Search

Objetivos: Dor crônica é uma complicação frequente e debilitante das Doenças Falciformes (DF). O objetivo deste estudo foi avaliar seu impacto na saúde mental e qualidade de vida dos pacientes, além de buscar identificar moléculas associadas à sua ocorrência, na prospecção de novos alvos terapêuticos. Material e métodos: Pacientes adultos com DF acompanhados no Hemocentro UNICAMP completaram questionários PROMIS (Patient-Reported Outcomes Measurement Information System) validados para língua portuguesa, nos domínios de depressão, ansiedade e interferência da dor na vida diária. Os resultados foram reportados na forma de T scores em relação a uma população referência, e usados na busca de correlações com dados clínicos e laboratoriais. Em paralelo, amostras plasmáticas dos mesmos pacientes e de controles saudáveis foram submetidas a análise de perfil metabolômico por Cromatografia Líquida de Ultra Performance acoplada à Espectrometria de Massa de Alta Resolução (UHPLC-HRMS) não direcionada (untargeted) na busca de possíveis marcadores moleculares diferenciando pacientes com ou sem dor crônica. Resultados: Foram incluídos 43 pacientes, com mediana de idade de 43 anos (15-78), sendo 27 (63%) do sexo feminino, 25 HbSS, 08 HbSC, 7 Sbeta-talassemia e 3 HbSD. Comparando-se os indivíduos de acordo com a presença ou não de dor crônica: indivíduos com dor crônica têm maior mediana de idade (39.3 x 48.7, p = 0.026), maiores níveis de Hb (9,9 x 8,7, p = 0.038), menores contagens leucocitárias totais (6.35 x 7.68, p = 0.04), mas sem diferenças significativas nos resultados dos testes PROMIS. Entretanto, a ocorrência de pelo menos uma crise vasooclusiva (CVO) nos últimos 6 meses ou o diagnóstico de necrose óssea avascular tiveram relação estatisticamente significativa com piores resultados nos 3 domínios PROMIS testados. Além disso, quanto menor a renda dos pacientes, pior o impacto da dor na vida diária (r = -0,46, p < 0,001). Em relação às análises por UHPLC-MS, foram identificadas 107 moléculas com significativa diferença de expressão entre controles saudáveis, pacientes com dor crônica ou sem dor crônica. Dentre elas, observou-se maior expressão de moléculas do sistema endocanabinóide (2-Arachidonoylglycerol e 2-Eicosapentaenoyl-glycerol) nos pacientes sem dor crônica, e a maior expressão de lisoplasmenilcolina e ácido adrênico no grupo acometido por dor crônica. Discussão: Nesta coorte de pacientes brasileiros, demonstrou-se que a ocorrência de CVOs, o diagnóstico de necrose óssea e baixa renda estão relacionados a piores índices de ansiedade, depressão e interferência da dor na vida diária. A maior expressão de moléculas do sistema endocanabinóide pode indicar um fator de proteção nos pacientes que não são acometidos por dor crônica. Já nos pacientes com dor crônica, o aumento de ácido adrênico pode estar associado a maior ocorrência de ferroptose, mecanismo já descrito como envolvido no desenvolvimento de dor neuropática; e lisoplasmenilcolina é liberada em resposta a hipóxia e geração de trombina, e aumenta a adesividade celular ao endotélio, revelando possíveis mecanismos microvasculares associados a maior ocorrência de dor. Conclusão: Este é o primeiro trabalho empregando UHPLC-HRMS untargeted para análise exploratória de metabólitos envolvidos em dor crônica nas Doenças Falciformes, identificando potenciais alvos-terapêuticos a serem explorados em futuros ensaios clínicos.

Introdução: A reativação dos genes da γ-globina (HBG1/2), que resultam na produção de hemoglobina fetal (HbF), é uma estratégia terapêutica validada para o tratamento da doença falciforme (DF) e talassemia β. Objetivo: Investigar o Composto 2, um derivado de 2-aminobenzamida, quanto à sua capacidade de induzir a produção de HbF em células HUDEP-2, através da inibição das Histonas Deacetilases (HDACs) 1 e 2. Métodos: O Composto 2 foi ensaiado em células HUDEP-2, uma linhagem derivada de progenitores eritróides. As culturas foram submetidas a tratamento com o composto durante 72 e 96 horas, nas concentrações de 0,8 μM e 1 μM. Após o tratamento, as células foram coletadas e a expressão dos genes HBG12 foi quantificada através de qPCR e porcentagem de células HbF-positivas foi avaliada por citometria de fluxo. Para efeitos comparativos, foi utilizado o tratamento com 100 μM de hidroxiuréia (HU). Ainda, foi realizado ensaio de inibição da atividade das HDACs 1 e 2 pelo Composto 2, assim como, caracterização de propriedades de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME). Resultados: O Composto 2 aumentou significativamente os níveis de RNAm de HBG1/2. Em 72 horas, as concentrações de 0,8 μM e 1 μM elevaram os níveis de RNAm de HBG1/2 em 58 e 63 vezes, respectivamente (CTRL = 0,012 ± 0,002 A.U vs. 0,8 μM = 0,68 ± 0,16 A.U e 1 μM = 0,73 ± 0,17 A.U, p < 0,0001, n = 4). Em 96 horas, os aumentos foram de 49 e 52 vezes (CTRL = 0,022 ± 0,014 A.U vs. 0,8 μM = 1,1 ± 0,19 A.U e 1 μM = 1,17 ± 0,28 A.U, p < 0,0001, n = 4). Em contraste, HU a 100 μM resultou em um aumento máximo de 10 vezes na expressão de mRNA de HBG1/2 em 72 horas (n = 2). A citometria de fluxo mostrou um aumento significativo em células HbF-positivas. Após 72 horas, houve um aumento para 7,06 ± 0,92% com 0,8 μM e para 7,48 ± 0,55% com 1 μM, comparado a 0,83 ± 0,12% nos controles (p < 0,0001, n = 4). Em 96 horas, os aumentos foram para 11,35 ± 1,15% e 12,78 ± 0,34%, comparado a 0,91 ± 0,12% (p < 0,0001, n = 4). HU induziu um aumento em células HbF-positivas para 5,65 ± 0,59% em 72 horas e 5,73 ± 0,52% em 96 horas (p < 0,0001, n = 2). Ainda, o Composto 2 inibiu 91% da atividade de HDAC1 e 71% de HDAC2 a 1 μM. Os estudos de ADME revelaram logD de 2,51 em pH 7,4, alta permeabilidade (Pe 14,61 x 10̂-6 cm/s), alta estabilidade metabólica (t = 266,6 minutos) e depuração de 10,4 μL/min/mg. Discussão: As HDACs 1 e 2 desempenham um papel crítico na regulação da expressão gênica das globinas, removendo grupos acetil e compactando a cromatina, o que silencia os genes HBG. A inibição dessas enzimas promove o aumento da acetilação de histonas, abrindo a cromatina e permitindo a reativação dos genes HBG1/2. O Composto 2, ao inibir seletivamente HDAC1 e HDAC2, demonstrou uma capacidade superior de aumentar a expressão de HBG1/2 e a produção de HbF em comparação com a HU, principal fármaco aprovado para o tratamento da DF e talassemia β. Conclusão: A potente reativação da produção de HbF e as propriedades farmacocinéticas favoráveis (alta estabilidade metabólica e boa permeabilidade) destacam o Composto 2 como um candidato promissor para desenvolvimento como uma terapia oral, possivelmente oferecendo uma alternativa para o tratamento da DF e talassemia β.

A indução da produção de hemoglobina fetal (HbF) é capaz de inibir a polimerização da hemoglobina S (HbS) presente na anemia falciforme e minimizar as manifestações clínicas da doença. A modulação de enzimas epigenéticas responsáveis pela repressão do gene HBG1/2, como as histonas deacetilases 1 e 2, apresentam-se como uma estratégia promissora para indução de HbF. Os objetivos do trabalho foram a avaliação farmacológica de moléculas degradadoras de HDAC 1 e 2 para indução de HbF. As células utilizadas para quantificação de degradação de HDACs 1 e 2 foi a HCT-116 e o ensaio foi realizado através de western blot quantitativo. As células utilizadas para indução de HbF foi a HUDEP-2, em que se utilizou qPCR para quantificação de mRNA de HBG1/2 e citometria de fluxo para avaliação da porcentagem de células positivas para HbF. Foram planejadas e sintetizadas novas moléculas capazes de promover a degradação seletiva das HDACs 1 e 2 através da formação de um complexo ternário entre HDACs- 1/2 e a enzima E3-ligase denominada cereblon. A formação desse complexo leva a ubiquitinação das enzimas alvo e posterior degradação via proteosoma. Treze moléculas foram sintetizadas e avaliadas em células HCT-116 em relação à degradação das HDACs 1, 2 e 3, resultando em três promissores compostos (I, II e III) com diminuição seletiva dos níveis de HDAC-1 e valor de DC50 de 2,5 μM. O composto III foi então selecionado para avaliação em células HUDEP-2, nas concentrações de 500nM e 750nM, e tempo de tratamento de 72h e 96h. A análise de qPCR mostrou um aumento significativo nos níveis de mRNA de HBG1/2, sendo este de 26,9x e 35,5x nas concentrações de 500nM e 750nM, respectivamente, em 72h quando comparados com o controle (CTRL = 0,027 ± 0,006 unidades arbitrárias (u.a.) vs 500nM = 0,73 ± 0,25 u.a. e 750nM = 0,96 ± 0,11 u.a., p < 0,0001, n = 4). Em 96h, o aumento foi de 34x e 44,5x, respectivamente, (CTRL = 0,034 ± 0,012 u.a. vs 500nM = 1,12 ± 0,35 u.a. e 750nM = 1,52 ± 0,37 u.a., p < 0,0001, n = 4). Após o tratamento, as células foram marcadas utilizando-se anticorpos anti-HbF para quantificação da porcentagem de células positivas para HbF, onde foi observado um aumento de 7,5x e 9x nas concentrações de 500nM e 750nM, respectivamente, em 72h (CTRL = 0,58 ± 0,15 % vs 500nM = 4,43 ± 0,88 % e 750nM = 5,29 ± 1,52 %, p < 0,0001, n = 4), enquanto que o aumento em 96h foi de 8,3x e 10,6x, respectivamente (CTRL = 0,65 ± 0,15 % vs 500nM = 5,44 ± 0,79 % e 750nM = 6,89 ± 1,05 %, p < 0,0001, n = 4). O tratamento realizado com hidroxiuréia, fármaco padrão, à 100 μM, resultou num aumento máximo dos níveis de mRNA de HBG1/2 de, aproximadamente, 10x em 72h e num aumento na porcentagem de células HbF-positivas de 8,5x e 8,9x em 72h e 96h, respectivamente (CTRL 72h = 0,66 ± 0,23% vs HU 72h = 5,65 ± 0,59%, CTRL 96h = 0,64 ± 0,15% vs HU 96h = 5,73 ± 0,52%; p < 0,0001, n = 2). Os dados obtidos demonstram que as moléculas sintetizadas apresentam seletividade de degradação contra HDAC-1, o que ainda não havia sido descrito na literatura. Além disso, a molécula III demonstrou ser mais efetiva quando comparada a HU, com atividade de indução da expressão do gene HBG1/2 2,6x maior, em uma concentração 200x menor. Estes resultados dão suporte para a continuação dos estudos da molécula III em ensaios pré-clínicos como potencial indutora de HbF para tratamento de hemoglobinopatias.

Recent evidence has demonstrated that the gut microbiota plays an important role in the pathophysiology of sickle cell disease (SCD). Enterocyte damage, increased permeability and intestinal dysbiosis may be directly involved in modulating inflammatory processes, increasing cell adhesion properties and the aging of neutrophils, which contribute to vaso-occlusion. The objective of this study was to investigate intestinal perfusion and permeability in mice with SCD. Townes AS (hemizygous) and SS (homozygous) mice aged 8 weeks were subjected, or not, to a model of overnight dehydration. The mice were subjected to nocturnal dehydration for 7 days consecutive and the water was returned after the 14-hour period of water restriction, always in the morning. In vivo intestinal permeability assays were carried out using the oral administration of FITC-dextran and blood perfusion was measured in the mesenteric region using the PeriCam PSI System (Perimed) and laser speckle contrast analysis. Plasma FITC-dextran levels were found to be higher in SS mice, compared to AS mice (0.6 ± 0.04 and 1.5 ± 0.1 μg/mL for AS and SS, respectively, p < 0.0001; n = 4-8), indicating that intestinal permeability is altered in 8-week-old sickle cell mice. Blood perfusion in the areas of the intestinal folds and mesenteric regions was also significantly lower in SS mice compared to AS mice (204.3 ± 4.2 and 116.4 ± 19.7 P.U for AS and SS, respectively, p = 0.012; n = 3), suggesting altered intestinal vascular function. Submitting mice to a model of chronic dehydration did not alter circulating FITC-dextran concentrations in SS mice, compared to SS mice that were not dehydrated, suggesting that existing intestinal permeability is not exacerbated by dehydration. However, mesenteric blood perfusion was lower in the dehydrated Townes SS mice, compared to the SS controls that were not dehydrated (154.7 ± 9.9 and 114.3 ± 14.3 for basal SS and dehydrated SS, respectively, p = 0.04; n = 5), indicating that dehydration negatively affects intestinal blood flow in SS mice. Thus, these findings suggest that the integrity of the intestinal barrier and mesenteric microcirculation are compromised in mice with SCD, highlighting the importance of the intestine in the pathophysiology of the disease and the need for new therapeutic approaches focusing on the modulation of gut microbiota and the preservation of vascular integrity.

Objetivo: Avaliar os efeitos moduladores e antioxidantes da ergotioneína (ERT) sobre vias de sinalização redox em camundongos falcêmicos. Materiais e métodos: Camundongos transgênicos para Anemia Falciforme (AF) foram gerados e mantidos na CEMIB/UNICAMP. Avaliou-se 3 grupos de camundongos humanizados: o controle, constituído de animais transgênicos para S+Fetal (SF); animais transgênicos para AF (SS) e transgênicos tratados com ERT (SS+ERT; VO 35 mg/kg), durante 60 dias. Os animais foram eutanasiados por aprofundamento da anestesia (CEUA 5955-1/2022) e a medula óssea foi utilizada para análise de RT-qPCR, em pseudo quintuplicatas, de membros de vias de sinalização centrais da biologia redox (ATF4, NFE2L2, FoxO3, CAT, SOD1, GPx1, PRDX1, TRX, TXNIP), do transportador específico de ERT (SLC22A4); e de um fator de iniciação da tradução eucariótica (EIF2α). O fold change do nível de mRNA foi calculado usando a fórmula 2-ΔΔCT. Para as análises estatísticas, adotou-se o General Linear Model, no formato one-way ANOVA, seguido pelo teste post hoc de Bonferroni. Resultados: No grupo SS foi observado uma indução dos fatores de transcrição NFE2L2 (̃9 vezes), FoxO3 (̃3 vezes) e das enzimas antioxidantes CAT (̃4 vezes) e GPX1 (̃6 vezes), enquanto para ATF4, TRX, SOD1 e PRDX1 houve uma inibição em relação ao grupo SF. Já no grupo SS+ERT observou-se uma expressão aumentada de ATF4 (̃2 vezes), TXNIP (̃6 vezes), CAT (̃8,5 vezes), SOD1 (̃1,2 vezes) e GPX1 (̃3,5 vezes), enquanto os níveis de NFE2L2, TRX1, PRDX1 se mantiveram similares ao controle. Interessantemente, houve uma indução da expressão do SLC22A4, tanto no grupo SS (̃7 vezes) quanto SS+ERT (̃13 vezes). Em relação ao EIF2α, sua expressão foi inibida nos SS e manteve-se similar ao controle em SS+ERT. Discussão: A AF é caracterizada pela geração incessante de espécies reativas de oxigênio, o que compromete a capacidade antioxidante das células eritroides. Assim, a fim de atenuá-lo, o mecanismo de resposta redox pode ocorrer de duas formas, pelo controle da atividade enzimática ou em nível transcricional, foco deste estudo, ao induzir as vias de sinalização redox e, consequente, aumentando síntese dos antioxidantes em situações de distresse oxidativo. Esta última, observada no grupo SS, como demonstrado pelos transcritos avaliados. No grupo SS+ERT, como esperado, a suplementação com ERT apresentou uma ação citoprotetora in vivo ao modular vias de adaptação redox. Resultados este que corroboram, nosso estudo prévio in vitro, em células K562 induzidas à diferenciação eritroide e submetidas a estresse oxidativo. Ainda, os altos níveis de SLC22A4 tanto nos SS quanto nos SS+ERT, demonstra que esse antioxidante é altamente acumulado em células hematopoiéticas. Ressaltando que a maior expressão desse transportador nos SS tratados sugere uma maior internalização da ERT após sua prolongada administração, reforçando seu papel crítico durante a hematopoiese. Atuação que é corroborada pela elevação de ATF4 e TXNIP que vem sendo propostos como novos reguladores da proliferação e diferenciação eritroide. Por fim, a análise da expressão de EIF2α, possibilita a proposição que os padrões observados em nível gênico se manteriam em nível proteico. Conclusão: ERT é um modulador com espectro ainda mais amplo do que o previamente disposto na literatura, atuando em vias essenciais para homeostasia redox e eritropoiese.

Introduction: Sickle cell anemia (SCA) is a hereditary condition characterized by morphological changes in erythrocytes, which increase their fragility and susceptibility to rupture, releasing intracellular components, including the heme molecule. Release of heme during intravascular hemolysis is closely associated with the vascular inflammatory response in this condition, contributing to the development of vaso-occlusive processes in the microcirculation. Objective: To evaluate the influence of heme on the activation of human microvascular endothelial cells, particularly with regard to the expression of surface adhesion molecules, the production of reactive oxygen species (ROS), and activation of caspase-1. Materials and methods: HMEC-1 (Human Microvascular Endothelial Cells) were used and incubated with varying concentrations of heme (0, 25, 50, and 100 μM) for 3 hours (37°C). Specific antibodies were used to assess the expression of adhesion molecules ICAM-1 (CD54), VCAM-1 (CD106), and E-selectin (CD62E) on the cells using flow cytometry. ROS production was measured using the 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) probe and caspase-1 activation was evaluated using the FAM-FLICA probe, and both were analyzed by flow cytometry. Data were analyzed using FlowJo, and statistical analysis was performed using ANOVA with Sidak's multiple comparisons post-tests, using Prism software. Results: Heme induced significant and dose-dependent increases in the expressions of ICAM-1 ([25 μM] p = 0.011; [50 μM] p = 0.002; [100 μM] p = 0.007, N = 5), VCAM-1 ([25 μM] p = 0.023; [50 μM] p = 0.011; [100 μM] p = 0.02, N = 5), and E-selectin ([25 μM] p = 0.024; [50 μM] p = 0.011; [100 μM] p = 0.001, N = 5) on the HMEC-1 cell surface. The evaluation of ROS production demonstrated a significant and progressive increase with increasing heme concentrations ([25 μM] p < 0.001; [50 μM] p = 0.023; [100 μM] p = 0.020, N = 6). Additionally, the analysis of caspase-1 activation revealed a significant and dose-dependent increase in response to heme concentration ([25 μM] p = 0.023; [50 μM] p < 0.001; [100 μM] p = 0.015, N = 5). Discussion and conclusion: The heme molecule was found to induce the expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM-1, and E-selectin by HMEC-1 cells. Additionally, heme prompted oxidative stress, with the generation of ROS, and activation of caspase-1, indicating the involvement of the inflammasome in this process of cell activation. Similar results have been observed by our group, previously, in macrovascular Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC). However, this study is novel in that we have investigated this effect specifically in microvascular HMEC-1 cells. These data suggest that heme, released during intravascular hemolysis and present in sickle cell anemia, may activate microvascular endothelial cells in small blood vessels such as venules, thereby contributing to the recruitment of circulating cells and the development of vaso-occlusive processes.

Objetivo: Demonstrar os efeitos protetores da melatonina (MEL) no controle do estresse oxidativo em modelo de camundongos transgênicos para anemia falciforme (AF). Materiais e métodos: Os camundongos foram gerados e mantidos no CEMIB/UNICAMP e divididos em três grupos: grupo controle constituído pelos animais S+Fetal (SF); animais transgênicos não tratados (SS); e animais transgênicos tratados com MEL (SS+MEL; VO 10 mg/kg) por 60 dias. Os animais foram eutanasiados por aprofundamento da anestesia (CEUA 5955-1/2022) e a medula óssea foi utilizada para análise de RT-qPCR, em pseudo quintuplicatas, de importantes genes de vias redox, tais como: NRF2, FOXO3, MST1, YWHAQ (14-3-3z), CAT, SOD1, GPX1, PRX1, TRX1 e TXNIP. A quantificação dos resultados se baseou na derivação da fórmula 2-ΔΔCT. As análises estatísticas foram realizadas pelo General Linear Model, no formato one-way ANOVA, seguido pelo teste post hoc de Bonferroni. Resultados: Os resultados demonstraram que a expressão do NRF2 (̃3 vezes), FOXO3 (̃3 vezes) e MST1 (̃6 vezes) foram induzidas nos SS, resultado este não observado nos SS+MEL; além disso, o YWHAQ foi induzido no SS+MEL (̃2 vezes) e se manteve similar ao controle no SS. Já para via TRX1/TXNIP, para os SS+MEL, a TRX1 se manteve similar ao SF e a TXNIP foi inibida (̃3 vezes), enquanto para os SS ocorreu uma inibição da TRX1 (̃3 vezes) e os níveis de TXNIP se mantiveram similares ao controle. Em relação aos genes que codificam antioxidantes, CAT e GPX1 foram induzidas 4 e 8 vezes, respectivamente, nos SS; porém, não quando sob tratamento com MEL. Já a SOD1 e PRX1 foram mantidos similares aos SF nos SS+MEL e inibidos nos SS. Discussão: Vários mecanismos moleculares têm sido propostos como contribuintes para uma elevada taxa oxidativa em pessoas com AF. Intermediários da homeostase redox não são apenas marcadores potenciais da gravidade da doença, mas também alvos importantes para terapias antioxidantes. Nossos resultados evidenciaram a atuação essencial dos fatores de transcrição NRF2 e FOXO3, em resposta ao distresse oxidativo característico da doença, como observado nos camundongos SS através da indução de seus transcritos associada a de genes sob seu controle, como das enzimas CAT e GPX1. Por outro lado, observamos uma restauração dos níveis de transcritos semelhante ao controle no grupo tratado com MEL. Já foi demonstrado que a MEL pode eliminar até dez espécies radicalares antes que o metabólito final seja eliminado do corpo, o que resulta em um efeito antioxidante em cascata. Esses resultados sugerem a noção de que a MEL atuou diretamente na detoxificação das espécies reativas no modelo usado, não sendo necessária a ativação das vias de sinalização redox. Além disso, alguns antioxidantes, como TRX, PRX1 e SOD1, que desempenham diversas outras funções celulares e são atualmente sugeridos como possíveis fatores de transcrição, foram mantidos com níveis de transcritos similares ao controle, demonstrando assim a modulação da MEL sobre genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo e outros processos celulares. Conclusão: A suplementação de camundongos transgênicos com MEL evidenciou o uso promissor dessa indolamina como estratégia terapêutica antioxidante na AF por meio da restauração dos níveis de transcritos de importantes genes envolvidos na manutenção redox para valores semelhantes ao grupo controle.

Introduction: Intravascular hemolysis (IVH) results in the release of damage-associated molecular patterns (DAMPs) into the circulation, particularly hemoglobin (Hb) and heme, which can trigger NLRP3 inflammasome activation and a sterile inflammatory response. Complications of hemolytic diseases include thrombosis, inflammation, and organ damage. In sickle cell disease (SCD), IVH can lead to vaso-occlusive crises and ischemic complications such as cutaneous leg ulcers, acute chest syndrome, and multiorgan infarction. Aim: To investigate the in vivo effects of inflammasome formation on microvascular function and its role in the pathophysiology of hemolytic conditions. Methods: We utilized two murine models to simulate intravascular hemolysis: an acute model where C57BL6 mice received osmotic stress (150 μl sterile water, i.v. -HEM); and a chronic model induced by repeated low doses of phenylhydrazine (10 mg/kg, i.p. -CHEM). Control mice received saline under similar conditions. Microvascular dysfunction was assessed by laser Doppler fluxometry (LDF) in the skin of the pelvis and by intravital microscopy of the cremaster muscle. Inflammasome activation was evaluated via flow cytometry measurement of caspase-1 (casp-1) activity, measurement of interleukin (IL)-1β and IL-18 release by ELISA, and NLRP3 protein expression in the liver using western blot. Results and discussion: Our findings show that acute hemolysis immediately increased plasma cell-free Hb and heme levels in HEM mice, along with decreased Hb scavenger haptoglobin (Hp). CHEM mice also displayed a significant depletion of hemopexin (Hx), indicating the persistent removal of this heme-neutralizing protein. These results confirm that these mouse models effectively mimic acute and chronic hemolytic stress. Acute IVH resulted in microvascular dysfunction characterized by a vaso-occlusive-like process, as demonstrated by an increase in rolling, adherent, and extravasated leukocytes. The blood flow velocity of HEM mice was reduced in the microcirculation, resulting in impaired tissue blood perfusion. These findings were accompanied by increased casp-1 activity in peripheral monocytes and elevated levels of IL-1β and IL-18, all hallmarks of inflammasome formation, suggesting that inflammasome assembly during hemolytic stress contributes to tissue microcirculation dysfunction. While acute hemolysis caused microvascular defects and impaired blood perfusion in mice, chronic hemolysis significantly affected the liver, leading to an increase in the macrophage population, which displayed elevated active casp-1 and increased NLRP3 protein expression. Next, we investigated whether the NLRP3 inflammasome contributes to hemolysis-induced microvascular pathology. As expected, casp-1 activation was reduced by the NLRP3 inhibitor, MCC950, in both the neutrophils and monocytes of HEM mice. Moreover, NLRP3 inflammasome inhibition reduced leukocyte recruitment to the venule walls of HEM mice, indicating an improvement in hemolysis-induced microvascular dysfunction. This was further corroborated by LDF, which showed improved blood perfusion in the skin of MCC950-treated HEM mice. Conclusion: These results demonstrate that NLRP3 inflammasome assembly, in response to hemolysis, compromises microvascular function by modulating leukocyte adhesion to the endothelium and impairing blood flow to tissues, which could contribute to clinical complications in hemolytic disorders such as SCD.

A hipercoagulabilidade é uma característica marcante da doença falciforme (DF), e sua fisiopatologia está associada à ativação simultânea da hemostasia e da imunidade inata, em um processo denominado imunotrombose. Estudos destacam que a formação de agregados leucócito-plaquetas (AgLP) é um processo importante na ativação plaquetária e da hemostasia. Recentemente, o receptor de plaqueta do tipo lectina 2 (CLEC-2) juntamente com seu ligante, podoplanina (PDPN), foi associado como uma via importante nesse contexto. Assim, sugere-se que a interação dos AgLP e a via PDPN/CLEC-2 possa ser um compartimento importante do estado pró-trombótico da DF. O objetivo do estudo foi avaliar a formação dos AgLP que expressam CLEC-2 em pacientes com DF e correlacionar com a gravidade da doença. Nesse estudo foram incluídos 31 pacientes com DF (genótipo SC = 8; genótipo SS = 23), e 10 indivíduos saudáveis (CAAE: 53121421.0.0000.5404). A avaliação foi realizada por citometria de fluxo do sangue periférico de pacientes DF no período estável da doença, além dos controles. Foram utilizados anticorpos anti-CD45 (leucócitos), anti-CD41 (plaquetas), anti-CD62p (P-selectina), anti-PDPN e anti-CLEC2. Para separar as populações celulares foi utilizado FSC (tamanho) e SSC (granulosidade), e os resultados foram descritos como porcentagem. Tanto os dados clínicos como laboratoriais foram obtidos através de fichas eletrônicas, e para avaliação dos parâmetros clínicos, foram utilizadas as variáveis: crise vaso-oclusiva (VOC) no último ano, histórico de AVC e/ou TEV, e osteonecrose (ON). A expressão em monócitos CD41+CLEC2+ teve diferença entre os grupos, teste Kruskal-Wallis [X2 (2) = 19,9; p < 0,0001], os pacientes DF-SS e DF-SC tinham expressão aumentada quando comparado aos indivíduos saudáveis (p < 0,0001; p = 0,01, respectivamente), não observou diferença entre os pacientes DF-SS e DF-SC (p = 0,99, Bonferroni, post-hoc). Na expressão de granulócitos CD41+CLEC2+ também observou diferença entre os grupos [X2 (2) = 11,6; p = 0,003], os pacientes DF-SS tinham um aumento da porcentagem quando equiparados aos indivíduos saudáveis (p = 0,002), não houve diferença entre DF-SS e DF-SC (p = 0,99), e DF-SC e indivíduos saudáveis (p = 0,07). Em relação aos parâmetros clínicos, os granulócitos CD41+CLEC2+ estavam elevados no grupo com ON quando comparados ao grupo sem ON (p = 0,02), bem como tinha uma tendência de estar elevado nos pacientes com VOC (P = 0,06). A expressão de monócitos CD41+CLEC2+ estava elevada nos pacientes que tiveram AVC/TEV quando equiparados aos que não tiveram AVC/TEV (p = 0,04). Na avaliação dos parâmetros laboratoriais, a partir da variável monócitos CD41+CLEC2+ observou correlação com hemoglobina (R = -0,507), reticulócitos (R = 0,445), RDW (R = 0,599), D dímero (R = 0,643), FvW: Antígeno (R = 0,495), granulócitos CD41+CLEC2+ (R = 0,850), monócitos CLEC2+CD62P+ (R = 0,760) e monócitos PDPN+ (0,494). Atualmente, poucos estudos relatam a avaliação de AgLP na DF, apesar da associação dos AgLP com a fisiopatologia da VOC ter sido demonstrada em modelos animais, tais achados não foram explorados em estudos clínicos. Além disso, nenhum trabalho relatou a associação dos AgLP com a via PDPN/CLEC-2. Assim, sugere-se que os AgLP que expressam CLEC-2 possa ser um mecanismo importante associado a hipercoagulabilidade na DF, uma vez que correlacionou com marcadores clínicos e laboratoriais.

Introduction: Phosphoinositide (PtdIns)-mediated cellular signaling and their regulatory proteins (phosphatidylinositol phosphate kinases - PIPKins) are involved in many cell functions. The Hemoglobinopathies Laboratory hypothesizes a relationship between PIPKins, particularly PIPKIIa, and the regulation of globin gene expression in a panel of cells. Recent data suggest a possible mechanism for regulating the fetal hemoglobin (HbF-α2γ2) to adult hemoglobin (HbA-α2β2) transition mediated by these enzymes. Objectives: To investigate the production of Hb gamma (γ) chains after PIPKIIa inhibition and after stimulating its activity by adding its main substrate, PtdIns5P. Materials and methods: Immortalized myeloid cells K562 (ATCC CCL-243) and KU812 (ATCC CRL-2099) were treated with 1 μM of PIPKIIa inhibitory drug BAY-091 (MedChem Express, USA) or 1 μM of synthetic PtdIns5P (Thermo Fisher, USA) and BAY-091 + PtdIns5P for 24 hours following dose-response assays for IC-50 calculation. All experiments were performed in biological triplicate (n = 3). Cells were collected, fixed, permeabilized (Cell Fixation & Cell Permeabilization Kit - Thermo Fisher, USA), and incubated with anti-HbF antibody (Thermo Fisher, USA). HbF (γ chains) positive cells were analyzed by flow cytometry (BD FACSCalibur). Qualitative (% total labeled cells) and quantitative (geometric mean of individual fluorescence intensity) analyses were performed by FlowJo program (BD Biosciences, USA). Statistical analyses were conducted using SPSS (IBM, USA) with one-way ANOVA and multiple comparisons with Tukey's test (α < 0.05). Results and discussion: Inhibition of PIPKIIa resulted in a consistent qualitative reduction (% total positive cells) of γ chains (p = 0.01) in K562 cells, as well as with the inhibition + stimulation with PtdIns5P (p = 0.04). No significant differences were observed after treatment with PtdIns5P alone (p = 0.08). The same pattern was observed quantitatively: intracellular reduction of γ chains (p = 0.01) and inhibition + stimulation (p = 0.02). In KU812 cells, stimulation with PtdIns5P resulted in qualitative (p = 0.01) and quantitative (p = 0.03) reduction of γ chains and a quantitative reduction with inhibition + stimulation (p = 0.04). Although individual stimulation with PtdIns5P did not influence γ chain production in K562 cells, data suggest that PIPKIIa activity and PtdIns5P might modulate γ chain production of Hb in these cell lines, as observed in KU812 cells following individual stimulation. Both cell lines showed γ chain reduction after BAY-091 + PtdIns5P treatment, suggesting a synergistic effect where inhibition of PIPKIIa by BAY-091 potentiates PtdIns5P's action by reducing its conversion into other phosphoinositides, increasing its bioavailability, possibly affecting chromatin structure, as demonstrated in previous literature. Conclusion: Inhibition of PIPKIIa activity, as well as its combination with PtdIns5P stimulation, reduces the production of Hb γ chains in K562 and KU812 cells, suggesting an important role of this enzyme in globin gene regulation. Financial support: Fapesp, CAPES, CNPq, Funcamp, and Faepex.

Introdução e objetivos: A anemia falciforme é uma doença genética causada por uma mutação de ponto no gene que codifica a cadeia β da hemoglobina (Hb), que resulta na formação de HbS nos indivíduos homozigotos para a mutação. Essa alteração torna as hemácias falcizadas, o que ocasiona as duas apresentações fisiopatológicas principais da anemia falciforme: crises vaso-oclusivas e anemia hemolítica crônica. Como manifestação clínica desse processo, destaca-se a úlcera de perna, que está associada com quadros mais graves da doença, além de ser um fator de risco de mortalidade precoce em pacientes com AF. No entanto, como os mecanismos fisiopatológicos envolvidos no surgimento das úlceras de perna não são bem definidos, é necessário estudar possíveis fatores envolvidos. Assim, o objetivo desse estudo foi investigar a possível associação do polimorfismo rs833068 do gene VEGF com a presença de úlcera de perna em pacientes adultos com anemia falciforme, a fim de contribuir para um melhor entendimento fisiopatológico dessa manifestação clínica tão relevante e de possibilitar uma identificação e manejo precoce de pacientes mais propensos ao seu desenvolvimento. Material e métodos: A população estudada corresponde a 211 participantes acompanhados no Ambulatório de Hemoglobinopatias do Hemocentro de Pernambuco (HEMOPE), divididos em um grupo que já apresentou algum evento de úlcera de perna (n = 102) e outro grupo que nunca apresentou episódio dessa manifestação clínica (n = 109). As amostras de DNA foram utilizadas para análise do polimorfismo com a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) utilizando ensaio TaqMan® SNP Genotyping Assays (Thermofisher, Foster City, CA, EUA) e sequenciamento do DNA de 32 amostras para confirmação dos resultados. Resultados: A discriminação alélica de 191 amostras foi realizada. Dentre esses, 91 pacientes são do grupo com úlcera de perna, divididos em 39 (42,9%) homozigotos selvagens (GG), 47 (51,6%) heterozigotos (AG) e 5 (5,5%) homozigotos mutantes (AA), sendo o alelo mutante (A) correspondente ao polimorfismo rs833068 analisado. No grupo controle, foram 100 pacientes, sendo 37 (37%) homozigotos selvagens (GG), 54 (54%) heterozigotos (AG) e 9 (9%) homozigotos mutantes (AA). Discussão: A partir dos resultados, observa-se que há maior frequência de indivíduos heterozigotos para o polimorfismo em ambos os grupos analisados. No entanto, em relação aos homozigotos mutantes para o polimorfismo, há diferença entre os grupos, visto que, para os indivíduos com úlcera de perna, essa frequência foi de 5,5% dos pacientes, enquanto para o grupo controle foi de 9%. Conclusão: Os resultados mostram a distribuição dos genótipos e, após a análise estatística, será possível determinar a influência do polimorfismo rs833068 do gene VEGF no evento de úlcera de perna em pacientes com anemia falciforme e, assim, possibilitar melhor entendimento dessa manifestação clínica.

Introdução e objetivo: Estudos anteriores indicam que a Fosfatidilinositol-Fosfato Quinase do tipo II (PIPKIIα) parece desempenhar papel na regulação dos genes de globina, particularmente no switch HbF - HbA. Diante disso, o presente estudo tem como objetivo avaliar e comparar o perfil de expressão gênica de PIPK2A e síntese proteica da PIPKIIα em lactentes até 6 meses de idade (n = 30) e adultos (> 18 anos) (n = 30). Material e métodos: Sessenta amostras foram coletadas no serviço de Hematologia do Hospital de Clínicas/Unicamp. Análises hematológicas e de hemoglobinopatias foram realizadas via hemograma e Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) - Variant II (Bio-Rad, EUA). As amostras foram divididas em 3 grupos de 10 amostras de adultos (GA1, GA2, GA3) e 3 grupos contendo 10 amostras de lactentes (GL1, GL2, GL3). A expressão gênica foi avaliada após extração de RNA total com Trizol (Thermo Fisher Scientific, EUA), quantificada por PCR em tempo real (qPCR) utilizando o equipamento StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystem, EUA). Genes ACTB e GAPDH serviram como controles endógenos. A análise proteica foi realizada por Western Blotting. Resultados e discussão: : Amostras dos grupos GA1, GA2, GA3 apresentaram idade média de 38,8 anos (DP = 4,9). Os índices do eritrograma (RBC e Hb) foram homogêneos, exceto HCT, VCM e CHCM entre grupos GA1, GA2 com diferenças estatísticas significativas (p = 0,04, 0,04 e 0,02, respectivamente). Dados homogêneos foram observados entre GL1, GL2, GL3, com idade média de 1,61 meses (DP = 0,65), sem diferenças significativas no eritrograma. As concentrações de HbA foram significativamente maiores entre os três grupos de adultos (GA) em relação ao de lactentes (GL) (p = 0,0001), enquanto que os percentuais de HbF foram significativamente maiores nos três grupos de Lactentes (GL) comparados aos de adultos (GA) (p = 0,04). A expressão gênica HBG em reticulócitos de lactentes (GL) foram significativamente maiores em relação à GA (p = 0,001), sem diferenças estatisticamente significativas entre HBB e HBA. Não foram encontradas diferenças significativas de PIP4K2A entre todos os grupos GL e GA (p = 0,7), com mesmo padrão observado na síntese proteica. Já o grupo GL3, com menores concentrações de HbF em relação aos demais grupos de lactentes [24,5% versus 45,1% (GL1) e 57% (GL2)], também apresentou maior concentração proteica de PIPKIIα nos estudos por Western Blotting, sugerindo que menores quantitativos de PIPKIIα estejam relacionados a maiores níveis de HbF. Conclusão: : Os resultados aqui apresentados apontam para significativas variações nos níveis de HbF e gama globina entre os grupos de lactentes e adultos, sem diferenças significativas entre os níveis de HbA e HBB e HBA, muito embora percentualmente haja variação nos níveis de HbA. Do mesmo modo, não foi encontrada diferença significativa de PIP4K2A nos grupos GL e GA, o que poderia apontar para uma relação entre PIP4K2A e HBB e não à regulação de HBG como anteriormente postulado.

Objetivo: O objetivo deste relato foi associar a aplasia de medula com hemoglobinúria paroxística noturna, uma desordem clonal adquirida que causa mutações genéticas e pode levar a deficiência global de certas proteínas na superfície de células sanguíneas e predisposição a hemólise, com reativação de infecções oportunistas em pacientes imunossuprimidos. Relato de caso: Masculino, 50 anos, com queixa de dispneia e astenia nos últimos 3 anos apresentando piora importante nos últimos 15 dias associada a episódios de hematoquezia. Procurou atendimento médico revelando pancitopenia sendo encaminhado ao hospital terciário para investigação. Além da pancitopenia grave, apresentava reticulopenia. Devido neutropenia grave, foi realizado profilaxias com ivermectina, sulfametoxazol + trimetropim e aciclovir. Pela possibilidade de síndrome mielodisplásica foi feito teste terapêutico com alfaepoetina e filgrastim, porém não houve resposta. Prosseguido com investigação medular e o resultado da biópsia de medula óssea evidenciou hipocelularidade importante (< 25% de celularidade global) sem aumento de precursores imaturos, que em conjunto com o quadro clínico e laboratorial, diagnosticado anemia aplásica. Devido idade do paciente, foi prescrito timoglobulina de coelho, ciclosporina 2,5 mg/kg e prednisona 60 mg/dia como tratamento de primeira linha, no entanto não houve melhora do hemograma. Pesquisa de clone HPN através de citometria de fluxo se mostrou positiva com presença de 12,3% do clone nos neutrófilos. Sendo assim, o paciente foi estratificado como Anemia Aplásica com clone hemoglobinúrico. Paciente evoluiu com hemianopsia em olho direito, avaliado pelo oftalmologista e neurologista clínico do hospital e solicitado tomografia de crânio, além de PCR, IgM e IgG para citomegalovírus. O resultado de PCR para citomegalovírus foi positivo, sendo então iniciados ganciclovir 300 mg de 12/12 horas por 21 dias com melhora expressiva do quadro oftalmológico. Pela falha de resposta ao tratamento de primeira linha foi encaminhado ao setor de transplante de hospital de referência para este fim, sendo sua irmã doadora HLA 100% compatível. Discussão: A anemia aplásica se enquadra nas síndromes de insuficiência medular e é caracterizada pela presença de pancitopenia e hipocelularidade global (< 25 %) na medula óssea devido a perda das células-tronco hematopoéticas. Esta perda ocorre devido mecanismo autoimunes, lesões diretas como drogas e irradiação, infecções virais, doenças clonais e genéticas. No presente relato houve uma anormalidade clonal, a hemoglobinúria paroxística noturna. Clinicamente, o paciente pode ser assintomático ou apresentar infecções recorrentes, hemorragia, fadiga, achados cardiopulmonares relacionados à anemia, quadro hemolítico e/ou trombótico. A biópsia de medula óssea é necessária para estabelecer o diagnóstico. O tratamento de escolha depende de fatores como idade do paciente e presença de doador aparentado, de preferência com compatibilidade 100%. Devido à imunossupressão prolongada, pode haver reativação de vírus e parasitas. Conclusão: A anemia aplásica é um diagnóstico desafiador e a associação com clone de hemoglobinúria paroxística noturna é rara, portanto, há a necessidade de conscientização da equipe médica para o reconhecimento desta patologia. Por causar imunossupressão prolongada, seja pela própria fisiopatologia da doença ou pelo tratamento imunossupressor, infecções oportunistas e reativação virais podem acontecer.

Introduction: Sickle cell disease (SCD), the most common inherited hemoglobinopathy worldwide, results in the production of abnormal hemoglobin S. Polymerization of this hemoglobin causes red blood cell sickling and pathophysiological consequences. Vaso-occlusive crises (VOCs) are the most frequent clinical complication of SCD and these crises can be triggered by different events, such as cold, dehydration, stress, and bacterial or viral infections. Models to study the mechanisms of VOC in SCD mice do exist, but there is little information regarding infection-induced VOC. Objectives: As part of a larger study that aims to compare the mechanisms by which different physiological and molecular triggers cause VOC, in in vivo and ex vivo protocols, this study has the objective of delineating the cellular and molecular mechanism by which the influenza A viral capsid component, PB1-F2, can induce VOC in the Townes SCD mouse model. Methods: Male Townes SS mice (20 weeks) were randomly distributed into two groups: Vehicle Control (intranasal vehicle administration, n = 6) or PB1-F2 (PB1-F2; 1 nmol, intranasal, 3 hours of incubation, n = 6). Optimal PB1-F2 dosing, administration times and route were previously determined in C57BL/6 mice. After administrations, anesthetized mice were submitted to laser Doppler perfusion monitoring (LDPM) to measure the perfusion and velocity of blood flow of the pelvic cutaneous microcirculation. Leukocyte recruitment in the cremaster microcirculation was evaluated by intravital microscopy (6 – 8 microvessels per mouse were filmed for quantification of leukocyte rolling and adhesion). Additionally, peripheral blood samples were collected for the analysis of neutrophil-platelet aggregates (CD45+/Ly6G+/CD41+) by flow cytometry. All animal procedures were approved by Commission of Ethics in Animal Experimentation (University of Campinas). Results: LDPM demonstrated that, compared to vehicle administration, a single intranasal administration of PB1-F2 significantly reduced the blood flow velocity and perfusion of the cutaneous microcirculation by approximately 18% and 15% respectively (p < 0.05). With regard to leukocyte recruitment in the cremaster microcirculation, PB1-F2 administration significantly increased the number of rolling leukocytes (p < 0.001), but did not increase the adhesion of leukocytes to the blood vessel wall. These microvascular alterations were associated with a modest increase in PB1-F2-induced neutrophil-platelet aggregate formation in the peripheral blood of the mice (p < 0.05). Conclusions: In conclusion, the viral component, PB1-F2, when given in a single intranasal administration, can induce vaso-occlusion in a SCD mice model, significantly decreasing microcirculatory blood flow and perfusion. Our data suggest that the acceleration of leukocyte rolling movements along venule walls, and the formation of aggregates between neutrophils and platelets in the circulation may contribute to this vaso-occlusion. Our findings also highlight the importance of standardizing new models for the study of VOC and its mechanisms in pre-clinical models of SCD for testing specific pharmacological approaches for preventing or reversing virally-induced VOC. Grants: #2021/11851-8, #2019/18886-1, São Paulo Research Foundation (FAPESP).

Objetivo: Investigar os efeitos de ligação do 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) e Voxelotor na Hemoglobina A (HbA), para avaliação da afinidade, cooperatividade heme-heme e efeito Bohr. Material e métodos: Utilizou-se hemolisado isolado de amostras de sangue periférico de 3 voluntários adultos saudáveis que assinaram o TCLE (CAAE: 62849022.5.0000.5404). A Hb foi purificada por cromatografia de exclusão molecular em colunas de Sephadex 25G (Sigma-Aldrich; Missouri, USA) em tampão Hepes 50 mM (Sigma-Aldrich; Missouri, USA) e por cromatografia de troca iônica (Amberlite MB3; Sigma-Aldrich; Missouri, USA). Obteve-se Curvas de Dissociação de Oxigênio (CDO) por espectrofotometria (DU800 Beckman Coulter-Fullerton, EUA) a 25oC, 70uM de Hb e relação estequiométrica Hb:composto de 1:1.5 (Voxelotor ou 5-HMF). Também realizou-se experimentos com Inositol Hexafosfato (IHP, Sigma-Aldrich) 1 mM como mimético do 2,3-BPG. A afinidade de oxigênio foi determinada com a obtenção de P50 (pressão parcial de O2 necessária para saturação de 50% da Hb total). Cooperatividade heme-heme foi calculada pela Constante de Hill (n), em que n = 1 indica interação não cooperativa e n = 2 indica interação heme-heme cooperativa. Os experimentos foram realizados nos pHs 6,5, 7,0 e 7,5 para avaliação de Efeito Bohr. Resultados: Voxelotor aumentou significativamente a afinidade pela Hb nos pHs 6,5 (p = 0.004) e 7,0 (p = 0.0104) em comparação a stripped HbA (controle) e em todos os pHs em comparação com 5-HMF (p = 0.0448, p = 0.0109 e p = 0.0047). Amostras com 5-HMF não tiveram alterações comparado com o controle. Na presença de IHP, houve diferença significativa de P50 nas amostras com Voxelotor em todos os pHs (6,5 p = 0.0038, 7,0 p = 0.043 e 7,5 p = 0.0007), demonstrando mudança significativa no alosterismo proteico e efeito Bohr positivo. Foi observada também diferença significativa entre 5-HMF e Voxelotor em pH 7,0 (p = 0.0275). Em relação à cooperatividade heme-heme, o Voxelotor apresentou valores de n abaixo de 1 para HbA stripped, indicando uma ligação não cooperativa, semelhantemente às mioglobinas. Diferenças significativas nos valores de n foram observadas entre Voxelotor e controle nos pHs 6.5 (p = 0.0114) e 7.0 (p = 0.0331), e entre Voxelotor e 5-HMF em todos os pHs (p = 0.0047, p = 0.026 e p = 0.0248, respectivamente). Com IHP, não foram encontradas diferenças significativas na cooperatividade heme-heme entre os grupos, e os valores de n foram aproximadamente 2, indicando que a ligação de Hb-O2 permaneceu cooperativa e sensível à ligação de fosfatos orgânicos, como o IHP. Discussão: Este trabalho sugere que o Voxelotor, atualmente utilizado no tratamento da anemia falciforme, possa aumentar a afinidade da HbA pelo O2 reduzindo drasticamente a cooperatividade heme-heme, mas permitindo que a mesma ainda se mostre sensível a variações de pH ou mesmo à presença de fosfatos orgânicos. Conclusão: Voxelotor aumentou significativamente a afinidade Hb-O2 em diferentes pHs, tanto em ambientes ácidos quanto alcalinos, modulando o alosterismo da Hb na presença de H+ e fosfatos. Estes achados mostram propriedades ainda não descritas do Voxelotor quanto a dinâmicas de ligação entre Hb e O2 e podem ser investigadas posteriormente como uma alternativa terapêutica em situações de baixa captação pulmonar de oxigênio e acidose.

Objetivo: Avaliar a dinâmica do metabolismo redox, ao longo do tempo, comparando eritrócitos falcêmicos e saudáveis, em um modelo de autoincubação celular prolongada; considerando o impacto sobre marcadores de hemólise e lesões oxidativas. Materiais e métodos: O estudo envolveu 12 brasileiros consentidos (19-42 anos), não aparentados e independente do sexo, dentre os quais, seis não apresentavam hemoglobinopatia (grupo controle - CG) e os demais possuíam anemia falciforme (grupo de estudo – AF). As amostras de sangue foram devidamente coletas e processadas, obtendo ao final, os eritrócitos lavados, os quais foram suspensos no seu próprio plasma na concentração celular de 40% (v/v) e submetidos a seis horas de incubação à 37°C, com dois períodos de análise (t0h e t6h). Ao final de cada período, a fragilidade osmótica, os níveis de hemoglobina livre [Hb livre (μM)] e atividade de enzimas antioxidantes, incluindo catalase [CAT (U/L)], glutationa peroxidase [GPx (U/mL)], glutationa redutase [GR (U/mL)], metahemoglobina redutase [metaHb-redutase (U/mL)] e tiorredoxina redutase [TrxR (U/mL)] foram avaliados por espectrofotometria. Ademais, a proporção de colesterol [Ch (nM)] para colesterol-aldeído [ChAld (uM)] foi analisada, como marcador de lesão oxidativa, utilizando HPLC-UV e HPLC-FD, respectivamente. Comparou-se os grupos celulares e os períodos de incubação isoladamente e em seguida a interação deles. Resultados: Na comparação entre os grupos, os eritrócitos falcêmicos apresentaram resistência osmótica na concentração de 5 g/L de NaCl, aumento de 33,8% nos níveis de Hb livre [AF:1,72 ± 0,30; p < 0,01], redução de 22,8% e 27,4% na atividade das enzimas CAT [AF:15,39 ± 4,02; p < 0,05] e GPx [AF: 2,91 ± 0,74; p < 0,01], respectivamente. Ademais, houve o aumento de 31,5% na atividade da metaHb-redutase [AF:3,75 ± 0,90; p < 0,01] e acúmulo de 22,5% de produtos oxidativos da membrana celular [AF: 2,45 ± 0,17; p < 0,01] nos eritrócitos falcêmicos. Entretanto, não houve interação significativa entre os grupos e o período de incubação, quanto as enzimas CAT (p = 0,93), GPx (p = 0,59), GR (p = 0,69), TrxR (p = 0,34), metaHb-redutase (p = 0,53), assim como nos níveis de Hb livre (p = 0,58) e na proporção ChAld/Ch (p = 0,12). Discussão: A estrutura e a bioquímica da hemoglobina S induzem um estado hiperoxidativo nos eritrócitos falcêmicos. Isso leva ao consumo de enzimas antioxidantes, danos oxidativos na membrana celular e aumento da hemólise, evidenciado na comparação entre os grupos CG e AF, desconsiderando o tempo. Entretanto, ao longo da incubação, houve um prejuízo semelhante das enzimas antioxidantes e um grau equivalente de lesão oxidativa nos grupos estudados, demonstrando que apesar das condições oxidativas distintas a que são submetidos, ambos os grupos eritrocíticos mantiveram uma dinâmica de metabolismo redox similar ao longo do tempo testado, fornecendo subsídio argumentativo para pesquisas futuras focadas na análise das características metabólicas dessas células durante a eritropoiese, a fim de averiguar a adaptabilidade celular nos precursores eritrocitários e possíveis alvos terapêuticos. Conclusão: A curiosa semelhança na dinâmica do metabolismo redox de eritrócitos falcêmicos e saudáveis sugere que os primeiros apresentam alta adaptabilidade celular em seus precursores, possibilitando respostas redox semelhantes aos saudáveis no período testado.

Objetivo: Este relato tem como objetivo evidenciar um caso atípico de Linfoma de Hodgkin (LH) devido ao acometimento inicial de pele em face, com posterior envolvimento de partes moles, osso e orofaringe, levando a piora da qualidade de vida devido envolvimento ocular, nasal e oral. Visa ainda, demonstrar protocolo adaptado o paciente idoso e a boa resposta ao tratamento, com ganho de sobrevida e principalmente em qualidade de vida. Relato de caso: Feminino, 83 anos, iniciou com lesão em face em outubro de 2023. No início de dezembro do mesmo ano, esteve em consulta com cirurgia de cabeça e pescoço optando por não realizar procedimentos cirúrgicos, porém, realizada biópsia do local com diagnóstico de LH. A lesão evoluiu com caráter expansivo acometendo toda a hemiface direita, com dor associada. Apresentava sintomas B associados como perda de peso e sudorese noturna, não tinha relato de febre até o momento. Pelo crescimento tumoral importante e declínio da qualidade de vida, foi internada, em janeiro de 2024, para definição de conduta terapêutica. Realizado estadiamento da paciente e evidenciado somente cometimento de partes moles (região frontal à mandíbula), lesões osteolíticas difusas, invasão da cavidade orbital com remodelação e extrusão ipsilateral e acometimento de naso-orofaringe. Não havia envolvimento de outros linfonodos no corpo, sendo classificada então como estádio IB de Ann-Arbor. Apesar da idade, paciente apresentava escala de funcionalidade como ECOG-2, portanto optado pela realização do protocolo ABVD (adriamicina, bleomicina, vimblastina, dacarbazina) adaptado. Contudo, foi discutido com os familiares sobre a gravidade da doença e possibilidade de desfecho desfavorável independente do tratamento, ficando definido cuidados paliativos complementares. Foram realizados 3 ciclos do ABVD e 3 ciclos de AVD (omissão da bleomicina). Já no primeiro ciclo, paciente apresentou melhora expressiva da lesão tumoral, com importante ganho em qualidade de vida. Terminou o ciclo no final de junho de 2024, não tendo apresentado nenhuma intercorrência durante os ciclos. Paciente segue em ambulatório aguardando exames de estadiamento pós término do protocolo, além da tentativa de retorno de alimentação oral e retirada de oxigenioterapia. Discussão: O LH é uma doença linfoproliferativas crônica que, comumente, apresenta-se com manifestações linfonodais. De acordo com a literatura o LH tem apresentação etária bimodal, em adultos jovens e idosos entre 60 a 70 anos. O acometimento de pele é raro e pouco relatado na literatura, e com isso torna-se um caso de difícil diagnóstico devido a ampla gama de lesões cutâneas existentes, perfazendo a biópsia excisional para diagnóstico da doença. Não há terapia padrão nos casos de acometimento cutâneo exclusivo, sendo necessária discussão caso a caso, tendo como opções terapêuticas: quimioterapia, radioterapia e/ou agentes tópicos. Nos casos que se evidenciam maior acometimento ou infiltração a quimioterapia sistêmica se faz imperativa, a depender do status funcional do paciente, sendo o protocolo mais utilizado o ABVD. Conclusão: No caso exposto, apesar da paciente apresentar primariamente acometimento de pele, ao ser avaliada pela hematologia e visualizado acometimento de partes moles e osso e, levando em conta a funcionalidade do paciente, optado pela realização de protocolo adaptado pela idade, apresentado boa resposta ao tratamento proposto, condizendo com a revisão de literatura realizada.

Objetivo: Visa demonstrar a associação da quimioterapia ao possível diagnóstico de Leucoencefalopatia Multifocal Progressiva (LEMP) em paciente vivendo com o HIV. Relato de caso: Masculino, 31 anos, pessoa vivendo com HIV, em tratamento regular, diagnosticado com Linfoma de Burkitt e iniciado tratamento com o protocolo CODOX-M-IVAC (doxorrubicina, ciclofosfamida, citarabina, metotrexato e vincristina). Após o segundo ciclo deste protocolo, o paciente evoluiu com sintomas neurológicos e motores. À eletroneuromiografia evidenciou polineuropatia periférica de padrão axonal e desmielinizante atribuída a vincristina. Substituído pelo protocolo da-EPOCH (etoposídeo, ciclofosfamida, doxorrubicina) com omissão da vincristina. Realizou PET-CT que evidenciou boa resposta ao tratamento (Deauville 2). Retornou ao serviço por quadro de cefaleia, vômitos incoercíveis e estrabismo, levantando-se a possibilidade de paralisia facial periférica de provável etiologia herpética, tendo iniciado aciclovir e solicitado ressonância magnética de crânio para diagnósticos diferenciais. À RNM evidenciou espessamento de glândula lacrimal esquerda, extensas áreas de alteração de sinal branca dos centros semiovais, regiões ganglionares, corpo caloso, pedúnculos cerebelares e núcleos dentados cerebelares, podendo estar relacionado a encefalopatia por HIV, infiltração neoplásica secundária ou leucoencefalopatia multifocal progressiva. Evoluiu com confusão mental e dois episódios de crises convulsivas tônico-clônico generalizadas. Realizada TC de crânio com achados possivelmente relacionados a edema cerebral difuso. Encaminhado para leito de terapia intensiva, com necessidade de intubação orotraqueal. Durante a internação, fora avaliado por médico hematologista, sendo prescrito ácido folínico devido a hipótese de leucoencefalopatia associada ao metotrexato. Paciente não apresentou melhora clínica ao medicamento, aumentando a possibilidade já aventada de leucoencefalopatia multifocal progressiva. Seguiu em declínio importante, sendo paliativado por limitações terapêuticas e gravidade da doença, evoluindo a óbito. Discussão: Pacientes convivendo com o HIV possuem uma alta chance de desenvolver linfoma não-Hodgkin, sendo o segundo tipo de câncer mais frequente neste grupo. O HIV não é considerado um vírus oncogênico, mas a imunossupressão decorrente da infecção favorece a infecção por vírus oncogênicos. O tratamento para linfoma não-hodgkin ainda é discutido, sendo o atual protocolo utilizado relacionado a um maior risco de toxicidade e maiores chances de infecções oportunistas associadas. Neste contexto, surge a leucoencefalopatia multifocal progressiva (LEMP), doença desmielinizante do sistema nervoso central em decorrência da infecção de oligodendrócitos pelo vírus JCV, um poliomavírus de DNA normalmente adquirido durante a infância e que permanece latente no organismo, podendo ser reativado principalmente em pacientes imunodeprimidos. Os sintomas comuns são o déficit visual e demência progressiva, sendo o comprometimento motor mais tardio, se comportando como uma síndrome do neurônio motor superior. Conclusão: Dessa forma, conclui-se que há relação causal entre este paciente imunossuprimido, pelo HIV ou por tratamento oncológico instituído, ao diagnóstico de LEMP. Devido às limitações terapêuticas apresentadas, salienta-se a importância da realização de diagnósticos precoces de doenças oportunistas em pacientes destes grupo, configurando ainda um desafio diagnóstico para tal.

Objetivo: O presente relato objetiva a apresentação de um caso de síndrome de Horner como manifestação associada a doença hematológica - linfoma não Hodgkin difuso de grandes células B. Relato de caso: Masculino, 52 anos, com diagnóstico de linfoma não Hodgkin de grandes células B, em tratamento como imunoquimioterapia (protocolo R-CHOP), apresentou em consulta ambulatorial quadro de anisocoria - pupila miótica a direita e ptose palpebral ipsilateral. Paciente apresentava PET-CT evidenciando massas em regiões axilares, torácica interna, cervical e paravertebral. Solicitada avaliação da neurologia clínica que aventou a possibilidade de Síndrome de Horner. Discussão: A Síndrome de Horner é uma condição neurológica caracterizada pela tríade: miose, ptose palpebral e anidrose facial (ipsilateral à lesão). Qualquer lesão localizada nas vias que fornecem inervação simpática ocular pode ser responsável pelo quadro, desde lesões benignas a causas malignas. A etiologia é extremamente variável. De forma geral, as possíveis causas são divididas de acordo com a ordem neuronal acometida. Os neurônios de primeira ordem associados à Síndrome de Horner originam-se no hipotálamo e possuem axônios que descem pela coluna cervical até os níveis de C8 a T12. Lesões encefálicas e cervicais são responsáveis por essa classificação, também chamada de central. As principais causas são acidentes vasculares encefálicos, tumores intracranianos ou cervicais e síndromes desmielinizantes. Contudo, dificilmente as manifestações da Síndrome de Horner são isoladas nestes casos, devido à proximidade de diversas outras estruturas importantes. A Síndrome de Horner de segunda ordem, ou pré ganglionar, por sua vez, é associada a neurônios que se originam no núcleo de Budge-Waller (núcleo espinal localizado entre C8 e T12) e com axônios que formam um nervo simpático que se apresenta próximo a diversas estruturas torácicas como aorta, ápice pulmonar e realizam sinapse no gânglio cervical superior, de localização próxima à bifurcação carotídea. Lesões da região superior do tórax e região cervical inferior, como tumores ou traumas torácicos, incluindo procedimentos médicos como passagem de acesso central, estão associadas a esta classificação da Síndrome de Horner. Um exemplo clássico é o tumor de Pancoast. Os neurônios de terceira ordem que estão associados a manifestações da SH se originam no gânglio cervical superior, com axônios que formam um plexo ao redor das artérias carótidas comum e interna, chegando até o sino cavernoso e então realizando a inervação ocular e orbitária. Esta classificação também é chamada de pós ganglionar. Uma das causas mais comuns é a dissecção carotídea, que em até 30% dos casos pode se manifestar através da Síndrome de Horner. A presença da tríade não é universal. Anidrose facial está associada somente com lesões de primeira ou segunda ordem. A miose geralmente é de leve intensidade, assim como a ptose, que geralmente afeta a pálpebra inferior. Conclusão: Desse modo, fica evidente que a Síndrome de Horner, mesmo não resultando em sintomas significativos, é um relevante sinal de patologia grave e até mesmo fatal. Exame físico e anamnese detalhada são extremamente importantes para detecção da Síndrome de Horner e de sua causa base. Ademais, diferenciar entre central, pré e pós ganglionar para identificar as possíveis etiologias e os exames complementares necessários, é imprescindível para o sucesso da terapêutica.

Introdução: As doenças causadas pela infecção pelo HHV-8 incluem, além do sarcoma de Kaposi, um espectro de doenças linfoproliferativas que afetam especialmente pacientes HIV. Geralmente, resultam da interação entre o vírus e um sistema imune desregulado, formando nichos inflamatórios nos quais as células B, em diferentes estágios de desenvolvimento, são infectadas, proliferam e podem passar de um estado policlonalpara monoclonal/neoplásico. Objetivo: Reportar um caso que envolve o espectro de doenças linfoproliferativas associadas ao HHV-8 em paciente diagnóstico recente de HIV em fase AIDS. Relato de caso: Homem de 34 anos, com diagnóstico de HIV recente, em uso de terapia antirretroviral há 1 mês, é encaminhado para investigação de quadro febril e bicitopenia (anemia normocítica normocrômica e plaquetopenia, ambas com requerimento transfusional). À admissão, apresentava linfonodos aumentados em número em cadeias cervicais, axilares e inguinais, hepatoesplenomegalia e manchas amarronzadas, irregulares e assintomáticas em membros inferiores. Demais exames laboratoriais alterados: hiponatremia, hipoalbuminemia e provas inflamatórias elevadas. As tomografias evidenciaram derrame pleural moderado bilateral e ascite pequena, ambos negativos para malignidade. Biópsias da lesão cutânea e de linfonodo com alterações morfológicas sugestivas de doença associada à infecção pelo HHV-8, manifestação cutânea compatível com Sarcoma de Kaposi e linfonodo compatível com Doença de Castleman Multicêntrica (DCM). A medula óssea continha apenas alterações reativas e a investigação foi ampliada com endoscopia e colonoscopia. Foi identificada lesão em corpo gástrico compatível com neoplasia de células linfoides de morfologia centroblástica e plasmablástica, com expressão de CD30, MUM-1 e Ki67 de 95%, também positiva para o HHV-8 compatível com o diagnóstico de um Linfoma Difuso de Grandes Células B associado ao HHV-8 (HHV-8 + LDGCB NOS). O paciente iniciou tratamento com quimioterapia (CHOP) e manteve a terapia antirretroviral com melhora clínica exuberante e resolução das citopenias ainda no 1° ciclo. Ao término do 6° ciclo, apresentou resposta metabólica completa bem como resolução das lesões do Kaposi. Discussão: A DCM é uma hiperplasia angiofolicular que leva à proliferação clonal de células B e tem as características histopatológicas presentes em mais de uma porção do linfonodo. Apresenta curso clínico com exacerbações intermitentes e 50% dos casos são positivos para HHV-8, diferindo em tratamento e prognóstico. Poucos casos de HHV-8 + LDGCB NOS ocorrem na ausência de DCM concomitante. Nesta entidade, os plasmablastos neoplásicos formam folhas e aglomerados confluentes que destroem a arquitetura do tecido subjacente e confere um prognóstico pior. No entanto, o número limitado de casos relatados dificulta a definição de uma terapia ideal. Conclusão: Relatamos o caso raro de um paciente com diagnóstico de três neoplasias sincrônicas associadas ao HHV-8, tratado com poliquimioterapia e desfecho favorável.

Introdução: O linfoma de células T/NK extranodal testicular, é uma doença rara, de comportamento clínico agressivo derivado de células natural-killer ou, mais raramente, de linfócitos T citotóxicos. O tumor geralmente acomete a região nasal e paranasal, mas pode acometer pele, pulmões, trato gastrointestinal, testículos, rins, pâncreas e sistema nervoso central. A infecção latente pelo vírus Epstein-Barr (EBV) está ligada a células tumorais. O diagnóstico é feito por biópsia, mostrando um infiltrado celular variado e positividade em testes para CD45Ro, CD3, CD7, CD56, EBER, Granzima B e TIA-1. O bjetivo: Relatar um caso clínico de linfoma de células T/NK testicular, tendo em vista ser uma patologia rara e com inúmeros desafios relacionados, principalmente, ao tratamento. Relato de caso: Homem de 53 anos, com histórico de aumento testicular à direita e úlcera dolorosa sem histórico de trauma local associado a perda ponderal de 15 quilos em 04 meses. Foi submetido a orquiectomia radical à direita. O exame anatomopatológico revelou a presença de neoplasia de células linfoides e imuno-histoquímica com positividade para TIA-1, GRANZIMA B, CD45 e CD03 difuso e negativo para ALK-1, CD56, CD138, CD8, CD5, CD30, CD4, CD7, TDT, CD20, c-KIT (CD117). O Ki67: alto índice proliferativo (60% das células). Encaminhado para o serviço de hematologia, realizado estudos tomográficos de estadiamento que evidenciaram: linfonodos axilares com 1,0 cm; nódulo pulmonar com 3,2 cm; nódulos adrenais bilaterais com 5,8 e 4,8 cm e formações nodulares em tecido subcutâneo em parede abdominal. Foi planejado tratamento com protocolo GELOX, profilaxia para SNC e RT escrotal direita. Após dois ciclos de quimioterapia, o paciente cursou com hepatotoxicidade grau IV, sendo optado por troca de protocolo para GEMOX. Até o momento, mostrando resposta parcial ao tratamento, com melhora importante da lesão testicular. Foi encaminhado para serviço de transplante de medula óssea. Discussão: O linfoma de células T/NK extranodal testicular é uma neoplasia muito rara e agressiva. Embora a apresentação clássica seja nas regiões nasais e paranasais, este caso destaca uma manifestação incomum como o envolvimento testicular. O local de acometimento sugere pior prognóstico, bem como o Ki67 elevado e expressão do EBV, que afetam negativamente na sobrevida do paciente. Além do mais, não há tratamento padronizado para esses pacientes, sendo, a quimioterapia contendo L-asparaginase e radioterapia as melhores opções. O transplante de medula óssea, embora controverso em qual modalidade, é uma opção para esses pacientes. Ainda assim, mantendo uma sobrevida média de 12 meses Conclusão: Este relato de caso enfatiza a raridade e agressividade do linfoma de células T/NK extranodal tipo nasal com envolvimento testicular. O diagnóstico precoce e preciso, baseado em características imunohistoquímicas específicas, é crucial para iniciar um tratamento adequado. A abordagem terapêutica, incluindo quimioterapia seguida de TMO, pode melhorar a sobrevida, embora a toxicidade e complicações associadas ao tratamento devam ser cuidadosamente gerenciadas.

Introdução: O Linfoma Cutâneo Primário de Células B (PCBCL) é uma forma de linfoma de células B que se origina exclusivamente na pele, sem evidências de comprometimento extracutâneo após a avaliação inicial de estadiamento. Dentro desta categoria, o Linfoma Cutâneo Primário de Células B tipo “leg” (PCDLBCL-leg type) é o subtipo menos prevalente, mas notoriamente significativo devido à sua natureza agressiva e ao impacto clínico associado. O PCDLBCL-leg type é raro, com uma incidência estimada de 4% entre todos os linfomas cutâneos e até 20% dos PCBCLs. Este subtipo tende a afetar predominantemente adultos mais velhos e frequentemente se apresenta com uma evolução clínica mais agressiva em comparação com outros PCBCLs. Objetivo: Relatar um caso de paciente com PCDLBCL-leg type. Relato de caso: Homem, 76 anos, refere aparecimento de nodulação em coxa direita com crescimento progressivo de 20 cm e surgimento de ulceração após 9 meses. Realizada biópsia da lesão em região inguinal esquerda em maio/24 com resultado de neoplasia maligna pouco diferenciada com extensas áreas de necrose. Imunofenotipagem com perfil positivo para CD20, CD10, BCL2, Ki 67 (90%), CD23; e perfil negativo para AE1/AE3, CD3, CD30, Ciclina D1, CD5, MUM-1, c-Myc, Bcl-6, Proteína S-100, compatível com infiltração dérmica por Linfoma difuso de grandes células B, perfil de células do centro germinativo. Realizado estadiamento com tomografias, sem evidência de linfonodomegalias e biopsia de medula óssea sem infiltração. Iniciado tratamento com esquema R-CHOP. Atualmente o paciente está no 4°ciclo de quimioterapia, em resposta parcial, apresentando melhora da lesão, em processo de cicatrização por segunda intenção. Discussão: O PCDLBCL-leg type é notoriamente mais agressivo em comparação com outras categorias de PCBCL. Clinicamente, este subtipo se manifesta por meio de nódulos ou tumores eritemato-violáceos, que podem ser únicos ou múltiplos, frequentemente agrupados, ulcerados e localizados predominantemente nas pernas. Esses tumores têm um padrão de crescimento rápido e progressão acelerada, o que reflete o comportamento agressivo observado neste caso e é consistente com o perfil clínico geralmente associado ao PCDLBCL-leg type. A diferenciação diagnóstica é crucial, pois o PCDLBCL-leg type pode ser confundido com outras neoplasias cutâneas que compartilham características morfológicas semelhantes. O diagnóstico preciso é realizado por meio de uma combinação de exames histopatológicos e imuno-histoquímicos, que permitem distinguir o linfoma de outras condições cutâneas e excluir linfomas sistêmicos com envolvimento secundário da pele. O prognóstico para o PCDLBCL-leg type é geralmente reservado, refletindo sua natureza agressiva e a tendência a apresentar um curso clínico desfavorável. Conclusão: Dada a natureza agressiva do PCDLBCL-leg type, caracterizada por rápido crescimento, elevado índice proliferativo e prognóstico reservado, é de extrema importância o reconhecimento precoce das suas manifestações clínicas. O diagnóstico precoce, aliado a uma abordagem terapêutica eficaz, pode impactar positivamente na resposta ao tratamento e na sobrevida dos pacientes.

Introdução: O linfoma primário de sistema nervoso central (LPSNC) é um linfoma não-Hodgkin extranodal restrito ao parênquima cerebral, meninges, medula espinhal, líquido cefalorraquidiano e/ou olhos. Cerca de 90% dos casos são linfomas difusos de grandes células B e os demais dividem-se em indolentes, Burkitt e células T. A incidência é de 0,4 casos por 100.000 habitantes, sendo o HIV um fator de risco importante. Outros fatores incluem idade avançada, doenças reumatológicas e imunossupressão. A apresentação clínica cursa com, principalmente, sintomas neurológicos. A biópsia cerebral é o exame confirmatório e o anatomopatológico mostra células B malignas no espaço perivascular. A imuno-histoquímica revela marcadores pan-B, como CD19, CD20, CD22 e CD79a. O estadiamento inclui exames de imagem e biópsia de medula óssea. Objetivo: O objetivo deste relato de caso é compartilhar uma experiência clínica rara sobre linfoma primário do sistema nervoso central, contribuindo para a compreensão da doença e oferecendo insights sobre apresentação, diagnóstico, tratamento e evolução. Relato de caso: Mulher, 52 anos, sem comorbidades, apresentou cefaléia fronto-temporal esquerda intensa há um ano e meio, com piora progressiva e um episódio convulsivo tônico-clônico generalizado. A RNM revelou lesão expansiva extra-axial no epicentro passelar esquerdo, comprometendo o cavum de Meckel ipsilateral e com extensão para a cisterna pré-pontina e conduto auditivo interno ipsilateral. A lesão tinha hipossinal em T2, intensa impregnação pelo contraste e mediu cerca de 40 mm. A artéria carótida interna estava encarcerada pela lesão, com leve redução do calibre e mínima extensão para a sela. A biópsia mostrou infiltrado por células linfoides intermediárias, com imuno-histoquímica positiva para CD20, CD3, CD10 localmente, BCL2, CD21, CD23 e negativo para Ciclina D1, Ki67 20%. Tomografias de estadiamento não mostraram massas ou linfonodomegalias. Iniciou-se o tratamento com protocolo R-MVP e citarabina em altas doses. Após a quimioterapia, a RNM mostrou resposta completa e o paciente foi encaminhado para transplante de medula óssea. Discussão: Este caso ilustra a importância do diagnóstico precoce e a identificação dos fatores prognósticos, como idade > 60 anos, ECOG > 1, aumento DHL e hiperproteinorraquia. O tratamento requer uma combinação de quimioterapia que contenha metotrexato, além da possibilidade de radioterapia, embora, a neurotoxicidade relacionada a essa terapia seja um obstáculo para ampla utilização, principalmente em pacientes jovens. O transplante de medula óssea pode levar a uma resposta completa. Conclusão: O diagnóstico precoce e tratamento imediato são cruciais para o sucesso no linfoma primário de sistema nervoso central. A análise detalhada dos fatores prognósticos e a escolha criteriosa do tratamento são fundamentais para obter melhores resultados. Relatos de casos como este são valiosos para aprimorar o conhecimento e desenvolver novas estratégias terapêuticas.

Introdução: A Síndrome de Evans (SE) é uma condição rara caracterizada pela presença simultânea ou sequencial de duas ou mais citopenias autoimunes, frequentemente incluindo anemia hemolítica autoimune (AHAI) e púrpura trombocitopênica idiopática (PTI). Pode também envolver neutropenia autoimune. Pode ser primária ou secundária, inclusive a doenças linfoproliferativas. A SE e a Macroglobulinemia de Waldenström (MW), uma neoplasia de células B caracterizada pela produção excessiva de imunoglobulina M (IgM), podem coexistir em um pequeno número de pacientes, complicando ainda mais a abordagem clínica. Objetivo: Relatar um caso de paciente com SE associado a MW. Relato de caso: Mulher, 62 anos, com queixa de astenia e hiporexia há 1 mês, encaminhada devido anemia severa e plaquetopenia. Ao exame físico hipocorada e com hepatomegalia. Realizados exames à admissão que evidenciaram hemoglobina de 2,6 g/dL e plaquetas 73.000/uL. Provas de hemólise alteradas (reticulócito 10,9%, DHL 604 UI/L, Bilirrubina Indireta 1,6, Haptoglobina < 10, TAD Positivo, Eluato Positivo IgG indeterminado), sorologias normais, complemento consumido e FAN 1/80 padrão nuclear pontilhado. Realizado diagnóstico de SE, iniciado corticoide, com boa resposta. Durante investigação ambulatorial realizada Imunoeletroforese de proteínas séricas: IgG 1202 IgM 3818 IgA 25 - Presença de banda monoclonal IgM Kappa. Realizada Biopsia de Medula Óssea com infiltrado de linfócitos e plasmócitos. Imunofenotipagem compatível com Linfoma de células B pequenas. Marcadores positivos: CD20, CD138 (5% de plasmócitos), Kappa Focal, Lambda focal, Kappa > Lambda, MPO, Glicoforina A, Fator VIII, CD34, CD117: positivo (mastócitos). Concluindo o diagnóstico de MW. Iniciado tratamento com protocolo DRC e após 6 ciclos paciente encontra-se em VGPR (EFP sem componente monoclonal, IgM < 300, ausência de linfonodomegalias, redução de visceromegalias) com hemoglobina 13,2 g/dL e plaquetas 186.000/uL. Discussão: O diagnóstico de SE depende da exclusão de demais causas de anemia hemolítica e trombocitopenia, além da pesquisa de etiologias infecciosas, neoplásicas e doenças autoimunes. No caso relatado vimos que durante a investigação da SE foi realizado o diagnóstico de MW, a qual pela sua variedade de sintomas e sua sobreposição com outras condições, podem tornar o diagnóstico desafiador. A infiltração dos tecidos hematopoéticos leva a sintomas sistêmicos, como anemia e aumento de órgãos, enquanto a proteína monoclonal IgM no sangue contribui para hiperviscosidade e neuropatia. Identificar esses sintomas precocemente é crucial para o manejo e tratamento eficaz da MW. Conclusão: Este caso destaca a dificuldade em estabelecer um diagnóstico preciso devido à sobreposição dos sintomas e à diversidade dos padrões clínicos apresentados. A interação entre as patologias requer uma avaliação diagnóstica cuidadosa, incluindo a realização de exames especializados e a consideração de diagnósticos diferenciais. Além disso, o manejo terapêutico exige uma abordagem integrada e individualizada, que leve em conta tanto a necessidade de controlar a produção excessiva de IgM quanto a gestão da autoimunidade associada.

Introdução: Na Leucemia Promielocítica Aguda (LPA), a alteração citogenética mais característica é a t(15;17)(q24;q21). Essa translocação resulta na formação do gene de fusão promielocítico-retinoico (PML-RARA), que interfere na regulação normal da diferenciação celular, levando ao acúmulo de promielócitos imaturos. A presença deste gene é fundamental para o diagnóstico da LPA e é alvo de terapias direcionadas. Objetivo: Relatar caso de paciente com LPA associado a cariótipo complexo. Relato de caso: Mulher de 51 anos, sem antecedentes prévios, procurou atendimento com história de hematomas espontâneos há 3 dias, associado a perda ponderal não quantificada. Exame inicial evidenciou pancitopenia (Hb 7.8 g/dL, leucócitos de 600/mm3 com 84/mm3 neutrófilos e 24.000/mm3 plaquetas) associado a alteração de INR (1,65). Realizado mielograma com presença de 77% de blastos granulares, alguns com núcleo convoluto, hipergranular e com projeções citoplasmáticas sugestivas de LPA. Foi iniciado ácido transretinoico (ATRA). A investigação adicional revelou cariótipo complexo - 46,XX, t(3;15;17)(p13;q22;q21),del(6)(p21)[20]. Foi iniciado o protocolo PETHEMA, sem intercorrências. A paciente atingiu remissão completa com PML-RARA negativo após indução. Atualmente a paciente segue em manutenção, mantendo remissão molecular. Discussão: Embora a t(15;17) seja a mais característica, outras alterações adicionais podem ocorrer em casos de LPA. Em estudo com 284 pacientes, 26 foram identificados com anomalias cromossômicas adicionais, complexas ou variantes no diagnóstico ou na recidiva. Algumas dessas aberrações cromossômicas foram associadas a morfologia e resposta medicamentosa atípicas. A análise dos dados de indução de remissão e sobrevida mostrou que a presença de anomalias cromossômicas adicionais estava relacionada a pior prognóstico, tendo uma sobrevida global de 70% em comparação a 91% de pacientes com cariótipo simples. Este mesmo trabalho mostrou possível influência em relação à resposta ao tratamento, tendo 1 caso com resistência ao ATRA. Conclusão: A presença da t(15;17) geralmente está associada a um bom prognóstico devido à eficácia das terapias direcionadas. Aberrações citogenéticas menos comuns permanecem incertas quanto ao prognóstico e resposta ao tratamento.

Introdução: A leucemia mieloide aguda megacarioblástica (LMA-M7) é uma forma rara de leucemia caracterizada pela proliferação clonal de megacariócitos imaturos. O cariótipo complexo, presente em alguns pacientes, está associado a um prognóstico desfavorável. Objetivo: Relatar o caso clínico de uma paciente idosa com diagnóstico de LMA-M7 com cariótipo complexo, enfatizando a apresentação clínica, diagnóstico, tratamento e evolução no contexto do serviço público de saúde. Relato de caso: Mulher, 67 anos, com histórico de diabetes mellitus e hipertensão arterial, foi admitida no serviço de saúde apresentando fraqueza generalizada que piorou progressivamente nos últimos 15 dias, culminando em dificuldade para deambular. O hemograma inicial revelou pancitopenia. O mielograma mostrou-se hipercelular com 31,2% de células de moderado a grande porte, alta relação núcleo/citoplasma, cromatina frouxa, nucléolo evidente, citoplasma basofílico com “blebs”, e alguns granulares, compatível com leucemia aguda. Cariótipo da medula óssea: 48,XX,del(5)(q11.2q31),add(9)(p24),-11,del(12)(p11.2),-18,+der(19)t(?;19)(?;q13.4), -20,add(21)(p13),+mar1 × 2;+mar2 × 2[20]. Imunofenotipagem: Positivos: CD15, CD33, CD36par, CD41a par (40%), CD61par(45%), CD71+, CD117 par (25%), MPO par (21%) Negativos: CD2, CD3 de superfície, CD3 citoplasmático, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11b, CD13 (13%), CD14, CD15, CD19, CD20, CD34, CD64, CD79a citoplasmático, CD123, HLA-DR, Lambda, MPO, TCR gamma-delta, TdT O laudo identificou 46,9% de células blásticas com expressão de antígenos mieloides. Houve expressão dos antígenos megacariocíticos CD41 e CD61, sem positividade para marcadores associados às linhagens linfoides. A paciente foi submetida a quimioterapia de indução com citarabina e daunorrubicina. No décimo dia após o início do tratamento, a paciente evoluiu com choque séptico refratário e veio a óbito. Discussão: A LMA-M7 é uma condição rara e agressiva, frequentemente associada a anomalias citogenéticas complexas. O cariótipo complexo observado nesta paciente está associado a um prognóstico ruim e resposta desfavorável ao tratamento convencional. As comorbidades pré-existentes, como diabetes e hipertensão, podem ter contribuído para a evolução negativa do quadro clínico. Estudos sugerem que pacientes com cariótipos complexos apresentam uma menor taxa de resposta ao tratamento quimioterápico padrão e uma sobrevida global reduzida. Conclusão: Este caso ilustra a complexidade e o prognóstico desfavorável da LMA-M7 com cariótipo complexo em pacientes idosos, especialmente no contexto de comorbidades. A rápida progressão para choque séptico refratário após o início do tratamento destaca a necessidade de abordagens terapêuticas menos tóxicas, mais eficazes e personalizadas. A gestão de tais casos no serviço público de saúde requer um esforço multidisciplinar para otimizar os resultados clínicos e melhorar a qualidade de vida dos pacientes.

Introdução: A leucemia mieloide aguda (LMA) é uma neoplasia hematológica caracterizada pela proliferação clonal de células progenitoras mieloides. As mutações nos genes FLT3 e NPM1 são comuns na LMA e estão associadas a um prognóstico variado. A presença de necrose de medula é uma apresentação rara e associa-se a um desafio diagnóstico e prognóstico. Objetivo: Relatar o caso clínico de um paciente idoso com diagnóstico de LMA com mutações simultâneas de FLT3 e NPM1 e necrose de medula óssea, destacando a apresentação clínica, diagnóstico, tratamento e evolução. Relato de caso: O paciente, Sr. M.P.S., de 42 anos, sem antecedentes patológicos relevantes, foi admitido no serviço público de saúde apresentando sintomas de fadiga intensa, dor lombar intensa, refratária a analgesia. O hemograma inicial revelou leucocitose com presença de blastos circulantes, anemia grave e plaquetopenia. O mielograma realizado mostrou os seguintes resultados: uma celularidade não avaliada devido à presença intensa de debris celulares, material róseo e amorfo de permeio e grumos medulares com células degeneradas, sugerindo necrose de medula óssea. A biópsia de medula óssea e a análise de biologia molecular confirmaram a presença de mutações em FLT3 e NPM1. A imunofenotipagem revelou 16,4% de células com o seguinte perfil inmunofenotípico positivo: CD45, CD56 (parcial), CD33, CD13, CD123, CD36 (parcial), CD99, CD38, MPO. O paciente foi submetido a um regime de indução quimioterápica com citarabina e daunorrubicina + inibidor de FLT3. Após 30 dias do início da indução, o paciente atingiu resposta morfológica e molecular completa, evidenciada pela ausência de blastos na medula óssea e normalização dos marcadores moleculares. A biópsia de medula mostrava uma intensa fibrose, com a pesquisa de doença residual mínima negativa. Discussão: A presença simultânea de mutações FLT3 e NPM1 na LMA está associada a um curso clínico agressivo e a um prognóstico variável. A necrose de medula óssea, embora rara, pode ocorrer em casos de LMA e está associada a uma alta carga de doença e resposta inflamatória significativas. O impacto prognóstico da necrose de medula óssea na leucemia aguda no momento do diagnóstico é pouco descrito, mas associado a um prognóstico adverso. Os principais sintomas descritos são a dor óssea e a febre. Conclusão: Este caso destaca a raridade e complexidade da LMA com mutações simultâneas de FLT3 e NPM1 e necrose de medula óssea. A identificação precoce da necrose medular em leucemia aguda recém-diagnosticada pode ser útil para estabelecer estratificação prognóstica e tomada de decisão em relação ao tratamento.

Introdução: A Leucemia de Células Plasmáticas (LCP) é uma forma rara, porém agressiva, de Mieloma Múltiplo (MM). Ela se caracteriza pela presença de células plasmáticas circulantes no sangue periférico. O diagnóstico requer a confirmação de Mieloma Múltiplo, evidenciado pela presença de uma população monoclonal de células plasmáticas no mielograma e/ou biópsia de medula óssea, além da presença de ≥ 5% de células plasmáticas no sangue periférico. Objetivo: O presente estudo relata um caso clínico de LCP, uma patologia rara com prognóstico desfavorável, que apresentou síndrome de DRESS durante tratamento medicamentoso. Relato de caso: Homem, 59 anos, com queixa de cansaço e perda ponderal de 23 kg em seis meses. Negou febre, sudorese e prurido. Havia sido internado em hospital externo devido a bicitopenia (anemia + plaquetopenia) com necessidade de transfusão de hemocomponentes. O estudo medular realizado no serviço indicou presença de 11,6% de plasmócitos anômalos. O paciente iniciou tratamento quimioterápico com esquema VTD e profilaxias com Alopurinol, Aciclovir e Sulfametoxazol +trimetoprim. Após 1° ciclo de VTD paciente desenvolveu quadro clínico de “rash” eritematoso maculopapular pruriginoso em face, tórax, dorso, membros superiores e abdome associado doença renal crônica agudizada - necrose intersticial aguda - o quadro foi considerado compatível com síndrome DRESS (Reação a drogas com eosinofilia e sintomas sistêmicos) e confirmado com biópsia de pele apresentando Dermatite de padrão misto e eosinofilia: Espongiótico; foliculite; dermatite de interface e eosinófilos intersticiais. Houve suspensão de alopurinol e sulfametoxazol + trimetropina e iniciou-se corticoterapia em altas doses aliada a suporte hemodinâmico, tratamento de infecções secundárias, hidratantes corporais e antialérgicos para melhora do prurido. Evoluiu com resolução das manifestações cutâneas e laboratoriais, sendo encaminhada para seguimento ambulatorial. Discussão: A síndrome DRESS é uma reação de hipersensibilidade grave induzida por drogas que causa erupções cutâneas, febre e outras manifestações como linfadenopatia, eosinofilia e acometimento de vários órgãos, como alteração da função renal. Uma grande proporção de casos (aproximadamente 75 por cento) é devida a alguns medicamentos de alto risco. Estes incluem anticonvulsivantes (por exemplo, carbamazepina, fenitoína, lamotrigina), alopurinol, antibacterianos contendo sulfonamida, mexiletina, minociclina e vancomicina. Conclusão: A síndrome DRESS está associada a um grande potencial de morbimortalidade. O reconhecimento precoce e a suspensão da droga desencadeadora aliada a corticoterapia são os tratamentos de escolha.

Objetivos: Um dos desafios científicos da LMA é compreender os mecanismos de resistência aos tratamentos quimioterápicos. O microambiente da medula óssea é constituído de múltiplos nichos, cada um deles possuindo diferentes tipos celulares, moléculas e via de sinalização específicas, onde ocorrem interações célula-célula e sofre efeitos parácrinos e endócrinos. As interações de células leucêmicas e nichos da medula óssea têm surgido como potenciais novos alvos terapêuticos, visto que recentemente elucidou-se a influência da LMA em modificar a arquitetura e funcionalidade dos nichos da medula óssea, bem como os nichos vascular e endosteal conseguem modificar o comportamento dos blastos leucêmicos. Entretanto, o efeito de tais interações e influências na resistência à quimioterapia permanecem desconhecidos. O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da interação entre células leucêmicas e o nicho vascular da medula óssea na modulação da resistência à citarabina. Material e métodos: A fim de avaliar a migração das células leucêmicas (THP1) em direção às células do nicho vascular (EAhy296), o co-cultivo foi documentado utilizando a microscopia confocal. Para o ensaio de resistência à morte induzida por quimioterapia, a linhagem EAHY296 foi marcada com o CellTrace™ CFSE e, em seguida, realizado o co-cultivo com a ThP1 utilizando duas abordagens: o modelo de cultivo em 2D convencional e o modelo de cultivo em 3D, por meio da técnica de bioimpressão. O biomaterial usado foi o gel de alginato de sódio e gelatina para associação com as células das duas linhagens e produção dos arcabouços. Após a bioimpressão, os arcabouços foram submetidos às mesmas condições de cultivo do modelo em 2D. Em ambos, o co-cultivo foi realizado por 6 horas para posteriormente ser tratado com citarabina 10 uM por 14 horas. A taxa de morte celular foi avaliada em citometria de fluxo pela marcação com iodeto de propídeo. Foi realizado o teste ANOVA de uma via com p < 0.05 de significância; em caso de diferença estatística significativa foi realizado o test post-hoc de Dunn. Resultados: Nos ensaios de co-cultura 2D e 3D, foi observado um padrão de migração espontânea de células leucêmicas em direção as células vasculares, e estas interações celulares aumentaram a resistência à citarabina em aproximadamente 30% na LMA. Discussão: A doença residual mínima consiste de blastos resistetes à quimioterapia, e esta população é responsável pela recidiva da leucemia nos pacientes. Nossos resultados sugerem que as interações LMA-nicho vascular da medula óssea contribui para a sobrevivência dos blastos durante o tratamento. Os mecanismos moleculares envolvidos neste processo ainda necessitam ser investigados. Conclusão: Os blastos leucêmicos apresentam padrão de migração e capacidade de adesão ao nicho vascular da medula óssea e, a interação da LMA com o nicho vascular confere aumento da resistência a apoptose induzida pela citarabina.

Objetivo: Avaliar a eficácia funcional da hemoglobina (Hb) em concentrado de hemácias (CH) em bolsas de sangue suplementadas com 2,3-Bifosfoglicerato (2,3-BPG), inositol hexafosfato (IHP) e hidroximetilfurfural (5-HMF). Material e métodos: Dois Concentrados de Hemácias (CH), concedidos por voluntários saudáveis que assinaram o termo de Consentimento Livre e Esclarecido (CAAE: 72004423.7.0000.5404), foram fracionados em 4 bolsas pediátricas, cada qual suplementada com seu respectivo composto: 2,3-BPG, 5-HMF, IHP e solução NaCl 0,9% (controle). A concentração adicionada de cada composto foi determinada em estudos de dose prévios, considerando a viabilidade celular e funcionalidade da Hb, através dos quais determinou-se as concentrações de 0,05mM de IHP e 0,5mM de 2,3-BPG e 5-HMF. A Hb foi isolada dos CHs nos tempos de 2, 17 e 35 dias de armazenamento (D2, D17 e D35) e purificadas por duas cromatografia de exclusão molecular (colunas Sephadex 25G - Sigma-Aldrich; Missouri, USA) e troca iônica (Amberlite MB3; Sigma-Aldrich; Missouri, USA). A interação Hb-O2 foi avaliada pela obtenção de curva de dissociação Hb-O2 (CDO), por espectrofotometria (DU 800, Beckman Coulter-Fullerton, EUA), a temperatura controlada de 25C, e concentração de Hb a 70uM. Foram determinadas P50, para avaliação de afinidade e Constante de Hill (n) para cooperatividade heme-heme em pH 7,4mM (tampão Hepes 50mM,Sigma Aldrich). Os experimentos também foram reproduzidos com adição de IHP 1mM, efetor alostérico mimético ao 2,3-BPG. A formação de meta-Hb também foi monitorada por espectrofotometria. Resultados: O composto 2,3-BPG promoveu queda da P50 ao longo do tempo de armazenamento, com desvio à esquerda da curva CDO da Hb stripped (D2-doador 1; D17-doador 2; D35-doadores 1 e 2). O polissacarídio 5-HMF resultou na redução da P50 no D35 das amostras stripped e no D2 e D17 no estado stripped + IHP. Em relação à formação de meta-Hb, observou-se pico de formação no D17 para todas as bolsas, incluindo controle. Apesar disso, foi observada redução de formação de meta-Hb em bolsas suplementadas em relação ao controle, particularmente naquelas com adição de 5-HMF e IHP (D35). Discussão: 2,3-BPG é metabólito eritrocitário que reduz a afinidade da Hb pelo O2, conforme observado em nossos estudos de dose. Interessantemente, após o armazenamento, este composto, assim como os demais efetores alostéricos, resultaram no aumento da afinidade da Hb pelo O2 e redução de formação de meta-Hb (particularmente no D35). O 5-HMF é um polissacarídeo capaz de aumentar a afinidade Hb-O2 in vitro, efeito também observado no estudo de dose do estudo. Já nos CHs armazenados, seu efeito foi parcialmente observado, em alguns tempos de armazenamento, possivelmente pela baixa dose de incubação. Já o IHP (mimético do 2,3-BPG para a Hb) apresentou resultados funcionais semelhantes ao controle, com o diferencial de redução de formação de meta-Hb. Conclusão: Este é um estudo preliminar e deverá ser completado com o estudo de mais um CH para efetiva comparação estatística. No entanto, os resultados são bastante promissores. A suplementação de bolsas de sangue com compostos que alterem seu metabolismo celular e que também desempenhem papel no alosterismo proteico pode ser interessante para a melhoria da eficácia funcional da Hb armazenada em CHs.

Introdução: As neoplasias mieloproliferativas crônicas (NMP) são distúrbios clonais das células hematopoéticas caracterizadas pela proliferação de uma ou mais das linhagens mieloides. Elas incluem trombocitemia essencial (TE), policitemia vera (PV), mielofibrose primária (MF), leucemia mieloide crônica (LMC) e NMP não classificada (NMP-N). Estudo dinamarques identificou 97 indivíduos com diagnósticos de NMP e doença linfoproliferativa (DLP). Em 90% destes, ambos os diagnósticos foram estabelecidos dentro de 5 anos um do outro. Objetivo: Relatar caso de paciente em seguimento por NMP evoluindo com infiltração medular por DLP. Relato de caso: Paciente masculino, 59 anos, com diagnóstico de TE de alto risco desde 2010, com presença de mutação do JAK2 V617F e antecedente de trombose de SNC em 2019. Em novembro de 2023 evolui com citopenias graves com necessidade transfusional (Hb 6 g/dL e plaquetas 45.000/mm2), esplenomegalia e sintomas constitucionais. Aventada a hipótese de evolução para mielofibrose ou leucemia aguda, foi submetido a reavaliação medular. Os achados foram compatíveis com doença mieloproliferativa associada a infiltração por linfoma de células B pequenas. A imunohistoquímica mostrou CD20 positivo e CD5, CD23, ciclina D1 e CD10 negativos. A imunofenotipagem de sangue periférico demonstrou linfocitose B clonal CD5 negativo. Tendo como principal hipótese diagnóstica o linfoma de zona marginal esplênico, iniciado rituximabe 375 mg/m2 semanal em 4 doses. Após término, paciente evoluiu com resolução dos sintomas B, baço não mais palpável e hemograma normalizado. Discussão: Pacientes com NMP apresentam redução de sobrevida e na qualidade de vida devido a eventos vasculares e transformação em leucemia aguda. A incidência acumulada de DLP em pacientes com NMP tem sido relatada como maior do que na população em geral, mas apenas recentemente começaram a ser reveladas vias carcinogênicas comuns. Em especial, a mutação JAK2 V617F, que está presente em grande parte dos casos de NMP, tem sido associada a um aumento do risco de DLP. Conclusão: O diagnóstico de múltiplas neoplasias hematológicas clonais concomitantes é considerado raro. Quando ocorre, não está claro se os distúrbios estão relacionados em sua fisiopatogenia ou se refletem eventos aleatórios independentes. Identificar a coexistência dessas duas entidades pode se revelar um desafio, dado que a clínica de ambas frequentemente se entrelaçam, criando um cenário clínico muitas vezes indistinguível.

Introdução: As doenças mieloproliferativas são distúrbios do sangue que resultam em um crescimento e acúmulo anormais de células sanguíneas no sangue e na medula óssea. Compreender os dados epidemiológicos dessas doenças é essencial para a implementação de estratégias e programas de saúde pública Objetivo: O objetivo principal foi delinear o perfil epidemiológico de 45 pacientes diagnosticados com doenças mieloproliferativas crônicas acompanhados no serviço de Hematologia do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Triângulo Mineiro/EBSERH. Materiais e métodos: Trata-se de um estudo observacional, quantitativo, descritivo e analítico. Foram avaliados, retrospectivamente, 45 prontuários médicos on-line de adultos do serviço de Hematologia do HC-EBSERH/UFTM, considerando fatores como sexo, idade, estado civil, cor, tempo de acompanhamento e medicamentos em uso. Resultados: Em relação aos diagnósticos, houve uma predominância de Leucemia Mieloide Crônica (66,6%), seguida por Trombocitemia Essencial (22,2%) e Policitemia Vera (11,1%). Houve uma leve predominância masculina (60%), exceto para TE, que foram mais comuns em mulheres (80%). A média de idade foi de 61 anos (60,55 anos), com maior concentração nas faixas de 51-70 anos (44,4%) e 53,3% acima de 60 anos. Pacientes não brancos representaram 51,1%, sendo LMC mais comuns nesse grupo, enquanto PV foi mais prevalente entre brancos. Quanto ao estado civil, 46,6% dos pacientes eram solteiros. O maior tempo de acompanhamento foi de 11 anos. O tratamento principal, na LMC, foi o Imatinibe (66,6%), seguido pelo Dasatinibe e Nilotinibe. Na PV e TE, o tratamento foi Hidroxiureia associada ao AAS ou à Rivaroxabana. Discussão: Os resultados mostram que LMC é mais prevalente entre os pacientes estudados, seguido por TE e PV. A ligeira predominância masculina em LMC e PV são consistentes com a literatura. Já no caso da TE, o resultado de maior incidência em mulheres foi condizente com a literatura. A distribuição etária dos pacientes está de acordo com a literatura, sendo o envelhecimento o principal fator de risco para a maioria das neoplasias hematológicas crônicas. A análise da distribuição de cor revelou que 51,1% dos pacientes eram não brancos e 48,8% brancos. A LMC foi ligeiramente mais comum entre pacientes não brancos, enquanto a PV foi um pouco mais prevalente entre brancos. A literatura indica que a prevalência dessas doenças pode variar entre diferentes grupos em relação a cor, por apresentarem variações de incidência baseadas em fatores genéticos e ambientais. A variabilidade do tempo de acompanhamento dos pacientes, reflete as diferentes fases e a cronicidade dessas doenças e a necessidade de monitoramento contínuo. No que tange aos padrões de tratamento instituído aos pacientes, estes estão em conformidade com as diretrizes clínicas atuais, refletindo práticas terapêuticas estabelecidas, e disponibilidade destas no sistema único de saúde. Conclusão: Este estudo contribuiu para o entendimento das características epidemiológicas dessas doenças, oferecendo uma base para futuras intervenções e políticas de saúde.

Introdução: Embora a Leucemia Mieloide Crônica (LMC) geralmente siga um curso indolente, ela pode evoluir para uma fase mais agressiva conhecida como crise blástica, podendo manifestar-se como uma crise blástica mieloide ou linfoide. Aproximadamente 75% das crises blásticas na LMC são de tipo mieloide, enquanto cerca de 25% são linfoides. A crise blástica linfoide, embora menos comum, representa um desafio significativo, pois está associada a uma piora no prognóstico e a uma resposta terapêutica mais complexa. A compreensão da evolução para a crise blástica linfoide é crucial para o manejo adequado da LMC, pois envolve uma mudança no perfil celular e nos padrões de expressão genética. Objetivo: Relatar um caso de paciente com LMC em crise blástica linfoide B. Relato de caso: Homem, 56 anos, com diagnóstico de LMC fase crônica desde novembro/22, iniciou tratamento com Imatinibe em Janeiro/23 na dose de 400 mg ao dia, apresentando resposta molecular completa. Durante acompanhamento ambulatorial evoluiu com sintomas constitucionais em novembro/23 e interna em janeiro/23 com lesões orais, furunculose em axilas e surgimento de 85% de blastos em sangue periférico. Realizada avaliação medular com mielograma sugestivo de crise blástica. Imunofenotipagem por citometria de fluxo com demonstração de 81,17% células blásticas linfoides B, perfil imunofenotípico positivo: CD19, CD34, TdT, CD79a fraca intensidade, CD10 parcial (36,12); CD81, CD38, CD58, CD45 fraca intensidade, CD86 parcial, CD73/304, CD66c/123. Perfil imunofenotípico negativo: MPO, CD3, CD15, CD4, CD8, CD56, DC7, CD11b, CD20, NG2, CD13, CD3 citoplasmático. Realizado diagnóstico de Leucemia Mieloide Crônica em crise blástica linfoide B. Iniciado protocolo GRAAPH associado a Dasatinibe 140 mg por dia. Após indução, paciente realizou novo estudo medular com pesquisa de doença residual mínima negativa. Paciente foi submetido a TMO Alogênico, apresentando enxertia neutrofílica no D+16 e plaquetária no D+17. Discussão: A crise blástica linfoide B na LMC, marcada por uma alteração significativa na biologia da doença, representa uma fase agressiva da doença, caracterizada pela transformação das células leucêmicas em células blásticas linfoides imaturas. O caso relatado evidencia a complexidade e a gravidade associadas a essa fase da LMC. A presença de células blásticas linfoides B não apenas implica em mudanças do manejo clínico e terapêutico. O acompanhamento frequente dos parâmetros clínicos e laboratoriais é crucial para identificar precocemente a evolução para a crise blástica linfoide B e ajustar o tratamento conforme necessário. Conclusão: A introdução de ITK tem revolucionado o manejo da LMC, mas a crise blástica permanece um desafio, frequentemente exigindo estratégias terapêuticas mais agressivas e o uso de TMO para alcançar a remissão duradoura.

Introdução: A mastocitose é uma doença rara com uma incidência de 1 em 10.000 pessoas e predominância em mulheres adultas. Ela se caracteriza pelo acúmulo anormal de mastócitos, que podem se limitar à pele (mastocitose cutânea) ou afetar outros tecidos (mastocitose sistêmica). Os sintomas incluem máculas na pele, rubor, taquicardia, diarreia, anafilaxias e pancitopenias. O diagnóstico de mastocitose sistêmica segue os critérios da OMS de 2016, que incluem infiltração densa de mastócitos em órgãos e medula óssea com morfologia atípica e com expressão de CD2 e/ou CD25, mutação no gene C-KIT, níveis elevados de triptase. Objetivos: Relatar um caso clínico de mastocitose sistêmica agressiva com alteração genética que confere resistência aos inibidores de tirosina-quinase. Relato de caso: Homem de 52 anos, apresentou anemia normocítica e normocrômica, hematúria microscópica, diarreia, hepatoesplenomegalia, perda ponderal e lesões cutâneas. A biópsia de medula óssea mostra com hipercelularidade de 70% e fibrose discreta, com imuno-histoquímicos positivos para CD20, CD3 e CD117 positivo em 70% dos elementos nucleados, sugerindo mastocitose sistêmica. A mutação C-KIT exon 8 está ausente. A dosagem de triptase é de 200 μg/L (VR < 11,4 μg/L). O tratamento inicial com prednisona (1 mg/kg) trouxe boa resposta, com redução parcial da esplenomegalia e da anemia. Entretanto, evoluiu com nova piora clínica após desmame. Nesse momento, foi tentado Imatinibe, sem resposta. Realizada pesquisa de mutação C-Kit exon 17 (D816V) positiva, mostrando a resistência conferida pela mutação D816V. Realizado novo ciclo de prednisona, com nova resposta parcial e estabilidade clínica há 5 anos. O paciente foi encaminhado para transplante alogênico de medula óssea. Discussão: O diagnóstico da mastocitose sistêmica é complexo e depende de uma combinação de critérios clínicos, morfológicos e moleculares. A mutação D816V no gene C-KIT, é um importante marcador diagnóstico e está associada à forma mais agressiva da doença, além de resistência a muitos tratamentos direcionados como o Imatinib. Tratamentos alternativos são necessários para pacientes com a mutação D816V. Corticóides podem aliviar os sintomas, mas não controlam a doença a longo prazo. O transplante alogênico de medula óssea é a abordagem recomendada para formas avançadas e refratárias da doença, oferecendo uma potencial cura. Conclusão: Este caso clínico destaca a complexidade e os desafios no diagnóstico e tratamento da mastocitose sistêmica agressiva, especialmente quando associada à mutação D816V. A presença desta mutação confere resistência a muitos tratamentos direcionados, como o Imatinib, e está associada a formas mais graves da doença. Apesar da resposta parcial inicial ao tratamento com prednisona, a evolução clínica negativa após desmame e a necessidade de pesquisa de mutações adicionais reforçam a importância de abordagens terapêuticas alternativas e personalizadas.

Introdução: Síndrome de POEMS (SP) é uma doença rara com incidência incerta, acometendo mais frequentemente homens entre 50 e 60 anos. De acometimento sistêmico, sua patogênese ainda não é completamente entendida. Para o diagnóstico são necessários 2 critérios obrigatórios (polirradiculopatia e disfunção de células plasmocitárias), 1 critério maior (doença de Castleman, lesões ósseas escleróticas e elevação de fator de crescimento endotelial) e 1 critério menor (congestão extravascular, endocrinopatia, alterações cutâneas, papiledema e trombocitemia/policitemia). Objetivo: Relatar o caso de síndrome de POEMS associada a doença de Castleman variante plasmocitária. Caso: Mulher de 48 anos, com hipotireoidismo, foi encaminhada em 2016 para investigar linfonodomegalia cervical, dor nas mãos e pés e hepatomegalia. Inicialmente, a imunoeletroforese revelou componente monoclonal IgA lambda, e as sorologias para HHV-8 e HIV negativas. A biópsia com imunohistoquímica mostrou características da Doença de Castleman (DC) variante plasmocitária (positividade para CD20, CD3, CD23, KI67, CD138, Kappa, Lambda, CD34). Neuropatia confirmada com eletroneuromiografia de nervo mediano em punho com acometimento mielínico sensitivo. O PET-CT revelou lesão expansiva de 6 cm nos 1°e 2° arcos costais à direita com erosão óssea e invasão pleural. Com a confirmação diagnóstica, foi iniciado tratamento com Bortezomib, Ciclofosfamida e Dexametasona (VCD) entre 2017 e 2018, com resposta satisfatória, mas houve perda de seguimento devido à gestação. Em 2023, a doença recidivou e foi optado por radioterapia na região torácica direita e quimioterapia sistêmica com VCD. Após 6° ciclo, o PET-CT de reavaliação em fevereiro de 2024 mostrou redução das dimensões e metabolismo glicolítico da lesão. A paciente segue assintomática, aguardando TMO autólogo. Conclusão e discussão: Aproximadamente 11 a 30% dos pacientes com SP têm associação com a DC, podendo ser mais comum uma vez que muitos pacientes não são submetidos à biópsia de linfonodo. O curso da SP é crônico e a sobrevida geral melhorou ao longo dos anos tendo uma sobrevida global de 79% em 10 anos. O tratamento da síndrome POEMS ainda não é totalmente definido, com radioterapia como principal opção para casos localizados. Em caso de envolvimento medular, o TMO autólogo é o mais recomendado, tendo como alternativas a Lenalidomida e o Bortezomibe. Obtivemos ótima resposta no caso apresentado, sem maiores toxicidades. A dificuldade em reunir um número suficiente de pacientes ressalta a necessidade de mais estudos para dados mais robustos, especialmente sobre sua interação com DC.

Objetivos: investigar a qualidade dos concentrados de hemácias suplementados com 2,3-bifosfoglicerato (2,3-BPG), hexafosfato de inositol (IHP) e hidroximetilfurfural (5-HMF), avaliando o potencial desses compostos em reduzir danos de armazenamento e manter a integridade celular das hemácias para transfusões. Material e métodos: Concentrados de Hemácias (CH), concedidos por dois voluntários saudáveis que assinaram o termo de Consentimento Livre e Esclarecido (CAAE: 72004423.7.0000.5404), foram fracionados em 4 bolsas pediátricas suplementadas, respectivamente com os compostos: 2,3-BPG (0,05mM, Sigma-Aldrich, EUA), 5-HMF (0,05mM, Sigma-Aldrich, EUA) e IHP (0,5mM, Sigma-Aldrich, EUA), além do controle (adicionada solução NaCl 0,9% em mesmo volume dos compostos). Foram realizadas as seguintes análises nos dias 2, 17 e 35 de armazenamento (D2, D17 e D35): quantificação de 2,3-BPG (2,3-DPG ELISA Kit, CUSABIO, EUA); ATP (ATP Assay Kit, Sigma-Aldrich, EUA); glicose (Bioclin, Brasil); e lactato (Bioclin, Brasil), determinação de pH (Quimis, Brasil), hemólise (método de Harboe) e avaliação da morfologia eritrocitária por microscopia óptica (Nikon, Japão). Resultados: A concentração de 2,3-BPG variou durante o armazenamento, aumentando em média 1,95 μmol/mL até o 17ºdia e diminuindo cerca de 2,3 μmol/mL aos 35 dias. O ATP manteve-se estável nos grupos controle, IHP e 2,3-BPG, mas apresentou variações e tendência de aumento nas bolsas suplementadas com 5-HMF. A hemólise aumentou gradualmente na bolsa controle (0,11 a 0,14%), assim como nas bolsas com IHP e 2,3-BPG. O 5-HMF manteve níveis mais baixos de hemólise (0,08% a 0,1%). A concentração de glicose reduziu ao longo do tempo em todas as condições, com o 5-HMF retardando esse consumo no 17ºdia. O lactato aumentou em todas as condições, refletindo o consumo de glicose, com maiores concentrações nas bolsas controle (25,84 mmol/L) e com 5-HMF (26,16 mmol/L) aos 35 dias. Análises de microscopia mostraram esferoequinócitos após 17 e 35 dias de armazenamento em todas as condições, associadas à diminuição do pH e das concentrações de ATP. Discussão: O aumento inicial de 2,3-BPG pode ser atribuído à atividade glicolítica elevada nos primeiros dias, que aumenta a produção de ATP, essencial para a síntese de 2,3-BPG. A subsequente queda de 2,3-BPG após 17 dias sugere uma perda da capacidade das hemácias de manter funções metabólicas. O aumento no lactato é consistente com o consumo de glicose e a produção de ácido lático pela glicólise. A estabilidade do ATP na maioria dos grupos, exceto com 5-HMF, indica que este composto pode modular o metabolismo energético eritrocitário. A bolsa com 5-HMF apresentou os níveis mais baixos de hemólise, possivelmente devido a propriedades antioxidantes. A redução da glicose ao longo do tempo é esperada, mas o 5-HMF retardou esse consumo, indicando um possível efeito protetor. Conclusão: A variação de 2,3-BPG e a estabilidade do ATP, exceto com 5-HMF, fornecem insights sobre o metabolismo das hemácias armazenadas. A menor hemólise com 5-HMF sugere seu potencial como aditivo para melhorar a preservação das hemácias, com benefícios adicionais na estabilidade do pH e no consumo retardado de glicose. O estudo é preliminar e deverá ser complementado com a análise de mais um CH para devida comparação estatística.

Objetivos: Apresentar os resultados, desafios e estratégias de gestão adotadas durante a reestruturação societária de um grupo de hemoterapia. A reestruturação societária é um processo corporativo com o intuito de rever a estrutura societária, operacional e financeira, para torná-las mais organizadas e eficientes. Em grupos de hemoterapia, essa reestruturação é crítica devido à conformidade com rígidos regulamentos de saúde, complexidade do ciclo de receita, essencialidade do serviço prestado e grande número de CNPJ. Material e métodos: Em 2022, para incorporar 13 empresas (94 CNPJ, sendo13 matrizes e 81 filiais) em uma única empresa, garantindo a continuidade e a regularidade da operação, desenhou-se um projeto com ações definidas e faseadas. Foram realizadas reuniões com 22 áreas estratégicas do grupo e alguns players do mercado para identificar desafios e lições aprendidas. A partir deste mapeamento, definiu-se as fases e as ações que compuseram o projeto. Apresentou-se o projeto para que os stakeholders tomassem conhecimento de suas ações. Semanalmente, as ações foram atualizadas em reunião com os gestores, para garantir que todos tivessem conhecimento das ações concluídas, desafios e recebessem o start para as próximas ações. Resultados: Em 2024, com o processo de incorporação em andamento, já é possível observar resultados consistentes, como a eliminação de sociedades, redução dos gastos administrativos de backoffice, e melhorias na eficiência tributária por meio da otimização dos resultados fiscais das empresas. Também foram revisados os processos de compras e centralizados os estoques, o que simplificou a logística de materiais e contratos. Além disso, os sistemas operacionais e administrativos financeiros foram ajustados, mantendo a conformidade com as normas regulatórias e reduzindo o risco de penalidades. Discussão: A reestruturação foi desafiadora devido à complexidade do setor de hemoterapia, especialmente com a necessidade de manter as atividades assistenciais ininterruptas. Entre os principais obstáculos estavam a resistência de alguns colaboradores, que exigiu acompanhamento constante e comunicação eficaz; a necessidade de garantir a conformidade com as normas vigentes, o que demandou uma comunicação ativa com os órgãos reguladores; e a gestão de um grande volume de contratos e stakeholders envolvidos na reestruturação societária. A estratégia de gestão adotada incluiu a formação de comissões e grupos de trabalho especializados para focar em temas críticos, promovendo a especialização e o foco. Também foi implementado um fluxo de comunicação transparente e contínuo para manter todos informados sobre o progresso e as atualizações. Além disso, utilizamos metodologias de gestão de mudança para reduzir a resistência e aumentar a aceitação das novas práticas e processos. Conclusão: A reestruturação trouxe benefícios operacionais e financeiros, melhorou a satisfação dos colaboradores e deixou os processos mais eficientes. No entanto, o maior ganho foi o fortalecimento do trabalho em equipe, com as áreas colaborando para alcançar o mesmo objetivo.

Anemia falciforme (AF) é uma doença causada por mutação em homozigose no gene da β-globina, levando à formação de uma hemoglobina anormal (HbS), que leva à falcização das hemácias em condição de desoxigenação, reduzindo sua meia-vida. É caracterizada por anemia hemolítica crônica e recorrentes crises de vaso-oclusão. Além disso, ocorrem alterações na diferenciação terminal dos eritrócitos - uma potencial causa de piora da anemia. A apoptose das células que não se desenvolvem ocorre nas Ilhas Eritroblásticas (IEs), fazendo com que os macrófagos centrais desses nichos aumentem sua capacidade de fagocitose para retirada dessas células, podendo alterar o metabolismo do ferro nos macrófagos, evitando assim o estresse oxidativo. Anteriormente observamos que monócitos (MC) circulantes de pacientes com AF expressam moléculas relacionadas aos macrófagos de IEs (CD206, CD169, CD163 e VCAM-1) e têm participação na fagocitose de hemácias. O objetivo do trabalho foi investigar se essa atividade fagocítica está relacionada aos MCs ou às hemácias dos pacientes AF e qual a consequência para o metabolismo do ferro. Para isso, MCs foram isolados de sangue periférico e incubados por 2 horas com hemácias previamente marcadas com um corante de membrana para realização da fagocitose. As hemácias não fagocitadas foram lisadas e as marcações com os anticorpos anti-ferroportina (FPN) e anti-heme-oxigenase-1 intracelular (HO-1) foram feitas. A avaliação das expressões foi feita por citometria de fluxo e as análises estatísticas, através do teste t-Student pareado (p < 0,05). Quando expostos à hemácias AF, os MCs de ambos os grupos fagocitam mais do que na presença de hemácias CTRL (MCCTRL 22.9 ± 8 vs 9.4 ± 1.1, **p = 0,0099; MCAF 33.6 ± 11.4 vs 16.4 ± 11, **p = 0,0054; respectivamente). Por outro lado, não foi observada diferença estatística entre as fagocitoses encontradas nos MC CTRL e MC AF na presença de hemácias de pacientes (p = 0.0699). Quanto ao metabolismo do ferro, em todos os casos houve aumento de expressão de HO-1 e de FPN após a fagocitose (HO-1: MCCTRL 68.4 ± 3.5 vs 88.2 ± 7.6, ***p = 0.0003; MCAF 65.9 ± 16.8 vs 91.9 ± ,4 **p = 0.0098; FPN: MCCTRL 68.9 ± 5 vs 77.5 ± 5.2, **p = 0.0017; MCAF 66.5 ± 15.7 vs 81.8 ± 13.7, ***p = 0.0003; antes e depois da fagocitose, respectivamente), indicando maior capacidade de quebra do heme liberado pelas hemácias e de exportação do ferro ali presente. Os resultados sugerem que hemácias de pacientes com AF são responsáveis por induzir maior fagocitose e que essa não é uma função intrínseca dos MCs de pacientes com AF, apesar de participarem desse processo na circulação e apresentarem um fenótipo similar ao dos macrofágos das IEs. O aumento de expressão de moléculas do metabolismo de ferro foi relacionado apenas com a fagocitose e não a um grupo específico de indivíduos. Em conclusão, os MCs de pacientes com AF podem assumir uma função que não é completamente inata à eles quando expostos à hemácias falcizadas, contribuindo para a sua retirada da circulação e os aumentos de expressão de moléculas do metabolismo de ferro após a fagocitose, sugerindo influência importante dos MCs na disponibilidade do metal para suprir a demanda na produção de células eritróides e mostrando importante contribuição dessas células nos mecanismos da doença.

Anemia Falciforme é uma hemoglobinopatia genética e hereditária caracterizada por uma mutação que ocorre na cadeia beta da globina, a qual ocasiona a substituição de um ácido glutâmico por uma valina, formando a hemoglobina S. Essa é irreversivelmente polimerizada durante o processo de desoxigenação, causando a falcização das hemácias. Os glóbulos vermelhos falcizados possuem função anormal e iniciam uma série de manifestações clínicas agudas e crônicas em pacientes homozigotos (HbSS), devido à intensa hemólise, vaso-oclusão e inflamação crônica induzida por liberação de DAMPs. Estudos recentes mostram que pacientes falciformes possuem uma importante assinatura de genes induzidos por IFN-I em células mononucleares de sangue periférico, porém essas células não são as responsáveis pela produção da citocina. O objetivo do presente trabalho foi investigar se as células dendríticas plasmocitóides (pDCs) podem ser fontes de produção de IFN-I na patologia, já que elas são produtoras profissionais dessa citocina. Para isso coletamos sangue de 41 pacientes falciformes atendidos no ambulatório de Hematologia do Hemocentro-UNICAMP e de 35 doadores de sangue saudáveis para quantificar citocinas no soro por citometria de fluxo. Além disso, analisamos as células de camundongos transgênicos, os quais expressam HbS humana (Townes), e comparamos com as dos camundongos WT, os quais expressam a hemoglobina normal (HbA) também humana. Nossos dados confirmam a produção sistêmica de IFN-I na nossa coorte de pacientes falciformes, a qual foi significativamente maior que a dos indivíduos controles (***p = 0,0002). Além disso, nós observamos uma correlação positiva forte entre as concentrações de IFN- e as de citocinas pro- e anti-inflamatórias, como IL-18, IL-23, IL12p70, IL-6, IL-10, TNF-, IL-33 e IL-1β em pacientes falciformes (*** p = 0,0001 e *** p = 0,0002; 1< R xy

Sickle cell disease (SCD) is caused by the production of abnormal hemoglobin S, whose polymerization (induced by deoxygenation) results in sickling of erythrocytes and numerous pathophysiological consequences, including painful vaso-occlusive episodes. At present, there are few non-invasive methods to detect the occurrence of vaso-occlusion (VO) in the microcirculation of pre-clinical experimental models. One alternative may be the use of laser speckle contrast imaging (LSCI) to detect changes in the microcirculation pattern of the skin. For this method, an infrared laser is positioned over a region of skin and the backscattered light can be quantified to determine the blood perfusion. Therefore, the first aim of this study was to standardize a novel non-invasive technique and the best region to quantify and compare skin perfusion in mice with SCD. Secondly, we aimed to look at the effect of administering a known vaso-occlusive stimulus (tumor necrosis factor-α; TNF-α) on skin perfusion in the Townes mice. For this, male Townes mice, aged 20 weeks and weighing ±25 g were used for determining total and regional skin microcirculation using the PeriCam PSI HR system. Mice were randomly distributed into 2 groups, according to stimuli: Saline (200 μL, i.p., n = 5) or TNF-α (0.5 μg in 200 μL, i.p., n = 5). At 3 hours post saline or TNF-α administration, the animals were anesthetized, the trichotomy of the abdominal and pelvic region was performed and animals were submitted to LSCI of the abdomen/pelvis (arbitrary units). Five different areas of skin were analyzed to standardize the best region to detect the occurrence of VO: upper abdomen (Region 1); lower abdomen (Region 2); central region of pelvis (Region 3); pelvis/hind limb (Region 4); abdomen + pelvis (Region 5). The data from the respective regions were submitted to unpaired t test (GraphPad Prism 8 software). All animal procedures were carried out with approval of the local Commission for Ethics in Animal Experimentation (University of Campinas; protocols 5790-1/6078-1). Different areas of the ventral region of mice were chosen for the analysis due to variations in vascularity and skin thickness when compared to the dorsum. Analyses of the entire images (total shaved area) of the mice demonstrated a significant reduction in the perfusion of the skin microvasculature after TNF-α (88 ± 5 units) administration, when compared with saline-treated mice (110 ±15 units) (p < 0.035). The comparison of each region in the Saline- or TNF-α-treated mice suggested that Region 5 (abdomen and pelvis) was the only region that demonstrated decreased blood perfusion (Saline: 128 ±8 units, TNF-α: 104 ± 5 units, p < 0.0335); the other regions presented reduced blood perfusion, but there was no statistical significance. Results suggest that the total area of the abdomen and pelvis is the best region to detect the variation in blood perfusion in the skin microvasculature using the LSCI technique in the Townes SCD mice model. Furthermore, the administration of a potent inflammatory molecule, known to induce vaso-occlusive-like processes in SCD mice, significantly decreased skin perfusion, confirming this method as suitable for analyzing and visualizing microcirculatory skin vaso-occlusion.

Several diseases and pathological events incur intravascular hemolysis (IVH), a pathophysiological mechanism characterized by the destruction of red blood cells and the release of hemoglobin (Hb) and heme into the circulation. Hemolytic diseases, such as sickle cell disease (SCD), result in chronic inflammation and vascular damage due to the accumulation of plasma Hb and heme, which overload the homeostatic defense system. Hemolytic disorders are often associated with dysregulated angiogenic processes, contributing to complications that include proliferative retinopathy, pulmonary hypertension, leg ulcers and neovascularization of ischemic tissues. However, the role of hemolytic events in generating angiogenic factors and mechanisms is unclear. Therefore, the aim of this study was to investigate the effects of hemolysis on neovascularization and angiogenic parameters in an in vivo experimental model of IVH. C57BL/6J mice were subjected to chronic IVH, induced by the administration of low doses of phenylhydrazine (LDPHZ; 10 mg/kg.day i.p twice a week) for 4 weeks, while control mice (CON) received saline at the same frequency and during the same experimental period. Blood samples were collected 48 hours and plasma separated after the last induction. Matrigel® plugs pre-inoculated with 50 μL plasma from mice subjected to hemolysis, or not, were injected subcutaneously in mice for evaluation of neovascularization. Chronic IVH significantly increased plasma vascular endothelial growth factor (VEGF) levels (p = 0.04; n = 5) and liver VEGF expression (p = 0.02; n = 4) compared to saline mice. No significant differences were found in other angiogenic factors evaluated. Furthermore, factors present in the plasma of mice subjected to chronic IVH stimulated neovascularization and accelerated the formation of new vessels, as demonstrated by a significant increase in Hb levels quantified in the plug (p = 0.04; n = 5), compared to control plugs. Concurrently with hemolysis induction, an experimental group received treatment with hydroxyurea (LDPHZ+HU; 50 mg/kg.day i.p. five times a week) during the 4 weeks. LDPHZ+HU mice presented a trend towards increased VEGF protein expression in the liver (p = 0.06; n = 4) and the plasma factors of these HU treated mice reduced (although not significantly) Matrigel-plug neovascularization, when compared to neovascularization induced by LDPHZ plasma (p = 0.06; n = 5). An in vivo wound healing assay was also performed on the dorsal skin of mice subjected to IVH and treated or not with HU (n = 2). Preliminary results showed that wound healing was slower in the LDPHZ group when compared to the CON group, while treatment with HU improved the wound-healing process. Therefore, this study provides important perspectives for understanding the angiogenic mechanisms associated with IVH and may contribute to the development of therapies aimed at modulating neovascularization and minimizing complications associated with dysregulated angiogenic processes in patients with clinical complications of hemolytic diseases. Funding: FAPESP.

A hipercoagulabilidade é uma característica importante da doença falciforme (DF), e sua fisiopatologia está relacionada à ativação concomitante da hemostasia e da imunidade inata, em um processo conhecido como imunotrombose. Recentemente, estudos destacam a via podoplanina/CLEC-2 como importante no processo de ativação plaquetária e trombose. A podoplanina (PDPN) é uma proteína que já foi descrita em monócitos, e tem como único ligante conhecido a CLEC-2, expressa principalmente em plaquetas. Apesar do papel da via PDPN/CLEC-2 não seja totalmente esclarecida, evidências sugerem que ela pode se encaixar como uma nova via dentro do conceito de imunotrombose. O objetivo do estudo foi avaliar a expressão de PDPN e CLEC-2 em pacientes com DF e explorar sua relação com a gravidade da doença. Foram incluídos 31 pacientes com DF (genótipo SS = 23; genótipo SC = 8), além de 10 controles saudáveis, com aprovação ética (CAAE: 53121421.0.0000.5404). A avaliação da expressão de PDPN e CLEC-2 foram feitas por citometria de fluxo do sangue periférico de pacientes DF na fase estável da doença, além dos indivíduos saudáveis. Foram utilizados anticorpos anti-CD45, Anti-CD41, Anti-P-Selectina, Anti-PDPN e Anti-CLEC-2. O FSC (tamanho) e SSC (granulosidade) foi utilizado para separar as populações celulares. Para tal, foram analisados “gates” de células monocitárias e granulocíticas, e os resultados foram descritos como porcentagem. Os dados clínicos e laboratoriais foram obtidos dos prontuários eletrônicos. A expressão de PDPN em monócitos mostrou tendência a aumento nos pacientes DF-SS quando equiparados aos indivíduos saudáveis (teste Kruskal-Wallis [X2 (2) = 3,69; p = 0,156]; p = 0,06, Bonferroni, post-hoc). Nas células granulocíticas não houve diferença na expressão de PDPN entre os grupos, teste Kruskal-Wallis [x2 (2) = 1,06; p = 0,58]. Já a expressão de CLEC-2 em monócitos foi diferente entre os grupos, teste Kruskal-Wallis [x2 (2) = 19,82; p < 0,0001], com os pacientes DF-SS apresentando aumento da porcentagem de expressão de CLEC-2 quando equiparados aos pacientes DF-SC (p = 0,03) e indivíduos saudáveis (p < 0,0001). Não observamos diferença entre os pacientes DF-SC e saudáveis (p = 0,57). Também observamos diferenças entre os grupos na expressão de CLEC-2 em granulócitos, teste Kruskal-Wallis [x2 (2) = 10,11; p = 0,006], com maior expressão em pacientes DF-SS quando comparados aos pacientes DF-SC (p = 0,02) e indivíduos saudáveis (p = 0,006). Houve correlação de monócitos PDPN+ com marcadores laboratoriais, tais como: monócitos CLEC-2+ (R = 0,646), monócitos P-Selectina+ (R = 0,540), monócitos CD41+ (R = 0,525), granulócitos PDPN+ (R = 0,664) e reticulócitos (R = 0,434). Também houve correlação de monócitos CLEC-2+ com marcadores laboratoriais, como: monócitos P-Selectina+ (R = 0,823), monócitos CD41+ (R = 0,720), granulócitos CLEC-2+ (R = 0,884), hemoglobina (R = -0,533), plaquetas (R = 0,415) e reticulócitos (R = 0,563). Estes resultados sugerem que a via PDPN/CLEC-2 possa fazer parte da fisiopatologia da DF, de forma análoga a outras vias imunotrombóticas já descritas como a expressão de fator tecidual em vesículas extracelulares e a geração de NETs. Estudos para explorar o papel da mediação das interações plaqueta:leucócitos nestes resultados estão em andamento. Embora preliminares, nossos dados representam a primeira avaliação da participação desta via da DF, que pode abrir caminho para novas estratégias prognósticas e terapêuticas para esta condição.

Sickle cell anemia (SCA) is an inherited disorder caused by a mutation in the gene encoding β-globin. This mutation brings about alterations in the hemoglobin molecule, resulting in abnormal red blood cell (RBC) properties, shape, and subsequent destruction in the circulation, leading to anemia and various complications. Genetic mutations that increase the activation of Piezo1, a mechanosensitive protein involved in calcium influx and Gardos channel activation, have been shown to be responsible for hereditary xerocytosis, a disorder in which RBCs are severely dehydrated. We recently showed that Piezo1 plays a role in some of the RBC properties that contribute to SCA vaso-occlusion, indicating that Piezo1 may represent a potential therapeutic target molecule for this disease (Nader et al.; PMID: 37011913). The aim of the current study was to explore the role of Piezo1 in neutrophil adhesive properties in SCA. This investigation was conducted collaboratively between Lyon and UNICAMP (Fapesp grant 2020/06133-6). Neutrophils were isolated from the peripheral blood of healthy control individuals (HbAA; N = 7) and individuals with SCA (HbSS; N = 7), by density separation. Neutrophils were incubated with Yoda1 (0.1-10 μM), a Piezo1 channel agonist that does not require mechanical activation, or DMSO vehicle, for 30 min (37ºC), and then perfused over fibronectin-coated microchannels (400 μm-wide) using the Venaflux microfluidic platform, under 0.5 dyn/cm2 shear stress, 37°C, 3 min for monitoring adhesion. Flow cytometry analysis was performed with fluorescent antibodies to detect activated CD11a (LFA-1 integrin subunit) and CD11b (Mac-1 integrin subunit) epitopes. Yoda1-treated neutrophils (0.1-10 μM) were co-incubated with antibodies that bind to either the activated epitopes of CD11a or CD11b when in their activated states (MEM-83 antibody/anti-mouse IgG-FITC, and CBRM1/5-PE; Invitrogen), and cells were analyzed by flow cytometry. Interestingly, in the microfluidic adhesion assays we found that incubation of SCA neutrophils, but not neutrophils from control individuals, with 1 μM Yoda1 significantly increased the adhesion of the cells to fibronectin ligand (p = 0.001). Yoda1-induced adhesion of the SCA neutrophils was not associated with any increase in the activation of either the MAC-1 or LFA-1 integrin subunits, as demonstrated by flow cytometry assays (p > 0.05). These results suggest that Piezo1 may influence the adhesive properties of neutrophils in SCA, implying that changes in flow and shear stress could also modulate this mechanosensor on neutrophils. This study highlights the significance of Piezo1 in the pathophysiology of SCA and could offer new insights for therapeutic approaches for treating this condition.

Introdução: A regulação dos genes HBE, HBG, HBD e HBB da hemoglobina (Hb) é realizada pela região de controle do locus β (β-LCR), onde se ligam fatores de transcrição, como EKLF, ou repressores gênicos - quais BCL11A. Estudos demonstram que esta relação também possa ser influenciada por vias quais PTEN/AKT/mTORC1 e MAPK, bem como pela atuação epigenética da proteína de metilação UHRF1, reguladas por fosfoinositídeos das vias que envolvem as fosfatidilinositol-fosfato quinases. Estudos realizados pelo Laboratório de Hemoglobinopatias (FCM-Unicamp) apontam que o gene PIP4K2A, da fosfatidilinositol-fosfato-quinase-II-alfa (PIPKIIα), está altamente expresso em precursores eritróides CD34+ e traz evidências de seu envolvimento na regulação da expressão dos genes HBA, HBB e HBG em modelos eritroleucêmicos K562 e KU812. Objetivos: Investigar os efeitos do silenciamento gênico de PIP4K2A bem como da inibição da atividade de PIPKIIα na expressão e síntese de globinas. Materiais e métodos: Realizou-se ensaios de knockdown de PIP4K2A por CRISPR-Cas9 utilizando 2.5ug de vetores plasmidiais contendo as sequências de RNAs guias (gRNAs) complementares a PIP4K2A: 5-TTTTAACAAGTAAGTACAAG-3, 5-GATCCGAACATCGACGTCTA-3(Genscript, EUA),transfectadas à linhagem KU812 (ATCC CRL-2099) por nucleofecção (4D Nucleofector X Unit - Lonza -Basiléia, CH). Análise proteica por Western Blotting foi realizada após 72h de nucleofecção (n = 1) e a quantificação proteica relativa (em porcentagem-%) medida pelo programa ImageJ (National Institutes of Health, EUA). A viabilidade celular foi avaliada por azul de trypan 0,4% (Thermo Fisher Scientific, USA) (n = 3). Para os ensaios de inibição enzimática, as células KU812 foram tratadas com 50uM (12h) do inibidor de PIPKIIα AG-82 (Santa Cruz Biotechnology, EUA) (n = 3). Análises de expressão gênica foram realizadas pelo método de comparação relativa (ddCT) à expressão dos genes ACTB e GAPDH a partir de ensaios de qRT-PCR (StepOnePlus - Applied Biosystem, EUA). Cálculos de significância estatística (p < 0,05) foram atribuídos pelos testes t (distribuição normal) ou Wilcoxon (sem distribuição normal) no programa SPSS (International Business Machines Corporation, EUA). Resultados e discussão: Experimentos de CRISPR-Cas9 resultaram na redução significativa da viabilidade celular de KU812 (p = 0.001; 72h/nucleofecção, n = 3), corroborando com dados de literatura acerca do papel desta enzima na viabilidade celular neoplásica (THP-1, astrócitos, na leucemia mieloide crônica e leucemia linfocítica aguda). Obteve-se redução parcial (20%) de PIPKIIα em relação ao controle (células submetidas à corrente elétrica da nucleofecção) e expressivo aumento das concentrações de globinas (1033%), β (128%) e γ (102%) - n = 1, dados estes que deverão ser replicados. A inibição de PIPKIIα nas condições supracitadas resultou no aumento significativo dos transcritos HBB (p = 0.009) e HBG (p = 0.006) em relação ao controle (tratado com DMSO) (n = 3). Não foram observadas alterações significativas na expressão de HBA. Conclusão: Resultados preliminares de knockdown de PIP4K2A por CRISPR e inibição de PIPKIIα com o composto AG-82 são bastante concordantes, sugerindo que o silenciamento/inativação de PIPKIIα tenha papel preponderante na viabilidade celular tanto quanto no aumento de expressão/síntese dos genes de globina, particularmente no locus β. Apoio financeiro: Fapesp, CAPES, CNPq, Funcamp e Faepex.

As doenças hemolíticas, como a anemia falciforme (AF), constituem um grupo de condições caracterizadas pela destruição prematura das hemácias (hemólise), que pode ocorrer ainda no interior dos vasos sanguíneos (intravascular; HI) ou no espaço extravascular. A HI resulta na liberação de padrões moleculares associados a danos eritrocitários (eDAMPs), induzindo inflamação e resposta imune. A caspase-1 (Casp-1) é uma protease que possui um papel importante na inflamação, iniciando processo de piroptose e clivagem da (pro)interleucina (IL)1β para sua forma ativa, IL-1β, através da ativação de inflamassomas. Nosso objetivo foi elucidar os mecanismos envolvidos na inflamação induzida pela HI, a ativação da Casp-1 e seu papel nas alterações microvasculares. A HI aguda foi induzida pela administração (i.v.) de água estéril em camundongos C57BL/6 (HEM) e salina para os controles (CON). Camundongos HEM e CON receberam inibidor de Casp-1, YVAD (i.p.) 1h antes dos estímulos. A técnica de microscopia intravital (MIV) foi realizada no músculo cremaster para quantificar o rolamento e a adesão dos leucócitos (WBC) venulares (n = 3). A perfusão sanguínea dos animais foi avaliada por fluxometria laser Doppler (FLD) na microvasculatura da pele da pelve (n = 6-8). Citocinas e proteínas plasmáticas foram quantificadas por ELISA e testes colorimétricos (n = 3-8). Atividade de Casp-1 foi mesurada por sonda intracelular FAM-FLICA através de citometria de fluxo (n = 4-8). Identificamos que camundongos HEM apresentaram aumento de heme plasmático (p < 0,0001) e hemoglobina livre (p < 0,001), associado a uma diminuição significativa de haptoglobina plasmática (p < 0,05), em comparação com os camundongos CON, confirmando a HI. A proteína S100A8 é uma alarmina secretada por WBC ativados que induz a formação de inflamassomas em células imunes. De forma consistente, os camundongos HEM exibiram aumento na concentração plasmática de S100A8 e IL-1β (p < 0,001). Além disso, essas alterações foram seguidas por aumentos nos níveis plasmáticos de TNF-α e IL-6 (p < 0,001). Os números de monócitos Ly6ChiCD43+ e neutrófilos Ly6GhiCD11+ positivos para FLICA foram significativamente maiores em camundongos HEM, em comparação com CON (p < 0,05), sugerindo a ativação de Casp-1 nessas células. Para investigar o papel da ativação da Casp-1, induzida pela HI, na dinâmica microvascular, camundongos HEM e CON tradados com inibidor de Casp-1, YVAD, foram submetidos a MIV e FLD. A HI provocou o aumento do rolamento e adesão de WBC à parede vascular de camundongos com HEM em comparação aos animais CON (p < 0,0001), conforme demonstrado anteriormente. Além disso, os camundongos HEM exibiram redução na velocidade do fluxo sanguíneo (p < 0,01), comprometendo a perfusão microvascular (p < 0,01). Por fim, a inibição da Casp-1, antes da HI, reduziu o rolamento (p < 0,01) e a adesão (p < 0,05) de WBC às paredes dos vasos, revertendo a diminuição da perfusão sanguínea microvascular induzida pela HI (p < 0,01). Esses resultados demonstram que a HI resulta em alterações microvasculares associadas à liberação de moléculas pró-inflamatórias e à ativação de Casp-1, contribuindo para processos semelhantes à oclusão vascular. Assim, este estudo sugere que a ativação da Casp-1 e suas vias associadas podem ser um potencial alvo terapêutico para mitigar os efeitos da HI, que ocorre em anemias hemolíticas graves, como a AF. Financiamento: CAPES, FAPESP.

As talassemias alfa (α) são frequentemente causadas por deleções nos genes da globina α (HBA1 e HBA2), e podem envolver um ou ambos os genes, o que resulta em redução parcial (alelo α+ ou -α) ou supressão total (alelo α0 ou –) da produção das globinas α. Raramente, as talassemias α podem resultar de mutações de ponto ou pequenas deleções/inserções. A heterozigose, a homozigose ou a interação destes diferentes alelos resultam em um amplo espectro de manifestações clínicas e laboratoriais. A Doença da Hemoglobina (Hb) H ocorre quando há uma deficiência acentuada na produção de globinas α, visto que apenas um gene α encontra-se funcional (interação α+/α0). Desta forma, nos fetos e recém-nascidos o excesso de cadeias γ forma a Hb Barts (γ4), e nos adultos o excesso de cadeias β forma a HbH (β4), um tetrâmero instável que precipita nas hemácias com o seu envelhecimento, ocasionando anemia hemolítica moderada a grave, com icterícia e hepatoesplenomegalia. Desde sua implantação em 1980, o Laboratório de Hemoglobinopatias do HC/UNICAMP, referência no diagnóstico molecular da talassemia α, analisou cerca de 150.000 amostras de sangue, a maior parte de indivíduos provenientes da região sudeste do Brasil, mas também da região nordeste, centro-oeste e sul, bem como de parte da América Latina. Apresentamos aqui um recorte dos casos de Doença da HbH caracterizados desde 2002 até o presente momento. Na triagem protéica foram realizadas eletroforese (pHs alcalino e neutro), cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e identificação da HbH em hemácias do sangue periférico (esfregaço sanguíneo corado com azul de cresil brilhante). Na caracterização molecular, as deleções mais comuns [-α3.7, -α4.2, -(α)20.5, –MED, –SEA, –FIL, –THAI] foram rastreadas por multiplex -gap -PCR e outras deleções foram investigadas por multiplex ligation -dependent probe amplification (MLPA). As mutações não delecionais mais comuns (α1-Nco I, α2-Nco I, α2-Hph I e α2TSAUDI) foram investigadas por análise de restrição, PCR alelo-específico e/ou sequenciamento direto. Trinta e dois (32) casos de Doença da HbH foram identificados em 27 famílias diferentes. Os alelos α+ resultaram de deleções em 30 casos: deleção -α3.7, a mais frequente na população mundial, encontrada em 29 casos e -α4.2 em um caso; outras duas mutações originaram alelos α+: em um caso encontramos uma mutação no sítio doador de splicing do primeiro íntron do gene HBA2 {α2-IVSI-1 [α2 nt 133 G>A (HBA2:c.95+1G>A)]} e um caso envolvia Hb variante instável {Hb Icaria [α2 142 Stop>Lys (HBA2:c.427T>A)]}. Os alelos α0 resultaram de diferentes deleções, tais como: deleções iniciando desde o telômero com variações estendendo-se até o gene SOX8 (225 a 1050 kb) foram identificadas em 8 casos, deleção –SEA em 7 casos, deleções iniciando na região do elemento regulatório do cluster α (HS40) com variações estendendo-se até o gene AXIN1 (15 a 175 kb) em 6 casos, deleção –MED em 6 casos, deleção -(α)20.5 em 2 casos e 3 casos apresentaram deleção apenas da região do HS40. Esses resultados evidenciam a expressiva variabilidade de mutações talassêmicas no cluster α presentes na nossa população, bem como reforça a importância do diagnóstico preciso, evitando, assim, procedimentos e esquemas terapêuticos equivocados, especialmente, quando os indivíduos apresentam microcitose e hipocromia.

Introduction: COVID-19 is a severe acute respiratory syndrome caused by SARS-CoV-2 infection marked by intercontinental variations in its clinical severity and outcomes. However, it is poorly understood if certain host genetic variations are important in determining the severity of the cytokine storm and thus the outcome of COVID-19. Objective: To determine if TMPRSS2 SNPs (rs2070788 and rs12329760) and CCR5Δ32 genotypes are associated with plasma hypercytokinemia in unvaccinated COVID-19 patients. Methods: 154 PCR-confirmed COVID-19 unvaccinated patients at the Hospital de Clínicas da Unicamp, Campinas-SP/Brazil, were enrolled for this study and genomic DNA extracted from peripheral blood samples. Two TMPRSS2 SNPs [rs2070788 (G>A) and rs12329760 (C>T)] and CCR5Δ32 genotypes were assayed using Taqman genotyping kit and fragment analysis by capillary electrophoresis, respectively, and the 13 plasma cytokines levels were quantified by LUMINEX immunoassay according to manufacturers’ protocols. Results: 154 COVID-19 patients were grouped as severe group (134 patients with moderate, severe, or critical COVID-19) and mild group (20 patients with mild or asymptomatic COVID-19) with median ages 62 (20-97) vs 49 (24-84) years respectively p = 0.007. 115 (74.7%) patients were homozygous CC (wild) and 39 were variants of the TMPRSS2 rs12329760 [32 heterozygous (CT) and 7 homozygous (TT)]. The wild group (CC) had a lower plasma levels of IL-37 (p = 0.0015), TNF-α (p = 0.0255), IL-17A (p = 0.0044), IL-1β (p < 0.0001) and higher TGF-β (p < 0.0001) than those with the variant (CT and TT) group. 32 (20.8%) patients were homozygous GG (wild) and 122 were variants of the TMPRSS2 rs2070788 [72 heterozygous (GA) and 50 homozygous (AA)]. The patients with the GG genotype had a higher CCL2/MCP-1 than those with the variant genotypes (GA and AA), p = 0.0218. Only 9 (5.8%) patients had the CCR5Δ32 mutation [1 homozygous and 8 heterozygous] and 145 (94.2%) were without CCR5Δ32 mutation. The COVID-19 patients with CCR5Δ32 mutation had a significantly lower median plasma TNF-α (p = 0.0024) and IL-8/CXCL8 (p = 0.0106) than the patients without the mutation. Conclusion: This study shows that presence of T allele of the rs12329760 was associated to hypercytokinemia in COVID-19 while the wild genotype GG of the rs2070788 was associated to higher levels of CCL2/MCP-1, both SNPs are in the TMPRSS2 gene. This may have led to worsening cytokine storm and outcome of COVID-19. Contrarily, the presence of the CCR5Δ32 mutation appears to be protective against the plasma hypercytokinemia in COVID-19. These findings further emphasize the role of host genetic variations play in the pathogenesis of SARS-CoV-2 infection. Funding: CNPq (#190374/2017-9), CAPES, FAPESP and FAEPEX (#338619).

Haptoglobina, hemopexina e heme-oxigenase (HO) representam mecanismos de defesa do nosso corpo frente à hemólise e níveis criticamente baixos dessas proteínas dificultam a eliminação da hemoglobina (Hb) e heme livres. Excesso de heme livre demonstrou contribuir e exacerbar a patogênese de uma variedade de doenças inflamatórias, como sepse, doença falciforme, síndrome respiratória aguda grave e falência de múltiplos órgãos. No promotor do gene da HO-1 (HMOX-1) existem variantes com papéis funcionais na regulação dos níveis de HO. Entre eles, estudos indicam que na mutação -413A>T (rs2071746) o alelo A tem atividade significativamente maior do que o alelo T. O objetivo do presente trabalho foi investigar esse polimorfismo e avaliar se há relação com marcadores de hemólise, gravidade da doença e mortalidade em pacientes com COVID-19. Neste estudo retrospectivo, de março/2020 a março/2021, foram incluídas amostras de DNA de 320 pacientes adultos, não vacinados, internados no Hospital de Clínicas da UNICAMP e com diagnóstico molecular de COVID-19. O polimorfismo -413A>T (rs2071746) foi determinado com a utilização do TaqMan® SNP Genotyping Assay (Thermo Fisher Scientific, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante e os dados hematológicos e a enzima lactato desidrogenase (LDH) foram determinados por métodos automatizados, ambos ao diagnóstico de COVID-19. A classificação de gravidade da doença seguiu as definições da OMS (não grave/grave/crítico). As análises estatísticas foram realizadas usando Graphpad Prism (v.9), considerando o valor significativo se p < 0,05. Dos pacientes desse estudo, 253 (79,1%) receberam alta hospitalar e 67 (20,9%) faleceram durante a internação, com média de idade 55,6 (20-90) e 65,4 (28-97) respectivamente (p < 00,1). Quanto ao polimorfismo do gene HMOX-1, a distribuição dos genótipos AA, AT e TT nos pacientes que receberam alta foi 32,0% (81), 46,7% (118) e 21,3% (54), enquanto no grupo óbito foi de 32,8% (22), 49,3% (33) e 17,9% (12), respectivamente, sem diferença significativa (p = 0,813). Resultados parciais referentes à gravidade mostraram que 119 (47,6%) foram classificados como não graves, 123 (49,2%) como graves e 8 (3,2%) como críticos, com médias de idade de 57,2 (20-90), 58,7 (28-97) e 58,0 (38-72) respectivamente (p = 0,946) e com a seguinte distribuição genotípica: 38,65% (46), 38,65% (46) e 22,7% (27) nos pacientes não graves, 26,8% (33), 55,3% (68) e 17,9% (22) nos graves e 37,5% (3), 25,0% (2) e 37,5% (3) nos críticos para AA, AT e TT, respectivamente (p = 0,065). Por fim, diferente do esperado, não houve diferença entre os genótipos AA, AT, TT e a média dos marcadores de hemólise analisados, Hb (p = 0,216) e LDH (p = 0,756). Os resultados encontrados na nossa população de estudo não suportam a hipótese de que pacientes com genótipo AA apresentariam certa proteção contra os efeitos da hemólise, em função da Hb e do LDH e, tampouco, da gravidade e mortalidade da doença. A COVID-19 é uma doença sistêmica e a análise de forma isolada de um único fator genético pode não influenciar nas consequências clínicas apresentadas por seus portadores. Assim, estudos de outros polimorfismos genéticos do gene HMOX-1 e outros genes envolvidos na hemólise serão realizados na nossa população a fim de ampliar o conhecimento da fisiopatologia dessa doença.

A HbS [HBB:c.20A>T (p.E7V)] é a variante de hemoglobina (Hb) mais prevalente e amplamente estudada devido às complicações clínicas quando em homozigose ou em associação a outra Hbpatia. Descrevemos aqui a associação entre HbS e HbTsukumi [HBB:c.352C>T (p.H118Y)], variante silenciosa, encontrada em dois bebês (P1 e P2) de famílias distintas. Triagem neonatal por focalização isoelétrica (IEF - RESOLVE® Neonatal Hemoglobin Test Kit pH 6-8, Perkin Elmer) de dois bebês, brancos, sexo feminino, com cerca de 50 dias de vida, provenientes do Departamento Regional de Saúde VII do estado de SP, presumidamente não aparentados, apresentou o seguinte perfil: HbS, HbF e HbF-acetilada em concentração maior que a esperada. Cromatografia líquida de alta performance (HPLC - nbs Newborn Screening System, Bio-Rad) revelou padrão diferente de IEF: HbS, HbF e HbA. Os casos foram encaminhados ao Laboratório de Hemoglobinopatias (FCM/Unicamp) para elucidação. Índices hematimétricos de P1 e P2, ambas as mães (MP1 e MP2) e do pai de P2 (PP2) apresentaram padrão normal à exceção de P2 e MP2, com discretas microcitose e hipocromia. Eletroforese em pH alcalino e HPLC de troca catiônica (Variant II, Bio-Rad), revelaram o perfil HbA2, HbS, HbF e HbX (=HbA, com migração/eluição da HbTsukumi concomitante à HbA, como variante silenciosa). Os percentuais de HbS foram 26,4% (P1) e 18,6% (P2) e da variante rara foram de 33,5% (P1) e 25,5% (P2). A presença de HbS foi detectada em MP1 e MP2 e confirmada por teste de solubilidade. PP2 apresentou o perfil eletroforético/cromatográfico: HbA2, HbA + HbX (co-eluição em tempo de retenção inferior à HbA). HPLC de fase reversa (RP-HPLC - Alliance, Waters) revelou a presença das globinas βS e βX (em co-eluição com globina γG) e cadeia γA anômala (P1, P2 e PP2). Sequenciamento de HBB (globina β) confirmou a presença da mutação GAG>GTG no 6ºcódon do referido gene, correspondente à substituição βGlu6Val, da HbS (P1, P2), bem como da mutação CAC>TAC no 117ºcódon, relativa à βHis117Tyr, da HbTsukumi (P1, P2 e PP2), ambas em heterozigose. Sequenciamento de HBG1 (globina γA) apontou a mutação ATA>ACA no 75ºcódon do referido gene, correspondente à substituição γAIle75Tyr, da HbF-Sardinia [HBG1:c.227T>C (p.I76T)] também em heterozigose (P1, P2 e PP2), sugerindo que as mutações relativas à HbTsukumi e F-Sardinia estejam no mesmo alelo. Triagem de talassemia α mais comuns por multiplex Gap-PCR, análise por enzimas de restrição e PCR alelo-específico, detectaram a deleção _α3.7 em heterozigose em P2 e MP2. As crianças foram encaminhadas para o serviço de referência para acompanhamento clínico e, até o momento, seguem sem sintomatologia relevante. De nosso conhecimento, trata-se da primeira identificação da HbTsukumi no Brasil e o primeiro relato desta em associação com HbS. Importante ressaltar que, apesar de não apresentarem alterações clínicas e hematológicas relevantes até o momento, ambas as crianças ainda apresentam elevados níveis de HbF. Considerando que estes possivelmente sejam os primeiros casos da concomitância das variantes, o acompanhamento clínico com o decorrer da idade e completo switch HBG-HBB, será fundamental para determinar aspectos clínicos e hematológicos desta associação, uma vez que a HbTsukumi pode apresentar certa instabilidade em alguns casos. Suporte: FAPESP, CNPq, CAPES, FAEPEX, Educorp-Unicamp.

Objetivos: A Anemia Falciforme (AF) é uma hemoglobinopatia que causa deformação das hemácias devido à polimerização da hemoglobina S, tornando-as mais suscetíveis a rupturas. Moléculas liberadas na hemólise, como heme e hemoglobina, podem ativar células dendríticas (DCs), desencadeando resposta inflamatória e estresse oxidativo. Neste estudo, caracterizamos as subpopulações de DCs durante a doença falciforme quanto a sua ativação, distribuição e desenvolvimento durante a AF. Materiais e métodos: Foram utilizados camundongos transgênicos fêmeas homozigotos Townes (SS) (modelo de AF) e seus controles, camundongos selvagens Townes (AA), para a fenotipagem de DCs e seus progenitores nos linfonodos periféricos, baço e medula óssea por citometria de fluxo. A diferenciação in vitro de DCs foi realizada incubando células da medula óssea com flt3l por 9 dias. Resultados: Os animais com AF (SS) mostraram uma diminuição na porcentagem de DCs totais no baço e na medula óssea e um aumento na porcentagem dessas células nos linfonodos em comparação com o grupo controle (AA), enquanto o número absoluto de DCs aumentou nos três órgãos de camundongos SS. Em relação à proporção de subpopulações de DCs, houve um aumento significativo na porcentagem de células dendríticas convencionais do tipo 1 (cDC1s) em todos os órgãos dos animais com AF, enquanto a porcentagem relativa de células dendríticas plasmocitoides (pDCs) foi significativamente menor na medula óssea e maior nos linfonodos. Além disso, as pDCs dos camundongos SS mostraram um fenótipo mais maduro nos três órgãos analisados, como observado por um aumento significativo na expressão de Sca-1. Por outro lado, tanto cDC1 quanto cDC2 dos camundongos SS mostraram um perfil mais imaturo, como observado pela menor expressão de MHC-II e CD86. A análise dos progenitores de monócitos e DCs (MDP), os quais são Lin-CD135+CD117+CD115+, e os progenitores de DCs (CDP), que são Lin-CD135+CD117-CD115+ na medula óssea, mostraram que há um acúmulo na proporção de MDPs e uma diminuição de CDPs na medula óssea de camundongos SS. A diferenciação in vitro de DCs revelou que células da medula óssea de animais SS se diferenciaram nos três subtipos de DCs de maneira semelhante aos controles em condições controladas. Discussão: A menor proporção de DCs na medula e o aumento no baço e nos linfonodos sugere uma maior migração dessas células após uma ativação. Aliado a isso, o perfil mais imaturo das células pode refletir uma alteração na ativação de células T, afetando assim o sistema imune adaptativo. Ainda, a diferença observada na porcentagem das diferentes subpopulações de DCs e em seus progenitores indica uma mudança no desenvolvimento ou morte das subpopulações de DCs durante a AF que pode ocorrer desde o estágio de desenvolvimento. Por fim, uma vez que a diferenciação in vitro não reproduziu as proporções das subpopulações de DCs vista em ex vivo, podemos concluir que a alteração no desenvolvimento de DCs em camundongos SS se deve ao ambiente inflamatório, em vez de um defeito intrínseco de DCs ou dos progenitores. Conclusão: Esses dados podem nos ajudar a entender o comportamento das células dendríticas durante a AF, tanto em termos da proporção/distribuição de seus subtipos quanto de sua influência no quadro inflamatório da doença.