversos grupos ao redor do mundo. Recentemente, a participação de canais iônicos no desenvolvimento de tumores tem sido investigada. Os canais de Na+ dependentes de voltagem são proteínas transmembrana importantes para a excitabilidade celular; alterações em seu funcionamento e expressão são normalmente associados a patologias cardíacas e neurológicas. Entretanto, diferentes estudos têm relatado o envolvimento desses canais com o aumento da agressividade tumoral em neoplasias da mama. O presente trabalho buscou avaliar a presença desses canais em células de tumores primários de mama, buscando indícios da possível participação dessas proteínas nas etapas iniciais do processo de tumorigênese. Os resultados demonstraram a presença de correntes de influxo produzidas por canais de Na+ dependentes de voltagem para ambas as linhagens de tumor primário. Além disso, identificou-se a presença de canais do tipo Nav1.5 e Nav1.7, que estavam expressos não apenas na membrana dessas células, mas também na membrana nuclear e em seu citoplasma. Ao final deste trabalho foi possível concluir que os canais de Na+ dependentes de voltagem estão presentes, ao contrário do que se pensava, em estágios mais iniciais do desenvolvimento tumoral, indicando a participação desses canais em processos importantes para o estabelecimento do tumor. Além disso, observamos que estes canais estão presentes em grande parte do ambiente subcelular, o que foi associado a possível participação destes canais em outros processos celulares que não estejam ligados à permeabilidade iônica.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O imunoproteassoma é uma isoforma de proteassoma constituído por três subunidades denominadas LMP2, LMP7 e MECL-1. Sua atividade proteolítica aumenta a quantidade e a qualidade dos peptídeos a serem apresentados pelas moléculas de MHC de classe I às células T CD8+. Por esta razão, esta isoforma especializada de proteassoma desempenha um importante papel no controle de infecções em hospedeiros. Neste trabalho, foi abordado o papel do imunoproteassoma durante a infecção por Brucella abortus, uma bactéria Gram-negativa, intracelular facultativa, patogênica para humanos e animais, cuja resposta imune protetora é dependente dos linfócitos T CD4+ e T CD8+. Vários trabalhos demonstraram a importância do imunoproteassoma no controle de infecções por diferentes patógenos por meio da utilização de camundongos knockout para uma ou duas subunidades do imunoproteassoma. Nós buscamos investigar, pela primeira vez, o impacto da ausência das três subunidades desta estrutura durante a infecção por uma bactéria intracelular. Para isto, a infecção por B. abortus foi induzida em camundongos triplo knockout para o imunoproteassoma, que se mostraram mais susceptíveis à infecção bacteriana, devido a uma diminuição na produção de IFN-γ por linfócitos TCD4+ e TCD8+. Além disso, a ausência do imunoproteassoma teve um impacto sobre a expressão de moléculas de MHC-I na superfície de células dendríticas e na geração e apresentação de antígenos por essas células. A função dos linfócitos T, que desempenha um papel fundamental na imunidade adaptativa contra B. abortus, também foi comprometida, tendo sido observada uma redução na produção de granzima-B e consequentemente na atividade citotóxica dos linfócitos T CD8+. Em conclusão, esses resultados sugerem fortemente que o imunoproteassoma é importante na resistência do hospedeiro à infecção por B. abortus, impactando tanto a magnitude quanto a qualidade das respostas das células T CD8+ The immunoproteasome is a specific proteasome isoform constituted of three subunits termed β1i, β2i and β5i. Its proteolytic activity enhances the quantity and quality of peptides to be presented by MHC class I molecules to CD8+ T cells. However, the role of combined deficiency of the three immunoproteasome subunits in protective immunity against bacterial pathogens have not been investigated. In this study, we addressed the role of immunoproteasome during Brucella abortus infection, an intracellular bacterium that requires CD8+ T cell responses for control of infection. Here, we demonstrate that immunoproteasome triple knockout mice (TKO) were more susceptible to the Brucella infection. This observed susceptibility was accompanied with reduced IFN-γ production by mouse CD4+ and CD8+ T lymphocytes. Moreover, the absence of the immunoproteasome had an impact on dendritic cells MHC-I surface expression and antigen presentation by these cells. CD8+ T cell function, which plays a pivotal role in B. abortus immunity, also presented partial impairment of granzyme-B expression and consequently reduced cytotoxic activity. In conclusion, these results strongly suggest that immunoproteasome subunits are important components in host resistance to B. abortus infection by impacting both the magnitude and quality of CD8+ T cell responses.

No Brasil, durante o ano de 2015 (últimos dados disponíveis), foram registrados 106.983 casos de acidentes com animais peçonhentos. Desse total, 19.495 envolveram aranhas (18,22%). O estado de Minas Gerais apresentou o maior número de acidentes com animais peçonhentos notificados com 19.474 casos registrados, sendo que 2.269 acidentes foram com aranhas (11,6%). Dentre os acidentes com Aranha, destaca-se o gênero Loxosceles (aranha-marrom), responsável por 58% dos acidentes com aranhas em que houve identificação da espécie. No mundo, já foram identificadas cerca de 100 espécies diferentes de Loxosceles, dentre elas, 10 são encontradas no Brasil. As espécies de maior importância médica são: L. intermedia, L. gaucho, L. similis e L. laeta. O veneno da aranha-marrom possui uma composição extremamente complexa, contendo diversas toxinas. Dentre as enzimas foram identificadas: hidrolases, hialuronidases, lipases, peptidases, colagenases, alcalino fosfatase, 5-ribonucleotidase, fosfohidrolases e proteases. Embora, provavelmente todas as enzimas presentes no veneno sejam capazes de contribuir de alguma forma para a progressão da lesão decorrente do acidente, somente as esfingomielinases D (SMase D), lipases presentes no veneno, foram capazes de produzir lesões dermonecróticas, hemólise e agregação plaquetária em animais de laboratório. Foi demonstrado em laboratório que as SMase D possuem diversos substratos e embora tenha sido demonstrado que em meio fisiológico a SMase D de L. laeta é capaz de liberar a colina da lisofosfatidilcolina (LPC), uma molécula de imunosinalização derivada de fosfatidilcolina (PC), assim gerando ácido lisofosfatídico (LPA), conhecido por induzir várias respostas biológicas e patológicas, o mecanismo das SMAses D causador dermonecrose ainda não foi totalmente elucidado. Recentemente foi identificado um motivo bem conservado na porção C-Terminal das SMases D (ATXXDNPW) de diferentes espécies e gêneros, logo após a última -hélice do TIM barril (/)8. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da mutação de aminoácidos conservados D277 e W280 na porção C-Terminal da esfingomielinase rLID1 do veneno de Loxosceles intermedia. As proteínas recombinantes rLID1, rLID1_D (D277A), rLID1_W (W280A) e rLID1_DW (D277A e W280A) foram submetidas a modelagem e dinâmica molecular a fim de avaliar os impactos das mutações in silico. Constatou-se que as mutações aumentam a flexibilidade da alça catalítica da proteína. Após a avaliação in silico, as proteínas foram expressas em BL21 (DE3) Arctic Express, porém, somente as proteínas rLID1, rLID1_D e rLID1_W ficaram solúveis. As proteínas solúveis foram purificadas utilizando cromatografia de afinidade e logo em seguida, cromatografia de gel filtração. Após a obtenção das proteínas puras, foi realizado o teste enzimático para avaliar a atividade das proteínas e foi observado que a proteína mutante rLID1_D possui atividade enzimática similar a proteína wildtype rLID1 enquanto a proteína rLID1_W possui atividade enzimática superior. Em seguida, foi realizado o teste biológico em coelho e foi constatado que as proteínas mutantes são capazes de causar dermonecrose, porém, a proteína rLID1_W, na quantidade testada, possui capacidade muito inferior a proteína wildtype. Nossos dados indicam que as mutações na região C-Terminal da rLID1 impactam na atividade enzimática e biológica da proteína. In Brazil, during the year 2015 (last available data), there were 106,983 cases of accidents with venomous animals. Of this total, 19,495 involved spiders (18.22%). The state of Minas Gerais had the highest number of accidents with venomous animals reported with 19,474 recorded cases, of which 2,269 were with spiders (11.6%). Among the accidents with Spider, the genus Loxosceles (brown spider) stands out, responsible for 58% of the spider accidents in which the species was identified. In the world, about 100 different species of Loxosceles have been identified, of which 10 are found in Brazil. The species of major medical importance are: L. intermedia, L. gaucho, L. similis and L. laeta. The venom of the brown spider has an extremely complex composition, containing several toxins. Among the enzymes were identified: hydrolases, hyaluronidases, lipases, peptidases, collagenases, alkaline phosphatase, 5-ribonucleotidase, phosphohydrolases and proteases. Although probably all the enzymes present in the venom are able to contribute in some way to the progression of the injury resulting from the accident, only sphingomyelinases D (SMase D), a lipase present in the venom, were able to produce dermonecrotic lesions, hemolysis and platelet aggregation In laboratory animals. It has been demonstrated in the laboratory that SMase D has several substrates and although it has been demonstrated that in physiological medium the SMase D of L. laeta is capable of releasing choline from lysophosphatidylcholine (LPC), an immunosin- guishing molecule derived from phosphatidylcholine (PC), thus generating lysophosphatidic acid (LPA), known to induce various biological and pathological responses, the mechanism of SMAse D causing dermonecrosis is still not fully elucidated. Recently, a well conserved motif was identified in the C-Terminal portion of SMasesD (ATXXDNPW) of different species and genera, shortly after the last -helix of the TIM barrel ( / )8. Thus, the objective of this work was to evaluate the effects of the conserved D277 and W280 amino acid mutation on the C-terminal portion of the rLID1 sphingomyelinase from the Loxosceles intermedia venom. The recombinant proteins rLID1, rLID1_D (D277A), rLID1_W (W280A) and rLID1_DW (D277A and W280A) were submitted to modeling and molecular dynamics in order to evaluate the impact of mutations in silico. The mutations were found to increase the flexibility of the protein's catalytic loop. After in silico evaluation, the proteins were expressed in BL21 (DE3) Arctic Express, however, only the rLID1, rLID1_D and rLID1_W proteins were soluble. Soluble proteins were purified using affinity chromatography and then, gel filtration chromatography. After obtaining the purified proteins, the enzymatic assay was performed to evaluate the activity of the proteins and it was observed that the mutant rLID1_D has enzymatic activity similar to the wildtype protein rLID1 while the rLID1_W protein has superior enzymatic activity. After that, it was performed a biological assay and mutant proteins were found to be capable of causing dermonecrosis, but the rLID1_W protein, in the concentration used, has much lower capacity than the wildtype protein. Our data indicates that the mutation on C-Terminal of rLID1 impacts both biological and enzymatic activity of the protein.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O câncer da mama continua sendo a segunda maior causa de morte em mulheres e a previsão é que a incidência desta doença aumente a cada ano. Apesar do grande número de pesquisas, estudos in vitro de linhagens celulares de câncer de mama derivadas de tumores não metastáticos têm sido raramente relatados ao passo que estes podem oferecer dados relevantes em relação a estágios de desenvolvimento do tumor e contribuir para um melhor entendimento da fisiopatologia da doença. O estudo dos componentes produzidos e secretados (secretoma) pelas células tumorais demonstraram a contribuição desses para o processo de tumorigênese em vários tipos de câncer, tais como câncer de mama e próstata. Entretanto, a atividade do secretoma das células MACL-1 sobre células não tumorais ainda não foi investigada e os componentes ainda não estão bem descritos. Para isso, fibroblastos CCD19-Lu foram expostos ao secretoma das células de adenocarcinoma de mama (MACL-1) verificando a morfologia, proliferação, expressão de proteínas e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Os ensaios de co-cultura em Transwell domonstraram que, quando expostas ao secretoma das células MACL-1, as células CCD19-Lu tiveram sua morfologia e proliferação alteradas, bem como aumento na expressão de Vimentina, da proteína de ativação de fibroblastos (FAP), do fator de transcrição nuclear NFκB, de proteases e de IL-6. Essas alterações sugeriram uma mudança no fenótipo dessas células e as análises proteômicas indentificaram uma atividade específica de proteínas decorrente do aumento na produção de ROS pelas células CCD19-Lu expostas a esse secretoma e permitiram estabelecer uma correlação direta com as alterações fenotípicas observadas nesses fibroblastos. Desta forma, sugerimos que as células MACL-1 oriundas de um tumor de mama primário secretam proteínas com atividades capazes de alterar o fenótipo de fibroblastos CCD19-Lu levando à modificações principalmente na expressão de proteínas que apontam para uma possível transformação dessas células em fibroblastos associados ao câncer (CAFs). Breast cancer remains the second cause of death in women and the incidence of this disease is growing every year. In spite the large studies in vitro of breast cancer cell lines derived from non-metastatic tumors have been rarely reported whereas they may offer relevant data regarding stages of tumor development and contribute to a better understanding of pathophysiology. The components studies produced and secreted (secretoma) by the tumor cells demonstrated their contribution to process of tumorigenesis in several types of cancer, such breast and prostate. However, MACL-1 cells secretome activity on nontumor cells has not been investigated and components are still poorly described. Then, CCD19-Lu fibroblasts were exposed of MACL-1 cells secretome and we evaluated changes in morphology, proliferation rate, protein expression and reactive oxygen species (ROS) production. Co-cultures in Transwells assays showed that, when exposed to MACL-1 cells secretome, CCD19-Lu cells had their morphology and proliferation rate altered and an increased in Vimentin, fibroblast activation protein (FAP), nuclear transcription factor NFκB, proteases and IL-6 expression. These results suggested a phenotype changes of cells and proteomic analyzes identified proteins specific activity to increase of ROS production by CCD19-Lu cells exposed MACL-1 cells secretome establish a direct correlation with the phenotypic alterations observed in fibroblasts. Thus, we suggest that MACL-1 cells from a primary breast tumor secrete proteins with biochemical activities capable of altering CCD19-Lu fibroblasts phenotype leading to modifications mainly in the proteins expression point to a possible transformation of these cells into cancer associated fibroblasts (CAFs).

A gota é uma doença causada pela deposição de cristais de urato monossódico (MSU) nas articulações. A IL-1 é a citocina chave da gota, que é produzida e liberada através da ativação do inflamassoma NLRP3 que ocorre após células residentes fagocitarem os cristais de MSU. Apesar de ser uma doença conhecida há vários séculos, os mecanismos envolvidos tanto no reconhecimento dos cristais de MSU pelos fagócitos, os quais são responsáveis pela ativação da cascata inflamatória, quanto no controle da resposta inflamatória induzida por esses cristais ainda não estão totalmente esclarecidos. No presente estudo foram identificadas duas moléculas regulatórias importantes nesse contexto: pentraxin 3 (PTX3) e microRNA-135b. Pentraxinassão consideradas como sendo o braço humoral do sistema imune inato enquanto microRNAs são pequenos RNAs responsáveis pela regulação pós-transcricional da expressão gênica. Os resultados apresentados neste estudo mostram que a produção de PTX3 está aumentada tantoem amostras de camundongos submetidos a um protocolo experimental de gota, quanto em amostras de pacientes com gota aguda. Além disso, foi possível demonstrar que PTX3 é importante para a fagocitose de cristais de MSU tanto em células humanas quanto em células de camundongos. Mecanisticamente, foi demonstrado que isto ocorre, em camundongos, por meio de receptores do tipo Fc, principalmente FcRIII. Esses dados sugerem que PTX3 é umimportante mediador para o desencadeamento da inflamação causada por cristais de MSU. Com relação ao microRNA-135b, sua expressão foi encontrada aumentada no contexto da gota experimental e foi demonstrado que a expressão deste microRNA é regulada por IL-1 emmacrófagos. Além disso, foi possível identificar o microRNA-135b como sendo um regulador negativo da via de sinalização de IL-1, tendo como alvos MyD88 e IL-1RAcP. Esses dados sugerem que o microRNA-135b é uma molécula importante no controle da inflamação articular na gota aguda. Dessa forma, a identificação dessas duas moléculas regulatórias da inflamação induzida por cristais de MSU ajuda a entender melhor a natureza da artrite gotosa assim como abrir novas perspectivas de diagnóstico e terapia. Gout is a disease caused by the deposition of monosodium urate crystals (MSU) into the joints. IL-1 is the key cytokine in gout, which is produced and released through NLRP3 inflammasome activation that occurs after MSU crystal phagocytosis by resident cells. Although this disease is known many centuries ago, the mechanisms involved in bothrecognition of MSU crystals by phagocytes, which are responsible for activating the inflammatory process, and also in the control of the inflammatory response induced by these crystals are still not completely elucidated. In this study, it was identified two important regulatory molecules in the context of gout: pentraxin 3 (PTX3) and microRNA-135b.Pentraxins are considered the humoral arm of innate immunity and microRNAs are small RNAs responsible for post-transcriptional regulation in the gene expression. The results of this study showed that PTX3 production is increased in both samples from mice submitted to anexperimental model of gout and also in samples from patients with acute gout. Moreover, it was demonstrated that PTX3 is important for the phagocytosis of MSU crystals in both murine and human cells. Mechanistically, this occurs in mice through Fc receptors, mainly FcRIII. These data suggests that PTX3 is an important mediator for triggering the inflammation caused by MSU crystals. Regarding to microRNA-135b, its expression was significantly increased in the context of experimental gout and it was showed that the expression of this microRNA is regulated by IL-1 in macrophages. In addition, it was possible to identify the microRNA-135b as a negative regulator of IL-1 signalling pathway, targeting MyD88 e IL-1RAcP. These data suggest that microRNA-135b is an important molecule in the control of articular inflammation in acute gout. In this way, the identification of these two regulatory molecules of the inflammation induced by MSU crystals help to understand better the nature of gouty arthritis and also open new perspectives of diagnostic and therapy

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As doenças inflamatórias intestinais (IBD) são definidas como um grupo de desordens do trato gastrointestinal (TGI) caracterizadas por inflamação e injúria epitelial. A colite ulcerativa e a doença de Crohn são as duas formas mais frequentes de IBD, diferenciadas pela localização da lesão ao longo do TGI. Muitos modelos experimentais murinos de IBD têm sido desenvolvidos para se estudar a patogênese e a regulação da inflamação intestinal, dentre eles a colite induzida por Sulfato de sódio dextrana (DSS). O DSS é um polissacarídeo sulfatado carregado negativamente que, quando administrado por via oral, causa lesões no cólon com algumas características semelhantes à colite ulcerativa humana. Este tem sido um modelo muito utilizado para se estudar agentes com propriedades terapêuticas para essa doença. Neste contexto, microorganismos probióticos têm aparecido como uma alternativa para pacientes com IBD e sua eficiência tem sido avaliada em modelos animais e também em estudos clínicos. As Lactococcus lactis são bactérias produtoras de ácido lático que estão sendo estudadas na colite devido aos seus efeitos antiinflamatórios. Portanto, o objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos imunomoduladores das cepas Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363, Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO2118 e Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 na colite experimental induzida por DSS. A colite aguda foi induzida em camundongos C57/BL6 pela oferta de solução contendo 2% de DSS como fonte líquida exclusiva durante 7 dias. Nos grupos experimentais, uma gavagem diária de L. lactis foi administrada por via oral em cada animal durante 7 dias concomitantemente com a ingestão de DSS. Em grupos que receberam L. lactis, observamos prevenção da perda de peso, melhora do escore clínico macroscópico e do escore histológico, aumento na produção de muco, aumento na frequência de células dendríticas tolerogênicas e modulação na produção de citocinas. Não observamos diferenças entre os efeitos das três cepas de L. lactis. Portanto, sugerimos que o papel anti-inflamatório das L. lactis nesse modelo experimental não é cepa-específico. As três cepas estudadas apresentaram efeitos protetores na mucosa intestinal.

Toxicidade pulmonar induzida por bleomicina é um efeito adverso comumente encontrado em pacientes submetidos ao tratamento quimioterápico de algumas neoplasias, gerando um quadro de dispneia, hypoxemia e diminuição da capacidade funcional dos pulmões que pode levar o paciente ao óbito. Bleomicina é um agente antineoplásico usado para tratar diversos tipo de cânceres, como linfomas, câncer de pescoço, câncer de cabeça, de ovário e de testículo, para o qual possui 90% de cura. Entretanto, seu uso terapêutico se torna limitado pelo fato desse fármaco desencadear quebra nas fitas de DNA e consequente toxicidade celular nos pulmões dos pacientes submetidos ao tratamento quimioteráptico, o que ocasionará no desenvolvimento de fibrose pulmonar. Diante disso, faz-se necessário o estudo de estratégias que minimizem o efeito colateral do tratamento com esse fármaco. Em nosso trabalho, estudamos o efeito do pré-tratamento com angiotensina 1-7 em um modelo de fibrose pulmonar induzida por bleomicina. Angiotensina 1-7 é um heptapeptídeo ndo sistema Renina-Angiotensina com atividade anti-fibrótica e anti-inflamatória que vem sendo estudada em modelos de fibrose pulmonar. Em vista disso, nosso objetivo foi investigar os parâmetros inflamatórios e fibróticos na fibrose pulmonar induzida por bleomicina, sob o tratamento com angiotensina 1-7, via oral. A principio, realizamos a padronização de uma dose de bleomicina a ser utilizada em nosso modelo, em camundongos machos C57Bl/6j. Feito isso, iniciamos o estudo do tratamento com angiotensina 1-7, também em camundongos machos C57Bl/6j, uma hora antes da indução da fibrose pulmonar, a qual foi induzida pela instilação com bleomicina. Os animais foram sacrificados 2, 7 e 14 dias após a instilação e o lavado broncoalveolar e retirada do tecido pulmonar foram realizados. Podemos observar que o tratamento prévio diminuiu a perda de peso e aumentou a sobrevida dos animais tratados. O tratamento também interferiu significativamente no recrutamento celular diminuindo os níveis de mononucleares e neutrófilos nas vias aéreas dos camundongos tratados assim como os níveis de neutrófilos no tecido pulmonar. Em conjunto, nossos resultados indicam que o tratamento prévio com angiotensina 1-7, em um modelo de fibrose pulmonar induzida por bleomicina melhora o processo inflamatório nas vias aéreas e no tecido pulmonar de camundongos tratados, aumentando assim, a sobrevida desses animais. Bleomycin - induced lung toxicity is a collateral effect commonly developed by patients submitted to chemotherapy treatments, causing dyspnea, hypoxia and decreased lung capacity, leading patients to death. Bleomycin is an antineoplastic agent used to treat a huge range of lymphomas, head and neck cancer, ovarium and testicular cancer, which has 90% of cure. However, bleomycin therapeutic efficacy is limited because it can mediate both single-stranded and double-stranded DNA damage, and consequently lung fibrosis. That is why the study of strategies that minimize the effect of treatment with this drug is necessary. We have studied the effect of the previous treatment with angiotensin 1-7 on bleomycin-induced lung fibrosis model. Angiotensin 1-7 is a heptapeptide of renin-angiotensin system, with anti-fibrotic and anti-inflammatory activity, and it has been studied in some models of lung fibrosis. Due to this, we aim to study the inflammatory and fibrotic parameters on Bleomycin-induced lung fibrosis of mice under the treatment with angiotensin 1-7, via gavage. First, we standardized a dose of bleomycin to be used in our model. After this, male mice C57Bl/6j were treated with angiotensin 1-7, one hour before the induction of lung fibrosis. The animals were euthanized 2, 7 and 14 days after bleomycin instillation. We observed that the pre-treatment with angiotensin -17 decreased the animals weight lost and increased the animal’s life time. The treatment also decreased, significantly, the levels of mononuclear cells and neutrophils in the mice airways, as well as the levels of neutrophil in lung tissue. Therefore, our results indicate that the pre-treatment with angiotensin 1-7, in this Bleomycin-induced lung fibrosis model, improves inflammatory process in the airways and lung tissue of mice treated, increasing their life time.

Crotoxina (CTx) é uma proteína dimerica responsável pela atividade neurotóxica do veneno da serpente Crotalus durissus terrificus. Neste trabalho nós utilizamos três técnicas diferentes para o mapeamento de epítopos lineares para células B na crotoxina. Os três métodos foram: Predição por bioinformática, método de Spot-Sintese e mapeamento por implantes subcutâneos de peptídeos em camundongos. Soros de cavalos imunizados com veneno total de C. d. terrificus foram utilizados no método de Spot-Synthesis. Imunoensaios no método de Spot-Synthesis revelam que a região C-terminal de cada uma das subunidades que conforman a CTx é uma região imunogenicamente dominante. Estes resultados foram coincidentes com os resultados obtidos pelo método bioinformatico. O mapeamento por implantes subcuâneos indentificaram outras regiões imunodominantes da crotoxina. Os peptídeos correspondientes as regiões imunogênicas previamente identificas foram sintetizadas quimicamente e a pureza desses peptídeos foram avaliados por espectrometria de massas. Os peptídeos sintéticos foram antigenicamente caracterizados por imunoblot utilizando soro de cavalo anticrotalico e para a caracterização imunogênica dos peptídeos, eles foram polimerizados com glutaraldehído e usados como imunógenos na imunização de camundongos. Anticorpos de camundongos anti-peptídeos reconheceram a CTx o veneno total de C. d. terrificus e os peptideos sintéticos. Todos os epitopos foram lozalizados na estrutura 3D da CTx e eles se encontram localizados na superficie da proteína. Crotoxin (CTx) is a dimeric protein that is responsible for the neurotoxic activity of Crotalus durissus terrificus venom. In this work we have used 3 different techniques for mapping of linear epitopes of the Crotoxin B cells. The three methods were: Prediction by bioinformatics, Spot-Synthesis method and mapping by subcutaneous implants of peptides in mice. Sera of horses immunized with the total venom of C. d. terrificus were used in the Spot-Synthesis method. Immunoassays in the Spot-Synthesis method have shown that the C-terminal region of each of the CTx subunits is a dominant immunogenic region. These results were similar to the ones obtained by the bioinformatic method. Mapping by subcutaneous implants has identified other immunodominant regions of the crotoxin. The previously identified amino acid sequences corresponding to the immunogenic regions were chemically synthesized and the purity of these peptides were evaluated by mass spectrometry. The synthetic peptides were antigenically characterized by immunoblot using anticrotalic horse serum, for the immunogenic characterization of peptides, they were polymerized with glutaraldehyde and used as immunogens in the immunization of mice. Anti-peptide anti-mouse antibodies recognized CTx, the total venom of C. d. Terrificus and the synthetic peptides.All epitopes were found in the CTx 3D structure and they are located on the surface of the protein

Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, é exposto a várias situações de estresse oxidativo durante o seu complexo ciclo de vida. Para lidar com este tipo de estresse, uma das estratégias utilizadas pelo parasito para detoxificar hidroperóxidos é um peculiar sistema de defesa antioxidante dependente de tripanotiona. Entretanto, o repertório antioxidante do T. cruzi não inclui a enzima catalase, a qual decompõe peróxido de hidrogênio (H2O2) e é encontrada na maioria dos organismos aeróbicos. Para investigar a razão pela qual o T. cruzi não possui a enzima catalase, geramos uma linhagem do parasito capaz de expressar o gene desta enzima. Parasitos que expressam catalase apresentam uma resistência aumentada ao tratamento com H2O2 em relação aos selvagens (WT). O pré-tratamento de parasitos WT com uma baixa concentração de H2O2 antes do tratamento com a mesma substância faz com que os mesmos sejam tão resistentes ao H2O2 quanto àqueles que expressam catalase. Porém, esta adaptação ao pré-tratamento não foi observada com a mesma intensidade nos parasitos mutantes. A expressão de catalase em T. cruzi aumentou o nível da enzima ferro-superóxido dismutase B e diminuiu o nível de tripanotiona redutase, resultando em níveis aumentados de H2O2 após a exposição a esta substância. Embora a expressão heteróloga de catalase contribua para o aumento da proliferação do parasito no inseto vetor, a mesma não induziu um grande aumento na virulência em camundongos. Nossos resultados, associados às informações de que a catalase está presente em tripanossomatídeos monoxênicos e que o H2O2 é capaz de atuar como segundo mensageiro, indicam que a ausência de catalase em T. cruzi seja importante para que o parasito possa sinalizar melhor o estresse oxidativo Trypanosoma cruzi, the causal agent of Chagas disease, is exposed to oxidative stress situations during its complex life cycle. To deal with these stresses, one of the strategies employed by this parasite for hydroperoxides detoxification is a peculiar trypanothione-dependent antioxidant system. However, T. cruzi's antioxidant repertoire does not include catalase, an enzyme that decomposes H2O2 and is found in most aerobic organisms. In order to investigate the reason why T. cruzi does not have the catalase gene, a T. cruzi cell line which expresses this enzyme was generated. Parasites expressing catalase have an increased resistance to H2O2 in relation to wild type cells (WT). Moreover, pretreatment of parasites with a low concentration of H2O2 before treatment with higher concentrations makes the WT cells as resistant to H2O2 as cells expressing catalase. However, improvement in resistance to H2O2 after pretreatment was not observed with the same intensity in cells expressing catalase. Catalase expression in T. cruzi decreased the trypanothione reductase and increased superoxide dismutase levels, which resulted in higher levels of H2O2 after H2O2 treatment. More important, although the heterologous expression of catalase contributed to higher proliferation rates in the insect vector, expression of catalase does not induce a large increase in virulence of mice. These results, associated with the facts that catalase is present in monoxenous trypanosomatids and that H2O2 can act as second messenger, indicate that the absence of the catalase gene in T. cruzi was important in order to allow cells with a better capacity in sensing oxidative stress

A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune sistêmica em que a inflamação das articulações determina a sua destruição e perda da mobilidade. Não há prevenção ou cura para a artrite reumatoide, e o tratamento baseia-se em anti-inflamatórios e analgésicos, restrito ao controle dos sintomas. A perda de tolerância na doença autoimune pode ser restaurada por ingestão do antígeno. Este processo induz tolerância oral, e os seus efeitos terapêuticos são bem estabelecida em modelos experimentais e clínicos. No entanto, a ingestão contínua de antígeno purificado nem sempre é viável. A Hsp65 é uma chaperonina essencial ne dobramento de proteínas e adaptação ao estresse celular. Ela também é uma potente reguladora da resposta imune e do processo inflamatório. Para a entrega direta de Hsp65 na mucosa, nós usamos uma linhagem recombinante de Lactococcus lactis que secreta Hsp65 de Mycobacterium leprae. Demonstramos que a terapia oral com Hsp65 inibiu a Artrite Induzida por Colágeno e um modelo agudo de artrite em camundongos. Este efeito preventivo incluiu a inibição do edema da pata, a inflamação das articulações. Ele esteve também associado à redução dos níveis de citocinas inflamatórias e de anticorpos patogénicos, assim como ao aumento de linfócitos B e T reguladores Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic autoimmune disease in which inflammation of the joints determines its destruction and loss of mobility. There is no prevention or cure for RA, and the treatment is based on conventional anti-inflammatory, analgesic drugs restricted to symptoms control. The loss of tolerance resulting in pathogenic autoimmunity can be restored by ingestion of the target antigen. This procedure induces oral tolerance, and their therapeutic effects are well established in experimental models and clinical trials. However, the continuous intake of purified antigen is not always feasible as an alternative therapy. Hsp65 is a chaperonin essential to protein folding and response to cellular stress. The Hsp65 is also a known regulator of the immune response and inflammatory process. For direct delivery of Hsp65 to the mucosa, a recombinant Lactococcus lactis was constructed in a way to produce and secret Mycobacterium leprae Hsp65. The present study has shown that the therapy with Lactococcus lactis prevented a Collagen Induced Arthritis and a model of acute arthritis in mice. This preventive effect included inhibition of paw edema and joint inflammation associated with reduced levels of inflammatory cytokines and pathogenic autoantibodies and augmented numbers of regulatory B and T lymphocytes

TLRs e PI3Ks sao proteinas muito importantes para o desenvolvimentode uma resposta inflamatoria robusta e eficiente. Enquanto TLRs sao responsaveis por reconhecer PAMPs/DAMPs e iniciar a resposta, as PI3Ks sao responsaveis por uma diversa variedade de funcoes que compreendem a migracao, ativacao e sobrevivencia celular, sintese de proteinas e outros. Como ambas as proteinas tem acoes complementares para a ativacao celular e desenvolvimentoda resposta imune, um desequilibrio nas suas vias de sinalizacao poderia levar a respostas inflamatorias excessivas. O objetivo deste trabalho foi estudar o papel de PI3K na regulacao da resposta TLR9 TLRs and PI3Ks are very important proteins for the developmentof a robust and efficient inflammatory response. While TLRs are responsible for the PAMPs/DAMPs recognition and initiate the response, PI3Ks are responsible for a myriad function that comprise cell migration, cell activation, protein synthesis, cell survival and others. As both proteins have complimentary actions toward cell activation and response, an imbalance on their signalling could lead to excessive inflammatory responses so, the aim of this work was to study the role of PI3K in the regulation of TLR9 response

Os nutrientes são capazes de modular o sistema imune em diversos aspectos, incluindo o seu desenvolvimento e homeostase. Após o desmame, as proteínas da dieta são essenciais para a maturação do tecido linfoide associado ao intestino (GALT) e modulação de atividade imunológicas sistêmicas tais como a resposta imune à infecção, a indução da tolerância nasal, a tolerância oral e respostas alérgicas. Porém, em situações de maturidade imunológica, em animais adultos, o papel das proteínas da dieta na operação do sistema imune não está claro. Entender os efeitos imunológicos das dietas contendo proteínas intactas ou aminoácidos (AA) livres é de grande importância na prática clínica, sobretudo em situações de inflamação intestinal nas quais dietas elementares contendo AA livres são utilizadas. A terapia nutricional é um ponto importante no tratamento das doenças inflamatórias intestinais, porém não há consenso sobre a formulação dietética mais adequada. Dessa forma, o objetivo do trabalho é estudar os efeitos imunobiológicos de dietas contendo aminoácidos livres ou proteínas intactas em animais adultos em situações fisiológicas e também durante a inflamação intestinal. Em todos os protocolos experimentais foram utilizados camundongos C57BL/6, machos com idade inicial de oito semanas. Esses animais foram alimentados com ração comercial desde o desmame até o início do protocolo experimental. As dietas experimentais seguiram o padrão AIN93G, sendo as modificações realizadas somente na composição da fonte nitrogenada (dieta contendo aminoácidos ou contendo caseína). Para a avaliação em situação fisiológica, os animais receberam a dieta contendo AA livres (dieta AA) ou caseína (dieta CAS) durante cinco semanas. O consumo de dieta AA não alterou o peso corporal e os exames bioquímicos indicativos do estado nutricional, porém provocou diversas alterações imunobiológicas, entre elas a redução sérica dos níveis imunoglobulinas e o aumento de diversas citocinas do intestino delgado e cólon como IL-17A, IL-10 e TGF-. No baço desses animais, ao contrário, ocorreu redução dos níveis de praticamente todas as citocinas avaliadas. Essas alterações foram observadas principalmente após uma semana de consumo da dieta. O grupo que consumiu dieta AA também apresentou aumento do número de células totais, células ativadas, linfócitos Th17 e T reguladores na lâmina própria do intestino delgado, mas não do cólon. Nesse caso, as diferenças entre os grupos foram observadas tardiamente, principalmente após cinco semanas. A morfologia intestinal apresentou-se alterada no grupo dieta AA, com aumento do tamanho do vilo e maior profundidade da cripta no intestino delgado e aumento do infiltrado celular, redução de células caliciformes e edema da camada submucosa no cólon. O papel da dieta AA também foi avaliado em situações de inflamação intestinal. Nesse caso, as dietas AA e CAS foram ofertadas em dois momentos diferentes do desenvolvimento da colite induzida por sulfato de sódio dextrano (DSS), sendo o primeiro juntamente com o consumo de DSS e o segundo previamente à indução da colite. A dieta AA provocou exacerbação da inflamação intestinal quando consumida previamente ou durante a indução da colite, o que foi evidenciado pelos escores clínico e histológico aumentados e pela redução do comprimento do cólon. Em conclusão, o consumo de dietas contendo AA livres em substituição às proteínas intactas não altera o estado nutricional, porém provoca diversas alterações imunológicas intestinais e sistêmicas em camundongos adultos. Essas alterações são proporcionais ao tempo de consumo das dietas. A presença de aminoácidos livres na dieta provoca também exacerbação da inflamação intestinal. Dessa forma, dietas contendo aminoácidos livres devem ser utilizadas com cautela na prática. Nutrients are capable of modulating the immune system in several ways, including the development and maintenance of immune homeostasis. After weaning, dietary proteins are essential for the maturation of the gut-associated lymphoid tissue (GALT) and modulation of systemic immune activity, such as response to infection, nasal and oral tolerance induction and allergic responses. In situations of immunological maturity, in adult animals, the role of dietary protein in the immune system is not known. To understand the immune effects of diets containing free amino acids (AA) is very important in clinical routine, especially in situations of intestinal inflammation in which elemental diets containing AA are used. Nutritional therapy is a commonly used complementary tool in the treatment of inflammatory bowel disease, but there is no consensus about the most appropriate dietary formulation. Thus, the objective of this study was to analize the immunobiological effects of diets containing either free amino acids (AA diet) or intact proteins (casein) in adult animals in physiological conditions as well as during intestinal inflammation. In all experimental protocols, 8 week-old mice C57BL/6 were chosen. AIN93 diet containing either 15% casein (CAS diet) or equivalente amounts of AA (AA diet) were used. For evaluation analysis in physiological conditions, animals received either CAS or AA diet for five weeks. AA diet consumption did not change weight or biochemical tests indicative of nutritional status, however it lead to several immunobiological changes in mice, such as reduction of serum immunoglobulins and increase of several cytokines in the small intestine and colon, including IL-17, IL-10 and TGF- . Conversely, there was a reduction of virtually all cytokines evaluated in spleen of AA-fed mice. These alterations were observed mainly after one week of diet consumption. Animals form the amino acid group also showed an increase of total cells, activated cells, Th17 and regulatory T lymphocytes in the lamina propria of the small intestine, but not in the colon. In this case, differences among the groups were seen later, particularly after five weeks. Intestinal morphology was altered in the AA group, including increase of villus size and crypth depth in the small intestine and increase of cellular infiltration, reduction of globlet cells and edema of the submucosal layer in the colon. The impact of AA diet consumption also was evaluated in inflammatory situations. In this case, AA and CAS diets were offered either during the development of colitis induced by dextran sulfate sodium (DSS) or prior to colitis induction. AA diet caused exacerbation of intestinal inflammation when consumed previously and during colitis induction. This was evidenced by the increased clinical and histological scores and shortening of the colon in AA-fed mice. In conclusion, consumption of diets containing free AA to replace the intact proteins does not change the nutritional status, but causes several intestinal and systemic immunological changes in adult animals. Severity of these changes are proportional to the time of diet consumption. Presence of free amino acids in the diet causes exacerbation of intestinal inflammation. Thus, the use of diets containing free amino acids should be used with caution in clinical practice, specially during intestinal inflammation.

O envelhecimento é um fenômeno complexo caracterizado por alterações nos sistemas fisiológicos do corpo e que está associada a mudanças no fenótipo e repertório de ativação de leucócitos, assim como no perfil das citocinas produzidas por essas células. A alteração cumulativa na rede de citocinas é responsável por um estado próinflamatório crônico conhecido como ''inflammaging''. Esse estado de inflamação crônica tem sido descrito como uma combinação de disfunções imunológicas, que se não reguladas, resulta em fragilidade e morbidade na população idosa. Vários mecanismos, como a inflamação e a composição alterada da microbiota, são comuns ao envelhecimento biológico e ao desenvolvimento de algumas condições patológicas associadas ao envelhecimento como a hipertensão arterial sistêmica. Eles parecem ter papel chave no desenvolvimento dos riscos cardiovasculares e de hipertensão em idosos. O impacto das alterações relacionadas à idade no perfil global de citocinas de indivíduos brasileiros saudáveis em várias faixas etárias (0-85 anos) (população 1) foram caracterizados utilizando culturas de células do sangue total e análise das células por citometria de fluxo. A contribuição das células da imunidade (neutrófilos e células NK) para a perfil global de citocinas foi particularmente importante em recém-nascidos e idosos. Os adultos apresentaram um perfil equilibrado de citocinas com contribuições equivalentes dos compartimentos da imunidade inata e da adaptativa e de ambas as categorias de citocinas (inflamatórias e reguladoras). Dentre os indivíduos selecionados como saudáveis, categorizamos aqueles que apresentavam hipertensão arterial relatada e avaliamos o perfil de citocinas produzidas por leucócitos do sangue além da composição da microbiota intestinal desses indivíduos. Foram coletadas amostras de 80 indivíduos brasileiros com idade entre 26 a 87 anos (população 2). Quando analisadas as concentrações das citocinas IFN-, TNF, IL-17A, IL-6, IL-10, IL-4 e IL-2 em sobrenadantes de cultura de PBMC, o grupo hipertenso mostrou uma maior proporção de TNF/IFN- e um perfil mais inflamado em comparação ao grupo de controle. Essas alterações foram acompanhadas, no grupo Hipertenso, por uma redução da diversidade da microbiota (analisada por sequenciamento Illumina de alto rendimento do rRNA 16S). A disbiose observada nesse grupo foi caracteriza por elevação da razão Firmicutes/Bacteroidetes (F/B), contração da população de Bacteroidetes e dos conhecidos produtores de butirato da família Lachnospiraceae, Roseburia, Coprococcus. Nossos resultados apoiam a hipótese de que o envelhecimento não está necessariamente associado a um declínio progressivo na produção de citocinas por todos os subtipos de leucócitos, mas caracterizado por distintas flutuações de citocinas produzidas em várias fases da vida. Além disso, mostramos que indivíduos classificados como saudáveis afetados por hipertensão sub-clínica e tratada apresentaram alterações inflamatórias e disbiose. Esses resultados apontam tais indivíduos como o grupo limítrofe entre a saúde e fragilidade durante a senescência Aging is a complex phenomenon characterized by changes in the physiological systems of the body and it is associated with several alterations in the phenotype, repertoire and activation status of leukocytes as well as in the cytokine profile produced by these cells. The alteration of the cytokine network seems to be responsible for a chronic proinflammatory status, known as inflammaging. This chronic inflammation has been described as a combination of dysfunctional immunity associated with frailty and morbidity in the elderly. Several key mechanisms such as inflammation and altered microbiota composition are common during biologic aging and also in individuals with hypertension. The impact of age-related changes on cytokine global profiles of healthy Brazilian individuals at several age intervals (085 years) (population 1) were characterized using short-term cultures of whole blood cells samples and single-cell flow cytometry. In newborns and elderly the contribution of innate immune cells (neutrophils and NK cells) were prominent in the cytokine profile. Adult individuals presented a balanced profile with equal contribution of both compartments (innate and adaptive cells) and both categories of cytokines (inflammatory and regulatory). Considering the high prevalence of Hypertension in Brazilians adults, we characterize the cytokine profile and the composition of microbiota in Brazilian subjects categorized by presence of Arterial Hypertension. Samples were collected from 80 Brazilian subjects with age between 26 to 87 years (population 2). Production of IFN-, TNF, IL-17A, IL-6, IL-10, IL-4 and IL-2 in PBMC supernatant was measured using CBA and flow cytometry.Fecal microbiota composition was analyzed using high-throughput Illumina sequencing of 16S rRNA gene. Hypertension-bearing group was characterized by a reduction in microbiota diversity, with higher Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) ratio, contraction of bacteroidetes population and of the well-known butyrate producers Lachnospiraceae family, Roseburia, Coprococcus. Moreover, the hypertension group showed a higher TNF/IFN ratio and a more inflamed profile compared to the control group. These variations were independent of age. Taken together, our results support the hypothesis that aging is not associated with a progressive decline in cytokine production by all leukocyte subsets but with distinct fluctuations of cytokines produced at various time points during life. Moreover, our findings showed that individuals classified as healthy although bearing sub-clinical hypertension presented inflammatory alterations and disbiosis, which points them as the borderline group between health and frailty during senescence

As ultimas decadas foram marcadas pela emergencia e reemergencia de virus pertencentes ao genero Flavivirus no Brasil e no mundo. Este genero inclui virus capazes de causar encefalite, uma manifestacao grave que pode levar ao obito ou a sequelas neurologicas, dentre os quais ha o virus da encefalite de Saint (St.) Louis (SLEV). A patogenese da encefalite de St. Louis e pouco compreendida, o que prejudica o desenvolvimento de tratamentos especificos e vacinas, uma limitacao em comum com outros flavivirus como o virus Zika e o virus da dengue. Para tal, desenvolvemos um modelo animal de infeccao pelo SLEV em camundongos a fim de investigar mecanismos envolvidos na resistencia a infeccao e doenca. O modelo animal e baseado nainoculacao da linhagem BeH 355964, um SLEV isolado de uma paciente no Brasil, que quando inoculado pela via intracranial (i.c) causa a morte de camundongos. Esse fenomeno e acompanhado de replicacao viral, inflamacao e dano tecidual no cerebro, caracterizando encefalite. A associacao da replicacao viral com mortalidade pos-infeccao nos levou ao estudo dos interferons (IFNs), que sao tradicionalmente associados ao controle de infeccoes virais. De forma inesperada, a infeccao de camundongos deficientes no receptor de IFN do tipo I (ABR-/-) ou deficientes para IFN do tipo II (IFN-/-) resultou em fenotipos distintos. Camundongos ABR-/- sao muito susceptiveis a infeccao, enquanto camundongos IFN-/- sao moderadamente resistentes. A investigacao dos parametros de doenca indicou que IFNs do tipo I sao essenciais para o controle da replicacao de SLEV ao induzir a expressao de ISGs, dentre os quais RIG-I, uma molecula associada as respostas imunes inatas contra virus de RNA. Em contrapartida, a ausencia de IFN em camundongos resultou na reducao da replicacao viral no cerebro, em associacao a uma expressao alterada de ISGs. Camundongos IFN-/- possuem uma alta expressao de RIG-I no cerebro em condicoes basais, que indicando que RIG-I pode estar relacionado ao controle da replicacao de SLEV. A infeccao por SLEV induziu a expressao de INF tipo III somente nos cerebros de camundongos IFN-/-, indicando IFNs tipo II e III interagem de maneiras ainda desconhecidas no contexto de infeccao. Por fim, concluimos que o modelo de infeccao por SLEV e uma ferramenta util para o estudo da encefalite de St. Louis. Ainda, este modelo pode contribuir para a geracao de conhecimento aplicavel, tais como o delineamento de respostas antivirais no cerebro, aplicavel para infeccoes por SLEV e outros flavivirus, como Zika. Flaviviruses are a genre of closely-related viral pathogens, which emerged or reemerged in the last decades in Brazil and in the world. Flaviviruses such as St. Louis encephalitis virus (SLEV) can cause encephalitis, a severe disease that may lead to death or neurological sequelae. St. Louis encephalitis pathogenesis is poorly understood, which delays the development of a specific treatment or vaccine, in similar way to Zika and Dengue. To address this problem, we developeda mice model of SLEV infection to study mechanisms involved in resistance to infection and disease. The model consists in the intracranial (i.c.) inoculation of the SLEV strain BeH 355964in mice, a strain isolated from a human patient in Brazil. Inoculated mice die from infection, presenting with SLEV replication, inflammation and brain damage, which are consistent with encephalitis. The correlation of SLEV replication and mortality after infection brought us to the study of IFNs, which are typically associated to the control of viral replication. We infected ABR-/- and IFN-/- mice, which lack type I IFN receptors or lack type II IFN, respectively, to find that ABR-/- mice are very susceptible to infection, in contrast to IFN-/- mice, which are slightly resistant. Further study of disease parameters showed that type I IFNs are essential for the control of SLEV replication, through the increase of ISG expression in the brain, notably RIG-I. RIG-I is a molecule known to participate in innate immune responses to RNA viruses. In contrast, absence of IFN (type II IFN) resulted in the reduction of viral load in the brain, due to high basal levels of RIG-I expression presented by IFN-/- mice in the brain. SLEV caused the expression of type III IFN only in the brains of IFN-/- mice, indicating that IFN type II and III interact in ways that are not yet understood, in the context of infection. We conclude that our SLEV infection model is a useful tool for the study of St. Louis encephalitis. This infection model allows for the study of mechanisms of disease pathogenesis and or resistance, such as antiviral responses against a flavivirus in the brain. Thus, this animal model will help to generate applicable knowledge to St. Louis encephalitis and to related flaviviral diseases, such as Zika.

A esquistossomose é uma doença causada por parasitos do gênero Schistosoma, sendo uma das mais prevalentes dentre as doenças tropicais negligenciadas. Atualmente, mais de 240 milhões de pessoas no mundo estão infectadas. No Brasil, a esquistossomose é causada pela espécie Schistosoma mansoni. Durante o seu complexo ciclo de vida, o S. mansoni é submetido a diferentes ambientes, onde a regulação da expressão gênica exerce um papel central nas transformações morfológicas e fisiológicas necessárias para o desenvolvimento deste parasito. Nesse contexto, a proteína SmZF1, um fator de transcrição de S. mansoni que contém quatro motivos dedos de zinco do tipo C2H2, representa um alvo em potencial para estudos do controle da expressão gênica associada ao desenvolvimento larval e ao processo reprodutivo em vermes adultos do parasito. Esse projeto teve como objetivo a caracterização funcional da proteína SmZF1, através de interferência de RNA (RNAi), a fim de investigarmos a importância dessa proteína durante o estabelecimento da infecção do hospedeiro vertebrado pelo S. mansoni. Após o cultivo in vitro de esquistossômulos na presença do dsRNA de SmZF1 por sete dias, verificamos que os transcritos de SmZF1 foram silenciados de maneira efetiva e específica, alcançando uma diminuição máxima de ~69% com relação aos esquistossômulos cultivados na ausência de qualquer dsRNA. Além disso, observamos um leve retardo no crescimento dos esquistossômulos após dois dias de tratamento com o dsRNA de SmZF1. Avaliamos ainda a expressão gênica de dois genes que podem ser alvo de regulação por SmZF1 em S. mansoni, Smp_065180 e Smp_030710, e verificamos que o silenciamento desse fator de transcrição não alterou significativamente os níveis dos transcritos de ambos os genes. A infecção de camundongos com esquistossômulos silenciados para os transcritos de SmZF1, quando comparada à infecção do grupo controle, resultou em uma diminuição de ~72% da carga parasitária, além de uma redução de ~70% na carga de ovos depositados nos fígados dos camundongos. O silenciamento dos transcritos de SmZF1 induzido em esquistossômulos foi transiente, uma vez que o mesmo não se manteve nos vermes adultos, derivados dos esquistossômulos transformados. Também não foram observadas alterações nos parâmetros histopatológicos avaliados nos fígados dos camundongos infectados com esquistossômulos silenciados para os transcritos de SmZF1. Os resultados sugerem o envolvimento de SmZF1 no desenvolvimento larval e no estabelecimento da infecção de S. mansoni no hospedeiro vertebrado. Schistosomiasis is a disease caused by parasites of Schistosoma genus. This parasitic disease is one of the most prevalent among the neglected tropical diseases affecting over 240 million people worldwide. In Brazil, schistosomiasis is caused by Schistosoma mansoni. S. mansoni is exposed to different environments during its complex life cycle, in which the regulation of gene expression plays a central role in the morphological and physiological changes required for parasite development. The SmZF1 protein, a transcription factor from S. mansoni that contains four C2H2 zinc fingers, represents a potential research target for the understanding of gene expression control associated to the parasite larval development and adult worm reproduction. Herein we performed functional studies through RNA interference (RNAi) in order to investigate whether SmZF1 is involved in the establishment of S. mansoni infection in the mammalian host. Therefore, we induced the silencing of SmZF1 mRNA by soaking schistosomula cultivated in vitro with SmZF1 dsRNA for seven days. We show that SmZF1 transcript levels were effective and specifically reduced by 69% relative to untreated control. Schistosomula growth was slightly affected after two days of treatment with SmZF1 dsRNA. Futhermore, the gene expression of two putative genes targeted by SmZF1, Smp_065180 and Smp_030710 were not significantly affected by SmZF1 silencing. We found that SmZF1 knockdown was transient, because the RNAi induced in schistosomules did not persisted in adult worms derived from mice infected with dsRNA-treated parasites. In addition, parasite and liver egg burden recovered from mice infected with transformed schistosomula compared to control infection was significantly reduced by 72% and 70%, respectively. We observed no changes in histopathological parameters from liver of mice infected with knockdown schistosomula. The results suggest that SmZF1 might play a role during S. mansoni larval development and parasite infection establishment in the mammalian host.

O veneno da aranha Phoneutria nigriventer contém vários polipeptídeos neurotóxicos que agem em canais iônicos e outros receptores de insetos e de mamíferos. A capacidade dessas toxinas de discriminar entre diferentes tipos de canais iônicos as tornam potenciais modelos para o desenvolvimento de novas moléculas para aplicação médica e biotecnológica. A toxina PnTx4(5-5) possui alta atividade inseticida, mas não apresenta efeitos comportamentais macroscópicos quando injetada pela via intracerebral em camundongos. No entanto, esta toxina é capaz de inibir o subtipo NMDA de receptores de glutamato de neurônios hipocampais de rato. Além disso, foi demonstrado também um efeito antinociceptivo central e periférico em camundongos e ratos. PnTx4(5-5) possui 63% de identidade de sequência com a toxina PnTx4(6-1), que possui ação em canal para sódio de insetos. Assim, propusemos investigar se PnTx4(5-5) poderia ter efeitos tanto sobre os canais para sódio de insetos, quanto de mamíferos. No entanto, a dificuldade em obter grandes quantidades de veneno e de isolar suas toxinas representa um fator limitante para a realização de estudos com toxinas de P. nigriventer. Assim, nesse estudo, a toxina PnTx4(5-5) foi expressa de forma heteróloga em E. coli e demonstrou ter estrutura secundária e a atividade biológica semelhante à toxina nativa. Os resultados dos experimentos eletrofisiológicos demostraram que rPnTx4(5-5) é uma modificadora de "gating" e apresenta diferentes afinidades e modo de ação sobre os canais para sódio de inseto e de mamífero. A toxina retardou de forma notável a inativação do canal para sódio de barata, aumentando o pico da corrente de sódio. A mesma também inibiu a corrente de sódio dos canais para sódio de mamífero, o que pode ser devido a mudança no potencial de ativação para potenciais mais despolarizados, como observado nos canais Nav1.3 e Nav1.5. Além disso, foram produzidos alguns mutantes de PnTx4(5-5) para estudos de relação estrutura-função. O mutante R32A demonstrou ter uma menor atividade nos canais de sódio de insetos do que a toxina original, sugerindo que este aminoácido pode estar envolvido na afinidade da toxina para os canais para sódio. Este estudo poderá contribuir para o melhor entendimento da relação estrutura/função de toxinas anti-inseto e anti-mamífero em canais para sódio. The venom from the spider Phoneutria nigriventer contains several neurotoxic polypeptides, which act on ion channels and other receptors of insects and mammals. The ability of such toxins to discriminate between different ion channels renders them potential models for the development of new biologically active tools of medical or biotechnological applications. Identifying their molecular binding targets and elucidating their mechanism of action are the first challenges to overcome, before considering toxins as potential lead compounds for drug discovery. The toxin PnTx4(5-5) have high insecticidal activity and no macroscopic behavioral effects when injected by intracerebral via in mice. Nevertheless, it can inhibit the NMDA - subtype of glutamate receptors of cultured rat hippocampal neurons. Furthermore, it was demonstrated to have peripheral and central antinociceptive effect in mice and rats. PnTx4(5-5) shares 63% sequence identity with toxin PnTx4(6-1), that was previously shown to act on the insect sodium channel. Thus, we proposed to investigate if the PnTx4(5-5) could have effects both on insect and mammalian sodium channels. However, the difficulty in obtaining large amounts of venom and isolating its toxins represent a limiting factor for carrying out studies on P. nigriventer toxins. To overcome this problem, in this study we have cloned and expressed the toxin PnTx4(5-5) in E. coli. The recombinant toxin, rPnTx4 (5-5), demonstrated to have secondary structure and biological activity similar to the native one. Results from electrophysiological experiments showed that rPnTx4(5-5) is a sodium channel gating modifier and has different affinity and mode of action on insect and mammalian sodium channels. The toxin strongly slowed down the inactivation of the cockroach sodium channel, increasing the peak current. Besides that, the toxin inhibited the sodium current on mammalian sodium channels, which is probably due to the small, but significant shift in the activation potential to more depolarized potentials, as observed on the channels Nav1.3 and Nav1.5. In addition, we produced some mutants of PnTx4(5-5) for structure-function relationship studies. The mutant R32A demonstrated to have lower activity on insect sodium channels than the original toxin, suggesting that this amino acid can be involved in the affinity of the toxin for sodium channels. This study can contribute to better understanding the structure/function relationship of mammal and insect toxins on sodium channels.

Leishmaniose é a denominação dada para doenças provocadas pela infecção por protozoários do gênero Leishmania que, dependendo da espécie, podem produzir vários tipos de manifestações clínicas (locais e sistêmicas), sendo um problema importante de saúde pública mundial, principalmente nos países em desenvolvimento, como por exemplo, o Brasil. A forma mucocutânea da leishmaniose é caracterizada pelo surgimento de lesões crônicas e disseminadas para a mucosa oral e nasal do paciente, porém com baixos níveis de parasitas. Para estudo da leishmaniose mucocutânea ainda não há modelo murino específico que desenvolva todas as características imunopatologicas descritas em humanos. Porém, nosso grupo vem mostrando que a infecção do camundongo TNFR1 KO com L. major provoca lesões cutâneas crônicas com algumas características que correlacionam às achadas em humanos, porém com a patologia restrita ao local de lesão. O objetivo desse trabalho foi avaliar a infecção de camundongos TNFR1 KO por L. braziliensis, como proposta de desenvolvimento de um modelo experimental para a leishmaniose mucocutânea. Nossas observações indicaram similaridade entre as lesões crônicas humana e nesses camundongos, compostas por um infiltrado inflamatório rico em linfócitos T CD8+ e neutrófilos, que permanecem mesmo após o controle do parasitismo e promovem intensa liberação de citocinas pró-inflamatórias, como TNF e IFN-. Os níveis similares de IL-10 entre os camundongos C57BL/6 (selvagem) e TNFR1 KO sugerem que ausência de regulação da inflamação nesses animais pode ser um dos fatores que favorece a disseminação de parasitas e a permanência de células inflamatórias nos linfonodos e baço, durante as fases avançadas da doença. Porém, não detectamos a presença de lesões nas mucosas desse camundongo, o que sugere que a manifestação da doença é o resultado da interação de múltiplos fatores inerentes não só ao parasita, mas também ao hospedeiro. Leishmaniasis is the name given to the disease caused by protozoa parasites of the genus Leishmania. Depending on the species a broad spectrum of clinical manifestations can be observed both locally and systemically during the infection. Leishmaniasis constitute an important public health problem worldwide, especially in developing countries, for example, Brazil. Mucocutaneous leishmaniasis is characterized by the development of chronic lesions disseminated to the oral and the nasal mucosa of patients, but with low parasite load. There is no specific murine model that mimics all the immunopathological characteristics described in humans. However, our group has recently shown that TNFR1 KO mouse infected with L. major can present some features that correlate with symptoms described in humans. The aim of this study was to evaluate the infection of TNFR1 KO mice by L. braziliensis attempting to develop an experimental model for mucocutaneous leishmaniasis. Our observations indicate similarities in the inflammatory infiltrate between human and TNFR1 KO mice lesions. There was an increase in TCD8+ lymphocytes and neutrophils in the site of infection that remain even after controlling the parasitism. Infiltration of these cells promote intense release of pro-inflammatory cytokines such as TNF and IFN-. Similar levels of IL-10 from C57BL/6 (wild-type) and TNFR1 KO mice suggest that the lack of regulation of the inflammatory process in these animals can be one of the factors that promote the spreading of parasites and maintenance of inflammatory cells in the lymph nodes and spleen during the advanced stages of the disease. Nevertheless, we did not detect the presence of mucosal lesions in those mice, suggesting that the manifestation of the disease is the result of the interaction of multiple factors inherent not only to the parasite, but also the host.

A malária é considerada uma das doenças mais prevalentes do mundo. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, a malária afeta aproximadamente 400 milhões de pessoas por ano. Apesar de sua incidência ter diminuído consideravelmente nos últimos anos, a malária continua sendo um dos maiores problemas de saúde pública no Brasil e no mundo. Durante a infecção, o agente etiológico Plasmodium spp. desencadeia a produção de altos níveis de citocinas pró-inflamatórias. Dados do nosso grupo e de outros demonstram a importância dos monócitos no controle e na patogênese da malária, visto que são os maiores produtores de citocinas inflamatórias durante a infecção. Os monócitos são uma população heterogênea e podem ser divididos em três subpopulações baseadas na expressão de CD14 e de CD16. Essas células são denominadas, monócitos clássicos (CD14+CD16-), inflamatórios ou intermediários (CD14highCD16+) e patrulhadores (CD14lowCD16+). Considerando a importância dos monócitos durante a malária, o objetivo do presente estudo foi definir o papel das subpopulações de monócitos durante a infecção pelo P. vivax. A fim de responder essa questão, os monócitos clássicos, inflamatórios e patrulhadores presentes no sangue periférico de pacientes na fase aguda da malária foram caracterizados fenotipicamente e funcionalmente. Primeiramente, foram avaliadas as características ultraestruturais e atividade mitocondrial das subpopulações de monócitos. Uma vez que as subpopulações apresentaram características distintas, foi avaliada a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) total e mitocondrial. Os dados demonstram que os monócitos CD14highCD16+ de pacientes com malária apresentam maior atividade mitocondrial e produzem mais ROS que os outros subtipos, sugerindo uma atividade metabólica diferenciada durante a infecção pelo P. vivax. Malaria is considered one of the most prevalent diseases in the world. According with World Health Organization, malaria affects approximately 400 million people a year. Although the incidence of the disease has decreased remarkably in recent years, malaria is still one of the greatest public health problems in Brazil and worldwide. During the disease, the etiologic agent Plasmodium spp. triggers the production of high levels of inflammatory cytokines. Data from our group and others indicate the importance of monocytes in the control and pathogenesis of malaria, once they are the major source of pro-inflammatory cytokines during the infection. Monocytes are heterogeneous and can be divided into three distinct subsets described based on their expression of CD14 and CD16. These cells are referred to as, classical (CD14+CD16-), inflammatory or intermediate (CD14highCD16+) and patrolling (CD14lowCD16+) monocytes. Given the importance of monocytes during malaria, the aim of our study is to define the role of the monocyte subsets during P. vivax infection. To address this question, we phenotypically and functionally characterized the classical, inflammatory, and patrolling monocytes present in the peripheral blood from patients experiencing acute malaria episodes. We first evaluated the ultra-structural features and mitochondria activity of monocyte subpopulations. Once they display distinct characteristics, we also assessed total and mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production. Our data show that CD14highCD16+ monocytes in malaria patients displays increased mitochondrial activity and produce higher ROS level than the others subsets, suggesting a differential metabolic activity during P. vivax infection.

O estudo das peçonhas de serpentes é importante para o desenvolvimento de terapias contra acidentes ofídicos e também porque estas peçonhas são fontes de moléculas com potencial terapêutico, uma vez que podem ser utilizadas como protótipos para o desenvolvimento de fármacos e de outros produtos biotecnológicos.Neste contexto, no presente estudo, realizamos uma caracterização bioquímica parcial e investigamos algumas atividades biológicas da peçonha de M. lemniscatus e das frações obtidas por fracionamento por exclusão molecular (Superose 12). As frações (EM-F1 - EM-F11) obtidas foram submetidas à SDS-PAGE e à espectrometria de massas (MALDI-TOF), o que mostrou que a peçonha é composta principalmente, por componentes com massas moleculares de 6 - 8 kDa e 12 - 14kDa. O screening de atividades biológicas demonstrou que a peçonha apresentou atividades fosfolipásica A2 (EM-F3 a EM-F10), hialuronidásica (EM-F1 e EM-F2) e hemaglutinante (EM-F6 e EM-F7), além de ter induzido perda da adesão celular em adenocarcinoma de mama em cultura (EM-F1 e EM-F2). Adicionalmente, a peçonhainduziu atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus (ATCC® 6538) (EM-F1 e EM-F2). Frente ao surgimento de bactérias super-resistentes aos antibióticos comerciais e ao interesse em investigar agentes antimicrobianos a partir de fontes naturais, isolamos e caracterizamos química e farmacologicamente, a enzima L-aminoácido oxidase, Ml-LAAO. Esta enzima foi purificada porcromatografia de troca aniônica (Synchropack AX300) e apresentou Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) de 1,56 g/mL contra Staphylococcus aureus (ATCC® 6538). Adicionalmente, a toxicidade celular desta molécula foi avaliada em três linhagens celulares (THLE-2, WI26-VA4 e HEK- 293), o que mostrou que esta não é tóxica para estas células quando testada nas concentrações de CIM/CBM obtidos contra Staphylococcus aureus. Além disso, Ml-LAAO não causou hemólise em eritrócitos de coelho e não induziu lise de lipossomos. A análise por espectrometria de massas MALDI-TOF mostrou uma massa molecular aparente de aproximadamente 69 kDa para Ml-LAAO. Nosso trabalho mostrou a primeira L-aminoácido oxidase isolada da peçonha de M. lemniscatus. No entanto, novos estudos são necessários para caracterizar a atividade enzimática de Ml-LAAO e compreender seu mecanismo de ação em bactérias. The study of snake venoms is useful to development of therapies against snakebites and these venoms are also source of molecules with therapeutic potential. Therefore it can be used as prototypes for the development of drugs and other biotechnological products. In this context, we performed a partial biochemical characterization and investigated some biological activities of M. lemniscatus venom and its fractionsobtained by fractionation by size exclusion (Superose 12). The fractions (EM-F1 - EM-F11) obtained were submitted to SDS-PAGE and to mass spectrometry (MALDITOF) analysis. The results showed that this venom consists mainly of components with molecular weights of 6 - 8 kDa and 12 - 14 kDa. The screening of biological activities demonstrated that the venom displayed phospholipase A2 (EM-F3 to EMF10), hyaluronidase (EM-F1 and EM-F2) and hemagglutinating (EM-F6 and EM-F7) activities and causes loss of cell adhesion in mammary adenocarcinoma in culture (EM-F1 and EM-F2). Additionally, this venom induced antimicrobial activity against Staphylococcus aureus (ATCC® 6538) (EM-F1 and EM-F2). Due to the emergence of super-resistant bacteria to commercial antibiotics and to the interest in investigating antimicrobial agents from natural sources, we isolated and characterized chemically and pharmacologically Ml-LAAO. This enzyme was purified by anion exchange chromatography (Synchropack AX300) and showed a Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and a Minimum Bactericidal Concentration (MBC) of1.56 g/mL against Staphylococcus aureus, (ATCC® 6538). In addition, cellular toxicity of this molecule was assessed in three cell lines (THLE-2, WI-26 VA4 and HEK-293), which showed that it is not toxic for these cells, when tested at the MIC/MBC concentrations obtained against Staphylococcus aureus. Furthermore, Ml-LAAO did not cause hemolysis in rabbit erythrocytes and did not induce liposome lysis. The MALDI-TOF mass spectrometric analyses showed an apparent molecular mass of approximately 69 kDa to Ml-LAAO. Our results showed the first L-amino acid oxidase isolated from the M. lemniscatus venom. However, more studies are need to characterize the enzymatic activity of Ml-LAAO and to understand its mechanism of action in bacteria.

Grandes defeitos no crânio não regeneram satisfatoriamente, representando um importante problema biomédico. As atuais estratégias para regenerar o tecido ósseo ainda apresentam algumas limitações, dessa forma, a engenharia de tecidos é uma ciência atrativa para contornar tais limitações. Atualmente as células-tronco derivadas do tecido adiposo humano (hASCs) estão em foco para aplicação na engenharia de tecidos. Previamente a sua aplicação clínica, as hASCs devem ser expandidas ex vivo para obter o número requerido de células para transplante. No entanto, a expansão ex vivo das células-tronco antes da aplicação clínica ainda representa um desafio. O soro fetal bovino (SFB) é amplamente empregado como um suplemento para meio de cultura e expõe os pacientes receptores a infecções e reações imunológicas após o transplante. Além disso, a expansão celular constitui um risco de transformação celular maligna. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar se há resistência para transformação maligna durante a expansão de hASCs em condição de cultura livre de componentes xenogênicos, usando o pool de soro alogênico humano (SH), assim como, avaliar a capacidade das hASCs, quando cultivadas em matrizes tridimensionais de polihidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHB-HV), em se diferenciar em células da linhagem osteogênica e regenerar defeito de tamanho crítico em calvária de camundongos imunossuprimidos. As hASCs expandidas em meio suplementado com SH não apresentaram diferenças notáveis na morfologia, viabilidade, capacidade de diferenciação e imunofenótipo. A principal diferença observada foi um efeito proliferativo significativamente maior nas hASCs cultivadas em SH comparado ao SFB. Não existiu diferença significativa na expressão de c-FOS, mas a expressão da proteína c-MYC estava elevada nas culturas com SH comparado as culturas com SFB. No entanto, nenhuma diferença foi observada nos níveis de mRNA de MYC, CDKN2A, ERBB2 e TERT. Além disso, as hASCs apresentaram cariótipo normal, sofreram senescência e não formaram tumores in vivo, eliminando a possibilidade de imortalização espontânea das hASCs na presença de SH. As matrizes de PHB-HV, desenvolvidas pela técnica de liofilização, apresentaram estrutura de poros e performance mecânica adequada, que permitiu a colonização celular. As matrizes não foram tóxicas para as células, como mostrado pelo ensaio de MTT. E a diferenciação osteogênica das hASCs cultivadas na matriz foi confirmada pela redução da proliferação, atividade de fosfatase alcalina, expressão gênica de ALPL, COL1A1, RUNX2 e BGLAP, e expressão de marcadores ósseo, como colágeno tipo I, osteopontina e osteocalcina. Além disso, a matriz de PHB-HV demonstrou alto grau de biocompatibilidade in vivo. Na última etapa desta tese, embora as análises histológicas mostrassem uma boa progressão da injúria óssea com neoangiogênese, as matrizes tridimensionais de PHB-HV, colonizadas ou não por hASCs implantadas não foram capazes de regenerar o defeito de tamanho crítico em calvária após 12 semanas de implantação. No geral, os resultados obtidos sugerem que o SH é uma abordagem adequada e segura para cultivar hASCs e diferenciá-las em células da linhagem osteogênica destinadas para aplicações clínicas. E a matriz tridimensional de PHB-HV parece ser adequada para o crescimento e diferenciação das hASCs útil para engenharia de tecido ósseo, porém mais estudos são necessários. Large cranial defects do not regenerate successfully, posing an important biomedical issue. The current approaches to heal the bone tissue still face some limitations and thus, the tissue engineering is an attractive science to bypass these limitations. Human adipose-derived stem cells (hASCs) are currently a point of focus for tissue engineering applications. Prior to their clinical application, hASCs must be expanded ex vivo to obtain the required number of cells for transplantation. However, the ex vivo expansion of stem cells before clinical application remains a challenge. The fetal bovine serum (FBS) is largely used as a medium supplement and exposes the recipient patient to infections and immunological reactions after tranplantation. Furthermore, the cell expansion poses a risk of malignant cell transformation. Therefore, the aim of this study was to evaluate if the hASCs are resistant to spontaneous transformation during expansion in a xeno-free culture condition, using a pooled allogeneic human serum (HS) as well as the capacity of hASCs cutured in poly-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate (PHB-HV) scaffolds to differentiate in osteogenic lineages and to heal critical-size calvarial defect in imunodeficient mouse. The hASCs expanded in medium supplemented with HS did not show remarkable differences in morphology, viability, differentiation capacity and immunophenotype. The main difference observed was a significantly higher proliferative effect on hASCs cultured in HS compared to FBS. There was no significant difference in C-FOS expression, but C-MYC protein expression was enhanced in HS cultures compared to FBS cultures. However no difference was observed in MYC, CDKN2A, ERBB2 and TERT mRNA levels. Moreover, the hASCs presented normal karyotype undergoing senescence, and did not form in vivo tumors, eliminating the possibility of spontaneous immortalization of hASCs in the presence of HS. The PHB-HV scaffolds developed by the freeze-drying technique showed an adequate porous structure and mechanical performance suitable for allowing cell colonization. The scaffolds were not toxic to cells as shown by MTT assay. And the osteogenic differentiation of hASCs cultured on scaffolds was confirmed by the reduction of the proliferation, the alkaline phosphatase activity, gene expression of ALPL, COL1A1, RUNX2 and BGLAP, and the expression of bone markers, such as collagen type I, osteopontin and osteocalcin. Furthermore, the PHB-HV scaffold demonstrates high degree of biocompatibility in vivo. In the last step of this thesis, although the histological analysis showed a good progression of the bone injury with neoangiogenesis, the implanted PHB-HV scaffolds seeded with/without hASCs were not able to heal critical-size mouse calvarial defects after 12 weeks of implantation. Overall, the findings suggest that the HS is an approach suitable and safe to culture hASCs and differentiate these cells in osteogenic lineages intended for clinical applications. And the PHB-HV scaffold seems to be adequate for cell growth and differentiation of hASCs usefull for bone tissue engineering, but further studies are needed.

Objetivos: A associação entre glúten e obesidade é ainda controversa e escassa na literatura. Previamente nosso grupo demonstrou que as dietas sem glúten levaram à redução do peso corporal em camundongos alimentados com dieta hiperlipídica. O presente trabalho objetivou investigar em modelos experimentais os mecanismos pelos quais o glúten exerce tais ações, com ênfase nos seus possíveis efeitos na termogênese, no gasto energético e no metabolismo do tecido adiposo. Métodos: Camundongos C57BL/6 foram alimentados com dieta padrão (Eutrófico Eut) ou dieta hiperlipídica indutora de obesidade (Obeso Ob) sem glúten ou adicionadas com 4,5% de glúten de trigo (EutG e ObG). Após oito semanas de tratamento, os animais receberam glúten radiomarcado com Tecnécio (99mTc-GLU) para estudo da absorção e biodistribuição corporal e foram submetidos à calorimetria para avaliação do consumo de oxigênio (VO2) e gasto energético. Após a eutanásia o tecido adiposo marrom (TAM) e o tecido adiposo subcutâneo (TAS) foram retirados para avaliação da expressão de proteínas relacionadas à termogênese e browning. Adipócitos do tecido adiposo visceral (TAV) foram isolados e cultivados para estudo da expressão de genes relacionados à inflamação e ao metabolismo lipídico. Resultados: A adição de 4,5% glúten não alterou a ingestão calórica em nenhum dos dois grupos experimentais (dietas padrão ou hiperlipídica). Apesar disso, os animais que consumiram glúten apresentaram maior ganho de peso devido à expansão do TAV e TAS, tanto nos grupos eutróficos quanto nos obesos. 99mTc-GLU ou seus fragmentos peptídicos foram detectados no sangue, fígado e TAV, sugerindo que o glúten poderia atingir órgãos extra-intestinais e exercer ações diretas. No TAM de animais obesos, dietas com glúten estiveram associadas à menor expressão da UCP1 (proteína desacopladora da fosforilação oxidativa, responsável pela termogênese). No TAS dos grupos EutG e ObG houve também redução na expressão das proteínas UCP1 e BMP7 (relacionada à diferenciação de adipócitos marrons no tecido adiposo branco: browning). A calorimetria indireta mostrou menor VO2 em animais EutG e ObG, comparados aos seus controles. Em obesos, o gasto energético foi reduzido com a ingestão de glúten. A ingestão de glúten também reduziu a expressão de gênica de adiponectina, PPAR, PPAR e da enzima lipase hormônio-sensível em cultura de adipócitos de animais obesos. Nos animais eutróficos a ingestão de glúten aumentou a expressão de IL-6 e TNF (p=0,06). Conclusão: Glúten ou seus fragmentos peptídicos podem atingir órgãos periféricos, sugerindo efeitos diretos nesses tecidos. A inclusão de glúten de trigo em dietas isocalóricas reduziu a termogênese, o browning e o gasto energético levando a aumento do peso e expansão do tecido adiposo, em camundongos eutróficos e, principalmente, em obesos. Objectives: Despite the popularity of gluten-free diets, an association between gluten and obesity is still controversial, and there are few controlled studies published. Previously, we showed that a gluten-free diet reduces weight gain without changing food intake in mice fed high-fat diets. In the present study, we investigated the effects of gluten intake on fat metabolism, thermogenesis and energy expenditure in mice fed a standard or a high-fat diet. Methods: C57BL/6 mice were fed a standard (Eutrophic Eut) or high-fat diet (Obese Ob) to induce obesity. EutG and ObG groups had diets containing 4.5% of wheat gluten. After eight weeks, the animals received 99mTechnetium-radiolabeled gluten (99mTc-GLU) orally to study gluten absorption and biodistribution or they underwent indirect calorimetry to study oxygen consumption (VO2) and energy expenditure. After euthanasia, brown (BAT) and subcutaneous adipose tissue (SAT) were collected to assess thermogenic and browning-related protein expression. Lipid metabolism and the inflammatory profile were studied in adipocyte cultures from the four groups. Results: Despite having had the same energy intake, EutG and ObG mice exhibited increased body weight and fat deposits (SAT and VAT visceral adipose tissue) compared with their respective controls.99mTc-GLU or its peptides were detected in the blood, liver and VAT, suggesting that it can reach extra-intestinal organs. Uncoupling protein 1 (UCP1) expression was reduced in the BAT of Ob-G and in the SAT of EutG and ObG mice. In SAT of EutG and ObG groups there was also a reduction in BMP7 expression (related to browning which is the differentiation of brown adipocytes in white adipose tissue). Indirect calorimetry showed lower VO2 in EutG and ObG groups compared with their controls. In obese mice, daily energy expenditure was reduced with gluten intake. Gluten also reduced adiponectin, peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) and PPAR and hormone-sensitive lipase in cultures of adipocytes isolated from Ob mice, while in the EutG group, gluten intake increased Il-6 expression and tended to increase that of TNF. Conclusion: Gluten or its peptides can reach extra-intestinal organs, such as liver and VAT, supporting a direct effect on those sites. The inclusion of wheat gluten in isocaloric diets decreases thermogenesis, browning and energy expenditure, and accelerates weight gain and adiposity in eutrophic and, mainly, in obese mice. Keywords: wheat gluten; obesity; thermogenesis; calorimetry; adipocyte culture

Sugiuchi et al. (1995) desenvolveram um método direto para a determinação de colesterol proveniente da lipoproteína de alta densidade (HDL), sem a necessidade de procedimentos pré-analíticos. O teste consiste na formação de complexos solúveis das apoB100-lipoproteínas com o poliânion -ciclodextrina sulfato, o que reduz a ação das enzimas colesterol esterase e colesterol oxidase sobre lipoproteínas de baixa densidade (LDL), muito baixa densidade (VLDL) e quilomicra. A inibição total da catálise enzimática sobre as apoB100-lipoproteínas é alcançado após a ligação covalente de moléculas de polietilenoglicol às superfícies das enzimas. Após essa ligação, somente as partículas de HDL ficam disponíveis para ação da colesterol esterase e colesterol oxidase. O presente trabalho verificou a capacidade de inibição da reação catalisada pelas enzimas colesterol esterase e colesterol oxidase pelos poliânions: ácido fosfotúngstico, sacarose octassulfato, sulfato de condroitina e -ciclodextrina sulfato. Foram determinados parâmetros cinéticos para a enzima colesterol esterase nativa e após adição de polietilinoglicol à sua superfície utilizando calorimetria de titulação isotérmica. Os resultados evidenciaram que o ácido fosfotúngstico é capaz de inibir satisfatoriamente a ação das enzimas sobre as apoB100-lipoproteínas. Os valores da constante de Michaelis-Menten (Km) para colesterol esterase nativa utilizando HDL e LDL foram de 4,26 M de linoleato de colesterila e 13,14 M de linoleato de colesterila, respectivamente. Após a adição do polietilenoglicol à enzima o Km da enzima utilizando HDL como substrato foi alterado para 21,6 M de linoleato de colesterila. Os resultados desse estudo fornecem o embasamento para o desenvolvimento de um reagente para a determinação de colesterol HDL. Sugiuchi et al. (1995) developed a direct method to determine cholesterol from high density lipoprotein, with no need for pre-analytical procedures. The assay consists of the formation apoB100-lipoproteins' soluble complexes with -cyclodextrin sulfate polyanion, which reduces the action of the enzymes cholesterol esterase and cholesterol oxidase over low density lipoprotein (LDL), very low density lipoprotein (VLDL) and chylomicra. Total inhibition of the enzymatic catalysis over apoB100-lipoproteins is achieved after the covalent bonding of polyethyleneglycol on the enzymes surfaces. Only the HDL's particles are available for the catalysis of cholesterol esterase and cholesterol oxidase. This study verified the inhibition of the reactions catalyzed by cholesterol esterase and cholesterol oxidase by the polyanions: phosphotungstic acid, sucrose octasulfate, chondroitin sulfate and - cyclodextrin sulfated. Kinetics parameters for the native enzyme cholesterol esterase and after the bonding with polyethyleneglycol were also determinate. The results showed that phosphotungstic acid is able to inhibit satisfactorily the enzymes' action over apoB100-lipoproteins. The Km's values for native cholesterol esterase with HDL and LDL were 4,26 M of cholesteryl linoleate and 13,14 M of cholesteryl linoleate, respectively. After the bound of polyethyleneglycol on the cholesterol esterase surface the enzimes Km for HDL was altered to 21,6 M of cholesteryl linoleate. The results of this study provide the knowledge to develop a reagent used to determine HDL cholesterol.

Os Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs), um grupo de compostos orgânicos formados por anéis benzênicos fusionados, são contaminantes ambientais amplamente distribuídos tanto devido a fontes naturais quanto antropogênicas, sendo as atividades de produção de carvão vegetal e mineral, de refino e transporte de petróleo os principais contribuintes para o despejo localizado de HAPs. Devido à sua ocorrência ubíqua , potencial de bioacumulação e atividade carcinogênica, vários HAPs foram listados como poluentes prioritários para a remediação destacando a importância da sua remoção do meio ambiente. Diversos microrganismos têm sido extensamente estudados em virtude de sua versatilidade em degradar uma gama de compostos aromáticos. A bactéria Pseudomonas putida G7 possui um plasmídeo associado ao metabolismo do naftaleno, o mais simples e abundante HAP, cuja degradação ocorre através de duas vias catabólicas ditas superior e inferior. NahI, uma 2- hidroximuconato semialdeído desidrogenase (2-HMSD) atuante na via inferior, converte 2- hidroximuconato semialdeído (2-HMS) a 2-hidroximuconato (2-HM) na presença de NAD+. Mesmo a despeito da baixa identidade de sequencia, uma característica comum entre enzimas aldeído desidrogenases (ALDHs) é a manutenção de um enovelamento estrutural semelhante, salvas as inúmeras particularidades concernentes ao estado de oligomerização e às interações específicas estabelecidas entre enzima, substrato e cofator. Assim, este trabalho se propôs a caracterizar cinética e estruturalmente a enzima NahI, uma vez que, através da elucidação de sua estrutura tridimensional e comparação com as de outras ALDHs, possibilita-se inferir distinções no sítio catalítico responsáveis por mudanças sistemáticas nas propriedades cinéticas destas enzimas sobre uma variedade de substratos aldeídos. Após purificação por cromatografia de afinidade e de exclusão molecular, ensaios de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) foram realizados para analisar o estado oligomérico da enzima em solução, identificada como um tetrâmero. No que diz respeito à estrutura cristalográfica, NahI apresentou o enovelamento / típico da superfamília ALDH organizado em domínio de oligomerização e domínios de ligação ao dinucleotídeo e ao substrato, este último também conhecido como catalítico. Através de operações de simetria cristalográfica, observou-se o tetrâmero de NahI formado por um dímero de dímeros. Ensaios de cinética confirmaram a preferência da enzima para o substrato alifático 2-HMS, porém não se observou qualquer atividade sobre salicilaldeído, substrato aromático natural de NahF, uma ALDH pertencente à mesma via de degradação do naftaleno. Mutações foram propostas para NahI a fim de aumentar o volume do bolso catalítico, uma vez que resíduos de cadeia lateral volumosa poderiam dificultar a atividade desta enzima sobre substratos aromáticos. Surpreendentemente, as formas mutantes não apresentaram atividade sobre salicilaldeído. Além disso, o alargamento da entrada do bolso catalítico afetou ligeiramente a afinidade da enzima para o seu substrato natural, 2-HMS. Sugere-se ainda que o resíduo L156 parece ser crucial para a oxidação do substrato. Os resultados desta investigação apresentam, pela primeira vez, características estruturais e cinéticas em relação à enzima NahI e favorecem futuros estudos sobre a identidade e função de resíduos cruciais para a catálise e a descrição de como a reação se processa. The Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs), a group of organic compounds consisting of fused benzene rings, are contaminants widely distributed in the environment due to natural as well as anthropogenic sources. Activities of production of coal, refining and transportation of oil are the major contributors to the contamination with PAHs. Due to their ubiquitous occurrence, potential to bio-accumulate and carcinogenic activity, a number of PAHs were listed as priority pollutants for remediation highlighting the importance of their removal from the environment. Several microorganisms have been extensively studied because of its versatility to degrade a wide range of aromatic compounds. The bacterium Pseudomonas putida G7 has a plasmid associated with the metabolism of naphthalene, the simplest and most abundant PAH. Its degradation by P. putida occurs through the upper and the lower catabolic pathways. NahI, a 2-hydroxymuconate semialdehyde dehydrogenase (2-HMSD) belonging to the lower pathway, converts 2-hydroxymuconate semialdehyde (2-HMS) to 2- hydroxymuconate (2-HM) in the presence of NAD+. A common feature among aldehyde dehydrogenases (ALDHs) is the similar scaffold, even despite their overall low sequence identity, modes of oligomerization and substrate specificity. Thus, this study was proposed to characterize the structure and kinetics of NahI. By elucidation of its three-dimensional structure and comparison with other ALDHS, it becomes possible to infer distinctions in the catalytic site that are responsible for systematic changes in the kinetic properties of these enzymes within a variety of aldehyde substrates After purification by affinity and sizeexclusion chromatography, dynamic light scattering (DLS) and small-angle X-ray scattering (SAXS) experiments were conducted to analyze the oligomeric state of the enzyme in solution, which was identified as being a tetramer. With regard to the crystal structure, NahI displayed a typical / aldehyde dehydrogenase superfamily fold with three well defined domains: the oligomerization domain, the nucleotide binding and the catalytic domains. Through crystallographic symmetry operations, the NahI tetramer formed by a dimer of dimers was observed. Kinetic assays confirmed the preference of the enzyme for the aliphatic substrate 2-HMS. On the other hand, NahI showed no activity with salicylaldehyde, the natural substrate for NahF enzyme, another ALDH belonging to the same naphthalenedegradation pathway. Mutations have been proposed for NahI in order to increase the volume of the catalytic pocket, since bulky side chain residues could hinder the activity of this enzyme with aromatic substrates. Surprisingly, the mutant forms showed no activity with salicylaldehyde. Moreover, the enlargement of the catalytic pocket entrance slightly affected the affinity of the enzyme for its natural substrate, 2-HMS. It also suggests that the L156 residue appears to be crucial for the oxidation of the substrate. For the first time, these findings show the structural and kinetic properties relative to the NahI enzyme and highlights further studies concerning the identity and function of critical residues for catalysis and description of how the reaction proceeds.

A Retocolite Ulcerativa (RCU) é uma doença inflamatória intestinal, crônica, com importante envolvimento do sistema imune. As doenças inflamatórias crônicas têm sido associadas com o aumento do risco de doenças cardiovasculares, mas poucos estudos têm avaliado esse risco em paciente com RCU e a influência do tratamento medicamentoso. Assim, nosso objetivo foi avaliar o risco de desenvolvimento de aterosclerose e doenças cardiovasculares em mulheres com RCU em remissão clínica, considerando o tratamento medicamentoso. Participaram do estudo vinte e uma mulheres sendo doze em uso exclusivo de aminossalicilatos (grupo ASA) e nove em uso de azatioprina associada a aminossalicilatos (grupo AZA+ASA). O grupo controle saudável foi pareado por idade. Foram avaliados a pressão arterial, composição corporal, hábitos alimentares e parâmetros bioquímicos e imunológicos. Comparados ao respectivo grupo controle, os grupos com RCU mostraram aumento do tecido adiposo e redução da massa livre de gordura. Pressão arterial, níveis de óxido nítrico, proteína C reativa, velocidade de hemossedimentação e anticorpos anti-LDL oxidada também foram maiores nos grupos RCU comparados aos seus controles. O grupo ASA apresentou aumento de IL-6 e MCP-1 circulantes enquanto no grupo AZA+ASA houve aumento de IL-6, TNF, MCP-1 e das citocinas anti-inflamatórias IL-10 e TGF-. Os escores de risco de Framingham para avaliação do risco de doenças cardiovasculares em 10 e 30 anos também foram maiores nos grupos com RCU. Quando os grupos RCU foram comparados entre si, observou-se que as mulheres tratadas com azatioprina associada aos aminossalicilatos mostraram níveis reduzidos de proteínas totais, globulinas, velocidade de hemossedimentação e linfócitos, com aumento dos níveis das citocinas inflamatórias IL-6 e TNF e anti-inflamatórias IL-10 e TGF-. Assim, os dados sugerem que as mulheres com RCU em remissão clínica têm maior risco de desenvolvimento de aterosclerose e doenças cardiovasculares quando comparadas ao grupo controle saudável. Por sua vez, mulheres tratadas com azatioprina e aminossalicilatos associados parecem estar mais protegidas que aquelas em uso isolado de aminossalicilatos, devido à melhor regulação do processo inflamatório Ulcerative colitis (UC) is an inflammatory bowel disease, chronic, with involvement of the immune system. Chronic inflammatory disease have been associated with increased risk of cardiovascular disease (CVD) but few studies have assessed this risk in patients with UC and the influence of drug treatment. Thus, we evaluated the risk of development CVD in women with UC in clinical remission considering the drug treatment. 21 women with UC participated in this study, where 12 used aminosalicylates (ASA group) and 9 used azathioprine added to aminosalicylates (AZA+ASA group). The healthy control group was matched for age. We evaluated blood pressure, body composition and biochemical and immunological parameters. Compared the respective control group, the UC groups showed expansion of body fat and less lean body mass. Blood pressure, pro-inflammatory cytokines, nitric oxide, C reactive protein, erythrocyte sedimentation rate (ESR) and anti-oxidized LDL antibodies were higher in UC groups. Only AZA+ASA group showed increased of anti-inflammatory cytokines (IL-10 and TGF-). The Framingham scores showed higher risk of CVD in UC groups. UC groups were compared and women treated with azathioprine showed reduction of total protein, globulin, ESR and lymphocytes, with increased of IL-6, TNF, IL-10 and TGF-. Data suggest that women with UC in clinical remission have a higher risk for development of atherosclerosis and CVD when compared to the control group, while women treated with azathioprine seem more protected than that in isolated use of aminosalicylates, due the better regulation of the inflammatory process

Durante a infecção por Trypanosoma cruzi, macrófagos produzem espécies reativas de oxigênio (ROS) em um processo chamado explosão respiratória. Diversos trabalhos têm tentado elucidar o papel das ROS durante a infecção pelo T. cruzi, mas os resultados obtidos algumas vezes são contraditórios. Embora o T. cruzi possua uma maquinaria antioxidante eficientemente regulada para lidar com a explosão respiratória, suas macromoléculas, particularmente seu DNA, ainda podem sofrer danos oxidativos. Devido ao seu baixo potencial redox, a guanina é a base mais vulnerável e sua oxidação resulta na formação de 8-oxoG, um marcador celular de estresse oxidativo. A fim de se verificar a contribuição das ROS na sobrevivência e infecção do parasito T cruzi, foram utilizados camundongos nocautes para a subunidade gp91phox da NADPH oxidase (Phox KO) e parasitos que superexpressam enzimas responsáveis pela remoção de 8-oxo-dGTP do conjunto de nucleotídeos. Os parasitos modificados apresentaram maior replicação em macrófagos de camundongos C57BL/6 WT quando comparados aos parasitos controle. Interessantemente, macrófagos de camundongos Phox KO infectados com estes parasitos, apresentaram um número reduzido de parasitos quando comparados com macrófagos de C57BL/6 WT. Os resultados obtidos nesse trabalho indicam um papel paradoxal para as ROS, uma vez que parasitos modificados multiplicam-se melhor em macrófagos, mas têm sua capacidade de replicação significativamente reduzida quando a produção de ROS é inibida na célula hospedeira. Nossos resultados sugerem que baixas concentrações de ROS podem funcionar como moléculas sinalizadoras, contribuindo para o crescimento dos parasitos no interior das células. During Trypanosoma cruzi infection, macrophages produce reactive oxygen species (ROS) in a process called respiratory burst. Several works have aimed to elucidate the role of ROS during T. cruzi infection and the results obtained are sometimes contradictory. T. cruzi has a highly efficiently regulated antioxidant machinery to deal with the oxidative burst, but the parasite macromolecules, particularly DNA, may still suffer oxidative damage. Guanine (G) is the most vulnerable base and its oxidation results in formation of 8-oxoG, a cellular marker of oxidative stress. In order to investigate the contribution of ROS in T. cruzi survival and infection, we utilized mice deficient in the gp91phox (Phox KO) subunit of NADPH oxidase and parasites that overexpress the enzyme EcMutT (from Escehricha coli) or TcMTH (from T. cruzi), which is responsible for removing 8-oxo-dGTP from the nucleotide pool. The modified parasites presented enhanced replication inside murine inflammatory macrophages from C57BL/6 WT mice when compared with control parasites. Interestingly, when Phox KO macrophages were infected with these parasites, we observed a decreased number of all parasites when compared with macrophages from C57BL/6 WT. In Phox KO macrophages we did not observe exacerbation of the infection. Our results indicate a paradoxical role for ROS, since modified parasites multiply better inside macrophages, but its proliferation is significantly reduced when ROS production is inhibited in host cell. Our findings suggest that lower concentrations of ROS can work like a signaling molecule, contributing to growth of this parasite inside the cells.

A pneumonia pneumocócica é uma importante causa de mortalidade no mundo. A resposta inflamatória contra as bactérias é necessária para controlar a infecção, mas a permanência e ativação excessiva dos neutrófilos nos pulmões podem resultar em dano tecidual significativo. Os inibidores de fosfodiesterase 4 (PDE4), tais como o rolipram, reduzem a inflamação de forma eficiente. O presente estudo analisou o impacto do tratamento com rolipram em um modelo murino de pneumonia pneumocócica. Camundongos Balb/C foram infectados por via intranasal com 103-106 CFU de Streptococcus pneumoniae e a cinética da inflamação desencadeada foi avaliada. Camundongos infectados com 104-105 CFU foram então tratados com o rolipram em um esquema profilático ou terapêutico, em combinação ou não com o antibiótico ceftriaxona. Foram realizadas contagens das células inflamatórias e bactérias recuperadas e ensaios ex vivo de fagocitose. O tratamento com rolipram durante a infecção por S. pneumoniae levou à diminuição do recrutamento de neutrófilos nos pulmões e vias respiratórias e reduziu a lesão pulmonar. A administração profilática de ROL também diminuiu os níveis das citocinas nas vias aéreas. Apesar da modulação da inflamação por ROL melhorar a pneumonia, a carga bacteriana nos pulmões não foi reduzida. Por outro lado, a antibióticoterapia reduziu o número de bactérias sem diminuir a infiltração de neutrófilos, os níveis das citocinas e a lesão pulmonar. O tratamento combinado de rolipram e ceftriaxona foi mais eficiente na redução da inflamação, aumentando a expressão da proteína pró-resolutiva anexina A1, e reduzindo o número de bactérias através do aumento da fagocitose. Ainda, camundongos deficientes em anexina A1 são mais susceptíveis à infecção pneumocócica. Estes dados mostram que os efeitos imunomoduladores dos inibidores de PDE4 são úteis durante pneumonia pneumocócica grave e sugerem o seu potencial como terapia adjuvante nesta infecção. Pneumococcal pneumonia is a leading cause of mortality worldwide. The inflammatory response to bacteria is necessary to control infection but the permanence and excessive activation of neutrophils in the lungs may cause tissue damage. Phosphodiesterase-4 (PDE4) inhibitors, such as rolipram (ROL), effectively reduce inflammation. This study examined the impact of rolipram in a model pneumococcal pneumonia in mice. Balb/C mice were infected intranasally with 103-106CFU of Streptococcus pneumoniae and the kinects of inflammation were evaluated. 104-104 CFU mice were then treated with ROL in a prophylactic or therapeutic schedule in combination or not with the antibiotic ceftriaxone. Inflammation and bacteria counts were assessed and ex vivo phagocytosis assays were performed. Rolipram treatment during S. pneumoniae infection decreased neutrophil recruitment into the lungs and airways and reduced lung injury. Prophylactic ROL treatment also decreased cytokine levels in the airways. Although modulation of inflammation by ROL ameliorated pneumonia, bacteria burden was not reduced. On the other hand, antibiotic therapy reduced bacteria without reducing neutrophil infiltration, cytokine levels and lung injury. Combined ROL and ceftriaxone treatment was more efficient in reducing inflammation, by increasing pro-resolving protein Annexin A1 expression, and reducing bacteria burden, by enhancing phagocytosis. Furthermore, annexin A1 deficient mice are more susceptible to pneumococcal pneumonia. These data show that immunomodulatory effects of PDE4 inhibitors are useful during severe pneumococcal pneumonia and suggest their potential benefit as adjunctive therapy during infectious diseases

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Outra Agência Doenças infecciosas é uma significativa causa de morte e, infecções bacterianas aparecem entre as 10 principais causas de mortes no mundo. Os fungos também podem causar graves infecções, especialmente em pessoas imunossuprimidas. No entanto, apesar de existir um grande arsenal de antimicrobianos como os antibacterianos e antifúngicos é importante o desenvolvimento de novos fármacos, considerando-se o aparecimento de linhagens resistentes aos medicamentos existentes. Os peptídeos com atividade antimicrobiana, encontrados em diversos organismos multicelulares, são potenciais candidatos para modelos de novos antibióticos. Neste trabalho o peptídeo antimicrobiano denominado LyeTx I, obtido da peçonha da aranha Lycosa erythrognatha, foi utilizado como modelo de estudo. Sintetizou-se, pelo método de Fmoc, um peptídeo representando parte da sequência de LyeTx I, mas com diferentes modificações, obtendo-se três diferentes derivados: LyeTxImn, LyeTxImnΔK e LyeTxImnΔKAc. Estes peptídeos derivados apresentaram diferentes atividades antimicrobianas, bem como diferentes atividades hemolíticas. Esta última é um importante indicador da atividade dos peptídeos antimicrobianos em células de mamífero, isto é, peptídeos com alta atividade hemolítica em geral não são bons candidatos para antibióticos. Dos peptídeos derivados obtidos, somente LyeTxImnΔK foi mais eficaz do que o peptídeo original, LyeTx I, quando seus índices terapêuticos foram comparados.Investigou-se ainda, a estruturação desses peptídeos em meios miméticos tais como trifluoretanol, dodecil sulfato de sódio e dodecil fosfocolina, sendo encontrado padrões de estruturação condizentes com perfis de α-hélice, semelhante ao peptídeo LyeTx I original. Em conclusão, obtivemos por síntese química, um peptídeo menor, derivado da estrutura da toxina original (LyeTxI), com mais alta atividade para alguns fungos e bactérias, menos hemolítico bem como, com menor custo de produção, características fundamentais para um candidato a novo fármaco. Infectious disease is one big cause to death, where bacterium infections show among some 10 mainly death´s causes in the world. Fungi can cause severe diseases too, particularly in imunossupressed people. However, although there are a vast antimicrobial arsenal, as antibiotics antimicrobials and antimycotic against fungi is important to develop new medicines, considering the growing of resistence by microorganisms. Antimicrobial peptides found in many multicellular organisms could be good candidates to this aim. In this work, the antimicrobial peptide, LyeTx I, from the spider Lycosa erythrognatha´s venom was used as a model. Part of this molecule (LyeTxI minimized) was synthesized by the Fmoc method. Three derivatives were obtained: LyeTxImn, LyeTxImnΔK and LyeTxImnΔKAc. They showed different antimicrobial activities as well as different hemolytic activities. This last activity is an important indicator to verify if the antimicrobial peptide is also active in cells from mammals. A high hemolytic activity is not a good indicator for a peptide as a good antibiotic. But only LyeTxImnΔK was more effective than the native peptide (LyeTx I), when compared therapeutic index among them. The structuration of these peptides was also investigated in mimetic media such as trifluorethanol, sodium dodecyl sulfate and dodecyl phosphocholine, being found structuration patterns consistent with α-helix profiles, similar to the original peptide LyeTx I. Therefore, was possible the synthesis of a peptide derivative from the a spider toxin LyeTxI with higher antimicrobial activities, as well as with lower production cost, some, essential characteristics to a candidate to newtherapeutic drugs.

A interação complexa entre o Plasmodium spp. e o hospedeiro vertebrado e o pouco conhecimento dos mecanismos pelos quais o parasito ativa as células do sistema imune inato contribuem para o limitado entendimento da patogênese da malária. Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico o principal foco de infecção do Plasmodium spp. Entretanto o papel destas células conferindo resistência ou induzindo dano tecidual é pouco compreendido. Assim este trabalho teve como objetivo avaliar o papel dos neutrófilos na patogênese da malária. Inicialmente foi observado elevadas concentrações de citocinas pró-inflamatórias nos plasmas de pacientes infectados com P. vivax, porém apesar do aumento do número de neutrófilos no sangue periférico durante a infecção estas células não são responsáveis pela produção destas citocinas. Entretanto foi demonstrado que os neutrófilos de pacientes com P. vivax estão altamente ativados durante a malária através da elevada produção de espécies reativas de oxigênio, mieloperoxidase, do aumento da expressão de genes estimulados por interferon (ISGs) e da alta frequência de neutrófilos de baixa densidade. Em humanos, essa assinatura transcricional de ISGs correlacionou com elevadas concentrações séricas de aminotransferases que indicam um dano hepático. Utilizando um modelo experimental murino de infecção foi observado que o recrutamento de neutrófilos para o fígado durante a infecção, assim como a produção de IL-1 e de quimiocinas são dependentes da sinalização por interferon do tipo I. Portanto este trabalho demonstra que interferon do tipo I tem um papel crucial na ativação de neutrófilos e consequentemente na indução de danos teciduais durante a malária. The complexity of parasite-host interactions and the limited knowledge of the mechanisms by which Plasmodium spp. trigger innate immune cells are the main impediments in understanding the pathogenesis of malaria. Neutrophils are the most abundant leukocyte population in the bloodstream, a main site of Plasmodium sp. infection. Yet, the role of these polymorphonuclear cells in mediating either resistance or pathogenesis of malaria is poorly understood. Here, we report that malaria patients display higher levels of plasma cytokines and although we found an increased number of circulating neutrophils in malaria patients, they are not responsible for this elevated production. We show that monocytes are the primary source of cytokines during P. vivax infection. Besides that, we demonstrated that neutrophils from malaria patients are highly activated, as indicated by type I interferon transcription signature, increased expression of surface activation markers, myeloperoxidase and release of reactive oxygen species, as well as high frequency of low-density granulocytes subpopulation. In humans, the activation of neutrophils was associated with increased levels of serum alanine and aspartate aminotransferases that indicate liver damage. In a rodent malaria model, we observed an intense recruitment of neutrophils to liver sinusoids. Neutrophil migration, caspase-1 activation, IL-1 and chemokines expression as well as liver damage were all dependent on type I interferon signaling. Thus, type I interferon has pivotal role in neutrophil activation and malaria pathogenesis.

O bagaço de cana-de-açúcar é o resíduo agrícola mais abundante no Brasil e apresenta elevado potencial para ser utilizado na produção de etanol de segunda geração. Entretanto, a grande complexidade da biomassa lignocelulósica requer diferentes enzimas para uma hidrólise eficiente. Neste trabalho, foi realizada a purificação, a caracterização bioquímica, a caracterização cinética e a aplicação na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar de duas xilanases de Aspergillus nidulans clonadas em Pichia pastoris: AN1818.2 e AN3613.2. A indução da expressão dos genes das xilanases foi realizada em meio BMMY contendo metanol, o qual induz a ativação do promotor AOX1, envolvido no metabolismo deste álcool. O sobrenadante do cultivo constitui-se no extrato bruto, o qual foi submetido à cromatografia de afinidade em coluna His Trap HP e, em seguida, à cromatografia de exclusão molecular em coluna Superdex 200. A temperatura ótima de atividade para a xilanase AN1818.2 foi 60 ºC, já para a xilanase AN3613.2 foi 50 ºC. Ambas as enzimas mostraram-se estáveis quando pré-incubadas a 50 ºC e pouco estáveis quando pré-incubadas a 60 ºC. A xilanase AN1818.2 apresentou um pH ótimo de atividade de 7,5 e a xilanase AN3613.2 apresentou melhor atividade em pH 6,0. Ambas as xilanases foram altamente estáveis quando pré-incubadas durante uma hora em tampões na faixa de pH de 2,5 a 13 e retornadas ao pH 5,0. As enzimas AN1818.2 e AN3613.2 foram fortemente inibidas por HgCl2, SDS, CuSO4 e xilotriose. A xilanase AN1818.2 hidrolisou melhor o substrato arabinoxilana de trigo e a xilanase AN3613.2 o substrato xilana beechwood. O valor de Km utilizando xilana beechwood como substrato foi de 1,66 e 4,23 mg/mL para as xilanases AN1818.2 e AN3613.2, respectivamente. A hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar com o coquetel Multifect CL Genencor® foi mais eficiente quando suplementada com a xilanase AN1818.2 em combinação com a xilanase AN3613.2. Já a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar com o coquetel Accellerase 1500 Genencor® foi mais eficiente quando suplementada apenas com a xilanase AN3613.2. Sugarcane bagasse is the most abudant agricultural waste in Brazil and has a high potential to be used in the production of second generation ethanol. However, the high complexity of lignocellulosic biomass requires different enzymes for efficient hydrolysis. In this study, two xylanases from Aspergillus nidulans, AN1818.2 and AN3613.2, cloned in Pichia pastoris were purified, biochemically characterized, kinetically characterized and applied in sugarcane bagasse hydrolysis. BMMY medium was used to induce xylanases gene expression. This medium contains methanol, which induces AOX1 promoter, involved in methanol metabolism. The enzymatic extract was submitted to affinity (His Trap HP) and gel filtration (Superdex 200) chromatographies. Xylanase AN 1818.2 is optimally active at 60 oC and in pH 7,5. AN3613.2 was optimally active at 50 oC and in pH 6,0. Both xylanases were higly thermostable at 50 oC and in pH range from 2,5 to 13 and less stable at 60 oC. HgCl2, SDS, CuSO4 and xylotriose inhibited enzymatic activities. Wheat arabinoxylan was the best substrate for AN1818.2 hydrolysis and AN3613.2 is better suitable for beechwood xylan hydrolysis. Km for AN1818.2 and AN3613.2 was 1,66 and 4,23 mg/mL, respectively, using beechwood xylan as substrate. Sugarcane bagasse hydrolysis with Multifect CL Genencor® was more efficient when xylanase AN1818.2 was added with xylanase AN3613.2. Sugarcane bagasse hydrolysis with Accellerase 1500 Genencor® was more efficient when only xylanase AN3613.2 was added.

O receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) ao entrar em contato com seus ligantes é ativado e se torna capaz de gerar diversos sinais como proliferação, diferenciação, migração e sobrevivência celular. Estudos recentes demonstram que o EGFR ativado pode gerar efeitos intranucleares, consistindo assim um novo modo de sinalização. A superexpressão desse receptor no núcleo está relacionada com a resistência ao tratamento e com a presença de tumores mais agressivos. Visto que os dados recentes demonstram a importância do EGFR nuclear para a sinalização tumoral, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a translocação nuclear do EGFR estimulada pelos ligantes EGF, HB-EGF, TGF-, -celulina, Anfiregulina e Epiregulina. Foram utilizadas células endoteliais de tumor hepático humano SKHep-1, as quais expressam altos níveis de EGFR. Observamos que ocorre translocação de EGFR após estímulo com EGF, HB-EGF, TGF- e -celulina e quanto maior a concentração do estímulo, maior a taxa de translocação nuclear do receptor. Os ligantes epiregulina e anfiregulina não geraram a translocação nuclear do EGFR. A ativação de tirosinas, serinas e treoninas na cauda carboxiterminal do EGFR foi avaliada por western blot após estímulo com 100 ng/mL de cada ligante e observou-se um perfil diferencial de fosforilação em vários resíduos específicos. Em geral, os ligantes que fosforilaram menos sítios foram epiregulina e anfiregulina. O teste de migração celular foi realizado para avaliar se os ligantes de EGFR eram eficientes na cicatrização de ferida em monocamada celular. Os ligantes EGF, HB-EGF, -celulina, TGF- e epiregulina apresentaram maior taxa de fechamento da ferida quando comparados aos grupos sem soro e anfiregulina. Por fim, o ensaio de curva de crescimento e o ensaio de clonogenicidade indicaram que os ligantes não foram capazes de gerar o crescimento celular e a formação de colônias, quando utilizados isoladamente em meio sem soro. Estes dados indicam que o EGFR é translocado para o núcleo após estímulo por EGF, HB-EGF, TGF-, -celulina e que estes mesmos ligantes geram maior perfil de fosforilação em resíduos de tirosina na cauda carboxiterminal do EGFR. The epidermal growth factor receptor (EGFR) once in touch with their ligands is activated and becomes able to generate a range of signals such as proliferation, differentiation, migration and cell survival. Recent studies demonstrated that the activated EGFR can generate intranuclear effects, giving rise a new signaling mode. The receptor overexpression in the nucleus is related with tumor treatment resistance and it agressiveness. Since recent data show the importance of nuclear EGFR for tumor signaling, this study aimed to evaluated the nuclear translocation of EGFR stimulated by the ligands EGF, HB-EGF, TGF-, -cellulin, Amphiregulin and Epiregulin. For that, we used the hepatic human endothelial tumor cells - SKHep-1, which express high levels of EGFR. We observed that translocation to the nucleus happens after stimulation with EGF, HB-EGF, TGF- and -cellulin and the higher the concentration of stimulus, the greater the rate of nuclear translocation. The ligands Amphiregulin and Epiregulin did not generate nuclear translocation of EGFR. The activation of tyrosines, serines and threonines in the carboxiterminus of EGFR were evaluated by western blot after stimulus with 100 ng/mL of which ligand and we observed a different profile of phosphorylation of specific residues. In general, the binding sites that are less phosphorylated are the ones stimulated by the ligands Amphiregulin and Epiregulin. The cellular migrations experiment was performed to evaluate whether the EGFR ligand were efficient in the wound healing in the cell monolayer. The ligands EGF, HB-EGF, TGF-, -cellulin and Epiregulin showed a higher wound closure rate when compared with the groups Amphiregulin and serum free. Finally the growth curve and the clonogenic assay indicated that the ligands were not able to generate cellular division and colony formation when used alone in the serum free medium. All together, these data indicated that EGFR is translocated to the nucleus after stimulation with EGF, HB-EGF, TGF- and -cellulin and the same ligands generate more phosphorylation of tyrosines in the carboxiterminus of EGFR.