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A Biologia Celular é uma área que detém um aporte massivo de conteúdos e termos complexos. Assim, muitos alunos se sentem desafiados no ato de aprender, podendo ser uma tarefa hercúlea. No intuito de facilitar a aprendizagem de conteúdos voltados nesta área, este artigo possui como principal objetivo avaliar o impacto de uma aula experimental aos alunos do curso de Gestão Ambiental, na disciplina de Biologia Geral do IFMT, Campus de Sorriso, no que tange a contextualização da ação da enzima catalase em células animais e vegetais quando submetidos a presença de peróxido de hidrogênio (água oxigenada ou H2O2). A metodologia consistiu em uma aula experimental utilizando-se materiais simples e de baixo custo como folhas de vegetais colhidas e carne de fígado, onde foram analisadas a ação da enzima catalase sob seu substrato (água oxigenada), em ambos os materiais in natura e submetidos à fervura (cozimento). Como principal resultado do experimento, os alunos puderam perceber que os tecidos frescos apresentaram borbulhas quando em presença do peróxido de hidrogênio, devido a reação de decomposição deste composto por meio da ação da enzima catalase presente nos peroxissomos destas células. Já para os materiais fervidos não foi observado reação, uma vez que o calor desnaturar a enzima catalase, perdendo sua função catalítica de decomposição do peróxido de hidrogênio. Assim, concluímos que os alunos se mantiveram atentos e mostraram-se motivados em todo o percurso experimental, fazendo desta atividade uma excelente metodologia para contextualização do tema abordado, impactando positivamente sua aprendizagem.

Islet-1 (Isl1) is one of the most conserved transcription factors in the evolution of vertebrates, due to its continuing involvement in such important functions as the differentiation of motoneurons, among other essential roles in cell fate in the forebrain. Although its functions are thought to be similar in all vertebrates, the knowledge about the conservation of its expression pattern in the central nervous system goes as far as teleosts, leaving the basal groups of actinopterygian fishes overlooked, despite their important phylogenetic position. In order to assess the extent of its conservation among vertebrates, we studied its expression pattern in the central nervous system of selected nonteleost actinopterygian fishes. By means of immunohistochemical techniques, we analyzed the Isl1 expression in the brain, spinal cord, and sensory ganglia of the cranial nerves of young adult specimens of the cladistian species Polypterus senegalus and Erpetoichthys calabaricus, the chondrostean Acipenser ruthenus, and the holostean Lepisosteus oculatus. We also detected the presence of the transcription factor Orthopedia and the enzymes tyrosine hydroxylase (TH) and choline acetyltransferase (ChAT) to better locate all the immunoreactive structures in the different brain areas and to reveal the possible coexpression with Isl1. Numerous conserved features in the expression pattern of Isl1 were observed in these groups of fishes, such as populations of cells in the subpallial nuclei, preoptic area, subparaventricular and tuberal hypothalamic regions, prethalamus, epiphysis, cranial motor nuclei and sensory ganglia of the cranial nerves, and the ventral horn of the spinal cord. Double labeling of TH and Isl1 was observed in cells of the preoptic area, the subparaventricular and tuberal hypothalamic regions, and the prethalamus, while virtually all motoneurons in the hindbrain and the spinal cord coexpressed ChAT and Isl1. Altogether, these results show the high degree of conservation of the expression pattern of the transcription factor Isl1, not only among fish, but in the subsequent evolution of vertebrates.

167 p. La degeneración de la mielina y la pérdida de sustancia blanca son eventos tempranos en la enfermedad de Alzheimer (EA) que conducen a déficits cognitivos. Uno de los rasgos distintivos de la EA es la presencia de agregados extracelulares del péptido beta amiloide (Aß), y se ha propuesto que los oligómeros de Aß (Aßo) inducen cambios en los oligodendrocitos y la mielina. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo desconocidos. En esta tesis doctoral, describimos que el metabolismo del ARN y la traducción, entre otros, son mecanismos significativamente afectados en oligodendrocitos in vitro tratados con los ¿¿¿ y en el ratón triple transgénico modelo de la enfermedad in vivo. En concreto, los oligodendrocitos expresaron niveles elevados de la proteína básica de la mielina, y esta alteración provocó cambios significativos en la homeostasis de calcio oligodendroglial, en la composición de la vaina de la mielina y en la morfología del citoesqueleto de la actina. En conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis doctoral muestran que los Aßo cambian la proteostasis oligodendroglial influyendo en la dinámica de la maduración de los oligodendrocitos y en la vaina de mielina, con posibles consecuencias para la conducción axonal.

Drug repurposing is a valuable source of new antivirals because many compounds used to treat a variety of pathologies can also inhibit viral infections. In this work, we have tested the antiviral capacity of four repurposed drugs to treat Bunyamwera virus (BUNV) infection in cell cultures. BUNV is the prototype of the Bunyavirales order, a large group of RNA viruses that includes important pathogens for humans, animals and plants. Mock- and BUNV-infected Vero and HEK293T cells were treated with non-toxic concentrations of digoxin, cyclosporin A, sunitinib and chloroquine. The four drugs inhibited BUNV infection with varying potency in Vero cells, and all except sunitinib also in HEK293T cells, with digoxin rendering the lowest half maximal inhibitory concentration (IC50). Since digoxin rendered the best results, we selected this drug for a more detailed study. Digoxin is an inhibitor of the Na+/K+ ATPase, a plasma membrane enzyme responsible for the energy-dependent exchange of cytoplasmic Na+ for extracellular K+ in mammalian cells and involved in many signalling pathways. Digoxin was shown to act at an early time point after viral entry reducing the expression of the viral proteins Gc and N. Effects on the cell cycle caused by BUNV and digoxin were also analysed. In Vero cells, digoxin favoured the transition from G1 phase of the cell cycle to S phase, an effect that might contribute to the anti-BUNV effect of digoxin in this cell type. Transmission electron microscopy showed that digoxin impedes the assembly of the characteristic spherules that harbour the BUNV replication complexes and the morphogenesis of new viral particles. Both BUNV and digoxin induce similar changes in the morphology of mitochondria that become more electron-dense and have swollen cristae. The alterations of this essential organelle might be one of the factors responsible for digoxin-induced inhibition of viral infection. Digoxin did not inhibit BUNV infection in BHK-21 cells that have a digoxin-resistant Na+/K+ ATPase, which suggests that the effects of the blockade of this enzyme is a key factor of the antiviral activity of digoxin in BUNV-infected Vero cells.

Satb1 and Satb2 belong to a family of homeodomain proteins with highly conserved functional and regulatory mechanisms and posttranslational modifications in evolution. However, although their distribution in the mouse brain has been analyzed, few data exist in other non-mammalian vertebrates. In the present study, we have analyzed in detail the sequence of SATB1 and SATB2 proteins and the immunolocalization of both, in combination with additional neuronal markers of highly conserved populations, in the brain of adult specimens of different bony fish models at key evolutionary points of vertebrate diversification, in particular including representative species of sarcopterygian and actinopterygian fishes. We observed a striking absence of both proteins in the pallial region of actinopterygians, only detected in lungfish, the only sarcopterygian fish. In the subpallium, including the amygdaloid complex, or comparable structures, we identified that the detected expressions of SATB1 and SATB2 have similar topologies in the studied models. In the caudal telencephalon, all models showed significant expression of SATB1 and SATB2 in the preoptic area, including the acroterminal domain of this region, where the cells were also dopaminergic. In the alar hypothalamus, all models showed SATB2 but not SATB1 in the subparaventricular area, whereas in the basal hypothalamus the cladistian species and the lungfish presented a SATB1 immunoreactive population in the tuberal hypothalamus, also labeled with SATB2 in the latter and colocalizing with the gen Orthopedia. In the diencephalon, all models, except the teleost fish, showed SATB1 in the prethalamus, thalamus and pretectum, whereas only lungfish showed also SATB2 in prethalamus and thalamus. At the midbrain level of actinopterygian fish, the optic tectum, the torus semicircularis and the tegmentum harbored populations of SATB1 cells, whereas lungfish housed SATB2 only in the torus and tegmentum. Similarly, the SATB1 expression in the rhombencephalic central gray and reticular formation was a common feature. The presence of SATB1 in the solitary tract nucleus is a peculiar feature only observed in non-teleost actinopterygian fishes. At these levels, none of the detected populations were catecholaminergic or serotonergic. In conclusion, the protein sequence analysis revealed a high degree of conservation of both proteins, especially in the functional domains, whereas the neuroanatomical pattern of SATB1 and SATB2 revealed significant differences between sarcopterygians and actinopterygians, and these divergences may be related to the different functional involvement of both in the acquisition of various neural phenotypes.

Retinitis pigmentosa (RP) is a group of inherited retinal disorders that lead to photoreceptor loss. RP has been reported to be related to oxidative stress, autophagy, and inflammation. (-)-Epigallocatechin gallate (EGCG), the most abundant catechin-based flavonoid in green tea leaves, has significant antioxidant, anti-carcinogenic, antimicrobial, and neuroprotective properties. EGCG, given its low molecular weight and hydrophilic properties, can cross the blood-retinal barrier and is able to reach different ocular tissues such as the lens, cornea, and retina. EGCG has been shown to provide retinal protection against ischemia; sodium nitroprusside-, N-methyl-D-aspartate-, lipopolysaccharide-, light-, sodium iodate-, or H2O2-induced damage and diabetic retinopathy. This suggests that systemic EGCG administration has the potential to protect against retinal degenerative or neurodegenerative diseases such as RP. The aim of this work was to investigate whether EGCG can protect against RP progression in the animal P23H line 1, the model of RP. Albino P23H rats were crossed with pigmented Long Evans rats to produce offspring exhibiting the clinical features of RP. Pigmented P23H rats were treated via intraperitoneal injection with saline or EGCG at a dose of 25 mg/kg every week from P100 to P160 and then compared to wild-type Long Evans rats. Rats treated with EGCG showed better visual and retinal electrical function with increased contrast sensitivity and b-wave values compared with those observed in P23H rats treated with vehicle. EGCG reduced lipid peroxidation and increased total antioxidant capacity and catalase and superoxide dismutase activities. No differences were observed in visual acuity, nitrate levels, nitrite levels or glutathione S-transferase activity. In conclusion, EGCG not only reduced the loss of visual function in P23H rats but also improved the levels of antioxidant enzymes and reduced oxidative damage. This study was approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (CEICA) from the University of Zaragoza under project license PI12/14 on July 11, 2014. This study was supported by the Instituto de Salud Carlos III (project PI13/01124 and Ocular Pathology National Net RETICS-Oftared RD16/ 0008) the Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) funds: “Una manera de hacer Europa”; and the Government of Aragon (Group B08_17R and Predoctoral Grant L. Perdices, C060/2014).

The generation of functional regulatory T cells (Tregs) is essential to keep tissue homeostasis and restore healthy immune responses in many biological and inflammatory contexts. Cannabinoids have been pointed out as potential therapeutic tools for several diseases. Dendritic cells (DCs) express the endocannabinoid system, including the cannabinoid receptors CB1 and CB2. However, how cannabinoids might regulate functional properties of DCs is not completely understood. We uncover that the triggering of cannabinoid receptors promote human tolerogenic DCs that are able to prime functional FOXP3+ Tregs in the context of different inflammatory diseases. Mechanistically, cannabinoids imprint tolerogenicity in human DCs by inhibiting NF-κB, MAPK and mTOR signalling pathways while inducing AMPK and functional autophagy flux via CB1- and PPARα-mediated activation, which drives metabolic rewiring towards increased mitochondrial activity and oxidative phosphorylation. Cannabinoids exhibit in vivo protective and anti-inflammatory effects in LPS-induced sepsis and also promote the generation of FOXP3+ Tregs. In addition, immediate anaphylactic reactions are decreased in peanut allergic mice and the generation of allergen-specific FOXP3+ Tregs are promoted, demonstrating that these immunomodulatory effects take place in both type 1- and type 2-mediated inflammatory diseases. Our findings might open new avenues for novel cannabinoid-based interventions in different inflammatory and immune-mediated diseases.

Tesis doctoral, 145 p., La conexión entre el ciclo celular y la diferenciación suele estudiarse in vitro o en modelos de organismos unicelulares. Sin embargo, la línea germinal del nematodo Caenorhabditis elegans es un excelente modelo para estudiar in vivo la dinámica de las células madre y su diferenciación, ya que estos procesos se organizan espaciotemporalmente. La lína germinal se compone de un conjunto de células madre mantenidas por un nicho unicelular, la "Distal Tip Cell". Cuando estas células madre proliferan y se alejan físicamente del nicho, comienzan un proceso de entrada en meiosis. El mantenimiento de las características de la línea germinal requiere de la presencia de los reguladores de cromatina MES-3 y MES-4, que en resultados previos de nuestro grupo de investigación se mostró que estaban regulados negativamente por el complejo ubiquitin ligasa APC/C-FZR-1. Este complejo regulador del ciclo celular marca esta proteínas para ser degradadas durante la transición a meiosis. En este trabajo demostramos que APC/C-FZR-1 está fuertemente regulado negativamente y positivemente en diferentes puntos para permitir la oportuna degradación de las proteínas MES-3 y MES-4. Interesantemente, el nicho parece coordinar la inactivación del complejo APC/C-FZR-1 en la zona mitótica, sin embargo, cuando las células entran en meiosis, la regulación negativa es liberada y permite que dicho complejo promueva la degradación de los reguladores de cromatina mencionados. Durante este trabajo de tesis se estudia como la vía Notch, a través de las proteínas de unión a ARN categorizadas como FBF, reprime la traducción de fzr-1. Además los altos niveles de CYE-1 en la zona mitótica inhiben la actividad de APC/C-FZR-1. Por el contrario, cuando las células se diferencian a meiosis, la actividad de APC/C-FZR-1 es regulada positivamente a través de dos vías: la poliA polimerasa GLD-2 y el complejo ubiquitin ligasa SCF-PROM-1. SCF-PROM-1 actúa iniciando la degradación de CYE-1, mientras que GLD-2 promueve la traducción de fzr-1 y cki-2, siendo este último un inhibidor de CDK que promueve la actividad de APC/C-FZR-1. Finalmente, el complejo APC/C-FZR-1 es capaz de reconocer y promover la degradación de CYE-1, actuando como soporte de SCF-PROM-1 y también es capaz de promover la degradación de CYA-1 y del propio coactivador FZR-1.

[ES] La lesión medular (LM) es un trastorno neurológico devastador y debilitante que se caracteriza por un grado variable de disfunción motora, sensorial y/o autonómica permanente. El trasplante de células madre neurales (NSC) ofrece una herramienta terapéutica prometedora para el tratamiento de la LM al proporcionar neuroprotección y neuroregeneración. Sin embargo, el entorno generado tras la lesión limita el potencial terapéutico de las terapias celulares al dar lugar a una escasa supervivencia y engraftment de las células y a una diferenciación inadecuada. Además, las terapias celulares han mostrado hasta la fecha una recuperación funcional limitada en los ensayos clínicos. Por lo tanto, se ha postulado el uso de terapias combinatorias para superar estas limitaciones y potenciar los beneficios terapéuticos de las terapias celulares. En esta tesis doctoral, se han estudiado distintas estrategias de combinación con el trasplante de NSC, como el uso de fármacos y biomateriales, con el objetivo de mejorar y potenciar el efecto de la terapia celular en el rescate de la actividad neuronal, en la modulación del proceso inflamatorio, en la supervivencia del trasplante, así como en su integración y diferenciación en el tejido medular. Así, En el capítulo 1 evaluamos la terapia combinada de células madre neurales humanas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-NSCs), células madre mesenquimales (MSCs) y un nanoconjugado de curcumina (PA-C) en un modelo de LM subagudo, proporcionando un mayor grado de neuroprotección en comparación con los tratamientos individuales. En el capítulo 2 desarrollamos una estrategia mínimamente invasiva mediante el uso de un scaffold de ácido hialurónico en forma de semi-luna para el transplante de iPSC-NSCs combinado con PA-C. Así, los análisis histológicos demostraron que el tratamiento combinado de iPSC-NSCs y la PA-C presentaban una mayor preservación de fibras neuronales en la zona de la lesión y una reducción de la extensión de la cicatriz fibrótica. Por último, en el capítulo 3 se describe una estrategia terapéutica que se aproxima más a la traslación clínica mediante el trasplante de progenitores neurales fetales humanos (hfNPCs) condicionados previamente con una forma conjugada del inhibidor de Rho/Rock fasudil (PGA-SS-FAS). Así, la combinación de las hfNPCs con el PGA-SS-FAS favoreció la migración del transplante en el tejido medular, la preservación de las interneuronas somatosensoriales Lbx1 inhibitorias y las Tlx3 excitatorias, así como la activación neuronal alrededor del epicentro de la lesión. Así pues, en la presente tesis doctoral se estudia y describe el beneficio aportado por tres estrategias combinatorias, que incrementan los efectos neuroprotectores proporcionados por la terapia celular en el tratamiento de lesiones medulares agudas y sub-agudas., [CA] La lesió medul·lar (LM) és un trastorn neurològic devastador i debilitant que es caracteritza per un grau variable de disfunció motora, sensorial i/o autonòmica permanent. El trasplantament de cèl·lules mare neurals (NSC) ofereix una eina terapèutica prometedora per al tractament de la LM proporcionant neuroprotecció i neuroregeneració. Tot i això, l'entorn generat després de la lesió limita el potencial terapèutic de les teràpies cel·lulars donant lloc a una escassa supervivència i engraftment de les cèl·lules i a una diferenciació inadequada. A més, les teràpies cel·lulars han mostrat fins ara una recuperació funcional limitada als assajos clínics. Per tant, s'ha postulat l'ús de teràpies combinatòries per superar aquestes limitacions i potenciar els beneficis terapèutics de les teràpies cel·lulars. En aquesta tesi doctoral, s'han estudiat diferents estratègies de combinació amb el trasplantament de NSC, com ara l'ús de fàrmacs i biomaterials, amb l'objectiu de millorar i potenciar l'efecte de la teràpia cel·lular en el rescat de l'activitat neuronal, en la modulació del procés inflamatori, en la supervivència del trasplantament, així com en la seva integració i diferenciació al teixit medul·lar. Així, Al capítol 1 avaluem la teràpia combinada de cèl·llules mare neurals humanes derivades de cèl·lules mare pluripotents induïdes (iPSC-NSCs), cèl·lules mare mesenquimals (MSCs) i un nanoconjugat de curcumina (PA-C) en un model de LM subagut, proporcionant un major grau de neuroprotecció en comparació dels tractaments individuals. Al capítol 2 desenvolupem una estratègia mínimament invasiva mitjançant l'ús d'un scaffold d'àcid hialurònic en forma de semilluna per al trasplantament d'iPSC-NSC combinat amb PA-C. Així, els anàlisis histològics mostraren que el tractament combinat d'iPSC-NSCs i la PA-C incrementaba la preservació de fibres neuronals a la zona de la lesió i reduïa l'extensió de la cicatriu fibròtica. Finalment, al capítol 3 es descriu una estratègia terapèutica que s'aproxima més a la translació clínica mitjançant el trasplantament de progenitors neurals fetals humans (hfNPCs) condicionats prèviament amb una forma conjugada de l'inhibidor de Rho/Rock fasudil (PGA-SS-FAS. Així, la combinació de les hfNPCs amb el PGA-SS-FAS va afavorir la migració del trasplantament al teixit medul·lar, la preservació de les interneurones somatosensorials Lbx1 inhibitòries i les Tlx3 excitatòries, així com l'activació neuronal al voltant de l'epicentre de la lesió. Així doncs, en aquesta tesi doctoral s'estudia i descriu el benefici aportat per tres estratègies combinatòries, que incrementen els efectes neuroprotectors proporcionats per la teràpia cel·lular en el tractament de lesions medul·lars agudes i sub-agudes., [EN] Spinal cord injury (SCI) is a devastating and debilitating neurological disorder characterized by a variable degree of permanent motor, sensory and/or autonomic dysfunction. Neural stem cell (NSC) transplantation offers a promising therapeutic tool for the treatment of SCI by providing neuroprotection and neuroregeneration. However, the environment generated after injury limits the therapeutic potential of cell therapies by resulting in poor cell survival and engraftment and inadequate differentiation. In addition, cell therapies have shown limited functional recovery in clinical trials to date. Therefore, the use of combinatorial therapies has been postulated to overcome these limitations and enhance the therapeutic benefits of cell therapies. In this doctoral thesis, we have studied different combination strategies with NSC transplantation, such as the use of drugs and biomaterials, with the aim of improving and enhancing the effect of cell therapy in the rescue of neuronal activity, in the modulation of the inflammatory process, in the survival of the transplant, as well as in its integration and differentiation in the medullary tissue. Thus, In Chapter 1 we evaluated the combined therapy of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem cells (iPSC-NSCs), mesenchymal stem cells (MSCs) and a curcumin nanoconjugate (PA-C) in a subacute LM model, providing a higher degree of neuroprotection compared to single treatments. In Chapter 2, we developed a minimally invasive strategy by using a demilune hyaluronic acid scaffold for combined transplantation of iPSC-NSCs with PA-C. Thus, histological analyses demonstrated that the combined treatment of iPSC-NSCs and PA-C exhibited increased preservation of neuronal fibers in the lesion area and a reduction in the extension of the fibrotic scar. Finally, Chapter 3 describes a therapeutic strategy that more closely approximates clinical translation by transplanting human fetal neural progenitors (hfNPCs) preconditioned with a conjugated form of the Rho/Rock inhibitor fasudil (PGA-SS-FAS). Thus, the combination of hfNPCs with PGA-SS-FAS favored transplant migration within the spinal parenchyma, preservation of endogenous inhibitory Lbx1 and excitatory Tlx3 somatosensory interneurons, as well as endogenous neuronal activation around the lesion epicenter. Thus, this PhD thesis studies and describes the benefit provided by three combinatorial strategies, which increase the neuroprotective effects provided by cell therapy in the treatment of acute and sub-acute spinal cord injury., This research was funded by Fundació Marató TV3 2017/refs.20172230, 20172231 and 20172110; FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación–Agencia Estatal de Investigación “RTI2018- 095872-B-C21/ERDF”, Agencia Valenciana de Innovación (AVI) INNVAL10/19/047 and TERCEL (RD12/0019/0011) funds from the Instituto de Salud Carlos III of Spain; Science by Women program, Women for Africa Foundation to HE and the grants FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación – Agencia Estatal de Investigación [RTI2018-095872-B-C21 and –C22/ERDF]; RISEUP project FetOpen in H2020 Program: H2020-FETOPEN-2018-2019-2020-01 and by Grants RTI2018-095872-B- C21 and PDI2021-1243590B-I00/ERDF funded by MCIN/AEI//10.13039/501100011033 and by ERDF A way of making Europe). This project was also funded by Project 964562 (RISEUP), H2020 FetOpen program

Producción Científica, In December 2019, Wuhan City in China officially declared the presence of an unknown virus (now called SARS-Cov-2) that soon gained pandemic status. The SARS-Cov-2 or COVID-19 pandemic quickly led to the closure of Universities and colleges following the advice of public Health officials to maintain social distancing (Murphy, 2020). Consequently, educational institutions quickly adopted e-learning under the distance education mode (Morgan, 2020). At University of Valladolid (Spain), two of the degrees with the highest number of new students are the Bachelor’s Degree (BD) in Medicine and the BD in Nursing, which also have subjects with a very important practical part. Two of these subjects are Medical Biology and Biology, in the first year of both degrees. The use of the optical microscope is essential to carry out the practical work in these subjects during which students not only manipulate and observe materials using the microscope, but also engage intellectually, using and applying theoretical concepts., This work is the result of two Teaching Innovation Projects funded by the University of Valladolid (PID_20-21_053 and PID_21- 22_052).

Presentamos las opiniones del alumnado de Odontología sobre la metodología empleada en Biología celular e Histología impartida online. Campus virtual, grabaciones de clases, cuestionarios y seminarios finales tuvieron unas valoraciones medias de 4,6350,675 mientras que casos, glosarios y mapas conceptuales de 3,31,28. El uso de herramientas de comunicación fue del 66% (chat o correo) frente al 24% (foro de dudas).

Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química, Línea de Investigación: Biología del Desarrollo, Clave Programa: DBI, Código Línea: 107, Los componentes nucleares tienen un comportamiento muy dinámico durante la progresión del ciclo celular y el desarrollo. En particular, la envuelta nuclear (EN) proporciona una barrera física entre los compartimentos nucleares y citoplasmáticos, controlando la intercomunicación a través del transporte nucleo-citoplasmático por los poros nucleares. Además, el papel de la EN controlando la actividad genómica y la organización cromosómica es cada día más evidente. Alteraciones en la estructura o componentes de la EN pueden dar lugar a un gran conjunto de enfermedades genéticas conocidas como laminopatías, que provocan disfunción tisular. Éstas incluyen un amplio rango de enfermedades como cardiomiopatía, distrofia muscular, afecciones neurológicas, lipodistrofia y envejecimiento prematuro. Dado que las proteínas relacionadas con laminopatías, como las láminas, emerina y BAF, se expresan de forma ubicua en todos los tipos celulares, es un reto entender cómo estas mutaciones resultan en fenotipos tejido específicos. Es posible que la organización nuclear en cada tejido lo haga más receptivo con respecto a otros a padecer los efectos de una mutación particular. En esta tesis nos centramos en la proteína nuclear BAF-1, el ortólogo en Caenorhabditis elegans de “Barrier to Autointegration Factor 1” que en humanos está codificado por el gen BANF1. BAF-1 es una proteína altamente conservada, con dominio de unión al ADN e implicada en la rotura de la envuelta nuclear, ensamblaje y reparación, así como en la compactación de la cromatina. Actúa en homodímero y se encuentra preferentemente en la EN, ya que su localización durante el ciclo celular es dependiente de lamina y de proteínas con dominio LEM (LAP2, emerina, MAN1 y otras) así como de la fosforilación por parte de VRK1. Sorprendentemente, la sustitución de un único aminoácido de BAF en la posición 12 (A12T) causa en humanos el síndrome progeroide de Nestor-Guillermo (NGPS). Esta enfermedad de envejecimiento prematuro afecta a una variedad de tejidos, provocando retraso en el crecimiento, defectos óseos y escoliosis. Debido a la similaritud entre las proteínas BAF humanas y de C. elegans, hemos modificado el locus endógeno de baf-1 para que mimeticemos en C. elegans la mutación causante de NGPS en humanos. El objetivo principal de mi tesis es caracterizar los fenotipos causados por la mutación G12T en el gusano a nivel de organismo, y también a escala celular. Esperamos que nuestra investigación contribuya a entender cómo una mutación en una proteína esencial que se expresa durante todo el desarrollo, desencadena la aparición de síntomas ~2 años después del nacimiento en pacientes humanos. Los resultados presentados en esta tesis están en proceso de ser publicados. En la primera sección de “Results” - “INTRODUCITION OF A PROGERIA LINKED MUTATION IN C. ELEGANS baf-1 PROVOKES MULTIPLE TEMPERATURE-DEPENDENT PHENOTYPES”- reportamos que la mutación baf-1(G12T) disminuye la Resistencia a estrés por calor y causa fenotipos dependientes de temperatura en la esperanza de vida, puesta de huevos y capacidad de fertilización. Los gusanos mutantes muestran, además, deformación de la EN, una característica típica del envejecimiento fisiológico, que se ve acelerado en los síndromes progeroides. En la sección “BAF-1(G12T) MUTATION DESTABILIZES ITS INTERACTION WITH LAMIN AND EMERIN IN C. ELEGANS” demostramos que BAF-1(G12T), al igual que el BAF-1 silvestre, se localiza preferentemente en la envuelta nuclear. Sin embargo, detectamos niveles de lamina y emerina reducidos en la EN en mutantes baf-1(G12T). Además, encontramos que estos mutantes son hipersensibles a perturbaciones en la EN, particularmente a aquellas afectando a lamina. La segregación cromosómica y la viabilidad embrionaria se ven dramáticamente afectadas por ello. En la sección “DNA INTERACTION CHANGES UPON baf-1 MUTATION” exploramos si la mutación causante de NGPS afecta la asociación de BAF-1 con la cromatina. Hemos determinado los perfiles de unión de las proteínas BAF-1 silvestre y mutante mediante la técnica del DamID tejido específica. En general, los perfiles de ambas proteínas son muy similares, pero además hemos identificado regiones concretas donde la asociación de BAF-1 está alterada y grandes diferencias en la asociación de BAF-1con el ADN entre los dos tejidos estudiados, hipodermis e intestino. Confirmamos mediante análisis de ontología génica que BAF-1 se asocial frecuentemente con genes involucrados en los procesos más afectados por la mutación baf-1(G12T). La penúltima sección, “FERTILITY IS AFFECTED UNDER NGPS MIMICKING MUTATION IN C. ELEGANS “, está dedicada al estudio de los defectos en la fertilidad en los mutantes baf-1(G12T). Una alta proporción de la puesta de estos mutantes consiste en oocitos sin fertilizar, lo que nos llevó a estudiar el desarrollo germinal, particularmente la espermatogénesis, donde vimos que BAF-1 se localiza en el esperma, pero no sus interactores, lamina y emerina, y que la mutación G12T afecta al proceso de espermatogénesis. Estas observaciones se hicieron en colaboración con el Dr. Jordan D Ward, donde estuve de visita durante tres meses en su grupo, en UCSC (California, EEUU). Gracias al conocimiento que he adquirido durante mi doctorado en el estudio de interacciones entre proteínas y la cromatina y con el uso de la bioinformática, he podidp participar en otros proyectos dentro del laboratorio, incluyendo colaboraciones internacionales con la Dr. S. Gasser del FMI en Suiza , donde hemos estudiado un modelo de C. elegans de la laminopatía “Emery-Dreifuss muscular dystrophy” (EDMD) causada por una mutación en lamina (LMN-Y59C). Hemos usado en C. elegans la técnica del DamID tejido específica en músculo, para monitorizar los efectos de esta mutación en la organización cromosómica. Fuimos capaces de suprimir los fenotipos asociados con la enfermedad muscular y rescatar las alteraciones en la organización cromatínica y transcripcional causada por la mutación LMN-Y95C mediante la combinación de la misma con la ablación de CEC-4, una proteína con dominios de unión a cromatina cuya función es anclar la cromatina metilada en H3K9 a la EN. Todo esto sugiere una nueva senda para las terapias de EDMD. En nuestra colaboración más reciente con la Dr. D. Larrieu del CIMR, en Cambridge (Reino Unido) hemos validado varios candidatos que alivian los fenotipos celulares en células inmortalizadas de pacientes de NGPS obtenidos en un escrutinio genético mediante CRISPR. Por último, he participado como primera autora en una publicación donde, entre otras técnicas, hemos desarrollado herramientas para aplicar de modo tejido específico la técnica de “RNA polymerase foot printing by DamID” (RAPID). Incluso hemos recapitulado los avances más recientes en el estudio de la organización nuclear en condiciones de estrés y envejecimiento en nuestra revisión y nuestra participación en el libro de protocolos “The Nuclear Pore Complex” , como primera autora de un capítulo donde describimos métodos para estudiar la función del complejo de poro nuclear en diferentes estadios del gusano mediante estrategias de visualización in vivo y etiquetado con proteínas fluorescentes, además de la optimización más reciente del protocolo de DamID tejido específico, útil para el estudio de la interacción de las nucleoporinas don el ADN. En conjunto, estos resultados muestran el impacto general de la mutación baf-1(G12T) pero también señala a procesos particulares, abriendo nuevas vías de investigación en la actualidad gracias a los descubrimientos hechos durante esta tesis., Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. Centro de Estudios de Postgrado

La meiosis es un mecanismo generador de variabilidad genética en los organismos eucariotas con reproducción sexual, ya que produce nuevas combinaciones alélicas. Es un tipo de división celular especializada que consiste en dos rondas de segregación cromosómica consecutivas sin fase de replicación entre ellas. De esta forma, se generan células haploides que, tras un proceso de diferenciación, darán lugar a los gametos. Tras la fecundación, mediante la que se produce la fusión de los gametos masculino y femenino, se forma un zigoto con el número cromosómico de los parentales. La meiosises un proceso de elevada complejidad, no sólo por las moléculas que participan y regulan esta división, sino también por el intrincado mecanismo por el cual los cromosomas homólogos se mueven en el núcleo buscándose y reconociéndose. En los momentos iniciales de la meiosis, durante la profase I, la envoltura nuclear(NE, nuclear envelope) cobra mucha importancia y, por extensión, las proteínas localizadas en ella. Diversas investigaciones previas, realizadas en diferentes organismos modelo, incluyendo Arabidopsis thaliana, han demostrado la participación de las proteínas SUN en el anclaje de los telómeros a la NE, permitiendo el desplazamiento sobre su superficie. Estas proteínas forman parte de los complejos de interacción núcleocito esqueleto(LINC, linker of nucleoskeleton and cytoskeleton), los cuales conectan deforma física el citoesqueleto con el interior nuclear, en este caso con los propios cromosomas. En este contexto planteamos la hipótesis de que otros complejos proteicos localizados en la envoltura o en la periferia nuclear podrían estar involucrados en esa dinámica cromosómica o en otras funciones relevantes durante la división meiótica. Por ello, el objetivo principal de la presente tesis es analizar en profundidad la función meiótica de estructuras como el complejo del poro nuclear (NPC, nuclear pore complex), la lámina nuclear y los complejos LINC o proteínas asociadas a estos...

Understanding the signaling cascades that govern adipocyte metabolism and differentiation is necessary for the development of therapies for obesity. Toll-like receptors (TLRs) are key mediators in adipogenesis, but their specific role is not completely understood. In this study, siRNA knockdown of Tlr2 in 3T3-L1 cells allowed them to differentiate more efficiently into adipocytes, whereas the opposite was observed for the knockdown of Tlr4. At the same time, we show that TLR2 knock-out mice spontaneously developed mature-onset obesity and insulin resistance. Besides a higher incidence of hyperplasia and hypertrophy in white adipose tissue (WAT), we found a significantly increased number of adipocyte precursor cells in TLR2−/− mice compared to TLR4−/− mice. Interestingly, genetic inactivation of Tlr4 in TLR2−/− mice reverted their increased adiposity, insulin resistance, and restored normal levels of adipocyte precursor cells. These findings provide evidence that TLR2 and TLR4 play opposing roles in WAT homeostasis and point to the existence of cross-regulation among TLR2 and TLR4 during adipocyte differentiation both in vitro and in vivo, This research was funded by the Spanish Ministry of Sciences and Innovation and MINECO (SAF2010-18733 and SAF2016-75988-R), from European Union H2020-MSC-ETN-642157 project TOLLerant, and from the Community of Madrid S2017/BMD-3671 INFLAMUNE-CM to MF as well as Institutional grants from “Fundación Ramón Areces” and “Banco de Santander” to CBMSO

Background: Diabetic retinopathy (DR) is the leading cause of legal blindness in the working population in developed countries. Optical coherence tomography (OCT) angiography (OCTA) has risen as an essential tool in the diagnosis and control of diabetic patients, with and without DR, allowing visualisation of the retinal and choroidal microvasculature, their qualitative and quantitative changes, the progression of vascular disease, quantification of ischaemic areas, and the detection of preclinical changes. The aim of this article is to analyse the current applications of OCTA and provide an updated overview of them in the evaluation of DR. Methods: A systematic literature search was performed in PubMed and Embase, including the keywords “OCTA” OR “OCT angiography” OR “optical coherence tomography angiography” AND “diabetes” OR “diabetes mellitus” OR “diabetic retinopathy” OR “diabetic maculopathy” OR “diabetic macular oedema” OR “diabetic macular ischaemia”. Of the 1456 studies initially identified, 107 studies were screened after duplication, and those articles that did not meet the selection criteria were removed. Finally, after looking for missing data, we included 135 studies in this review. Results: We present the common and distinctive findings in the analysed papers after the literature search including the diagnostic use of OCTA in diabetes mellitus (DM) patients. We describe previous findings in retinal vascularization, including microaneurysms, foveal avascular zone (FAZ) changes in both size and morphology, changes in vascular perfusion, the appearance of retinal microvascular abnormalities or new vessels, and diabetic macular oedema (DME) and the use of deep learning technology applied to this disease. Conclusion: OCTA findings enable the diagnosis and follow-up of DM patients, including those with no detectable lesions with other devices. The evaluation of retinal and choroidal plexuses using OCTA is a fundamental tool for the diagnosis and prognosis of DR. Spanish Ministry of Universities (FPU18/02964) and the Health Research Fund Instituto de Salud Carlos III (Fondo de Investigación Sanitaria, Spanish Ministry of Health) PI20/00740.