Rekombinant DNA teknolojisi ile rekombinant bir antijene karşı antikor üretimi

IX ÖZET Son yıllarda klasik hibridoma teknolojisi ile hücrelerin ölümsüzleştirilmesinin yerini, rekombinant DNA teknolojisi ile faj gösterim tekniklerinin birleştirilerek uygulanması ile genlerin ölümsüzleştirilmesi almaya başlamıştır. Monoklonal antikorlar in vitro tanı testlerinde, 1980'lerden beri basan ile kullanılmaktadır. Antikorların tedavi ve in vivo tanı testlerinde kullanımı 1990' dan sonra giderek artmıştır ve tedavi molekülleri olarak da değerlendirilmeye başlanmışdır. Monoklonal antikor üretiminde kullanılan B hücre ölümsüzleştirme tekniğindeki pek çok zorluk faj gösterim ile çözülmüştür. 1990'lann başına kadar monoklonal antikorlar Köhler ve Milstein tarafından tanımlanan hibridoma teknolojisi ile elde edilmekte idi. İmmün sistemin antijene özgül antikorları üreten B hücrelerinin sayısını artırmaya yönelik uyarımı, hücre fîizyonu ile bu antikor üreten hücrelerin immortalizasyonu ve geniş bir tarama ile istenen özelliklerde antikor üreten sabit hücre hatlarının tanımlanması ile özetlenebilen teknik 20 yıldan fazla zamandır kullanılmaktadır. 1990'lann başından bu yana kaydedilen son gelişmelerle; bakteride fonksiyonel antikor parçalannın üretilmeye başlanması, polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) (58) kullanılarak antikor genlerinin izolasyonu ve çoğaltılması, faj gösterimle güçlü tarama sistemlerinin birleştirilmesi (53), hibridoma tekniğindeki karşılaşılan pekçok zorluğu aşmakta hatta immünizasyon ve hayvan kullanımı tamamen işlem dışı bırakılmaktadır. Bu tez çalışması rekombinant DNA teknolojisi ve faj gösterim tekniği uygulanarak yapısal olmayan bir protein antijen olarak kullanılarak rekombinant proteine ait scFv eldesi üzerine yapılan bir çalışmadır. Model protein olarak kullanılan Tütün Mozaik Virüs'ünün fonksiyonel proteini olan RNA'ya bağlı RNA polimerazın (replikaz) antijenik bölgesi, bakteride fuzyon protein olarak eksprese edilmiş ve fîizyon protein antijen olarak hazırlanmıştır. TMV'nin bitki hücresini enfekte ettiğinde ilk sentezlenen proteini olan replikaz membran yapıda bulunan saflaştınlması zor bir proteindir. Fuzyon protein olarak hazırlanan replikaz farelere immunize edilmiş ve fare dalaklanndan antikorlann değişken bölge genleri çoğaltılmıştır. scFv şeklinde bir araya getirilen antikor V bölge genleri pCANTAB 5E fajmit vektöre klonlanmıştır. scFv-faj kütüphanesi fuzyon protein ile elenerek anti-replikaz-P-gal.-scFv kütüphanesi elde edilmiştir. Bu tez çalışması TMV replikazına karşı ilk rekombinant antikor çalışmasıdır. ABSTRACT Hybridoma technology is uesd for the immortalization of antibody producing cells, but in recent years by using recombinant DNA and phage display antibody genes are immotalized. Monoclonal antibodies have been used succesfMy in vitro diagnostic tests since 1980. In vivo therapeutic and diagnostic use of antibodies have been increasing since 1990. The technical problems seen in B cell immortalization in monoclonal antibody production has not been observed in phage display. Monoclonal antibodies have been obtained by the methods described by Köhler and Milstein till 1990's. Stimulation of immune system to increase antigen specific B cell number immortalization of antibody producing cells by cell fusion, and with wide screening system to detect stable cell lines producing antibodies with desired properties. Hybridoma technology have been used for 20 years succesfully. The improvements from the begining of 1990; production of antibody fragments in bacteria, isolation and amplification of antibody varibale region by using polimerase chain reaction (PCR) (58), combination of phage display (53) and powerful screaning systems, the difficulties in hybridoma technology have been bypassed even without immunization and use of animal. In this thesis, recombinant DNA technology and phage display techniques have been used for obtaining scFv against a recombinant nonstructural protein. Tobacco Mosaic virus nonstructural protein, RNA dependent RNA polymerase (replicase) antigenic site was used as a model protein and expressed in bacteria and used as an antigen. Replicase is a membraneus protein and it is difficult to purify. Replicase is the first protein expressed by TMV after infection of plant cell. Mouse were immunized with prepared replicase fusion protein and V genes were amplified. V genes were assembled as scFv and cloned on pCANTAB 5E phagemid vector. ScFv-phage library selected with fusion protein and an anti-replicase-P-gal.-scFv library has been obtained. This thesis is the first scFv study against TMV replicase. 111