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Agradecimentos: This work was supported by the São Paulo state Research Foundation (FAPESP, Brazil; grant no. 2015/10356-2) and the Brazilian National Council for Research and Development (CNPq; grants no. 304668/2014-1 and 421299/2018-5). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish or preparation of the manuscript. The authors thank Mr. E.H.M. dos Anjos for assistance with formatting of the figures Abstract: Valproic acid/sodium valproate (VPA), a drug primarily used for treatment of seizure disorders, is recognized as an efficient epigenetic agent, inducing inhibition of histone deacetylases, promoting changes in the methylation status of DNA and histones, and affecting chromatin structure. In addition to these epigenetic effects, molecular affinity of VPA for histone H1 has been proposed based on thermal denaturation, fluorescence spectroscopy and circular dichroism assays. VPA interactions with DNA and histones using Fourier transform infrared (FTIR) microspectroscopy and high-performance polarization microscopy that are not related to the effects promoted on epigenetic markers have been recently explored. Data in this article provide supplementary information for a better understanding of the resulting FTIR spectra for mixtures of VPA and histones H1 and H3 and of the potential effect of VPA directly on histones that has been reported in the literature FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Aberto

Agradecimentos: The support of Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Brazil; grant no. 2007/58251-8) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brazil: grant no. 304668/2014-1) is gratefully acknowledged. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript Abstract: Optical anisotropy properties and infrared spectra of collagen and DNA as individual entities have been widely described. However, they have not been studied in collagen-DNA complex biofilms. We investigated whether collagen type I and DNA birefringence evaluated using polarization microscopy, and the vibrational patterns of their chemical groups identified in Fourier transform-infrared (FT-IR) spectra are retained in collagen-DNA complexes. Collagen gel rods extruded into a DNA saline solution and films dried from drops using mixtures of a 10-µL (14 µg) collagen solution and a 50-µL (305 µg) DNA solution and of a 50-µL (70 µg) collagen solution and a 10-µL (61 µg) DNA solution were used. Changes in the collagen fibers' stereoarrangement occurred in the gel rods interacting with the DNA. Even when the DNA concentration (305 µg) was significantly higher than the collagen concentration (14 µg) and the DNA played the main role in establishing the overall oriented geometry in the collagen-DNA films (intertwisted fibrillary structure and negative birefringence), some collagen markers were present in the FT-IR spectra of the complex. When collagen and DNA concentrations were similar, DNA denaturation may occur. Present observations suggest formation of collagen-DNA complexes even if highly organized collagen macromolecules are offered to DNA CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Fechado

Orientadores: Maria Luiza Silveira Mello, Benedicto de Campos Vidal Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Em eucariotos, o estado da cromatina, o empacotamento de DNA com proteínas histonicas, contribui para o controle da expressão gênica. Assim como outras modificações pós-tradução de histonas (PTMs), a metilação de histonas em resíduos de lisina contribui para a regulação de diversos processos biológicos. Famílias de proteínas, como por exemplo, as lisinas metiltransferases (KMTs) e demetilases (KDMs), são responsáveis por controlar os níveis de metilação nos resíduos de lisina da histona. Portanto, um equilíbrio adequado de estabilidade e dinâmica em PTMs de histonas é necessário para a expressão gênica precisa. Apesar disso, aberrações nas regiões regulatórias controladas pela metilação da lisina podem estar associados com o silenciamento de vários genes, incluindo os supressores de tumores, e são frequentemente observados no câncer. Por outro lado, é conhecido que inibidores de histona desacetilase (HDACi) podem induzir mudanças globais na modificação das histonas, podendo então reverter esse processo. O valproato de sódio (VPA), um conhecido agente antiepiléptico, é também caracterizado como HDACi, induzindo hiperacetilação de histonas e desmetilação de DNA em vários tipos de células. Em alguns modelos, também há dados mostrando que o VPA pode afetar a metilação das histonas bem como as enzimas que adicionam e removem essas marcas e pode regular a expressão de proteínas envolvidas no controle do ciclo celular. Dessa forma, neste estudo foi investigado por meio de técnicas de imunofluorescência, Western Blot e RT-qPCR a capacidade do VPA em alterar os níveis de metilações das histonas H3 (H3K4me2/3, H3K9me/2 e H3K27me/3) e das enzimas KMT2D, EZH2 e KDM3A em células HeLa, tratadas com VPA cujas concentrações foram de 0,5 mM e 2 mM por 24 h. Além disso, a expressão do oncogene p16INK4a e do gene supressor de tumor p21WAF1/Cip1 também foram analisados na presença dessa droga. Um estudo também foi conduzido a fim de avaliar a interferência do VPA em histonas totais, através da análise microespectroscópica das histonas totais no infravermelho por FT-IR ("Fourier transform-infrared"), uma vez que há evidencias recentes da afinidade do VPA ligando-se à histonas H1 e H3. Com base no conjunto de dados, os resultados sugerem que o VPA promoveu hipermetilação em marcas associadas à transcrição ativa de genes, H3K4me2/3 e H3K9me, e conferiu um estado hipometilado para a marca associada ao silenciamento, H3K9me2. Apesar de observar o aumento nos níveis globais de H3K27me/3, nenhuma conexão causal para essas marcas com a expressão gênica pode ser concluída até o momento, uma vez que elas foram identificadas na literatura com consequências regulatórias distintas. O VPA alterou os níveis dessas marcas epigenéticas possivelmente por participação das metiltransferases KMT2D, EZH2 e demetilase KDM3A. Nessas condições o VPA também induziu a ativação da proteína supressora de tumor p21WAF1/Cip1 e reprimiu a ação de p16INK4a nessas células. Além disso, esses resultados indicaram que o VPA possa promover parada na fase G1 do ciclo celular por indução de p21WAF1/Cip1. Quanto a análise da possível interação do VPA com as histonas, não foi observado nenhuma modificação conformacional dessas proteínas ao longo do espectro. No entanto, notou-se um ligeiro aumento na absorbância na região de frequência dos grupos CH3 e CH2 nos espectros de FT-IR, que pode ser justificado pela intensificação das metilações em alguns dos resíduos de lisina na histona H3. Até o momento foi possível notar que o VPA altera o epigenoma na linhagem celular tumoral estudada, por meio das alterações das metilações nos resíduos de lisina 4, 9 e 27 da histona H3. Entretanto, o VPA promoveu aumento em marcas associadas à transcrição ativa de genes e diminuiu aquelas relacionadas ao silenciamento, sendo consistentes com uma possível intensificação da expressão gênica global induzida por esta droga. Portanto, o VPA pode oferecer uma estratégia potencial para reverter mudanças epigenéticas, principalmente associadas a doenças como o câncer. No entanto, quanto à expressão dos genes p16INK4a e p21WAF1/Cip1 eles podem ser regulados em células HeLa por HDACi que atuam sobre marcas epigenéticas ao nível de DNA e histonas Abstract: In eukaryotes, the state of chromatin, the DNA packaging with histone proteins, contributes to the control of gene expression. Like other post-translational histone modifications (PTMs), histone methylation at lysine residues contributes to the regulation of several biological processes. Protein families, such as lysine methyltransferases (KMTs) and demethylases (KDMs), are responsible for controlling methylation levels at histone lysine residues. Therefore, a proper balance of stability and dynamics in histone PTMs is necessary for accurate gene expression. Despite this, aberrations in regulatory regions controlled by lysine methylation may be associated with the silencing of several genes, including tumor suppressors, and are frequently observed in cancer. On the other hand, it is known that histone deacetylase inhibitor (HDACi) can induce global changes in histone modification, thus being able to reverse this process. Sodium valproate (VPA), a well-known antiepileptic agent, is also characterized as HDACi, inducing histone hyperacetylation and DNA demethylation in various cell types. In some models, there are also data showing that VPA can affect histone methylation as well as the enzymes that add and remove these tags, and can regulate the expression of proteins involved in cell cycle control. Thus, in this study, the ability of VPA to alter the methylation levels of histone H3 (H3K4me2/3, H3K9me/2 and H3K27me/3) and of the enzymes KMT2D, EZH2 and KDM3A was investigated using immunofluorescence, Western Blot and RT-qPCR techniques in HeLa cells, treated with VPA whose concentrations were 0.5 mM and 2 mM for 24 h. In addition, the expression of p16INK4a oncogene and p21WAF1/Cip1 tumor suppressor gene were also analyzed in the presence of this drug. A study was also carried out in order to evaluate the interference of VPA in total histones, through the microspectroscopic analysis of total histones in the infrared by FT-IR ("Fourier transform-infrared"), since there is recent evidence of the affinity of VPA binding up to histones H1 and H3. Based on the dataset, the results suggest that VPA promoted hypermethylation in markers associated with active gene transcription, H3K4me2/3 and H3K9me, and conferred a hypomethylated state on the marker associated with silencing, H3K9me2. Despite observing the increase in global levels of H3K27me/3, no causal connection for these marks with gene expression can be concluded to date, as they have been identified in the literature with distinct regulatory consequences. VPA altered the levels of these epigenetic marks possibly through the participation of methyltransferases KMT2D, EZH2 and demethylase KDM3A. Under these conditions, VPA also induced the activation of the tumor suppressor protein p21WAF1/Cip1 and repressed the action of p16INK4a in these cells. Furthermore, these results indicated that VPA can promote arrest in the G1 phase of the cell cycle by inducing p21WAF1/Cip1. Regarding the analysis of the possible interaction of VPA with histones, no conformational modification of these proteins was observed along the spectrum. However, a slight increase in absorbance was observed in the frequency region of the CH3 and CH2 groups in the FT-IR spectra, which can be explained by the intensification of methylations in some of the lysine residues in histone H3. So far, it has been possible to notice that VPA alters the epigenome in the studied tumor cell line, through alterations in methylations in lysine residues 4, 9 and 27 of histone H3. However, VPA promoted an increase in markers associated with active transcription of genes and decreased those related to silencing, being consistent with a possible enhancement of global gene expression induced by this drug. Therefore, VPA may offer a potential strategy to reverse epigenetic changes, mainly associated with diseases such as cancer. However, regarding the expression of p16INK4a and p21WAF1/Cip1 genes, they can be regulated in HeLa cells by HDACi that act on epigenetic marks at the DNA and histone levels Doutorado Biologia Celular Doutora em Biologia Celular e Estrutural CAPES 0 FAPESP 2015/10356-2 CNPQ (421299/2018-5, 304797/2019-7

Orientador : Benedicto de Campos Vidal Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: No presente trabalho, foram realizados vários métodos topoquímicos e bioquímicos de análise, com o intuito de caracterizar as sementes quiescentes e folhas cotiledonares de Canavalia ensiformis e C. gladiata. A principal reserva dessas sementes é o amido, que representa mais de 50% do peso seco das sementes. Outra reserva expressiva é,o material protéico, que atinge 27-30% do peso seco em C. ensiformis e 37-44% em C. gladiata. As sementes possuem pouco lipídio e destas substâncias destaca-se um conteúdo elevado de ácido esteárico. Os perfis eletroforéticos das duas espécies revelam uma grande semelhança do material protéico, com predominância de canavalina e concanavalina A, presentes nas sub-frações de vicilinas. Os extratos protéicos totais e as vicilinas, apresentam poder hemaglutinante, enquanto que nas leguminas e albuminas isso não ocorre. Esse poder só se manifesta nos testes "in vitro", pois "in situ" a ConA está agregada a outras proteínas dos corpos protéicos e/ou apresenta-se dissociada. As paredes celulares dos cotilédones apresentam grandes plasmodesmos, que poderiam contribuir para o transporte das reservas de célula a célula no decorrer da germinação. As folhas cotiledonares de C. ensiformis sofrem excisão no 21º dia de germinação, enquanto que as de C. gladiata, apenas no 28%, quando a planta já se encontra com mais de 1,7 m de altura.... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: The present research was carried out using various topochemical and histochemical methods of analysis, wlth the lntentlon of characterizing quiescent seeds and cotyIedons Canavalia ensiformis and C. gladiata. The principal stored material in these seeds is starch, which represents over 50% of their dry weight. Another important reserve is protein, which represents up to 27-30% of the dry weight of C. ensiformis and 37-44% of C. gladiata. The seeds contain very little lipid which consists mostly of stearic acid. The electrophoretic profiles of the two species are very similar, with predominance of canavalin and concanavalin A, present in the vicilin fractions. The total protein extracts and the vicilin are hemaglutinating, whiIe the legumins and albumins do not have this characteristic. .This hemaglutinating ability can only be verified "in vitro" since "In situ" the concanavalin A is elther associated with other proteins, and/or occurs dissociated. The cell walls of the cotyledons have large plasmodesms, which may contribute to the transport of reserve material from cell to cell durlng germlnation. The cotyledons of C. ensiformis falI on the 21 day of germlnation, while those of C. gladiata falI only on the 28 day when the plant has attained a helght of 1.7 m.... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Doutorado Doutor em Ciências Biológicas

Orientadores: Benedicto de Campos Vidal, Maria Luiza Silveira Mello Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As glândulas salivares de Bradysia spatitergum apresentam um aspecto morfológico típico, quando comparadas com glândulas salivares de outros sciarídeos. Suas características citoquímicas são também particulares, quando comparadas com as de Bradysia sp, Rhynchosciara americana e Rhunchosciara sp. Os testes citoquímicos realizados evidenciaram a presença de glicogênio e um outro tipo de glicosaminoglicana neutra na porção distal da região 'S IND. 3¿ das glândulas salivares de Bradysia spatitergum, em maior quantidade a partir do '4 GRAUS¿ estádio larval. Glicosaminoglicanas ácidas sulfatadas se fazem presentes, no citoplasma da região 'S IND. 2¿ e porção proximal de 'S IND. 3¿, durante todo o desenvolvimento pós-embrionário. Proteínas e lipídios foram encontradas nestas glândulas salivares (citoplasma e secreção no lúmen) em maior concentração nas regiões 'S IND. 2¿ e 'S IND. 3¿ distal e 'S IND. 1¿ e 'S IND. 3¿ distal, respectivamente. As observações realizadas ao nível da microscopia de polarização demonstram que estes componentes apresentam alta orientação molecular. O RNA citoplasmático e nuclear se mostrou presente durante todo o desenvolvimento pós-embrionário, em todas regiões glandulares. Os intervalos de duplicação dos valores Feulgen ¿ DNA encontrados nas glândulas salivares, (menores em 'S IND. 1¿ e maiores em 'S IND. 2¿, possivelmente se relacionem com a menor e maior atividade secretora dessas regiões glandulares respectivamente Abstract: The salivary glands of Bradysia spatitergum show a typical morphological aspect when compared with salivary glands of other Sciarid flies. Their cytochemical characteristics ate also peculiar when compared with those of Bradysia sp., Rhynchosciara americana and Rhynchosciara sp.. Glucogen and other neutral glycosaminoglycans were specially detected in the cytoplasm of the distal part of the 'S IND. 3¿ region of the glands, where they increase in amount from the 4th instar on. Sulphated acid glycosaminoglycans are present in the epithelial cells of the 'S IND. 2¿ region and proximal zone of the 'S IND. 3¿ region, during all the post-embryonic development. RNA was found in the gland epithelial cells throughout the organ and during all the post-embryonic development. Proteins and lipids are present in the cytoplasm of the epithelial cells and also in the lumen of the organ as part of the gland secretion. Their content was shown to be specially increased in 'S IND. 2¿ and distal 'S IND. 3¿ regions (proteins) and in 'S IND. 1¿ and distal 'S IND. 3¿ regions (lipids). Both protein and lipid (lipoprotein?) components were proved to display high molecular orientation patterns when studied with polarizing microscopy. Nuclear Feulgen-DNA values were cytophotometrically evaluated in the various gland zones at the 1st and early 4th larval instars and prepupal stage... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O câncer diferenciado de tireóide (carcinoma folicular e papilífero) geralmente possue bom prognóstico. O Sistema utilizado para estadiamento destes tumores é o Sistema TNM, proposto pela UICC (União Internacional Contra o Câncer). Este Sistema baseia-se na extensão anatõmica da doença, dividindo-a em estádios. O prognóstico dos tumores está diretamente relacionado ao estádio: quanto mais avançado, pior o prognóstico. Esta correspondência clínica é observada em todos o tumores da região da cabeça e pescoço onde este Sistema é utilizado. Entretanto, para os tumores diferenciados da tireóide, este sistema é inadequado, pois observa-se que pacientes e tumores em condições similares, com estádios similares e tratamento similares, tem evoluções diferentes. A detecção da proteína p53 em células tumorais tem sido associada a mau prognóstico em alguns tipos de tumores. Em células que apresentam o DNA danificado o gene p53 medeia a interrupção do G 1 e retarda a entrada na fase S, facilitando o reparo do DNA, e, ao mesmo tempo induz a apoptose, prevenindo desta forma, a propagação de células que apresentem alterações genõmicas estáveis. O gene p53 está perdido ou mutado em vários tipos de tumores. A mutação do gene p53 leva à estabilização e ao aumento da meia-vida da proteína p53 e está associada com o acúmulo desta proteína no núcleo das células tumorais. A marcação imunológica da proteína p53 é desta forma, um meio indireto de detectar o gene p53 mutado. O presente estudo avaliou o valor do p53 no prognóstico dos tumores diferenciados da tireóide, correlacionando-o com o estadiamento pelo Sistema TNM, estudando os seguintes parâmetros: a) número de procedimentos cirúrgicos necessários para o controle da doença; b) necessidade de associação do esvaziamento cervical à tireoidectomia; c) necessidade de associar a ressecção de estruturas cervicais; d) sobrevida. Após revisão de lâminas, 43 casos foram levados à imunocoloração com o anticorpo antip53 (Novacastra, U.K), utilizando-se o método de imunoperoxidase indireta (método AvidinaBiotina). Foram positivos para imunocoloração do p53 25 casos e negativos 18. A distribuição entre os dois grupos quando analisado sexo, idade, tempo de seguimento, tipo histológico e estadiamento pelo Sistema TNM , foi semelhante.O número de procedimentos cirúrgicos realizados no grupo de pacientes p53( +) foi de 44/25(média 1,76 por paciente), enquanto que no grupo p53(-) foi de 22/18 (média 1,22 por paciente). No grupo de pacientes p53( +) foi necessário realizar o esvaziamento cervical em alguma fase do tratamento em 13/25 pacientes (52%), enquanto que no grupo p53( - ) foi de 4/18 (22%). Estruturas cervicais foram ressecadas em 7/25 (28%) pacientes p53(+), enquanto que no grupo p53( -) foi necessário em 3/18 (17%). Dentre os 43 casos estudados, 2 morreram por outras causas. Nos pacientes p53(+) 8/24 (33%) morreram em conseqüência ao câncer de tireóide, enquanto que no grupo p53(-) 2/17 (12%). No presente estudo, a imunocoloração para a proteína p53 foi o fator preditivo mais fidedigno na avaliação do prognóstico do câncer de tireóide. Os pacientes p53( +) apresentaram doença mais agressiva e mortalidade mais alta do que os pacientes p53( -). A detecção por coloração imunohistoquímica da proteína p53 em pacientes portadores de câncer diferenciado de tireóide pode se tornar no método mais efetivo para antecipar o prognóstico desta doença, com maior acuracidade inclusive que o Sistema TNM Abstract: The differentiated thyroid cancer (papilary and folicular) usually has good prognosis The System used for the stagement of these tumors is the TNM System, proposed by the TIJAC (International Union Against Cancer). This System is based on the anatomical extension of the disease, dividing it in stages. The prognosis of the tumors is directly related to the stage: how more advanced, worse the prognosis. This clinical correspondence is observed in all the tumors of the head and neck region where this system is used. However, for the thyroid tumors, this system is inadequate, as it is observed that patients and tumors in similar conditions, with similar stages and similar treatment have different evolutions. The detection of the p53 in tumorous cells have been associated to a poor prognosis in some kinds of tumors. In cells that present damaged DNA the p53 gene mediates the interruption of the G 1 phase and retards the entrance in the S phase, facilitating the mending of the DNA, and, at the same time, it induces the apoptosis, preventing this way, the propagation of the cells that present stable genomic alterations. The p53 gene is lost or muted in various kinds of tumors. The mutation ofthe p53 gene leads to the stabilization and to the increase ofthe halflife of the p53 protein and it is associated with the accumalation of the protein in the nucleus of the tumorous cells. The immunologyc coloration of the p53 protein is then indirect means of detecting the muted p53 gene. The present study analyzed the value of the p53 in the prognosis of the differentiated cancer of the thyroid gland, correlating it to the stagement by the TNM system, studying the following parameters: a) number of surgical procedures necessary to control the disease; b) the necessyty to associate neck dissection to the thyroidectomy; c) the necessity to associate the resection of the cervical structures; d) Survival. After reviewing slides, 43 cases were taken to the immunocoloration with the anti-p53 antibody (Novacastra, U. K), using the indirect immunoperoxidase method (Avidina-Biotina). In these 43 cases, 25 were positive for the immunocoloration of the p53, and 18 were negative. The distribution between the two groups was similar when Sex, age, follow-up time, histologycal type and stagement by the TNM system. The number of surgical procedures done in the group of patients p53( +) was of 44/25 (average 1.76), while in the group p53(-), it was of22/18 (average 1.22). In the group.ofpatients p53(+), it was necessary to make neck dissection in some phase of the treatment in 13/25 patients (52%), while in the group p53(-), it was made in 4/18 (22%) ofthe patients. Resection of cervical structures was necessary in 7/25 (28%) of the patients p53( +), while in the group p53( -), it was made in 3/18 (17%) of the patients. Among the 43 studied cases, 2 died of other causes. In the patients p53( +), 8/24 (33%) died as a consequence ofthyroid cancer, while 2/17 (12%) died of it in the group p53(-). In this study, the immunocoloration for the p53 protein was the most trustworthy predictive factor in the evaluation of the thyroid cancer prognosis. The group p53( +) patients presented more agressive disease and higher mortality than the p53( -) patients. The detection by immunohistochemical coloration of the p53 protein in patients with differentiated thyroid cancer can became the most effective method to anticipate the prognosis of this disease, with higher accuracy than the TNM System Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador : Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A Ciclofosfamida é uma agente alquilante que inibe a síntese de ácidos mucleicos e portanto reduz o número de células que estão se dividindo. Vários tecidos sofrem o efeito tóxico desta droga, principalmente bexiga, trato gastrintestinal e medula óssea. No estudo citológico da medula óssea, observou-se que 24 horas após o uso de Ciclofosfamida, a celularidade total diminuiu intensamente e restaram apenas neutrófilos maduros, eritroblastos ortocromáticos, linfócitos, plasmócitos e histiócitos. Na análise citofotométrica da série vermelha verificou-se que a quase totalidade dos eritroblastos estavam na fase G1 do ciclo celular. Persistiram portanto, somente células que não se multiplicam mais e que por isso não sofrem ação da droga. No grupo de ratos sacrificado após 72 horas do uso de Ciclofosfamia, houve regeneração celular, às custas, principalmente, da série granulocítica, o que foi visto pelo grande número de mieloblastos e pró-melócitos. Observou-se também o aparecimento de eritroblastos jovens (pró-eritroblastos e eritroblastos basófilos) com características megaloblásticas e que apresentaram valores Feulgen/DNA muito baixos, ou seja, eram hipodiplóides. O achado de células com conteúdo de DNA inferior ao do grupo controle foi interpretado como decorrente de inibição parcial da síntese de DNA pela Ciclofosfamia. Ela teria causado quebras cromossômicas e as células -filhas receberam menor quantidade de material genético... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: Not informed. Mestrado Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Benedicto de Campos Vidal Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O tendão do músculo plantaris longus de da rã-touro (Rana catesbeiana) está sujeito a forças de compressão, de torsão e de fricção, em adição às forças de tensão exercidas pelo músculo. Este trabalho visou caracterizar as adaptações estruturais e composicionais apresentadas por este tendão frente a este complexo sistema biomecânico. Estruturalmente duas regiões principais foram delimitadas, uma região de tensão, tipicamente fibrosa e tida como responsável pela transmissão das forças de tensão, e uma região de compressão, de aspecto cartilaginoso, que se desenvolve na área em que o tendão contorna a articulação tibio-fibular distal. A região de compressão distingue-se do aspecto fibrocartilaginoso descrito para tendões de mamíferos encontrados em situações semelhantes e apresenta feixes primários e fibras extremamente onduladas e/ou contorcidas, na superfície dos quais deposita-se um material basofílico caracterizado como proteoglicanos. Ultraestruturalmente estes feixes apresentam -se formados por fibrilas associadas em grupos independentes que à semelhança dos feixes que formam são também contorcidas e sem direcionamento predominante. Afixação em presença de vermelho de rutênio faz com que os proteoglicanos precipitem-se como grânulos interligados por filamentos que formam estruturas aneladas. Além destes componentes encontrados nos espaços interfibrilares, existem grânulos que são encontrados em associação com as fibrilas de colágeno e distribuídos de forma periódica de acordo com o perído d. A comparação dos tamanhos destes grânulos na região de compressão com aqueles observados na região de tensão demonstra que os primeiros são bem maiores que os últimos. Estudo morfométrico revelou que as fibrilas de colágeno da região de compressão apresentam diâmetros reduzidos e com distribuição de valores menos ampla que a região de tensão. As células da região de compressão podem ser distinguidas em três tipos, principalmente pelo conteúdo de filamentos intermediários que acumulam no citoplasma e no tipo de interação com componentes da matriz extracelular. Foi demonstrado que a região de compressão possui cerca de 7 vezes mais glicosaminoglicanos (quantificados pelo método do carbazol) que a região de tensão e que parte destes componentes estão associados na formação de grandes proteoglicanos, como revelado por filtração em gel de Sepharose CL-4B, eletroforese em gel de agarose-acrilamida e por ultracentrifugação em gradiente de cloreto de césio. Também os pequenos proteoglicanos foram identificados, sendo que o biglicam é encontrado na região de compressão e está virtualmente ausente da região de tensão, onde o decorim apresenta tamanho reduzido provavelmente por menor extensão do seu glicosaminoglicano. O menor tamanho do decorim é demonstrado também pela dimensão reduzida dos grânulos associados às fibrilas de colágeno que são revelados pelo vermelho de rutênio. Fibromodulim foi identificado nas duas regiões sem apresentar modificações estruturais evidentes entre elas. Foi demonstrado que o colágeno do tipo I é o principal componente das duas regiões do tendão, embora a presença de outros componentes de natureza colagênica tenha sido sugerida pela existência de fragmentos distintos obtidos por digestão com pepsina de material proveniente de cada região e por precipitação diferencial de colágenos, com conteúdo em aminoácidos diferente daquele apresentado pelo colágeno do tipo I. As análises efetuadas permitem concluir que este tendão possui grande capacidade de deformação, possibilitada pelo arranjo dos elementos fibrilares e pelo conteúdo em grandes proteoglicanos, além da esperada resistência à compressão, comuns a outros tendões sujeitos a forças de compressão Abstract: The tendon of muscle plantaris longus of Rana catesbeiana is subjected to compressive, torsional and frictional forces in addition to the tension forces exerted by the muscle. This work was carried out to characterize the structural and compositional features of the tendon facing this complex biomechanical system. Two main regions can be distinguished structurally. The tension region, typically fibrous and assumed to be responsible for the transmission of tension forces, and the compression region. with cartilaginous aspect, which develops in the area where the tendon wraps the distal tibial joint. At histologicallevel, the compression region differs from the fibrocartilaginous array described for mammalian tendons under compression and exhibits primary bundles and fibers extremely wavy and convoluted, with an coarse covering of basophilic material identified as proteoglycans. Ultrastructurally, these bundles are constituted by independent groups of convoluted fibrils without a predominant direction. Fixation in presence of ruthenium red precipitates the proteoglycans as granules associated by filaments in ring formations. Besides these granules of the interfibrillar spaces, there are granules associated with the collagen fibril surface and disposed periodically according to the d period. Comparison of the size of these granules in the compression regions with those of the tension regions demonstrated that the former are larger than the latter granules. A morphometric study demonstrated that the fibrils of the compression region show reduced diameters with a narrow distribution of values while fibrils of the tension region exhibit a wide dispersion of values reaching extremely large diameters. Cells of the compression region can be distinguished in three main types, differing essentialIy by the amount of intermediate filaments deposited in the cytoplasm and in the kind of association with extracellular matrix components. Biochemical analysis demonstrated that the compression region possess almost 7 times the amount of glycosaminoglycans found in the tension region. Part of these glycosaminoglycans are in the form of large proteoglycans as demonstrated by gel filtration in Sepharose CL-4B, composite agarose-acrylamide gel eletrophoresis, and ultracentrifugation in cesium chloride gradient. DEAE-cellulose chromatography of material extracted by 4M GuCl unveil the existence of small proteoglycans in both region of the tendon. eventhough biglycan is virtually absent of the tension region and that decorim from this region migrates faster in SDS-PAGE, pointing to its smaller size. It agrees with the smaller size offibril-associated granules revealed by fixation in presence of ruthenium red. Fibromodulim was also identified in both regions without remarkable structural modifications. Is was shown that collagen type I is the main collagenous component of both regions, though other members of the family must be present as indicated by differences in fragments obtained by digestion with pepsin and by obtention of residues of collagenous material other than type I in differential precipitation by NaCl from neutraI saline. The analysis allow us to conclude that this tendon has an increased deformability, which is guaranteed by the spacial arrangement of fibrillar components as welI as by the content in large proteoglycans, besides the expected capacity to resist compressive forces, shared with different pressure-bearing tendons Doutorado Bioquímica Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Benedicto de Campos Vidal Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Diabetes mellitus é uma doença crônica que afeta o metabolismo de lipídios, carboidratos e proteínas. Sua principal característica é a hiperglicemia devido à produção insuficiente de insulina ou a defeitos na resposta à insulina pelos tecidos periféricos. A hiperglicemia, quando muito acentuada, induz glicosilação não-enzimática de proteínas, que é responsável pela formação de produtos finais de glicosilação não-enzimática (AGEs) e de ligações cruzadas intermoleculares. Neste estudo, organização supramolecular, orientação espacial e propriedades ópticas foram investigadas em proteínas extracelulares da córnea e da aorta de camundongos diabéticos não-obesos (NOD) e não diabéticos (BALB/c). CÓRNEAS: Birrefringência e dicroísmo linear foram investigados em fibras colágenas do estroma corneal de camundongos NOD/Uni e BALB/c/Uni. A contribuição de proteoglicanos do estroma para as anisotropias da córnea também foi investigada. Retardo óptico foi medido em fibras colágenas de córneas intactas e seccionadas com 8 µm de espessura (sem coloração). Dicroísmo linear e índices dicróicos foram investigados em cortes de córnea corados com ponceau SS pH 2.5 e azul de toluidina pH 4.0, usando microespectrofotômetro de varredura e diferentes comprimentos de onda obtidos com régua monocromática. Análise morfológica das birrefringências revelou que fibras colágenas de camundongos NOD e BALB/c estão intercruzadas em vários planos espaciais e orientadas em mais que uma direção ao longo da trajetória corneal. Córneas de NOD apresentaram maiores valores de retardo óptico das birrefringências que o controle. Fibras colágenas coradas com ponceau SS apresentaram valores positivos de dicroísmo linear e índice dicróico. Esses valores foram maiores para as córneas de NOD. Após coloração com azul de toluidina, córneas de NOD e BALB/c apresentaram reação metacromática devido à presença de grupamentos aniônicos (glicosaminoglicanos de proteoglicanos) no estroma; e valores negativos de dicroísmo linear e índice dicróico. Não foi verificada diferença significativa entre córneas de NOD e BALB/c coradas com azul de toluidina. Esses resultados sugerem que o diabetes foi capaz de alterar as anisotropias ópticas da córnea, possivelmente por aumentar o empacotamento molecular das fibras colágenas. Entretanto, o diabetes não alterou a organização espacial dos proteoglicanos do estroma. AORTAS: Ocorrência de glicosilação não-enzimática foi verificada em aortas abdominais de camundongos NOD/Uni, usando azul de nitro-tetrazólio (NBT). Alterações moleculares e estruturais foram investigadas em lâminas elásticas e fibras colágenas, após colorações com cloreto de danzila e anilino-sulfato naftaleno (ANS). Alterações em auto-fluorescência e birrefringência arterial foram investigadas em aortas sem coloração. Proliferação de células musculares lisas também foi investigada em amostras coradas com a reação de Feulgen, usando microscopia confocal e análise de imagem. NBT demonstrou a formação de produtos de glicosilação (frutosamina) na matriz extracelular da aorta de NOD. Lâminas elásticas e fibras colágenas da aorta de NOD apresentaram fluorescência menos intensa que o controle, após colorações com cloreto de danzila e ANS. Entretanto, a auto-fluorescência arterial foi maior nos camundongos NOD. Análise da birrefringência revelou alterações no empacotamento molecular das fibras colágenas da aorta NOD. Nenhuma evidência de proliferação de células musculares lisas foi observada em aortas NOD coradas com a reação de Feulgen Abstract: Diabetes mellitus is a chronic disorder of the carbohydrate, lipids and protein metabolism. A characteristic feature of this disorder is the hyperglycemia due to a deficient insulin production or to metabolic defects on its response in peripheral tissues. Hyperglycemia induces non-enzymatic glycosylation of proteins, which is responsible for advanced glycosylation end-products (AGEs), and intermolecular crosslinks reactions. In this study, supramolecular organization, spatial orientation and optical properties were investigated in extracellular proteins of the cornea and of the abdominal aorta from nonobese diabetic (NOD) mice and non-diabetic mice (BALB/c). CORNEAS: Birefringence and linear dichroism were investigated in corneal stroma collagen fibers from nonobese NOD/Uni mice and BALB/c/Uni mice. The contribution of stroma proteoglycans to optical anisotropies of the cornea was also investigated in NOD and BALB/c mice. Birefringence optical retardations were measured in stroma collagen fibers of unstained whole and sectioned (8 µm) corneas. Linear dichroism and dichroic ratios were investigated in cornea sections stained with ponceau SS pH 2.5 and toluidine blue pH 4.0, using scanning microspectrophotometer and different wavelengths that were obtained with a monochromator filter ruler. Morphological analysis of the birefringences revealed that NOD and BALB/c stroma collagen fibers are intercrossed in different spatial planes and oriented in more that one direction along the corneal trajectories. NOD corneas showed higher birefringence optical retardation values than the control. Ponceau SS-complexed collagen fibers showed positive linear dichroism and dichroic ratios values that were higher for NOD corneas. After staining with toluidine blue, NOD and BALB/c corneas showed metachromatic reaction verifying the presence of anionic groups (proteoglycan glycosaminoglycans) in the stroma, and negative linear dichroism values. No significant difference was observed between NOD and BALB/c corneas stained with toluidine blue. These results demonstrate that diabetes was capable of altering the optical anisotropies of the cornea, possibly to increase the number of intermolecular crosslinks in stroma collagen fibers, making them more crystalline and aggregate than the control. However, diabetes did not affect the spatial organization of the stroma proteoglycans. Nonenzymatic glycosylation was assessed in aorta extracellular matrix from NOD/Uni mice, using nitroblue tetrazolium (NBT). Molecular and structural changes were investigated in elastic lamellae and collagen fibers of diabetic mice aortas, after staining with dansyl chloride and anilinonaphthalene sulfonate (ANS). Alterations in arterial autofluorescence and birefringence of collagen fibers were investigated in unstained aortas. Smooth muscle cells proliferation was also investigated by confocal microscopy and image analysis, after Feulgen reaction. Assessment of nonenzymatic glycosylation demonstrated glycosylation products formation in the aorta extracellular matrix from NOD mice. Elastic lamellae and collagen fibers from diabetic aortas presented less intense fluorescence after staining with dansyl chloride and ANS when compared to controls. However unstained NOD aortas showed more intense autofluorescence when compared to controls. Birefringence analysis suggests alterations in the higher molecular packing of the arterial collagen fibers in diabetic aortas. In aortas stained by Feulgen reaction no evidence of smooth muscle cells proliferation was observed in diabetic aortas Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Dois tendões de frangos com idades de 21 e 41 dias da região tibiotarsus foram utilizados: o tendão calcaneus communis e o tendão flexor digitorum superficialis, que são submetidos a forças compressivas e tensionais, respectivamente. O objetivo deste estudo foi detectar diferenças morfológicas e funcionais, de ordem molecular e de cristalinidade entre esses dois tendões. Tendões que trafegam sobre uma articulação possuem características fibrocartilaginosas em resposta a forças compressivas apresentando grandes quantidades de glicosaminoglicanos livres e organizados com os feixes de colágeno. Por outro lado, tendões que são submetidos a forças tensionais possuem menores quantidades de glicosaminoglicanos, fato esse indicado por uma metacromasia menos evidente na coloração com Azul de Toluidina e por apresentarem valores maiores em testes de intumescimento em ácido acético a 3%. Análises de curvas de birrefringência de forma revelam um maior estado de agregação ordenada e uma maior cristalinidade neste tendão, demonstrada por maiores valores de retardas ópticos. Células do tendão calcaneus communis exibem grandes variações morfológicas, assim como seus núcleos, que possuem formas que vão da fusiforme até a arredondada, semelhantemente a condrócitos. Foi também observado aumento da quantidade de DNA nesses núcleos, com o avanço da idade, comparativamente à quantidade determinada em eritrócitos de frangos, utilizados como controle para os parâmetros geométricos e absorciométricos analisados. Portanto, todos esses dados indicam que estes tendões, por necessitarem de processos adaptativos constantes, possuem uma maior organização e orientação de seus componentes, além de uma alta atividade metabólica de suas células Abstract: Two tendons of chickens with 21 and 41 days old from tibiotarsus region were utilized: calcaneus communis tendon and fIexor digitorum superficialis tendon that are submitted to compressive and tensional forces, respectively. The aim of this study was to detect morphological and functional differences, related with molecular order _nd crystallinity between these two tendons. Tendons that pass above joints have fibrocartilagenous characteristics in response to compressive forces, presenting high amounts of free glycosaminoglycans and organized with the collagen bundles. Otherwise, tendons subjected to tensional forces have minor glycosaminoglycans amount, in agreement with the decreased metachromasy after toluidine blue staining and with the great values found in the intumescing tests with 3% acetic acid. Form birefringence curves analyses reveal a higher ordered aggregational state and crystallinity in this tendon according to the optical retard values. Cells of the calcaneus communis tendon exhibit great morphological variations, as its nuclei, wich have forms ranging from elongated to round, similar to chondrocytes. Its was also watched an increase on the DNA amount at these nuclei with the ages advance when compared to the amount found in chicken erythrocytes, here utilized as control for the geometric and absorciometric parameter. However, ali these data indicate that these tendons, for needing constant adaptative processes, have a high organization and orientation of their components, besides a high metabolic activity of the cells Mestrado Histologia Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Benedicto de Campos Vidal, Maria Luiza Silveira Mello Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Camundongos NOD são ótimos modelos para estudo, uma vez que são portadores de duas importantes características: diabetes e resistência à apoptose. É desconhecido se a elevada resistência à apoptose atinge células somente do sistema imune onde foi descrita, ou se é uma característica de células de outros sistemas/tecidos. O diabetes mellitus provoca alterações na matriz extracelular (MEC) por meio da glicosilação não-enzimática das proteínas intercelulares, tal como o colágeno. No processo não-enzimático de glicosilação da proteína colagênica, o grupo aldeído da glicose reage com o grupamento amina livre de resíduos de lisina e hidroxilisina do colágeno, formando uma base Schiff reversível que origina os produtos de Amadori. Estes produtos dão origem aos produtos de glicosilação avançada (AGEs) que desencadeiam a formação de ligações cruzadas entre as moléculas de colágeno. O colágeno interage com receptores de superfície celular de modo que alterações nesta glicoproteína poderiam alterar a transdução de sinais da MEC para as células. O presente estudo visa descrever e quantificar as propriedades anisotrópicas ópticas em feixes de colágeno; buscar alterações elicitadas pelo diabetes nos proteoglicanos (PGs) da MEC; verificar a ocorrência de resíduos de glicose disponíveis no colágeno glicosilado; descrever o intumescimento e a extração de feixes de colágeno em ácido acético a 3% e comparar alguns aspectos da morte celular e do fenótipo nuclear de fibroblastos de feixes de colágeno de camundongos sadios e NOD, buscando-se alterações elicitadas pelo diabetes. Para isso, tendões do calcâneo e da cauda de 14 camundongos NOD e BALB/C (não-diabéticos) foram submetidos aos seguintes experimentos: Medidas de retardo óptico (RO) das birrefringências; digestão enzimática com hialuronidase testicular; colorações com azul de toluidina (AT) pH 4.0 e concanavalina Br (ConBr); intumescimento e extração do colágeno; reação de Feulgen, análise de imagem nuclear e teste imunocitoquímico de TUNEL. Os resultados indicam que toda a glicose incorporada não-enzimaticamente ao colágeno foi convertida a produtos de Amadori. O aumento no número de ligações cruzadas intermoleculares tornou as fibras de colágeno mais alinhadas, estáveis e com condições de empacotamento molecular mais intensas em relação às fibras de colágeno controle. A estabilidade torna o colágeno glicosilado mais resistente à extração por ácido acético a 3% e sugere a ocorrência de diminuição na taxa de remodelação tecidual de animais e/ou pacientes diabéticos. Em termos de ordem molecular (cristalinidade) dos feixes de colágeno, parece que o diabetes induz mudanças variáve is em função da estrutura, fato este que sugere a existência de significados fisio-patogênicos distintos. Quanto aos PGs da MEC, não foram observadas alterações elicitadas pelo diabetes nestas macromoléculas. Os parâmetros geométricos e densitométricos que caracterizam o fenótipo nuclear dos fibroblastos também foram alterados pelo diabetes, sendo que encontrou-se um aumento desses parâmetros ao compará-los com os observados em núcleos de fibroblastos de camundongos não-diabéticos. Não foi constatada positividade ao teste de TUNEL nos núcleos dos fibroblastos estudados Abstract: NOD mice possess two characteristics: diabetes and resistance to various apoptosis signals. Diabetes mellitus provokes alterations in the extracellular matrix (ECM) through of the non-enzymatic glycosylation of intercellular proteins, such as the collagen. In the process of non-enzymatic glycosylation of the collagen protein, the carbonyl group of a sugar reacts with the amino group of a protein and forms a Schiffs¿ base which reacts further into a Amadori products. The products of early glycosylation undergo rearrangements resulting in the formation of irreversible products, the so-called advanced glycosylation endproducts (AGEs). AGEs formation is probably one of the main mechanisms underlying the increased arterial stiffness in diabetic patients or diabetic complications in general. The collagen interacts with cell receptors, consequently alterations in the collagen can change the signal transduction from ECM for the cells. The principal objectives of present study are: to describe the anisotropic properties of collagen bundles obtained from NOD mice and to compare some aspects of the cell death and nuclear phenotype of fibroblasts obtained from NOD and BALB/C mice. For this, calcaneal and tail tendons were submitted to the following experiments: measurements of intrinsical and textural birefringence; enzymatic digestion; staining with toluidine blue (TB) pH 4.0; Concanavalin Br method; collagen extraction; Feulgen reaction, analysis of nuclear images and TUNEL test. The results indicate that all glucose was converted the Amadori products. The increase in the number of cross-linking becomes the collagen fibers both more 16 aligned and with more intense molecular packing conditions than those of the control. In terms of molecular order (crystallinity) of collagen bundles, the diabetes induces variable changes in function of the structure, fact this that suggests the existence of different physio-pathogenics meanings. The analysis of parameters that characterize the nuclear phenotype (area, perimeter, OD, IOD, SDtd and entropy) indicate physiological differences between the fibroblasts obtained from NOD and BALB/C mice. The reply to the TUNEL test was negative in the fibroblasts Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Paulo Cesar Rodrigues Palma, Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Várias propriedades do colágeno justificam seu emprego como agente embolígeno. Trata-se de um material biologicamente compatível, pouco imunogênico e com propriedades hemostáticas. O preparado de colágeno ideal para embolização deve ter características que permitam a obstrução completa e duradoura do lúmen arterial, determinando a necrose isquêmica do tecido embolizado, com reação inflamatória local e resposta imunológica mínimas. O objetivo deste experimento foi estudar a eficácia e segurança no uso do gel de colágeno bovino purificado na embolização da artéria renal, em cães. Este preparado foi obtido a partir de colágeno do tipo I, extraído de tendões bovinos tratados por meio de técnica de alta purificação, com a finalidade de eliminarem-se as porções imunogênicas e reconstituído através de diálíse prolongada, em água destilada. Esta técnica permitiu obterse um gel com características reológicas (elasticidade e viscosidade), que visavam facilitar sua adesão ao endotélio e o preenchimento vascular completo, além de possibilitar a injeção através de cateteres de fino calibre. Dezesseis cães de raça indefinida (peso médio de 12,3 kg) foram submetidos à embolização aleatória da artéria renal, direita ou esquerda, com o gel de colágeno purificado. O rim contralateral foi submetido à infusão de solução de NaCI 0,9 %, segundo à mesma técnica cirúrgica, constituindo os controles. Os cães foram divididos em dois grupos e sacrificados após 2 dias (grupo 1) e 21 dias (grupo 2) do procedimento. As vísceras abdominais, pulmões e a musculatura das patas posteriores foram detalhadamente examinados no sacrificio, sendo colhidas amostras para o estudo anátomo-patológico. A variação do volume renal, após a embolização, foi calculada com um paquímetro estéril a partir da medida intra-operatória dos diâmetros longitudinal e ântero-posterior. A análise dos resultados foi realizada através do teste não-paramétrico de Friedman, sendo fixado em 5 % o nível de rejeição da hipótese de nulidade. No grupo -1, foram verificadas isquemia difusa do parênquima e aderências perirrenais frouxas após a embolização com gel de colágeno, sem alterações volumétricas significativas. O estudo, sob microscopia, mostrou êmbolos amorfos acidófilos e birreftingentes preenchendo o lúmen da artéria renal e prolongando-se até as arteríolas. Os glomérulos e túbulos contornados apresentavam sinais precoces de necrose difusa. Não foi identificada reação inflamatória significativa, denotando um infarto asséptico. No grupo 2, houve uma diminuição significativa (p=0,04) dos volumes dos rins embolizados com gel de colágeno, acompanhada de aumento compensatório dos volumes dos rins controle contralaterais (p=0,04). Microscopicamente, foi verificada reação proliferativa do endotélio em tomo dos êmbolos que encontravam-se intimamente aderidos à parede arterial e apresentavam sinais de proliferação fibroblástica em seu interior. O parênquima renal apresentava atrofia e hialinização glomerular difusa, acompanhadas de fibrose intersticial e fibrose tubular extensa com áreas de vacuolização. Um dos cães deste grupo apresentou refluxo, de parte do material injetado, para o rim contralateral durante a embolização, provavelmente em virtude das particularidades anatômicas do animal, que dificultaram tecnicamente o procedimento. Nos demais rinscontrole não foram encontradas alterações patológicas. Em ambos os grupos estudados, as vísceras abdominais, pulmões e a musculatura das patas posteriores de todos os animais não apresentaram sinais de migração do material. Os resultados permitiram inferir que, o gel de colágeno purificado foi eficaz na embolização da artéria renal, de acordo com os parâmetros anátomo-patológicos analisados no modelo experimental proposto. A ausência de migração de partículas de colágeno. para outras vísceras e. patas posteriores sugere que este material é seguro para o emprego na embolização de órgãos. Estes resultados podem ser explicados pelas características do preparado utilizado, tomando o gel de colágeno atraente para uso na embolização renal terapêutica Abstract: Several properties of collagen such as its high biocompatibility, low immunogenicity and intrinsic hemostatic properties as pro-aggregant substance, justify its use as an emboligenic agent. The ideal collagen-based embolic agent should produce complete and permanent arterial obstruction, leading to ischemic necrosis with a minimal inflammatory reaction and immunological response. The aim of this study was analyze the effectiveness and safety of a purified collagen gel in producing renal arterial embolization in dogs. The collagen gel was obtained from bovine tendons type I collagen fibers, highly purified and extensively dialyzed in order to remove the immunogenic sites. The resulting gel was designed to have specific rheologic properties (viscoelasticity) which would allow optimal endothelial adhesion and arterial flow obstruction, even when injected through small caliber catheters. Sixteen mongrel dogs (weight of 12,3 kg) underwent randomized renal arterial embolization with collagen gel. The contralateral kidney was infused with 0,9 % NaCI solution using the same procedure as in treated dogs (control). The animals were divided in two groups and were sacrificed 2 days (group 1) and 21 days (group 2) after the procedure. The abdominal organs, lungs and posterior limb muscles were dissected and samples were collected for pathological analysis, in order to verify the presence of an inflammatory reaction. The variation in kidney volume was studied by intraoperative measurement of the longitudinal and ântero-posterior diameters using a sterile paquimeter. Statistic analysis was performed using the non-parametric test of Friedman (a. = 5 %). General ischemia of the tissue and thick perirenal aderences were observed in group 1 after collagen gel embolization, although there were no significa tive changes in volume. Examination by light microscopy showed acidophilic emboli of bireftingent collagen fibers filling the renal artery and extending into the arterioles. The glomeruli and tubules showed early signs of dilfuse necrosis. There was no significant inflammatory response, indicating that the reaction represented an aseptic infarction. A significant reduction in the volume was seen in the embolized kidneys of the animals in the group 2 (p = 0.04), while compensatory renal enlargement were verified in the controls (p = 0.04). Light microscopy showed a proliferative endothelial reaction around the emboli. Similarly, fibroblast proliferation was observed at the periphery ofthe emboli. The parenchyma was atrophied and showed diffuse glomerular hya1inization and extensive tubular fibrosis. There was a retlux of collagen gel to the contralateral kidney in one animal fi.-om group 2, probably secondary to difficuIties related to the animal anatomy. The other control kidneys were normal upon histological analysis. The abdominal organs, lungs and posterior limb muscles showed no signs of undesirable collagen migration in both groups. These results suggest that the purified collagen gel was a safe and effective agent for inducing renal arterial embolization in dogs. The absent of collagen particles migration to other organs or posterior limbs suggest that this material may be safe for the organ embolization. These resuIts can be expIained by the inherent properties of the collagen gel and suggest that this substance may be a useful and attractive for therapeutic renal arterial embolization Mestrado Mestre em Cirurgia

Orientador : Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Glicoproteínas estruturais (G.P.Es.) associadas aos feixes de colágeno foram isoladas por meio de extrações se letivas e analisadas as suas propriedades físicas, químicas e estruturais. o processo de extração e isolamento, além de limitar conceitualmente uma fração de glicoproteínas dentre todas aquelas encontradas na matriz do tecido conjuntivo, permite também constatar o alto grau de estabilidade fíSico-química das G.P.Es. A utilização de ácido tricloroacético (T.e.A.) aquecido, criticada por ser considerada um tratamento drástico na extração destas glicoproteínas, foi reavaliada frente a um processo alternativo ( extração pela colagenase tipo III), não revelando este diferenças significativas no produto final de extração. Por outro lado, a solubilidade destas glicoproteínas restrita a uréia '8H + 2-mercaptoetanol 0,1%, limitou alguns dos estudos bioquímicos. A heterogeneidade atribuída às G.P.Es. é discutida frente aos resultados encontrados entre tecidos heterólogos de um mesmo animal (tendões e ossos de bovinos) e tecidos homólogos de animais diferentes (tendões da cauda de rato e tendões calcaneares bovinos). Para se estabelecer a disposição e a organização das G.P.Es. nos feixes colagênicos foram efetuados estudos ultraestruturais ao nível da microscopia eletrônica e da polarização. Este último permitiu detectar" in situ " um grau de cristalinidade apreciável das G.P.Es. Tal grau de cristalinidade é atribuído ao ordenamento molecular decorrente do alinhamento e interação das fibrilas de G.P.Es. entre sI, cuja organização espacial lembra uma paliçada de fibrilas circunscrevendo fibras colagênicas Abstract: Structural glycoproteins (SGP) associated to collagen fibers were isolated by a selective extraction procdure and their physical, chemical and structural properties were analysed. The extraction and isolation procedures used permit a conceptual separation of certain glycoproteins fraction from the connective tis3ue matrix, and appraisal of their high degree of physico-chemical stability. The use of hot trichloroacet acid (TCA) has been criticised by various authors who consider it a drastic method for the extraction of glycoproteins. This treatment was therefore, re-evaluated in compari30n with an alternative method (extraction with type 111 collagenase), and no significant differences were encountered in the resulting fraction. On the other hand the limiting solubility of this glicoprotein which occurs only at 8M urea + 0,1% 2-mercaptoetanol restricts others biochemical analyses. The heterogeneity attributed to SGP is discussed in relation to the results found for heterogeneous tissues of the same animal (bovine tendon and bone) and homologous tis sues from different animal sources ( rat tail tendon and bovine Achilles tendon). Based on the current model proposed by JACKSON & BENTLEY (1964) for the arrangement and organization of SGP around native collagen fibers, analyses were made at the ultrastructural leveI with the polarizing and electron microscopes. The polarizing microscope revealed a considerable crystallini ty of the SGP " in situn. This crystalline is attributed to the molecular order formed by the arrangemente and interaction of this fibrils. Considering this a spatial distribution, a model of SGP fibrils arranged as a palisad, and encircling collagen fiberis suggested. Mestrado Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: o sistema quitinoso da concha resquicial de Loligo brasiliensis foi estudado através de eletroforese em poliacrilamida, de testes topoquímicos e da microscopia de polarização. O material mostra-se intensamente reativo aos xylidine ponceau, sirius rede picrosírius, bem como apresenta incrementos na birrefringincia e intenso dicroísmo linear quando examinados sob luz polarizada, o que demonstra a existência de ordenação molecular do componente protéico associado à quitina. O material responde positivamente aos Congo red e PAS e reage fracamente com o azul de alcian e o azul de toluidina. A eletroforese em poliacrilamida demonstrou a existencia de pelo menos 10 componentes glicoprotéicos associados de forma não covalente à quitina. Alguns destes componentes formam complexos estabilizados por pontes dissulfeto. Curvas de birrefringência de forma construídas para cortes histológicos demostraram a existincia de maiores cristalinidade e agregação lateral das fíbrilas de quitina após hidrolise alcalina, o que faz supor que as proteínas atuem mantendo certo afastamento entre os componentes fibrilares, atribuindo plasticidade ao sistema, além de reduzir sua susceptibilidade a hidratação e à degradação enzimatica Abstract: The chitin system of Loligo brasiliensis pen was studied through electrophoresis, topochemical tests i}nd polarization microscop Pen sectionspresent intense reactivity to xylidine ponceau, sirius red and picrosirius stains, as well as exhibit increases in birefringence and conspicuous extrinsic linear dichroism under polarized light, what suggests on the existence of molecular ordering in the association of the protein moiet to chitin. 0positive responses to Congo red and PAS beside weak reaction to alcian blue and toluidine blue were a150 demonstrated. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis highlighted the presence of at least 10 gl_coprotein5 associated non-covalentl to chitin, some of them making up disulfide-bonded complexes. Form birefringence curves constructed with retardatlon measurements showed that hydrolised pen has higher crystallinity and lateral aggregation of chitin fibrils. This fact support lhe assumption that proteins act maintaining apart the fibrillar components and ascy"ibe plasticity and resistence to hidration and enzymatic degradation to this system Mestrado Biologia Celular Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Cesar C. Santana, Benedicto C. Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica Resumo: O estudo do comportamento viscoelástico dos géis de colágeno é importante para sua caracterização reológica visando-se aplicações em bioengenharia e práticas clínicas. Neste trabalho, as propriedades viscoelásticas dos géis de colágeno, obtidos a partir do tendão da cauda do rato (RTT), foram avaliadas e correlacionadas em função de variáveis de preparação (tempo de diálise, concentração de colágeno e pH, e da freqüência de oscilação do reômetro (Haake CV20, no modo oscilante e configuração de placas paralelas). Os parâmetros reológicos avaliados foram: módulo de armazenamento (G¿), módulo de dissipação (G¿¿) e viscosidade complexa ('eta POT. *¿). O desenvolvimento da estrutura do gel durante a diálise foi acompanhado por micrografia óptica e correlacionado com os parâmetros reológicos medidos. A concentração de colágeno variou com o tempo de diálise devido à hidratação das fibras. Os géis mostraram estruturas fibrilares características, nas quais as fibras estavam entrelaçadas e formando anéis e/ou arranjos helicoidais. O modelo de Maxwell e de Zenner, mostraram-se apropriados para a descrição das características viscoelásticas dos géis de acordo com suas concentrações de colágeno: o modelo de Maxwell para baixas concentrações de colágeno (menor que 1% em peso) e o de Zenner modificado para concentrações moderadas de colágeno (de 1% até 2,50% em peso) ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: The study of the viscoelastic behavior of collagen gels important for its rheological characterization aiming applications in bioengineering and clinical practice. Viscoelastic properties of native and crosslinked collagen gels obtained from rat tail tendon (RTT) were evaluated and correlated as a function of gel preparation variables (dialysis time, collagen concentration, and pH) and oscillation frequency. The rheological parameters evaluated were the storage module (G¿), dissipation module (G¿¿), and complex viscosity ('eta POT. *¿), using a Haake CV20 rheometer operating with two parallel plate configuration in oscillating mode. The development of the fibrilar structure at the gel during dialysis was evaluated by optical photomicrography and correlated with the reological parameters. The collagen concentration changed with dialysis time due to the hydration of the fibers. The gels showed a typical fibrilar structure in which the fibers were interwinned forming either rings and/or helical arrangements. The models of Maxwell and Zenner showed to be appropriate to describe the viscoelastic behavior of the gels. The Maxwell model was in a good aggrement with the experimental rheological parameters for the low range collagen concentration (less than 1% by weight), while moderate collagen concentration range (1.0% to 2.5% by weight) had a good fit by modified Zenner¿s model... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Mestre em Engenharia Química

Orientador: Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Noventa e um camundongos (42 machos e 49 fêmeas) receberam dimetilnitrosamina na água de beber, durante 6 meses, com a seguinte concentração: a) 17 ppm (partes por milhão), durante o primeiro mês. b) 10,6 ppm durante os cinco meses restantes. A solução contendo a droga foi oferecida ¿ad libitum¿. Nestas circunstâncias, a DMN provoca diversas modificações nos núcleos de hepatócitos, tais como são vistos após a reação de Feulgen. Os cromocentros desses núcleos (heterocromatina constitutiva) sofrem um processo de dissolução ou descompactação. Paralelamente, determinações citofotométricas revelaram alterações nos padrões de distribuição dos valores Feulgen-DNA de tais núcleos. Há que se relatar ainda, um notável aumento no volume de seus nucléolos. Os próprios núcleos também sofrem modificações na forma e aumento de volume porém, de natureza mais discreta. Além das alterações hepáticas, desenvolveram-se tumores malignos primários nos pulmões. De fato, todos os animais que completaram os seis meses de tratamento, mostravam tumores pulmonares. Os mesmo foram classificados como adenocarcinomas oriundos, provavelmente, do epitélio de pequenos bronquíolos. A análise citofotométrica de dois desse tumores revelou a ocorrência de processos de poliploidização no parênquima tumoral. Os dados são discutidos com base em achados recentes à respeito da ação bioquímica de DMN e sua relação com o aparecimento do câncer. Valemo-nos também do conceito de ¿stem line cell¿ (Makino, 1957) para interpretação de certos achados citofotométricos Abstract: Ninety one mice (42 males and 49 females) received dimethylnitrosamine (DMN) in the drinking water, ¿ad libitum¿ during six months. The concentration of DMN in the water varied from: a) 17 ppm (parts per million) during the first month to, b) 10,6 ppm during the other five months. DMN produces several changes in hepatocyte nuclei, as seen by Feulgen¿s reaction. Dissolution of its chromocenters (constitutive heterochromatin) is one of the alterations described. There is also a considerable increase in nuclear and nucleolar volumes (especially in the last one). Simultaneously, cytophotometric measurements revealed modifications in the distribution patterns of Feulgen-DNA values of these nuclei. Besides the hepatic modification, DMN caused the development of primary malignant tumors in the lungs. Actually, all the animals that survived to 6 months of treatment, showed lung tumors. They were classified as adenocarcinomas derived from outgrowths of the epithelium of small bronchioles. Cytophotometric analysis performed in two of these tumors showed the occurrence of polyploidy in tumoral parenchyma. The data are discussed in view of recent findings concerning DMN mode of action and cancer development. Makino¿s stem line cell theory which has important implications for tumor therapy, is also discussed. Mestrado Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores : Paulo Cesar Rodrigues Palma, Benedicto de Campos Vidal Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A insuficiência esfincteriana intrínseca da uretra é uma das causas freqüentes de incontinência urinária de esforço na mulher, sobretudo no período pós-menopausa. As opções de tratamento desta condição incluem os "slings", os esfincteres artificiais e as injeções periuretrais. No desenvolvimento do material ideal para a injeção periuretral, foram propostos, entre outros, a pasta de teflon, o colágeno bovino purificado, os balões de silicone e o tecido adiposo autólogo. Como vantagens sobre os demais, este último apresenta: facilidade de obtenção, biocompatibilidade e baixo custo. No entanto, a absorção de parte do tecido adiposo injetado continua representando um problema, que implica na realização de injeções repetidas para aumentar a possibilidade de se alcançar o resultado desejado. A influência do estrógeno sobre o trato urinário feminino foi bem estabelecida na literatura, particularmente sua ação no trofismo uretral e no suprimento sangüíneo aos vasos do trígono e da submucosa uretral. O presente estudo experimental foi desenvolvido com base nestas evidências, para verificar a influência da hipoestrogenia (induzi da artificialmente através de ooforectomia bilateral) sobre os aspectos anatomopatológicos e histométricos do enxerto de tecido adiposo autólogo periuretral. O conhecimento deste fenômeno pode ser útil para determinar a aplicabilidade clínica da reposição estrogênica previamente à lipoinjeção periuretral. A lipoinjeção periuretral foi realizada em dois grupos de 14 coelhas (cada um) albinas adultas e isogênicas (peso médio de 3,85 quilogramas). Após 120 di~ de observação, os animais foram sacrificados para o estudo dos aspectos anatomopatológicos e histométricos do enxerto de tecido adiposo. Em um dos grupos (denominado grupo 1) realizou-se a ooforectomia bilateral 120 dias antes da lipoinjeção periuretral. A análise microscópica avaliou de forma qualitativa a presença de: exsudato inflamatório linfomonocitário e granulomatoso, áreas de fibrose cicatricial, acúmulos de gordura extracelular e septos conjuntivos no interior do enxerto. Os resultados obtidos nos dois grupos foram comparados através do teste de Mann- Whitney. Por meio de técnicas histométricas, os dois grupos foram analisados de forma comparativa, tomando por parâmetros a trimédia das áreas dos adipócitos e a densidade dessas células (número de adipócitos por 104 !J.m2) em uma amostra do enxerto de cada animal. Os mesmos parâmetros mbém foram estudados em amostras do tecido adiposo pélvico que serviu de sítio doador, a fim de permitir, em cada animal, a análise da evolução do tecido enxertado. Foi empregado o teste de Wilcoxon pareado nas comparações realizadas entre o enxerto de tecido adiposo e o respectivo tecido adiposo pélvico de um mesmo animal. Para as comparações entre os dois grupos foi utilizado o teste de Mann-Whitney. Em todos os testes foi fixado em 5 % o nível de rejeição da hipótese de nulidade. Não foram encontradas diferenças macroscópicas significantes nos enxertos de tecido adiposo entre os grupos. Também não foram verificadas diferenças significativas, entre os grupos, na freqüência de todos parâmetros microscópicos estudados. Foram verificados focos de infiltrado inflamatório linfomonocitário (p=O,228), acúmulos de gordura extracelular (p=O,432) e septos conjuntivos no interior dos enxertos (p=O,694) na maior parte dos animais, em ambos os grupos. Em todos animais foi observada reação granulomatosa do tipo corpo estranho, com fagocitose de parte da gordura injetada (p=O,455), enquanto áreas de fibrose cicatricial foram menos frequentes e, em geral, de leve a moderada intensidade (p=O,545). Na análise histométrica dos enxertos de tecido adiposo não foram encontradas diferenças significativas na distribuição das trimédias das áreas celulares dos adipócitos (p=O,696) e na densidade de adipócitos (p=O,183) entre os dois grupos estudados. Os resultados permitiram concluir que a ooforectomia não determinou diferenças significantes na vitalidade do enxerto de tecido adiposo autólogo periuretral em coelhas, de acordo com os parâmetros anatomopatológicos e histométricos estudados. Isto permite inferir que a terapia de reposição estrogênica neoadjuvante não causaria benefícios significativos na integração deste tipo de enxerto Abstract: Intrinsic sphincteric insufficiency is a common cause of urinary stress incontinence in women, especially during the post-menopausal period or when these have been previous surgi cal attempts to correct incontinence. The treatment for this problem includes "slings", artificial sphincters and periurethral injections. In the search for an ideal bulk-enhancing material, several clinical trials have tested the use of teflon paste, highly purified cross-linked bovine collagen, silicon balloons and autologous fatty tissue. Fatty tissue has several advantages, including it is ready availability and biocompatibility. However, the absorption of part of the injected fat is a problem that still has to be solved. The effect of estrogen on the female lower urinary tract, especially its action on the blood supply to submucosal vessels of the trigone and urethral submucosa, is well known. In this study we examined the effect of hypoestrogenism induced through bilateral oophorectomy, on the histopathological and histometric aspects of periurethral grafting with autologous adipose tissue. Such information may be useful fOF establishing the clinical applicability of estrogen reposition prior to periurethrallipoinjection. The study was done in two groups of 14 female isogenic New Zealand rabbits (mean body weight 3,8 kg) in which fatty tissue was injected in the bladder neck and proximal urethra. AlI the animaIs were observed for 120 days and then sacrificed for histopathological and histometric analysis of the adipose tis sue graft. One of the groups (group 1) underwent bilateral oophorectomy 120 days before the lipoinjection. The injected fatty tissue acquired an elliptical shape in all grafts, with no significant macroscopic differences between the groups. Histopathological analysis showed no significant differences between the groups, with both showing a chronic lymphomonocytic inflammatory response and the accumulation of free extracellular fat in most of the animals. AlI grafts developed a chronic granulomatous inflammatory response and a mild to moderate fibroblast reaction inside the grafts. Comparison of the histopathological findings of the two groups by the Mann-Whitney test showed that there were no significant differences between them. Histometric evaluation included the tri-median of the adipocyte areas and the density of these celIs (number of adipocytes per 1 04 ~m2) in a graft sample from each rabbit. The progress of the grafted tissue in each rabbit was assessed using the same parameters calculated for pelvic adipose tissue samples from the donor site. The Wilcoxon test was used to compare the adipose tissue of the graft and the respective adipose pelvic tissue of the same animal. The Mann-Whitney test was used to compare the two groups. The rejection leveI for the nulI hypothesis was fixed at 5% for alI tests. Histometric analysis of the adipose tissue grafts in the two groups showed no significant differences in the distribution of the adipocyte celIular areas (p=O,696) or in the density ofthe adipocytes (p=O,183). These results indicate that oophorectomy did not affect the outcome of the autologous adipose tissue graft integration. They also suggest that neoadjuvant estrogen replacement therapy has no benefits on the late outcome of autologous adipose tissue grafts Doutorado Cirurgia Doutor em Cirurgia

Orientador: Benedicto de Campos Vidal Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: o presente trabalho é composto de dois estudos, o primeiro que trata a respeito da análise da morte celular por apoptose em células fibroblásticasem culturas confluentes e o segundo, sobre a influênciado substrato à base de colágeno tipo I hiperpolimerizado no crescimento e apoptose de células fibroblásticascultivadas por longo período. As células BHK21 em apoptose, submetidas à reação de Feulgen e a seguir à análise de imagem, demonstraram menor conteúdo de DNA, representado pela diminuição dos valores de IOD (densidade óptica integrada). Após a reação de ConcanavalinaA (Com A), os núcleos apoptóticos exibiram uma maior positividade de reação que os núcleos normais, o que demonstra a presença de glicoproteínas, possivelmente da matriz nuclear, rearranjadas e complexadas ao DNA do núcleo apoptótico. O arranjo ordenado da complexação de glicoproteínas ao DNA foi confirmado através de coloração com ATCEC (azul de toluidina-concentração crítica de eletrólitos), a qual diferencia DNA de RNA, seguida por observação em microscopia de polarização. Células fibroblásticasV79, submetidas à reação de Feulgen e estudadas por análise de imagem, mostraram em culturas confluentes três fenótipos diferentes classificados como normal, suspeito de apoptose e apoptótico. Tal classificação foi feita aliando análise morfológica e avaliação de parâmetros como conteúdo de DNA (IOD), condensação cromatínica em termos de densidade óptica e medidas de área nuclear. Nossos resultados revelaram que a condensação cromatínica aumentou quando comparados os três fenótipos entre si. Foi observado decréscimo nos valores Feulgen-DNA em células apoptóticas e em células suspeitas de apoptose, revelando-se perda de DNA. Em conclusão, destacou-se a importância do método utilizado para caracterizar fases iniciaisdo processo apoptótico e a possibilidade de diagnóstico inequívoco de apoptose, ao utilizar esta metodologia, desde que associada a outras, quer citoquímicas, imunocitoquímicasou bioquímicas. No último estudo, células fibroblásticas V79 foram cultivadas em substrato de colágeno tipo I hiperpolimerizado. Este substrato apresenta características especiais de auto-agregação e é uma estrutura ordenada que mimetiza a estrutura apresentada pelos tendões in vivo. O cultivo celular de longa duração sobre este substrato foi caracterizado por análise de proliferação, diferenciação e morte celular por apoptose, comparado ao crescimento das células sobre lamínulas. A reação de Feulgen, associada à análise de imagem demonstrou que as células apresentaram um aumento no conteúdo de DNA e da condensação cromatínica quando crescidas em substrato colagênico. A proliferação das células V79 sobre colágeno foi menor, refletindo uma fase de latência neste substrato e após o método de TUNEL, específico para detecção de apoptose, observou-se que a morte celular ocorria, porém em tempos de cultivo superiores aqueles observados para células que cresceram sobre lamínula. Demonstrou-se que o substrato colagênico altera o desenvolvimento proliferativo e metabólico dos fibroblastos, características que sugerem a diferenciação celular, e também atrasa, mas não previne o processo apoptótico Abstract: matrix which were disorganized and complexed to the DNA of apoptotic nuclei. The ordered arrangement of glycoproteins on the DNA was confirmed by TB-CEC (Toluidine blue-critical electrolyte concentration) which diferentiatesDNA ftom RNA after polarization mycroscopy analyses. V79 fibroblast cells submitted to the Feulgen reaction and image analysis of confluent cultures showed three different nuclear phenotypes classified as normal, suspected of apoptosis and apoptotic. This classification were done using morphological analysis and consideration of parameters such as DNA content (IOD), chromatin condensation in terms of optical density (OD) and nuclear area. The results showed that chromatin condensation increased when the three phenotypes were compared. A decrease of Feulgen-DNA values was observed in apoptotic cells and in cells suspected of apoptosis, revealing loss of DNA. In conclusion, this pointed out the importance of this method to characterized early phases of an apoptotic process and the possibility of inequivocal apoptosis diagnosis using this methodology when associated with others, such as cytochemical, immunocytochemical or biochemicalmethods. In the other aprroach, V79 fibroblastic cells were cultured on hyperpolymerized collagen type I substrates. The substrate showed special characteristics of self-assemleyand is an ordered structure that mimics the in vivo tendon. The long-term cell culture on this substrate was characterized by proliferation, differentiation and cell death by apoptosis analysis when compared to cell growth on coverslips. The Feulgen reaction allied to image analysis demonstrated that there is an increase in DNA content and in chromatin condensation when the cells are grow on the collagen substrate. The proliferation of V79 cells on collagen was less than observed for cells grown on a coverslips, which reflects the latency of this substrate. After the apoptosis specific TUNEL method, cell death was found to occur after longer culture periods than for cells grown on coverslips. The collagen substrate alters fibroblast proliferation and morphological aspects, characteristics that suggest cellular differentiation and the delay of apoptosis but not prevent the prevention of the apoptotic processo Doutorado Bioquímica Doutor em Ciências Biológicas

Orientador : Benedicto de Campos Vidal Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Farmacia e Odontologia de Piracicaba Doutorado

Orientador : Benedicto Campos Vidal Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O íon AI3+ é um agente tóxico relacionado-s com a baixa produtividade agrícola de cereais em solos ácidos e com doenças degenerativas em animais. O objetivo deste trabalho foi examinar os- efeitos tóxicos do A13+ em plantas de milho sensíveis e tolerantes ao AI3+ e - também em células animais em cultura. Foi verificada a ligação do AI3+ com o DNA,causando neste uma perda de viscoelasticidade e a formação de precipitados cuja morfologia variou em consequência à quantidade de DNA e AI3+ disponíveis. Um modelo de interação AI-DNA foi proposto com base nos resultados obtidos neste trabalho. A análise das paredes celulares vegetais demonstrou a existência de uma maior disponibilidade de radicais aniônicos em plantas sensíveis ao Af+ do que em plantas tolerantes ao íon. Um aumento da birrefringência das paredes em plantas sensíveis ao Al3+foi observado após tratamento com AICh. Isto foi confirmado por microscopia de força atômica em membranas de celulose de Acetobacter xy/inum desenvolvidas em meio contendo AI3+. A composição do revestimento extracelular da raiz foi determinada como sendo principalmente de celulose. Nossos resultados indicam que a parede celular é capaz de influenciar a tolerância da plaritaaoAI3+. Em plantas sensíveisaoAI3+, o cátion-desencadeou um processo de morte celular nas raízes, levando à inibição permanente de seu crescimento. A morte destas células apresentou características típicas de apoptose, mas não a fragmentação ordenada da cromatina. Isto sugere a existência de mecanismos alternativos de morte celular em vegetais. Em células animais, a morte celular foi observada em consequência da presença de AICh em concentrações variando de 10-8 M a1ey-3 M.Contudo, a ocorrência deapoptosesedeuc:ipenas em [AICbl

Orientador: Benedito de Campos Vidal Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba Resumo: Não informado Abstract: Not informed. Doutorado Doutor em Odontologia

Orientadores: Cássio Luís Zanettini Riccetto, Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculade de Ciências Médicas Resumo: Introdução: A incontinência urinária é um problema de saúde muito prevalente, afetando entre 10% a 50% das mulheres em algum momento de sua vida, causando morbidade social e redução na qualidade de vida. Nas mulheres entre 40-59 anos a incontinência urinária de esforço é mais frequente e naquelas acima de 60 anos a urge-incontinência é mais prevalente. A mudança de padrão de incontinência com o aumento da idade pode sugerir que o envelhecimento em geral e as alterações fisiológicas decorrentes deste processo possam contribuir com a sua patogênese. Há vários anos foi demonstrado que os tecidos originados do seio urogenital são sensíveis aos hormônios sexuais, principalmente o estrógeno. Recentemente, tem surgido importante interesse no uso da suplementação de andrógenos nas mulheres. Embora existam significativos interesses nas aplicações clínicas dos andrógenos em mulheres, não se sabe exatamente como se dá a atuação destes hormônios no assoalho pélvico e trato urinário inferior. Objetivo: Analisar o efeito da suplementação de metiltestosterona sobre as propriedades anisotrópicas das fibras musculares e colágenas periuretrais de ratas. Métodos: Foi realizado um estudo experimental com 30 ratas que foram divididas em dois grupos: 15 ratas submetidas a suplementação de metiltestosterona por 60 dias e 15 ratas controles. Posteriormente foi removida a bexiga, uretra e região perineal em bloco. A região periuretral foi analisada através de microscopia de polarização, com quantificação da birrefringência das fibras musculares e colágenas. Resultados: A densidade média de brilho da musculatura, no grupo controle foi de 65,3070. No grupo com suplementação de testosterona foi 84,7624, portanto com diferença estatisticamente significativa (p =0,006). Quanto às medidas da birrefringência do colágeno periuretral nos grupos controle e com suplementação de testosterona, foram obtidas com mediana de 95,9436 no controle e a mediana foi de 100,8646 no grupo com testosterona, com diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos avaliados, com p = 0,005. Conclusão: O uso de testosterona promoveu um aumento nos valores de birrefringência das fibras colágenas e musculares periuretrais de ratas submetidas a suplementação de metiltestosterona quando comparadas com o grupo controle Abstract: Introduction: Urinary incontinence is a prevalent health problem, affecting between 10% and 50% of women at some point in their lives, causing social morbidity and reduced quality of life. Among women between 40-59 years of age, stress urinary incontinence is more frequent and in those above 60 years of age urge incontinence is more prevalent. The changing pattern of incontinence with increasing age may suggest that the aging process and the physiological changes resulting from this process may play a role in its pathogenesis. It has been shown for the last years that the tissues derived from urogenital sinus are sensitive to estrogen. Recently, there has been significant interest in the use of androgen supplementation in women. Although there is significant interest in clinical applications of androgens in women, it is not known exactly how occurs the action of these hormones in the pelvic floor and lower urinary tract. Objective: To analyze the effect of methyltestosterone supplementation on the anisotropic properties of the periurethral collagen and muscle fibers of rats. Methods: We conducted an experimental study with 30 female rats that were divided into 2 groups: 15 rats subjected to supplementation of methyltestosterone for 60 days and 15 control rats. Bladder, urethra, and perineum were removed en block after sacrifice. The periurethral region was analyzed by polarized light microscopy with quantification of the birefringence of muscle and collagen fibers. Results: The mean density of brightness of the muscles in the control group was 65.3070. In the group with testosterone supplementation was 84.7624, so the difference was statistically significant (p = 0.006). The measurements of birefringence of periurethral collagen fibers in control and testosterone groups were obtained with a median of 95.9436 in control and 100.8646 in the testosterone group, with statistically significant difference between them, with p = 0.005. Conclusion: The use of testosterone promoted an increase in the values of birefringence of periurethral collagen fibers and muscle tissue of rats submitted to methyltestosterone supplementation when compared with the control group Mestrado Fisiopatologia Cirúrgica Mestre em Ciências

Orientadores: Cássio Luís Zanettini Riccetto, Benedicto de Campos Vidal Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Introdução: O material sintético (tela) mais utilizado atualmente no tratamento da Incontinência Urinária de Esforço (IUE) e dos prolapsos da parede vaginal, também conhecidos como Prolapsos dos Orgãos Pélvicos (POP) é o polipropileno monofilamentar, com índices de cura de até 90%. Porém, as complicações relacionadas à integração tecidual desses implantes são relativamente prevalentes. O colágeno, por ser um material biologicamente compatível, pouco imunogênico e com propriedades moduladoras do processo inflamatório, pode ser utilizado como um importante agente cicatrizante e, nesse sentido, poderia melhorar a integração das telas. Objetivo: Estudar os efeitos biomecânicos e histológicos do recobrimento de tela de polipropileno monofilamentar com gel purificado de colágeno, implantadas no tecido subcutâneo de ratas. Material e Métodos: Vinte ratas foram utilizadas para o estudo histológico e outras 20 para o estudo biomecânico. De um lado da parede abdominal do animal foi implantado um fragmento tela de polipropileno monofilamentar macroporosa medindo 20 x 10 mm, habitualmente utilizada no tratamento da IUE e dos POP (Grupo I), denominada PLP (tela de polipropileno) e do outro lado foi implantada uma tela com as mesmas dimensões recoberta com gel purificado de colágeno (Grupo II), denominada PLP+C (tela de polipropileno recoberta com o gel purificado de colágeno). De acordo com o tempo de eutanásia (7, 30, 90 ou 180 dias) após o implante os animais de cada grupo foram divididos em quatro subgrupos contendo cinco animais cada. Foi então realizada excisão em bloco da parede abdominal para as análises. O estudo biomecânico foi realizado em um tensiômetro de precisão, no qual a tela era tracionada em sentido uniaxial até que se desprendesse da interface tecidual. Para quantificar a aderência do material, em cada grupo, foi analisada a carga máxima necessária para este desprendimento. No estudo histológico foram analisadas as características relativas à inflamação aguda e crônica além do tecido de granulação, formação de granuloma e reação de corpo estranho em lâminas coradas com Hematoxilina-Eosina (HE), utilizando-se de método semiquantitativo. A organização supramolecular da deposição colágena em torno das telas foi estudada através de microscopia de polarização (birrefringência). Resultados: No estudo biomecânico observou-se que a aderência das telas de polipropileno aos tecidos circunvizinhos aumentou significativamente após o recobrimento com o gel purificado de colágeno, como demonstrado na análise dos valores encontrados para a Carga Máxima no 7º (p=0,0016), 14º (p=0,0039), 90º (p=0,0009) e 180º (p=0,0029) dias após o implante. Considerou-se nessa pesquisa, que o aumento da biocompatibilidade da tela de polipropileno seria alcançado quando, na interface tecidual, houvesse redução da intensidade do processo inflamatório. Verificou-se que a resposta inflamatória crônica e aguda (neutrofílica), assim como a formação de tecido de granulação foi menos intensa, respectivamente p=0,004, p

Orientador: Cássio Luís Zanettini Riccetto, Benedicto de Campos Vidal Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Introdução: O aumento da expectativa de vida elevou o risco da necessidade de cirurgia para o tratamento dos prolapsos de órgãos pélvicos (PO) em mulheres, principalmente no período pós-menopausa. Os distúrbios ocasionados pelos POP afetam a qualidade de vida, ao estabelecer alterações na sexualidade, função urinaria e intestinal. Neste cenário, o uso das telas ganhou popularidade. Embora as telas de polipropileno sejam consideradas um bom material para restaurar o assoalho pélvico, diminuindo o tempo cirúrgico e a dor pós-operatória, existem preocupações quanto à infecção e exposição da tela. Objetivos: Estudar as características da deposição colágena associada aos implantes subcutâneos de telas de polipropileno revestidas por biomembrana de colágeno de submucosa intestinal suína (BMSS) em ratas, e descrever as características da reação inflamatória local. Material e Métodos: 30 ratas fêmeas foram divididas em três grupos conforme a data de eutanásia (7º; 14º, e 28º pós-operatório). Foram implantadas no subcutâneo abdominal destes animais um segmento de tela de polipropileno revestida com colágeno à direita e outro segmento de tela não revestida no lado esquerdo. O material foi fixado em HE e analizado no microscópio de polarização Olympus BX51 e acoplado ao software image Pro plus 6.0 para estudar as propriedades anisotrópicas do colágeno e as características da reação inflamatória local. Resultados: 7ºPO: A biomembrana induziu intensa proliferação vascular, vasodilatação, infiltração de linfocitos e proliferação fibroblástica. No subgrupo da tela de polipropileno isolada notaram-se predomínio de células com aspecto histiocitário e células gigantes. 14ºPO: No subgrupo da biomembrana persistiu o infiltrado predominantemente linfocitário semelhante ao 7ºPO. Não ocorreram alterações expressivas na intensidade da deposição colágena, persistiu o aspecto de congestão vascular. No subgrupo do polipropileno isolado, observou-se alguma proliferação fibroblástica em torno dos filamentos de polipropileno, além de células gigantes achatadas pelo envoltório de colágeno e fibroblastos, mantendo pouco infiltrado linfocitário, em relação à tela recoberta pela biomembrana. 28º PO: No subgrupo da biomembrana de colágeno observou-se intensa deposição colágena com diminuição do infiltrado linfocitário e presença de mononucleares histiocitários. No subgrupo da tela de polipropileno isolada evidenciaram-se células gigantes as quais apresentavam tendência de envolver o polímero, além de menor infiltrado fibroblástico em comparação ao grupo recoberto com a biomembrana. Conclusão: A tela de polipropileno revestida pela BMSS evidenciou resolução precoce da inflamação, melhor neoangiogênese e deposição colágena melhor organizada do que a tela não revestida. Isto pode representar um vantagem em segmentos clínicos se estes resultados experimentais puderem ser reproduzidos em outros estudos Abstract: Introduction: The raise of expectance of life has brought an increase of women which will underwent pelvic organ prolapse (POP) surgery, mainly in the post menopause period. The distress caused by POP affects women's quality of life, as it alters their sexuality, urinary and bowel functions. In this scenario, the use of meshes is gaining popularity worldwide. Although polypropylene mesh (PM) is considered a good material to restore the pelvic floor, decreasing operative time and post-operative pain, there are concerns about infection and vaginal mesh exposure. Objetives: To study the characteristics of collagen deposition related to covering subcutaneous implants of monofilament polypropylene mesh in rats with purified suine collagen biomembrane and to describe the characteristics of the local inflammatory reaction. Methods: Thirty female rats were shared in three groups according to the euthanasia's day (7º; 14º, 28º post-operative day). Polypropylene meshes were implanted at abdominal subcutaneous, on the right side the mesh covered by a collagen biomembrane and on the left side a non covered PM. The material were stained with HE and analyzed with Olympus BX51 polarized microscope and image Pro plus 6.0 software to study the collagen anisotropic properties and inflammatory reaction. Results: In the 7º PO the CM group showed vascular proliferation and intense infiltration of lymphocytes and fibroblasts. The PM without CM group presented a intense histiocytary infiltrate and a mild fibrosblastic reaction and angiogenesis. At the 14º PO, the group A maintained a similar lymphocytic infiltrate which was observed at the 7º PO, without expressive alterations in the degree of fibroblastic reaction and collagem deposition. In the group B, there was a intense fibroblastic reaction surrounding the PM. Also, there were multinucleated giant cells crushed by a wrap of collagen and fibroblasts. In the 28º PO, the group A revealed an intense fibroblastic reaction process and collagen deposition. In contrast, in the group B, it is observed that the multinucleated giant cells tried to wrap up the polypropylene, and there were a decrease of fibroblastic reaction in comparison to the PM with CM group. Conclusions: PM covered with a purified porcine collagen membrane showed earlier resolution of inflammatory reaction, better neoangiogenesis and more organized host collagen deposition than in pure PM. This can represent an advantage in clinical setting if these experimental results proved to be reproducible in other trials Doutorado Fisiopatologia Cirúrgica Doutor em Ciências da Cirurgia

Orientadores: Benedicto de Campos Vidal, Sergio Rocha Piedade Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A relação estrutura-função tem sido abordada em diversos estudos de tecidos colagenosos, como o tendão. É conhecido, que dependendo do tipo de força aplicada, uma composição e organização molecular específica, com características morfológicas peculiares podem ser observadas. Tendões comportam-se viscoelasticamente, sendo esta propriedade estudada através de análise biomecânica, na qual está diretamente relacionada com a organização dos componentes teciduais. Com isso, os objetivos do presente trabalho foram descrever a importância dos componentes não-colagênicos na propriedade viscoelástica de tendões e verificar possíveis alterações na organização e no arranjo dos componentes da matriz extracelular nos tendões após os ensaios de tensão. Tendões de frangos foram escolhidos como modelo experimental já que apresentam um comprimento viável para ensaios de tensão, além de possuírem peculiaridades em sua composição e organização molecular. Tendões flexores digitais superficiais foram dissecados e distribuídos em: grupo I (não-tratados), grupo II (tendões tratados com hialuronidase testicular) e grupo III (tendões tratados com papaína). Parâmetros dimensionais como peso, espessura, largura e área seccional transversa foram mensurados. Os tendões foram preservados em solução fisiológica até sua utilização nos ensaios. Após os ensaios, eles foram fixados, incluídos em parafina e encaminhados para análises morfológicas, histoquímicas e microespectrofotométricas. Os ensaios do grupo I mostraram maiores valores de tensão, energia elástica e módulo de elasticidade do que os dos grupos II e III. Ao contrário, valores de deformação foram maiores para o grupo II, indicando que, após o tratamento enzimático, os tendões perderam sua capacidade de resistir a forças tensionais e sugere a participação de componentes não-colagênicos nesta função. Análises histoquímicas confirmaram a remoção dos componentes não-colagênicos nos grupos II e III. Ainda, curvas de absorção espectral foram obtidas em cortes de tendões não submetidos a ensaios e do grupo I (não-tratado com enzimas, porém estirado) corados com azul de toluidina e ponceau SS. Em cortes de tendões do grupo I corados com azul de toluidina, dois picos de absorção foram observados, enquanto em cortes de tendões não submetidos a ensaios foi observado apenas um pico. Com isso, pode-se considerar que o grupo negativo dos glicosaminoglicanos disponíveis quando o tendão encontrava-se não-tensionado tornaram-se menos disponíveis quando o tendão foi estirado. Cortes de tendões corados com ponceau SS demonstraram um pico de absorção e cortes do grupo I apresentaram altos valores de absorbâncias. A deformação de materiais envolve diversos mecanismos, como o desaparecimento de crimps. Essa alteração morfológica explicaria tanto a não disponibilidade dos grupos negativos de glicosaminoglicanos quanto o alto valor de absorbância detectado em cortes do grupo I corados com ponceau SS. Em conclusão, os componentes dos tendões são estruturas dinâmicas, altamente organizadas e orientadas, que são capazes de se rearranjarem quando tensionados. Mais ainda, esses componentes não-colagênicos são fundamentais para a integridade funcional dos tendões Abstract: The structure-function relationship has been shown in several works regarding collagenous tissues, such as tendon. It is known that different loads can alter composition, molecular organization and morphological characteristics. Tendons present viscoelastic behavior and this characteristic is studied by biomechanical analyses and is directly related to tissue component organization. The aim of this work was to describe the importance of noncollagenous components on tendon viscoelasticity by analyzing changes in the organization and arrangement of extracellular matrix constituents and, consequently, changes in tendon morphology after mechanical tests. Chicken tendons were chosen due to their organization and composition; besides presenting a good length for mechanical tests. Superficial digital flexor chicken tendons were dissected and distributed into 3 groups: group I, non-treated; group II, tendons treated with testicular hyaluronidase; and group III, tendons treated with papain. Then, dimensional parameters, such as weight, width, thickness and cross-sectional area, were measured. The tendons were preserved in physiological solution until use in the mechanical tests. During the mechanical tests, they were tensioned and immediately afterwards were fixed and processed for morphological and histochemical analyses. The mechanical test results of groups II and III showed decreased ultimate tensile strength, elastic energy and elasticity modulus values, when compared with group I. In contrast, the ultimate strain values were highest for group II, indicating that after enzymatic treatment the tendons lost their capacity to resist tensile forces. Groups II and III presented different deformations in comparison with group I. Histochemical analysis confirmed the removal of the noncollagenous components in groups II and III. Spectral absorption curves were obtained for the non-stretched and group I tendon sections (non-treated to enzyme, but stretched) stained with toluidine blue and Ponceau SS. In group I sections stained with toluidine blue, two absorption peaks was observed, while in the non-stretched sections only one absorption peak was observed. Negative groups of GAGs available in non-stretched tendon sections most likely became unavailable in stretched tendons sections. Sections stained with Ponceau SS showed one absorption peak and group I sections showed the highest absorbancy values. Deformation of tendinous materials could involve a number of mechanisms, like collagen uncrimping. Collagen uncrimping could be involved in the unavailable of negative GAG groups and the highest absorbancy values in group I sections stained with Ponceau SS. In conclusion, tendon component constituents are dynamic, highly organized and oriented structures capable of rearranging during stretching. Moreover, the noncollagenous components are fundamental to tendon functions Doutorado Histologia Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Benedicto Campos Vidal Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Tecido pericardial tem sido utilizado na confecção de biopróteses empregadas na reparação de diferentes lesões. Entretanto, calcificações e falência mecânica têm sido as principais causas de durabilidade limitada de biopróteses cardíacas fabricadas com pericárdio bovino. Nesse trabalho foi realizado um estudo do pericárdio fibroso porcino em sua estrutura microscópica e sua natureza bioquímica. A morfologia geral e a arquitetura das fibras colágenas e elásticas foram estudadas em tecido seccionado e também em montagens totais, corados por diferentes métodos histoquímicos e analisados em microscopia de luz convencional, de polarização, de fluorescência e confocal. O estudo bioquímico da matriz pericardial foram realizados de acordo com procedimentos bioquímicos pertinentes. O pericárdio mostrou-se um tecido altamente celularizado com características de tecido jovem. Os feixes colagênicos apresentaram-se arranjados em camadas multidirecionalmente orientadas, formando uma rede de trama fechada, com um número maior de fibras orientando-se obliquamente, partindo da região central inferior em direção súpero-lateral esquerda em relação ao coração. Uma discreta predominância de fibras colágenas no sentido base-ápice foi verificada na região anterior direita do pericárdio. A matriz extracelular apresentou-se pouco metacromática. Observaram-se finas fibrilas elásticas intimamente associadas às fibras colágenas, entrelaçadas em direções diversas ou paralelas entre si. Extração comparativa de componentes da matriz não revelou diferenças entre proteínas extraídas das regiões direita e esquerda e também entre material fresco e congelado. A análise em SDS-PAGE revelou dezesseis proteínas com valores de massa molecular aparente entre 11 e 109 kDa. Análises realizadas sugerem que o GAG encontrado possivelmente é o dermatam sulfato. Os dados obtidos podem subsidiar novos procedimentos direcionados à obtenção de biomembranas melhor preparadas e funcionalmente mais adequadas à construção de biopróteses. Abstract: Pericardial tissue has been used to construct bioprostheses employed in the repair different kinds of injuries. However, calcification and mechanical failure have been the main causes of limited durability of cardiac bioprostheses constructed with bovine pericardium. In the course of this work a study has been conducted on the porcine fibrous pericardium and its microscopic structure and its biochemical nature. The general morphology and the architecture of the collagen and elastic fibers have been studied in sectioned tissue and also total assemblies, stained by diverse histochemical methods and analyzed by conventional light, polarizing light, fluorescence and confocal microscopy. Biochemical study of the pericardial matrix was conducted according to pertinent procedures. The pericardium was shown as a highly cellularized tissue with a vascular tree very ramified and collagen fibers arranged in multidirectionally oriented layers. A predominant direction was verified, with a larger number of fibers obliquely oriented, starting at the lower central region towards high-lateral-left relatively to the heart. A discreet predominance of collagen fibers is the base-apex direction was verified in the right-front region of the pericardium. Extracellular matrix with little metachromasy was observed, indicating small quantities of acid glycosaminoglycans. Fine elastic fibrils were observed, intimately associated to collagen fibers, interlaced in various directions or parallel to themselves. No differences were found between proteins extracted from the right or left regions and between fresh or frozen material. The quantities of extracted GAGs were too small to be detected by the method used. The SDS-PAGE showed proteins with values of apparent molecular mass between 11 and 109 kDa included two polydisperse bands around 71 and 85kDa. The ectrophoretic analysis showed that the found GAG is possibly dermatan sulfate. Doutorado Histologia Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Edson Rosa Pimentel, Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As cúspides da valva aórtica são constituídas principalmente de água (cerca de 80%), mas também contém proteínas colagênicas e não colagênicas, elastina, pequenos e grandes proteoglicanos, responsáveis por suas propriedades mecânicas. Estruturalmente são formadas por três camadas distintas, a fibrosa, a esponjosa e a ventricular. As camadas fibrosa e ventricular mantém a integridade estrutural da valva, enquanto a esponjosa tem papel importante na absorção de forças mecânicas de tensão e compressão. As valvas aórticas de porco têm sido utilizadas para a produção de biopróteses, mas sua durabilidade tem sido prejudicada especialmente devido à calcificação, o que justifica a necessidade de um melhor conhecimento sobre seus aspectos organizacionais e composicionais. A montagem total dos folhetos valvares corados com azul de toluidina, mostrou uma estrutura fortemente corada, com componentes fibrosos e material metacromático acompanhando estes componentes. Estes componentes fibrosos emergiam das regiões de inserção da valva na parede da artéria, de ambos os lados do folheto e exibiram um trajeto preferencialmente longitudinal, seguindo o eixo mais longo do folheto. A análise em microscopia de polarização mostrou brilho intenso exibido pelas fibras e fibrilas evidenciando a distribuição altamente orientada dessas estruturas. A metacromasia foi intensa ao longo dos feixes de colágeno e em várias regiões distribuídas de maneira não uniforme no folheto. Análise de cortes histológicos mostrou as três camadas bem distintas do folheto, sendo duas fibrosas e uma intermediária com características de tecido conjuntivo frouxo. Os folhetos apresentaram grande quantidade de células com diferentes morfologias e distribuição, enquanto que, nas faces voltadas para a artéria aorta e para o ventrículo, foi encontrada uma camada endotelial. Na camada fibrosa as células são alongadas, denominadas de fibroblastos, e apareceram dispostas ao longo dos feixes de colágeno. A camada ventricular apresentou células arredondadas, similares aos condrócitos. Na camada esponjosa foram encontrados os dois tipos celulares. O estudo bioquímico mostrou a presença de proteínas não colagênicas que apresentaram massa molecular aparente entre 18 - 170kDa. Uma banda polidispersa em torno de 70kDa e outra na faixa de 80 a 100kDa possivelmente correspondam aos pequenos proteoglicanos fibromodulim e decorim, além da presença de proteoglicano de alto peso molecular. Condroitim sulfato e dermatam sulfato são os principais glicosaminoglicanos presentes nesse folheto. Analizando os dados morfológicos e bioquímicos, podemos concluir que: 1) Pequenos e grandes proteoglicanos estão presentes na matriz extracelular da valva aórtica. 2) Os proteoglicanos estão preferencialmente distribuídos no folheto em certas regiões, devido a presença de intensas forças compressivas nestas regiões. 3) Feixes de colágeno estão distribuídos ao longo do maior eixo do folheto que se fundem formando uma estrutura entrelaçada para fornecer a sustentação da valva durante a sístole e a diástole Abstract: The cuspids of the aortic valve are constituted mainly by water (approx. 80%), but also by collagen and noncollagenous proteins, elastin and proteoglycans, which are responsible for their mechanical properties. Structurally are formed by fibrous, spongeous, and ventricular layers. Fibrous and ventricular layers maintain the structural integrity of the valve, while the spongeous layer has an important role in absorption of tension and compression mechanical forces. The porcine aortic valves have been utilized for the production of bioprostheses, however its durability is reduced especially due to calcification process. Structural analyses of whole mounts of the valvar leaflets stained with toluidine blue showed strongly stained fibrous components and metachromatic material following the fibrilar components. The fibrous components emerged from the insertion regions of the valve at the aorta wall, from both sides of the leaflet and have exhibited a mainly longitudinal trajectory, according the main axis of the leaflet. Analysis in polarization microscopy showed an intense bright of the fibers and fibrils demonstrating the high molecular order of the collagen molecules in the fibrous components. Along the main axis of the collagen bundles intense metachromasy was observed. Several metachromatic regions were also found in a non-uniform distribution. Analysis of histological sections stained with toluidine blue showed the three well distinct layers of the leaflet. A great amount of cells was observed in the endothelial layer of the aortic and ventricular faces of the leaflet. Cells with different morphologies and distributions were also observed in the different layers. At the fibrous layer elongated cells, named fibroblasts, were found along the collagen bundles. The ventricular layer showed round cells, similar to condhrocytes. At the spongeous layer both types of cells were fond. The biochemical study consisted of extracting the extracellular matrix components using 4 M guanidine-chloride, fractionation in DEAE-Sephacel column and analysis in SDS-PAGE. The collagenic proteins found at the leaflets showed Mr values between 18- 170 kDa. A polydisperse band with 70 kDa and another between 80 and 100 kDa were found and possibly are the small proteoglycans fibromodulin and decorin. The analysis of glycosaminoglycans in agarose-propilenodiamino gel, after digestion with papain, revealed the presence of chondroitin sulfate and dermatan sulfate. The analysis in agarosepolyacrylamide gel of the ultracentrifugation D1 fraction revealed a polydisperse and metachromatic band after toluidine blue staining, indicating the presence of proteoglycans of high molecular weight. Analyzing the biochemical and morphological data, may be concluded that: 1) Small and large proteoglycans are present in the extracellular matrix of the aortic valve. 2) Proteoglycans are distributed preferentially in certain regions of the leaflet probably due a more intense presence of compressive forces in those regions. 3) Collagen bundles are distributed along the main axis of the leaflet but are also found forming an interwoven structure to provide sustentation of the valve during systole and diastole Mestrado Anatomia Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Maria Luiza Silveira Mello, Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Mestrado

Orientador: Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A técnica espectrométrica de FTIR vem sendo amplamente utilizada como método diagnóstico devido a sua rapidez, sensibilidade e capacidade de analisar os biomateriais de modo não destrutivo. Este trabalho visa analisar a possibilidade de utilização desta técnica no estudo da agregação molecular das fibras de colágeno, bem como determinar a existência de algum indicador deste fenômeno, uma vez que a agregação desta fibras está relacionada a uma série de fenômenos fisiológicos como ossificação, inflamação e envelhecimento. Foram analisadas quatro tipos de amostras: tendão sem tratamento, tendão tratado com condroitin sulfato, tendão tratado com papaína e gelatina. Foi observado um aumento da intensidade da banda amida I (estiramento do grupo C=O) no espectro do tendão tratado com condroitin sulfato e uma diminuição da mesma nos espectros da gelatina e do tendão tratado com papaína em relação ao espectro sem tratamento. Estes resultados sugerem uma relação inversa entre a intensidade da banda amida I e o grau de agregação molecular das fibras de colágeno. Portanto, pode se afirmar que a técnica de FTIR é capaz de detectar alterações no estado de agregação molecular das fibras de colágeno e que a banda de amida I é o indicador deste fenômeno Abstract: The FTIR spectroscopy technique has been largely used as a diagnosis method because of its speed, sensivity anda capability to analyse the biomaterials in a non destructive way. This researchs aim is to analyse the possibility of using that technique to study collage fibers molecular agregation, as well as to determine the existence of something that indicates this phenomenon, since the collection is related to several physiological phenomenons as ossification, inflamation and aging. Four types of samples were analysed: non treated tendon, tendon treated with sulfate condroitin, tendon treated with papin and gelatin. It was noticed a rise in intensity of the amide I band (stretching C=O group) in the spectrum of the tendon treated with sulfate condroitin and it's reduction of the gelatin and the tendon treated with papain's spectrum im comparasion with the non treated spectrum. These results suggest an inverse relation between the low intensity of amide I band and the levei of collagen fibers molecular agregation. Therefore, it's possible to affirm that FTIR technique is able to detect alterations in the collagen fibers molecular agregation state and that the amide I band is the indicàtor for this phenomenon Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Reinaldo Gamba, Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Este trabalho teve por objetivo analisar o comportamento mecânico deste tendão artificial biológico, quando submetido a ensaios uniaxiais de tração. Os ensaios foram conduzidos até a ruptura dos tendões. Realizaram-se ensaios mecânicos uniaxiais de tração em corpos de prova de tendão artificial biológico, produzido no Instituto de Biologia Celular da Unicamp. O grupo-controle foi formado por tendão calcâneo bovino e tendões humanos (músculos As secções médias dos corpos de prova foram determinadas. Os parâmetros mecânicos obtidos foram: carga de ruptura, deformação relativa, energia de ruptura e módulo de elasticidade. Foi possível estabelecer, a partír destes parâmetros: os tendões calcâneos bovinos e humanos (músculos gracilis e semitendinoso) apresentaram tensão de ruptura entre 15 e 30 1 Abstract: The purpose of this study was to analyzethe mechanicalbehavior of an artificial biological tendon when it undergoes uniaxial traction assays. The test were carried out until the tendons ruptured. These uniaxial mechanicaltraction assays were conducted on test bodies having an artificial biological tendon produced by the Institute of Cellular Biology at Unicamp. The control group was made up of calcaneus bovine and human tendons (gracilis and semitendinus muscle). The median cross-sectional area of the test bodies were defined. The mechanical parameters obtained were: ultimate load, relative deformation, rupture energy and modulus of elasticity. Basedon these parameters, it was possible to establishthe following: ~ the bovine (calcaneus) and human (gracilis and semitendinus muscle) tendon presented a ultimate tension strengh between 15 and 30 MPa, wile in the artificial tendon the ultimate tension strengh was less then 4 MPa. . ~ the extreme deformation values for the varying strain rate showed that the defromation of the bovine calcaneus tendon was two times more than that of the artificial tendon. ~ the diagram of force versus dislocation of the artificial tendon differed from that ofbovine and human tendons and showed lesser elasticity Mestrado Cirurgia Geral Mestre em Medicina

Orientadores: Maria Luiza Silveira Mello, Benedicto de Campos Vidal Tese(doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Uma expressiva fração da população masculina brasileira tem sido diagnosticada com lesões na próstata ou com sintomas de prostatismo. O presente trabalho teve como objetivo a caracterização dos núcleos e da matriz extracelular, com enforque à morfologia, citoquímica, cariometria e imunocitoquímica de lesões prostáticas humanas. Foram examinadas biópsias de ressecções trans-uretrais e punção por agulha fina de um total de 26 pacientes com hiperplasia nodular prostática (HNP) e 25 pacientes com adenocarcinomas (AC) de pacientes da Região Norte do Estado de São Paulo. Dos casos acima estudados, 12 pacientes com regiões livres de comprometimento histopatológico foram considerados controles ou regiões normais (NOR). Cortes histológicos de 6-8flm de espessura foram submetidos às colorações pela hematoxilina-eosina para as análises da distribuição da cromatina e cariometria (área e perímetro nucleares e fator forma de 200 núcleos para cada paciente estudado); azul de toluidina pH 4,0 e suas variantes para estudos citoquímicos de ácidos nucléicos; Reação de Feulgen para estudo do DNA; Reação imunocitoquímica para detecção de Apoptose - Apoptag e Impregnação argêntica de Gõmõri para o estudo da matriz estracelular. Da análise das lâminas e das medidas nucleares pôde-se concluir que existem diferenças visuais, principalmente nos adenocarcinomas, onde predomina um acentuado pleiomorfismo nuclear. As diferenças cariométricas observadas, foram significativas para os valores de área e perímetro nucleares e não significativas para o fator forma, entre as três classes, utilizando-se o teste estatístico não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Para a comparação das populações amostrais utilizou-se as medianas dos valores obtidos na cariometria, como mostra a tabela abaixo. Classes Área nuclear (m2) Perímetro nuclear (m) Fator Forma NOR 44,30 24,80 0,94 HNP 37,14 22,52 0,92 AC 60,86 29,70 0,93 valor p p=0,0001 p=0,0001 p=0,0513(ns) (ns)não significativo Entretanto, nas categorias internas da classificação dos adenocarcinomas, segundo a graduação clássica proposta por Gleason, na versão combinada e considerando apenas o primeiro dígito da graduação, não se detectaram diferenças significativas (p=O,838 para área; p=O,6076 para perímetro e p=O,9202 para fator forma). Nestas categorias vale ressaltar a grande heterogeneidade do universo amostral Assim conclui-se que os dados de morfometria não podem ser utilizados como parâmetros discriminatórios isoladamente, sem levar em. conta a histoaquitetura do tumor. Da análise dos cortes corados pelo azul de toluidina na sua variante para detecção de apoptose e da imunocitoquímica para detecção de apoptose, pôde-se concluir não serem detectadas células apoptóticas nas regiões normais e nos adenocarcinomas, mas serem detectados corpos apoptóticos nas hiperplasias, principalmente em áreas onde estaria ocorrendo a regressão do ácino hiperplástico. Isto pode sugerir que o fenômeno apoptótico seja um modulador da recuperação localizada da hiperplasia, podendo ser inclusive um parâmetro auxiliar para o acompanhamento diagnóstico durante o tratamento. Da análise dos cortes submetidos à impregnação argêntica, pôde-se concluir que as fibras colágenas na matriz extracelular do estroma prostático, em sua dinâmica supra-molecular, respondem a estímulos externos ao estroma, modificando a disposição e o grau de compactação fibrilar. Na hiperplasia nodular prostática parece não haver modificações na integridade molecular do colágeno, pois a sua afinidade pela prata e birrefringência não são alteradas. Nos adenocarcinomas com alto grau de indiferenciação, fibras colágenas finas, ramificadas e fortemente argirófilas e birrefringentes são detectadas nas regiões de proliferação tumora!. E no estroma adjacente, hospedeiro do tumor, placas hialinas de matriz extracelular sugerem degradação ou remodelação dos componentes da matriz Abstract: An expresive fraction of the Brasilian male population has been diagnosed with prostatic lesions or presents prostatism symptons. The present work aimed at characterizing the nuclei and the extracellular matrix, emphazing the morphology, cytochemistry, kariometrics and immunocitochemistry in some human prostatic lesions. Transurethral resections and fine needle aspiration of patients presenting prostatic nodular hyperplasia (PNH - 26 cases) or adenocarcinoma (AC - 25 cases), from the north region of the São Paulo State were examined. Twelve of these cases presented regions with no histopathological alterations which were considered normal and employed as control (Ct). Six to eigth micrometers thick histological sections were stained by hematoxylin and eosin for the analysis of chromatin distribution and kariometry (nuclear area and perimeter and form factor - 200 measurements for each patient); toluidine blue at pH 4.0 and its modifications for the cytochemical study of nucleic acids; Feulgen reaction for DNA; immunocytochemistry for detection of apoptosis (Apoptag kit) and Gõmõri' s silver impregnation for study of fibrilar collagens. The analysis showed the existence of visual differences in the nuclear phenotype among the studied cases, in special in AC, which showed a amked nuclear pleomorphism. Karyometry showed significative differences in area and perimeter values but form factor, amongst the three classes, by the use of the Kruskal-Wallis non-parametric statistical testo The median values employed for comparision between the samples are shown in the table below. Classes Nuclear area (m2) Nuclear perimeter (m) F orm factor Ct 44.30 24.80 0.94 PHN 37.14 22.52 0.92 AC 60.86 29.70 0.93 P value p=0.0001 p=O.OOOl p=0.0513(ns) (ns)non-significant The different classifications of the adenocarcinomas, according to the GIeason grading, in the combined version and considering only the first grading, showed no significative differences (p=O.838 for the area, p=O.6076 for perimeter and p=O.9202 for the form factor). It is worth to refer to the Iarge heterogeneity of the nuclear popuIation. It is concluded that morphometrics cannot be used isoIatedly to discriminate prostatic Iesions, without considerations of the tumor histoarchitecture. The use of toIuidine bIue staining modification for detection ofapoptosis and the Apoptag test demonstrated the absence of apoptotic cells and in adenocarcinomas but in hyperpIasia, especially in areas of regressing hyperpIastic acina. This is suggestive that apoptosis may represent a factor invoIved in Iocalized recover of hyperpIasia and its detection is IikeIy to represent an additionaI parameter for the follow up after treatment. The anaIysis of silver impregnated tissue sections allowed for the conclusion that collagen fibers of the prostatic stroma, in their supramoIecuIar dynamics, respond to externaI stimuli, modifying their disposition and fibrillar compactation. In PNH, there is no modifications in collagen moIecuIar integrity, since the silver affinity and birefringence are similar to controIs. In AC with high degree of non-differentiation, thin and branched collagen fibers, strongIy argyrophilic and birefrlngent are detectedin regions of cell proliferation. In the adjacent stroma, host of the tumor, hya1ine pIaques are probabIe signs of matrix degradation or remodellation Doutorado Biologia Celular Doutor em Ciências

Orientadores: Admar Costa de Oliveira, Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: O presente trabalho teve como objetivo estudar uma nova utilização ao tendão bovino, subproduto da indústria animal, mais particularmente ao colágeno tipo I extraído, purificado e reconstituído na forma de gel, visando sua aplicação no tratamento de ulcerações do trato gastrintestinal (duodeno). Para se obter o colágeno, os tendões foram colocados em solução de ácido acético adicionada de pepsina, seguida de homogeneização por 48 horas (10-12°C), para logo após ser centrifugada. O material não colagênico insolúvel foi descartado e as fibras colágenas reconstituídas a partir do sobrenadante por adição de NaCl para completa precipitação destas fibras. As lesões do trato gastrintestinal de ratos Wistar foram obtidas pela ação tóxica de lectinas, quando os animais passaram a ser alimentados com dieta contendo feijão (Phaseolus vuIgaris, cv Aroana) cru. Esses feijões foram moídos e analisa dos quanto a composição centesimal, e empregados como única fonte protéica na formulação da dieta, em ensaio randomizado. No período de aclimatação (4 dias) os animais foram mantidos em dieta não-purificada de fórmula fechada (DC) e água. O grupo controle após esse período continuou nesta dieta até o final do experimento enquanto o grupo a ser testado passou a receber a dieta contendo o feijão cru (DU). Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura e ciclo de luz em gaiolas individuais, e receberam as dietas e água ad libitum. Após 09 dias, com a morte de 25% dos ratos, sabendo-se que desta forma ter-se-ia animais lesionados e em estado grave, foi encerrado o período da ocorrência das lesões e sacrifica dos alguns animais dos dois grupos (controle e lesão) e extraí do os duodenos para posterior exame histológico. Os animais restantes foram divididos em dois grupos, sendo um tratado com gel de colágeno e outro com água destilada esterilizada por intubação oro-gástrica nos tempos 0, 24 e 48 horas, sendo, desta forma coletados os duodenos para histologia, em 24, 48 e 72 horas desde a primeira intubação. Durante e após período de intubação, os animais restantes, 4 por tratamento, foram alimentados com dieta DC e água ad libitum, por mais 22 dias, em um experimento de crescimento. Os resultados obtidos na análise de crescimento ponderal mostraram que os animais, após terem tido um ganho de peso de aproximadamente 31% no período de aclimatação, passaram a perder peso quando alimentados com dieta DU, chegando esta perda ser de aproximadamente 31%. Quando retirados desta dieta, tratados com gel de colágeno ou água e alimentados com dieta DC, esses animais voltaram a ganhar peso e chegaram ao final dos 35 dias, com os tratados com colágeno não apresentando diferença significativa (p < 0,05) quando comparados aos controles. Os resultados obtidos do exame histológico da mucosa duodenal dos ratos alimentados com dieta DU apresentaram lesões generalizadas, modificando a morfologia tecidual das vilosidades, glândulas de Lieberkuhn e atingindo até mesmo a lâmina própria. Observou-se que aqueles animais que foram tratados com gel de colágeno apresentaram integridade morfológica na mucosa duodenal já nas primeiras 24 horas após intubação, o mesmo não ocorrendo com os tratados com água que, mesmo em 72 horas, ainda apresentavam lesão no ápice das vilosidades. Foi observado também, por teste in situ, que o colágeno adere á superfície do trato gastrointestinal. A contagem do número de células caliciformes das vilosidades representada pelo material PAS-positivo nas mesmas, mostrou que em ratos tratados com colágeno, em 24 horas, a quantidade destas células não difere (p < 0,05 ) dos controles; em 48 horas este número é maior na metade inferior das vilosidades, e em 72 horas, maior na metade inferior, superior e no total das vilosidades. Estes resultados demonstram não haver uma diminuição de células calicíformes, mas um esgotamento das mesmas interrompendo sua produção de muco. Os ratos tratados com água, somente em 72 horas, e, na metade superior das vilosidades, apresentaram quantidade semelhante aos controles. Os resultados indicaram uma utilização promissora do gel de colágeno purificado, obtido de tendões bovinos (colágeno tipo I), com vistas à recuperação de lesões do trato gastrintestinal Abstract: The effect of collagen extracted from bovine tendons (Type I collagen) in the recuperation of lesions of duodenal epithelium induced by bean (Phaseolus vulgaris) lectins. Experimental model in the rat. The present thesis aimed at studying the utilization of type I collagen from bovine tendons, a by-product of animal industry, in the treatment of gastrointestinal (duodenum) lesions in rats. The collagen was extracted, purified and reconstituted in a gel form. Tendon collagen was obtained by extraction in acetic acid solution containing pepsin, and lightly homogenization at 10-12°C for 48 h, followed by centrifugation. The precipitate, considered to be insoluble collagen or a non-collagen material, was discarded and collagen fibers were reconstituted from the supernatant by adding NaCl to achieve precipitation. The lesions of gastrointestinal tract of Uistar rats were caused by the action of active lectins from raw common dry beans (Phaseolus vulgaris, cv Aroana). Raw common bean was offered to the rats in an otherwise balanced diet (DU) as the sole protein source, in a randomized assay. Another group of rats (control) was fed a non-purified diet of closed formula (DC) during the assay. The rats were caged individually and maintained on the experimental diets and water ad libitum. The temperature and light cycle of the animal laboratory were controlled. Within 9 days of the assay, 25% of the rats receiving raw bean died, and the surviving rats become seriously ulcerated. The duodenum of some control and ulcerated rats was dissected at this time for histological examination. The surviving rats were then divided in two groups: one received the collagen and other received distil led water by gastric intubation at time, 0, 24 and 48 h. At 24, 48 and 72 h after the first intubation, the duodenum of the rats were dissected for histological examination. During and after the intubation procedures, the remaining animals, 4 per treatment, were fed DC and water ad libitum for 22 days, in a growth experiment. The rats fed DU showed 31% loss of body weight, and a subsequent restoration of the normal growth when the toxic effect of bean lectins have been removed by feeding DC. Nevertheless, the rats treated with collagen showed a better weight recovery than those treated with distilled water, and at the end of the experiment their weights did not differed (p

Orientador : Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Com o objetivo de estudar as diversas alterações no conteúdo protéico em sementes de Glycine Max durante o processo de germinação, foram realizadas no presente trabalho, uma série de técnicas gerais e citoquímicas para a detecção "in situ" dos corpos protéicos dessa leguminosa, constatando-se a presença dos mesmos nas células cotiledonares a partir da coloração pela hematoxilina-eosina, impregnação pela prata e coloração com xylidine Ponceau (XP). A quantificação do conteúdo protéico foi realizada através de medições absorciométricas do material corado pelo XP em diversos tempos e posições, indicando uma mobilização do material de reserva das células distantes do sistema vascular, para o interior dos vasos e destes, para a radícula do embrião. Os corpos proteicos apresentaram-se delimitados por membrana, evidenciada pelo azul de toluidina (AT), devido a presença de material basófilo nesse local. As paredes celulares dos cotilédones e radículas foram coradas pelo AT, apresentando-se metacromáticas. Durante o processo de germinação, houve um aumento no índice metacromatico do material corado, indicando uma liberação de radicais negativos. A nível de organização molecular, foi constatada uma diminuição no estado de cristalinidade e de agregação das paredes durante a germinação e uma variação no conteúdo de glicosaminoglicanas nos diversos locais analisados. As lectinas presentes na semente de soja encontram-se agregadas como material protéico, de forma a perderem seu poder aglutinante no material "in si tu" Abstract: Seeking to study the various changes in the protein content in seeds of Glycine max during germination, a series of general and cytochemical techniques was performed in order to study the protein bodies of this legume "in situ",verifing the presence of these bodies in the cotyledon cells by hematoxilin-eosin and xylidine-ponceau stains and silver impregnation. The quantification of protein was made by absorption measurements of the specimens stained with XP at various times and positions, indicating a mobilization of the reserve material of the cells far from the vascular system, to the interior of this system and then to the radicle of the embryo. The protein bodies were found to be membrane, evidenced by toluidine blue (TB), surrounded by a dueto the presence of basophilic material in this area. The cell walls of the cotyledon and radicle were stained by the TB,displaying metachromasy. During germination there was an increase in the metachromatic index of the stained substrate, indicating a decrease of negative radicaIs. In relation to the molecular organization there was a decrease in the cristalinity and agregation of the cell alls during germination along with a variation in the alycosaminoglycans content in the various areas analysed. The lectins present in the soybean seed are associated with the proteic material, thus losing their agglutinating properties in the ¿in situ¿ material Mestrado Biologia Celular Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Benedicto de Campos Vidal Orientador : Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Este trabalho teve por objetivo estudar as alterações histológicas ocorridas na matriz extracelular. estimar a área ocupada pelo colágeno tipo l. por intermédio de mi>todos estereológicos, bem como verificar () num('J'o e a distribuição de mastócitos durante o crescimento e regressão normais de glândulas mamárias de ratas. Foram usados cortes impregnados por prata. ou submetidos a técnicas gerais e citoquímicas. Constatou-se que independentemente da idade. ou do estado fisiológico. que o colágeno ocupava uma maior área média em mamilos que nos estromas glandulares. sendo que paralelamente ao crescimento do parênquima ocorria uma diminuição da área média ocupada por esta proteína no estroma mamário. Esta diminuição tornou-se mais acentuada durante os processos regressivos. Em ratas do grupo C (amamentação) notou-se uma grande concentração de fibras reticulares (estimadas visualmente). estas contornavam ahéolos e apresentavam um aspecto compacto, Com a instalação dos processos regressivos fibrilas individualizadas podiam ser observadas, Foi encontrado um maior nÚmero de mastócitos em mamilos dos animais (Oll) 50 dias de idade. sendo contado um menor nÚmero destas células ao nível do estroma distal de mamas submetidas à regressão, O extenso coxim adiposo. que envolvia glândulas mamárias de ratas com 25 e 50. tornou-se reduzido passando a apresentar uma distribuição esparsa durante o período de amamentação, com o mesmo voltando a se desenvolveu a durante a regressão Abstract: This study was directed towards evaluating the histological alterations 01' the eX1raccll Mestrado Biologia Celular Mestre em Ciências

Orientador: Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Com o propósito de se determinar as modificações da resis­tência à tração e dos níveis de orientação macromolecular dos feixes de colágeno frente a estímulos mecânicos, animais de laboratório foram submetidos a diferentes condições experimentais como o exercício físi­co e a denervação de um grupo muscular. Após o período experimental, os tendões calcaneares destes animais foram submetidos a experimentos biomecânicos e biofísicos. A análise das curvas de tensão de tração-deformação demons­trou que os tendões de animais treinados apresentam parâmetros de TENSÃO DE RUPTURA e RIGIDEZ ELáSTICA superiores aos tendões de animais controle. A avaliação das Curvas de Birrefringêncla de Forma dos felixes de colágeno destes tendões mostrou um aumento do estado de agrega­ção e orientação macromolecular dos elementos da matriz extracelular,sendo constatada a manutenção dos níveis de cristalinidade. Valores médios de TEHSXO DE RUPTURA ainda mais elevados fo­ram observados para tendões de animais denervados da mesma forma que foi detectada para estes uma acentuação dos perfís das curvas de bir­refringêncla de forma. Visto terem sido detectadas modificações biomecãnicas e bio­físicas nos feixes de colágeno, estes resultados podem contribuir para elucldação dos prováveis mecanismos de controle dos padrões de sín­ tese e estado de agregação dos elementos fibrilares da matriz extrace­lular dos tendões Abstract: For the purpose of determ1n1ng the modifications of tensile strength and of the d1fferent levels of macromolecular or1entation in collagen bundles due to mechanical stimuli, rats were submitted to different experimental treatments, such as physical exercise and mus­cular denervation. After these treatments the Achilles tendons of animais were subm1tted to b10mechanical and blophys1cal experiments. The analysis of the stress-deformation curves indicated that the tendons of trained animais presented superior RUPTURE TEHSIOH and ELASTIC STIFFHESS parameters in comparison to the1r controls. The form birefringence curves of collagen bundles in these tendons also showed na increase of aggregation state and macromolecular orientation of the extracelular matrix elements, while maintain1ng the crystall1n1ty levels. Average values of RUPTURE TENSION were even h1gher in the tendons of denervated animaIs. An acentuation in the profile of the Form B1refringence Curves was also observed 1n these tendons. The finding of the biomechanical and biophysical modifications can contribute to the understanding of the probable control mechanisms of both the syntesis and aggregation state patterns of the f1brous elements of extracellular matrix Mestrado Biologia Celular Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Benedicto de Campos Vidal Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Neste trabalho foram considerados alguns aspectos estruturais da fração rica em histona 'H IND. 5' (FR'H IND. 5') bem como a sua participação na estrutura da cromatina. Para isto foram empregados núcleos de eritrócitos de frango, dos quais se extraiu FR'H IND. 5' . Os métodos, tais como os processos extrativos, espectrofotometria de absorção, fluorometria, complexação com corantes, estudos de anisotropia e eleytroforese, permitiram determinar algumas características intrínsecas da FR'H IND. ', bem como diferenças em relação a histona 'H IND. 1' de timo de bezerro. Com a mesma finalidade, foram feitas observações ao microscópio de polarização do material nuclear tratado com NaCl 0,7M, e corado com azul de toluidina e sirius red. Ao microscópio eletrônico foram observados tanto complexos FR'H IND. 5'-DNA como material nuclear em NaCl 0,7M. As extrações levadas a efeito usando ácido perclórico 5%, NaCl 0,7M e NaCl 0,15M-HCl pH 1,85, mostraram que este último apresenta uma maior preferência para extrair FR'H IND. 5' do que os demais. As curvas espectrais de absorção de FR'H IND. 5' e de 'H IND. 1' de timo em meios ácidos e alcalino, não mostraram diferenças nos seus perfis. No entanto, foi relevante o fato de que estas histonas quando desnaturadas em meio básico apresentaram hipercromasia em relação às nativas, ocorrendo o inverso quando em meio ácido... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: This thesis deals with structural aspects of an 'H IND. 5' histone rich fraction ('H IND. 5'RF), as well as its importance in the chromatin structure. 'H IND. 5'RF was extracted from chicken erythrocyte nuclei. Some intrinsic characteristics of 'H IND. 5'RF a few differenciating qualities in relation to the 'H IND. 1' histone of the calf thymus were determined by the following methods: an extractive process; absorption espectrophotometry; fluorometry; dye binding as measured by anisotropy and electrophoresis. These were complemented by observations, carried out with the polarization microscope, of chromatin treated with 0,7 NaCl, and stained with toluidine blue or sirius red. 'H IND. 5'RF-DNA complexes and nuclear material in 0,7M NaCl were studied with the electron microscope. Extraction were made using 5% perchloric acid, 0,7M NaCl and 0,15M NaCl at pH 1,85. This last solution was shown to extract 'H IND. 5'RF preferencially. No differences were detected in the spectral absorption profiles of 'H IND. 5'RF and calf thymus 'H IND. 1' in acid or in alkaline medium. Its is remarkable, however, that the histones, when denatured in a basic medium, were hyperchromic in relation to these some proteins in their native state. In acid medium, the opposite occurred. Fluorescence spectral curves of 'H IND. 5' RF and calf thymus 'H IND. 1' solutions indicated a more intense fluorescence for 'H IND. 5'RF than for 'H IND. 1'. The fluorescence of denatured 'H IND. 5'RF was markedly diminished in relation to that in the native condition. No important difference was noted in their spectral absorption profiles... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A ação de tratamentos químicos dissociativos e en zimiticos sobre a cartilagem hialina do septo nasal bovino, estudada atraves de tecnicas cito quimicas. As variações nas respostas aos referidos testes citoquímicos em função dos tratamentos realizados, foram utilizadas como uma forma de estimar o grau de estabilidade fisico-química dos diferentes componentes macromoleculares da cartilagem hialina, bem como o estado de agregação e ordem molecular dos mesmos. A utilização de procedimentos distintos (tratamentos realizados sobre cortes obtidos por microtomia de congelação e sobre fragmentos de cartilagem posteriormente incluídos em parafina), permitiu uma avaliação acerca da eficiencia e acessibilidade dos diferentes agentes empregados, avaliação esta que demonstrou que os cortes obtidos por congelação produzem respostas mais evidentes a nivel qualitativo...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: The hyaline cartilage of the bovine nasal septum was cytochemically studied, with respect to the physicochemical stability, state of aggregation and molecular order of its macromolecular components. Techniques based on the "dissociative" principle of SAJDERA & HASCALL (1969), and on enzymatic digestions were used as extraction methods. The results showed that chemical-dissociative treatments are not indicated for cytochemical studies, particularly because of the monreproducibility of such methods. Dense granules were observed on the cartilage extracellular matrix. The physicochemical stability and the stainability of such granules, lead to the supposition that they represent a multiaggregated proteoglycan complex...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Biologia Celular Mestre em Ciências Biológicas