Estudo estrutural e bioquimico do tecido conjuntivo da valva aortica de porco

Orientador: Edson Rosa Pimentel, Benedicto de Campos Vidal Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As cúspides da valva aórtica são constituídas principalmente de água (cerca de 80%), mas também contém proteínas colagênicas e não colagênicas, elastina, pequenos e grandes proteoglicanos, responsáveis por suas propriedades mecânicas. Estruturalmente são formadas por três camadas distintas, a fibrosa, a esponjosa e a ventricular. As camadas fibrosa e ventricular mantém a integridade estrutural da valva, enquanto a esponjosa tem papel importante na absorção de forças mecânicas de tensão e compressão. As valvas aórticas de porco têm sido utilizadas para a produção de biopróteses, mas sua durabilidade tem sido prejudicada especialmente devido à calcificação, o que justifica a necessidade de um melhor conhecimento sobre seus aspectos organizacionais e composicionais. A montagem total dos folhetos valvares corados com azul de toluidina, mostrou uma estrutura fortemente corada, com componentes fibrosos e material metacromático acompanhando estes componentes. Estes componentes fibrosos emergiam das regiões de inserção da valva na parede da artéria, de ambos os lados do folheto e exibiram um trajeto preferencialmente longitudinal, seguindo o eixo mais longo do folheto. A análise em microscopia de polarização mostrou brilho intenso exibido pelas fibras e fibrilas evidenciando a distribuição altamente orientada dessas estruturas. A metacromasia foi intensa ao longo dos feixes de colágeno e em várias regiões distribuídas de maneira não uniforme no folheto. Análise de cortes histológicos mostrou as três camadas bem distintas do folheto, sendo duas fibrosas e uma intermediária com características de tecido conjuntivo frouxo. Os folhetos apresentaram grande quantidade de células com diferentes morfologias e distribuição, enquanto que, nas faces voltadas para a artéria aorta e para o ventrículo, foi encontrada uma camada endotelial. Na camada fibrosa as células são alongadas, denominadas de fibroblastos, e apareceram dispostas ao longo dos feixes de colágeno. A camada ventricular apresentou células arredondadas, similares aos condrócitos. Na camada esponjosa foram encontrados os dois tipos celulares. O estudo bioquímico mostrou a presença de proteínas não colagênicas que apresentaram massa molecular aparente entre 18 - 170kDa. Uma banda polidispersa em torno de 70kDa e outra na faixa de 80 a 100kDa possivelmente correspondam aos pequenos proteoglicanos fibromodulim e decorim, além da presença de proteoglicano de alto peso molecular. Condroitim sulfato e dermatam sulfato são os principais glicosaminoglicanos presentes nesse folheto. Analizando os dados morfológicos e bioquímicos, podemos concluir que: 1) Pequenos e grandes proteoglicanos estão presentes na matriz extracelular da valva aórtica. 2) Os proteoglicanos estão preferencialmente distribuídos no folheto em certas regiões, devido a presença de intensas forças compressivas nestas regiões. 3) Feixes de colágeno estão distribuídos ao longo do maior eixo do folheto que se fundem formando uma estrutura entrelaçada para fornecer a sustentação da valva durante a sístole e a diástole Abstract: The cuspids of the aortic valve are constituted mainly by water (approx. 80%), but also by collagen and noncollagenous proteins, elastin and proteoglycans, which are responsible for their mechanical properties. Structurally are formed by fibrous, spongeous, and ventricular layers. Fibrous and ventricular layers maintain the structural integrity of the valve, while the spongeous layer has an important role in absorption of tension and compression mechanical forces. The porcine aortic valves have been utilized for the production of bioprostheses, however its durability is reduced especially due to calcification process. Structural analyses of whole mounts of the valvar leaflets stained with toluidine blue showed strongly stained fibrous components and metachromatic material following the fibrilar components. The fibrous components emerged from the insertion regions of the valve at the aorta wall, from both sides of the leaflet and have exhibited a mainly longitudinal trajectory, according the main axis of the leaflet. Analysis in polarization microscopy showed an intense bright of the fibers and fibrils demonstrating the high molecular order of the collagen molecules in the fibrous components. Along the main axis of the collagen bundles intense metachromasy was observed. Several metachromatic regions were also found in a non-uniform distribution. Analysis of histological sections stained with toluidine blue showed the three well distinct layers of the leaflet. A great amount of cells was observed in the endothelial layer of the aortic and ventricular faces of the leaflet. Cells with different morphologies and distributions were also observed in the different layers. At the fibrous layer elongated cells, named fibroblasts, were found along the collagen bundles. The ventricular layer showed round cells, similar to condhrocytes. At the spongeous layer both types of cells were fond. The biochemical study consisted of extracting the extracellular matrix components using 4 M guanidine-chloride, fractionation in DEAE-Sephacel column and analysis in SDS-PAGE. The collagenic proteins found at the leaflets showed Mr values between 18- 170 kDa. A polydisperse band with 70 kDa and another between 80 and 100 kDa were found and possibly are the small proteoglycans fibromodulin and decorin. The analysis of glycosaminoglycans in agarose-propilenodiamino gel, after digestion with papain, revealed the presence of chondroitin sulfate and dermatan sulfate. The analysis in agarosepolyacrylamide gel of the ultracentrifugation D1 fraction revealed a polydisperse and metachromatic band after toluidine blue staining, indicating the presence of proteoglycans of high molecular weight. Analyzing the biochemical and morphological data, may be concluded that: 1) Small and large proteoglycans are present in the extracellular matrix of the aortic valve. 2) Proteoglycans are distributed preferentially in certain regions of the leaflet probably due a more intense presence of compressive forces in those regions. 3) Collagen bundles are distributed along the main axis of the leaflet but are also found forming an interwoven structure to provide sustentation of the valve during systole and diastole Mestrado Anatomia Mestre em Biologia Celular e Estrutural