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Le mélanome est le cancer de la peau le plus mortel. Il est caractérisé par une grande hétérogénéité et une reprogrammation métabolique importante qui lui confère l’habileté de promouvoir des programmes immunosuppressifs et de développer une résistance aux traitements. Cette capacité permet au mélanome d’agir sur le microenvironnement tumoral et d’échapper à l’immunosurveillance du système immunitaire. La famille des peroxisome-proliferator activated receptor gamma coactivator 1 (PGC-1s) est un joueur clé du métabolisme cellulaire en régulant la biogenèse mitochondriale, la phosphorylation oxydative et la détoxification du stress oxydatif. Des études ont montré que l’expression de PGC-1α module la fonction mitochondriale. Les fonctions de PGC-1β et PRC, les 2 autres membres de cette famille, dans le mélanome restent largement inexplorées. Ce mémoire montre pour la première fois que l’expression des PGC-1s est non seulement associée à l’expression de plusieurs molécules pro-inflammatoires (IL-8, TNF, IL-1), mais aussi à l’expression de molécules immunosuppressives (CD73, PD-L2, Galectin-9) pouvant contrôler la réponse immunitaire. Par l’utilisation d’inhibiteurs ciblant des voies de signalisation de l’immunité innée, nous avons montré que la régulation de ces molécules s’effectue via MEK et IKK dans les cellules déplétées en PGC-1β. La déplétion en PGC-1 altère la fonction mitochondriale, induisant l’expression de p21 et l’arrêt du cycle cellulaire d’une manière soutenue et via un mécanisme indépendant des dérivés réactifs de l’oxygène (ROS). Nos travaux montrent que les PGC-1s possèdent d’importantes fonctions immunitaires dans le mélanome qui peuvent potentiellement dicter la croissance tumorale, l’évasion cellulaire et la réponse aux thérapies anticancéreuses., Melanoma is the deadliest form of skin cancer. It is defined by great heterogeneity and extensive metabolic reprogramming which gives it the ability to promote immunosuppressive programs and develop therapy resistance. This ability allows melanoma to define the tumor microenvironment and escape the immunosurveillance of the immune system. The peroxisome-proliferator activated receptor gamma coactivator 1 (PGC-1s) family is a key player in cell metabolism by regulating mitochondrial biogenesis, oxidative phosphorylation and oxidative stress detoxification. Studies have shown that the expression of PGC-1α is linked to increased mitochondrial function and the metastatic potential of melanoma. The functions of PGC-1β and PRC, the other 2 members of this family, in melanoma remain largely unexplored. This thesis shows for the first time that the expression of PGC-1s is not only associated with the expression of several pro-inflammatory molecules (IL-8, TNF, IL-1) but also with the expression of immunosuppressive molecules (CD73, PD-L2, Galectin-9) which can control the immune response. Using inhibitors targeting innate immunity signaling pathways, we have shown that the regulation of these molecules occurs via MEK and IKK in PGC-1β depleted melanoma cells. Depletion of PGC-1 impairs mitochondrial function and leads to p21 induction and cell cycle arrest in a sustained manner by a reactive oxygen species (ROS)-independent mechanism. Our work shows that PGC-1s have important immune functions in melanoma that can potentially dictate tumor growth, cell evasion and response to cancer therapies.

Le cycle cellulaire eucaryote se divise en une série de phases ordonnées qui ont pour finalité la division cellulaire. Ce processus est primordial dans la prolifération des cellules normales et le développement, mais il est aussi très fortement dérégulé dans les cellules cancéreuses. Les phases de cycle cellulaire sont différenciées par les tâches effectuées au cours de celles-ci et requièrent l’expression de gènes spécifiques à chacune des phases. Chez l’humain, il existe environ 1000 gènes dont l’expression est dépendante de la phase du cycle cellulaire. Les mécanismes impliqués dans le contrôle de l’expression périodique de ces gènes ont principalement été étudié aux niveaux transcriptionnels et post-traductionnels. Cependant, la régulation post-transcriptionnelle demeure encore peu étudiée dans le contexte du cycle cellulaire, malgré son importance dans le contrôle de l’expression génique. Afin d’identifier des régulateurs post-transcriptionnels du cycle cellulaire, nous avons analysé la corrélation existante entre l’expression des gènes périodiques du cycle cellulaire et celle de 687 protéines liant l’ARN (RNA-binding protein; RBP) sur plus de 1000 spécimens de cancer du sein. Cette analyse nous a permis d’identifier 39 RBP dont les protéines Nuclear Factor 45 (NF45) et Nuclear Factor 90 (NF90). NF45 et NF90 forment un hétérodimère qui lie des structures d’ARN double brin et qui contrôle l’expression génique à différents niveaux de l’épissage à la stabilisation des ARNm. La déplétion de NF45 ou NF90 inhibe la prolifération des cellules en induisant de nombreux défauts mitotiques qui résultent d’une baisse d’expression de plusieurs gènes essentiels à la mitose. D’autre part, à l’aide d’une méthode de protéomique nous avons réalisé l’interactome du complexe NF45-NF90 afin de déterminer à quels niveaux ce mécanisme de régulation prend place et avons identifié une interaction avec le complexe Staufen1/2-UPF1 responsable de la dégradation des ARNm. Ainsi, les niveaux d’expression de certains ARNm importants à la mitose sont conditionnés par une compétition entre NF45-NF90 et Staufen1/2 pour la liaison à ces ARNm. Dans une seconde étude, nous avons recherché les régulations potentielles sur NF45 et NF90 au cours du cycle cellulaire et avons i découvert des évènements de phosphorylation sur NF90 prenant place en phase G2/M. Nous avons montré que cette phosphorylation est médiée par CDK1, et l’activation de CDK1 provoque la translocation de NF90 du noyau vers le cytoplasme. Enfin, au vu de l’implication du complexe NF45-NF90 dans la prolifération des cellules cancéreuses, nous avons réalisé un essai de criblage à haut débit de 120 000 molécules sur l’interaction entre NF45 et NF90. Cet essai nous as permis d’identifier plus de plus 1000 molécules pouvant potentiellement interférer avec le complexe NF45-NF90. Parmi celles-ci, nous avons retrouvé 14 molécules de la famille des glycosides cardiaques, qui sont des composés antiarythmiques mais qui par ailleurs possèdent des effets anticancéreux décrits depuis plusieurs décennies. De façon intéressante, le traitement des cellules à ces composés mène à un phénotype mitotique très similaire à la déplétion de NF45 ou NF90, suggérant une implication du complexe NF45-NF90 dans les effets antimitotiques induits par les glycosides cardiaques. En conclusion, ces études nous ont permis d’éclairer le rôle du complexe NF45-NF90 dans la prolifération cellulaire, mais aussi d’approfondir la compréhension des différents mécanismes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire., The eukaryotic cell cycle is divided into a series of ordered phases leading to cell division. This process is essential in normal cell proliferation and development, but it is also largely deregulated in cancer cells. Cell cycle phases are differentiated by the different molecular processes performed and expression of specific genes at each phase is determinant. In humans, there are approximately 1000 genes that are periodically expressed throughout the cell cycle. Control of this periodic expression has been well characterized at the transcriptional and post-translational levels. However, post-transcriptional regulation remains little studied in the context of the cell cycle, despite its importance in the control of gene expression. In order to identify post-transcriptional cell cycle regulators, we have correlated the expression of cell cycle genes with the expression of 687 RNA-binding proteins (RBP) in more than 1000 breast cancer specimens. This analysis allowed us to identify 39 RBPs, including Nuclear Factor 45 (NF45) and Nuclear Factor 90 (NF90). NF45 and NF90 form a heterodimer that binds double-stranded RNA structures and controls gene expression at various levels, from splicing to stabilization of mRNAs. Depletion of NF45 or NF90 inhibits cell proliferation by inducing several mitotic defects resulting from decreased expression of many genes essential for mitosis. In order to determine at which levels this regulatory mechanism takes place, we performed a proteomic method to identifyNF45-NF90 proximal interactors and identified an interaction with the Staufen1/2-UPF1 complex responsible for the degradation of mRNAs. Thus, it appears that the expression of some mitotic mRNAs is controlled by a competition between NF45-NF90 and Staufen1/2 for binding to these mRNAs. In a second study, we looked for potential regulations on NF45 and NF90 during the cell cycle and found phosphorylation events on NF90 taking place in the G2/M phase of the cell cycle. We have shown that this phosphorylation is CDK1-dependent, and that CDK1 activation leads to the translocation of NF90 from the nucleus to the cytoplasm. Finally, based on the involvement of the NF45-NF90 complex in cancer cell proliferation, we carried out a high-throughput screening assay of 120,000 ii. Abstract ii molecules on the interaction between NF45 and NF90. This assay allowed us to identify more than 1000 molecules that could potentially interfere with the NF45-NF90 complex. Amongst them, we found 14 molecules belonging to the cardiac glycoside family, which are antiarrhythmic drugs that also display anticancer effects. Interestingly, treatment with cardiac glycosides leads to a mitotic phenotype very similar to the depletion of NF45 or NF90, suggesting an involvement of the NF45-NF90 complex in the antimitotic effects induced by cardiac glycosides. In conclusion, these studies have shed light on the role of the NF45-NF90 complex in cell proliferation, but also deepened our understanding of the different mechanisms involved in cell cycle control.

The poor prognosis of pancreatic cancer (PC) is explained by a late diagnosis and lack of efficient treatments. A better understanding of the molecular mechanisms that govern its initiation, progression and resistance to most chemotherapies is essential to improve the patient care. TRIP12 (Thyroid hormone Receptor Interacting Protein 12) is an HECT (Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus) type E3 ubiquitin ligase. TRIP12 regulates cell cycle and chromosome stability, it is involved in chromatin remodeling, DNA damage response and activation of P53 pathway. TRIP12 mRNA is overexpressed in pancreatic cancer. Furthermore, TRIP12 is involved in PTF1a (Pancreas Transcription Factor 1a) degradation, a transcription factor essential for the development and homeostasis of the pancreatic acinar cells. PTF1a is a tumor suppressor that is lost during pancreatic carcinogenesis suggesting a role of TRIP12 in PC. My first thesis goal was to determine why TRIP12 expression increases during PC and what are the consequences of its increased expression. I also hypothesized that TRIP12 plays a role in the PC initiation. My second thesis goal was to determine how TRIP12 contributes to the acinar cells reprogramming into ductal cells, the first step in the preneoplastic lesions formation. I demonstrated that TRIP12 expression is necessary for pancreatic tumor growth and its expression is variable within tumors and patients derived-cell lines. I showed that TRIP12 expression is heterogeneous in these cell lines and is explained 1) - by different mRNA levels linked to the activity of the TRIP12 promoter and 2) - by a different TRIP12 protein regulation during the cell cycle involving the deubiquitinase USP7 and a defect in TRIP12 protein nuclear export. Pancreatic cell lines with a high level of TRIP12 had a better response to anticancerous agents highlighting the role of TRIP12 in chemosensitivity. Moreover, results obtained from a novel mouse model showed that TRIP12 conditional invalidation in the pancreas during embryogenesis does not alter the pancreas development and function in adulthood. However, TRIP12 is essential for PC initiation. Indeed, TRIP12 loss in acinar cells prevents acino-ductal metaplasia. TRIP12 is also important for cancer progression since its absence reduces tumor development mediated by Kras mutation and loss of P53. My thesis researches demonstrated that TRIP12 is a decisive player in PC and explained the TRIP12 heterogeneity of expression observed in pancreatic tumors. This new knowledge could offer new treatment opportunities for PC where the need is huge. TRIP12 is a candidate protein of high importance which may contribute to innovative therapeutic strategies., Le mauvais pronostic du cancer du pancréas (CP) peut s'expliquer par un diagnostic tardif et le manque de traitements efficaces. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui régissent l'initiation, la progression et la résistance aux chimiothérapies est indispensable pour améliorer la prise en charge des patients. TRIP12 (Thyroid hormone Receptor Interacting Protein 12) est une E3 ubiquitine ligase de la famille HECT (Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus). TRIP12 régule le cycle cellulaire et la stabilité chromosomique, elle intervient dans le remodelage de la chromatine, dans la réponse aux dommages à l'ADN et dans l'activation de la voie P53. L'ARNm de TRIP12 est surexprimé dans le CP. De plus, TRIP12 est impliquée dans la dégradation de PTF1a (Pancreas Transcription Factor 1a), facteur de transcription essentiel du développement et de l'homéostasie des cellules acinaires du pancréas, suppresseur de tumeur dont l'expression est perdue au cours de la carcinogénèse pancréatique. Ces données suggèrent un rôle de TRIP12 dans le CP. Mon premier objectif de thèse était de déterminer pourquoi l'expression de TRIP12 augmente dans le CP et quelles en sont les conséquences. J'ai également émis l'hypothèse que TRIP12 joue un rôle dès l'initiation du CP. Mon second objectif de thèse était de déterminer si et comment TRIP12 contribue à la reprogrammation des cellules acinaires en cellules canalaires, première étape de la formation de lésions prénéoplasiques. J'ai découvert que TRIP12 est nécessaire à la croissance des tumeurs pancréatiques et que son expression est variable dans les tumeurs et les lignées cellulaires dérivées de CP. J'ai démontré que l'hétérogénéité d'expression de TRIP12 dans ces lignées cellulaires s'explique 1)- par des niveaux d'ARNm différents liés à l'activité du promoteur du gène Trip12 et 2)- par une régulation différente de la protéine TRIP12 au cours du cycle cellulaire mettant en jeu la déubiquitinase USP7 et un défaut de l'export nucléaire de TRIP12. Les lignées pancréatiques ayant un taux élevé de TRIP12 répondent mieux aux agents anticancéreux mettant en évidence le rôle de TRIP12 dans la chimiosensibilité des cellules cancéreuses pancréatiques. Par ailleurs, les résultats obtenus à partir d'un nouveau modèle murin montrent que l'invalidation conditionnelle de TRIP12 dans le pancréas au cours de l'embryogenèse n'altère pas le développement et la fonction du pancréas à l'âge adulte. Cependant, TRIP12 est capitale pour l'initiation du CP. En effet, la perte de TRIP12 dans les cellules acinaires empêche la métaplasie acino-canalaire. TRIP12 est aussi importante pour la progression du CP car son absence ralentit le développement des tumeurs engendrées par la mutation du gène Kras et la perte du gène P53. L'ensemble de mes travaux de thèse montre que TRIP12 est un acteur décisif du CP et explique l'hétérogénéité d'expression de TRIP12 observée dans les tumeurs pancréatiques. Ces nouvelles connaissances pourraient offrir de nouvelles options thérapeutiques pour le CP où le besoin est énorme. TRIP12 est une protéine candidate de haute importance qui peut contribuer aux stratégies de thérapie par des médicaments innovants.

Type 2 Diabetes (T2D) is one of the most prevalent diseases in modern society, with more than 415 million people living with it. In recent years, treatments targeting Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1), a hormone secreted by entero-endocrine L-type cells, as well as its receptor agonists (GLP-1R), have been shown to be effective in restore normal blood glucose levels in diabetic patients.The laboratory has been interested for some years in the potential links existing between the regulators of the cell cycle and the metabolism, and in particular the protein E2F1. E2F1 has been shown to be an important regulator of metabolism with a role in adipose tissue, liver, muscle and pancreas.The GLP-1 pathway in the Beta cell (insulin secretory cell) and E2F1 signaling pathway have similar effects with a role on proliferation, anti-apoptotic and important effects in insulin secretion.From these observations, we investigated a potential link between E2F1 and the GLP-1 pathway within the pancreatic beta cell., Le Diabète de type 2 (DT2) est l’une des maladies les plus répandues dans la société moderne, avec plus de 415 millions de personnes atteintes. Ces dernières années, des traitements visant le Glucagon-Like Peptide 1 (GLP-1), hormone sécrétée par les cellules entéro-endocrines de type L, ainsi que des agonistes de son récepteur (GLP-1R), se sont avérés efficaces dans le rétablissement d’une glycémie normale de patients diabétiques.Le laboratoire s'intéresse depuis quelques années aux liens potentiels existant entre les régulateurs du cycle cellulaire et le métabolisme, et notamment la protéine E2F1. E2F1 a été montré comme un régulateurs important du métabolisme ayant un rôle dans le tissus adipeux, le foie, le muscle et le pancréas.La voie du GLP-1 dans la cellule Bêta (cellule sécrétrice d'insuline) et celle de E2F1 ont des effets similaires avec un rôle sur la prolifération de ces cellules, un rôle anti-apoptotique et des effets importants dans la sécrétion d'insuline.De ces observations, nous nous sommes intéressés à un lien potentiel entre E2F1 et la voie du GLP-1 au sein de la cellule bêta pancréatique.

The Pacific cupped oyster, Crassostrea gigas is a successive irregular hermaphrodite bivalve mollusc with an annual and seasonal breeding cycle. Its gametogenetic cycle is strongly influenced by the environment parameters. Most of living species, oysters are naturally diploids (2n). For shellfish aquaculture, triploids oysters (3n) have been developed to obtain sterile animals. Therefore, they exhibit a higher growth by allocating these energy reserves for the growth. But, some studies have shown the ability of a group of 3n oysters (named 3nα) to carry out gametogenesis closed to 2n with numerous proliferating gonial cells and a second group without or with low reproduction potential (named 3nβ) showing an abnormal accumulation of locked germ cells with condensed nuclei. Our study aims to understand the regulations of spermatogenesis in both α and β groups, during mitosis and meiosis events. Thus, our results argue to the deregulation of the germinal lineage and the establishment of the gonadal tract to explain the lower spermatogenesis in 3n oysters. Transcriptomic analysis on the SAC (Spindle Assembly Complex) actors and a proteomic approach reveals the involvement of a cell spindle checkpoint during mitosis and meiosis and of the meiotic homologous recombination in the successful of spermatogenesis in 3nα and disruptions in 3nβ. The spermatogenesis of the 3nα oysters can be explain by epigenetic regulations such as DNA methylation have involved in gene silencing. To conclude, these results provide major data to understand the reproductive regulations of 3nα and β, particularly in the context of global changes, regarding the natural 2n oysters., L'huître creuse du Pacifique, Crassostrea gigas, est un mollusque bivalve hermaphrodite irrégulier successif avec un cycle de reproduction annuel et saisonnier. Son cycle gamétogénétique est fortement influencé par les paramètres environnementaux. Comme la plupart des êtres vivants, les huîtres sont naturellement diploïdes (2n). Pour la conchyliculture, les huîtres triploïdes (3n) ont été développées afin d'obtenir des animaux stériles. Par conséquent, elles présentent une croissance plus élevée en allouant leurs réserves d'énergie uniquement à la croissance. Cependant, des études ont montré la capacité d'un groupe d'huîtres 3n (nommées 3nα) à réaliser une gamétogenèse proche des 2n avec de nombreuses gonies en prolifération et un second groupe sans ou avec un faible potentiel de reproduction (nommé 3nβ) présentant une accumulation anormale de cellules germinales bloquées avec des condensations nucléaires. Notre étude aspire à comprendre les régulations de la spermatogenèse dans les groupes α et β, lors de la mitose et de la méiose. Ainsi, nos résultats montrent que la spermatogenèse plus faible chez les huitres 3n résulte tout d’abord d'une dérégulation de la lignée germinale et de la mise en place du tractus gonadique. L’analyse transcriptomique des acteurs du SAC (Spindle Assembly Complex) et une approche protéomique montrent l'implication du point de contrôle du fuseau pendant la mitose et la méiose et des régulations de la recombinaison homologue méiotique dans le succès de la spermatogenèse chez les 3nα et dans l’échec de celle des 3nβ. La spermatogenèse des 3nα peut également être liée à des régulations épigénétiques telles que la méthylation de l'ADN impliquées dans le silençage génique. Pris ensemble, ces résultats fournissent des données importantes pour comprendre les régulations de la reproduction 3nα et β, surtout dans le contexte des changements globaux vis-à-vis des huîtres 2n naturelles.

Metastases account for the great majority of cancer-associated deaths. Metastasis formation consists in several steps from the invasion of the tissue surrounding the primary tumor, intravasation in the bloodstream where they survive as circulating tumor cells (CTCs), to extravasation and colonization of distant organs in order to form malignant lesions. The escape of individual cells from the primary tumor is at the initiation of this process. Nonetheless, recent advances have shown the invasion and migration of cellular groups in the metastasis formation cascade. Clusters of CTC has been identified in the blood of patients in many cancers and they have shown to have a higher metastatic potential than single CTC. Moreover, their presence in patient bearing tumors is characterized as a worse prognosis in cancer evolution. Thus, the understanding of the mechanisms underlying the formation of these aggregative tumor cell structures is an important issue in the treatment of cancer progression. The cell cycle is a physiological process controlled by several regulators as cyclin-dependent kinases (CDKs) leading to cell division in two identical daughter cells. Alterations of the cell-cycle regulation is the most fundamental trait of cancer cells inducing their ability to sustain chronic proliferation. The aim of my work was to study the relationship between tumor cells ability to form clusters and their cell cycle dynamic progression. We used semi-automated imaging technologies combining time lapse microscopy and image processing to perform a quantitative analysis of the dynamic of aggregation of breast tumor cells in vitro in anchorage-independent conditions. First of all, we aim to determine the role of tumor cell aggregation in the cell-cycle progression. At the cellular population scale, we did not highlight a modification of the cellular repartition in the cell cycle during this process. In order to measure this phenomenon at the cell scale, we used an MCF-7 cell line expressing a fluorescent reporter for CDK2 kinase activity. This work allowed us to show that cells having cross the restriction point formed clusters less efficiently, suggesting that the position of cells in the cycle modulated their ability to aggregate. In a second time, I studied the impact of altered progression of breast tumor cells in the cell cycle in response to pharmacological treatments on their ability to form clusters. Thus, I demonstrated that cells synchronized at the intra-mitotic checkpoint showed an impairment of their ability to aggregate that appears to be associated with a reduced ability to form membrane extensions. Similarly, treating MCF-7 cells with taxol or with vinorelbin, two microtubules targeting poisons used in anti-tumor therapy, impairs their ability to aggregate. Besides, preliminary results obtained with CDK4/6 cyclin dependent kinases inhibitors treatments also showed an impaired ability to form clusters. Together these data provide new and complementary elements to the previous studies based on the regulators of cluster formation involved in the formation of metastases and could provide a better understanding of the effects, possibly adverse, of certain treatments.; La mortalité associée au cancer est principalement liée à la maladie métastatique. Le mécanisme de formation des métastases comporte plusieurs étapes depuis le détachement de cellules de la tumeur primaire, leur intravasion dans les systèmes circulatoires où elles survivent sous forme de cellules tumorales circulantes (CTCs), puis leur extravasion dans les organes distants où elles établissent des lésions malignes. Initialement décrit comme provenant de l'échappement de cellules individuelles depuis la masse tumorale primaire, depuis plusieurs années, le détachement et la migration de groupes de cellules ont également été observés et mis en lien avec la formation de métastases. On les retrouve au niveau de la circulation sanguine sous forme de clusters de CTC dont le potentiel métastatique a été révélé comme supérieur à celui de cellules tumorales circulantes isolées. De plus, leur présence chez les patients est associée à un pronostic péjoratif d'évolution de la maladie. Ainsi, la compréhension des mécanismes responsables de la formation de ces structures agrégatives de cellules tumorales présente un enjeu majeur dans le traitement de la progression du cancer. Le cycle cellulaire est un processus physiologique contrôlé par différents régulateurs tels que les kinases dépendantes des cyclines (CDK), et assure le bon déroulement du phénomène de division cellulaire d'une cellule mère en deux cellules filles identiques. Des altérations de sa régulation sont des caractéristiques associées à la prolifération incontrôlée des cellules tumorales. Dans ce contexte, l'objectif de mes travaux de thèse a été d'étudier les relations entre la capacité des cellules tumorales à former des clusters et la dynamique de progression dans le cycle cellulaire. Nous avons mis en œuvre différentes technologies semi-automatisées, précédemment développées au laboratoire, associant l'imagerie en temps réel et le traitement d'image. Ces approches nous ont permis de réaliser une analyse quantitative de la dynamique l'agrégation des cellules tumorales mammaires de la lignée MCF-7 in vitro en condition ancrage-indépendant. Dans une première partie de nos travaux, nous avons cherché à déterminer le rôle l'agrégation des cellules tumorales sur la progression des cellules dans le cycle cellulaire. A l'échelle de la population cellulaire, nous n'avons pas mis en évidence de modification de la répartition des cellules dans le cycle cellulaire au cours de ce processus. À l'échelle cellulaire, via l'utilisation d'une lignée de cellules MCF-7 exprimant un rapporteur fluorescent de l'activité de la kinase CDK2, nous avons montré que les cellules ayant franchi le point de restriction (R) formaient des clusters de manière moins efficace, suggérant que la position des cellules dans le cycle modulait leur capacité à agréger. Dans une seconde partie, j'ai étudié l'impact de l'altération de la progression des cellules tumorales mammaires dans le cycle cellulaire en réponse à des traitements pharmacologiques sur leur capacité à former des clusters. J'ai ainsi montré que des cellules synchronisées au point de contrôle intra-mitotique, présentaient une altération de leur capacité à agréger, altération qui semble être associée à une moindre capacité à former des extensions membranaires. De manière similaire, le traitement des cellules MCF-7 avec du taxol ou avec de la vinorelbine, deux poisons des microtubules utilisés en thérapie anti-tumorale, altère leur capacité à agréger. Dans une moindre mesure, des résultats préliminaires ont également montré qu'un traitement avec les inhibiteurs des kinases dépendantes des cyclines CDK4/6 altérait la capacité à former des clusters. Ensemble, ces résultats apportent des éléments nouveaux et complémentaires aux études préalables réalisées sur les régulateurs de la formation de clusters impliqués dans la formation de métastases et pourraient permettre de mieux comprendre les effets, parfois adverses, de certains traitements.

In this thesis, we are interested in the qualitative analysis of the dynamics of two biological cycles that are central in eukaryotic cells, the cell division cycle and the circadian clock. For that purpose, we use asynchronous Boolean networks that provide an adapted qualitative framework. In these networks, cycles are captured by complex attractors containing hundreds of states. A new method for the analysis of such complex attractors is proposed. It is based on the construction of a summary graph of the attractor, enabling the comparison between the attractor's trajectories and qualitative properties of the biological cycle. The method is illustrated on a cell cycle model from the literature and of a circadian clock model we built from an existing continuous model. In both models our method proves to be efficient to visualize the attractor's structure and to compare it with the biological cycle. By combining the summary graph with a Markov chain, proportions of time spent in each phase are estimated. By combining it with a Boolean inference technique, we show how to locally adjust the asymptotic dynamics of the model in order to force specific dynamical properties. These two applications show the interest of our method in the modeling and analysis of cellular regulatory networks., Dans cette thèse, nous nous intéressons à l'analyse qualitative de la dynamique de deux cycles biologiques centraux dans les cellules eucaryotes, le cycle de division cellulaire et l'horloge circadienne. Nous utilisons pour cela des réseaux Booléens asynchrones, bien adaptés à une analyse qualitative. Dans ces réseaux, les cycles sont capturés par des attracteurs complexes, pouvant contenir des centaines d'états. Nous proposons une nouvelle méthode d'analyse de ces attracteurs complexes, basée sur la construction d'un graphe résumé. Cette méthode permet de comparer les trajectoires contenues l'attracteur avec les propriétés qualitatives du cycle biologique. Nous illustrons notre méthode sur un modèle du cycle cellulaire de la littérature et sur un modèle de l'horloge circadienne, que nous avons construit à partir d'un modèle continu existant. Dans ces deux modèles, notre méthode s'est montrée efficace pour visualiser la structure de l'attracteur complexe et le comparer avec un cycle biologique. En combinant le graphe résumé avec une chaîne de Markov, nous estimons les proportions de temps passé dans les phases décrites par les oscillations. En le combinant avec une méthode d'inférence Booléenne, nous montrons également comment ajuster localement la dynamique asymptotique du modèle, afin de forcer certaines propriétés dynamiques. Ces deux applications montrent l'intérêt de notre méthode pour la modélisation et l'analyse de réseaux de régulation cellulaire.

In this thesis, we are interested in the qualitative analysis of the dynamics of two biological cycles that are central in eukaryotic cells, the cell division cycle and the circadian clock. For that purpose, we use asynchronous Boolean networks that provide an adapted qualitative framework. In these networks, cycles are captured by complex attractors containing hundreds of states. A new method for the analysis of such complex attractors is proposed. It is based on the construction of a summary graph of the attractor, enabling the comparison between the attractor's trajectories and qualitative properties of the biological cycle. The method is illustrated on a cell cycle model from the literature and of a circadian clock model we built from an existing continuous model. In both models our method proves to be efficient to visualize the attractor's structure and to compare it with the biological cycle. By combining the summary graph with a Markov chain, proportions of time spent in each phase are estimated. By combining it with a Boolean inference technique, we show how to locally adjust the asymptotic dynamics of the model in order to force specific dynamical properties. These two applications show the interest of our method in the modeling and analysis of cellular regulatory networks.; Dans cette thèse, nous nous intéressons à l'analyse qualitative de la dynamique de deux cycles biologiques centraux dans les cellules eucaryotes, le cycle de division cellulaire et l'horloge circadienne. Nous utilisons pour cela des réseaux Booléens asynchrones, bien adaptés à une analyse qualitative. Dans ces réseaux, les cycles sont capturés par des attracteurs complexes, pouvant contenir des centaines d'états. Nous proposons une nouvelle méthode d'analyse de ces attracteurs complexes, basée sur la construction d'un graphe résumé. Cette méthode permet de comparer les trajectoires contenues l'attracteur avec les propriétés qualitatives du cycle biologique. Nous illustrons notre méthode sur un modèle du cycle cellulaire de la littérature et sur un modèle de l'horloge circadienne, que nous avons construit à partir d'un modèle continu existant. Dans ces deux modèles, notre méthode s'est montrée efficace pour visualiser la structure de l'attracteur complexe et le comparer avec un cycle biologique. En combinant le graphe résumé avec une chaîne de Markov, nous estimons les proportions de temps passé dans les phases décrites par les oscillations. En le combinant avec une méthode d'inférence Booléenne, nous montrons également comment ajuster localement la dynamique asymptotique du modèle, afin de forcer certaines propriétés dynamiques. Ces deux applications montrent l'intérêt de notre méthode pour la modélisation et l'analyse de réseaux de régulation cellulaire.

In plants as in animals, organ size is a crucial characteristic achieved by cell proliferation, growth, differentiation and death Those processes are precisely monitored and many of their key regulators are conserved in all eukaryotes. Among them, TRANSLATIONNALY CONSERVED TUMOR PROTEIN (TCTP) is known to play an essential role in organ development. My thesis aims at specifying the pathway leading TCTP to control cell cycle progression in Arabidopsis thaliana. CSN4, a sub-unit of the CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENESIS 9 SIGNALOSOME (CSN) , was identified as a TCTP interactor. CSN regulates the activity, the assembling and the stability of CULLIN-RING UBIQUITIN LIGASES (CRLs), a major class of E3-ubiquitine ligases. Hence, CRLs are implicated in protein degradation through the ubiquitin/proteasome system and more notably in the degradation of key cell cycle regulators. Firstly, I characterized the physical interaction between TCTP and CSN4. I demonstrated that this interaction takes place outside of the CSN holocomplex. Then, I showed that csn4 mutants are delayed during embryogenesis in similar way to tctp mutants, even if the delay remains less important. Finally, I highlighted defaults in the expression levels of several key cell cycle regulators in those mutants. The defects are limited to regulators of the G1/S transition in tctp mutants whereas they are much more diverse in csn4 mutants. I also led a global proteomic study showing an enrichment in proteins linked to translation in both proteins upregulated in tctp mutants and down-regulated in csn4 mutants. My PhD work enriches the current level of knowledge on how TCTP regulates the cell cycle's G1/S transition in association with CSN4 . It opens new questions and perspectives on the implication of key cell cycle regulators such as CYCD6;1, CYCD7;1 and KRP6 and on the link between this pathway and the regulation of protein translation., Chez les plantes comme chez les animaux, la taille des organes est une caractéristique cruciale dépendant de différents processus que sont la prolifération, la croissance, la différentiation et la mort cellulaires. Ces processus sont très précisément contrôlés et beaucoup de leurs régulateurs clefs sont fortement conservés chez les eucaryotes. Parmi eux, TRANSLATIONNALLY CONTROLLED TUMOR PROTEIN (TCTP), une protéine régulée lors de sa traduction, est connue pour jouer un rôle essentiel dans le développement des organes. Ma thèse vise à préciser la voie d'action de TCTP sur la progression du cycle cellulaire chez Arabidopsis thaliana. CSN4, une sous-unité du complexe CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENESIS 9 SIGNALOSOME (CSN), a été identifiée comme interacteur de TCTP. Le complexe CSN régule l'activité, l'assemblage et la stabilité des complexes CULLIN-RING UBIQUITIN LIGASES (CRL), une classe majeure d'E3-ubiquitine ligases. Les CRL sont donc impliqués dans la dégradation par la voie Ubiquitine/protéasome de nombreux substrats dont des régulateurs clefs du cycle cellulaire. J'ai tout d'abord caractérisé l'interaction physique entre AtTCTP et AtCSN4 et montré que celle-ci se fait en dehors du complexe CSN. J'ai ensuite caractérisé l'existence, chez les mutants csn4, d'un délai embryonnaire semblable, bien que nettement moins important, à celui observé chez les mutants tctp. Enfin, j'ai mis en évidence que des défauts d'expression de régulateurs clefs du cycle cellulaire : uniquement chez des régulateurs de la transition G1/S (CYCD7;1 et KRP6) pour les mutants tctp et beaucoup plus variés chez les mutants csn4. J'ai également mené une étude protéomique globale montrant un enrichissement de protéines impliquées notamment dans la traduction à la fois parmi celles surexprimées chez tctp et celles sous-exprimées chez csn4. Les travaux durant ma thèse apportent de nouvelles connaissances sur les mécanismes par lesquels TCTP régule la transition G1/S du cycle cellulaire en association avec CSN4 et ouvrent sur de nouvelles questions et perspectives notamment sur l'implication de régulateurs clefs du cycle comme CYCD7;1 et KRP6 ou le lien avec la régulation de la traduction des protéines.

The historical median survival of advanced luminal breast cancer does not exceed four years. The deciphering of the mechanisms of resistance to hormone therapy has led to the development of inhibitors of cyclin D dependent kinases (CDK4 and 6). Three drugs, palbociclib, ribociclib and abemaciclib, very similar pharmacologically, have been evaluated in the context of pivotal, randomized phase III trials. Strikingly and regardless of the endocrine therapy backbone, and in both hormone-sensitive and hormone-resistant patients, the addition of a CDK4 / 6 inhibitor doubles progression-free survival with a hazard ratio always around 0.55. The benefit in overall survival begins to be demonstrated. This review presents all published results, as well as the main safety data.

The goal of this thesis is to study how the mammal cell adjusts its metabolism to the steps of the cell cycle. The cell cycle is the series of events leading a cell to divide itself. The purpose of the metabolism is to supply the cell with all the elements and the energy it needs to work. In particular, at every step of the cell cycle, the cell needs different elements to properly divide itself. So, it is crucial for the cell to coordinate the metabolism and the cell cycle and in particular to control what the metabolism produces through the cell cycle. To have a better understanding of the links between these two processes, we studied how a mathematical model representing the metabolism answered to different variations imposed by the cell cycle and we compared those answers to the literature. Satisfied by the results, we therefore built a hybrid model representing the evolution of the metabolism through the cell cycle. We recover in this hybrid model the main known variations of the metabolism through the cycle’s phases as well as experimental variations of the energetic and redox metabolites. Encouraged by these results, we finally disturbed our hybrid model to recover metabolic tendencies due to cancer, a set of diseases affecting both the metabolism and the cell cycle., L’objectif de cette thèse est d’étudier comment la cellule mammifère adapte son métabolisme aux étapes du cycle cellulaire. Le cycle cellulaire est l’ensemble des étapes menant une cellule à se diviser. Le rôle du métabolisme est de fournir à la cellule les éléments et l’énergie dont elle a besoin pour fonctionner. En particulier, à chaque étape du cycle cellulaire, la cellule a besoin de différents éléments pour pouvoir, à terme, se diviser correctement. Il est donc crucial pour la cellule de coordonner le métabolisme et le cycle cellulaire et en particulier de contrôler ce que le métabolisme produit au cours du cycle cellulaire. Pour mieux comprendre ce lien entre ces deux processus, nous avons étudié comment un modèle mathématique du métabolisme répondait à différentes variations imposées par le cycle cellulaire et nous avons comparé ces réponses à la littérature. Satisfaits des résultats obtenus, nous avons alors construit un modèle hybride représentant l’évolution du métabolisme au cours du cycle cellulaire. Nous retrouvons dans ce modèle hybride les grandes variations connues des voies métaboliques au cours des phases du cycle cellulaire ainsi que des variations expérimentales des métabolites énergétiques et redox. Encouragés par ces résultats, nous avons finalement perturbé notre modèle hybride pour retrouver des tendances du métabolisme dues au cancer, un ensemble de maladies touchant à la fois le cycle cellulaire et le métabolisme.

De nombreuses voies de signalisation cellulaire complexes permettent de répondre à la présence de dommages à l’ADN. Cette réponse cellulaire est indispensable afin d’éviter l’accumulation de mutations pouvant éventuellement conduire à la transformation tumorale. Ces différentes voies de réponse aux dommages à l’ADN sont hautement coordonnées et sont regroupées au sein d’un mécanisme global appelé DNA damage response (DDR). Les facteurs du DDR sont régulés à plusieurs niveaux de la cascade de l’expression des gènes. De façon notable, plusieurs protéines de liaison à l’ARN (RBP) participent à la régulation de l’expression des gènes du DDR via la régulation post- transcriptionnelle de leur ARN messager. La RBP STAU2 est connue pour lier plusieurs ARNm codant pour des protéines impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire ainsi que dans les voies du DDR. La protéine STAU2 est elle-même régulée au niveau transcriptionnel par le facteur de transcription E2F1. De récentes observations laissent penser que la kinase centrale du DDR, CHK1, pourrait être impliquée dans la régulation de la stabilité de STAU2. Par ailleurs, les conséquences cellulaires de la diminution du niveau d’expression de STAU2 sont à ce jour très peu connues. Ce mémoire a d’abord été entrepris dans le but de mieux comprendre l’implication de la voie de la kinase CHK1 dans la régulation de la protéine de liaison à l’ARN STAU2. CHK1 est une protéine centrale des voies du DDR ainsi que du contrôle de la progression du cycle cellulaire en l’absence de dommages à l’ADN. Nos résultats montrent que la diminution de CHK1 induit une dégradation rapide de STAU2 par les caspases d’une façon indépendante de l’apoptose. Nous avons également renforcé ce lien entre STAU2 et les mécanismes de réparation des dommages à l’ADN en identifiant plusieurs protéines des voies de réparation dans l’environnement immédiat de STAU2. D’autre part nos travaux visent à mettre en évidence les conséquences de la déplétion de STAU2 dans plusieurs types cellulaires. STAU2 étant une RBP, sa dérégulation impacte inévitablement le devenir de plusieurs ARNm. Afin de caractériser ces différentes conséquences, nous avons dans un premier temps réalisé la déplétion totale de STAU2 dans des cellules hTert-RPE par la technique de CRISPR/Cas9. Nos résultats montrent que ces cellules accumulent anormalement des dommages à l’ADN et prolifèrent plus rapidement que des cellules normales. En outre plusieurs gènes impliqués dans la réparation des dommages à l’ADN se retrouvent diminués dans ces cellules. Dans un second temps, afin de définir si cet effet est dépendant du type cellulaire, nous avons induit la diminution de l’expression de STAU2 dans des cellules IMR90. Nous avons montré que dans ce cas, la diminution de STAU2 induit un arrêt du cycle cellulaire et une entrée des cellules en sénescence. Ainsi, les données présentées dans ce mémoire contribuent à mieux comprendre l’implication de STAU2 dans les processus cellulaires majeurs que sont la régulation du DDR et le contrôle du cycle cellulaire., Many complex cellular pathways are induced in response to DNA damages. This cellular response is indispensable to prevent the accumulation of mutations and to avoid malignant transformation. These different pathways are highly coordinated and are organized in a global mechanism called DNA damage response (DDR). Proteins involved in the DDR are regulated at different levels of the gene expression process. Notably, several RNA binding proteins are involved in the regulation of DDR gene expression through the post-transcriptional control of their mRNA. The RBP STAU2 is known to bind various mRNAs coding for proteins involved in the DDR or cell cycle control. STAU2 is regulated at the transcriptional levels by the major transcription factor E2F1. Recent observations suggest that CHK1 could be implicated in the control of the steady-state level of STAU2. Otherwise, the cellular consequences of STAU2 downregulation remain elusive. The purpose of this research was first to elucidate the implication of CHK1 pathway in STAU2 regulation. CHK1 is a major protein involved in the DDR regulation as well as in the control of cell cycle progression in the absence of DNA damage. Our data show that the downregulation of CHK1 rapidly leads to a caspase-dependent degradation of STAU2 independently of apoptosis. The link between STAU2 and mechanisms of DNA repair was reinforced by our BioID2 experiment that identified several proteins of the DDR in close proximity with STAU2. On the other hand, the aim of this study was to determine the consequences of STAU2 downregulation in different cell lines. Given that STAU2 is an RBP, its dysregulation will inevitably change the fate of several mRNA. In order to increase our understanding of theses consequences, we generated an hTert-RPE1 STAU2-KO cell line using the CRISPR/Cas9 technique. Our data show that these cells accumulate DNA damage and have an increased proliferation rate. Moreover, several genes involved in the DNA repair pathway are downregulated. We also downregulated STAU2 in IMR90 to determine if the previous observations are cell-type specifics. In the latter case, STAU2 diminution triggers cell cycle arrest and cellular senescence. Altogether, these results contribute to improve our knowledge of STAU2 function, especially in DNA damage response pathway and in cell cycle regulation.

Building a functional central nervous system requires tight regulation between proliferation of neural stem/progenitor cells, and their differentiation into neurons. Abnormal proliferation can lead to tumor development, whereas early differentiation can deplete the progenitor pool and lead to brain malformations such as microcephaly. Increasing data suggest that the cell cycle kinetic of progenitors can influence their choice between proliferation or differentiation. In the chick embryo neural tube, our group showed that the expression of the CDC25B phosphatase, a positive regulator of the G2/M transition, shortens the G2 phase length and promotes neuronal production. In addition, a part of this neurogenic function of CDC25B is independent of its cell cycle function. In order to improve our understanding of its function in controlling cell fate and determining the part of its dependent and independent cell cycle functions, we generated conditionally CDC25B knock-out murine line. During my PhD project, I took advantage of this genetic model to explore the function of CDC25B during mammalian neurogenesis. My project aimed to (1) determine whether the neurogenic function of CDC25B in the bird model is conserved during mammalian spinal cord development, (2) explore the function of CDC25B during cerebral cortex development. (1) I showed that CDC25B loss-of-function lengthens the G2 phase without affecting the proliferation rate of spinal progenitors, and decreases the production of dorsal neurons. CDC25B therefore promotes neuronal differentiation in the developing mammalian spinal cord. (2) The cerebral cortex is the most recent central nervous system tissue from an evolutionary point of view. Its development is more complex and involves a more various cellular diversity than in the spinal cord. During its development, apical progenitors (aRGs) perform proliferative divisions and then switch their mode of division to produce neurons and basal progenitors (bIPs and bRGs). In this tissue, I showed that CDC25B loss-of-function results in a lengthening of the G2 phase and a shortening of the G1 phase of aRGs, without affecting the proliferation rate and the total cell cycle duration. In parallel, I quantified a decrease in bIPs production and an increase in bRGs number. Conversely, CDC25B gain-of-function increases the number of bIPs. CDC25B therefore regulates the ratio of basal progenitors produced from aRGs.[...]; Construire un système nerveux central fonctionnel nécessite une régulation stricte entre la prolifération des cellules souches/progéniteurs neuraux, et leur différenciation en neurones. Une prolifération anormale peut mener à l'apparition de tumeur, alors qu'une différenciation précoce peut épuiser le stock de progéniteurs et conduire à des malformations cérébrales comme la microcéphalie. De plus en plus de données suggèrent que la cinétique du cycle cellulaire des progéniteurs peut influencer le choix de proliférer ou se différencier. Dans le tube neural d'embryon de poulet, notre équipe a montré que l'expression de la phosphatase CDC25B, régulateur positif de la transition G2/M, raccourcit la longueur de la phase G2 et promeut la production neuronale. De plus, une partie de cette fonction neurogénique de CDC25B est indépendante de sa fonction sur le cycle cellulaire. Afin d'améliorer notre compréhension de sa fonction dans le contrôle du destin cellulaire et de déterminer la part de ses fonctions cycle cellulaire dépendante et indépendante, nous avons créé un modèle murin conditionnellement invalidé pour CDC25B. Au cours de ma thèse, j'ai mis à profit ce modèle génétique pour explorer la fonction de CDC25B dans la neurogenèse chez les Mammifères. Mon projet a consisté à (1) déterminer si la fonction neurogénique de CDC25B dans le modèle oiseau est conservée dans le développement de la moelle épinière mammifère, (2) explorer la fonction de CDC25B dans le développement du cortex cérébral. (1) J'ai pu montrer que la perte de fonction de CDC25B rallonge la phase G2 sans affecter le taux de prolifération des progéniteurs spinaux, et diminue la production des neurones dorsaux. CDC25B promeut donc la différenciation neuronale dans la moelle épinière en développement des Mammifères. (2) Le cortex cérébral est le tissu du système nerveux central le plus récent d'un point de vue évolutif. Sa mise en place est plus complexe et met en jeu une plus grande diversité cellulaire que dans la moelle épinière. Au cours de son développement, les progéniteurs apicaux (aRGs) effectuent des divisions prolifératives puis changent de mode de division pour produire des neurones et des progéniteurs basaux (bIPs et bRGs). Dans ce tissu, j'ai montré que la perte de fonction de CDC25B entraine un rallongement de la durée de la phase G2 et un raccourcissement de la durée de la phase G1 du cycle des aRGs, sans affecter le taux de prolifération et la durée totale du cycle cellulaire. En parallèle, j'ai identifié une diminution de la production des bIPs et une augmentation des bRGs. A l'inverse, le gain de fonction de CDC25B augmente le nombre de bIPs. [...]

Building a functional central nervous system requires tight regulation between proliferation of neural stem/progenitor cells, and their differentiation into neurons. Abnormal proliferation can lead to tumor development, whereas early differentiation can deplete the progenitor pool and lead to brain malformations such as microcephaly. Increasing data suggest that the cell cycle kinetic of progenitors can influence their choice between proliferation or differentiation. In the chick embryo neural tube, our group showed that the expression of the CDC25B phosphatase, a positive regulator of the G2/M transition, shortens the G2 phase length and promotes neuronal production. In addition, a part of this neurogenic function of CDC25B is independent of its cell cycle function. In order to improve our understanding of its function in controlling cell fate and determining the part of its dependent and independent cell cycle functions, we generated conditionally CDC25B knock-out murine line. During my PhD project, I took advantage of this genetic model to explore the function of CDC25B during mammalian neurogenesis. My project aimed to (1) determine whether the neurogenic function of CDC25B in the bird model is conserved during mammalian spinal cord development, (2) explore the function of CDC25B during cerebral cortex development. (1) I showed that CDC25B loss-of-function lengthens the G2 phase without affecting the proliferation rate of spinal progenitors, and decreases the production of dorsal neurons. CDC25B therefore promotes neuronal differentiation in the developing mammalian spinal cord. (2) The cerebral cortex is the most recent central nervous system tissue from an evolutionary point of view. Its development is more complex and involves a more various cellular diversity than in the spinal cord. During its development, apical progenitors (aRGs) perform proliferative divisions and then switch their mode of division to produce neurons and basal progenitors (bIPs and bRGs). In this tissue, I showed that CDC25B loss-of-function results in a lengthening of the G2 phase and a shortening of the G1 phase of aRGs, without affecting the proliferation rate and the total cell cycle duration. In parallel, I quantified a decrease in bIPs production and an increase in bRGs number. Conversely, CDC25B gain-of-function increases the number of bIPs. CDC25B therefore regulates the ratio of basal progenitors produced from aRGs.[...]; Construire un système nerveux central fonctionnel nécessite une régulation stricte entre la prolifération des cellules souches/progéniteurs neuraux, et leur différenciation en neurones. Une prolifération anormale peut mener à l'apparition de tumeur, alors qu'une différenciation précoce peut épuiser le stock de progéniteurs et conduire à des malformations cérébrales comme la microcéphalie. De plus en plus de données suggèrent que la cinétique du cycle cellulaire des progéniteurs peut influencer le choix de proliférer ou se différencier. Dans le tube neural d'embryon de poulet, notre équipe a montré que l'expression de la phosphatase CDC25B, régulateur positif de la transition G2/M, raccourcit la longueur de la phase G2 et promeut la production neuronale. De plus, une partie de cette fonction neurogénique de CDC25B est indépendante de sa fonction sur le cycle cellulaire. Afin d'améliorer notre compréhension de sa fonction dans le contrôle du destin cellulaire et de déterminer la part de ses fonctions cycle cellulaire dépendante et indépendante, nous avons créé un modèle murin conditionnellement invalidé pour CDC25B. Au cours de ma thèse, j'ai mis à profit ce modèle génétique pour explorer la fonction de CDC25B dans la neurogenèse chez les Mammifères. Mon projet a consisté à (1) déterminer si la fonction neurogénique de CDC25B dans le modèle oiseau est conservée dans le développement de la moelle épinière mammifère, (2) explorer la fonction de CDC25B dans le développement du cortex cérébral. (1) J'ai pu montrer que la perte de fonction de CDC25B rallonge la phase G2 sans affecter le taux de prolifération des progéniteurs spinaux, et diminue la production des neurones dorsaux. CDC25B promeut donc la différenciation neuronale dans la moelle épinière en développement des Mammifères. (2) Le cortex cérébral est le tissu du système nerveux central le plus récent d'un point de vue évolutif. Sa mise en place est plus complexe et met en jeu une plus grande diversité cellulaire que dans la moelle épinière. Au cours de son développement, les progéniteurs apicaux (aRGs) effectuent des divisions prolifératives puis changent de mode de division pour produire des neurones et des progéniteurs basaux (bIPs et bRGs). Dans ce tissu, j'ai montré que la perte de fonction de CDC25B entraine un rallongement de la durée de la phase G2 et un raccourcissement de la durée de la phase G1 du cycle des aRGs, sans affecter le taux de prolifération et la durée totale du cycle cellulaire. En parallèle, j'ai identifié une diminution de la production des bIPs et une augmentation des bRGs. A l'inverse, le gain de fonction de CDC25B augmente le nombre de bIPs. [...]

TRIP12 is an E3 ubiquitin ligase that belongs to the HECT (Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus) family. Several proteins are targeted by TRIP12 polyubiquitination which triggers their proteasomal degradation. Among its targets, several proteins are involved in DNA damage responses, chromatin remodelling and p53 pathway activation. Unpublished results of my team showed an increased expression of TRIP12 in pancreatic cancer and pre-neoplastic lesions. My group revealed that TRIP12 polyubiquitinates and provokes the degradation of the transcription factor PTF1a (Pancreas Transcription Factor 1a) stability. Describing for the first time a post-translational regulation of PTF1a. PTF1a is essential in pancreatic development and homeostasis. It inhibits the proliferation of pancreatic cells and is considered as a tumour suppressor gene and. Even if several TRIP12 targets are involved in cellular processes that are tightly cell cycle regulated, the regulation of TRIP12 expression and its functions during the cell cycle was unknown at the beginning of my thesis. I showed that TRIP12 expression and nuclear localization are regulated throughout the cell cycle. I identified an intrinsically disordered domain within the N-terminal region of TRIP12 that permits its interaction to euchromatin. I demonstrated TRIP12 implication in mitosis entry by controlling DNA replication timing Independently of its catalytic activity. TRIP12 is also required for maintaining a correct mitotic progression and chromosomes stability. My results propose TRIP12 as a new chromatin-associated protein that is essential for cell cycle progression and to preserve genome integrity. In the end, my studies will be fundamental to explain the increased expression of TRIP12 protein observed in pancreatic cancer and its impact in carcinogenesis.; TRIP12 est une E3 ubiquitine ligase de la famille HECT (Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus). TRIP12 a plusieurs cibles connues qu'elle adresse au protéasome par polyubiquitination. Parmi ces cibles, plusieurs protéines ont des rôles importants dans la réponse aux dommages à l'ADN, le remodelage de la chromatine et la voie d'activation de p53. Des résultats non publiés de mon équipe d'accueil ont montré une surexpression de la protéine TRIP12 dans le cancer du pancréas et les lésions pré-néoplasiques. Le groupe a mis en évidence que TRIP12 polyubiquitine et provoque la dégradation du facteur de transcription PTF1a (Pancreas Transcription Factor 1a), décrivant pour la première fois un mécanisme de régulation post-traductionnelle de PTF1a. PTF1a est essentiel au développement et à l'homéostasie du pancréas. Il est capable d'inhiber la prolifération de cellules cancéreuses pancréatiques et est considéré comme un gène suppresseur de tumeur. Bien qu'ayant pour substrats des protéines intervenant dans des processus finement régulés au cours du cycle cellulaire et altérés dans les cancers, la régulation de l'expression et les fonctions de TRIP12 au cours du cycle cellulaire n'étaient pas connues au début de mes travaux de thèse. J'ai démontré que l'expression et la localisation nucléaire de TRIP12 varient au cours du cycle cellulaire. J'ai identifié un domaine intrinsèquement désordonné dans la partie N-terminale de TRIP12 qui lui permet d'interagir avec l'euchromatine. J'ai montré que TRIP12 est impliqué dans l'entrée en mitose en contrôlant la durée de la réplication de l'ADN indépendamment de son activité catalytique. TRIP12 est également indispensable pour une bonne progression en mitose et la stabilité chromosomique. Mes résultats proposent TRIP12 comme une nouvelle protéine associée à la chromatine, essentielle à la progression dans le cycle cellulaire et au maintien de l'intégrité du génome. A terme, ce travail de thèse servira de base pour comprendre la surexpression de TRIP12 dans le cancer du pancréas et son impact dans la carcinogénèse.

Cohesin is an evolutionary-conserved complex composed of a ring capable of DNA entrapment and of auxiliary proteins regulating its association with DNA. On the one hand, cohesin confers sister chromatid cohesion required for their proper segregation and on the other hand it establishes and maintains chromatin looping. Chromatin loops are crucial for assembly of topological domains, gene expression and genome stability. However, mechanisms driving their establishment remain to be elucidated. According to loop extrusion model, cohesin would capture small loops and enlarge them by extruding DNA throughout its ring. This model predicts that loop size would depend on both cohesin residence time on DNA and on its processivity. Deciphering cohesin regulation is thus fundamental to understand chromosome biology. In this study, we showed that mitotic chromosome arms of yeast Saccharomyces cerevisiae are organised in cohesin-dependent chromatin loops. We studied the role of cohesin regulatory subunits Pds5, Wpl1 and Eco1 on loop establishment. Our data show that Pds5 inhibits loop expansion via Wpl1 and Eco1. As previously described in mammals, Wpl1 counteracts loop expansion by dissociating cohesin from DNA. Our results suggest that Eco1 would inhibit cohesin translocation on DNA, required for loop expansion. We then studied how these proteins contribute to the organisation of the ribosomal DNA array (rDNA), a cohesin-rich, highly transcribed sequence segregated away from the rest of the genome. Our data point toward a central role for Pds5 in organising this genomic region, independently of Wpl1 and Eco1. To study in detail rDNA spatial organisation, we developed a dedicated image analysis to assess its organisation in three dimensions. We have unveiled an underlying organisation for rDNA, made by a succession of small domains spatially organised by cohesin. This study opens large perspectives towards a better understanding of cohesin regulation in genome organisation.; La cohésine est un complexe protéique conservé dans l'évolution composé d'un anneau capable d'embrasser l'ADN et de protéines auxiliaires régulant son association avec l'ADN. D'une part, la cohésine confère la cohésion des chromatides sœurs nécessaire à leur ségrégation, d'autre part elle établit et maintient des boucles de chromatine. Ces boucles sont requises pour la formation de domaines topologiques, l'expression génique et la stabilité du génome. Cependant les mécanismes régissant leur formation ne sont pas entièrement élucidés. Selon le modèle d'extrusion de boucles, la cohésine capturerait des boucles de petites tailles et les élargirait en extrudant l'ADN à travers son anneau. Dans ce modèle, la taille des boucles dépendrait à la fois du temps de résidence des cohésines sur l'ADN et de leur processivité. Étudier la régulation des cohésines est donc fondamental pour comprendre la biologie des chromosomes. Dans cette étude nous avons montré que les bras des chromosomes mitotiques de la levure Saccharomyces cerevisiae étaient organisés sous forme de boucles de chromatine dépendantes des cohésines. Nous avons étudié le rôle des sous-unités régulatrices des cohésines, Pds5, Wpl1 et Eco1 dans la formation de ces boucles. Nos données montrent que Pds5 inhibe leur expansion, via Wpl1 et Eco1. Comme décrit chez les mammifères, Wpl1 les abolit en dissociant les cohésines des chromosomes. En revanche, nos résultats suggèrent qu'Eco1 entraverait la translocation des cohésines sur l'ADN, nécessaire pour l'agrandissement des boucles. Nous avons ensuite analysé le rôle de ces protéines dans l'organisation de l'ADN ribosomique (ADNr), séquence enrichie en cohésines, hautement transcrite et isolée du reste du génome. Pds5 semble avoir un rôle central dans l'organisation de cette séquence, qui ne dépendrait pas de Wpl1 ou d'Eco1. Afin d'analyser de manière fine les réorganisations spatiales de l'ADNr, nous avons développé une analyse d'image dédiée permettant de sonder l'organisation de cette fibre en trois dimensions. Nous avons révélé une structure sous-jacente de l'ADNr composée d'une succession de domaines organisés spatialement par les cohésines. Cette étude ouvre des perspectives vers une meilleure compréhension de la régulation des cohésines dans l'organisation du génome.

Cohesin is an evolutionary-conserved complex composed of a ring capable of DNA entrapment and of auxiliary proteins regulating its association with DNA. On the one hand, cohesin confers sister chromatid cohesion required for their proper segregation and on the other hand it establishes and maintains chromatin looping. Chromatin loops are crucial for assembly of topological domains, gene expression and genome stability. However, mechanisms driving their establishment remain to be elucidated. According to loop extrusion model, cohesin would capture small loops and enlarge them by extruding DNA throughout its ring. This model predicts that loop size would depend on both cohesin residence time on DNA and on its processivity. Deciphering cohesin regulation is thus fundamental to understand chromosome biology. In this study, we showed that mitotic chromosome arms of yeast Saccharomyces cerevisiae are organised in cohesin-dependent chromatin loops. We studied the role of cohesin regulatory subunits Pds5, Wpl1 and Eco1 on loop establishment. Our data show that Pds5 inhibits loop expansion via Wpl1 and Eco1. As previously described in mammals, Wpl1 counteracts loop expansion by dissociating cohesin from DNA. Our results suggest that Eco1 would inhibit cohesin translocation on DNA, required for loop expansion. We then studied how these proteins contribute to the organisation of the ribosomal DNA array (rDNA), a cohesin-rich, highly transcribed sequence segregated away from the rest of the genome. Our data point toward a central role for Pds5 in organising this genomic region, independently of Wpl1 and Eco1. To study in detail rDNA spatial organisation, we developed a dedicated image analysis to assess its organisation in three dimensions. We have unveiled an underlying organisation for rDNA, made by a succession of small domains spatially organised by cohesin. This study opens large perspectives towards a better understanding of cohesin regulation in genome organisation.; La cohésine est un complexe protéique conservé dans l'évolution composé d'un anneau capable d'embrasser l'ADN et de protéines auxiliaires régulant son association avec l'ADN. D'une part, la cohésine confère la cohésion des chromatides sœurs nécessaire à leur ségrégation, d'autre part elle établit et maintient des boucles de chromatine. Ces boucles sont requises pour la formation de domaines topologiques, l'expression génique et la stabilité du génome. Cependant les mécanismes régissant leur formation ne sont pas entièrement élucidés. Selon le modèle d'extrusion de boucles, la cohésine capturerait des boucles de petites tailles et les élargirait en extrudant l'ADN à travers son anneau. Dans ce modèle, la taille des boucles dépendrait à la fois du temps de résidence des cohésines sur l'ADN et de leur processivité. Étudier la régulation des cohésines est donc fondamental pour comprendre la biologie des chromosomes. Dans cette étude nous avons montré que les bras des chromosomes mitotiques de la levure Saccharomyces cerevisiae étaient organisés sous forme de boucles de chromatine dépendantes des cohésines. Nous avons étudié le rôle des sous-unités régulatrices des cohésines, Pds5, Wpl1 et Eco1 dans la formation de ces boucles. Nos données montrent que Pds5 inhibe leur expansion, via Wpl1 et Eco1. Comme décrit chez les mammifères, Wpl1 les abolit en dissociant les cohésines des chromosomes. En revanche, nos résultats suggèrent qu'Eco1 entraverait la translocation des cohésines sur l'ADN, nécessaire pour l'agrandissement des boucles. Nous avons ensuite analysé le rôle de ces protéines dans l'organisation de l'ADN ribosomique (ADNr), séquence enrichie en cohésines, hautement transcrite et isolée du reste du génome. Pds5 semble avoir un rôle central dans l'organisation de cette séquence, qui ne dépendrait pas de Wpl1 ou d'Eco1. Afin d'analyser de manière fine les réorganisations spatiales de l'ADNr, nous avons développé une analyse d'image dédiée permettant de sonder l'organisation de cette fibre en trois dimensions. Nous avons révélé une structure sous-jacente de l'ADNr composée d'une succession de domaines organisés spatialement par les cohésines. Cette étude ouvre des perspectives vers une meilleure compréhension de la régulation des cohésines dans l'organisation du génome.

The radiobiological concepts described for conventional doses per fraction (1.8 to 2Gy) seem difficult to translate to high doses per fraction radiobiology. In fact, specific mechanisms are involved during high dose per fraction irradiation, involving vascular microenvironment damage and anti tumor immune response. The "5R's" of "classical" radiobiology (factors influencing the response of healthy or cancer cells to irradiation) seem to play a less important role in case of high doses per fraction. In addition, applicability of the linear quadratic model in this context is debated. It is therefore difficult to obtain reliable equivalent doses, hence the importance of including our patients in clinical trials, especially in case of concomitant systemic treatments. In addition to stereotactic radiotherapy, flash irradiations defined by a dose rate approximately 2000 times faster than "conventional" irradiation can also deliver high doses per fraction, with a much better tolerance for normal tissue without loss of anti tumor efficacy. Finally, availability of robust prospective data is a prerequisite to answer the question of short and long-term risk/benefit ratio of these different irradiation techniques.

Le cycle cellulaire est crucial pour la croissance, mais aussi pour le développement. Ce mécanisme est tellement critique que la moindre atteinte faite à l’une de ses étapes peut conduire à des problèmes de croissance et de développement, mais aussi à l’apparition d’anomalies, tels que les cancers, et ultimement la mort. De ce fait, la prolifération cellulaire est un mécanisme finement régulé, évitant au mieux les défaillances et les déséquilibres éventuels. Les mécanismes de régulation des étapes du cycle cellulaire sont rassemblés à plusieurs niveaux, et sont hautement hiérarchisés et structurés : les régulations transcriptionnelle et post-traductionnelle font partie des aspects les mieux étudiés à ce jour. D’autres processus, comme la régulation post-transcriptionnelle, se trouvent moins documentés. Cependant, les découvertes des protéines liant l’ARN, et ayant un rôle clé lors des différentes phases du cycle de division, semblent de plus en plus fréquentes. L’épissage, l’export nucléaire, la localisation, la dégradation et la traduction des ARNm représentent les multiples facettes de la régulation post-transcriptionnelle, et justifient amplement leur importance dans l’affinement du contrôle des différentes phases du cycle cellulaire. Staufen1 (STAU1), une protéine liant l’ARN, fait partie de ces incroyables découvertes qui ont contribué à révolutionner notre approche de la régulation de l’expression génique, et qui ont aidé à approfondir notre compréhension des mécanismes régissant divers processus cellulaires et physiologiques. Les travaux de recherche entrepris dans le cadre de cette thèse ont contribué à approfondir nos connaissances sur le rôle de la protéine Staufen1 dans la régulation post-transcriptionnelle du cycle cellulaire et de la prolifération. En occurrence, nous avons identifié un nouveau mécanisme de dégradation de STAU1 en sortie de mitose, impliquant le système ubiquitine-protéasome. Nous avons également montré pour la première fois que STAU1 pourrait inhiber la prolifération tumorale dans le cas du cancer colorectal, et les résultats de nos travaux ont été confirmés et approfondies dans des études ultérieures. Par ailleurs, les résultats de nos approches expérimentales, en vue de l’étude de l’impact de STAU1 sur le contrôle de la prolifération dans des modèles cellulaires non transformées suggèrent fortement un rôle positif dans le développement du potentiel prolifératif en cas de transformation tumorale. Ces résultats sont en harmonie avec une multitude d’études portant sur le rôle positif de STAU1 dans la régulation de la prolifération et sur son implication dans divers types de cancers. Cependant, l’examen plus exhaustif des études portant sur Staufen1 suggère un modèle multi-mécanistique dans les divers processus carcinogènes, et ouvre un champ d’investigation futur d’une grande ampleur pour élucider les mécanismes moléculaires qui soutiennent les fonctions STAU1 associés à la prolifération cellulaire et le développement tumoral., The cell cycle is crucial for growth, but also for development. This mechanism is so critical that the slightest damage to one of its stages can lead to problems of growth and development, but also to the appearance of anomalies, such as cancers, and ultimately death. As a result, cell proliferation is a finely regulated mechanism, best avoiding possible failures and imbalances. The regulation mechanisms of the cell cycle transitions are grouped at several levels, and are highly hierarchical and structured: the transcriptional and post-translational regulations are among the most studied aspects to date. Other processes, such as post-transcriptional regulation, are less documented. However, number of discoveries of RNA-binding proteins, which play a key role in the different phases of the division cycle, is increasing since the past decade. Splicing, nuclear export, localization, degradation and translation of mRNAs represent the multiple aspects of post-transcriptional regulation, and amply justify their importance in refining the control of the different phases of the cell cycle. Staufen1, an RNA-binding protein, is one of the incredible discoveries that have revolutionized our understanding of gene expression regulation, and has helped deepen our understanding of the mechanisms underlying various cellular and physiological processes. The research work undertaken during this thesis has contributed to deepening our knowledge of Staufen1 protein function in the post-transcriptional regulation of the cell cycle and proliferation. We have identified a new mechanism of degradation of STAU1 during mitosis exist, involving the ubiquitin-proteasome system. We have also shown for the first time that STAU1 could inhibit tumor proliferation in colorectal cancer, and our results have been confirmed and extended in later studies. Moreover, the results of our experimental approaches in untransformed cellular models, strongly suggest a positive roleof Staufen1 in promoting the proliferative potential during tumorigenesis. . These results are consistent with a multitude of studies showing the positive role of STAU1 in the regulation of proliferation and its involvement in various types of cancers. However, more comprehensive review of Staufen1 studies suggests a multi-mechanistic model in the various carcinogenic processes, and opens up a future field of investigation to elucidate the molecular mechanisms that support the STAU1 functions associated with cell proliferation and tumor development.

TRIP12 is an E3 ubiquitin ligase that belongs to the HECT (Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus) family. Several proteins are targeted by TRIP12 polyubiquitination which triggers their proteasomal degradation. Among its targets, several proteins are involved in DNA damage responses, chromatin remodelling and p53 pathway activation. Unpublished results of my team showed an increased expression of TRIP12 in pancreatic cancer and pre-neoplastic lesions. My group revealed that TRIP12 polyubiquitinates and provokes the degradation of the transcription factor PTF1a (Pancreas Transcription Factor 1a) stability. Describing for the first time a post-translational regulation of PTF1a. PTF1a is essential in pancreatic development and homeostasis. It inhibits the proliferation of pancreatic cells and is considered as a tumour suppressor gene and. Even if several TRIP12 targets are involved in cellular processes that are tightly cell cycle regulated, the regulation of TRIP12 expression and its functions during the cell cycle was unknown at the beginning of my thesis. I showed that TRIP12 expression and nuclear localization are regulated throughout the cell cycle. I identified an intrinsically disordered domain within the N-terminal region of TRIP12 that permits its interaction to euchromatin. I demonstrated TRIP12 implication in mitosis entry by controlling DNA replication timing Independently of its catalytic activity. TRIP12 is also required for maintaining a correct mitotic progression and chromosomes stability. My results propose TRIP12 as a new chromatin-associated protein that is essential for cell cycle progression and to preserve genome integrity. In the end, my studies will be fundamental to explain the increased expression of TRIP12 protein observed in pancreatic cancer and its impact in carcinogenesis., TRIP12 est une E3 ubiquitine ligase de la famille HECT (Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus). TRIP12 a plusieurs cibles connues qu'elle adresse au protéasome par polyubiquitination. Parmi ces cibles, plusieurs protéines ont des rôles importants dans la réponse aux dommages à l'ADN, le remodelage de la chromatine et la voie d'activation de p53. Des résultats non publiés de mon équipe d'accueil ont montré une surexpression de la protéine TRIP12 dans le cancer du pancréas et les lésions pré-néoplasiques. Le groupe a mis en évidence que TRIP12 polyubiquitine et provoque la dégradation du facteur de transcription PTF1a (Pancreas Transcription Factor 1a), décrivant pour la première fois un mécanisme de régulation post-traductionnelle de PTF1a. PTF1a est essentiel au développement et à l'homéostasie du pancréas. Il est capable d'inhiber la prolifération de cellules cancéreuses pancréatiques et est considéré comme un gène suppresseur de tumeur. Bien qu'ayant pour substrats des protéines intervenant dans des processus finement régulés au cours du cycle cellulaire et altérés dans les cancers, la régulation de l'expression et les fonctions de TRIP12 au cours du cycle cellulaire n'étaient pas connues au début de mes travaux de thèse. J'ai démontré que l'expression et la localisation nucléaire de TRIP12 varient au cours du cycle cellulaire. J'ai identifié un domaine intrinsèquement désordonné dans la partie N-terminale de TRIP12 qui lui permet d'interagir avec l'euchromatine. J'ai montré que TRIP12 est impliqué dans l'entrée en mitose en contrôlant la durée de la réplication de l'ADN indépendamment de son activité catalytique. TRIP12 est également indispensable pour une bonne progression en mitose et la stabilité chromosomique. Mes résultats proposent TRIP12 comme une nouvelle protéine associée à la chromatine, essentielle à la progression dans le cycle cellulaire et au maintien de l'intégrité du génome. A terme, ce travail de thèse servira de base pour comprendre la surexpression de TRIP12 dans le cancer du pancréas et son impact dans la carcinogénèse.

The shape of the cell nucleus can vary considerably during developmental and pathological processes as a consequence of the mechanical forces emanating from the microenvironment or generated by the cytoskeleton. However the impact of nuclear morphology on the transcriptional machinery is not known. Using a combination of tools to manipulate the nuclear morphology, we observed that changes in nuclear shape regulate the activity of AP1 and TEAD. We showed that nuclear flattening increases c-Jun phosphorylation and YAP nuclear translocation, leading to transcriptional induction of AP1 and TEAD-target genes. Surprisingly, we found that nuclear compression is necessary and sufficient to mediate c-Jun and YAP activation in response to cell- generated contractility or cell spreading. We additionally observed that nuclear flattening occurs during the cell cycle and promotes proliferation via TEAD and AP1- dependent G1 to S progression.; La forme du noyau peut varier significativement au cours du développement ou lors de processus pathologiques en raison des forces mécaniques émanant du microenvironnement ou générées par le cytosquelette. L’impact de la morphologie nucléaire sur la machinerie transcriptionnelle n’est cependant pas connu. En utilisant plusieurs approches afin de manipuler la morphologie nucléaire, nous avons observé que des changements de forme de l’enveloppe nucléaire régulent l’activité de AP1 et TEAD. Nous avons montré que l’aplatissement du noyau augmente la phosphorylation de c-Jun et la translocation de YAP, conduisant à une augmentation de la transcription des gènes cibles de AP1 et TEAD. Nous avons également observé que l’aplatissement du noyau se produit au cours du cycle cellulaire et favorise la prolifération via l’activation de TEAD et AP1 qui stimulent la progression de la phase G1 à la phase S.

The shape of the cell nucleus can vary considerably during developmental and pathological processes as a consequence of the mechanical forces emanating from the microenvironment or generated by the cytoskeleton. However the impact of nuclear morphology on the transcriptional machinery is not known. Using a combination of tools to manipulate the nuclear morphology, we observed that changes in nuclear shape regulate the activity of AP1 and TEAD. We showed that nuclear flattening increases c-Jun phosphorylation and YAP nuclear translocation, leading to transcriptional induction of AP1 and TEAD-target genes. Surprisingly, we found that nuclear compression is necessary and sufficient to mediate c-Jun and YAP activation in response to cell- generated contractility or cell spreading. We additionally observed that nuclear flattening occurs during the cell cycle and promotes proliferation via TEAD and AP1- dependent G1 to S progression., La forme du noyau peut varier significativement au cours du développement ou lors de processus pathologiques en raison des forces mécaniques émanant du microenvironnement ou générées par le cytosquelette. L’impact de la morphologie nucléaire sur la machinerie transcriptionnelle n’est cependant pas connu. En utilisant plusieurs approches afin de manipuler la morphologie nucléaire, nous avons observé que des changements de forme de l’enveloppe nucléaire régulent l’activité de AP1 et TEAD. Nous avons montré que l’aplatissement du noyau augmente la phosphorylation de c-Jun et la translocation de YAP, conduisant à une augmentation de la transcription des gènes cibles de AP1 et TEAD. Nous avons également observé que l’aplatissement du noyau se produit au cours du cycle cellulaire et favorise la prolifération via l’activation de TEAD et AP1 qui stimulent la progression de la phase G1 à la phase S.

Afin d’optimiser les chances de survie d’une cellule dans son environnement, le métabolisme et le cycle cellulaire doivent nécessairement être interconnectés. En effet, les cellules possèdent des mécanismes leur permettant, d’une part, de vérifier leur état métabolique avant d’initier l’une ou l’autre étape du cycle cellulaire souvent énergivore et, d’autre part, d’achever certaines étapes du cycle cellulaire avant d’éventuellement modifier leur métabolisme. Parce que les bactéries ne dérogent pas à cette règle, un nombre croissant d’exemples de connexions entre le métabolisme et le cycle cellulaire a émergé ces dernières années. L’identification d’enzymes métaboliques comme messagers coordonnant métabolisme et cycle cellulaire, permet d’ajouter une nouvelle dimension aux cartes métaboliques. La très grande conservation de ces mêmes cartes métaboliques, des bactéries jusqu’à l’homme, permet également d’imaginer des recherches sur les cellules tumorales qui ont un cycle cellulaire débridé et un appétit vorace., To increase chances for a cell to survive in its natural environment, metabolism and cell cycle necessarily have to be interconnected. Indeed, cells need, on the one hand, to check their metabolic status before initiating a cell cycle step often energy-consuming, and, on the other hand, to complete some cell cycle steps before modifying their metabolism. Because bacteria do not differ from the rules, an increasing number of examples of connection between metabolism and cell cycle emerged these last years. Identifying metabolic enzymes as messengers coordinating metabolism and cell cycle allows the addition of another dimension to metabolic maps. Likewise, the very high conservation of these metabolic maps, from bacteria to human, allows inspiring research on tumor cells that are known to have an unrestrained cell cycle and a voracious appetite.

Mass cytometry (CMM) has revolutionized the study of cell and phenotypic diversity, significantly increasing the number of markers that can be analyzed simultaneously (41 to date). By making it possible to precisely define the state of the lymphocyte populations, particularly regarding their differentiation, activation and entry into the cell cycle, the CMM has revealed small subsets so far unknown. In this study, the CMM was used to try to better characterize the HIV’s reservoirs. With the introduction in 1996 of Combined Antiretroviral Therapy (ART), HIV infection has shifted from a fatal destiny to a manageable chronic disease with a normal life span through a reduction in active viral replication (the amount of virus is below optimal detection limits). However, if treatment is interrupted, the viral load increases again in the patient due to viable provirus reservoirs located in long-lived cell populations that cannot be eliminated by current treatments. These reservoirs constitute a major obstacle to the eradication of HIV. The best characterized reservoir is that of CD4+ T cells and is mainly hosted in TCM, TTM, TSCM and Tfh. A first study allowed us to evaluate the stages of the cell cycle in association with markers of differentiation, activation and exhaustion, leading to a thorough assessment of the quiescent state of CD4 T cells likely to harbour latent reservoirs of HIV. This broad multiplex analysis demonstrates that some subsets of LTCD4+CD25-HLA-DR- classically considered "at rest" – do actually contain significant amounts of cells in cycling or expressing inhibitory receptors, opening new pathways for redefining CD4 T quiescent cells from peripheral blood. A second study aimed to define CD4+ T Cells populations producing HIV in vivo. We have developed a multiparametric analysis on cells of HIV+ patients under ART and in therapeutic interruption phase (ATI). This study shows that CD3+CD4+CD32high cells express a high level of activation markers and receive important activation signals via cytokines, unlike CD32a- cells. On the other hand, the analysis of HIV-producing LTCD4+ (expressing the p24 capsid protein), allowed us to detect a very small number of p24+ positive cells (less than 0.004% in ATI phase but none before). The phenotype of the producing cells was then highlighted. These are T lymphocytes that do not express CD8, enriched with a factor 4 in TSCM cells, and a factor 2 in TFH. These populations are highly enriched in activated cells co-expressing 3 activation markers (increased by a factor of 20) and are in cycle (Ki67+) and/or over-express immune control molecules (ICPs) with an enrichment of a factor of 500. This allows us to detect producing cells with much higher frequencies in these TCD3+CD8- populations in cycles up to 0.08%, and in G2 phase (2.46%), but also in cells with poly-expression of 4 immune-checkpoints (2.27%). The advent of mass cytometry has exponentially increased the information we could get on a cell. Thanks to this tool, cell cycle identification, in correlation with different phenotypic markers, makes possible the exploration of previously inaccessible information, including the analysis of latent and productive reservoirs of HIV. This work enables us to characterize as precisely as possible these HIV-producing cells, but also the latent cells, and potentially reservoirs of the virus.; La cytométrie de masse CMM) a révolutionné l'étude de la diversité cellulaire et phénotypique, en augmentant de manière significative le nombre de marqueurs pouvant être analysés simultanément (41 à ce jour). En permettant de définir précisément l'état des populations de lymphocytes, notamment en ce qui concerne leur différenciation, activation et leur entrée dans le cycle cellulaire, la CMM a mis au jour de petits sous-ensembles jusqu'ici inconnus. Dans cette étude, la CMM a été utilisée pour tenter de mieux caractériser les réservoirs du VIH. Avec l'introduction de la thérapie antirétrovirale combinée (ART) en 1996, l'infection par le VIH est passée d'un destin fatal à une maladie chronique gérable avec une durée de vie normale grâce à une réduction de la réplication virale active (la quantité de virus est en deçà des limites de détection optimales). Cependant, si le traitement est interrompu, la charge virale chez le patient augmente à nouveau du fait des réservoirs de provirus viables localisés dans des populations de cellules à longue durée de vie et qui ne peuvent pas être éliminées par les traitements actuels. Ces cellules infectées réservoirs constituent un obstacle majeur à l'éradication du VIH. Le réservoir le mieux caractérisé est celui des lymphocytes T CD4+ et est principalement hébergé dans les TCM, les TTM, les TSCM et les Tfh. Une première étude nous a permis d’évaluer les stades du cycle cellulaire en association à des marqueurs de différenciation, d'activation et d'épuisement, pour aboutir à une évaluation poussée de l'état de quiescence des lymphocytes T CD4 susceptibles d’abriter les réservoirs latents de VIH. Cette large analyse multiplexe démontre que certains sous-ensembles des LTCD4+CD25-HLA-DR- classiquement considérés "au repos"- contiennent en fait des quantités notables de cellules en cycle ou exprimant des récepteurs inhibiteurs, ouvrant de nouvelles voies pour une redéfinition des cellules T CD4 quiescentes du sang périphérique. Une deuxième étude avait pour but de définir les populations de LT CD4 produisant du VIH in vivo. Nous avons développé une analyse multiparamétrique sur des cellules de patients VIH+ sous ART et en phase d’interruption thérapeutique (ATI). Cette étude met en évidence que les cellules CD3+CD4+CD32high expriment un fort taux de marqueurs d’activation et reçoivent d’importants signaux d’activation via des cytokines, à l'inverse des cellules CD32a-. D'autre part, l'analyse des LTCD4+ producteurs de VIH (exprimant la protéine de capside p24), nous a permis de détecter un très faible nombre de cellules positives p24+ (inférieur à 0,004% en phase d’ATI mais aucun avant). Le phénotype des cellules productrices a ensuite été mis en évidence. Il s’agit de lymphocytes T n’exprimant pas de CD8, enrichis d’un facteur 4 en cellules TSCM, et d'un facteur 2 en TFH. Ces populations sont très enrichies en cellules activées co-exprimant 3 marqueurs d’activation (augmentés d’un facteur 20) et sont en cycle (Ki67+) et/ou sur-expriment des molécules de contrôle immunitaire (ICP) avec un enrichissement d’un facteur 500. Ceci nous permet de détecter des cellules productrices avec des fréquences beaucoup plus élevées dans ces populations TCD3+CD8- en cycle à hauteur de 0,08%, et en phase G2 (2,46%), mais également dans les cellules présentant une poly-expression des 4 immune-checkpoints (2,27%). L’avènement de la cytométrie de masse a augmenté de façon exponentielle les informations que nous pouvions obtenir sur une cellule. Grâce à cet outil, l’identification du cycle cellulaire, en corrélation avec différents marqueurs phénotypiques, permet d’explorer des informations jusque-là inaccessibles, entre autre l’analyse des réservoirs latents et productif du VIH. Ce travail permet ainsi de caractériser le plus précisément possible ces cellules productrices de VIH, mais aussi les cellules latentes, et potentiellement réservoirs du virus.

Salt stress is one of the main environmental factors limiting plant growth and yield in cereal crops. It is therefore imperative to develop varieties more tolerant to salt stress in order to increase yield and ensure food security. The signaling pathway linking salt stress perception to cellular response was addressed here by studying RSS1-like proteins in plants. RSS1 (Rice Salt Sensitive 1) protein plays an important role in salt stress tolerance. It acts at the interface of stress perception and developmental control and division in meristems. During this work, the RSS1 counterpart named TdRL1 (Triticum durum RSS-Like 1) was isolated from the durum wheat Tunisian variety "Oum Rabiaa". We have demonstrated that TdRL1 carries the conserved D and DEN-Box motifs involved in the post-translational regulation of the protein. In addition, we show that TdRL1 is the functional homologue of RSS1 since it was able to complement the loss-of-function mutant rss1, hypersensitive to salt stress. In addition, heterologous expression of TdRL1 enhances salt stress tolerance in yeast and in Arabidopsis by increasing germination and reducing the accumulation of reactive oxygen species. Our cytological studies have shown that the TdRL1 protein is cytoplasmic in interphase and is localized at the spindle during mitosis. Remarkably, TdRL1 changes its subcellular localization under salt stress treatment and shows a partial accumulation in the nucleus, highlighting the multifunctional nature of this protein during salt stress response. Our data suggest that under salt stress, TdRL1 plays a role in the regulation of the cell cycle in relation with the microtubule network. Pursuing the study of RSS1-like multifunctional proteins will open up new research areas for the creation of wheat varieties that are more resilient to environmental stresses.; Le stress salin est l'un des principaux facteurs environnementaux limitant la croissance des plantes et entraînant des pertes de rendement des cultures céréalières. Il est ainsi impératif de développer des variétés plus tolérantes à la salinité afin d’augmenter leurs rendements et assurer la sécurité alimentaire. La voie signalétique reliant la perception du stress salin à la réponse cellulaire, encore peu connue, a été abordée ici par l’étude des protéines RSS1-like conservées chez les plantes. La protéine RSS1 (Rice Salt Sensitive 1) du riz joue un rôle primordial dans la tolérance au stress salin en agissant à l’interface entre la perception des stress et le contrôle du développement et de la division dans les méristèmes. Lors de ce travail, l'homologue de RSS1 nommé TdRL1 (Triticum durum RSS-Like 1) a été isolé à partir de la variété tunisienne de blé dur “Oum Rabiaa“. Nous avons démontré que TdRL1 porte les motifs D et DEN-Box conservés impliqués dans la régulation post-traductionnelle de la protéine. En outre nous avons apporté la preuve que TdRL1 est l’homologue fonctionnel de RSS1 puisqu'il est capable de complémenter le mutant de perte de fonction rss1, hypersensible au stress salin. En outre, l’expression hétérologue de TdRL1 améliore la tolérance au stress salin chez la levure ainsi que chez Arabidopsis et ce par l’augmentation du pouvoir germinatif et la réduction de l’accumulation des espèces oxygénées réactives. Nos études cytologiques ont montré que la protéine TdRL1 est cytoplasmique en interphase et se localise au niveau des microtubules kinétochoriens pendant la mitose. Remarquablement, TdRL1 change de localisation cellulaire sous stress salin et montre une accumulation partielle dans le noyau, soulignant le caractère multifonctionnel de cette protéine dans la réponse au stress salin. L’ensemble des données suggère que sous contrainte saline, TdRL1 joue un rôle dans la régulation du cycle cellulaire en relation avec le réseau microtubulaire. L‘étude de la famille RSS1-like multifonctionnelle permettra ainsi d’aborder de nouvelles voies de recherche pour la création variétale de blé plus résilientes aux stress de l'environnement.

The actin cytoskeleton generates and mechanotransducts forces. Here we report that the cortical branched actin that depends on RAC1, WAVE and ARPC1B-containing Arp2/3 complexes is specifically monitored by the Coronin1B sensor, WISp39 and the cyclin-CDK inhibitory protein p21, to control cell cycle progression. Accordingly, the duration of the G1 phase scales with the persistence of single cell migration, ensuing from branched actin and lamellipodium protrusion. Cortical branched actin determines the cell decision to enter into S phase by integrating soluble stimulifrom growth factors and mechanotransduced signals, such as substratum rigidity and cell density. The Arp2/3 complex is overall overexpressed in brest cancer. Among its subunits, The ARPC1B isoform overexpression is the strongest prognostic factor for patients. Furthermore, Arp2/3 inhibition prevents the growth of mammary carcinoma and melanoma cell lines transformed by the RAC1 oncogene, for which no targeted therapy is available. The discovery of the cortical branched actin checkpoint thus provides diagnostic and therapeutic opportunities in cancer., Résumé : Le cytosquelette d’actine génère et mécanotransduit des forces. Dans cette étude, nous montrons que l’actine branchée corticale, qui dépend de RAC1, WAVE et des complexes Arp2/3 contenant ARPC1B, est spécifiquement détectée par le senseur Coronin1B, qui signale, via WISp39 et l’inhibiteur de cycline/CDK p21, à la cellule, de progresser dans le cycle cellulaire. En conséquence, la formation d’un lamellipode et la migration persistante des cellules qui en découle, est corrélée à la durée de la phase G1. L’actine branchée corticale détermine l’entrée en phase S des cellules, en intégrant les stimuli solubles des facteurs de croissance et la mécanotransduction desadhérences à la matrice extracellulaire et aux cellules voisines. Le complexe Arp2/3 est globalement sur-exprimé dans le cancer du sein. Parmi ses sous-unités, la sur-expression de l’isoforme ARPC1B est le plus fort facteur prognostique pour les patientes. En outre, l’inhibition du complexe Arp2/3 bloque la prolifération de lignées de carcinomes mammaires et de mélanomes transformées par l’oncogène RAC1, contre laquelle il n’existe pas de thérapie ciblée. La découverte du checkpoint de l’actine branchée corticale apporte ainsi de nouvelles options pronostiques, diagnostiques et thérapeutiques dans les cancers.

P16INK4a is a tumor suppressor protein that is a well described cell cycle regulator. Recently, genome-wide association studies (GWAS) associated the CDKN2A locus, from which p16INK4A is encoded, with increased risk for development of type 2 diabetes. A pathophysiological link between p16INK4a and hepatic glucose homeostasis has been unraveled recently, through the control of gluconeogenesis. Patients with T2D also present with disturbances in fat metabolism, associated with an increased prevalence to Non Alcoholic Fatty liver diseases (NAFLD). In this context, we investigated the role of p16INK4a in hepatic lipid metabolism in vitro using primary hepatocytes, the murin AML12 and human IHH hepatocyte cell line transfected respectively with siRNA-CDKN2A and siRNA-p16 and in vivo using p16+/+ and p16-/- mice.Transcriptomic analyses of p16+/+ and p16-/- primary hepatocytes using microarrays revealed that metabolic and PPARα signaling pathways were among the most modulated in p16 absence. Moreover, in primary hepatocytes and in hepatocyte cell lines, p16 deficiency modulates a subset of PPARα target genes associated to fatty acids oxidation (FAO). These effects were associated with an increased response to GW647, a PPAR945; agonist, and reversed by siRNA targeting PPAR45;. Investigating known PPAR945; activators and transcriptional co-activators in vitro, we found that upregulation of FAO genes expression was linked to SIRT1. AMPK is a known activator of FAO and has been shown to induce SIRT1 activation through increase of NAD/NADH ratio. Interestingly, downregulation of p16 expression in vitro led to increased AMPK phosphorylation and activation.In vitro, p16-/- primary hepatocytes demonstrated enhanced fatty acid oxidation of oleate compared to p16+/+. During fasting, enhanced FAO leads to a shift of acetyl-coA utilization from the TCA cycle to ketogenesis. Interestingly, p16-/- mice showed a tendency to produce more ketone bodies than their control littermate after sodium octanoate injection. These findings describe a new function for p16INK4a in hepatic lipid metabolism through activation of AMPK-SIRT1-PPARα pathway.; Plusieurs études génétiques d’association de gènes ont mis en évidence le locus CDKN2A, codant notamment la protéine p16INK4a (p16), un gène suppresseur de tumeur, comme étant associé au risque de développement du diabète de type 2 (T2D) et des maladies cardiovasculaires. Le T2D, caractérisé par une hyperglycémie et/ou une insulinorésistance, s’accompagne fréquemment d’une stéatose hépatique prédisposant au développement de la NASH (Non Alcoholic Steatohepatitis), et contribuant à un risque accru de complications cardiovasculaires. Nous avons montré que la déficience de p16 augmente la néoglucogenèse hépatique lors d'un jeûne suggérant un rôle de p16 dans le T2D. Cependant, le rôle de p16 dans l’homéostasie hépatique des lipides n’est à ce jour pas connu. Afin de déterminer le rôle de p16 dans le métabolisme hépatique des lipides, nous avons utilisé des hépatocytes primaires isolés de souris p16+/+ et p16-/- ainsi que les lignées d’hépatocytes murins AML12 et humains IHH transfectées respectivement avec un siRNA-CDKN2A ou siRNA-p16.Nous avons montré par l’étude transcriptomique des hépatocytes primaires de souris par puces à ADN, que l’absence de p16 module les voies métaboliques associées à PPARα et contrôle préférentiellement l’expression de certains gènes cibles de PPARα, associés au catabolisme des acides gras. _x000D_Dans les lignées cellulaires hépatocytaires, certains de ces gènes sont également modulés après diminution de l’expression de p16 par siRNA. Ces effets sont associés à une meilleure réponse à l’agoniste de PPARα, le GW647, et abolis par un siRNA ciblant PPARα. Afin d’étudier par quel(s) mécanisme(s) l’absence de p16 module l’expression des gènes cibles de PPARα, le rôle de certains de ses coactivateurs transcriptionnels a été étudié par l’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques ou de siRNA. De manière intéressante, nous avons pu montrer que l’absence de p16 active la voie AMPK-SIRT1 afin d’augmenter l’expression des gènes cibles de la β-oxydation et de la cétogenèse. De plus, ces effets sont indépendants du rôle de p16 dans le cycle cellulaire. In vitro, les hépatocytes primaires p16-/-, incubés avec de l’oléate radiomarqué, présentent une β-oxydation augmentée comparés aux hépatocytes primaires p16+/+. Au cours du jeûne, l’acétyl-CoA provenant de la β-oxydation est redirigé vers la production de corps cétoniques. De manière intéressante, les souris p16-/- injectées avec du sodium octanoate, un acide gras à chaîne courte préférentiellement utilisé via la cétogenèse, ont une tendance à avoir une production plus importante de corps cétoniques.Nous avons ainsi pu mettre en évidence que la déficience de p16 dans les hépatocytes favorise l’utilisation des acides gras, via l’activation de la voie SIRT1-AMPK-PPARα.

When ageing, cells profoundly reprogram to enter a state called senescence. Although the link between senescence and cancer is well established, the nature of this link remains unclear and debated. We will describe in this article the properties of senescent cells and make clear on how they could promote or oppose to cancer initiation and progression. We will also consider senescence as a response to classical anti-cancer therapies and discuss how to take advantage of senescence to improve the efficacy of these therapies while decreasing their toxicity.

The bacterial cell cycle is a very well studied process but current models don't reflect the complexity and diversity of involved molecular machineries and associated regulation mechanisms. In fact, our knowledge of cell cycle is based on study of a few model organisms. Yet, comparative analyses showed that some described systems and mechanisms are not conserved and not transposable from a taxon to another. Evolutionary approach such as phylogenomic can be used for functional studies of such systems at the bacterial scale. Those approaches allow to determine the key evolutionary events that lead to a such diversity but also to identify potential functional links between proteins. Furthermore, the development of high throughput sequencing methods leads to a big amount of genomic data, particularly for prokaryotes. In this context, I realized a very large scale phylogenomic analysis of proteins involved in cell cycle and its regulation in Firmicutes. My goal was to search some coevolution patterns between protein families reflecting potentially functional links. The application of methods that I developed during my PhD to cell cycle proteins allowed to reconstruct the evolutionary history of this cell process in Firmicutes. Notably, I highlighted some hot-spots corresponding for example to the emergence of Bacilli or Streptococcaceae. The emergence of such taxa has been accompanied by many acquisitions/losses of cell cycle genes but also many genomic rearrangements in gene clusters suggesting that major changes have occurred at the level of the cell cycle and its regulation. I also highlighted some potential functional links between genes involved in different machineries of cell cycle that have never been described. The application of these approaches to the entire proteomes of Firmicutes allowed to identify proteins presenting same evolution patterns than cell cycle proteins suggesting potential functional links that have to be experimentally tested, Le cycle cellulaire chez les bactéries est un processus très étudié mais il apparait que les modèles actuels ne rendent pas compte de la complexité et surtout de la diversité des machineries et des mécanismes de régulation impliqués. En fait, notre connaissance du cycle cellulaire repose sur l'étude de quelques organismes modèles. Or les analyses comparatives ont montré que certains systèmes et mécanismes décrits sont peu conservés et donc difficilement transposables d'un taxon à l'autre. Des approches évolutives telles que la phylogénomique peuvent être utilisées pour l'étude fonctionnelle de tels systèmes biologiques à l'échelle des bactéries. Ces approches permettent notamment de déterminer les évènements évolutifs clés qui ont conduit à une telle diversité mais également d'identifier des liens fonctionnels potentiels entre protéines. De plus, le développement des méthodes de séquençage à très haut débit a conduit à une accumulation de données génomiques sans précèdent, notamment chez les procaryotes. Dans ce contexte, j'ai réalisé une analyse phylogénomique à très large échelle des protéines impliquées dans le cycle cellulaire et sa régulation chez les Firmicutes. Mon objectif était de rechercher des patrons de coévolution entre familles protéiques pouvant refléter des liens fonctionnels. L'application des méthodes développées dans le cadre cette thèse aux protéines impliquées dans le cycle cellulaire chez les Firmicutes a permis de reconstruire l'histoire évolutive de ce processus cellulaire fondamental à l'échelle de ce phylum bactérien majeur. En particulier, j'ai pu mettre en évidence l'existence de quelques points chauds correspondant par exemple à l émergence des Bacilli ou des Streptococcaceae. L'émergence de ces taxa s'est accompagnée de nombreuses acquisitions et/ou de pertes de gènes ainsi que de nombreux réarrangements dans l'organisation des clusters de gènes codant pour ces protéines, suggérant que des changements majeurs se sont produits au niveau du cycle cellulaire et de sa régulation. J'ai également pu mettre en évidence de possibles liens fonctionnels qui n'ont jamais été décrits jusqu'à présent entre des gènes impliqués dans différentes machineries du cycle cellulaire. L'application de ces approches à l'ensemble des protéomes de Firmicutes a également permis d'identifier des protéines présentant des patrons de coévolution communs avec les protéines impliquées dans la division cellulaire et sa régulation, suggérant de possibles liens fonctionnels qu'il serait nécessaire de tester expérimentalement

Mass Cytometry (MCM) has revolutionized the study of cell and phenotypic diversity, significantly increasing the number of markers that can be analyzed simultaneously (41 to date). By making it possible to precisely define the status of lymphocyte populations, particularly with regard to their differentiation, activation and entry into the cell cycle, CMM has uncovered small subsets previously unknown. In this study, MMC was used to try to better characterize HIV reservoirs. With the introduction of combination antiretroviral therapy (ART) in 1996, HIV infection has been transformed from a fatal fate to a manageable chronic disease with a normal lifespan due to a reduction in active viral replication (the amount of virus is below optimal detection limits). However, if treatment is interrupted, the patient's viral load increases again due to viable provirus reservoirs located in long-lived cell populations that cannot be eliminated by current therapies. These infected reservoir cells are a major obstacle to the eradication of HIV. The best characterized reservoir is that of CD4+ T lymphocytes and is mainly hosted in MCT, MST, MSCT, and Tfh. An initial study allowed us to evaluate the stages of the cell cycle in association with markers of differentiation, activation and depletion, leading to an in-depth evaluation of the quiescence status of CD4 T cells likely to harbour latent HIV reservoirs. This broad multiplex analysis demonstrates that certain subsets of LTCD4+CD25-HLA-DR - classically considered "at rest" - actually contain significant amounts of cells cycling or expressing inhibitory receptors, opening new avenues for redefining quiescent CD4 T cells in peripheral blood. A second study aimed to define in vivo HIV-producing CD4 LT populations. We developed a multiparametric analysis on cells from HIV+ patients on ART and in the therapeutic interruption phase (TIA). This study shows that CD3+CD4+CD32high cells express a high level of activation markers and receive important activation signals via cytokines, in contrast to CD32a cells. On the other hand, the analysis of HIV-producing LTCD4+ (expressing the p24 capsid protein), allowed us to detect a very low number of p24+ positive cells (less than 0.004% in ATI phase but none before). The phenotype of the producing cells was then highlighted. They are T lymphocytes that do not express CD8, enriched with a factor 4 in TSCM cells and a factor 2 in TFH. These populations are highly enriched in activated cells co-expressing 3 activation markers (increased by a factor of 20) and are cycling (Ki67+) and/or over-expressing immune control molecules (ICP) with an enrichment of a factor of 500. This allows us to detect producer cells with much higher frequencies in these TCD3+CD8- populations in cycle up to 0.08%, and in G2 phase (2.46%), but also in cells showing poly-expression of the 4 immune-checkpoints (2.27%). The advent of mass cytometry has exponentially increased the information we could obtain on a cell. Thanks to this tool, the identification of the cell cycle, in correlation with different phenotypic markers, makes it possible to explore previously inaccessible information, including the analysis of the latent and productive reservoirs of HIV. This work thus makes it possible to characterize as precisely as possible these HIV-producing cells, but also latent cells, and potential reservoirs of the virus., La cytométrie de masse CMM) a révolutionné l'étude de la diversité cellulaire et phénotypique, en augmentant de manière significative le nombre de marqueurs pouvant être analysés simultanément (41 à ce jour). En permettant de définir précisément l'état des populations de lymphocytes, notamment en ce qui concerne leur différenciation, activation et leur entrée dans le cycle cellulaire, la CMM a mis au jour de petits sous-ensembles jusqu'ici inconnus. Dans cette étude, la CMM a été utilisée pour tenter de mieux caractériser les réservoirs du VIH. Avec l'introduction de la thérapie antirétrovirale combinée (ART) en 1996, l'infection par le VIH est passée d'un destin fatal à une maladie chronique gérable avec une durée de vie normale grâce à une réduction de la réplication virale active (la quantité de virus est en deçà des limites de détection optimales). Cependant, si le traitement est interrompu, la charge virale chez le patient augmente à nouveau du fait des réservoirs de provirus viables localisés dans des populations de cellules à longue durée de vie et qui ne peuvent pas être éliminées par les traitements actuels. Ces cellules infectées réservoirs constituent un obstacle majeur à l'éradication du VIH. Le réservoir le mieux caractérisé est celui des lymphocytes T CD4+ et est principalement hébergé dans les TCM, les TTM, les TSCM et les Tfh. Une première étude nous a permis d’évaluer les stades du cycle cellulaire en association à des marqueurs de différenciation, d'activation et d'épuisement, pour aboutir à une évaluation poussée de l'état de quiescence des lymphocytes T CD4 susceptibles d’abriter les réservoirs latents de VIH. Cette large analyse multiplexe démontre que certains sous-ensembles des LTCD4+CD25-HLA-DR- classiquement considérés "au repos"- contiennent en fait des quantités notables de cellules en cycle ou exprimant des récepteurs inhibiteurs, ouvrant de nouvelles voies pour une redéfinition des cellules T CD4 quiescentes du sang périphérique. Une deuxième étude avait pour but de définir les populations de LT CD4 produisant du VIH in vivo. Nous avons développé une analyse multiparamétrique sur des cellules de patients VIH+ sous ART et en phase d’interruption thérapeutique (ATI). Cette étude met en évidence que les cellules CD3+CD4+CD32high expriment un fort taux de marqueurs d’activation et reçoivent d’importants signaux d’activation via des cytokines, à l'inverse des cellules CD32a-. D'autre part, l'analyse des LTCD4+ producteurs de VIH (exprimant la protéine de capside p24), nous a permis de détecter un très faible nombre de cellules positives p24+ (inférieur à 0,004% en phase d’ATI mais aucun avant). Le phénotype des cellules productrices a ensuite été mis en évidence. Il s’agit de lymphocytes T n’exprimant pas de CD8, enrichis d’un facteur 4 en cellules TSCM, et d'un facteur 2 en TFH. Ces populations sont très enrichies en cellules activées co-exprimant 3 marqueurs d’activation (augmentés d’un facteur 20) et sont en cycle (Ki67+) et/ou sur-expriment des molécules de contrôle immunitaire (ICP) avec un enrichissement d’un facteur 500. Ceci nous permet de détecter des cellules productrices avec des fréquences beaucoup plus élevées dans ces populations TCD3+CD8- en cycle à hauteur de 0,08%, et en phase G2 (2,46%), mais également dans les cellules présentant une poly-expression des 4 immune-checkpoints (2,27%). L’avènement de la cytométrie de masse a augmenté de façon exponentielle les informations que nous pouvions obtenir sur une cellule. Grâce à cet outil, l’identification du cycle cellulaire, en corrélation avec différents marqueurs phénotypiques, permet d’explorer des informations jusque-là inaccessibles, entre autre l’analyse des réservoirs latents et productif du VIH. Ce travail permet ainsi de caractériser le plus précisément possible ces cellules productrices de VIH, mais aussi les cellules latentes, et potentiellement réservoirs du virus.

In eukaryotic cells, the organization of DNA into chromatin not only ensures its compaction into nucleus, but also serves as a dynamic structure that offers a range of possibilities for regulating DNA transactions, such as transcription, DNA replication and repair. The basic unit of chromatin is the nucleosome, which is constituted of 147 bp of DNA wrapped with an octamer composed of histone proteins. This nucleosome structure is versatile showing distinct variations, including post-translational modifications of histone proteins. Histone modifications contribute to the regulation of genome functions by altering directly the nucleosome structure or through the recruitment of specific chromatin-binding proteins. In this regard, the lysine 20 of histone H4 (H4K20) can be modified to generate three different methylation states: mono- (me1), di- (me2), and trimethylation (me3), with a unique activity being coupled to the specific extent of methylation on this lysine residue. PR-Set7 (also known as SET8 or SETD8) is the sole enzyme that catalyzes H4K20me1, whereas H4K20me2 and H4K20me3 occur through the action of Suv4-20h, which requires PR-Set7-induced H4K20me1 as a substrate. These enzymes are essential since knockout studies have shown that both PR-Set7 and Suv4-20h are required for mouse development and their loss causes DNA damage and cell cycle defects. However, the functions of different H4K20 methylation states and the associated enzymes still remain poorly understood.The work carried out during this thesis reveals that the concerted activity of PR-Set7 and Suv4-20h is required for the timely control of (i) heterochromatin assembly on nascent DNA and (ii) the licensing of a critical subset of late-firing origins necessary for the replication of heterochromatin regions in the following cell cycle. Both functions depend on the conversion of H4K20me1 to H4K20me3 and the specific recruitment of the H4K20me-binding protein LRWD1/ORCA. Accordingly, siRNA-mediated PR-Set7 depletion triggers a defective interphase chromatin compaction in cells that exit of mitosis, which in turn favor a non-specific chromatin loading of ORC and MCMs subunits of pre-replication complexes. Finally and consistent with a key role of H4K20 methylation in heterochromatin formation and replication, my thesis work contributes to reveal that up-regulation of PR-Set7 is a poor prognosis factor in multiple myeloma and that its inhibition by specific chemical compounds might be a great interest for cancer treatment in near future.; Dans les cellules eucaryotes l’organisation de l’ADN en chromatine n’assure pas seulement la compaction de l’ADN dans le noyau mais sert aussi de structure dynamique qui permet la régulation des processus pour lesquels l’ADN est une matrice comme la transcription, la réplication et la réparation de l’ADN. L’unité de base de la chromatine est le nucléosome qui est constitué de 147pb d’ADN qui s’enroule autour d’un octamère d’histones. Le nucléosome possède une structure flexible régulée par les modifications post-traductionnelles d’histones. Les modifications d’histones contribuent à la régulation des fonctions du génome en modérant directement la structure de la chromatine ou bien via le recrutement de protéines spécifiques liant la chromatine. La lysine 20 de l’histone H4 (H4K20) peut être modifiée pour générer 3 niveaux de méthylation : mono- (me1), di- (me2), et tri-méthylation (me3), chaque niveau de méthylation est associé à des fonctions spécifiques. PR-Set7 (aussi appelée Set8, Setd8 ou KMT5A) est l’unique enzyme connue pour catalyser la mono-méthylation H4K20 alors que les niveaux de di- et tri-méthylation sont le résultat de l’activité des enzymes Suv4-20h qui requièrent la mono-méthylation H4K20 induite par PR-Set7 comme substrat. Ces enzymes sont essentielles puisque des études de Knock-Out ont montré que PR-Set7 et les Suv4-20h sont requises pour le développement de la souris et que leur perte dans des modèles cellulaires entraine des dommages ADN et des défauts de cycle cellulaire. Toutefois, les fonctions des différents niveaux de méthylation et des enzymes associées restent peu claires. Le travail réalisé pendant cette thèse a révélé que l’action concertée des enzymes PR-Set7 et Suv4-20h est requise pour le contrôle (i) de l’assemblage de l’hétérochromatine sur l’ADN naissant, (ii) de la liaison du pre-RC sur un groupe d’origines de réplication tardives nécessaires pour la réplication de régions d’hétérochromatine dans le cycle cellulaire suivant. Les deux fonctions dépendent de la conversion de la mono-méthylation H4K20 en tri-méthylation H4K20 et du recrutement spécifique de la protéine liant la méthylation H4K20 ORCA/LRWD1. Ainsi, la déplétion de PR-Set7 par siRNA entraine des défauts de compaction de la chromatine en interphase des cellules qui sortent de mitose, ce qui favorise la fixation non spécifique des sous-unités MCMs et ORCs des complexes pre-RC. Finalement et étant donné le rôle clé de la méthylation H4K20 dans la formation de l’hétérochromatine et la réplication, mon travail de thèse a contribué à révéler que la surexpression de PR-Set7 est un facteur de mauvais pronostic dans le myélome multiple et que l’inhibition de cette enzyme par des composés chimiques pourrait dans le futur avoir un grand intérêt pour le traitement du cancer.