Search

Die vorliegende Dissertation hatte zum Ziel, einen Literaturüberblick über Transfusionsrisiken bei Mensch und Hund zu geben. Dabei wurde die Akkumulation von Vascular endothelial growth factor (VEGF) in gelagerten Blutkonserven genauer betrachtet. VEGF ist einer der wichtigsten Wachstumsfaktoren für Gefäße und somit wichtig während Embryonalentwicklung und Wundheilung. Zudem ermöglicht VEGF Tumoren den Anschluss an das Gefäßsystem und erleichtert durch seine permeabilitätssteigernde Wirkung die metastatische Ausbreitung. Die Bildung von VEGF findet nicht nur in Endothel- und Tumorzellen, sondern auch in Thrombozyten und Leukozyten statt. Da diese in Blutkonserven zerfallen, stieg in humanmedizinischen Studien die VEGF-Konzentration in gelagerten Blutprodukten wie Vollblut und thrombozytenreichem Plasma an. Durch den Einsatz von Leukozytenfiltern vor der Lagerung kann diese Anreicherung vermindert werden. Die Freisetzung von VEGF aus Tumorgewebe ist bei Hunden beschrieben, doch es gibt bisher keine Daten zur Akkumulation von VEGF in Blutkonserven. Der Einsatz von Leukozytenfiltern bei Vollblut vor der Auftrennung und Lagerung bei Hunden wurde bereits beschrieben. Ziel des experimentellen Teils der Dissertation war es, die Anreicherung von VEGF incaninen Blutkonserven während des Lagerungsverlaufs sowie den Einfluss von Leukozytenfiltern zu untersuchen. Dazu wurden Plasmaproben von 10 caninen Blutspendern entnommen und mittels eines humanen ELISA, der bereits für canines VEGF etabliert worden war, untersucht. Die Proben wurden in Zitratplasmaröhrchen gesammelt, die durch den Zusatz von Theophyllin, Adenosin und Dipyridamin eine maximale Thrombozytenstabilität gewährleisteten. Fünf der 10 Vollblut-Spenden wurden vor der Auftrennung in Erythrozytenkonzentrat und frisch gefrorenes Plasma durch einen Filter der 3. Generation (Sepacell RS-2000, Baxter, Unterschleißheim) leukozytenreduziert. Direkt nach der Auftrennung erfolgte die Probenentnahme aus Erythrozytenkonzentrat und frisch gefrorenem Plasma, und in wöchentlichem Abstand wurden Aliquoten der Erythrozytenkonzentrate untersucht. Frisch gefrorene Plasma-Proben, von denen je 2 gefiltert und nicht-gefiltert waren, wurden nach ca. 4 bzw. 6 Wochen untersucht. Es gab keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf Erythrozytenzahl zwischen gefilterten und ungefilterten Konserven. Durch die Leukozytenfilter wurden jedoch sowohl Leukozyten als auch Thrombozyten effektiv entfernt (Leukozytenzahl 0 – 0,2 G/l und Thrombozytenzahl 0 – 10 G/l nach Filtration). Die VEGF-Konzentration lag im Plasma von 9 der 10 Blutspender unterhalb der Nachweisgrenze von 9 pg/ml, in einer Plasmaprobe betrug die Konzentration 12 pg/ml. Der VEGF-Wert war < 9 pg/ml in allen Erythrozytenkonzentraten und frisch gefrorenen Plasma-Konserven direkt nach der Auftrennung. Nach 1 Woche Lagerungszeit lag die mediane VEGF-Konzentration der 5 ungefilterten Ec-Konzentrate bei 37 (0-139) pg/ml, nach 2 Wochen bei 164 (0-333) pg/ml und nach 3 Wochen bei 110 (37-358) pg/ml. In den 5 gefilterten Erythrozytenkonzentraten und in allen gelagerten frisch gefrorenen Plasma- Konserven blieb die VEGF-Konzentration während der gesamten Lagerungszeit unterhalb der Nachweisgrenze. In einem zweiten Teil der Arbeit erfolgte die VEGF-Messung im Plasma von 5 transfundierten Hunden, die niemals zuvor eine Transfusion erhalten hatten und während des Probenentnahmeintervalls nicht operiert wurden. Die Untersuchung wurde vor, direkt nach und 6, 12 und 24 Stunden nach Ende der Transfusion durchgeführt. Die VEGF-Konzentration von 3 der 5 Patienten lag zu jedem Zeitpunkt unterhalb der Nachweisgrenze. Bei einem Hund fiel der VEGF-Wert von 154 pg/ml vor Transfusion auf 53 pg/ml 24 Stunden nach Transfusion ab. Ein weiterer Hund zeigte nach 6 Stunden (176 pg/ml) und nach 24 Stunden (74 pg/ml) messbare Werte. Die Patientengruppe war für ein aussagekräftiges Ergebnis jedoch zu klein und zu heterogen. Weiterhin wurde 8 Hämangiosarkom-verdächtigen Hunden mit rupturierter abdominaler Masse in Milz (n=7) oder Leber (n=1) einmalig eine Plasmaprobe entnommen und untersucht. Zwei Patienten, deren Milzmassen sich als benigne herausstellten, zeigten Werte, The objectives of this study were to review the literature of transfusion risks in humans and dogs, and to determine the accumulation of vascular endothelial growth factor (VEGF) in stored blood products. VEGF is one of the most potent factors involved in angiogenesis and essential for embryonic development and wound healing. It is also secreted from different tumor cells, thereby promoting tumor angiogenesis and metastatic spread. VEGF is not only produced in endothelial and tumor cells but also in platelets and white blood cells. In stored human blood products such as whole blood and platelet-rich plasma the VEGF concentration increases due to the disintegration of these blood cells. This accumulation can be reduced by prestorage leukoreduction of blood products. The secretion of VEGF from tumor tissue has been reported in dogs; but there are no publications describing its accumulation in canine blood products. The use of a prestorage leukoreduction filter in dogs has been reported recently. The goal of this study was to evaluate the accumulation of VEGF in filtered and non-filtered canine blood products during storage as well as to evaluate the impact of leukocyte filters. VEGF measurements were performed using a human ELISA which has been evaluated for the detection of canine VEGF recently. VEGF was determined in plasma samples of 10 canine blood donors before donation. Samples were collected in tubes containing sodium citrate, theophyllin, adenosine and dipyridamine allowing maximal platelet stabilisation. Five of the 10 whole blood units were leukocyte-reduced with a 3rd generation filter (Sepacell RS-2000, Baxter, Unterschleißheim) before separation into packed red blood cell units and fresh frozen plasma. Packed red blood cell and plasma samples were taken immediately after separation; further aliquots of the packed red blood cell units were examined at weekly intervals. Fresh frozen plasma samples of 2 filtered and 2 non-filtered units were examined after storage for 4 to 6 weeks. There was no significant difference regarding the red blood cell counts between filtered and non- filtered units. However the leukoreduction filter effectively removed white blood cells and platelets (WBC count 0 – 0.2 G/l and platelet count 0 – 10 G/l after filtration). The VEGF concentration was below the detection limit of 9 pg/ml in plasma samples of 9 of the 10 blood donors. The VEGF concentration in one dog was 12 pg/ml. VEGF concentration was < 9 pg/ml in all pRBC and FFP units immediately after separation. The median VEGF concentration in the 5 non filtered packed red blood cell units was 37 (0 – 139) pg/ml after 1 week, 164 (0 – 333) pg/ml after 2 weeks and 110 (37 – 358) pg/ml after 3 weeks. During the entire storage time the 5 filtered packed red blood cell units and all fresh frozen plasma units had VEGF concentrations below the detection limit. Furthermore, plasma VEGF of 5 transfused patients were taken. The patients were not transfused previously and there was no surgery performed during the time of sample collection. The samples were examined before transfusion, immediately and 6, 12 and 24 hours after the transfusion. The VEGF concentration of 3 of the 5 dogs was below the detection limit at all time points. In one patient the concentration of VEGF decreased from 154 pg/ml before transfusion to 53 pg/ml 24 hours after transfusion. Another dog had messurable VEGF concentrations after 6 hours (176 pg/ml) and after 24 hours (74 pg/ml). One of the disadvantages of this study was the small and heterogenous study population. Furthermore 8 single plasma samples of dogs with a suspected hemangiosarcoma and abdominal bleeding from spleen (n=7) or liver (n=1) were taken and examined. Two dogs with benign tumors and 3 of 6 patients with verified hemangiosarcoma had concentrations < 9 pg/ml. The concentration of the other 3 hemangiosarcoma patients ranged from 33 to 106 pg/ml; 2 samples of abdominal blood showed much higher contents (625 and 1617 pg/ml respectively) than the corresponding plasma samples. In conclusion transfusion medicine is an important part in human medicine and veterinary practice. Many risk factors may be limited by a responsible use of blood products and development of fittings. Leukocyte-reduction filters are routinely used in human medicine. Its use is effective in preventing the release of VEGF during the storage of canine blood products. The higher costs of leukoreduction filters compared to standard multiple pack systems might reduce its routine use in veterinary practice. However the use of leukoreduced or fresh red blood cell products should be considered when transfusing dogs with hemangiosarcoma or other tumors.

Titel und Inhaltsverzeichnis 1 AUFGABENSTELLUNG 3 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 Einleitung M Definitionen von Begriffen Gründe für die Akkreditierung Akkreditierungsstand im Ausland Akkreditierungsstand in Deutschland Stand des Institutes für Transfusionsmedizin der Charité vor der Akkreditierung Voraussetzung für die CAP - Akkreditierung Optimierung der Qualitätskriterien der hergestellten Blutkomponenten 3 6 7 8 8 9 10 10 2 MATERIAL UND METHODEN 14 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 Vorbereitung zur Akkreditierung Leukozytendepletion Bestrahlungsverfahren Lagerung von Erythrozytenkonzentraten Lagerung von Thrombozytenkonzentraten Lagerung von Frischplasma Blutprodukte aus der Routineherstellung Statistik 14 17 18 18 20 20 21 25 3 ERGEBNISSE 26 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 Audits und Akkreditierung Leukozytendepletion von Erythrozytenkonzentraten Sterilitätsuntersuchungen Lagerungsuntersuchungen unbestrahlter u. bestrahlter Erythrozytenkonzentrate Bestrahlungsuntersuchungen an Thrombozytenkonzentraten Lagerungsuntersuchungen an Thrombozytenkonzentraten ohne Bestrahlung Lagerungsuntersuchung von Aphereseplasma Qualitätsuntersuchungen an Blutprodukten aus der Routineherstellung 26 27 29 29 40 52 61 65 4 DISKUSSION 77 4.1 4.2 Audits und Akkreditierung bis 2003, Transfusionsgesetz (TG), Qualitätsmanagement (QM) Blutkomponenten 77 80 5 ZUSAMMENFASSUNG 95 6 LITERATURVERZEICHNIS 98, Die Hauptaufgabe in dieser Arbeit bestand darin, bereits 1995 ein Qualitätsmanagementsystem im Institut für Transfusionsmedizin der Charité einzurichten. Das Institut wurde auf internationaler Ebene durch das College of American Pathologists (CAP) bereits 1997 akkreditiert. Da im Mittelpunkt der Akkreditierung die Etablierung eines funktionierenden good manufactoring practice (GMP), good laboratory practice (GLP) und Qualitätsmanagementsystems stand und eine vollständige Berücksichtigung der nationalen Vorgaben bei CAP möglich war, waren alle später entstandenen Anforderungen für die Einrichtung einer Qualitätssicherung durch das Inkrafttreten des Transfusionsgesetzes 1998 in Deutschland bereits erfüllt. Während das Transfusionsgesetz nur ein Gerüst für die Qualitätssicherung darstellt, schreibt CAP für alle Abläufe, einschließlich der Labordiagnostik, definierte Ausführungs-bestimmungen vor. Durch das von CAP vertretene Prinzip der Transfusionsmedizin "von der Nadel (Blutspender) bis zur Nadel (Patient)", alle Prozesse qualitätssicherend nach dem aktuellen Stand der Wissenschaft zu begleiten, werden die Prinzipien des neuen modernen TQM (Total Quality Management) realisiert. Eine weitere wichtige Besonderheit der Akkreditierung ist der Peer-Review. Dadurch ist ein positiver Erfahrungsaustausch unter Gleichen gewährleistet. Dies ist von hoher psychologischer Bedeutung für die Anwender und führt direkt zur Qualitätssicherung. Daher wird die Akkreditierung transfusionsmedizinischer Einrichtungen in Deutschland zusätzlich zum Transfusionsgesetz empfohlen. Im Rahmen der Akkreditierung und der qualitätssichernden Maßnahmen am Institut für Transfusionsmedizin der Charité wurden Untersuchungen durchgeführt, mit dem Ziel die Qualität der mit verschiedenen Verfahren hergestellten Blutprodukte zu optimieren. Dazu wurden Blutproben aus Erythrozyten- und Thrombozytenkonzentraten, sowie aus Frischplasma unmittelbar nach deren Herstellung und während deren Lagerung auf relevante Qualitätsmerkmale untersucht. Zusätzlich zu den unbestrahlten Blutprodukten wurde die veränderte Qualität bestrahlter Blutprodukte untersucht. Bei der Bestrahlung der EK mit einer Dosis von 20 Gy sind noch 10 bis 15 % proliferationsfähige Zellen vorhanden. Auch bei einer Bestrahlung mit 30 Gy existieren noch ca. 3 % proliferationsfähige Zellen. Nach Bestrahlung und Lagerung der Blutprodukte wurden die allgemein bekannten Veränderungen bei den Erythrozytenkonzentraten wie der extrazelluläre Anstieg der K-, LDH- und Hämoglobin-Konzentration gefunden. Unter Berücksichtigung aller bestimmten Qualitäts-Parameter wurde festgestellt, dass die Bestrahlung der untersuchten EK bis zum 28. Tag nach der Herstellung zu keinem nachteiligen Effekt geführt hat, im Vergleich zu den unbestrahlten EK. Auch die Qualität bestrahlter und unbestrahlter TKs war weitgehend identisch. Die Untersuchung von Buffy coat-armen und Leukozyten depletierten ergab eine starke lagerungszeitabhängige Zunahme der IL-1RA Konzentration in Buffy coat-armen EK, aber nicht in Leukozyten depletierten EK’s. Die ansteigenden Mengen von IL-1RA in den Überständen von nicht gefilterten Blutprodukten können demnach zum immunsuppressiven Effekt von Bluttransfusionen beitragen. Sowohl hinsichtlich der Wirkstoffgehalte, der Reinheit, als auch der am Ende der Haltbarkeit bestimmten Qualitätsparameter genügten alle Arzneimittel den Anforderungen, die sich aus den Vorgaben des PEI ergeben. Somit hat die Einführung nationaler und internationaler Qualitätsstandards bewirkt, dass die Qualität aller hergestellten Blutprodukte zu jedem Zeitpunkt Spitzenanforderungen erfüllte., The goal of this study was to implement a quality system within the Institute for Transfusion Medicine at the Charité in 1995. In 1997, the institute became accredited by the international accreditation institute the College of American Pathologists (CAP). The implementation of good manufacturing practice (GMP), good laboratory practice (GLP), and a quality system are the main criteria for accreditation, and a complete consideration of national regulations is warranted by CAP. Thus, it was possible to fulfil all demands specified by the German Transfusion Law in 1998. While this law reflects only the skeleton of quality management, CAP provides the exact procedures for all processes including laboratory diagnostics. In addition, CAP holds the principle from needle (blood donor) to needle (patient), and all processes are scientifically controlled, allowing the realisation of the principle of modern total quality management. Another aspect of accreditation is the peer-review process which allows a positive exchange of experiences between the involved experts. This is very important from a psychological view point for personnel, and leads to quality assurance. Therefore, accreditation of other German transfusion centres is recommended. In the setting of accreditation and quality management, different studies have been made to optimize the quality of the blood products produced at the Charité. Samples were taken from red blood cell concentrates (EC), platelet concentrates (TC), and fresh frozen plasma (FFP) to test their quality prior to and during storage. In addition, irradiated and non-irradiated products were investigated. It has been shown that these products still contain up to 15% proliferative lymphocytes following irradiation with 20 Gy, and 3% following irradiation with 30 Gy. As generally expected, potassium, lactate dehydrogenase and free hemoglobin increased after storage. Considering all measured quality controls, irradiation did not result in a negative effect in comparison to non- irradiated EC. Similarly, the quality of irradiated and non-irradiated TC was essentially equal. The investigation of buffy-coat free and leukocyte depleted EC showed an increase of IL-IRA in the former concentrates, but not in the latter concentrates. This may explain the immunosuppressive effect of leukocyte undepleted concentrates. The quality of EC, TC and FFP was investigated during the period from November 1998 to March 2000. The results including function, purity and quality of the products at the end of storage fulfilled the demands required for drugs and the regulation of PEI. Hence, the introduction of national and international quality standards resulted in an improved quality of all produced blood products.

Um die Qualität von Blutprodukten nach GMP zu überprüfen, wurden 72 Blutspenden bzw. ihre Folgeprodukte Erythrozytenkonzentrat in PAGGS-M, gefiltertes Erythrozytenkonzentrat und Fresh Frozen Plasma untersucht. Zusätzlich wurden an jeweils 12 Blutderivaten, die z.T. nicht zum Routineprogramm des Blutspendedienstes der Abteilung für Klinische Hämostaseologie und Transfusionsmedizin in Homburg/Saar gehören, Messungen durchgeführt, um ihre Qualität am Herstellungstag und am Ende der Haltbarkeit zu bestimmen. Als letztes wurden schließlich auch rheologische Parameter an 21 Erythrozytenkonzentraten in PAGGS-M und Fresh Frozen Plasma über einen Zeitraum von 28 Tagen gemessen und dokumentiert. Die Messung der Parameter, sowohl hämatologische als auch hämostaseologische und hämorheologische, erfolgte nach Standardmethoden. Die Ergebnisse waren insgesamt nicht zufriedenstellend. Ausschlaggebende Grundlage der Untersuchung sind die GMP-Richtlinien, die sich an den europäischen Normen orientieren. Zwar zeigten die Produkte, die routinemäßig hergestellt werden, wie auch die, die nur für diese Untersuchung produziert wurden, in vielen Bereichen ein Übereinstimmen mit den Vorschriften. Speziell auch die Qualität der gefilterten Erythrozytenkonzentrate, die besonders für Immunsupprimierte wegen ihres niedrigen Gehalts an Leukozyten verwendet werden, war in vielen Fällen gut. Die Ergebnisse der rheologischen Messungen glichen denen anderer Studien: so wurde ein Abfall der Fließfähigkeit über den Meßzeitraum hinweg beobachtet, was auf ein leichtes Schwellen der Zellen und eine Zunahme der Rigidität zurückzuführen ist. Fast durchgängig wich der Meßwert für den Hämatokrit der EK von der Richtlinie ab, am stärksten in PAGGS-M. Als Grund hierfür wurde eine Meßungenauigkeit des elektronischen Zellzählers bzw. die Methode der Bestimmung angesehen, so daß eine echte Abweichung als unwahrscheinlich anzusehen ist. Jedoch wurde die vorgeschriebene maximale Hämolyserate mit Ablauf der Haltbarkeit häufig überschritten, ebenso wie die gemessenen Leukozytenzahlen. Eine Vielzahl der Plasmen war durch Erythrozyten und Leukozyten kontaminiert. Durch häufige Waschvorgänge beim Auftauen von tiefgefrorenen EK wurde ein erhöhter Hb-Überstand erzeugt, das geforderte Mindestvolumen wurde dabei unterschritten. Daher ist festzuhalten, daß für jede untersuchte Produktgruppe Abweichungen festgestellt wurden, die in diesem Maße nicht tolerabel sind. Damit ist die Qualität der Produkte insgesamt als unzureichend zu bezeichnen. Der hier geführte Nachweis dieser Abweichungen ermöglichte die Einführung geänderter Herstellungsverfahren, so daß die heute erzeugten Produkte den Qualitätsvorschriften entsprechen., 72 blood donations and their follow-up products (red blood cell concentrates resuspended in PAGGS-M, leukocyte-reduced red cell concentrates and fresh frozen plasma) were investigated to check their quality. Additionally, tests were performed on blood components of which most were not part of the routine program in the Department of Hemostaseology and Transfusion Medicine in Homburg/Saar. Finally, rheological parameters of red blood cell concentrates in PAGGS-M and of fresh frozen plasma were measured and documented over a period of 28 days. The results were not satisfying. Both the routine products and the blood components which were only produced for this study met the GMP-guidelines in many cases. Especially the quality of leukocyte-reduced red blood cell concentrates which are used especially for the transfusion for immunocompromised patients was good. The results of the rheological measurements were similar to those of other studies: decreasing flow over a period of time which was put down to slight swelling of the cells and to a rise in erythrocyte rigidity. The average hematokrit of red cell concentrates was generally too low especially in PAGGS-M. The reason for this was thought to be the electronic cell counter or rather the method of measuring. Hemolysis after storage and mean leucocyte count often exceeded the official dates. Many samples of the FFP were contaminated with red and white blood cells. Repeated washing after thawing of frozen red blood cell concentrates caused an excess of extracellular haemoglobin and low concentrate volumes. Any deviation from the guidelines is not tolerable. After this study adjustments in the production could be made so blood products now meet all of the requirements.