Search

Lesitin Kolesterol Açil Transferaz (LCAT) kolesterol hemostazını sağlayan ve kanda taşınmasını düzenleyen anahtar enzimdir. LCAT’nin görevi yüksek dansiteli lipoprotein-kolesterol (HDL-K)’deki kolesterolü kolesteril esterlerine çevirerek dokulardan HDL’ye kolesterol hareketini sağlamaktır. Ayrıca kolesterol ters taşınmasında önemli bir enzim olarak plazmadan karaciğere kolesterol taşınmasını ve karaciğerdeki kolesterol yıkımını düzenler. HDL-K düzeyinin yanı sıra fonksiyonunun da önemli olduğu son çalışmalarda görülmüştür. Bu çalışmada lipid metabolizmasında Türkiye’de sık görülen ve iyi kolesterol olarak bilinen HDL-K’nin düşüklüğünün muhtemel sebeplerinden biri olan LCAT, gen ve enzim düzeyinde incelenmiştir. Çalışma için plazma HDL-K düzeyleri düşük (HDL-K 35) sağlıklı 50 kişi ve HDL-K düzeyleri yüksek (HDL-K 65) sağlıklı 50 kişi seçildi. Her iki gruba dahil bireylerde beden kütle indeksi (BKİ), sigara ve alkol tüketimi, aile hikayesi sorgulandı ve kan lipid profilleri incelendi. Çalışma RFLP genotiplemesi, LCAT enzim aktivitesi ve ELISA ile enzim düzeyi olmak üzere üç aşamalı olarak planlandı. İlk aşamada RFLP analizinde LCAT geninde Exon 4’te 511C/T, Exon 5’te 608C/T ve Exon 6’da 4886C/T polimorfizmleri çalışıldı. LCAT enzim aktivitesi ve ELISA plazmada bakıldı. 4886C/T ve 608C/T polimorfizmleri Hardy Weinberg uyumluydu. Literatürden farklı olarak 4886 C/T polimorfizmi HDL-K seviyeleriyle istatistiksel anlamlılığa sahipti (p=0.05). Diğer iki polimorfizmin HDL-K ile ilişkisi istatistiksel olarak anlamlı değildi. Literatür ile uyumlu olarak çalışmamızda LCAT aktivitesinin HDL seviyesi düşük grupta daha düşük (p=0.04), LCAT düzeylerinin de HDL seviyesi düşük gruplarda daha düşük (p=0.05) olduğu görülmektedir. Yeni bir bulgu, LCAT düzeyi ile TG (p=0.01) Total kolesterol (p=0.000), LDL (p=0.001) ve BKİ (p=0.000) arasında da pozitif ilişki bulunmasıydı. Çalışmamızda aktivite, enzim düzeyi ve genetik varyasyonun HDL fonksiyonu ve düzeyine ışık tutabileceği gösterilmiştir.Anahtar kelimeler: Enzim aktivitesi, kolesterol, lipoprotein, polimorfizmABSTRACTLecithin cholesterol acyltransferase (LCAT) is one of the key enzymes controlling cholesterol hemostasis and transport. LCAT maintains cholesterol efflux from tissues by converting the cholesterol content of High Density Lipoprotein Cholesterol (HDL-C) to long chain cholesteryl esters. Furthermore it accentuates ‘reverse cholesterol transport’ from plasma to liver, and induces cholesterol degradation. LCAT enzyme is a potential cause for low HDL-C. LCAT may also modify HDL-C function. The aim of this study was to investigate whether LCAT polymorphisms, LCAT activity and mass separately or together had an effect on reverse cholesterol transport and low HDL-C. Healthy subjects (N=50) with high HDL-C levels (HDL-C>65) and subjects (n=50) with low HDL levels (HDL

GADD45 gen ailesi hücrede DNA hasarına cevap oluşturulması ve hücre bölünmesinin durdurulması süreçlerinde etkili olan, nükleer proteinler GADD45?,ß ve ?' yı kodlar. Her üç GADD45 gen ailesi üyesi de MTK1 kinazı aktive ederek p38/c-jun-NH2-kinaz aktivasyonunu ve apoptozu indüklemektedir. Yapılan çalışmalarda GADD45?'nın tümör hücrelerinin koloni oluşturmasını ve bölünmesini baskıladığı gösterilmiştir. Ayrıca birçok kanser türünde GADD45?'nın metile durumda bulunduğu ve metilasyonun ekspresyonu baskıladığı gösterilmiştir. Yapılan çalışmanın amacı hematolojik malignitelerde GADD45? promotorunun metilasyon durumunun belirlenmesi ve metilasyonun ekspresyona etkisinin saptanmasıdır. Bunun için hemotolojik malignite hücre soylarından ve 117 akut miyeloid lösemi (AML), 94 multipl miyelom (MM) teşhisi konmuş hastadan alınan kan ve kemik iliği örneklerinden DNA izolasyonu yapılmıştır. Bisülfit modifikasyonunun ardından örneklerle metilasyon spesifik polimeraz zincir reaksiyonu (MSP) yapılmıştır. Non-Hodgkin lenfoma hücre serileri L?428 ve L?1236, Burkitt lenfoma hücre serisi Raji hücrelerinde GADD45? promotoru tamamiyle metillenmiş olduğu, AML hücre serileri GDM?1, HL?60, KG1a ve MM hücre serisi OPM?2 hücrelerinde ise kısmen metillenmiş olduğu görülmüştür. İncelenen AML hasta örneklerinde metilasyon saptanmazken 94 MM hasta örneğinden 8'inde metilasyon saptanmıştır. İstatistiksel hesaplamalar sonucunda metilasyon saptanan hastalarda ortalama kalsiyum düzeyinin metilasyon görülmeyenlere oranla daha yüksek olduğu görülmüştür. Ayrıca GADD45?'nın metile durumda olduğu hastaların ortalama sağ kalım sürelerinin 13,7 ay, genin metillenmemiş olarak bulunduğu hastalarda ise bu sürenin 57,1 ay olduğu görülmüştür. Metilasyonun genin ekspresyonuna etkisinin belirlenmesi amacıyla hücre soyları DNA metiltransferaz (DNMT) inhibitörü DAC ile 96 saat boyunca inkübe edilmiş ve RT-PCR uygulanmıştır. GADD45? promotorunun tamamiyle metillenmiş durumda bulunduğu L?1236 hücrelerinde DAC uygulaması sonrası genin ekspresyonunda değişiklik olmazken, Raji, L?428, HL?60, KG1a, OPM?2 hücrelerinde DAC uygulaması sonrası genin ekspresyonunda artış gözlemlenmiştir. Elde edilen bulgular hemotolojik malignitelerde GADD45? geninin tümör tipine bağlı olarak epigenetik mekanizmalarla sessizleştirilebileceğini göstermiştir. GADD45 gene family encodes the nuclear proteins, GADD45?, ß and ?, which response to damage in DNA in a cell and stopping cell proliferation. It has been shown from the research conducted in recent years that GADD45? suppresses the colony formation and proliferation of tumor cells.The purpose of this study is to determine the methylation state of GADD45? promoter in hemotologic malignities and the effect of methylation on expression. Therefore, DNA isolation is performed on blood and bone marrow samples of 117 acute myeloid leukemia (AML), and 94 multiple myelom (MM) patients and hematologic malignency cell lines . After the bisulfide modification of DNA, methylation specific polymerase chain reaction (MSP) has been performed on the samples. It has been found that, in Hodgkin lymphoma cell lines L-428 and L-1236 and Burkitt lymphoma cell lines Raji, GADD45? promoter was fully methylated. However in AML cell lines GDM-1, HL-60, KG1a and MM cell lines OPM-2 , GADD45? promoter has been found to be partially methylated. No methylation was found in AML patient samples whereas 8 of of 94 MM patient samples show promoter methylation. The survival time of the patients with methylated GADD45? is 13.7 months, whereas the survival time of the patients with unmethylated GADD45? is 57.1 months. In order to understand the effect of methylation on the gene expression, the cell lines were treated with DNA methyltransferase inhibitor (DAC) for 96 hours and then real-time polymerase-chain reaction (RT-PCR) was performed. In L-1236 cells where GADD45? promoter was fully methylated, there has been no change in gene expression after DAC treatment whereas in Raji, L-428, HL-60, KG1a and OPM-2 cells, an increase in gene expression has been observed after DAC treatment,. The findings of this study indicate that in hemotoligic malignancies, GADD45? gene may be silenced in epigenetic mechanisms according to the type of tumor. 59

Lesitin Kolesterol Açil Transferaz (LCAT) kolesterol hemostazını sağlayan ve kanda taşınmasını düzenleyen anahtar enzimdir. LCAT'nin görevi yüksek dansiteli lipoprotein-kolesterol (HDL-K)'deki kolesterolü kolesteril esterlerine çevirerek dokulardan HDL'ye kolesterol hareketini sağlamaktır. Ayrıca kolesterol ters taşınmasında önemli bir enzim olarak plazmadan karaciğere kolesterol taşınmasını ve karaciğerdeki kolesterol yıkımını düzenler. HDL-K düzeyinin yanı sıra fonksiyonunun da önemli olduğu son çalışmalarda görülmüştür. Bu çalışmada lipid metabolizmasında Türkiye'de sık görülen ve iyi kolesterol olarak bilinen HDL-K'nin düşüklüğünün muhtemel sebeplerinden biri olan LCAT, gen ve enzim düzeyinde incelenmiştir. Çalışma için plazma HDL-K düzeyleri düşük (HDL-K ? 35) sağlıklı 50 kişi ve HDL-K düzeyleri yüksek (HDL-K ? 65) sağlıklı 50 kişi seçildi. Her iki gruba dahil bireylerde beden kütle indeksi (BKİ), sigara ve alkol tüketimi, aile hikayesi sorgulandı ve kan lipid profilleri incelendi. Çalışma RFLP genotiplemesi, LCAT enzim aktivitesi ve ELISA ile enzim düzeyi olmak üzere üç aşamalı olarak planlandı. İlk aşamada RFLP analizinde LCAT geninde Exon 4'te 511C/T, Exon 5'te 608C/T ve Exon 6'da 4886C/T polimorfizmleri çalışıldı. LCAT enzim aktivitesi ve ELISA plazmada bakıldı. 4886C/T ve 608C/T polimorfizmleri Hardy Weinberg uyumluydu. Literatürden farklı olarak 4886 C/T polimorfizmi HDL-K seviyeleriyle istatistiksel anlamlılığa sahipti (p=0.05). Diğer iki polimorfizmin HDL-K ile ilişkisi istatistiksel olarak anlamlı değildi. Literatür ile uyumlu olarak çalışmamızda LCAT aktivitesinin HDL seviyesi düşük grupta daha düşük (p=0.04), LCAT düzeylerinin de HDL seviyesi düşük gruplarda daha düşük (p=0.05) olduğu görülmektedir. Yeni bir bulgu, LCAT düzeyi ile TG (p=0.01) Total kolesterol (p=0.000), LDL (p=0.001) ve BKİ (p=0.000) arasında da pozitif ilişki bulunmasıydı. Çalışmamızda aktivite, enzim düzeyi ve genetik varyasyonun HDL fonksiyonu ve düzeyine ışık tutabileceği gösterilmiştir. Lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT) is one of the key enzymes controlling cholesterol hemostasis and transport. LCAT maintains cholesterol efflux from tissues by converting the cholesterol content of High Density Lipoprotein Cholesterol (HDL-C) to long chain cholesteryl esters. Furthermore it accentuates `reverse cholesterol transport? from plasma to liver, and induces cholesterol degradation. LCAT enzyme is a potential cause for low HDL-C. LCAT may also modify HDL-C function. The aim of this study was to investigate whether LCAT polymorphisms, LCAT activity and mass separately or together had an effect on reverse cholesterol transport and low HDL-C. Healthy subjects (N=50) with high HDL-C levels (HDL-C>65) and subjects (n=50) with low HDL levels (HDL

ÖZETMESANE KANSERİ TEDAVİSİ İÇİN BAĞIŞIKLIK SİSTEMİNİ EN ETKİLİBİÇİMDE UYARAN MİKOBAKTERİ TÜRÜNÜN BELİRLENMESİGünümüze değin birkaç mikobakteri türü ile yapılan çalışmalarda, mikobakterilerinhücre duvarının hem bağışıklık sistemini uyardığı hem de kanserli hücrelerin öldürülmesindeetkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu çalışmanın konusu, bugüne dek tanımlanmış yüz kadarmikobakteri türü içerisinde, hücre duvarı en fazla bağışıklık sistemini uyaran ve en güçlüantikanser etkiyi gösteren mikobakteri türünü saptamaktır. Mesane tümörleri, yüzeyel vederin olmak üzere kabaca iki sınıfa ayrılırlar. Olguların %70’inde, yüzeyel mesane tümörünerastlanmaktadır. Yüzeyel mesane tümöründe progresyon, bazı risk faktörlerinedayanmaktadır. Bunlardan başlıcaları tümörün evresi, derecesi, sayısı ve boyutudur.Günümüzde intravezikal Bacillus Calmette-Guerin (BCG), yüzeyel mesane tümörlerinintedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır Yüzeyel mesane tümörlerinin tedavisi veönlenmesinde mitomisin C, doksorubisin, epirubisin, valrubisin, tiyotepa, etiglisid gibikemoterapötik ajanlar da kullanılmasına karşın, bu ajanların intravezikal BCG uygulamasıkadar etkin olmadıkları tespit edilmiştir. BCG etkin bir terapötik olmasına karşın, patojenolması ve ölüme kadar uzanan yan etkileri nedeniyle kullanımı sınırlıdır. Daha az toksik vedaha etkili ajanlar üzerinde yoğun olarak çalışılmaktadır. Bunlardan en önemlisiMycobacterium phlei ile yapılan araştırmalardır. M.phlei’nin antitümöral etkinlik göstermesiiçin hücre duvar ekstresi yeterli olmaktadır. Bu bakterinin BCG’ ye benzer immünstimulanetkinliğinin yanında direkt apoptotik etkinliği olduğu da öne sürülmektedir. Ön çalışmalarımızM. phlei hücre duvarının proteinlerce zengin bileşeninin TNF-α (Tümor Nekröz Faktörü Alfa)ve IL-12 (İnterlökin 12) aktivasyonuna yol açtığını göstermiştir. Bu çalışmanın amacıbağışıklık sistemini en güçlü şekilde uyaran, nisbeten daha zararsız, öncelikle mesanetümörlerinde antitümöral etkinlik gösterebilecek hücre duvarına sahip mikobakteri türlerininsaptanmasıdır.Anahtar Sözcükler: Yüzeyel Mesane Tümörü, Mikobakteri Suşları, Hücre ZarBileşenleri, Saflaştırma, Antitümöral Aktivite.ABSTRACTIDENTIFICATION OF THE MYCOBACTERIAL SPECIES THAT STIMULATETHE IMMUNE SYSTEM MOST EFFICIENTLY FOR THE TREATMENT OFBLADDER CANCERAs shown by several studies with several mycobacterium species, the mycobacteriumcell wall is effective in both stimulating the immune system and killing cancer cells byapoptosis. The subject of this study is to identify the most powerful and least harmfulmycobacterium species among approximately one hundred species identified to date, in termsof how they stimulate the immune system and exert anticancerous activity. Bladder tumorsare roughly classified into two groups: superficial and invasive. About 70% of the cases aresuperficial bladder carcinoma. Progression in superficial bladder carcinoma depends onseveral risk factors such as the stage, grade, and size of the tumor and number of tumors.Currently, intravesical (directly into bladder) application of Bacillus Calmette-Guerin (BCG)is used widely in the treatment of the superficial bladder carcinoma. Chemotherapeutic agentssuch as mitomycin C, doxorubicin, epirubicin, valrubicin, thiotepa, etyglycid are used also forthe treatment and prevention of superficial bladder carcinoma, but it was found out that theseagents are not as effective as the intravesical BCG treatment. Despite being an effectivetherapeutic, the pathogenicity and lethal side effects of BCG limits its usage. Intensiveresearch has been carried out to find less toxic and more potent therapeutic agents for thetreatment. Researchers often focus on Mycobacterium phlei as the primary therapeutic agent.The cell wall extract of M. phlei is sufficient for antitumoral activity. This research shows thatthis bacterium has direct apoptotic activity in addition to BCG-like immune-stimulatingeffects. Our preliminary experiments indicate that the fractions rich in cell wall proteins causeactivation of TNF-α ( Tumor Necrosis Factor - Alpha) and IL-12 (Interleukin - Twelve). Thisresearch identifies the most potent and comparatively less harmful mycobacterium speciesthat cause immunostimulation primarily in bladder tumors.Keywords: Superficial Bladder Tumors, Mycobacteria Species, Cell WallComponents, Purification, Antitumoral Activity

Toksik tiroid nodüllerinde (TTN) bugüne kadar bildirilen çeşitli somatik TSHR ve Gs? mutasyon insidanslarındaki farklılıklar ile iyot alımındaki farklılıkların ilişkilendirilmesi mümkündür. Aynı toplumda farklı iyot düzeylerine sahip bölgelerde TTN ile ilgili mutasyonların insidansı belirlenmediği için bugüne kadar iyot ile TSHR yolağında yer alan mutasyonlar arasındaki ilişki henüz açıklanamamıştır. Yapılan bu tez çalışmasında, temel olarak ülkemizde iyotça fakir ve normal guatr bölgelerinde yaşayan hastalardan alınan TTN'lerinde TSHR ve Gs? Mutasyon sıklığı araştırılmıştır.Ellialtı hastaya ait 74 TTN'ünde olası mutasyonların saptanması için TSHR geninin 9. ve 10. ekzonu ile Gs? geninin 7. ve 8. ekzonları DGGE ile taranmıştır. Mutasyon negatif 22 nodülde TSHR geninin 1-8. ekzonları DNA dizi analizi ile incelemiştir. Kadın hastalarda mutasyon pozitif ve negatif nodüllerde klonalite tayini PZR'nu takiben DNA parça analizi ile yapılmıştır. Yeni bulunan mutasyonların işlevsel tanımlamaları COS-7 hücreleri üzerinde gerçekleştirilmiştir.Taranan 74 TTN'nün 52'sinde (%70.2) TSHR mutasyonu bulunmuştur. Sadece bir vakada Gs? mutasyonu tespit edilmiştir. Ayrıca üçü somatik biri ?germline? dört yeni TSHR mutasyonu da (N372T, I486N, A627V ve I640K) tanımlanmıştır. TSHR mutasyonlarının sıklığının dağılımı açısından iyotça fakir (%70) ve normal (%78.9) bölgeler arasında istatistiksel olarak herhangi bir farklılık tespit edilememiştir (p: 0.57). TSHR mutasyonu pozitif (% 69.5) ve negatif (%69.3) sıcak nodüllerde rastgele olmayan X kromozom inaktivasyon sıklığının iyotça fakir (%82.6) ve normal (%75) guatr bölgeleri arasında benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Ayrıca I486N, A428V, A627V ve I640K somatik mutasyonlarının yapısal aktiviteye neden olduğu tespit edilirken N372T ?germline? mutasyonunun herhangi bir yapısal aktivasyona neden olmadığı bulunmuştur.Bu bulgular iyotça fakir ve normal guatr bölgelerinde TTN'nin klonal kökene sahip olduklarını göstermektedir. Elde ettiğimiz sonuçlar ne TSHR mutasyon oranlarının ne de TTN'nin monoklonal köken oranlarının günlük iyot alımı ile ilişkisinin olmadığını ortaya koymaktadır. Bu da büyük bir olasılıkla iyodun TTN'nin moleküler belirteçlerini etkilemekten daha çok tiroid otonomisine yol açan bir süreçte rol aldığını göstermektedir.Anahtar kelimeler: TSHR mutasyonları, iyot eksikliği, toksik tiroid nodülü, klonalite Differences in iodine intake could account for the variable incidence reported for somatic TSH receptor (TSHR) mutations in toxic thyroid nodules (TTNs). However, this question has not been settled, since no study has yet determined the TSHR mutation incidence in regions with different iodine supplies in the same population with the same methodology. Therefore, in this study, the incidance of somatic TSHR mutations in TTNs from patients living in iodine deficient or iodine sufficient regions in Turkey were investigated.Seventy-four TTN samples from 56 patients were enrolled to this study. 9-10. exons of TSHR gene and 7-8. Exons of Gs? gene were screened by DGGE. In 22 Mutation negative TTNs, 1-8. TSHR exons were screened by direct sequencing. Clonality assay was carried out on TTN with/without mutations from female patients by DNA fragment analysis based on PCR. Functional characterisation of new TSHR mutations were performed on COS-7 cell lines.TSHR mutations were identified in 52 (70.2%) of 74 TTNs. Three somatic (I486N, A627V, I640K) and one germ line mutation (N372T), totally four new TSHR mutations were detected in this study. No statistically significant differences for frequencies of TSHR mutations in iodine deficient (70 %) and iodine sufficient regions (78.9 %) were found (x2: 0.751. p: 0.57). The frequency of non-random-X-chromosome inactivation was similar in iodine sufficient or deficient regions and in TSHR mutation positive (69.5 %) or negative (69.3 %) hot nodules. Also it was found that A428V, I486N, A627V and I640K somatic mutations of TSHR have a constitutive activity but N372T germline mutation is lack of constitutive activity.In conclusions, these findings suggest that TTNs in both iodine deficient and iodine sufficient areas predominantly arise from aberrant growth of a single cell. Moreover, this study conclude that neither the frequency of TSHR mutations nor the frequency of a monoclonal origin of TTNs is significantly related to iodine supply in the diet. This would imply that iodine deficiency more likely plays a role in determining the number of events that lead to thyroid autonomy rather than deciding the molecular signature of TTNs.Keywords: TSHR mutations, iodine deficiency, toxic thyroid nodule, clonality. 149

İYOT DÜZEYİNİN FARKLI OLDUĞU BÖLGELERDE HİPERFONKSİYONE TİROİD NODÜLLERİNDE TİROTROPİN RESEPTÖR (TSHR) MUTASYON İNSİDANSININ SAPTANMASIÖZETToksik tiroid nodüllerinde (TTN) bugüne kadar bildirilen çeşitli somatik TSHR ve Gsa mutasyon insidanslarındaki farklılıklar ile iyot alımındaki farklılıkların ilişkilendirilmesi mümkündür. Aynı toplumda farklı iyot düzeylerine sahip bölgelerde TTN ile ilgili mutasyonların insidansı belirlenmediği için bugüne kadar iyot ile TSHR yolağında yer alan mutasyonlar arasındaki ilişki henüz açıklanamamıştır. Yapılan bu tez çalışmasında, temel olarak ülkemizde iyotça fakir ve normal guatr bölgelerinde yaşayan hastalardan alınan TTN’lerinde TSHR ve Gsa Mutasyon sıklığı araştırılmıştır.Ellialtı hastaya ait 74 TTN’ünde olası mutasyonların saptanması için TSHR geninin 9. ve 10. ekzonu ile Gsa geninin 7. ve 8. ekzonları DGGE ile taranmıştır. Mutasyon negatif 22 nodülde TSHR geninin 1-8. ekzonları DNA dizi analizi ile incelemiştir. Kadın hastalarda mutasyon pozitif ve negatif nodüllerde klonalite tayini PZR’nu takiben DNA parça analizi ile yapılmıştır. Yeni bulunan mutasyonların işlevsel tanımlamaları COS-7 hücreleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Taranan 74 TTN’nün 52’sinde (%70.2) TSHR mutasyonu bulunmuştur. Sadece bir vakada Gsa mutasyonu tespit edilmiştir. Ayrıca üçü somatik biri “germline” dört yeni TSHR mutasyonu da (N372T, I486N, A627V ve I640K) tanımlanmıştır. TSHR mutasyonlarının sıklığının dağılımı açısından iyotça fakir (%70) ve normal (%78.9) bölgeler arasında istatistiksel olarak herhangi bir farklılık tespit edilememiştir (p: 0.57). TSHR mutasyonu pozitif (% 69.5) ve negatif (%69.3) sıcak nodüllerde rastgele olmayan X kromozom inaktivasyon sıklığının iyotça fakir (%82.6) ve normal (%75) guatr bölgeleri arasında benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Ayrıca I486N, A428V, A627V ve I640K somatik mutasyonlarının yapısal aktiviteye neden olduğu tespit edilirken N372T “germline” mutasyonunun herhangi bir yapısal aktivasyona neden olmadığı bulunmuştur.Bu bulgular iyotça fakir ve normal guatr bölgelerinde TTN’nin klonal kökene sahip olduklarını göstermektedir. Elde ettiğimiz sonuçlar ne TSHR mutasyon oranlarının ne de TTN’nin monoklonal köken oranlarının günlük iyot alımı ile ilişkisinin olmadığını ortaya koymaktadır. Bu da büyük bir olasılıkla iyodun TTN’nin moleküler belirteçlerini etkilemekten daha çok tiroid otonomisine yol açan bir süreçte rol aldığını göstermektedir. DETECTION OF THYROTROPIN RECEPTOR (TSHR) MUTATION INCIDENCE IN HYPERFUNCTIONING THYROID NODULES FROM THE REGIONS WITH DIFFERENT IODINE STATUSSUMMARYDifferences in iodine intake could account for the variable incidence reported for somatic TSH receptor (TSHR) mutations in toxic thyroid nodules (TTNs). However, this question has not been settled, since no study has yet determined the TSHR mutation incidence in regions with different iodine supplies in the same population with the same methodology. Therefore, in this study, the incidance of somatic TSHR mutations in TTNs from patients living in iodine deficient or iodine sufficient regions in Turkey were investigated.Seventy-four TTN samples from 56 patients were enrolled to this study. 9-10. exons of TSHR gene and 7-8. Exons of Gsa gene were screened by DGGE. In 22 Mutation negative TTNs, 1-8. TSHR exons were screened by direct sequencing. Clonality assay was carried out on TTN with/without mutations from female patients by DNA fragment analysis based on PCR. Functional characterisation of new TSHR mutations were performed on COS-7 cell lines.TSHR mutations were identified in 52 (70.2%) of 74 TTNs. Three somatic (I486N, A627V, I640K) and one germ line mutation (N372T), totally four new TSHR mutations were detected in this study. No statistically significant differences for frequencies of TSHR mutations in iodine deficient (70 %) and iodine sufficient regions (78.9 %) were found (x2: 0.751. p: 0.57). The frequency of non-random-X-chromosome inactivation was similar in iodine sufficient or deficient regions and in TSHR mutation positive (69.5 %) or negative (69.3 %) hot nodules. Also it was found that A428V, I486N, A627V and I640K somatic mutations of TSHR have a constitutive activity but N372T germline mutation is lack of constitutive activity.In conclusions, these findings suggest that TTNs in both iodine deficient and iodine sufficient areas predominantly arise from aberrant growth of a single cell. Moreover, this study conclude that neither the frequency of TSHR mutations nor the frequency of a monoclonal origin of TTNs is significantly related to iodine supply in the diet. This would imply that iodine deficiency more likely plays a role in determining the number of events that lead to thyroid autonomy rather than deciding the molecular signature of TTNs.

ÖZETDüşük dereceli gliomaların seyrinde önemi ispatlanan değişkenler yaş ve operasyonla tümörün çıkartılmasıdır; ancak glial tümörlerin biyolojik özelliklerinin gün ışığına çıkartılabilmesi de gerek tedavinin seçilmesinde, gerekse sağkalımın uzatılabilmesinde etkili olacaktır. Bu doğrultuda yapılan çalışmalar erken evre gliomaların %60’ının TP53 geni mutasyonu taşıdığını ve p53 işlev kaybının %70-80 oranında olduğunu göstermiştir. p53 işlevini etkileyen p14ARF ve mdm-2’nin düzensizlikleri erken evre tümörün ileri evreye geçişini kolaylaştıran unsurlardır. Hücrelere farklılaşma ve büyüme sinyali ileten PDGFR-α, EGFR ve bu yolakları baskılayan PTEN proteinleri gliomaların tedavisini değiştirebilecek değişkenlerdendir. Tüm bu moleküler değişimler, histopatolojik olarak tanımlanması güç olan bu tümör grubunun genetik tanısının doğrulanması veya histopatolojik tanının tekrar gözden geçirilmesini sağlamanın yanında prognoz hakkında bilgi alınabilmesine de imkan verecektir. Bu çalışmada Nisan 1999- Ocak 2005 arasında araştırmaya katılmayı kabul eden, glioma cerrahisi geçiren, Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Beyin Cerrahisi AD kontrolündeki 39 ve Haydarpaşa Numune Hastanesi kontrolündeki dokuz hastanın tümör dokuları alınmış; DNA izolasyonunu takiben SSCP tekniği kullanılarak TP53 mutasyonları saptanmıştır. mdm2 amplifikasyonu ve p14 delesyonu multipleks PZR yöntemiyle incelenmiştir. Ayrıca tümörlerin parafin dokularında p53, MGMT, EGFR, PDGFR-α ve PTEN proteinlerinin varlığı immunohistokimyasal yöntemle araştırılmıştır.Çalışmaya alınan 12’si astrositoma, 16’sı oligodendroglioma ve 20’si oligoastrositoma tanısı konulan 48 hastadan 22’sinde TP53 mutasyonu saptanmıştır. p53 proteini anlatımının üç histopatolojik grupta da mutasyonlu örneklerde mutasyon taşımayanlara oranla anlamlı olarak yüksek olduğu bulunmuştur. Sağkalım analizlerinden TP53 mutasyonu taşıyanların sağkalım süresinin taşımayanlara göre daha kısa olduğu saptanmıştır. Bu bulgulara ek olarak astrositoma ve oligoastrositomalarda EGFR, PDGFR-α ve PTEN anlatımlarının arttığı saptanmıştır. Ayrıca MGMT ve p53 anlatımlarının tümör yerleşimine göre değişiklik gösterdikleri gözlemlenmiştir.Anahtar Kelimeler; Düşük dereceli glioma, TP53 mutasyonları, EGFR-PDGFR-α- PTEN anlatımı, MGMT anlatımı, sağkalım.SUMMARYAge and surgical resection of tumor mass are accepted variables effective on glioma progression but distinction of biological properties of glial tumours is important for both selection of appropriate treatment and prolongation of the survival. Researches confirmed that TP53 mutations are present in 60% of the initial stage gliomas and 70-80 % of all gliomas had loss of TP53 gene function. p14ARF and mdm2 aberrations especially found on progression through higher grade gliomas. Differentiation and growth signal transmission modulator PDGFR-α and EGFR and their suppressor PTEN create faith of glioma cells. Determination of these aberrations could help verifying the genetic diagnosis and reviewing histopathological diagnosis in this complex tumour group. Not only confirmation of the diagnosis but also getting idea about the prognosis could be possible. In this study, tumour tissues of 39 and nine patients, accepted informed consent and had glioma surgery, applied to Marmara University Neurosurgery Department and Haydarpasa Numune Hospital between April 1999- January 2005 respectively are used; Following DNA isolation TP53 mutations were detected by SSCP. mdm2 amplifications and p14 deletions were studied with multiplex PCR. Simultaneously from the paraffin tissues, p53, MGMT, EGFR, PDGFR-α and PTEN expressions were detected immunohistochemically.Of the 48 cases, composed of 12 astrocytomas, 16 oligodendrogliomas and 20 oligoastrocytomas, 22 patients had TP53 mutations. p53 expression was increased in mutation positive specimens. TP53 mutation carriers lived shorter compared to non-carriers. PDGFR-α, EGFR, PTEN expressions were increased in astrocytomas and oligoastrocytomas and according to tumour location MGMT and p53 expressions were different.Key Words; Low grade glioma, TP53 mutations, EGFR-PDGFR-α-PTEN expressions, MGMT expression, survival.

1.ÖZETDüşük dereceli gliomaların seyrinde önemi ispatlanan değişkenler yaş ve operasyonlatümörün çıkartılmasıdır; ancak glial tümörlerin biyolojik özelliklerinin gün ışığınaçıkartılabilmesi de gerek tedavinin seçilmesinde, gerekse sağkalımın uzatılabilmesindeetkili olacaktır. Bu doğrultuda yapılan çalışmalar erken evre gliomaların %60'ının TP53geni mutasyonu taşıdığını ve p53 işlev kaybının %70-80 oranında olduğunugöstermiştir. p53 işlevini etkileyen p14ARF ve mdm-2'nin düzensizlikleri erken evretümörün ileri evreye geçişini kolaylaştıran unsurlardır.Hücrelere farklılaşma ve büyüme sinyali ileten PDGFR-α, EGFR ve bu yolaklarıbaskılayan PTEN proteinleri gliomaların tedavisini değiştirebilecek değişkenlerdendir.Tüm bu moleküler değişimler, histopatolojik olarak tanımlanması güç olan bu tümörgrubunun genetik tanısının doğrulanması veya histopatolojik tanının tekrar gözdengeçirilmesini sağlamanın yanında prognoz hakkında bilgi alınabilmesine de imkanverecektir.Bu çalışmada Nisan 1999- Ocak 2005 arasında araştırmaya katılmayı kabul eden,glioma cerrahisi geçiren, Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Beyin Cerrahisi ADkontrolündeki 39 ve Haydarpaşa Numune Hastanesi kontrolündeki dokuz hastanıntümör dokuları alınmış; DNA izolasyonunu takiben SSCP tekniği kullanılarak TP53mutasyonları saptanmıştır. mdm2 amplifikasyonu ve p14 delesyonu multipleks PZRyöntemiyle incelenmiştir. Ayrıca tümörlerin parafin dokularında p53, MGMT, EGFR,PDGFR-α ve PTEN proteinlerinin varlığı immunohistokimyasal yöntemlearaştırılmıştır.Çalışmaya alınan 12'si astrositoma, 16'sı oligodendroglioma ve 20'si oligoastrositomatanısı konulan 48 hastadan 22'sinde TP53 mutasyonu saptanmıştır. p53 proteinianlatımının üç histopatolojik grupta da mutasyonlu örneklerde mutasyon taşımayanlaraoranla anlamlı olarak yüksek olduğu bulunmuştur. Sağkalım analizlerinden TP53mutasyonu taşıyanların sağkalım süresinin taşımayanlara göre daha kısa olduğusaptanmıştır. Bu bulgulara ek olarak astrositoma ve oligoastrositomalarda EGFR,PDGFR-α ve PTEN anlatımlarının arttığı saptanmıştır. Ayrıca MGMT ve p53anlatımlarının tümör yerleşimine göre değişiklik gösterdikleri gözlemlenmiştir.1Anahtar Kelimeler; Düşük dereceli glioma, TP53 mutasyonları, EGFR-PDGFR-α-PTEN anlatımı, MGMT anlatımı, sağkalım.2 2.SUMMARYABERRATIONS IN EGFR, PTEN, PDGFR-α, MGMT EXPRESSIONS, TP53AND p53 PATHWAY (MDM-2 AND P14ARF) GENES IN LOW GRADEGLIOMAS AND THEIR CLINICAL EFFECTSAge and surgical resection of tumor mass are accepted variables effective on gliomaprogression but distinction of biological properties of glial tumours is important for bothselection of appropriate treatment and prolongation of the survival. Researchesconfirmed that TP53 mutations are present in 60% of the initial stage gliomas and 70-80 % of all gliomas had loss of TP53 gene function. p14ARF and mdm2 aberrationsespecially found on progression through higher grade gliomas.Differentiation and growth signal transmission modulator PDGFR-α and EGFR andtheir suppressor PTEN create faith of glioma cells. Determination of these aberrationscould help verifying the genetic diagnosis and reviewing histopathological diagnosis inthis complex tumour group. Not only confirmation of the diagnosis but also getting ideaabout the prognosis could be possible.In this study, tumour tissues of 39 and nine patients, accepted informed consent and hadglioma surgery, applied to Marmara University Neurosurgery Department andHaydarpasa Numune Hospital between April 1999- January 2005 respectively are used;Following DNA isolation TP53 mutations were detected by SSCP. mdm2amplifications and p14 deletions were studied with multiplex PCR. Simultaneouslyfrom the paraffin tissues, p53, MGMT, EGFR, PDGFR-α and PTEN expressions weredetected immunohistochemically.Of the 48 cases, composed of 12 astrocytomas, 16 oligodendrogliomas and 20oligoastrocytomas, 22 patients had TP53 mutations. p53 expression was increased inmutation positive specimens. TP53 mutation carriers lived shorter compared to non-carriers. PDGFR-α, EGFR, PTEN expressions were increased in astrocytomas andoligoastrocytomas and according to tumour location MGMT and p53 expressions weredifferent.3Key Words; Low grade glioma, TP53 mutations, EGFR-PDGFR-α-PTEN expressions,MGMT expression, survival.4 89

TÜRKÇE TEZ BAŞLIKMESANE TÜMÖRLERİNDE İNSÜLİN BENZERİ BÜYÜME FAKTÖRÜ 2 (IGF-2) DE GÖRÜLEN İFADE KAYBI VE HASTALIĞIN SEYRİ BAKIMINDAN ÖNEMİAdı ve Soyadı: N. Levent TürkeriDanışman adı: Prof. Dr. Beyazıt ÇırakoğluKabul tarihi:Program: DoktoraAnabilim Dalı: Tıbbi Biyoloji ve GenetikÖZETİnsülin Benzeri Büyüme Faktörleri (IGF) hücre çoğalması ve farklılaşmasını kontrol eden güçlü düzenleyici etkiye sahip moleküller olup, embiryolojik gelişim, normal büyüme ve farklılaşma ve nihayet değişik dokularda hiperplazi ve neoplazi ortaya çıkışında önemli bir yere sahiptirler. İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü-2 (IGF-2) geni alel spesifik olarak (alelin ebeveyn orijinine göre) ekspresyon gösterir (genomik imprinting). Bu olayın insanlarda görülen bir kısım hastalık ve kanser gelişimi açısından önemli olduğu düşünülmektedir. Bugüne kadar "imprinted" olduğu saptanmış bir grup gen izole edilmiş olup, bunlar kromozom 11p15.5 bölgesinde yerleşiktirler. Söz konusu genler IGF-2, H19, IPW ve p57kip'dir. İnsan IGF-2 geni 67 amino asit içeren bir otokrin büyüme faktörü kodlamaktadır. Bu gendeki "imprinting" kaybı (LOI) değişik malignitelerde (örn. Wilms tümörü, meme kanseri, prostat kanseri) ve mesane tümörlerinde bildirilmiştir. Herhangi bir sebeple IGF-2 geninde bi-alelik aktivasyonun ortaya çıkması durumunda genin aşırı biçimde eksprese edildiği ve bu olayın tümör gelişim mekanizmaları içinde önemli bir role sahip olduğu düşünülmektedir. Ayrıca böyle bir durumun varlığında tümörün histopatolojik özellikleri ile klinik davranışının da (rekürrens ve progresyon) olumsuz yönde olacağı da ileri sürülmektedir.Bu çalışmada, mesane kanseri olan hastalardan alınan tümör örneklerinde IGF-2 geninin alel-spesifik ekspresyonu ve bunun prognoz ile ilişkisi araştırılmıştır. Toplam 70 adet tümör örneğinden genomik DNA izolasyonu yapılarak, 11. kromozom üzerinde bulunan IGF-2 geni 9. eksonu üzerindeki polimorfik bölge Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edilmiştir. PCR ürünleri Apa-I restriksiyon enzimi ile kesilerek, oluşan 236-bç ya da 173 ve 63-bç uzunluktaki parçalar %2 agaroz jelde elektroforez ile ayrılmış (Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP) ve etidyum bromür ile görüntülenmiştir. Tümör örneklerinin 39 tanesi RFLP sonucu informatif bulunmuş ve bu olgulara ait tümör dokularından izole edilen RNA örnekleri kullanılarak Ters Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) gerçekleştirilmiştir. Bu olgulardan 20 tanesinde RT-PCR ile yapılan inceleme sonucunda (%51.3) bi-allelik ekspresyon (LOI) saptanmıştır. LOI varlığı ile tümör evresi ve derecesi (grade) arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır. Yüzeyel tümörlerde %51.6 oranında LOI gözlenirken bu oran invaziv tümörlerde %50 olarak saptanmıştır. Genel olarak çalışma grubunda tümör derecesinin artması ile LOI oranı da artmakla beraber, bu değişim istatistik analizde anlamlı bir farka ulaşmamıştır. Benzer şekilde LOI olan tümörlerde rekürrens ve progresyon oranları LOI göstermeyen olgulara göre daha yüksek olmakla birlikte aradaki fark anlamlı bulunmamıştır (%60'a karşılık %66.6, p=0.9, ve %20'ye karşılık %41.6, p=0.5). Sonuç olarak IGF-2 geninde ortaya çıkan LOI mesane tümörü olgularının yaklaşık yarısında gözlenmekte olup, yüksek dereceli tümörlere, ayrıca da artmış bir rekürrens ve progresyon oranına eşlik etmektedir. Bir başka deyişle mesane kanserinde söz konusu gende ortaya çıkan LOI'nın, tümörün yapısı ve klinik davranışı bakımından kötü prognostik özellikler ile ilişkili olduğu düşünülmüştür. İNGİLİZCE TEZ BAŞLIKLOSS OF IMPRINTING OBSERVED IN INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR 2 (IGF-2) IN BLADDER CANCER AND ITS IMPROTANCE IN DISEASE PROGRESSIONSUMMARYInsulin-Like Growth Factors (IGF) are molecules with profound regulatory activitiy on cell proliferation and differentiation which also have an important role in embryological development, normal growth and differentiation and finally hyperplasia and development of neoplasia. Insulin-Like Growth Factor-2 (IGF-2) gene displays allele spesific (depending on the origin of the allele) expression (genomic imprinting). This is considered to be an important event in a variety of diseases and cancer development in human beings. A number of imprinted genes were identified so far and they are located on chromosome 11p15.5. These genes are IGF-2, H19, IPW, and p57kip. Human IGF-2 gene encodes an autocrin growth factor consisting of 67 amino acids. Loss of imprinting (LOI) in this gene has been reported in various malignancies (such as Wilms' tumor, breast cancer, prostate cancer) and bladder cancer. In case of of bi-allelic expression of IGF-2 gene due to any reason, overexpression of the gene occurs, and may play an important role in tumor development mechanisms. Also, it is suggested that histopathological characteristics and clinical behaviour (recurrence and progression) of such tumors will be unfavourable. Alelle- specific expression of IGF-2 gene and its relation with the prognosis of the disease was investigated in this study. Genomic DNA was isolated from a total of 70 tumor samples and Polymerase Chain Reaction (PCR) amplification of the polymorphic region on exon 9 of IGF-2 gene on chromosome 11 was performed. PCR products were digested with Apa-I and resulting products in 236-bp or 173 and 63-bp length were seperated by 2% agarose gel electrophoresis (Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP) and visualised by ethidium bromide staining. Thirty-nine of the tumor samples were found to be informative by RFLP, and RT-PCR was performed by RNA samples isolated from these tumors. Bi-allelic expression (LOI) was detected by RT-PCR analysis in 20 (51.3%) of these samples. There was no statistically significant correlation between the presence of LOI and tumor stage and grade. Frequency of LOI was 51.6% in superficial tumors, and 50% in invasive tumors. In general, the rate of LOI increased by increasing tumor grade in this study group. However the difference between the groups was not statistically significant. Similarly, no statistically significant difference was observed in recurrence and progression rates although these were higher in tumors with LOI compared to the ones withouth LOI (60% vs 66.6%, p=0.9, and 20% vs 41.6%, p=0.5).In conclusion, LOI occurring in the IGF-2 gene was observed in about half of the cases and accompanied by high grade tumors as well as increased rate of recurrence and progression. In other words, LOI within this particular gene appears to be associated with poor prognostic factors in bladder cancer in terms of tumor structure and clinical behaviour.

KOLLAJENAZ PERFÜZYONU İLE İZOLE EDİLMİŞ PRİMER HEPATOSİTLERDE FARKLI KOŞULLARDA GEN EKSPRESYONUNUN İNCELENMESİAdı ve Soyadı: Zelal AdıgüzelDanışman adları: Prof. Dr. Beyazıt Çırakoğlu Doç. Dr. Kemal BaysalKabul tarihi: 06.05.2004Program: Yüksek LisansAnabilim Dalı: Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı ÖZETKronik karaciğer hastalığına yol açan hepatit gibi hastalıkların yaygınlaşması nedeniyle organ naklinin önemli ve vericilerin az olduğu karaciğer gibi bir organda, az sayıda sağlam karaciğer hücresinden hücre kültür teknikleriyle işlevsel bir organ oluşturulması tıp alanında üzerinde uğraşılan bir hedeftir. Bu amaca ulaşmada çalışmalar, hücre biyolojisi, moleküler biyoloji, kimya ve biyomühendislik alanlarının bir ara kesiti olan doku mühendisliği alanında yapılmaktadır ve ilerlemeler son yıllarda büyük hız kazanmıştır. Bu amaçla ve aynı zamanda karaciğer hücrelerine özgü işlevlerin ve gen ekspresyonu mekanizmalarının araştırılmasında kullanmak üzere hepatositler izole edilmekte ve primer hücre kültürleri yapılmaktadır. Hepatositler, üre ve albumin sentezi, ksenobiyotik mekanizması, bilurubin konjugasyonu gibi işlevlerden oluşan bir fenotip gösterir. Ancak kültür süresince izole hücreler, hepatositleri karakterize eden proteinlerin ekspresyonlarının değişmesi sonucunda dediferansiye olmakta ve fenotiplerini kaybetmektedirler. Hepatositlerin fenotiplerini kültür ortamında sürdürebilmeleri sağlamak için yoğun deneysel çalışmalar yapılmaktadır. Hepatositlerin fenotipini etkileyen faktörler; ekstraselüler matrikste yer alan bileşenler, kültür şekli, medyum içeriği, kültürde başka hücrelerin varlığı ve suda çözünür protein faktörlerdir. Bu tezde öncelikle Sprague-Dawley tipi sıçan karaciğerinden primer hepatositlerin izolasyonu için iki adımlı perfüzyon yöntemi optimize edilmiştir. Literatürde belirtilen sayılara benzer olarak 14-21 gün sürecek deneylerde yeterli protein ve RNA eldesini sağlayacak sayıda %90'ın üzerinde canlı, 100-200 X 106 hücre elde edilmiştir. Çalışmalar, hepatositlerin bir ekstraselüler matriks bileşeni olan kollajenle etkileşiminin, karaciğer dokusunda hepatosit fenotipini ve karaciğer spesifik gen ekspresyonunu etkilediğini göstermiştir. Bu tezde ekstraselüler matriksin karaciğer spesifik gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini anlamak amacıyla hepatositler iki adımlı kollajenaz perfüzyonu yöntemiyle izole edilerek, 14 gün boyunca tek tabaka ve sandviç olarak kültüre edilmiş ve karaciğer spesifik gen ekspresyonu RNA ve protein düzeyinde ölçülmüştür. Bu amaçla, bu hücrelerden belli günlerde total RNA izole edilmiş, bu RNA'lardan cDNA sentezlenmiş ve karaciğere özgü bir protein olan albumin ve farklı koşullarda ekspresyonu değişmeyen (housekeeping) bir gen olan gliseraldehit 3 fosfat dehidrogenaz geninin ekspresyonu, semikantitatif RT-PZR yöntemi ile incelenmiştir. Tek tabakalı kültürlerde olduğu gibi, sandviç kültürlerde de bu süre zarfında albumin ekspresyonu gözlemlenmiştir, ancak her iki kültür sisteminde de ekspresyon azalmıştır. Farklılaşmış bir karaciğer proteini olan CK 18 sentezindeki değişiklikleri çalışmak amacıyla, hücreler lize edilerek bu lizatlardaki protein miktarı ölçülmüştür. Eşit miktarda protein lizatları SDS-PAGE jele yüklenerek PVDF membrana transfer edilmişlerdir. Bu membranlar kullanılarak immün blotlama yapılıp, CK18 ekspresyonlarının değişip değişmediği kemilüminesans yöntemi ile incelenecektir. Bu proteinin kollajen tek tabaka ve sandviç kültürlerde ekspresyon değişimlerinin ölçüm ve karşılaştırma çalışmaları sürdürülecektir. Bundan sonraki çalışmalar olarak, benzer deneyler laminin, matrigel gibi matrikslerle tekrarlanacaktır. Son olarak laboratuarımızda yürütülen projenin ana amacı olan yapay doku oluşumuna yönelik biyobozunur biyopolimerler ile hepatositlerin etkileşimleri gen ve protein ekspresyonu düzeyinde karakterize edilecektir.ISOLATION OF PRIMARY HEPATOCYTES BY COLLAGENASE PERFUSION AND ANALYSIS OF GENE EXPRESSION UNDER DIFFERENT CONDITIONS2. SUMMARYAs a consequence of prevalence of chronic liver disease causing viruses such as hepatitis, importance of liver transplants and donor shortage, obtaining organ function from minimal amounts of healthy liver cells using cell culture techniques has preoccupied the medical field. Efforts directed towards attaining this goal have been mainly in the field of tissue engineering, an intersection of cell biology, molecular biology, chemistry and bioengineering and progess has been accelerating in recent years.To attain this goal, as well as to investigate liver cells specific functions and gene expression mechanisms, hepatocytes have been isolated and primary cell cultures have been maintained. Hepatocyte phenotype includes urea and albumin synthesis, xenobiotic metabolism and bilirubin conjugation. However while in culture, isolated cells de-differentiate and lose their phenotypes as a result of changes in expression of hepatocyte characterizing proteins. In order to maintain the hepatocyte phenotype in culture, great variety of experimental studies have been performed. Factors that affect the hepatocyte phenotype are extracellular matrix components, culture configuration, media formulation, presence of other cell types in culture and soluble protein factors.İnitially a two-step perfusion method was optimized for isolation of primary hepatocytes from Sprague-Dawley rat liver. Consistent with numbers reported in the literature, 100-200 X 106, 90 % viable cells were obtained and sustained for 14-21 days, providing a sufficient yield for protein and RNA isolation. It has been reported that, the interaction of hepatocytes with collagen, an extracellular matrix component, influences the hepatocyte phenotype and liver specific gene expression in liver tissue. In this thesis, in order to understand the effect of extracellular matrix on liver specific gene expression, hepatocytes were isolated by two-step collagenase perfusion method, cultured for 14 days using monolayer and sandwich culture systems and liver specific gene expression was measured as a function of message and protein. To this end, total RNA was isolated from cells on the days specified, cDNA was synthesized from this RNA, and expression of albumin, a liver specific protein, and GAPDH, a housekeeping gene was analyzed using semi-quantitative RT-PCR. Albumin expression was detected in the monolayer cultures as well as in the sandwich cultures however, in both culture systems expression decreased gadually. In order to study changes in differentiated liver cell specific protein, CK18 synthesis, cells were lysed and the amount of protein in these lysates was measured. Equal amounts of cell lysates were resolved by SDS-PAGE followed by transfer onto PVDF membranes. Using these membranes, changes in CK18 expression will be analyzed by immuno-blotting and detected by chemiluminescence method. Variations in this protein's expression in monolayer and sandwich cultures will be measured and compared. Subsequent to these studies, experiments will be repeated using laminin and matrigel as extracellular matrix. Finally, to realize the main aim of the ongoing project in our laboratory towards formation of artificial tissue, the interaction of biodegadable polymers with hepatocytes will be characterized as a function of protein and gene expression.

1. ÖZET Insulin Benzeri Büyüme Faktörleri (IGF) hücre çoğalması ve farklılaşmasını kontrol eden güçlü düzenleyici etkiye sahip moleküller olup, embiryolojik gelişim, normal büyüme ve farklılaşma ve nihayet değişik dokularda hiperplazi ve neoplazi ortaya çıkışında önemli bir yere sahiptirler. Insulin Benzeri Büyüme Faktörü-2 (IGF-2) geni alel spesifik olarak (alelin ebeveyn orijinine göre) ekspresyon gösterir (genomik imprinting). Bu olayın insanlarda görülen bir kısım hastalık ve kanser gelişimi açısından önemli olduğu düşünülmektedir. Bugüne kadar `imprinted` olduğu saptanmış bir grup gen izole edilmiş olup, bunlar kromozom 11p15.5 bölgesinde yerleşiktirler. Söz konusu genler IGF-2, H19, IPW ve p57kip,dir. İnsan IGF-2 geni 67 amino asit içeren bir otokrin büyüme faktörü kodlamaktadır. Bu gendeki `imprinting` kaybı (LOI) değişik malignitelerde (örn. Wilms tümörü, meme kanseri, prostat kanseri) ve mesane tümörlerinde bildirilmiştir. Herhangi bir sebeple IGF-2 geninde bi- alelik aktivasyonun ortaya çıkması durumunda genin aşırı biçimde eksprese edildiği ve bu olayın tümör gelişim mekanizmaları içinde önemli bir role sahip olduğu düşünülmektedir. Ayrıca böyle bir durumun varlığında tümörün histopatolojik özellikleri ile klinik davranışının da (rekürrens ve progresyon) olumsuz yönde olacağı da ileri sürülmektedir. Bu çalışmada, mesane kanseri olan hastalardan alınan tümör örneklerinde IGF-2 geninin alel-spesifik ekspresyonu ve bunun prognoz ile ilişkisi araştırılmıştır. Toplam 70 adet tümör örneğinden genomik DNA izolasyonu yapılarak, 11. kromozom üzerinde bulunan IGF-2 geni 9. eksonu üzerindeki polimorfik bölge Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edilmiştir. PCR ürünleri Apa-I restriksiyon enzimi ile kesilerek, oluşan 236-bç ya da 173 ve 63-bç uzunluktaki parçalar %2 agaroz jelde elektroforez ile ayrılmış (Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP) ve etidyum bromür ile görüntülenmiştir. Tümör örneklerinin 39 tanesi RFLP sonucu informatif bulunmuş ve bu olgulara ait tümör dokularından izole edilen RNA örnekleri kullanılarak Ters Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) gerçekleştirilmiştir. Bu olgulardan 20 tanesinde RT-PCR ile yapılan inceleme sonucunda (%51.3) bi-allelik ekspresyon (LOI) saptanmıştır. LOI varlığı ile tümör evresi ve derecesi (grade) arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır. Yüzeyel tümörlerde %51.6 oranında LOI gözlenirken bu oran invaziv tümörlerde %50 olarak saptanmıştır. Genel olarak çalışma grubunda tümör derecesinin artması ile LOI oranı da artmakla beraber, bu değişim istatistik analizde anlamlı bir farka ulaşmamıştır. Benzer şekilde LOI olan tümörlerde rekürrens ve progresyon oranları LOI göstermeyen olgulara göre daha yüksek olmakla birlikte aradaki fark anlamlı bulunmamıştır (%60'a karşılık %66.6, p=0.9, ve %20'ye karşılık %41.6,p=0.5). Sonuç olarak IGF-2 geninde ortaya çıkan LOI mesane tümörü olgularının yaklaşık yarısında gözlenmekte olup, yüksek dereceli tümörlere, ayrıca da artmış bir rekürrens ve progresyon oranına eşlik etmektedir. Bir başka deyişle mesane kanserinde söz konusu gende ortaya çıkan LOl'nın, tümörün yapısı ve klinik davranışı bakımından kötü prognostik özellikler ile ilişkili olduğu düşünülmüştür. 2. SUMMARY LOSS OF IMPRINTING OBSERVED IN INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR 2 (IGF-2) IN BLADDER CANCER AND ITS IMPROTANCE IN DISEASE PROGRESSION Insulin-Like Growth Factors (IGF) are molecules with profound regulatory activitiy on cell proliferation and differentiation which also have an important role in embryological development, normal growth and differentiation and finally hyperplasia and development of neoplasia. Insulin-Like Growth Factor-2 (IGF- 2) gene displays allele spesific (depending on the origin of the allele) expression (genomic imprinting). This is considered to be an important event in a variety of diseases and cancer development in human beings. A number of imprinted genes were identified so far and they are located on chromosome 11p15.5. These genes are IGF-2, H19, IPW, and p57kip. Human IGF-2 gene encodes an autocrin growth factor consisting of 67 amino acids. Loss of imprinting (LOI) in this gene has been reported in various malignancies (such as Wilms' tumor, breast cancer, prostate cancer) and bladder cancer. In case of of bi-allelic expression of IGF-2 gene due to any reason, overexpression of the gene occurs, and may play an important role in tumor development mechanisms. Also, it is suggested that histopathological characteristics and clinical behaviour (recurrence and progression) of such tumors will be unfavourable. Alelle- specific expression of IGF-2 gene and its relation with the prognosis of the disease was investigated in this study. Genomic DNA was isolated from a total of 70 tumor samples and Polymerase Chain Reaction (PCR) amplification of the polymorphic region on exon 9 of IGF-2 gene on chromosome 1 1 was performed. PCR products were digested with Apa-I and resulting products in 236-bp or 173 and 63-bp length were seperated by 2% agarose gel electrophoresis (Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP) and visualised by ethidium bromide staining. Thirty-nine of the tumor samples were found to be informative by RFLP, and RT-PCR was performed byRNA samples isolated from these tumors. Bi-allelic expression (LOI) was detected by RT-PCR analysis in 20 (51.3%) of these samples. There was no statistically significant correlation between the presence of LOI and tumor stage and grade. Frequency of LOI was 51.6% in superficial tumors, and 50% in invasive tumors. In general, the rate of LOI increased by increasing tumor grade in this study group. However the difference between the groups was not statistically significant. Similarly, no statistically significant difference was observed in recurrence and progression rates although these were higher in tumors with LOI compared to the ones withouth LOI (60% vs 66.6%, p=0.9, and 20% vs 41.6%, p=0.5). In conclusion, LOI occurring in the IGF-2 gene was observed in about half of the cases and accompanied by high grade tumors as well as increased rate of recurrence and progression. In other words, LOI within this particular gene appears to be associated with poor prognostic factors in bladder cancer in terms of tumor structure and clinical behaviour. 64

Çocuklarda en sık görülen malign hastalık tipi akut lösemidir. Beyaz ırkta çocukluk çağında lösemi sıklığı 100.000 canlı doğumda yaklaşık 5 kadardır. Çocukluk çağında görülen kanserlerin %80'ni Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) oluşturmakta ve en sık 2-5 yaşları arasında görülmektedir. Poliaminler, bütün hücrelerde varlıkları kanıtlanmış pozitif yüklü alifatik amin gruplarıdır. Bunların en iyi bilinenleri, bir diamin olan putresin (Put), bir triamin olan spermidin (Spd) ve bir tetraamin olan spermin (Spm) dir. Poliaminlerin hücre bölünmesine etkileri ve RNA ile olan ilişkileri, büyüme ve protein sentezi mekanizmalarını doğrudan etkilemektedir. Ayrıca tümör karakteristiği gösteren dokularda özellikle Spd ve Spm konsantrasyonlarında artış saptanmıştır.Bu araştırma da, farklı tip ve evrelerdeki lösemi hastalarında ve bilinen hücre hatlarında poliamin metabolizmasının incelenmesi ve bu süreçlerin lösemi oluşumundaki rollerinin açıklanması amaçlanmıştır.Bu doğrultuda biyomarkır olarak poliaminlerin klinik anlamda kullanılabilirliğinin yararının saptanması amacıyla bir dizi çalışma yapılmıştır. Medikal uygulama görmemiş hastalardan alınan periferal kan lökositleri ve hastalık seviyesi belli hücre hatlarında (CCL-119 ve KG1) poliamin miktar analizleri yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak incelenmiştir. Yine aynı örneklerde poliamin katabolizmasında görevli enzimlerden diamin oksidaz (DAO) ve peroksidaz (POD) aktiviteleri spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. Gözlemler Spd'nin hasta lökositlerinde fazla miktarda bulunduğunu göstermiştir. Ancak en belirgin sonuçlar Spm miktar tayini ile saptanmıştır. Spm kontrol örneklerine göre hastaların periferal taze lökositlerinde 20 kat, periferal kan örneklerinden yapılan süspansiyon lökosit kültürlerinde 17 kat, ALL hücre hattında 15 kat ve AML hücre hattında 10 kat artış göstermiştir (p

1. ÖZET Tromboz yatkınlığı, kalıtımla ya da sonradan edinilen etkenlere bağlı olarak gelişen bir bozukluktur. Edinsel etkenlere maruz kalmanın önlenebilirliği ve patofizyolojinin açıklanmasında, çoğu zaman, tek bir grup etkenin yeterli olmaması, özellikle kalıtsal tromboz yatkınlığı ile araştırmaların ön plana çıkmasına neden olmuştur. Gebeliğe bağlı, nedeni açıklanamayan hipertansiyon, preeklampsi, eklampsi, intrauterin gelişme geriliği, intrauterin fötus ölümü, plasenta dekolmanı gibi gebelikle ilişkili komplikasyonlar, anne ve fotus ölüm nedenlerinin önemli bir bölümünü oluşturmaktadır. Bu komplikasyonların gelişiminde endotel işlev bozukluğu, vazokonstriksiyon, plasenta iskemisi ve pıhtılaşma artışının rol oynadığı, bu etkenlerin uterusla plasenta arasındaki dolaşımın yetmezliğine yol açtığı gösterilmiştir. Tromboza yol açan kalıtsal etkenlerden pıhtılaşma ve fibrin yıkım düzeneklerinde yer alan moleküllere ait kusurlar, gebelikle ilişkili bu bozukluklarda araştırılmaktadır. Bu çalışmada, tromboza yatkınlığı arttırdığı düşünülen kalıtsal etkenlerden, pıhtılaşma düzeneği içinde yer alan faktör V, metionin-homosistein döngüsünde görev yapan metilentetrahidrofolat redüktaz enzimi ve fibrin yıkımında düzenleyici görevi yapan plazminojen aktivatör inhibitörü-1 moleküllerine ilişkin kusurların, nedeni açıklanamayan komplikasyonlu ve sağlıklı gebelerdeki sıklığı, klinik ve demografik özelliklerle ilişkisi incelenmiştir. İlerleyen yıllarda, riskli gebeliklerin erken dönemlerinde, kalıtsal tromboz yatkınlığı etkenlerine yönelik koruyucu tedaviler uygulanmasının rutin hale gelebileceği öne sürülmektedir. Bu tip çalışmaların, bu konuya katkı yapması beklenmektedir. 2. SUMMARY The Incidence and Interpretation of Factor V A4070G, Methylenetetrahydrofolate Reductase A1298C, and Plasminogen Activator Inhibitor-1 4G/5G Mutation Rates In Women With Complicated Pregnancies of Unknown Etiology Thrombophilia is a disorder, developing due to acquired or heritable factors. The preventable feature of acquired factors and the inefficiency of solely a group of etiologic causes, raise the importance of reserach on heritable factors of thrombophilia. Pregnancy complications with an unknown cause like pregnancy-induced hypertension, pre-eclampsia / eclampsia, intrauterine foetal death, intrauterine growth retardation and abruptio placentae are the major causes of maternal and foetal morbidity and mortality. Endothelial dysfunction, vasoconstriction, plasental ischemia, and increased coagulation are shown to be associated with the development of these complications by leading to utero-placental insufficiency. The association of defects in coagulation and fibrinolysis are currently being investigated in pregnancy complications with an unknown cause. In this study, in women with healthy and complicated pregnancies, the incidence of the defects of factor V of the coagulation cascade, methylenetetrahydrofolate reductase enzyme in methionine-homocysteine cycle, and plasminogen activator inhibitor-1 in fibrinolysis regulation and their relation to the clinical findins have been analysed. Preventive measures against heritable thrombophilic causes can be applied in management of pregnancies under risk, in the future. Such studies are expected to have additive effect on the knowledge about the subject. 103

l.ÖZET Bir iyon çifti ters faz yüksek basınçlı sıvı kromatografisi metodu olan denatüran yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (DHPLC), polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılmış çift zincirli DNA dizilimlerindeki farklı bazlar yüzünden oluşan bağlanmamış bölgelerin meydana getirdiği heterodupleks yapıları temel alarak mutasyon ve polimorflzm taranmasında kullanılır. Yöntem ucuz, etkin, tekrarlanabilir ve kolay olması açısından son zamanlarda polimorflzm ve nokta mutasyonu tespiti için rutin bir laboratuvar uygulaması haline gelmeye başlamıştır. Çalışmada TÜBÎTAK Marmara Araştırma Merkezi, Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Arastama Enstitüsü'nde mevcut bulunan HPLC sistemi DHPLC analizine uygun hale getirilmiştir. Sistemin etkinliği ve güvenirliği, 248 'inci ve 249 'uncu amino asitlerini kodlayan kodonlarında bilinen nokta mutasyonları bulunan P53 geninin 300 nükleotidlik bölgesi kullanılarak yapılan deneylerle kanıtlanmıştır. pBluescript II SK(+) plazmidinin BamHI ve Spel restriksiyon enzim kesim bölgeleri arasına klonlanmış olan, doğal ve 248'inci ve 249'uncu amino asitleri kodlayan kodonlannda nokta mutasyonu bulunan 300 nükleotid uzunluğundaki PS3 gen formları özgül primerler kullanılarak çoğaltıldıktan sonra kaynatılarak denature edilmiş ve doğal ve mutant formlar karıştırılarak homo ve heterodupleks yapıların eldesi sağlanmıştır. `The DHPLC Melt Program` tarafından belirlenen 58°C'lik kısmi denatüran kolon sıcaklığında ve HaelII restriksiyon enzimi ile kesilmiş pBR322 plazmidi kullanılarak yapılan kolon kalibrasyonu ile belirlenen dakikada 0.6 mi akış hızında yapılan DHPLC analizleri sonrasında elde edilen kromatogramlarda, sadece homoduplekslerin verdiği tek, yarılmamış ve ideal bir gausian pikinin yanı sıra gözlemlenen daha erken elüe olmuş ve yarılmış pik oluşumlarına dayanarak örneklerde heterodupleks yapıların tespiti yapılmıştır. Mevcut HPLC sistemlerinin yapılan küçük eklemelerle DHPLC analizi ile polimorflzm ve nokta mutasyonlarının taranmasında güvenilir, etkin ve kolay bir şekilde kullanılabileceği bu çalışma ile ispatlanmıştır. 2. SUMMARY DETECTION OF MUTATIONS CODING AMINO ACIDS 248 AND 249 OF P53 GENE USING DHPLC METHOD Denaturing high-pressure liquid chromatography (DHPLC) is an ion-pair reverse-phase high-pressure liquid chromatography method. DHPLC enables the detection of point mutations and polymorphism based on the heteroduplex formations due to non-paired bases on the PCR amplified DNA duplexes. As being a relatively cheap, effective, reproducible, DHPLC is becoming a routine laboratory technique. In this study, the HPLC system at TÜBİTAK, Marmara Research Center, Research Institute for Genetic Engineering and Biotechnology was modified to be used in DHPLC analysis. The usage of 300-nucleotide long P53 gene region containing known point mutations in codons 248 and 249 proved the efficiency and reproducibility of the system. The native and mutant forms of P53 gene region of 300 nucleotide long, cloned between BamHI and Spel restriction enzyme sites of pBluescript II SK(+) plasmid, were amplified by using gene specific primers. After denaturation by heating, the native and mutant forms were mixed to form homo and heteroduplexes. Denaturing column temperature was determined as 58°C using `the DHPLC Melt Program`. The optimum flow rate of 0.6 ml/min was determined by column calibration using pBR322/HaeIII digest. The presence of heteroduplexes in the sample was detected as early eluted and multiple peaks as compared to a single, ideal gausian peak of homoduplexes in the chromatograms of DHPLC analysis under these conditions. This study proved that by a slight modification of HPLC systems at hand, it is possible to make DHPLC analysis to detect polymorphism and point mutations easily, efficiently and reproducibly. 70

Serebrovasküler malformasyonlar (CVM); arteiovenöz malformasyonlar (AVMler) ve kavernöz malformasyonlar (CMler) santral sinir sisteminin neoplastik olmayan vasküler lezyonlarıdır. Hem AVMler hem de CMler dinamik lezyonlardır ve her iki lezyon tipi anjiogenik olarak aktiftir. Anjiogenez ise vaskülogenezle oluşan damarlardan özgül sinyallerle, kapiller şeklinde yeni damarlar oluşturulması işlemidir. Bu işlemde büyüme faktörleri anahtar rol oynar; PDGF anjiogenik olarak tanımlanan büyüme faktörlerinden biridir. PDGF embriyogenez, yara iyileşmesi, ateroskleroz ve kanser gibi anjiogenezle yakın ilişkili fizyolojik ve patolojik olaylarda rol oynar. Bununla beraber hipoksi ve diğer anjiogenezle ilişkili stimülasyonlar PDGF ekspresyonunu teşvik eder. PDGF ligand ve reseptörleri otokrin ve/veya parakrin fonksiyonla, anjiogenezi çeşitli yollarla düzenleyebilir. Bu çalışmada AVM ve CM lezyonlarında, anjiogenik özellikdeki PDGF ligand ve reseptörlerinin yoğun şekildeki ekspresyonu gerek immünohistokimyasal yöntemler gerekse de duyarlı moleküler biyolojik bir yöntem olan western blot analizleri ile gösterilmiştir. Elde edilen bulgular, PDGF-AA'nın her iki lezyon tipinde kontrol grubuna göre fazla eksprese edildiğini; lezyonlar birbirleri ile kıyaslandığında ise PDGF-AA ekspresyonun AVMlerde CMlere kıyasla fazla olduğunu göstermiştir. PDGF-AA bağlayan PDGF -reseptörünün AVMlerde, özellikle AVM endotelinde CM endoteline kıyasla fazla eksprese edildiği görülmüştür. PDGF-BB'nin, PDGF-AA'dan daha yoğun olarak her iki lezyon tipinde kontrol grubuna göre fazla eksprese olduğu; PDGF-AA'nın tersine, CM lezyonlarında AVMlere göre fazla eksprese edildiği saptanmıştır. Sadece PDGF-BB ligandına yüksek afinite gösteren PDGF -reseptörünün ise CM endotelinde AVM endoteline kıyasla fazla eksprese edildiği gözlenmiştir. Bu bulgular iki farklı serebrovasküler malformasyonun PDGF sinyal ileti sistemi ile ilişkili olduğunu ancak patogenezlerinde farklı PDGF izoformların etkin olduğunu düşündürmektedir.The Expression of PDGF Ligands and Their Receptors in Cerebrovascular MalformationsSummary:Cerebrovascular malformations (CVM); arteriovenous malformations (AVMs) and cavernous malformations (CMs) are defined as non-neoplastic lesions consist of abnormal blood vessels of central nervous system. Both AVMs and CMs are dynamic lesions and they are both angiogenically active. Angiogenesis is a process which new kapilleries are developed from existing vessels. In this process growth factors play key role; PDGF is one of these angiogenic growth factors. PDGF has important roles in processes which have close relations with physiological and pathological angiogenesis; like embryonal development, wound healing, atherosclerosis and cancer. Hipoxia and angiogenesis related stimuli can induce PDGF expression. PDGF ligands and receptors regulate angiogenesis in an autocrine and/or paracrine fashion. In this work we investigate the role of PDGF ligands and receptors in AVM and CM pathogenesis. We also examine the relation between the factors play role in CVM pathogenesis and PDGF pathway. Both immunohistochemical methods and western blott analysis showed that PDGF ligands and receptors are expressed in these lesions strongly. In conclusion, PDGF-AA is expressed strongly in both lesions campared with control group. When we compare two lesions; AVMs express PDGF-AA stronger than CMs in total. PDGF receptor- which has more affinity to PDGF-A, expression is specifically more in AVM endothelium than CM endothelium. PDGF-BB is expressed stronger than PDGF-AA in both lesion type when compared to control group and expression is stronger in CMs compared to AVMs in total. PDGF receptor- which binds only PDGF-B ligand, is specifically expressed more in CM endothelium than AVM endothelium. These datas suggest that two different subgroups of cerebrovascular malformations have a relation with PDGF signal transduction pathway and different isoforms of PDGF ligands and receptors are more effective in these lesions' pathogenesis.

Hepatit B virüsü (HBV) akut ve kronik hepatit B, karaciğer sirozu ve hepatoselüler karsinoma gibi hastalıkların en önemli etkenidir. HBV ile enfekte olan bir kişi için günümüzde etkin bir tedavi söz konusu değildir. HBV enfeksiyonuna karşı, toplum sağlığının korunmasında en etkin yöntem aşılamadır. Mevcut Hepatit B aşıları, bağışık cevabın tam oluşması için 3 doz uygulanmasına rağmen yetişkinlerin yaklaşık %5'inde cevap oluşturamamaktadır. Bu sebeplerle geliştirilmeye başlanan yeni aşı yaklaşımlarından biri etken antijenini taklit eden anti-idiyotipik antikorların kullanılmasıdır. Tez çalışmasında, Hepatit B virüsü yüzey antijenine (HBsAg) karşı geliştirilen anti-HBsAg (aHBsAg) monoklonal antikorları kullanarak hibridoma teknolojisi ile anti-idiyotipik aHBsAg (aid-aHBsAg) monoklonal antikorlarının üretilmesi ve bu aid-aHBsAg monoklonal antikorlarının HBsAg'ye karşı antikor yanıtı (aHBsAg) oluşturma yeteneklerinin in-vivo sistemde gösterilmesi amaçlandı. Bunun için TÜBİTAK-GMBAE Hibridoma Laboratuarında HBsAg'ye karşı geliştirilmiş IgG izotipindeki MAM-A1, 2B7 ve 9D12 monoklonal antikorları (aHBsAg) kullanılarak fareler bağışıklandı. En yüksek bağışık cevabı gösteren fareler sırasıyla füzyona alındı. Füzyon sonrası, IgG2b izotipinde 1F11; IgG3 izotipinde 11E2; IgM izotipinde ise 4F11 ve 5B11 aid-aHBsAg monoklonal antikorları elde edildi. IgG tipi antikorlar Protein-G immün-afinite, IgM tipi antikorlar ise S-300 jel filtrasyon kolon kromatografisi ile saflaştırılarak farelere çeşitli dozlarda enjekte edildi. Enjeksiyon sonrası, 11E2 ve 4F11 aid-aHBsAg monoklonal antikorlarının ticari aşıya benzer aHBsAg cevabı oluşturduğu gözlendi. Elde edilen verilere göre aid-aHBsAg monoklonal antikorlarının, aHBsAg antikor cevabı oluşturmada etkili olabileceği ve tanımlanan yöntemlerin alternatif aşı üretiminde kullanılabileceği sonucuna varıldı.Anahtar Kelimeler: Monoklonal antikor; Hibridoma teknolojisi; Anti-idiyotip; Hepatit B; Bağışık cevapProduction of anti-idiotypic monoclonal antibodies that mimic the hepatitis B surface antigen and investigation of their immunogenic capability in-vivo SUMMARYHepatitis B virus (HBV) is the major cause of acute and chronic hepatitis B, liver cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. Today, there is no effective treatment for people infected by HBV. The most potent method for protecting society against HBV infection is vaccination. Although as much as 3 dose applications of the current hepatitis B vaccine are performed to obtain the whole immune response, about %5 of adults are non-responders. Therefore, one of the new approaches for developing vaccines is utilizing anti-idiotypic antibodies, which mimic the antigen.In this study, we aimed to develop anti-idiotypic anti-HBV surface antigen (aid-aHBsAg) monoclonal antibodies by employing anti-HBsAg (aHBsAg) monoclonal antibodies which had previously been produced against HBV surface antigen (HBsAg) by means of hybridoma technology and to demonstrate the capability of these aid-aHBsAg monoclonal antibodies for developing an immune response against HBsAg in-vivo. To that end, MAM-A1, 2B7 and 9D12 monoclonal antibodies of IgG isotype that had been produced against HBsAg in TÜBİTAK-GMBAE Hybridoma Laboratory were used for immunizing mice. The most stimulated mice were selected for the fusion. Following the fusion, four aid-aHBsAg monoclonal antibodies which, namely 1F11 of IgG2b isotype, 11E2 of IgG3 isotype, and 4F11 and 5B11 of IgM isotype, were produced. Antibodies of IgG isotype were purified by Protein-G immuno-affinity while antibodies of IgM isotype were purified by S-300 gel filtration column chromatography. Subsequently, different doses of these antibodies were injected into mice. Postinjection, it was demonstrated that 11E2 and 4F11 aid-aHBsAg monoclonal antibodies induced an aHBsAg response in mice similar to that of commercial vaccine.These results show that aid-aHBsAg monoclonal antibodies could be effective in inducing antibody response against HBsAg and techniques that were explained could be used as an alternative way of vaccine production.Keywords: Monoclonal antibody; Hybridoma technology; Anti-idiotype; Hepatitis B; Immune response

ÖZETHepatit B Virüsü (HBV) akut, kronik karaciğer hastalıklarının yanısıra, hepatoselüler karsinomaya (HCC) yol açan bir DNA virüsüdür. İnsan sağlığını tehdit eden en önemli risk faktörlerinden biri olan HBV'nin konak sayısının sınırlı olması ve virüsün üretildiği in vivo kültür sisteminin yokluğu, virüs ile ilgili araştırmalarda HBV genomunu (kısmi/bütün) taşıyan transgenik fare modellerinin önemini arttırmıştır. Bu çalışmada ülkemiz için de önemli bir sağlık sorunu yaratan kronik HBV enfeksiyonunun tedavisinde kullanılacak ilaç ve aşı çalışmalarının yanısıra, HCC ile olan ilişkisinin de araştırılabileceği transgenik fare modeli oluşturulması planlanmıştır.HBV genomunu taşıyan plazmitten saflaştırılan tüm HBV genomu mikroenjeksiyon yöntemi ile fertilizasyon sonrası elde edilen CD-1 soyu fare tek hücreli embriyolarına aktarılmıştır. HBV genomu taşıyan fare embriyoları anestezi altındaki pseudopregnant (yalancı gebe) CBGF1 soyu farelere yerleştirilmiştir. Manipülasyon sonrası doğan yavrulardan transgenik olanlar polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ve dot-blot yöntemi ile saptanmıştır. HBV gen ekspresyonu transgenik farelerin serumlarında ve karaciğerlerinde ELİSA ve immünohistokimyasal yöntemlerle HBV yüzey antijeni (HbsAg) saptanarak ve fare karaciğer dokularından elde edilen RNA'lara RT PZR uygulanarak belirlenmiş ve ülkemizde ilk kez HBV trnasgenik fare modeli gerçekleştirilmiştir.ABSTRACTTRANSGENIC MICE MODELS IN WHICH HBV REPLICATION AND GENE EXPRESSION OBTAINED BY MICRO ENJECTION METHODThe Hepatitis B virus (HBV) is a DNA virus that causes acut, chronic liver diseases and also leads to hepatocellular carcinoma (HCC). The limited host range of HBV and the inability to grow in vitro, have increased development of HBV transgenic mice models that carry whole/partial HBV genome in the viral experiments. In this study, to develop transgenic mice model has been planned to determine the drug/ and vaccine in the threapy of chronic HBV infection and HBV/HCC relation which is an important health problem in our country. The HBV genome was purified from the Pt HBV 1,3 plazmid with terminally redundant DNA construct (HBV 1,3) and transferred to the one-celled embriyos of CD-1 mouse strain which were obtained after fertilization by pronuclear microenjection. The mice embriyos were transferred to the pseudopregnant CBGF 1 mouse strain that were under anesthesia. Transgenic offspring which were born after manipulation have been determined by polimerase chain reaction and dot-blot hybridization assays. HBV gene expression of transgenic mice has been shown to determine hepatitis B virus surface antigen by ELISA and immunohistochemical methods in their sera and livers and RT PCR was applied to the RNA samples which have been obtained from liver specimens. In this sudy, production of first transgenic animal in Turkey which is the transgenic mice containing and expressing HBV genome, has been accomplished.

1. ÖZET Hepatit B Virüsü (HBV) akut, kronik karaciğer hastalıklarının yanısıra, hepatoselüler karsinomaya (HCC) yol açan bir DNA virüsüdür. însan sağlığını tehdit eden en önemli risk faktörlerinden biri olan HBV'nin konak sayısının sınırlı olması ve virüsün üretildiği in vivo kültür sisteminin yokluğu, virüs ile ilgili araştırmalarda HBV genomunu (kısrni/bütün) taşıyan transgenik fare modellerinin önemini arttırmıştır. Bu çalışmada ülkemiz için de önemli bir sağlık sorunu yaratan kronik HBV enfeksiyonunun tedavisinde kullanılacak ilaç ve aşı çalışmalarının yanısıra, HCC ile olan ilişkisinin de araştınlabileceği transgenik fare modeli oluşturulması planlanmıştır. HBV genomunu taşıyan plazmitten saflaştınlan tüm HBV genomu mikroenjeksiyon yöntemi ile fertilizasyon sonrası elde edilen CD-1 soyu fare tek hücreli embriyolarına aktarılmıştır. HBV genomu taşıyan fare embriyoları anestezi altındaki pseudopregnant (yalancı gebe) CBGF1 soyu farelere yerleştirilmiştir. Manipülasyon sonrası doğan yavrulardan transgenik olanlar polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ve dot-blot yöntemi ile saptanmıştır. HBV gen ekspresyonu transgenik farelerin serumlarında ve karaciğerlerinde ELÎSA ve irnmünohistokimyasal yöntemlerle HBV yüzey antijeni (HbsAg) saptanarak ve fare karaciğer dokularından elde edilen RNA'lara RT PZR uygulanarak belirlenmiş ve ülkemizde ilk kez HBV trnasgenik fare modeli gerçekleştirilmiştir. 2. SUMMARY The Hepatitis B virus (HBV) is a DNA virus that causes acut, chronic liver diseases and also leads to hepatocellular carcinoma (HCC). The limited host range of HBV and the inability to grow in vitro, have increased development of HBV transgenic mice models that carry whole/partial HBV genome in the viral experiments. In this study, to develop transgenic mice model has been planned to determine the drug/ and vaccine in the threapy of chronic HBV infection and HBV/HCC relation which is an important health problem in our country. The HBV genome was purified from the Pt HBV 1,3 plazmid with terminally redundant DNA construct (HBV 1,3) and transferred to the one-celled embriyos of CD-I mouse strain which were obtained after fertilization by pronuclear microenjection. The mice embriyos were transferred to the pseudopregnant CBGF 1 mouse strain that were under anesthesia. Transgenic offspring which were born after manipulation have been determined by polimerase chain reaction and dot-blot hybridization assays. HBV gene expression of transgenic mice has been shown to determine hepatitis B virus surface antigen by ELISA and immunohistochemical methods in their sera and livers and RT PCR was applied to the RNA samples which have been obtained from liver specimens. In this sudy, production of first transgenic animal in Turkey which is the transgenic mice containing and expressing HBV genome, has been accomplished. 5118

1. ÖZET Viral hepatitler, gerek dünyada gerekse ülkemizde en önemli karaciğer hastalıkları grubunu oluşturmaktadır. Temel viroloji ve moleküler biyolojide yaşanan gelişmeler HCV enfeksiyonlarının epidemiyolojisi, patojenitesi ve tedaviye cevaplan hakkında birçok bilgi edinmemizi sağlamıştır. Fakat HCV enfeksiyonun doğal gelişimi ve klinik sonuçlan hala çözülememiş soranlardır. Farklı hepatit C virüsü genotiplerinin dünya üzerinde değişik coğrafi dağılım gösterdikleri, klinik seyri etkileyebildikleri ve tedaviye alınan yanıtsızlıktan sorumlu olabildikleri bilinmektedir. Farklı genotiplerin, farklı hastalık gruplarındaki rolünü değerlendirmek ve ülkemizdeki baskın genotipin Akdeniz ülkelerinde sık rastlanan genotip ile uyumlu olup olmadığını belirlemeyi amaçladık. Çalışmaya diabetes mellitus tanısı konmuş 85 hasta, lichen planus tanısı konmuş 40 hasta ve damar içi madde bağımlısı 63 hasta olmak üzere toplam 188 hasta dahil edildi. Serum örneklerinin HCV RNA varlığı PZR yöntemi ile gösterildi. Pozitif çıkan toplam 31 hasta ise restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (RFLP) Yöntemi ile HCV genotipleri açısından araştırıldı. Çalışmaya alman toplam 85 diyabet hastasının 8 'inde (%9,4) oranında, lichen planuslu 40 hastanın 3 'ünde (%7,5) oranında ve damar içi madde bağımlısı 63 hastanın 20'sinde (%31,7) oranında HCV RNA pozitifliği saptandı. HCV RNA pozitif diabetes mellituslu 8 hastanın tümü HCV genotipi açısından tip lb, lichen planuslu 3 hastanın tümü tip lb ve damar içi madde bağımlısı 20 hastanın 17 'si tip 3a, kalan 3 hasta ise tip lb ile enfekte bulundu. Elde edilen bu sonuçlar doğrultusunda HCV enfeksiyonu için yüksek risk grubu olan damar içi madde bağımlılannda baskın genotip dünya literatürüyle uyumlu olarak 3a saptandı. Orta risk grubunda olan diabetes mellitus ve lichen planusta baskın olan genotipin ülkemiz coğrafyasıyla uyumlu tip lb olduğu belirlendi. 2. SUMMARY GENOTYPES AND CARRIAGE OF HEPATITIS C VIRUS IN DIABETES MELLITUS, LICHEN PLANUS AND INTRAVENOUS DRUG ABUSER Viral hepatitis constitutes the most important group of liver diseases in both our country and the world. Today, the progresses in the fields of basic virology and moleculer biology improved our knowledge about the epidemiology, pathogenicity of HCV infection and the response of this infection to treatment. But questions regarding to the naturel course and clinical consequences of HCV infection are still not answered, yet. It is now known that HCV genotypes have different geographic distribution, can effect the clinical course of disease and even can be responsible from the unresponsiveness to the treatment. In this study, it was planned to determine the role of different HCV genotypes in different diseases and try to find out whether the dominant genotype in our country is consistent with the most frequent genotype in the mediterranean countries. 85 patients with diabetes mellitus, 40 patients with lichen planus and 63 intravenous drug abusers are included in this study. HCV RNA detection was done by PCR. The sera of 31 patients, determined as HCV RNA (+), were used for genotype detection by RFLP. HCV RNA was positive in 8 of 85 (9,4%) patients with diabetes mellitus, 3 of 40 (7,5%) patients with lichen planus 20 of 63 (31,7%) intravenous drug abusers. All HCV RNA(+) patients with diabetes mellitus and lichen planus were found to have genotype lb. In the 20 HCV RNA (+)intravenous drug abusers group, 17 patients had 3a, and 3 patients had lb genotype. Given the results above, it was concluded that, in our country genotype 3 a is the dominant genotype in intravenous drug abusers who constitute the high risk group for HCV infection this finding is consistent with the literature. For patients with diabetes mellitus and lichen planus who form the intermediate risk group, the dominant genotype is found to be lb, as it is in mediterian countries. 469

II ÖZET Derin Ven Tromboz (DVT) sıklığının toplumlar ve ırklar arasında farklılıklar gösterdiği bilinmektedir. Gelişmiş ülkelerde DVT'li hastalar üzerinde yapılan çalışmalarda bu bireylerin % 21'inde pıhtılaşma faktör V geninin 1691. nükleotidinin guaninden adenine dönüştüğü saptanmıştır ( Leiden mutasyonu). Özbek ve arkadaşlarının 1997' de yayınlanmış olan çalışmasında anılan mutasyonun Türkiye'deki sıklığı araştırılmış ve %9,1'lik Bir oran ile sık görülen ülkeler arasında olduğumuz belirlenmiştir. Yapılan çalışmalarda; tromboza yatkınlığın gebelik nedeniyle arttığı gösterilmiş ve bu durumun anne ve bebek sağlığı açısından risk oluşturduğu saptanmıştır. Bu nedenle, bu çalışmada ülkemizdeki kadın hastalıkları ve doğum kliniklerinde takip edilen gebelerde mutasyon taşıyıcılık oranına yönelik veri elde edilmesi planlanmıştır. Kasım 1999 - Eylül 2000 tarihleri arasında İ. Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilin Dalına başvuran ve çalışmaya katılmayı kabul eden gebe kadınlardan kan örnekleri alınmış; DNÂ örnekleri standart tekniklerle periferik kandan izole edilmiştir. Elde edilen DNA örneklerinden Faktör V genindeki hedef bölge, Polimeraz Zincir Reaksiyonu ( PZR ) ile çoğaltılmış, Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi ( RFLP ) yöntemi ile 1691. nükleotitdeki nokta mutasyonunun varlığı araştırılmıştır. Çalışmaya alınan 35'i sağlıklı, 37'si kompükasyonlu gebeliğe sahip toplam 72 kadından 10'unda faktör V Leiden mutasyon taşıyıcılığı gösterilmiştir. Ayrıca preeklampsi olgusu ve întrauterin fetüs gelişme geriliği ( IUGR ) ve ölü doğum görülen gebelerin 8 'inde ise bu mutasyon heterozigot olarak saptanmıştır. Elde edilen bu sonuçlar Leiden mutasyonunun kontrol grubu ile karşılaştırıldığında kompUkasyonlu gebe grubunda 4 kat daha fâzla olduğunu göstermektedir. in ABSTRACT It is well known that incidence of deep vein thrombosis ( DVT ) varies between races and populations. In the studies conducted at developed countries on patients with DVT. It was detected that guanine at 1691. position of coagulation factor V gene was replaced by adenine ( Leiden mutation ). In the study published by Özbek et al. In 1997 the incidence of the mentioned mutation in Turkey was investigated and it was found out that with a ratio of 9,1%, Turkey is among the countries in which the mutation is frequently seen. In the studies conducted; the tendency to thrombosis was shown to increase because of pregnancy and this situation was found to constitute a risk for the health of the mother and baby. Therefore this study was planned to obtain data referring to the mutation carrier rate in pregnant women followed up in gynecology and obstetrics clinics in our country. Blood specimens were obtained from pregnant women who were admitted to gynecology and obstetrics department of the I.U. Cerrahpaşa Faculty of Medicine between November 1999 to September 2000 and agreed to participate in the study; DNA specimens were isolated from peripheric blood using standard techniques. From the DNA specimens obtained the target site in the factor V gene was amplified with polymerase chain reaction ( PCR ) and the existance of the point mutation at 1691. nucleotide was investigated with restriction fragment length polymorphism ( RFLP ). Among the 72 women enrolled in the study - 35 healthy and 37 with complicated pregnancies - 10 women were shown to carry factor V Leiden mutation. Besides, among the pregnant women with complicated pregnancies - preeclampsia, IUGR, stillbirth - 8 were shown to be heterozygous for factor V Leiden mutation. These results obtained show that Leiden mutation is four times prevalent in the complicated pregnancies group when compared with the control.group. T&&**0*** 50

VI 3. ÖZET DİKKAT EKSİKLİĞİ AŞIRI HAREKETLİLİK BOZUKLUĞUNUN DOPAMİN GENLERİ İLE İLİŞKİSİ Okul çağı çocuklarında en sık rastlanan nöröpsikiyatrik bozukluk olan Dikkat Eksikliği Aşın Hareketlilik Bozukluğu (DEAHB) küçük yaşlarda başlayıp, %2-5 arasında görünme sıklığı olan önemli bir sorundur. DEAHB belirgin düzeyde davranışsal, sosyal ve eğitimsel problemlere neden olmakla beraber çoğunlukla erişkin yaşamda da devam eder (1,2). Genetik unsurların yanında, etiyoloj isinde dopamin nörotransmisyon hataları en yaygın görüştür. Bu bağlamda farklı çalışmalar dopamin 4 reseptör (DRD4), dopamin taşıyıcısı (DAT1), dopamin 5 reseptör (DRD5), ve dopamin beta hidroksilaz (DI3H) genleri ile DEAHB 'lu olan çocuklarda genetik ilişkiyi (association) göstermiştir. Moleküler genetiği ilk defa bu tezde araştırılan Türk DEAHB populasyonunun olası dopamin genleri ile ilişkisi, ve bu genlerin klinik semptomlarla bağlantıları toplam 106 anne-baba- hasta çocuk üçlüsünde ve 7 anne veya baba-hasta çocuk ikilisinde irdelenmiştir. Aile temelli Kalıtılabilme Eşitsizliği Testleri (KET) sonucunda DEAHB ile DRD4 genindeki 7-tekrarlı alelle anlamlı ilişki (ki kare =2.79 tek yönde p=0.047) ve DRD5 genindeki ikili-tekrarlı polimorfizimdeki en sık görünen 151 bç'lik alel (8 aleli) ile doğru yönde bir trend gösterilmiştir (ki kare=2.38, tek yönde p=0.06). Analiz sadece metilfenidat tedavisine pozitif yanıt veren çocuklar arasında yapıldığında, her iki gende de tüm örneklerdeki bulgulara oranla daha anlamlı ilişkiler gösterilmiştir (DRD4 için: ki kare =4.48 tek yönde p=0.017; DRD5 için: ki kare =4.9 tek yönde p=0.013). DRD5VII bulgusu bildiğimiz kadarıyla, DRD5 genin ilk defa İrlanda populasyonunda gösterilen pozitif ilişkisinin ilk doğrulanmasıdır (3). Bu çalışmanın limitleri dahilinde diğer aday genlerden olan DAT1, DBH ve COMT genlerinin DEAHB ile doğrudan ilişkileri bulunamamıştır. Diğer psikiyatrik hastalıklar gibi DEAHB 'da klinik heterojenite gösterdiğinden, aday genlerin ilişkileri DEAHB 'nun klinik özellikleri çerçevesinde de irdelenmiştir. Daha önceki bulguların tersine, lojistik regresyon ve öğrenci t-testleri, DRD4 7-tekrarlı alelin kalıtımının, DEAHB 'nun aşın hareketlilik ve dürtüsellik semptomplan ile ters orantı içinde olduğunu, dolayısıyla bu hasta grubunda DRD4 7-tekrarlı alelin daha az ciddi bir klinik tablo ile ilişkilendiğini ortaya çıkarmıştır. Ayrıca davranış bozuklukları komorbitesinin DRD4 7-tekrarlı aleli taşıyan grupta daha az ortaya çıktığı da gösterilmiştir. DBH genindeki 174 bç aleli ile DEAHB' na komorbit dürtüsel davranış özellikleri ile karakterize edilen Tourette Sendromu (TS)/tikleri olan çocuklarda anlamlı bir ilişki gösterilmiştir ve bu da örnekler arasından ayrı bir etiyolojiye sahip DEAHB- TS/tik altgrubu olabileceği düşündürmektedir. Sonuç olarak bu tezden çıkan bulgular DRD4 ve DRDS genlerinin, Türk populasyonunda DEAHB fenotipinin oluşumunda rol oynayabileceklerini ortaya koymaktadır. vuı 3. SUMMARY DOPAMINE GENES ASSOCIATION EST ATTENTION DEFICIT HYPERACTIVITY DISORDER Attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) is a common childhood neuropsychiatry disorder, affecting 2-5 % of school age children. ADHD leads to significant behavioural, social and educational impairments which frequently persist into adult life (1,2). Genetic factors together with dysfunctional dopaminergic neurotransmission are the most common believes in the etiology of the disorder. Accordingly, different studies have shown positive associations of dopamine 4 receptor (DRD4), dopamine 5 receptor (DRD5), dopamine transporter (DAT1), and dopamine beta hydroxylase (DBH) genes in children with ADHD. This thesis has attempted to investigate, for the first time, the molecular genetics of Turkish ADHD population in a total of 106 mother-father-affected child trios and 7 mother or father- affected child single parented families. It aimed to replicate previous dopamine genes associations and their relation to clinical semptomps of ADHD. Using family based approaches, like Transmission Disequilibrium Test (TDT), we found increased transmission of the DRD4 7-repeat allele (chi-square = 2.79, one tailed p = 0.047). We also detected a trend with the the most common allele of DRD5 polymorphism(chi square=2.38, one tailed p = 0.06). Analysis of the sample excluding non-responders revealed more significant evidence for the association in both genes (DRD4 chi square = 4.48, one tailed p = 0.017; DRD5 chi-square = 4.9, one tailed p = 0.013). To our knowledge DRD5 finding of this study represents the first replication of the original DRD5 association in Irland population (3). Within the limits of this study TC¥ÛKSEKÜG*m MKÜMMITASY6N MKBKEZJIX there was no evidence for direct involvement of other candidate genes, that were DAT1, DBH and COMT in this Turkish ADHD population. As ADHD presents a clinical heterogeneity, like other psychiatric disorders, candidate genes associations have been further analysed with regards to clinical characteristics of ADHD. In contrast to previous findings, student t-test and logistic regression TDT analyses of DRD4 7-repeat allele transmission with respect to hyperactivity and impulsivity dimensions, showed an inverse relation suggesting that in this sample DRD4 7-repeat is associated with a lower level of ADHD symptomatology. Furthermore, the presence of the 7-repeat was also found to be inversely related to presence of conduct disorder comorbidity. There was also a significant association with a polymorphism on DBH gene (174 bp allele) and Tourette Sendrome (TS)/tic comorbidity. This suggested a presence of an etiologically different ADHD-TS/tic subgroup. In conclusion, the findings of this thesis suggests that DRD4 and DRDS genes might have a role in the development of ADHD phenotype in this selected Turkish ADHD sample. 127

ÖZETSon yyllarda klasik hibridoma teknolojisi ile hücrelerin ölümsüzle?tirilmesinin yerini, rekombinant DNA teknolojisi ile faj gösterim tekniklerinin birle?tirilerek uygulanmasy ile genlerin ölümsüzle?tirilmesi almaya ba?lamy?tyr.Monoklonal antikorlar in vitro tany testlerinde, 1980'lerden beri ba?ary ile kullanylmaktadyr. Antikorlaryn tedavi ve in vivo tany testlerinde kullanymy 1990'dan sonra giderek artmy?tyr ve tedavi molekülleri olarak da de?erlendirilmeye ba?lanmy?dyr. Monoklonal antikor üretiminde kullanylan B hücre ölümsüzle?tirme tekni?indeki pek çok zorluk faj gösterim ile çözülmü?tür.1990'laryn ba?yna kadar monoklonal antikorlar Köhler ve Milstein tarafyndan tanymlanan hibridoma teknolojisi ile elde edilmekte idi. Ymmün sistemin antijene özgül antikorlary üreten B hücrelerinin sayysyny artyrmaya yönelik uyarymy, hücre füzyonu ile bu antikor üreten hücrelerin immortalizasyonu ve geni? bir tarama ile istenen özelliklerde antikor üreten sabit hücre hatlarynyn tanymlanmasy ile özetlenebilen teknik 20 yyldan fazla zamandyr kullanylmaktadyr.1990'laryn ba?yndan bu yana kaydedilen son geli?melerle; bakteride fonksiyonel antikor parçalarynyn üretilmeye ba?lanmasy, polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) (58) kullanylarak antikor genlerinin izolasyonu ve ço?altylmasy, faj gösterimle güçlü tarama sistemlerinin birle?tirilmesi (53), hibridoma tekni?indeki kar?yla?ylan pekçok zorlu?u a?makta hatta immünizasyon ve hayvan kullanymy tamamen i?lem dy?y byrakylmaktadyr. Bu tez çaly?masy rekombinant DNA teknolojisi ve faj gösterim tekni?i uygulanarak yapysal olmayan bir protein antijen olarak kullanylarak rekombinant proteine ait scFv eldesi üzerine yapylan bir çaly?madyr. Model protein olarak kullanylan Tütün Mozaik Virüs'ünün fonksiyonel proteini olan RNA'ya ba?ly RNA polimerazyn (replikaz) antijenik bölgesi, bakteride füzyon protein olarak eksprese edilmi? ve füzyon protein antijen olarak hazyrlanmy?tyr. TMV'nin bitki hücresini enfekte etti?inde ilk sentezlenen proteini olan replikaz membran yapyda bulunan safla?tyrylmasy zor bir proteindir. Füzyon protein olarak hazyrlanan replikaz farelere immünize edilmi? ve fare dalaklaryndan antikorlaryn de?i?ken bölge genleri ço?altylmy?tyr. scFv ?eklinde bir araya getirilen antikor V bölge genleri pCANTAB 5E fajmit vektöre klonlanmy?tyr. scFv-faj kütüphanesi füzyon protein ile elenerek anti-replikaz-b-gal.-scFv kütüphanesi elde edilmi?tir. Bu tez çaly?masy TMV replikazyna kar?y ilk rekombinant antikor çaly?masydyr.PRODUCTION OF ANTIBODY AGAINST A RECOMBINANT ANTIGEN BY USING RECOMBINANT DNA TECHNIQUESSUMMARYHybridoma technology is uesd for the immortalization of antibody producing cells, but in recent years by using recombinant DNA and phage display antibody genes are immotalized.Monoclonal antibodies have been used succesfully in vitro diagnostic tests since 1980. In vivo therapeutic and diagnostic use of antibodies have been increasing since 1990. The technical problems seen in B cell immortalization in monoclonal antibody production has not been observed in phage display.Monoclonal antibodies have been obtained by the methods described by Köhler and Milstein till 1990's. Stimulation of immune system to increase antigen specific B cell number immortalization of antibody producing cells by cell fusion, and with wide screening system to detect stable cell lines producing antibodies with desired properties. Hybridoma technology have been used for 20 years succesfully.The improvements from the begining of 1990; production of antibody fragments in bacteria, isolation and amplification of antibody varibale region by using polimerase chain reaction (PCR) (58), combination of phage display (53) and powerful screaning systems, the difficulties in hybridoma technology have been bypassed even without immunization and use of animal.In this thesis, recombinant DNA technology and phage display techniques have been used for obtaining scFv against a recombinant nonstructural protein. Tobacco Mosaic virus nonstructural protein, RNA dependent RNA polymerase (replicase) antigenic site was used as a model protein and expressed in bacteria and used as an antigen. Replicase is a membraneus protein and it is difficult to purify. Replicase is the first protein expressed by TMV after infection of plant cell. Mouse were immunized with prepared replicase fusion protein and V genes were amplified. V genes were assembled as scFv and cloned on pCANTAB 5E phagemid vector. ScFv-phage library selected with fusion protein and an anti-replicase-b-gal.-scFv library has been obtained. This thesis is the first scFv study against TMV replicase.

IX ÖZET Son zamanlarda geliştirilen `Faj Gösterim Teknikleri` ile farklı sınıflara ait birçok molekül için algılayıcı yapıların oluşturulması sağladığı gibi bağışıklama yapılmaksızın antikor geliştirilmesi de mümkün olmaktadır. Faj gösterim teknolojisinin bu özellikleri bilim adamlarına, tanı amaçlı hayvan antikorları geliştirilmesinde zaman kazanımı, tedaviye yönelik insan antikorları geliştirme olanağı ve aynı zamanda immünojen olmayan moleküller ve haptenler için antikor üretim şansı sağlar. Bu çalışmada, kolon kanserinin bir işareti olabilecek dışkıdaki gizli kanın ve hemoglobinopatilerde populasyon taraması çalışmalarında diğer hemoglobin tiplerinin tespit edilmesinde kullanılmak üzere nihai hedef olan immünokitlerin geliştirilmesi amacıyla faj gösterim teknolojisi kullanarak scFv ( tek zincir değişken parça) formunda rekombinant anti-hemoglobin A elde edildi. Hemoglobin A'ya karşı scFv üretimi için, ticari olarak satılan liyofilize hemoglobin A ile Balb/CJ soyuna ait fare bağışıklandı ve antikor molekülünün fonksiyonel değişken ağır ve hafif zincir genleri antijenle uyarılmış B lenfosit mRNA'larından elde edildi. Immunglobulin değişken ağır ve hafif zincirleri PCR yardımıyla scFv formunda bir arayagetirilerek pCANTAB5E vektörüne klonlandı. Beş tur yapılan `biopanning` işlemi sorasında rastlantısal olarak seçilen 93 adet klon hemoglobine karşı faj ELİSA yöntemi ile tarandı ve beş adet klon pozitif olarak kabul edildi. Faj ELİSA sonuçlarına göre pozitif olan klonlar klonlama bölgeleri ve insert büyüklükleri polimeraz zincir reaksiyonu ve enzim kesimleriyle ile test edildi. BerHb77 olarak isimlendirilen klonun nükleotid dizisinin tespit çalışmaları yapıldı. BerHb77' ye ait olan nükleotid dizisinin nükleotid dizi bankasında ( GENBANK) yapılan karşılaştırmaları sonucunda aynı diziye rastlanmadı. Sonuçlar diğer hemoglobin tiplerinin saha tespit çalışmasında kullanılacak olan immüntanı kitlerinin geliştirilmesinde faj gösterim teknolojisinin kullanılabilirliğini göstermektedir. vıı SUMMARY Recently developed `phage display techniques` are used to find ligands for many molecules of different classes which can be applied in purification schemes, diagnostics or therapeutics.presenting great potential in the field of the development of antibodies. These characteristics of the `Phage DisplayTechnology` can givethe opportunity to the scientists time- saving in the case of animal antibodies, the chance for the development of human antibodies and also providing antibody production for non- immunogenic molecules and haptens or self antigens in all cases. In this study we obtained recombinant anti-human hemoglobin A in the form of scFv ( single chain variable fragment ) by using phage display technology with the ultimate aim of developing immunodiagnostic kits for the detection of occult blood in the feces which could be a sign of the column cancer and other hemoglobin types for population screening studies in hemoglobinopathies. In the production of anti-hemoglobin A scFv, Balb/CJ mice were immunized with lyophilized commercial human hemoglobin A and the functional variable heavy and light chain genes of antibody were obtained from antigen stimulated B-lymphocyte mRNAs. Variable Ig heavy and light chain genes were assembled together in the form of scFv by polymerase chain reaction and cloned into the vector pCANTAB5E ( purchase from Pharmacia). After the five round of `biopanning`.randomly selected 93 clones were tested against human hemoglobin by phage ELISA and five clones were accepted as positive. According to the phage ELISA results ; positive clones were tested with respect to its multiple cloning site and its insert size with polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion. The clone coded as BerHb77 was sequenced to identify its nucleotide composition. The nucleotide sequence of BerHb77scfv was compared with nucleotide data bank ( GENBANK) by using BLAST and couldn't be found same nucleotide sequence in data bank.vııı The results show that application of phage display technology is possible for developing immunodiagnostic kits for detection other hemoglobin types for population screening studies in hemoglobinopaties. 141

IV- Özet: Telomerik tekrarlar ilk tanımlandıkları günden beri özellikle telomer uzunluğunun kanser oluşum mekanizmasında ve yaşlanmadaki rolü açısından bilimin ilgi odağı olmuşlardır. Telomerik bölge kromozomların terminal ucunda yerleşmiş tekrarlayan dizilerden oluşmuştur. Telomerik tekrarların görevi her replikasyonla gerçekleşen lineer kromozom kısalmasını dengelemektir. Kromozomlarda meydana gelen kısalmanımn olası nedeninin arkadan gelen zincirin tamamlanmamış replikasyonu olabileceği düşünülmektedir. Bu problem kromozom uçlarına DNA ilavesi ile çözümlenmektedir. Telomerik dizilerin sentromerik uçlarında değişken diziler bulununurken uç kısımda konvansiyonel dizi yer almaktadır. Telomerlerdeki kısalma araştırılırken konvansiyonel ve değişken dizinin beraber incelenmesi gerekmektedir. Farklı gruplar konvansiyonel dizinin incelenmesinde in situ hibridizasyon tekniğini kullanmışlardır. Bu çalışmada telomerik tekrarlar fare, hamster hücre soyları ile sağlıklı insan ve lösemili hastalardan elde edilen lenfosit kromozomları üzerinde; telomer organizasyonunun analizi için dd PRINS, yöntem karşılaştırması içinse PNA-FISH ile ddPRINS kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlar her iki yöntemin de telomer çalışmaları için uygun olduğunu buna karşın PRINS le elde edilen sinyallerin PNA ile elde edilenlerden genelde daha güçlü olduğunu göstermektedir. Kullanılan üç tür arasında benzerlikler ve farklılıklar gözlenmiştir. Elde edilen sonuçlar değişken dizinin türler arasmda farklılık gösterdiği ve organizasyonunun konvansiyonel dizi içinde serpiştirilmiş bir yapıda mı yoksa farklı bir bölge olarak mı yapılandığım açıklar niteliktedir. Bir türün kromozomlarının telomerlerinde oluşan kısalma veya yapısal değişiklikler kromozomlar tararından bireysel olarak mı yönetiliyor yoksa hücre tararından mı kontrol ediliyor sorusunu cevaplamak amacıyla yapılan çalışmalardan elde edilen sonuçlar, yabancı kromozomların telomerlerinin konakçı hücrenin özelliklerini taşıdığım ve onun gibi davrandığını göstermektedir. -V- SUMMARY: Investigation on the Relationship of Telomeres with Cancer and Aging by Using Advanced Molecular Cytogenetic Techniques Ever since the first identification of telomeric repeats, the study of telomere organization has been of scientific interest. This is particularly due to an assumed role of telomere length in cellular aging and cancer progression. The telomeric region of chromosomes is composed of repeats of disposable DNA, localized at extremity of the chromosomes. The function of the telomeric repeats is to compensate the shortening of linear chromosomes, as it happens in every round of replication. The chromosome shortening is possibly caused by an incomplete replication of the lagging strand. This problem has been solved by the addition of disposable DNA repeats at chromosomal termini. In the centromeric end of telomeric repeats, variable repeats are defined. Whereas, at the tip part of telomeric repeats, perfect repeats are localized. In studies of telomere shortening it would be relevant to analyze both, variant and perfect (canonical) repeats. Different groups have reported perfect repeat detection in situ and we have recently achieved selective staining of variant repeats as well. In this study, we have investigated telomeric repeats in mouse cell lines, hamster cell lines and in human lymphocyte chromosomes from healthy donors and leukemia patients, stained by ddPRINS (to investigate the organization) and by FISH (to compare these two methods ) with PNA probes. Our results with the two techniques are comparable, except that the PRINS signals are seem to be generally three times as strong as the PNA signals. Both, similarities and differences in the organization of telomeric repeats exist between the three species compared here. The differences include which variant repeats are actually found at the telomere, and also whether these are organized as a discrete domain or dispersed in the canonical repeat. In chromosomes from one of the species, propagated inside another species, we were unable to identify telomeric differences between this chromosome and the `host` chromosomes, and we thus found no evidence that individual chromosome ends influence their own telomere organization. 104

IX ÖZET Son yıllarda klasik hibridoma teknolojisi ile hücrelerin ölümsüzleştirilmesinin yerini, rekombinant DNA teknolojisi ile faj gösterim tekniklerinin birleştirilerek uygulanması ile genlerin ölümsüzleştirilmesi almaya başlamıştır. Monoklonal antikorlar in vitro tanı testlerinde, 1980'lerden beri basan ile kullanılmaktadır. Antikorların tedavi ve in vivo tanı testlerinde kullanımı 1990' dan sonra giderek artmıştır ve tedavi molekülleri olarak da değerlendirilmeye başlanmışdır. Monoklonal antikor üretiminde kullanılan B hücre ölümsüzleştirme tekniğindeki pek çok zorluk faj gösterim ile çözülmüştür. 1990'lann başına kadar monoklonal antikorlar Köhler ve Milstein tarafından tanımlanan hibridoma teknolojisi ile elde edilmekte idi. İmmün sistemin antijene özgül antikorları üreten B hücrelerinin sayısını artırmaya yönelik uyarımı, hücre fîizyonu ile bu antikor üreten hücrelerin immortalizasyonu ve geniş bir tarama ile istenen özelliklerde antikor üreten sabit hücre hatlarının tanımlanması ile özetlenebilen teknik 20 yıldan fazla zamandır kullanılmaktadır. 1990'lann başından bu yana kaydedilen son gelişmelerle; bakteride fonksiyonel antikor parçalannın üretilmeye başlanması, polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) (58) kullanılarak antikor genlerinin izolasyonu ve çoğaltılması, faj gösterimle güçlü tarama sistemlerinin birleştirilmesi (53), hibridoma tekniğindeki karşılaşılan pekçok zorluğu aşmakta hatta immünizasyon ve hayvan kullanımı tamamen işlem dışı bırakılmaktadır. Bu tez çalışması rekombinant DNA teknolojisi ve faj gösterim tekniği uygulanarak yapısal olmayan bir protein antijen olarak kullanılarak rekombinant proteine ait scFv eldesi üzerine yapılan bir çalışmadır. Model protein olarak kullanılan Tütün Mozaik Virüs'ünün fonksiyonel proteini olan RNA'ya bağlı RNA polimerazın (replikaz) antijenik bölgesi, bakteride fuzyon protein olarak eksprese edilmiş ve fîizyon protein antijen olarak hazırlanmıştır. TMV'nin bitki hücresini enfekte ettiğinde ilk sentezlenen proteini olan replikaz membran yapıda bulunan saflaştınlması zor bir proteindir. Fuzyon protein olarak hazırlanan replikaz farelere immunize edilmiş ve fare dalaklanndan antikorlann değişken bölge genleri çoğaltılmıştır. scFv şeklinde bir araya getirilen antikor V bölge genleri pCANTAB 5E fajmit vektöre klonlanmıştır. scFv-faj kütüphanesi fuzyon protein ile elenerek anti-replikaz-P-gal.-scFv kütüphanesi elde edilmiştir. Bu tez çalışması TMV replikazına karşı ilk rekombinant antikor çalışmasıdır. ABSTRACT Hybridoma technology is uesd for the immortalization of antibody producing cells, but in recent years by using recombinant DNA and phage display antibody genes are immotalized. Monoclonal antibodies have been used succesfMy in vitro diagnostic tests since 1980. In vivo therapeutic and diagnostic use of antibodies have been increasing since 1990. The technical problems seen in B cell immortalization in monoclonal antibody production has not been observed in phage display. Monoclonal antibodies have been obtained by the methods described by Köhler and Milstein till 1990's. Stimulation of immune system to increase antigen specific B cell number immortalization of antibody producing cells by cell fusion, and with wide screening system to detect stable cell lines producing antibodies with desired properties. Hybridoma technology have been used for 20 years succesfully. The improvements from the begining of 1990; production of antibody fragments in bacteria, isolation and amplification of antibody varibale region by using polimerase chain reaction (PCR) (58), combination of phage display (53) and powerful screaning systems, the difficulties in hybridoma technology have been bypassed even without immunization and use of animal. In this thesis, recombinant DNA technology and phage display techniques have been used for obtaining scFv against a recombinant nonstructural protein. Tobacco Mosaic virus nonstructural protein, RNA dependent RNA polymerase (replicase) antigenic site was used as a model protein and expressed in bacteria and used as an antigen. Replicase is a membraneus protein and it is difficult to purify. Replicase is the first protein expressed by TMV after infection of plant cell. Mouse were immunized with prepared replicase fusion protein and V genes were amplified. V genes were assembled as scFv and cloned on pCANTAB 5E phagemid vector. ScFv-phage library selected with fusion protein and an anti-replicase-P-gal.-scFv library has been obtained. This thesis is the first scFv study against TMV replicase. 111

In studies of hybridoma cell and vaccine preparation, in order to obtain a specificantibody, the selection of adjuvants, especially those which may help to increase theantigenicity of a particular substance is essential. In this perspective ,in the study presentedthe use of polyelectrolyte adjuvants was investigated.For the development of a model system, Bovine serum albumine (BSA) was complexedwith a number of different sytnthetic polymers which posses different physicochemicalproperties. Negatively charged polyacrilic acid (P AA) and BSA molecules were ligated byCu2+ions and the light -scattering method stable complexes and conjugates, which wereobserved soluble or insoluble forms in water and their immunological properties wereanalysed. The results obtained from the analysis of the correlation between thephysicochemical properties of polycomplexes and their immunological activities in vivosystems were as follows. (1) When polyanions were complex with BSA, the immunoresponse was increased by 4 to 5 fold, (2) this increase could only be observed only whenthe three substances, Cu2+, BSA and PAA were all participated in the complexes formed,and (3) it was found that antigens that were complexed with polymers required muchshorter time of immunization than that of conventional immunization procedures.Based on the resuls obtained from the model system described above, the second part ofthe thesis was concerned with the immunological studies on BSA -Progesterone (BSAP)complexes and the complexes they formed with polymer adjuvants. When compared to theresuls of controls used, immuno responses specific to progesterone appeared to beconsiderably higher. A comparative study of immunologic properties of polycomplexesversus BSAP-mcomplete Freund's adjuvant (IF A) mixtures revealed specific differences inthe antibody production. The immunized mice with BSAP+ polycomplexes and BSAP+IF A were used for fusion. 12 monoclonal antibodies of IgG 1 and IgG2a types wereobtained and the affinities of these antibodies were found to be 10.7_10.8 M . There was nocross reaction with the other steroid hormones.In consideration of the whole data obtained, it can be suggested that a helpful method forthe increase of the immunogenicity of antigens with little or no immunogenicity wasdescribed. 107

It is necessary to determine some of the proteins and hormons which exist inthe body fluids such as urin, serum or mucus for diagnosis of some disease. In orderto determine these proteins and hormons (antigens) by using immunological methods,some antibodies which are binding to them are required. In this study, clinicallyimportant antigens and some monoclonal and polyclonal antibodies developed againstthese antigens were choiced. Some of the antigens were purified and test systemswhich are based on antigen-antibody interactions were developed.Using hybridoma technology, some hybrid cells which produce anti-HbA andanti-Transferrin monoclonal antibodies were produced. Monoclonal antibodies fromsupernatant of culturated hybrid cell and prepared antybody - enzyme conjugateswere prufied by using various protein prufication methods. The application of theimmunological test systems are based on antibodies. These systems are differentdepending on the structure of the antibody (monoclonal or polyclonal) and bodyfluids. We used generally indirect, competitive or sandwich ELISA systems.We developed enzyme-linked immunoassays using monoclonal or polyclonalantibodies against fhM (~2 Microglobulin) or hCG (Human Chorionic Gonadotropin).We prepared second antibody-enzyme conjugates m order to use inimmunological kits. Polyclonal antibodi 150

IV 3. ÖZET Yurtdışında son yıllarda, ileri moleküler biyolojik yöntemler kullanılarak, HBV'nin genomik yapısının araştırılmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. HBV enfeksiyonunun ciddi seyirli olması, kronikleşmesi ve tedaviye yanıtsız kalması konağın dışındaki etkenlerle de ilişkilendirilmek- tedir. HBV genomunun Prekor-Kor bölgesinde saptanan bazı mutasyonlar, özellikle de Akdeniz ülkelerinde sık görülen HBe Ag'nin sentezlenmesini engelleyerek, virüsün konağın bağışıklık sisteminden kurtulmasına neden olan A1896mutasyonu bu durumlardan sorumlu tutulmaktadır. Bu çalışma, ülkemizin HBV enfeksiyonu yönünden endemik olması, bir Akdeniz ülkesi olması ve HBV genomunun baz dizisine ilişkin moleküler düzeyde çalışmaların bildiğimiz kadarı ile ülke koşullarımızda gerçekleştirilmemiş olması temel alınarak, Marmara Üniversitesi (M.Ü.) Tıp Fakültesi Gastroenteroloji Bilim Dalı işbirliği ile M.Ü. Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalında planlanmıştır. Bu amaçla yürütülen çalışmada, serum ve doku HBV DNA varlığı, dot blot hibridizasyon ve Digoksigenin İn Situ Hibridizasyon (DİSH) yöntemleri ile gösterildi; HBV genomuna ilişkin A1896 ve/veya diğer mutasyonların varlığı ise, DNA dizi analizi, mutasyon belirleyici dot blot hibridizasyon ve Amplifikasyona Refrakter Mutasyon Sistemi (ARMS), Amplifikasyon İle Yara tılan Restriksiyon Kesim Noktası (Amplification Created Restriction Site - ACRS) gibi Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile Restriksiyon Endonükleaz (RE) kesimine dayalı ileri moleküler biyolojik yöntemler kullanılarak saptandı. Çalışmada akut ve kronik hepatitli 170 olgunun serumu dot blot hibridizasyon yöntemi ile incelendi ve 87 olgu serum HBV DNA yönünden pozitif bulundu. 12 olgunun karaciğer ince iğne aspirasyon biyopsi örnekle rinde HBV DNA varlığı DİSH yöntemi ile incelendi ve 10 olgu doku HBV DNA yönünden pozitif bulundu. Anti HBe pozitif kronik hepatit B enfeksiyonlu 17 olgu, HBV genomunun Prekor-Kor ve bir kısım X gen bölgeleri yönünden DNA dizi analizi ile incelendiğinde, 4 olguda A1896 stop kodon mutasyonuna ek olarak çeşitli nokta mutasyonlarına rastlandı. Bu 4 olguda DNA dizi analiziyöntemiyle saptanan A1896 mutasyonunun varlığı ayrıca, bilinen bir mutasyonu saptamaya olanak tanıyan dot blot hibridizasyon, ARMS ve ACRS yöntemleri uygulanarak da doğrulandı. Çalışmada ayrıca, HBV genomunun Prekor-Kor ve bir kısım X gen bölgelerinde şimdiye dek yayınlanmış mutasyonlara ek olarak, hiç tanımlan mamış nokta mutasyonlarına da rastlanmıştır. Bunlar: Prekor bölgesinde kodon 10, 11 ve 17'de ve X geninde kodon 104, 105, 116, 117, 120, 122, 123, 128, 129 ve 145'te saptanan nokta rotasyon larıdır. VI 4. SUMMARY In recent years, by the use of advanced molecular techniques, a lot of progression has been accomplished in the field of HBV genome analysis. The tendency of HBV to cause a more severe and a chronic disease in certain cases and the reason of poor or intermittant response to therapy in those patients have been related to facts other than that of the host. Specific mutations in the precore region of HBV genome, especially the A1896 stop codon mutation, which is mostly seen in Mediterranean countries and which abolishes the synthesis of HBeAg, thereby causing the virus to escape from the immune system of the host, have been hypothesized to be responsible for such cases. This study has been planned and performed by Marmara University, Medical Faculty, Department of Medical Biology and Genetics with the cooperation of Department of Internal Medicine, Division of Gastroenterology, by taking into consideration the facts that, Turkey is an endemic country in terms of HBV infection, is also a Mediterranean country where the frequency of A1896 stop codon mutation may also be high. No study being conducted to enlighten the base sequence of HBV genome in Turkey was another stimulus for the realisation of this study. In this study, presence of HBV DNA in serum and tissue has been shown by dot blot hybridization and Digoxigenin In Situ Hybridization (DISH) methods respectively. Presence of A1896 stop codon mutation or other mutations of HBV genome have been detected by the use of advanced molecular techniques such as DNA sequence analysis, mutation detecting dot blot hybridization, Amplification Refractory Mutation System (ARMS) and Amplification Created Restriction Site (ACRS). These are techniques mainly based on Polymerase Chain Reaction (PCR) and/or restriction endonuclease digestion (RE). Sera from 170 patients with acute and chronic HBV infection were analysed by dot blot hybridization and 87 cases were found to be positive forVII HBV DNA. Liver thin needle aspiration biopsy samples of 12 cases were analysed for the absence of HBV genome by DISH and 10 of them were found to carry HBV DNA in their liver tissues. 17 anti-HBe (+) chronic hepatitis B cases were analysed by direct sequencing of PCR amplified HBV DNA and 4 cases were found to have A1896 stop codon mutation. This specific mutation has also been confirmed by other techniques such as ARMS, ACRS and mutation detecting dot blot hybridization. In addition to mutations that were published earlier, some unidentified mutations have also been detected in this study. These mutations are point mutations detected in codon 1 0, 1 1 and 1 7 of Precore region and codon 1 04, 105, 116, 117, 120, 122, 123, 128, 129 and 145 in X open reading frame of HBV genome. 159