In this work we studied the bacterial community obtained from water samples collected in Kandalaksha Bay (White Sea), Russia in order to obtain information both at the ecological level and for possible future application in biotechnology. The study has been carried out both on cultivable strains, isolated by traditional methods, and on the total bacterial (Eubacteria) community by molecular methods. The isolates were preliminary investigated in order to understand their temperature preferences then their metabolic competences, including the production of extracellular enzyme activities, were tested for possible further biotechnological applications. Furthermore, a detailed taxonomical study was carried out both on cultivable and total bacterial population Strain isolation and preliminary tests Sea water was sampled in various areas of Kandalaksha Bay. The majority of samples were collected, at minimum tide level using sterile containers, in an intertidal zone pool and from the adjacent water surface. Others, from different offshore locations and depths (0.5, 2.5, 15, 70 m), were taken by scuba divers or boats using Niskin bottles. Water was filtered on membranes in order to obtain both bacteria pure cultures and DNA for molecular to studies. Pure cultures of isolates (ca. 500) were obtained by plate streak method. To discharge evident replicates of same isolates, preliminary tests were carried out considering strain morphological characteristics (shape, color and dimensions), Gram reaction and simple biochemical tests (catalase and oxidase production). This preliminary selection permitted to remove the majority of replicates and to keep 52 isolates. Taxonomical identification of isolates by 16S rDNA 2 Bacterial genomic DNA was extracted from pure cultures and used for amplification of 16S rDNA, to allows taxonomical identification of each isolate. Only 20 strains out of 52 (ca. 38%), showing high identity (99-100%) with a single known microorganism, were identified at species level. All other isolates were identified at the genus level only: for most of them, affiliation was not possible because 98-99% of identity was recorded with various species of the same genus. Moreover 3 strains showed a very low percentage of identity (96-97%). The majority of sequences were phylogenetically related to the genera Pseudomonas and Serratia that are well worldwide distributed. However, only a typical bacteria of cold marine environment Shewanella baltica (KB30) have been revealed. When Blastn analyses supplied uncertain identification, sequences were aligned with highly similar 16S in the Genbank and phylogenetic analysis was performed. To get a confident branch-length, three different trees, Pseudomonas, Serratia and a group containing all the other genera, were inferred. Basing on the results some of the strains were identified with certainty at species level while some others, due to the branch length or the external position, probably belonged to new species. For all other strains identification was possible at genus level only. In many cases this could be due to the scarce informative power of the gene target used to discern the relations below the genus level. Temperature growth profiles The optimal temperatures for growth of the various strains were tested in the range 0-45°C on PCA plates (steps of 5 °C). Most of the strains (42% ca.) showed the optimum at 30°C. The lowest optimum was recorded at 15°C for one strain only (KB75), while the highest was at 40°C (KB22 and KB49). Most of the strains (56%) were able to growth at 0°C while only 25% grew at 45°C.In addition, the majority were able to grow in a rather broad range of temperature. The majority of the isolates (42%) seems to be psychrotrophics while no psychrophiles were detected. Almost all the strains could be considered as eurythermics, 3 indicating adaptation to frequent and wide temperature variations such as those of Kandalaksha Bay. Moreover, it was evident that many KB strains had wider ranges of growth if compared with same species described in literature; optima were also different. Extracellular enzyme activity The strains where submitted to plate screening for the production of various extracellular enzyme activities (amylase, cellulase, chitinase, pectinase, phosphatase, protease, urease, lipases), at their optimal temperature, in order to obtain metabolic information and to find new microorganisms for possible applications. Lipases, phosphatase and protease were common (ca. 54% and 44% of the isolates, respectively). Pectinase and amylase were present in about 32 % of the strains, while chitinase and urease were detected in a limited number of isolates (17% both); cellulase was not detected. Organisms producing large halos of activity were considered as possible high producers and could be further investigated for biotechnological application. However, none of the isolates produced all the tested activities and a rather large number of strains (17%) produced no activity at all. The results of the screening could be useful also at ecological level. In fact, the isolates producing a limited number of enzymes could be considered as specialized, while those with more diversified enzymatic competence, showing a higher eco-nutritional versatility, are probably advantaged in the harsh White Sea environment. Metabolic competences by BIOLOG system The BIOLOG system was used to test the metabolic competences of the strains by their ability to use different compounds as carbon sources. The system is able to detect the oxidation of 95 compounds (including sugars, fatty, organic amino and acids), used by microorganisms as sole carbon sources.In our case, amino acids were generally the preferred compounds: the most utilized carbon sources were L-Glutamic Acid and L-asparagine (96% of strains). Also use of sugars was, as expected, rather common, being α-D-Glucose oxidized by ca. 92%of strains. The information obtained by BIOLOG could be considered as an index 4 regarding the strain metabolic complexity. A small number of strain apparently showed a rather simple metabolism being using a limited number of carbon sources and only few showed a very diversified metabolic competence. However, the majority of the bacteria tested used about 30-50 compounds showing medium-high competence. In general, the strains able to use a wide array of carbon sources were also able to produce diversified extracellular enzyme patterns confirming their high eco-nutritional versatility. Study on the total bacterial (Eubacteria) community In order to have a complete overview of the bacterial community structure, by a cultivation-independent approach, total DNA was extracted from the filter-membranes. The bacteria biodiversity was studied by PCR-TGGE fingerprinting of partial 16S-rRNA gene amplicons. TGGE band patterns were normalized, compared and clustered. showed The community structure was revealed by the cluster analysis of the fingerprints. Samples collected both from the intertidal zone and the nearby sea surface, grouped together (80% similarity). Samples from open sea clearly clustered away. This was particularly evident for the sample collected at -70 m, which branched away at only 40% similarity. TGGE gel images allow the analysis of band patterns generated from the environmental samples representing the various species present in the community. A single species is identified by a single band and the relative abundance of a single species is determined by the band intensity. Among the KB samples, a total of 70 different banding positions (band classes) were detected. The average number of bands per sample was 26 with a maximum of 30 in the samples from open sea. Simpson's Diversity Index calculated for all the samples showed very high level of diversity. Based on the total number of bands in each TGGE pattern and the relative temperature gradient, range-weighted richness indexes (Rr) were calculated and indicated a very high community biodiversity. Relative bands intensities were also calculated and expressed as percentages of the total band intensity in each TGGE lane. To render a graphic representation of the bacterial communities evenness, Pareto-Lorenz distribution curves were drawn based on the intensities. 5 The functional community redundancy (response to perturbing environmental conditions) is evaluated by the Functional organization index (Fo) considering curves slope. Results showed a balanced community with medium Fo and a medium evenness. In other words, due to the elevated concentration of some species and the availability of many others, the community can potentially deal with environmental conditions changes thus preserving its functionality. Prominent TGGE bands were excised from the gel, re-amplified and sequenced, to obtain the identities of the community predominant populations. Sequences phylogenetic analysis, showed a great presence of α-proteobacteria (16 sequences out of 27) with some γ-proteobacteria and some actinobacteria too. Some cyanobacteria were revealed also. Among α -proteobacteria strains can be affiliated mainly to the genus Roseobacter and one sequence was related to Ruegeria. All γ-proteobacteria showed highly similarity with the species of Cobetia marina, while all the cyanobacteria were unknown. Taxonomic results obtained by the total community study were quite different from those gained by the pure cultures: the pure culture strains were completely different (genera and species) from those by 16S rDNA analysis. This could be explained by the limits of TGGE technique. In fact, due to the bias introduced by the PCR reaction, this methodology can only detect bacteria representing at least 1% of the total community. It is possible that some species, even if present in a very low percentage, had prevailed due to favorable culture conditions of the isolation procedures. However, it is known that a large number of marine bacteria are uncultivable. Another important information was that some bands showed very low sequence identity if compared with sequences present in the database, suggesting the possible presence of unknown bacteria. Study on Pseudomonas species present in the community In the TGGE gel relative to the total bacterial community, no Pseudomonas species were revealed. By contrast, the majority (ca. 45%) of the cultivable KB strains were affiliated to 6 this genus. In order to find possible explications to this apparent incongruity, further TGGE analyses have been carried out focusing on Pseudomonas. Thus, total DNA was used for PCR-TGGE fingerprinting of partial 16S-rRNA gene amplicons using specific primers for the amplification of this Genus and different temperature gradients. Again, prominent TGGE bands, excised from the gel, were re-amplified and sequenced. The phylogenetic analysis showed that only 6 sequences out of 22 can be affiliated to Pseudomonas. Although the primers used were specific for this genus, possible amplification of other similar 16S rDNA (in particular γ-proteobacteria) could occur. In fact, a big cluster, comprising the majority of the sequences, showed very low similarity with Pseudomonas but high similarity with clones of marine invertebrates symbiotic γ-proteobacteria. It is possible that some new genera and/or species were present in our samples. TGGE patterns were normalized, compared and clustered as reported for the total bacteria community. Cluster analysis of the fingerprints was similar to that obtained for total community. However, in this case sample collected at -70 m, was even more clearly separated from all the others samples: similarity was only 20%. Analysis of bands number allowed to detect a total of 26 different banding positions All the statistical indexes, discussed for total bacteria and related to community diversity and organization, in this case are meaningless because they would refer only to a limited portion of the entire population. To the best of our knowledge, this work represents the first and extensive study carried out on Kandalaksha Bay bacterial community. In questo lavoro di tesi è stata studiata la comunità batterica di campioni di acqua marina prelevati nella Baia di Kandalaksha (Mar Bianco), Russia. Lo studio è stato condotto con lo scopo di ottenere informazioni a livello ecologico ma anche per possibili applicazioni biotecnologiche. Per queste ragioni sono stati analizzati sia i ceppi isolati con metodi di microbiologia tradizionale sia la comunità batterica totale con metodi di biologia molecolare. Sui ceppi isolati sono stati condotti studi sulle preferenze di temperatura per la crescita e sulle competenze metaboliche, quali produzioni di enzimi extracellulari, per possibili applicazioni. Inoltre una dettagliata analisi tassonomica è stata condotta sia sui ceppi coltivabili che sulla comunità totale. Isolamento dei campioni e test preliminari I campioni di acqua marina sono stati prelevati in varie zone diella Baia di Kandalaksha. La maggior parte di essi sono stati ottenuti da una pozza di acqua formatasi dal ritirarsi delle acque nella zona intertidale e dalla superficie del mare ad essa adiacente. Altri campioni, da differenti punti a largo sono stati prelevati con bottiglie Niskin a varie profondità (0.5, 2.5, 15, 70 m). L’acqua è stata poi filtrate e i filtri sono stati utilizzati per l’isolamento di colture pure e per studi di biologia molecolare. Gli isolati ottenuti in coltura pura per strisciamento (ca. 500) sono stati sottoposti a scrematura. Per scartare eventuali doppi ceppi sono state osservati forma, colore e aspetto delle colonie e vari test, tra cui colorazione di Gram e test per catalasi e ossidasi, sono stati effettuati. Questa selezione ha permesso di ottenere 52 ceppi finali che sono stati mantenuti per i successivi studi. 2 Identificazione tassonomica dei ceppi tramite il gene del 16S rRNA Il DNA genomico delle colture pure è stato estratto ed utilizzato per l’ amplificazione del gene del 16S rRNA in modo da permettere l’identificazione tassonomica dei ceppi. Solo 20 ceppi su 52 (ca. 38%) sono stati identificati a livello di specie: infatti mostravano un’alta percentuale di identità con un solo microrganismo. Tutti gli altri ceppi avevano un’identità di circa 98-99% con varie specie dello stesso genere, per questo sono stati identificati solo a livello di genere. Infine 3 ceppi avevano identità molto basse (96-97%). La maggior parte delle sequenze sono state identificate come ceppi dei generi Pseudomonas and Serratia, generi piuttosto ubiquitari, mentre è stato trovato un solo ceppo tipicamente marino Shewanella baltica (KB30). Per i ceppi per cui l’analisi in banca dati non ha permesso un’identificazione certa, è stata effettuata un’analisi filogenetica basata sull’allineamento delle sequenze del 16S con le sequenze più simili presenti in banca dati. Per ottenere una migliore risoluzione sono stati costruiti differenti alberi filogenetici per i generi Pseudomonas e Serratia ed uno per tutti gli altri generi. Sulla base dei risultati alcuni ceppi sono stati identificati a livello di specie mentre altri potrebbero appartenere a nuove specie. Comunque per molti ceppi l’identificazione è stata possibile solo a livello di genere probabilmente a causa di una scarso livello di specie-specificità del gene utilizzato. Temperature ottimali e range di crescita Le temperature di crescita dei vari ceppi sono state testate nel range 0-45°C su piastre di PCA (steps di 5 °C). La maggior parte (42% ca.) mostrava un optimum a 30°C. L’ optimum più basso è stato registrato per il ceppo KB75 (15°C), mentre KB22 e KB49 avevano quello più alto (40°C). Molti ceppi (56%) erano in grado di crescere a 0°C mentre solo il 25% cresceva a 45°C. La maggior parte di essi poteva essere considerato psicrotrofo e quasi tutti erano euritermi, indicando capacità di adattamento alle frequenti e repentine variazioni di temperatura di Kandalaksha Bay. 3 Enzimi extracellulari Con lo scopo di ottenere informazioni metaboliche ed individuare ceppi di interesse biotecnologico, è stato effettuato uno screening in piastra per varie attività enzimatiche extracellulari (amilasi, cellulasi, chitinasi, pectinasi, fosfatasi, proteasi, ureasi, lipasi). Lipasi, fosfatasi e proteasi erano abbastanza comuni (ca. 54% e 44% dei ceppi, rispettivamente). Pectinasi e amilasi erano presenti in circa il 32 % dei ceppi mentre chitinasi e ureasi sono state rilevate in un numero limitato (17%); la cellulasi non era prodotta da nessun ceppo. Alcuni ceppi che hanno prodotto aloni di attività particolarmente grandi possono essere considerati alto-produttori e verranno studiati ulteriormente per eventuali applicazioni biotecnologiche. Dal punto di vista ecologico lo screening ha mostrato la presenza di ceppi che possono essere considerati altamente specializzati perché in grado di produrre un numero limitato di attività, mentre altri, presentando una competenza enzimatica più elevata potrebbero essere ecologicamente avvantaggiati nelle estreme condizioni ambientali presenti nel Mar Bianco. Competenze metaboliche tramite il sistema BIOLOG Il sistema BIOLOG è stato utilizzato per saggiare le competenze metaboliche dei ceppi attraverso la capacità di ossidare differenti composti come fonte di carbonio. Il sistema è in grado di stabilire l’ossidazione di 95 composti, tra cui zuccheri, acidi organici e amino acidi come unica fonte di carbonio. In generale gli amminoacidi erano la fonte preferita: l’acido L-Glutammico e l’Asparagina erano i composti più utilizzati (96% dei ceppi). Anche gli zuccheri, in particolare l’ α-D-Glucosio (92% dei ceppi) erano abbastanza comuni. Sono state inoltre ottenute informazioni sulla complessità metabolica: la maggior parte dei ceppi hanno dimostrato una capacità metabolica elevata in quanto erano in grado di ossidare circa 30-50 fonti. Confrontando i dati con quelli ottenuti per le attività enzimatiche è stato possibile confermare la loro elevata capacità eco-nutrizionale. 4 Studio della comunità batterica(eubatteri) totale La biodiversità della comunità totale è stata studiata con metodi non-colturali tramite la tecnica di PCR-TGGE fingerprinting basata sull’analisi del gene 16S-rRNA. Il DNA totale è stato estratto dalle membrane e frammenti amplificati del 16S sono stati separati tramite elettroforesi su gel di polyacrilammide sottoposto a differente gradiente termico. I profili di banda ottenuti dai vari campioni sono stati analizzati tramite analisi di cluster. I campioni relativi alla pozza d’acqua della zona intertidale e della superficie marina ad essa adiacente sono risultati piuttosto simili mentre i campioni presi a varie profondità raggruppavano in clusters separati, in particolare il campione preso a -70m che presentava un similarità minore al 40% rispetto a tutti gli altri. I profili sono stati poi analizzati per lo studio delle bande che rappresentano le varie specie di batteri presenti nei campione. Sono state individuate un totale di 70 classi di bande in tutti campioni, con una media di 26 nei campioni di zona intertidale ed un massimo di 30 nei campioni di profondità. In tutti i campioni la biodiversità è stata calcolata con l’indice di diversità di Simpson e con l’indice di ricchezza ponderata. In entrambi i casi i valori di biodiversità erano molto alti per tutti i campioni analizzati. La rappresentazione grafica delle intensità relative delle bande in ogni area di campionamento è stata effettuata tramite le curve di Pareto-Lorenz. Tramite queste curve è stato possibile anche calcolare l’organizzazione funzionale della comunità (risposta a perturbazioni ambientali): la struttura della comunità è risultata piuttosto equilibrata e con un valore medio-alto di organizzazione funzionale. Le bande preminenti presenti dei vari profili sono state escisse, riamplificate e sequenziale per ottenere l’affiliazione tassonomica delle specie tramite costruzione di alberi filogenetici. L’analisi ha permesso di individuare una grande presenza di α-proteobatteri (16 sequenze su 27) tra cui principalmente batteri appartenenti al genere Roseobacter. Erano presenti anche specie di γ-proteobatteri tutte riconducubili alla specie Cobetia marina. E’ stata rilevata anche una sequenza relativa agli attinobatteri e alcune relative a vari ciano batteri non coltivabili. In 5 generale alcune bande avevano una similarità bassa con le specie presenti nell’albero. E’ dunque possible ipotizzare la presenza di nuove specie. Studio delle specie di Pseudomonas presenti nella comunità Vista la grande presenza tra i ceppi coltivabili di specie di Pseudomonas, un ulteriore analisi della comunità tramite PCR-TGGE è stata effettuata utilizzando primers specifici per questo genere. Le bande preminenti sono state amplificate, sequenziate e utilizzate per l’analisi filogenetica. Solo 6 sequenze su 22 sono state affiliate a Pseudomonas: nonostante i primers fossero specifici per questo genere tuttavia possono portare all’amplificazione di 16S simili come quelli di altri γ-proteobatteri. L’analisi di cluster dei profili di banda anche in questo caso ha evidenziato similarità tra i profili dei campioni presi nella zona intertidale, mentre i campioni di mare profondo erano in gruppi esterni. L’analisi di biodiversità in questo caso non è stata effettuata in quanto si sarebbe riferita solo ad una porzione limitata della comunità totale e dunque non rilevante. Sulla base delle nostre conoscenze, è possibile affermare che questo lavoro rappresenta il primo studio dettagliato della comunità batterica della Baia di Kandalaksha. Dottorato di ricerca in Scienze ambientali