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Les mutations somatiques sur le variant d’histone H3.3 et les régulateurs épigénétiques associés à H3.3 ont été identifiés dans 30 % des glioblastomes pédiatriques. Ces mutations sont caractérisées par des substitutions d'acides aminés à des positions spécifiques dans la région N-terminale de l'histone H3.3 telles que la glycine 34 en valine/arginine (G34V/R), l'alanine 29 en proline (A29P), ou une haplo-insuffisance de la protéine Zinc Finger MYND-Type Containing 11 (ZMYND11). ZMYND11 est un co-répresseur de la transcription qui se lie spécifiquement à H3.3K36me3 pour moduler l'activité de l'ARN polymérase II. De plus, il est intéressant de mentionner que l’interaction entre ZMYND11 et H3.3K36me3 est altérée lorsque le résidu G34 est muté en G34V. Récemment, les mutations germinales H3.3G34V, H3.3A29P et ZMYND11 ont été identifiées chez des patients présentant une déficience neurologique. Nous émettons l'hypothèse que les mutants H3.3G34V et H3.3A29P empêchent ZMYND11 de se lier à H3.3K36me3 et pourrait converger mécaniquement avec la perte de fonction de ZMYND11, ce qui perturberait la neurogenèse. À l'aide de la technologie CRISPR Cas9, nous avons généré des modèles mutants isogéniques à partir de cellules souches pluripotentes (iPSC) pour H3F3B-A29P, H3F3B-G34V et ZMYND11-knock-out (KO). Par la suite, nous avons stimulé la différenciation de ces modèles vers des lignées neuronales afin d’identifier si ces mutations affectent la neurogenèse. Enfin, en utilisant des méthodes de séquençage à haut-débit nous avons analysé le profil épigénomique et transcriptomique pour déterminer comment l’interaction entre ZMYND11 et H3K36me3 est perturbée et à quels degrés ces mutations impactent sur les modifications post-traductionnelles des histones. Ce projet permettra de mieux comprendre les fonctions de ZMYND11 sur le remodelage de la chromatine et sa fonction biologique au cours du développement cérébral., Somatic mutations on the histone 3 variant H3.3 and H3.3-associated chromatin modifiers have been identified in 30% of pediatric high-grade gliomas (pHGG). The mutations are characterized by amino acid substitutions at specific positions within the histone H3.3 tail such as glycine 34 to valine/arginine (G34V/R), alanine 29 to proline (A29P), or haploinsufficiency of the chromatin reader Zinc Finger MYND-Type Containing 11 (ZMYND11). ZMYND11 is a transcriptional co-repressor that specifically reads H3.3K36me3 to modulate RNA polymerase II activity. Notably, binding of ZMYND11 to H3.3K36me3 is altered when G34 residue is mutated to G34V. Recently, germline mutations of H3.3G34V, H3.3A29P, and ZMYND11 have been identified in patients with Intellectual disability. We hypothesize that H3.3 G34V and H3.3A29P mutants impede the binding of ZMYND11 to H3.3K36me3 and may mechanistically converge with ZMYND11 loss-of-function mutation to perturb neurogenesis. Using CRISPR Cas9-mediated gene editing, we will generate isogenic human induced pluripotent stem cell (iPSC) models for H3F3B-A29P, H3F3B-G34V and ZMYND11-KO, and perform in vitro neural differentiation to identify whether specific neural lineages are affected. Next, using epigenomic and transcriptomic profiling we will study whether binding between ZMYND11 and H3K36me3 is disrupted, and the downstream impact on Post-Translational Modifications of histones (PTMs) and transcription. This project will lead to a better understanding of the crucial role of the chromatin reader ZMYND11 on chromatin remodeling and the biological function during neural development.

Le titane (Ti) est largement utilisé en orthopédie et médecine dentaire. Ce matériau présente d´excellentes propriétés mécaniques, est biocompatible et résiste à la corrosion. L’interaction entre les cellules et la surface d’un implant joue un rôle décisif dans l’ostéointégration. Malgré la grande variété d’études que nous trouvons dans la littérature, le comportement des cellules en contact avec des matériaux implantables comme le Ti n’est toujours pas élucidé à toutes les échelles topographiques. Notre laboratoire a développé une méthode de modification physico-chimique de la surface de métaux à intérêt médical. Cette méthode génère des surfaces nanoporeuses qui favorisent la différenciation de cellules souches, affectent le comportement cellulaire de façon différentielle, promeuvent la formation osseuse in vitro et in vivo, et qui ont une capacité antibactérienne. Afin de mieux comprendre comment cette surface influence le comportement cellulaire, nous avons étudié leur influence sur la formation et la maturation des adhésions focales (FAs, de l’anglais) et la formation des filopodes. De plus, nous avons examiné comment les caractéristiques physico-chimiques de la surface obtenue guident l’expression génique des protéines associées aux FAs et aux filopodes en utilisant différentes lignées cellulaires. Finalement, afin de mieux comprendre la biomécanique de la cellule, la force d’adhésion à la surface des filopodes a été déterminée à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM). Des disques de Ti commercialement pur (Cp-Ti) ont été polis a fini miroir (Ti-Control), une partie des disques a été traité avec un mélange d’acide sulfurique et de peroxyde d’hydrogène pour créer une surface nanostructurée poreuse (Ti-Nano). L’influence de la nanoporosité, de la cristallinité et la mouillabilité de cette surface sur des cellules pre-ostéoblastiques de souris (MC3T3) et des bactéries a été évalué par la microscopie électronique à balayage (MEB) et par immunofluorescence (IF). Nous avons ensuite utilisé une lignée cellulaire épithéliale (CHO-K1) qui exprime la paxilline (une protéine des FAs) de type sauvage ou la paxilline avec des mutations. De plus, la force d’interaction des filopodes avec la surface a été quantifié en mesurant la force latérale nécessaire pour les déplacer avec une pointe d’AFM. Finalement, la centrifugation a été utilisée pour étudier les changements fonctionnels des cellules MC3T3. L’analyse du comportement des cellules MC3T3 sur des surfaces amorphes et cristallines n'a pas montré de différence par rapport au nombre des cellules ou la quantité des FAs. La cristallinité de la couche superficielle n’avait également aucune incidence sur l’adhésion bactérienne. Les deux lignées cellulaires utilisées ont montré une présence abondante de filopodes avec des nanoprotrusions latérales en réponse à la nanoporosité. La taille et la forme des cellules CHO-K1 ont été grandement affectées par la topographie. L’expression génique des protéines associées aux différents marqueurs des FAs et aux protrusions a été aussi significativement augmentée sur la surface nanoporeuse, quel que soit le type de cellule. Les filopodes sur Ti-Nano ont montré une plus grande résistance au détachement latéral, ce qui indique qu'ils adhèrent à la surface avec plus de force. Également, l’analyse par MEB a révélé une restructuration de la membrane cellulaire accompagnée d’un changement de la forme cellulaire après centrifugation. Parce que les mitochondries fournissent de l’énergie pour les processus cellulaires, l’organisation du réseau mitochondrial a été influencée aussi par la topographie de surface et la centrifugation. Bien qu’il ne puisse pas être exclu que la cristallinité et la mouillabilité de la surface contribuent dans une certaine mesure à déterminer le comportement des cellules, nos résultats suggèrent que les caractéristiques physiques des surfaces représentent le principal déterminant. Nous avons démontré aussi, pour la première fois, que la topographie de surface peut modifier l’interaction adhésive d’une structure subcellulaire qui est fondamentale dans la détection des caractéristiques physico-chimiques des surfaces. En conclusion, nos résultats montrent que la topographie de surface peut modifier des propriétés fondamentales dans les cellules. Dans leur ensemble, ils soulèvent la possibilité que les surfaces nanostructurées puissent être utilisées non seulement pour guider/accélérer l’intégration de biomatériaux dans des conditions normales, mais également dans des situations où l’activité cellulaire est compromise ou également pour les prothèses soumises à des charges externes, telles que les implants orthopédiques et dentaires., Titanium (Ti) is widely used in orthopedics and dentistry. This material has excellent mechanical properties, is biocompatible and corrosion resistant. The interaction between the cells and the surface of an implant plays a key role in osseointegration. Despite the wide variety of studies found in the literature, the behavior of cells in contact with implantable materials such as Ti is not yet fully elucidated at all topographic scales. Our laboratory has developed a method for the physicochemical modification of the surface of medically relevant metals. This method generates nanoporous surfaces that promote stem cell differentiation, differentially affect cellular behavior, promote bone formation in vitro and in vivo and have antibacterial capacity. To better understand how this surface influences cell behavior, we studied their influence on the formation and maturation of focal adhesions (FAs) and filopodia formation. Furthermore, we examined how the physicochemical characteristics of the resulting surface guide the gene expression of proteins associated with FAs and filopodia using different cell lines. Finally, to better understand the biomechanics of the cell, the adhesion strength of filopodia to the surface was determined using atomic force microscopy (AFM). Commercially pure Ti discs (Cp-Ti) were polished to a mirror finish (Ti-Control), some of the polished discs were treated with a mixture of sulfuric acid and hydrogen peroxide to create a nanostructured surface (Ti-Nano). The influence of nanoporosity, crystallinity and wettability of this surface on mouse pre-osteoblastic cells (MC3T3) and bacteria was evaluated by scanning electron microscopy (SEM) and immunofluorescence. Then, to evaluate the response to nanotopography, we used an epithelial cell line (CHO-K1) that expresses wild type paxillin (a protein of FAs) or paxillin with mutations. In addition, the interaction forces of the filopodia with the surface were quantified by measuring the lateral force required to displace these structures from the surface with an AFM tip. Finally, centrifugation was used to study functional changes in MC3T3 cells. Analysis of the behavior of MC3T3 cells on amorphous and crystalline surfaces showed no difference in cell number or the number of focal adhesions. The crystallinity of the surface layers also had no effect on bacterial adhesion. Both cell lines used showed abundant presence of filopodia 4 with lateral nanoprotrusions in response to nanoporosity. The size and shape of CHO-K1 cells was greatly affected by the topography. Gene expression of proteins associated with different focal adhesion markers and protrusions was also significantly increased on the nanoporous surface, regardless of cell type. Filopodia on the Ti-Nano showed greater resistance to lateral detachment force, indicating that they adhere to the surface with greater strength. Also, SEM analysis revealed a restructuring of the cell membrane accompanied by a corresponding change in cell shape after centrifugation. Because mitochondria provide energy for cell processes, the organization of the mitochondrial network was also influenced by surface topography and centrifugation. Although it cannot be excluded that surface crystallinity and wettability contribute to some extent to determining cell behavior, our results suggest that the physical characteristics of the surfaces represent the main determinant. We have also shown for the first time that surface topography can modify the adhesive interaction of a subcellular structure that is fundamental in the detection of the physicochemical characteristics of surfaces. In conclusion, our results show that surface topography can modify fundamental properties in cells. Together, they raise the possibility that nanostructured surfaces can be used not only to guide/accelerate the integration of biomaterials under normal conditions, but also in situations where cellular activity is compromised or also for prostheses under external loads, such as orthopedic and dental implants.

Deep learning has been a significant advance in artificial intelligence in recent years. Its main domains of interest are image analysis and natural language processing. One of the major future challenges of this approach is its application to precision medicine. This new form of medicine will make it possible to personalize each stage of a patient's care pathway according to his or her characteristics, in particular molecular characteristics such as gene expression data that inform about the cellular state of a patient. However, deep learning models are considered black boxes as their predictions are not accompanied by an explanation, limiting their use in clinics. The General Data Protection Regulation (GDPR), adopted recently by the European Union, imposes that the machine learning algorithms must be able to explain their decisions to the users. Thus, there is a real need to make neural networks more interpretable, and this is particularly true in the medical field for several reasons. Understanding why a phenotype has been predicted is necessary to ensure that the prediction is based on reliable representations of the patients rather than on irrelevant artifacts present in the training data. Regardless of the model's effectiveness, this will affect any end user's decisions and confidence in the model. Finally, a neural network performing well for the prediction of a certain phenotype may have identified a signature in the data that could open up new research avenues.In the current state of the art, two general approaches exist for interpreting these black-boxes: creating inherently interpretable models or using a third-party method dedicated to the interpretation of the trained neural network. Whatever approach is chosen, the explanation provided generally consists of identifying the important input variables and neurons for the prediction. However, in the context of phenotype prediction from gene expression, these approaches generally do not provide an understandable explanation, as these data are not directly comprehensible by humans. Therefore, we propose novel and original deep learning methods, interpretable by design. The architecture of these methods is defined from one or several knowledge databases. A neuron represents a biological object, and the connections between neurons correspond to the relations between biological objects. Three methods have been developed, listed below in chronological order.Deep GONet is based on a multilayer perceptron constrained by a biological knowledge database, the Gene Ontology (GO), through an adapted regularization term. The explanations of the predictions are provided by a posteriori interpretation method.GraphGONet takes advantage of both a multilayer perceptron and a graph neural network to deal with the semantic richness of GO knowledge. This model has the capacity to generate explanations automatically.BioHAN is only established on a graph neural network and can easily integrate different knowledge databases and their semantics. Interpretation is facilitated by the use of an attention mechanism, enabling the model to focus on the most informative neurons.These methods have been evaluated on diagnostic tasks using real gene expression datasets and have shown competitiveness with state-of-the-art machine learning methods. Our models provide intelligible explanations composed of the most contributive neurons and their associated biological concepts. This feature allows experts to use our tools in a medical setting.; L'apprentissage profond est une avancée majeure de l'intelligence artificielle de ces dernières années. Ses domaines de prédilection sont principalement l'analyse d'image et le traitement du langage naturel. Un des futurs enjeux majeurs de cette approche est son application à la médecine de précision. Cette nouvelle forme de médecine permettra de personnaliser chaque étape du parcours de soin d'un patient en fonction de ses caractéristiques, notamment moléculaires telles que les données d'expression de gènes qui informent de l'état cellulaire d'un patient. Les modèles d'apprentissage profond sont néanmoins considérés comme des boîtes noires où aucune explication n'est fournie à la prédiction calculée. L'Union Européenne a adopté récemment un texte imposant aux algorithmes d'apprentissage automatique d'être capables d'expliquer leurs décisions aux utilisateurs. Il y a donc un réel besoin de rendre les réseaux de neurones plus interprétables et cela est particulièrement vrai dans le domaine médical pour différentes raisons. D'une part, pour s'assurer que le modèle se base sur des représentations fiables des patients et ne se concentre pas sur des artefacts non pertinents présents dans les données d'apprentissage. Ensuite, cela permettrait de rendre les différents utilisateurs (médecins, patients, chercheurs…) confiants dans leur utilisation de ce modèle. Enfin, un réseau de neurones performant pour la prédiction d'un certain phénotype peut avoir identifié une signature dans les données qui pourrait ouvrir sur de nouvelles pistes de recherche. Dans l'état de l'art actuel, il existe deux approches pour interpréter les réseaux neurones : en créant des modèles qui sont par essence interprétables, ou en ayant recours a posteriori à une méthode tierce dédiée à l'interprétation du réseau de neurones déjà appris. Quelle que soit la méthode choisie, l'explication fournie consiste généralement en l'identification des variables d'entrée et des neurones importants pour la prédiction. Or, dans le cas d'une application sur les données d'expression de gènes, cela n'est pas suffisant, car ces données sont difficilement compréhensibles par l'homme. Nous proposons ainsi de nouvelles méthodes originales d'apprentissage profond, interprétables par construction. L'architecture de ces méthodes est définie à partir d'une ou plusieurs bases de connaissances. Un neurone y représente un objet biologique et les connexions entre les neurones correspondent aux relations entre les objets biologiques. Trois méthodes ont été développées, listées ci-dessous dans l'ordre chronologique. La méthode Deep GONet se base sur un perceptron multicouche contraint par une base de connaissance biologique, la Gene Ontology (GO), par l'intermédiaire d'un terme de régularisation adapté. Les explications des prédictions sont fournies par une méthode d'interprétation a posteriori. La méthode GraphGONet tire parti à la fois d'un perceptron multicouche et d'un réseau de neurones de graphes afin d'exploiter au maximum la richesse sémantique de la connaissance GO. Ce modèle a la capacité de rendre automatiquement des explications. La méthode BioHAN ne se base plus que sur un réseau de neurones de graphes et peut facilement intégrer différentes bases de connaissances et leur sémantique. L'interprétation est facilitée par le recours aux mécanismes d'attention orientant le modèle à se concentrer sur les neurones les plus informatifs. Ces méthodes ont été évaluées sur des tâches de diagnostic à partir de jeux de données d'expression de gènes réelles et ont montré leur compétitivité par rapport aux méthodes d'apprentissage automatique de l'état de l'art. Nos modèles fournissent des explications intelligibles composées des neurones les plus importants et des concepts biologiques qui leur sont associés. Cette caractéristique permet aux experts d'utiliser nos outils dans un cadre médical.

Au cours du développement précoce de l'embryon, une importante vague de reprogrammation épigénétique efface et rétablit les profils de méthylation d’ADN (metADN) à travers le génome. Cependant, des régions spécifiques telles que les gènes à empreinte doivent échapper à cette vague de reprogrammation et maintenir leurs profils de metADN précis par l’activité constante de l’enzyme DNMT1 (ADN méthyltransférase 1) pour assurer le bon développement embryonnaire. En utilisant un modèle de cellules souches embryonnaires (mES) de souris avec une répression inductible de Dnmt1 (Dnmt1tet/tet), nous avons précédemment montré que la perte temporaire de Dnmt1 déclenche la perte permanente des profils de metADN sur les régions à empreinte et régions similaires, ainsi que sur d'autres régions du génome. Nous ne comprenons toujours pas pourquoi certaines séquences génomiques sont incapables de rétablir leurs profils de metADN normaux après la ré-expression de Dnmt1, et comment d'autres marques épigénétiques (e.g. les modifications des histones) sont altérées. Notre hypothèse est qu’un réarrangement erroné des marques d’histones aux régions promotrices, suivant une perte temporaire du maintien de la méthylation d’ADN par DNMT1, empêchera l’expression normale dans les cellules souches embryonnaires de souris. Pour ce faire, nous avons collecté des cellules mES Dnmt1tet/tet avant l'inactivation de Dnmt1, après l'inactivation de Dnmt1, puis après la réactivation complète de l'expression de Dnmt1. Nous avons ensuite utilisé la technique ChIP-Seq pour les marques d'histones (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K9me3, H3K4me1), celle de RRBS pour la méthylation de l'ADN et la technique de RNA-Seq pour l'expression des gènes. En définissant une liste de 18 166 promoteurs uniques, nous les avons classés en quatre catégories (Actif, Bivalent, Déplété et Réprimé). Nous montrons que l'inactivation de Dnmt1 mène à une dérégulation drastique des marques d'histones à travers les types de promoteurs. Cependant, lors de la réactivation de Dnmt1, la plupart de ces défauts ont été corrigés. Pourtant, dans l’ensemble des catégories, nous observons des promoteurs avec des dysrégulations persistantes des marques d'histones ainsi qu'un nombre significatif de gènes avec une expression différentielle. Dans l'ensemble, nos résultats montrent qu'une absence temporaire de DNMT1 a un impact plus important sur la conservation des profils des marques d'histones et l'expression des gènes que sur le maintien des profils de metADN sur les régions promotrices, dans les cellules souches embryonnaires de souris. Cela suggère que l'absence temporaire de maintien de la méthylation d’ADN déclenche une série d'événements qui conduisent à des dérégulations permanentes de marques d'histones aux promoteurs, lesquelles ne sont pas directement associés aux altérations sous-jacentes de la méthylation d’ADN dans les régions promotrices., During early embryo development, a major epigenetic reprogramming wave erases and re-establishes DNA methylation (DNAmet) profiles across the genome. However, specific regions such as imprinting loci must escape this reprogramming wave and maintain their precise DNAmet profiles by constant DNMT1 (DNA methyltransferase 1) activity to ensure the proper development. Using a mouse embryonic stem (mES) cell model with inducible Dnmt1 repression (Dnmt1tet/tet), we previously showed that the temporary loss of Dnmt1 triggers the permanent loss of DNAmet profiles on imprinted and imprinted-like regions, as well as on other regions across the genome. We still do not understand why particular genomic sequences are unable to re-establish their normal DNAmet profiles following Dnmt1 re-expression, and how other epigenetic marks (e.g., histone modifications) are altered. Our hypothesis is that an erroneous rearrangement of histone marks on promoter regions following a temporary lack of DNAmet maintenance by DNMT1 will prevent proper gene expression in mouse embryonic stem cells. To test this, we collected mESDnmt1tet/tet cells prior to Dnmt1 inactivation, after Dnmt1 inactivation, and following complete reactivation of Dnmt1 expression. We then performed ChIP-Seq for histone marks (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K9me3, H3K4me1), RRBS for DNA methylation and RNA-Seq for gene expression. By defining a list of 18 166 unique promoters we categorized them in four categories (Active, Bivalent, Depleted and Repressed). We show that inactivation of Dnmt1 lead to drastic dysregulation of histone marks across types of promoters. However, upon reactivation of Dnmt1, most of these defects were rescued. Still, across categories, we observe promoters with persistent histone mark dysregulations as well as a significant number of associated genes with differential expression. Overall, our results show that a temporary lack of DNMT1 has a greater impact on the conservation of histone mark profiles and gene expression than it has on the maintenance of DNAmet profiles on promoter regions in mouse embryonic stem cells. This suggests that the temporary lack of methylation maintenance triggers a series of events that leads to the permanent dysregulation of histone marks in promoter regions, which are not directly associated with underlying DNA methylation alterations in the promoter regions.

Durant le développement embryonnaire, une seule cellule, le zygote, est à l’origine de la formation de tous les types de cellules de l’organisme. L’information génétique nécessaire au destin d’une cellule y est gardé dans la chromatine condensée, d’abord inaccessible, et se déploie progressivement au moment opportun de la différenciation cellulaire grâce à des facteurs pionniers. Les facteurs de transcription pionniers sont des acteurs clés des cascades génétiques et épigénétiques déterminant le destin cellulaire. Les facteurs pionniers ont la propriété unique de reconnaître leurs cibles dans la chromatine fermée. Leur action permet d’augmenter l’accessibilité à un répertoire d’enhancers spécifique à un destin cellulaire, ouvrant la voie aux autres facteurs de transcription. Les aspects entourant la reconnaissance initiale des facteurs pionniers à leurs cibles dans la chromatine fermée sont mal compris. Dans l’hypophyse, le facteur pionnier Pax7 est spécifique aux cellules du lobe intermédiaire et met en place le programme génétique mélanotrope. Pour se faire, Pax7 repère les régions régulatrices clé de l’identité mélanotrope dans la chromatine fermée, afin d’accroître l’accessibilité à l’ADN permettant la liaison d’autres facteurs non-pionniers. Pax7 possède deux domaines de liaison à l’ADN, le domaine paired (PD) et l’homéodomaine (HD), chacun liant un motif de séquence caractéristique. De plus, une séquence cible composite, formé de la juxtaposition des motifs reconnus par PD et HD, est enrichie aux sites pionniers de Pax7. Dans le but de définir les propriétés de liaison à l’ADN de Pax7, nous avons caractérisé les interactions de Pax7 avec ses différentes séquences cibles. Nous avons démontré par des expériences de liaison à l’ADN in vitro (retard sur gel) que l’interaction de Pax7 avec le motif composite est d’affinité supérieure et sous forme de monomère où le PD est principalement impliqué. Comme les sites cibles de Pax7 dans l’hétérochromatine sont marqués par la méthylation de l’ADN, nous avons montré que la méthylcytosine dans le motif de liaison n’interfère pas avec la liaison à l’ADN par Pax7. De plus, des mutations ponctuelles aux domaines de liaison à l’ADN de Pax7 ont montré que les deux domaines de liaison à l’ADN sont nécessaires pour le recrutement aux sites dans la chromatine fermée, a fortiori pour l’ouverture de la chromatine. Des études antérieures ayant identifié des transcrits alternatifs de Pax7, nous avons étudié l’impact fonctionnel des variants Pax7. Les quatre isoformes Pax7 comportent des résidus d’acides aminés alternatifs au niveau du PD : elles ont des propriétés de liaison à l’ADN in vitro ainsi qu’un potentiel de transactivation très similaires. Bien que les isoformes de Pax7 aient des activités pionnières variables, leur action différentielle n’est pas dû à leurs propriétés intrinsèques de liaison à l’ADN ou de transactivation. Nos travaux ont identifié les particularités de Pax7 par rapport à d’autres facteurs pionniers dans les mécanismes de reconnaissance des sites dans l’hétérochromatine. Ainsi, les enhancers sujet à l’action pionnière de Pax7 contiennent typiquement plus de motifs cibles que les cibles d’action transcriptionnelle et l’action pionnière de Pax7 un recrutement fort aux sites pionniers ; de plus, les deux domaines de liaison à l’ADN intacts sont essentiels pour ce recrutement et l’action pionnière. Nos travaux ont défini les paramètres requis pour le reprogrammage cellulaire par un pionnier, Pax7, tout particulièrement en regard des sites de recrutement dans la chromatine fermée. La reprogrammation de cellules souches pour la production de cellules différenciées présente un potentiel thérapeutique unique en médecine régénérative et nos travaux supportent le rôle critique des pionniers dans ce contexte., During embryonic development, a single cell, the zygote, is responsible for the formation of all cell types in the body. The genetic information necessary for cell fates is stored there in condensed chromatin, initially inaccessible, and is gradually deployed at the opportune moment of cell differentiation by the pioneer factors. Pioneer transcription factors are key determinants in the genetic and epigenetic cascades leading to cell fate. Pioneer factors have the unique property of recognizing their DNA targets in closed chromatin. Their action provides accessibility to a repertoire of enhancers specific to a cell fate, opening the way for other transcription factors. We poorly understand initial recognition of pioneer factors at their targets in closed chromatin. In the pituitary gland, the pioneer factor Pax7 is specific to the intermediate lobe and implements the melanotrope genetic program. To do so, Pax7 identifies key regulatory regions of melanotrope identity in closed chromatin to provide DNA accessibility allowing the binding of other non-pioneer factors. Pax7 has two DNA binding domains (DBD), the paired domain (PD) and the homeodomain (HD), each binding a characteristic sequence motif. In addition, a composite target sequence, formed from the juxtaposition of PD and HD motifs, is enriched at the pioneer sites of Pax7. In order to define the DNA binding properties of the pioneer factor Pax7, we characterized the interactions of Pax7 with its different target sequences. We have demonstrated by in vitro DNA binding experiments (gel shift) that the interaction of Pax7 with the composite motif is of higher affinity and as a monomeric form in which the PD is primarily involved. As Pax7 target sites in heterochromatin are marked by DNA methylation, we showed that methylcytosine within the binding motif does not interfere with Pax7 DNA binding. Using point mutations in the Pax7 DBDs, we showed that both DBDs are required for the recruitment to sites in closed chromatin, furthermore for chromatin opening. Since previous studies identified alternative Pax7 transcripts, we investigated the functional impact of Pax7 variants. The four Pax7 isoforms contain alternative amino acid residues in the PD: they have similar in vitro DNA binding properties and transactivation potential. Although Pax7 isoforms have varying pioneering activities, their differential action is not due to their intrinsic DNA-binding or transactivation properties. Our work has identified the particularities of Pax7 compared to other pioneering factors in the mechanisms of site recognition in heterochromatin. Thus, the enhancers subject to the pioneer action of Pax7 typically contain more target motifs than the targets of transcriptional action and the pioneer action of Pax7 a strong recruitment to the pioneer sites; moreover, the two intact DNA-binding domains are essential for this recruitment and pioneering action. Our work has defined the parameters required for cellular reprogramming by a pioneer, Pax7, particularly with regard to recruitment to sites in closed chromatin. The reprogramming of stem cells for the production of differentiated cells has unique therapeutic potential in regenerative medicine and our work supports the critical role of pioneers in this context.

Le syndrome de Tatton-Brown-Rahman (TBRS) est une maladie génétique rare caractérisée par une taille plus grande que la normale, une déficience intellectuelle et des traits faciaux dysmorphiques. Ce trouble est associé à une mutation fonctionnelle de DNMT3A, une enzyme responsable de l’établissement de modifications de la méthylation de l’ADN impliquée dans la régulation des gènes et indispensable au développement. Actuellement, nous ne savons pas comment les mutations fonctionnelles de la protéine DNMT3A peuvent être à l'origine d’altération lors du développement neurologique et d'autres problèmes observés chez les patients atteints de TBRS. Ainsi, il existe un besoin urgent de développer des modèles chez l’humain pour comprendre les causes moléculaires et cellulaires du TBRS et pour trouver des traitements potentiels et spécifiques pour les patients. Par conséquent, nous proposons d'utiliser des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), une technologie qui permet de convertir les cellules d'un patient en cellules souches, que nous avons reprogrammées en progéniteurs neuronaux (NPC). Grâce à cette approche, nous avons pu effectuer une série d’analyses bio-informatiques, nous permettant de déterminer comment les cellules neuronales sont affectées. Le séquençage des profils de méthylation et de transcription des cellules iPSC et NPC nous a permis de démontrer que les mutations étudiées dans le domaine Mtase du gène DNMT3A induisent des changements de méthylation et d’expression significatifs dans les cellules mutées, et ce pour les deux types cellulaires (iPSC et NPC). L’annotation des régions et des transcrits différentiellement méthylés et exprimés a permis d’associer ces derniers à des gènes et des enrichissements biologiques liés au développement ainsi qu’au neurodéveloppement démontrant ainsi une perturbation de ces processus. Dans l'ensemble, ce projet permettra de découvrir l’impact des mutations dans le gène DNMT3A et fournira un modèle fonctionnel permettant de tester de nouvelles avenues thérapeutiques pour traiter le TBRS., Tatton-Brown-Rahman syndrome (TBRS) is a rare genetic disorder characterized by larger than normal height, intellectual disability, and dysmorphic facial features. This disorder is associated with a functional mutation in DNMT3A, an enzyme responsible for establishing DNA methylation changes involved in gene regulation and essential for development. Currently, we do not know how functional mutations in the DNMT3A protein may cause neurodevelopmental impairment and other problems seen in patients with TBRS. Thus, there is an urgent need to develop models in humans to understand the molecular and cellular causes of TBRS and to find potential and specific treatments for patients. Therefore, we propose to use induced pluripotent stem cells (iPSC), a technology that converts a patient's cells into stem cells, which we reprogrammed into neuronal progenitors (NPCs). Using this approach, we were able to perform a series of bioinformatics analyzes allowing us to determine how neuronal cells are affected. The sequencing of the methylation and transcription profiles of iPSC and NPC cells allowed us to demonstrate that the mutations studied in the Mtase domain of the DNMT3A gene induce significant methylation and expression changes in the mutated cells, for both cell types (iPSC and NPC). Annotation of the differentially methylated and expressed regions and transcripts allowed them to be associated with genes and biological enrichments related to development as well as neurodevelopment, demonstrating a disruption of these processes. Overall, this project will uncover the impact of mutations in the DNMT3A gene and provide a functional model for testing new therapeutic avenues for treating TBRS.

La santé cardiovasculaire, la fonction immunitaire, l'hémostase et la réponse à d'autres maladies dépendent de l'abondance et des caractéristiques spécifiques des cellules sanguines. Au fil des années, un effort considérable a été fait pour trouver les variants génétiques, les gènes et les mécanismes de régulation impliqués dans la création de ces cellules. L'inactivation d'un allèle, appelée "perte de fonction" (LoF), est un type de variant codant que nous aimerions associer aux phénotypes sanguins. Comme ces mutations ne peuvent pas être artificiellement induites chez l'humain, pour des raisons éthiques évidentes, nous observons les occurences naturelles de ces pertes de fonction et espérons que la taille des cohortes sera suffisante pour trouver des associations statistiquement significatives. L'inactivation des deux allèles, appelée "knockout" (KO), peut avoir des conséquences plus fortes qu'une simple perte de fonction. Nous espérons également trouver des KO d'origine naturelle grâce à la taille des cohortes. La combinaison de deux variants LoF différents sur les deux allèles est appelée knockout hétérozygote composé. Nous nous intéressons également aux variants non codants qui affectent l'expression des gènes impliqués dans l'hématopoïèse. Certains de ces variants créent ou perturbent des sites de liaison des facteurs de transcription (TF), ces protéines qui se lient à des séquences d'ADN spécifiques et régulent l'expression des gènes. Les sites de liaison (TFBS) des facteurs de transcription se trouvent dans les promoteurs des gènes et dans les amplificateurs spécifiques au type cellulaire. Alors que certaines de ces mutations peuvent être bénignes ou même bénéfiques, la présence d'un LoF ou d'un KO peut être trop nuisible à la survie de l'individu. Les résultats de cette étude sont limités par le biais de survie. Comparée à une étude d'association pangénomique, cette étude se concentre sur un plus petit nombre de variants génétiques pour augmenter la puissance statistique et offrir une interprétation pour les résultats statistiquement significatifs. Le programme Trans-Omics for Precision Medicine (TOPMed) recueille et garantit la qualité des 45 000 séquences du génome entier que nous avons utilisées dans cette étude, ainsi que les bilans sanguins correspondants. Grâce à ces données, nous avons pu trouver plusieurs associations connues et nouvelles entre des variants rares et des phénotypes sanguins., Cardiovascular health, immune function, hemostasis and the response to other illnesses depend on the abundance and specific features of blood cells. Over the years, a considerable effort has been made to find which genetic variants, genes and regulatory mechanisms are involved in the creation of these cells. The inactivation of an allele, called a loss-of-function (LoF), is a type of coding variant we would like to associate with blood phenotypes. For obvious ethical reasons, these mutations cannot be artificially induced in human, so we fall back on natural occurrences and hope that large cohorts will provide enough samples to find statistically significant associations. The inactivation of both alleles, called a knockout (KO), may have stronger consequences than a simple loss-of-function. We also hope to find naturally occurring knockouts thanks to the size of a large cohort. The combination of two different LoF variants is called a compound heterozygote knockout. We are also interested in non-coding variants that affect the expression of genes that are involved in hematopoiesis. Some of these variants create or disrupt the binding sites of transcription factors (TF), the proteins that bind to specific DNA sequences and regulate gene expression. Transcription factors binding sites (TFBS) are found in gene promoters and cell type specific enhancers. While some of these mutations can be benign or even beneficial, the presence of a LoF or KO may be too detrimental for the individual to survive. The results of this study are limited by survival bias. Compared to a genome-wide association study, this study focuses on a smaller number of genetic variants to increase statistical power and give an interpretation to the statistically significant findings. The Trans-Omics for Precision Medicine (TOPMed) program collects and ensures the quality of the 45,000 whole-genome sequences we used in this study, as well as the corresponding complete blood counts. Thanks to this raw data, we were able to find several known and novel associations between rare variants and blood phenotypes.

The excessive use of antibiotics has exacerbated the phenomenon of antibiotic resistance throughout the world. Today, the fight against antibiotic resistance has become a global public health priority. Indeed, every year, it is responsible for more than 700,000 deaths in the world and by 2050, it will cause more than 10 million deaths per year, if concrete actions are not implemented to curb the development of this phenomenon. In addition to the human losses, the financial cost of antibiotic resistance-related care could reach 100,000 billion dollars worldwide. To face this crisis, several innovative strategies, including the use of antimicrobial peptides (AMPs), have been proposed. In this perspective, bacteriocins, which are ribosomally APMs, could contribute to the therapeutic solution. Recently, the Lacticaseibacillus paracasei CNCM I-5369 strain has been particularly distinguished for its activity against Gram-negative pathogens. This activity is due to 5 new bacteriocins encoded by chromosomal genes orf010, orf012, orf023, orf030 and orf038. However, the activity is pH-dependent, i.e., it is exerted, only at a pH value ≤ 5. In the framework of this thesis, we first verified the expression of these genes during the growth of the bacteria, using the qPCR technique. Thus, we observed that these 5 genes were expressed after 24 h of growth, concomitantly with the appearance of antimicrobial activity indicating a possible link between gene expression and the production of the five bacteriocins. These 5 bacteriocins were expressed in a heterologous system in Escherichia coli Rosetta. It should be noted that only the bacteriocin encoded by orf030, called lacticaseicin 30, could be produced in large quantities, in contrast to the other bacteriocins which were produced but remain trapped in the insoluble fraction. In a second step, we investigated the relationship between the structure of lacticaseicin 30 and its activity against Gram-negative bacteria. Structural predictions suggested a 5-helix organization of lacticaseicin 30. The proportion of helix-α was greater at pH 5 than at pH 7. To identify the regions involved in the activity against Gram-negative bacteria, we produced lacticaseicin 30-derived peptides by a molecular biology approach. These derived peptides are obtained by reducing their sizes, or by inserting targeted mutations in different regions. Thus, we generated shorter forms of lacticaseicin 30, containing either its N-terminal region (amino acids 1 to 39), or the central and C-terminal regions (amino acids 40 to 111). Similarly, a derivative peptide containing only the first helix of the N-terminal region was also produced. Mutations introducing amino acid substitutions were introduced within the α-helices. With regard to their activities, these derived peptides localized antibacterial activity mainly in the N-terminal region, and requires at least two helix-αs. Furthermore, the activity of these peptide variants E32G, T33P, T52P, and D57G remained essentially the same, unlike to those of the variants E6G, T7P, D57G T52P, A74P, Y78S, Y93S, and A97P, which were significantly impaired. In the last part, we tested the activity of lacticaseicin 30 against a panel of Gram-negative clinical strains with colistin resistance. The results obtained highlighted a synergy between lacticase 30 and colistin and a significant reduction of the expression of the mcr-1 and mcr-9 genes, responsible for colistin resistance., L’usage abusif et excessif des antibiotiques a exacerbé le phénomène d’antibiorésistance, à travers la planète. Aujourd’hui, la lutte contre l’antibiorésistance est devenue une priorité mondiale en matière de santé publique. En effet, chaque année, elle est responsable de plus de 700,000 décès dans le monde et d'ici 2050, elle causera plus de 10 millions de décès par an, si des actions concrètes ne sont pas mises en place afin de freiner le développement de ce phénomène. En plus des pertes humaines, le coût financier des soins afférents à l’antibiorésistance pourra atteindre 100,000 milliards de dollars dans le monde. Pour faire face à cette crise annoncée, plusieurs stratégies innovantes, parmi lesquelles l’usage des peptides antimicrobiens (PAMs), ont été proposées. Dans cette perspective, les bactériocines, qui sont des PAMs synthétisés par voie ribosomique pourraient contribuer à la solution thérapeutique. Récemment, la souche Lacticaseibacillus paracasei CNCM I-5369 s’est particulièrement distinguée pour son activité contre des germes pathogènes à Gram-négatif. Cette activité est due à 5 nouvelles bactériocines codées par des gènes chromosomiques orf010, orf012, orf023, orf030 et orf038. Toutefois, l’activité est pH-dépendante, c’est-à-dire qu’elle est exercée, uniquement à une valeur de pH ≤ 5. Dans le cadre de cette thèse, nous avons dans un premier temps, vérifiée l’expression de ces gènes lors de la croissance de la bactérie, en utilisant la technique de qPCR. Ainsi, nous avons observé que ces 5 gènes sont exprimés après 24 h de croissance, de façon concomitante à l’apparition de l’activité antimicrobienne indiquant ainsi un lien entre l’expression génique et la production des cinq bactériocines. Ces 5 bactériocines ont été exprimées en système hétérologue chez Escherichia coli Rosetta. Seule la bactériocine codée par orf030, appelée lacticaséicine 30, a pu être produite en grande quantité, contrairement aux autres bactériocines qui ont été produites mais demeurent piégées dans la fraction insoluble. Dans un deuxième temps, nous avons étudié la relation entre la structure de la lacticaséicine 30 et son activité contre les bactéries à Gram-négatif. Les prédictions de structure ont suggéré une organisation en 5 hélices  de la lacticaséicine 30. La proportion d’hélice-α était plus importante à pH 5 qu’à pH 7. Pour identifier les régions impliquées dans l’activité contre les bactéries à Gram-négatif, nous avons produit des peptides dérivés de la lacticaséicine 30 par une approche de biologie moléculaire. Ces peptides dérivés sont obtenus en réduisant leurs tailles, ou en insérant des mutations ciblées dans différentes régions. Ainsi, nous avons généré des formes plus courtes de la lacticaséicine 30, contenant soit sa région N-terminale (acides aminés 1 à 39), soit les régions centrale et C-terminale (acides aminés 40 à 111). De la même manière, un peptide dérivé contenant uniquement la première hélice de la région N-terminale a été également produite. Les mutations introduisant des substitutions des acides aminés ont été introduites au sein des hélices-α. Au regard de leurs activités, ces peptides dérivés ont permis de localiser l’activité antibactérienne essentiellement dans la région N-terminale, et nécessite à minima deux hélices-α. Par ailleurs, l’activité de ces variants peptidiques E32G, T33P, T52P et D57G reste sensiblement identique, contrairement à celles des variants E6G, T7P, D57G T52P, A74P, Y78S, Y93S et A97P qui ont été significativement altérées. Dans la dernière partie, nous avons testé l’activité de la lacticaséicine 30 contre un panel de souches cliniques à Gram-négatif et portant des résistances à la colistine. Les résultats obtenus ont mis en lumière une synergie entre la lacticaséicine 30 et la colistine et la réduction significative de l’expression des gènes mcr-1 et mcr-9, responsables de la résistance à la colistine.

The objectives of this thesis fall within the broad issue of processing data from next generation sequencers, and more particularly short reads from second-generation sequencers. The aspects addressed in this issue mainly focus on the development of new methodologies based on unique molecular sequences called UMI used to label the initial DNA fragments and to improve the precision of the results.First of all, in the field of transcriptomics, a new method has been developed in order to improve the results of measuring gene expression on the one hand, and to detect fusion transcripts in tumors on the other hand. This method is based on an RT-MLPA coupled to an NGS sequencer. It makes it possible to amplify the RNA fragments from a tumor sample and to obtain the sequences of the analyzed fragments. The underlying analysis aims to analyze these sequences one by one in order, first, to assign each sequence to the corresponding sample, and secondly, to find the name of the gene it expresses. For this, RT-MiS has been developed. RT-MiS is a tool that is able to perform the entire analysis starting with the extraction and correction of the UMI from the sequences until the production of the results in the form of an gene expression matrix for each sample. RT-MiSalso includes a dedicated analysis interface allowing for the tool to be launched easily by the users. This interface automates the entire analysis process as much as possible and produces the results in the form of interactive figures and graphs making biological interpretation much easier.Then, in the field of genomics, a new somatic variant detection tool was developed. The UMI-VarCal tool is a UMI-based variant caller that implements a UMI analysis to efficiently call the variants in tumor samples. The utility of using the information from the UMI is highlighted by the improved accuracy of variant detection, especially when the frequency falls below 1%. UMI-VarCal applies a Poisson test to filter out non-variant positions and then applies a UMI analysis and two complementary filters to remove false positives. UMI-VarCal has been designed in a highly optimized manner allowing it to perform its analysis while remaining more efficient than other tools in terms of variant detection and execution time.Finally, and still in the field of variant detection, a new read simulator was developed. This tool called UMI-Gen is the first read simulator capable of generating sequences with UMI. In addition, UMI-Gen is capable of inserting somatic variants (SNV) or structural variants (CNV) into the simulated files. Furthermore, by analyzing a set of normal files, it is able to estimate the background noise in these samples and reproduce it in the simulated data. These files can be used later to evaluate different variant callers, especially those implementing a UMI analysis in their algorithm., Les objectifs de cette thèse s’inscrivent dans la large problématique du traitement des données issues de séquenceurs à très haut débit, et plus particulièrement des reads courts, issus de séquenceurs de deuxième génération. Les aspects abordés dans cette problématique se concentrent principalement sur le développement de nouvelles méthodologies se basant sur des séquences moléculaires uniques appelées UMI utilisées pour étiqueter les fragments d’ADN initiaux et permettant d’améliorer la précision des résultats obtenus.Tout d’abord, dans le domaine de la transcriptomique, une nouvelle méthode a été développée afin d’améliorer les résultats de mesure de l’expression génique d’une part, et de détecter les transcrits de fusion dans les tumeurs d’autre part. Cette méthode se base sur une RT-MLPA couplée à un séquenceur NGS. Elle permet d’amplifier les fragments d’ARN présents dans un échantillon tumoral et d’obtenir les séquences des fragments récoltés. L’analyse sous-jacente vise à analyser ces séquences une par une pour, dans un premier temps, attribuer chaque séquence à l’échantillon séquencé, et dans un deuxième temps, retrouver le nom du gène qu’il exprime. Pour cela, RT-MiS a été développé. RT-MiS est un outil permettant d’effectuer la totalité de l’analyse commençant par l’extraction et la correction des UMI des séquences jusqu’à la production des résultats sous forme de matrice d’expression par gène pour chaque échantillon. RT-MiS comporte aussi une interface d’analyse dédiée permettant de lancer l’outil facilement par les chercheurs. Cette interface permet d’automatiser le plus possible le processus d’analyse complet et de produire les résultats sous formes de figures et graphiques interactifs rendant l’interprétation biologique plus facile.Ensuite, dans le domaine de la génomique, un nouvel outil de détection de variants somatiques a été développé. L’outil UMI-VarCal est un variant caller basé sur les UMI et donc implémentant une analyse de ces derniers pour appeler efficacement les variants dans les échantillons tumoraux. L’utilité des UMI est mise en évidence par l’amélioration de la précision de détection des variants, surtout quand la fréquence tombe au-dessous de 1%. UMI-VarCal applique un test de Poisson pour filtrer les positions ne présentant pas des variants et puis se sert d’une analyse des UMI et de deux filtres complémentaires pour filtrer les faux positifs. UMI-VarCal a été conçu de façon très optimisée afin d’effectuer son analyse tout en restant plus efficace que les autres outils en termes de détectionde variants et de temps d’exécution.Finalement, et toujours dans le domaine de la détection des variants, un nouveau simulateur de reads a été développé. Cet outil appelé UMI-Gen est le premier simulateur de reads capable de générer des séquences avec des UMI. De plus, UMI-Gen est capable d’insérer des variants somatiques (SNV) ou des variants structuraux (CNV) dans les fichiers simulés. En outre, en analysant un ensemble de fichiers normaux, il est capable d’estimer le bruit de fond dans ces échantillons pour le reproduire dans les reads simulés. Ces fichiers peuvent être utilisés par la suite pour évaluer les variant callers, surtout ceuximplémentant une analyse UMI dans leur algorithme.

In a context of contamination of natural waters by anthropogenic micro and nanoparticles (plastics, metals, oxides...), the study of their interactions with freshwater microalgae, the first link in the trophic chain, is essential. Techniques such as vibrational spectroscopies (Raman and infrared), which allow sensitive and rapid analysis without sample preparation, may be of interest. They have been tested here on the model microalga Chlamydomonas reinhardtii to quickly detect the effects of environmental stresses (light, drop of nutrients and presence of metals). Infrared spectroscopy proved to be a good tool, allowing rapid variation in biochemical composition to be monitored, helping to easily discriminate between the different stresses on the microalgae. This technique was then used to assess the impact of the presence of particulate pollutants (metallic and plastic nanoparticles in particular). The short- and medium-term impact of nanoparticles on freshwater microalgae was characterized in parallel with another known stress (nitrogen nutrient deficiency) in order to compare the different responses. The main results of exposure to nanoparticles show overall the immediate non-toxicity of nanoparticles at the tested concentrations. However, a loss of membrane integrity in contact with polystyrene nanoparticles suggests a stronger interaction of the microalgae studied with nanoplastics than with gold nanoparticles of similar size. Infrared spectra of C. reinhardtii showed a modification of protein and carbohydrate bands following environmental changes. In order to understand the variations observed at the level of carbohydrates, components of the microalgae structure and representing an important and complex part of the infrared spectrum, an in-depth study of this area was carried out by deconvolution of the infrared spectra. In order to better understand the response mechanisms involved, a study of the expression of genes (RT-QPCR) related to stress and carbohydrates production was carried out in parallel with infrared spectroscopy. The results thus obtained showed that polystyrene nanoparticle and C. reinhardtii interactions resulted in a genetic and macromolecular response at the carbohydrate level. Thus, the nanoparticle type effect was confirmed by the expression of the gene linked to the biosynthesis of galactose. Understanding the role of the cell-wall in the interaction with nanoparticles, particularly in case of polymers, was also studied by comparing two strains of C. reinhardtii (with and without cell-wall). Finally, microalgae response as a function of the interaction time with nanoparticles was investigated in order to try to understand whether, in the medium term, the responses presented a temporal variation. In addition, in order to better understand the effect of plastic particles at a higher trophic level, complementary work on the impact of microplastics on daphnia was carried out., Dans un contexte de contamination des eaux naturelles par des micro et nanoparticules anthropogéniques (plastiques, métaux, oxydes…), l'étude de leurs interactions avec les microalgues d’eau douce, premier maillon de la chaîne trophique, est primordiale. Pour cela, des techniques comme les spectroscopies vibrationnelles (Raman et infrarouge) permettant des analyses sensibles, rapides et sans préparation d’échantillon, peuvent avoir un intérêt. Elles ont ici été testées sur une microalgue modèle Chlamydomonas reinhardtii pour détecter rapidement les effets de stress environnementaux (diminution absence de lumière et nutriment et présence de métaux). La spectroscopie infrarouge s’est révélée être un bon outil, permettant l’obtention rapide de la variation de composition macromoléculaire, aidant à discriminer facilement les différents types de stress subis par la microalgue. Cette technique a ensuite été utilisée pour évaluer les impacts de la présence de polluants particulaires (nanoparticules métalliques et nanoplastiques en particulier). L’impact des nanoparticules à court et moyen termes sur des microalgues d’eau douce a été caractérisé en parallèle avec un autre stress connu (carence en nutriment azoté) afin de comparer les effets des différents types de "stress". Les principaux résultats de l'exposition aux nanoparticules montrent globalement la non-toxicité immédiate des nanoparticules aux concentrations testées. Cependant, une perte d’intégrité membranaire au contact des nanoparticules de polystyrène suggère une plus forte interaction des microalgues étudiées avec les nanoplastiques qu'avec les nanoparticules d’or de tailles proches. Les spectres infrarouges de C. reinhardtii ont montré une modification des bandes des protéines et des polysaccharides suite aux changements d’environnement. Afin de comprendre les variations observées au niveau des polysaccharides, composants de la structure de la microalgue et représentant une part importante et complexe du spectre infrarouge, une étude approfondie de cette zone a été réalisée par déconvolution des spectres infrarouges. Dans le but de mieux comprendre les mécanismes de réponse impliqués, une étude de l’expression des gènes (RT-QPCR) liés au stress et à la production de polysaccharides a été réalisée en parallèle de la spectroscopie infrarouge. Les résultats ainsi obtenus ont montré que les interactions entre nanoparticules de polystyrène et C. reinhardtii entrainaient une réponse génétique et macromoléculaire au niveau des sucres. Ainsi l’effet « type de nanoparticules » a pu être confirmé notamment par l’expression du gène lié à la biosynthèse du galactose. Dans cette dynamique, la compréhension du rôle de la paroi dans l’interaction avec les nanoparticules, dans le cas des polymères notamment, a été étudiée par la comparaison de deux souches de C. reinhardtii (avec et sans paroi). Enfin, la réponse des microalgues en fonction du temps d’interaction avec les nanoparticules a été étudiée afin de tenter de comprendre si à moyen terme, les effets observés sur les microalgues présentaient une variation temporelle. Par ailleurs, afin de mieux comprendre l’effet des particules de plastiques à un niveau trophique supérieur, des travaux complémentaires sur l’impact de microplastiques sur des daphnies ont été menés.

Les protéines sont responsables de pratiquement toutes les fonctions performées au sein du corps cellulaire et de ses alentours. Le contrôle de l’expression génique détermine l’abondance, la localisation et le moment de la production de protéines dans la cellule. Il s’agit de l’un des processus centraux à la régulation de la physiologie et du fonctionnement cellulaire. La moindre perte de balance dans ce complexe système engendre des conséquences majeures sur l’intégrité cellulaire, menant au développement de plusieurs maladies parfois incurables. La traduction de l’ARN messager en produit protéique constitue la dernière étape de l’expression génique. Elle est régulée de plusieurs façons, intrinsèques et extrinsèques à la séquence. Il s’agit également du processus cellulaire le plus coûteux en termes d’énergie. Le profilage des ribosomes (Ribo-Seq) figure parmi les récentes et prometteuses technologies ayant permis une meilleure étude des mécanismes de régulation de la traduction. Ces résultats contiennent toutefois la présence de variabilité et de bruits de nature infondée. Ce travail présente la mise en place d’une stratégie permettant la dissociation de signaux d’origine biologique de ceux ayant une origine technique. Ceci est effectué au travers de la mise en place de profiles consensus de densité ribosomale extrait d’une analyse comparative de plusieurs expériences de Ribo-Seq chez la levure (Saccharomyces cerevisiae). Les signaux biologiques dérivés par les profils consensus correspondent avec les signatures de pauses ribosomales connues, telles que les scores de repliements de l’ARNm et la charge des acides aminés. Épatamment, notre stratégie a également permis l’identification de séquences différentiellement transcrites (DT). Ces dernières jouent un rôle sur la cinétique de la phase d’élongation de la traduction, elles comportent notamment une surreprésentation de codons associés aux modifications des ARNs de transfert (tRNAs). Elles se retrouvent d’ailleurs impliquées dans le maintien de l’homéostase cellulaire, ayant une présence marquée chez des gènes prenants part aux mécanismes de biosynthèse de la macromolécule ribosomale ainsi que chez les ARNms aux sublocalisations cellulaires précises, notamment chez les mitochondries et le réticulum endoplasmique (ER). En plus de démontrer les possibilités de découvertes offertes par la technique du Ribo-Seq, cette étude présente une évidence de la nature dynamique et hétérogène du processus de traduction chez la cellule eucaryote. Elle démontre également le rôle de l’information directement encodée dans la séquence dans l’optimisation générale de l’homéostasie cellulaire., Proteins are responsible for virtually all functions performed within and in the surroundings of a cell. The control of gene expression, which determines the amount, localisation and timing of protein production in the cell, is the central processes in the regulation of cellular physiology and function. Any disturbance in this complex system can generate important consequences on cellular integrity, sometimes leading to incurable diseases. The translation of messenger RNA into a protein product is the last step of the gene expression mechanism. It can be regulated in manifold ways, both intrinsically and extrinsically to the transcript sequence. It is also the costliest cellular process in terms of energy. Ribosome profiling (Ribo-Seq) is one of the recent and promising technologies making it possible to better study the mechanisms of translation regulation. Its results have however been shown to display variability in reproducibility and to contain noise of uncharted sources. This work presents the implementation of a strategy for dissociating signals of biological origin from those of technical origin. This is performed by the computation of a consensus profile of ribosomal density derived from a comparative analysis of several Ribo-Seq experiments in yeast (Saccharomyces cerevisiae). The biological signals derived by the consensus profiles correspond with signatures of known ribosomal pauses, such as mRNA folding strength and amino acid charges. Amazingly, our strategy also enabled the identification of differentially transcribed (DT) sequences. The latter have shown an over-representation of codons associated with modifications of transfer RNAs (tRNAs). They are also involved in the control of cellular homeostasis, exhibiting a marked presence in genes involved in ribosome biosynthesis as well as in mRNAs with precise translation sub-localization, particularly in mitochondria and the endoplasmic reticulum (ER). In addition to demonstrating the possibilities of discovery offered by the Ribo-Seq technique, this study also presents evidence of the dynamic and heterogeneous nature of the translation process in the eukaryotic cell. It also showcases its diverse regulatory mechanisms and the role of information directly encoded in the sequence in the general optimization of cellular homeostasis.

À la fois le sommeil et la privation de sommeil ont un impact sur la synthèse protéique au niveau du cerveau, mais la contribution des mécanismes traductionnels à la régulation de l’éveil et du sommeil n’a été que peu étudiée. Dans ce mémoire de maitrise, nous étudions le rôle de deux répresseurs de la traduction protéique, les protéines de liaison du facteur 4E d’initiation eucaryote 1 et 2, 4E-BP1 et 4E-BP2 dans l’architecture du sommeil et l’activité électroencéphalographique (EEG), ainsi que dans la réponse EEG et moléculaire à la privation de sommeil. Ces deux protéines inhibent la synthèse protéique en séquestrant une protéine nécessaire à l’initiation de la traduction, eIF4E. Activé par différentes voies de signalisation intra- et extracellulaires, mTORC1 phosphoryle les 4E-BP, ce qui relâche l’inhibition et permet l’initiation de la synthèse protéique. 4E-BP1 est très exprimé au niveau des noyaux suprachiasmatiques et est impliqué dans les rythmes circadiens. 4E-BP2, très exprimé au niveau du cerveau, est nécessaire pour la mémoire et la plasticité synaptique. Des électrodes EEG et électromyographiques (EMG) ont été implantées chez des souris mutantes pour les gènes encodant 4E-BP1 ou 4E-BP2 (Eif4ebp1-/- et Eif4ebp2-/-). Les souris ont été enregistrées pendant 48h et soumises à une privation de sommeil de 6h au début de la seconde journée d’enregistrement. L’effet de la privation sur l’expression de certains gènes a également été mesuré dans le cortex préfrontal des souris. Les souris Eif4ebp1-/- diffèrent des souris sauvages dans la quantité et la qualité du sommeil et de l’éveil. De légères différences au niveau de l’expression génique après privation ont également été trouvées. Les souris Eif4ebp2-/- présentaient, quant à elles, seulement des changements dans la qualité de l’activité EEG en éveil, révélé suite à la privation de sommeil. Les résultats de mon projet de maitrise suggèrent une implication de la machinerie de traduction protéique dans la régulation du sommeil et de l’éveil, et pointent vers des rôles différents des deux répresseurs de la traduction., Albeit it is known that sleep and sleep loss are impacting protein synthesis in the brain, several unknowns persist about the contribution of the mechanisms of translational control to wakefulness and sleep regulation. In this master project, we studied the role of two suppressors of protein synthesis, the eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1 and 2 (4E-BP1 and 4E-BP2) in sleep architecture and electroencephalographic (EEG) activity as well as in the EEG and molecular responses to acute sleep loss. These two proteins normally repress cap-dependent translation initiation by binding eIF4E. When activated by extracellular and intracellular signaling, mTORC1 phosphorylates 4E-BPs leading to their dissociation from eIF4E, thus allowing the translation initiation. 4E-BP1 is highly expressed in the suprachiasmatic nucleus and implicated in circadian rhythms. 4E-BP2, widely expressed in the brain, is critical for memory and plasticity. Yet, there is no data on their implication in sleep regulation. Mutant mice for the genes encoding 4EBP1 or 4E-BP2 (Eif4ebp1-/- and Eif4ebp2-/- mice) were implanted with EEG and electromyographic (EMG) electrodes and recorded under undisturbed conditions and following a 6-h sleep deprivation (SD). The effect of SD on the expression of genes known to respond to SD was also assessed in the prefrontal cortex of Eif4ebp1-/- and Eif4ebp2-/- mice. Mice lacking Eif4ebp1 differed from wildtype mice regarding the quantity and quality of their sleep and wakefulness, and more subtly in the gene expression response to SD. Moreover, Eif4ebp2-/- mice differed from wild-type mice only for wakefulness and sleep quality, changes in EEG spectral activity generally revealed during and after SD. The results of my master project point towards an implication of the translation machinery in the regulation of wakefulness and sleep and of synchronized cortical activity and suggest different roles of effectors of translational control.

Pulmonary hypertension is a severe multifactorial disease of the pulmonary circulation characterized by a progressive elevation in mean pulmonary arterial pressure (PAPm), leading to right ventricular failure and the death of the patient. Current therapies slow the progression of the disease but do not offer a cure. Nerve growth factor NGF is a growth factor playing a significant role in the pathophysiology of pulmonary hypertension, particularly in pulmonary arterial hyperreactivity, and the remodelling and inflammation of the pulmonary vasculature. Thus, targeting NGF may offer new therapeutic strategies in the treatment of this disease.

International audience; Insects represent 85% of the animals. They have adapted to many environments and play a major role in ecosystems. Many insect species exhibit phenotypic plasticity. We here report on the mechanisms involved in phenotypic plasticity of different insects (aphids, migratory locust, map butterfly, honeybee) and also on the nutritional size plasticity in Drosophila and the plasticity of the wing eye-spots of the butterfly Bicyclus anynana. We also describe in more detail our work concerning the thermal plasticity of pigmentation in Drosophila. We have shown that the expression of the tan, yellow and Ddc genes, encoding enzymes of the melanin synthesis pathway, is modulated by temperature and that it is a consequence, at least in part, of the temperature-sensitive expression of the bab locus genes that repress them.; Les insectes représentent 85 % des animaux. Ils se sont adaptés à de nombreux environnements et jouent un rôle majeur dans les écosystèmes. De nombreuses espèces d'insectes montrent de la plasticité phénotypique. Nous présentons ici les mécanismes impliqués dans la plasticité phénotypique chez différents insectes (les pucerons, le criquet migrateur, le papillon carte géographique, l'abeille ainsi que la plasticité nutritionnelle de la taille chez la drosophile et la plasticité des ocelles sur les ailes du papillon Bicyclus anynana). Nous décrivons également plus en détail nos travaux sur la plasticité thermique de la pigmentation chez la drosophile. Le froid induit une pigmentation abdominale plus foncée chez les femelles drosophiles. Nous avons montré que l'expression des gènes tan,yellow et Ddc, codant des enzymes de la voie de synthèse des mélanines, est modulée par la température et que c'est une conséquence, au moins en partie, de l'expression sensible à la température des gènes du locus bab qui les répriment.

Live organisms are not isolated in their environments. They are in contact with siblings, partners, predators and competitors in a shared environment where, to survive, they must be able to orient themselves but also organize and feed themselves. Thus, they must interact with each other and from these complex interactions emerge an evolutionary force. Understanding these interactions, which are at the heart of species adaptation, is a key question in evolutionary biology. This adaptation is a driving force of species evolution, depending on a communication system which allows individuals to obtain information about their surrounding environments. Back-and-forth message sharing represents the main component of the communication between a transmitter and a receiver, between a source and a receptor. Based on information from biotic and abiotic sources, individuals modify their behaviors. Therefore, a behavioral polymorphism emerges, which involves modifications of other organisms and of the surrounding abiotic factors as well. The individual emitting this behavior, will modify its physiology, its gene expression and sometimes its morphology. The double modification of the individual's internal and external factors defines the dynamic "environment - gene - behavior". Communication systems thus play a central role in ecological interactions (individual-environment interactions). Based on communication signals emitted in the environment, they act on gene expression and modify the behavioral responses of individuals.In the following discussion, I summarize my work on communication in insects through the study of communication signals, the formation of these signals, the adaptation of species to their environment using different perceived signals and the mechanisms of the behavioral polymorphism through specialized communication channels. The direct observable results from communication systems is behavior, therefore it represents the main focus of my studies. Through the prism of my own work, we will discover how a communication signal is produced, centralized and then how it circulates between individuals to eventually change their behaviors, their ability to adapt to environmental constraints and to finally end up changing their own future through the modification of their gene expression and their phenotype.; Les organismes vivants ne sont pas isolés dans leurs environnements. Ils côtoient des semblables, des partenaires, des prédateurs et des compétiteurs dans un milieu où ils doivent s'orienter, s'organiser, se substanter pour survivre. Ainsi les êtres vivants interagissent tous les uns avec les autres et de ces interactions complexes émergent une force évolutive. Comprendre ces relations qui sont au centre de l'adaptation des espèces à leur environnement est une question centrale en biologie évolutive. Force majeure de l'évolution, cette adaptation dépend d'un système de communication qui permet aux individus d'obtenir des informations sur ce qui les entourent. Une relation dynamique d'échange de messages forme la nature même de la nécessité de communication, entre un émetteur et un receveur, entre une source et un récepteur. C'est sur cette base d'informations provenant de sources biotiques et abiotiques, que les individus modifient leurs comportements. Ainsi, un polymorphisme comportemental émerge, influençant par la même les autres organismes et les autres facteurs abiotiques avoisinants. L'individu lui-même émetteur de ce comportement va modifier sa physiologie, l'expression de ses gènes, voire sa morphologie. La double modification des facteurs externes et internes de l'individu définit la dynamique "environnement – gène – comportement". Les systèmes de communication ont donc un rôle central dans les interactions écologiques (interactions individu–environnement), s'appuyant sur des signaux de communication émis dans l'environnement, ils agissent sur l'expression génique des individus et modifient leurs réponses comportementales.Dans l'exposé qui suit, je résume mes travaux sur la communication chez les insectes à travers l'étude des signaux de communication, la formation de ces signaux, l'adaptation des espèces à leurs environnements en utilisant les différents signaux perçus et le fonctionnement du polymorphisme comportemental via des canaux de communication spécialisés. Le comportement est la résultante observable des systèmes de communication, il représente donc l'objet principal quantifiable de mes travaux, tout en y étant intimement lié. Ainsi à travers le prisme de mes travaux, nous allons découvrir comment un signal de communication est produit, centralisé puis circule entre les individus pour finir par modifier leurs comportements, leurs capacités d’adaptation face aux contraintes environnementales jusqu’à changer leurs propres devenir en modifiant l’expression de leurs gènes et leurs phénotypes.

Live organisms are not isolated in their environments. They are in contact with siblings, partners, predators and competitors in a shared environment where, to survive, they must be able to orient themselves but also organize and feed themselves. Thus, they must interact with each other and from these complex interactions emerge an evolutionary force. Understanding these interactions, which are at the heart of species adaptation, is a key question in evolutionary biology. This adaptation is a driving force of species evolution, depending on a communication system which allows individuals to obtain information about their surrounding environments. Back-and-forth message sharing represents the main component of the communication between a transmitter and a receiver, between a source and a receptor. Based on information from biotic and abiotic sources, individuals modify their behaviors. Therefore, a behavioral polymorphism emerges, which involves modifications of other organisms and of the surrounding abiotic factors as well. The individual emitting this behavior, will modify its physiology, its gene expression and sometimes its morphology. The double modification of the individual's internal and external factors defines the dynamic "environment - gene - behavior". Communication systems thus play a central role in ecological interactions (individual-environment interactions). Based on communication signals emitted in the environment, they act on gene expression and modify the behavioral responses of individuals.In the following discussion, I summarize my work on communication in insects through the study of communication signals, the formation of these signals, the adaptation of species to their environment using different perceived signals and the mechanisms of the behavioral polymorphism through specialized communication channels. The direct observable results from communication systems is behavior, therefore it represents the main focus of my studies. Through the prism of my own work, we will discover how a communication signal is produced, centralized and then how it circulates between individuals to eventually change their behaviors, their ability to adapt to environmental constraints and to finally end up changing their own future through the modification of their gene expression and their phenotype., Les organismes vivants ne sont pas isolés dans leurs environnements. Ils côtoient des semblables, des partenaires, des prédateurs et des compétiteurs dans un milieu où ils doivent s'orienter, s'organiser, se substanter pour survivre. Ainsi les êtres vivants interagissent tous les uns avec les autres et de ces interactions complexes émergent une force évolutive. Comprendre ces relations qui sont au centre de l'adaptation des espèces à leur environnement est une question centrale en biologie évolutive. Force majeure de l'évolution, cette adaptation dépend d'un système de communication qui permet aux individus d'obtenir des informations sur ce qui les entourent. Une relation dynamique d'échange de messages forme la nature même de la nécessité de communication, entre un émetteur et un receveur, entre une source et un récepteur. C'est sur cette base d'informations provenant de sources biotiques et abiotiques, que les individus modifient leurs comportements. Ainsi, un polymorphisme comportemental émerge, influençant par la même les autres organismes et les autres facteurs abiotiques avoisinants. L'individu lui-même émetteur de ce comportement va modifier sa physiologie, l'expression de ses gènes, voire sa morphologie. La double modification des facteurs externes et internes de l'individu définit la dynamique "environnement – gène – comportement". Les systèmes de communication ont donc un rôle central dans les interactions écologiques (interactions individu–environnement), s'appuyant sur des signaux de communication émis dans l'environnement, ils agissent sur l'expression génique des individus et modifient leurs réponses comportementales.Dans l'exposé qui suit, je résume mes travaux sur la communication chez les insectes à travers l'étude des signaux de communication, la formation de ces signaux, l'adaptation des espèces à leurs environnements en utilisant les différents signaux perçus et le fonctionnement du polymorphisme comportemental via des canaux de communication spécialisés. Le comportement est la résultante observable des systèmes de communication, il représente donc l'objet principal quantifiable de mes travaux, tout en y étant intimement lié. Ainsi à travers le prisme de mes travaux, nous allons découvrir comment un signal de communication est produit, centralisé puis circule entre les individus pour finir par modifier leurs comportements, leurs capacités d’adaptation face aux contraintes environnementales jusqu’à changer leurs propres devenir en modifiant l’expression de leurs gènes et leurs phénotypes.

Various studies have shown that events that occurred very early in the life of an animal could have "programming" effects on the physiology of the adult. Recently, it has been shown that embryonic thermal manipulation (TM) has an impact on hepatic metabolism in Pekin ducks, 15 days post hatch.The first objective of this thesis was to measure the impact of an embryonic TM on the performances of mule ducks, used for the production of “foie gras”. For that, we tested three experimental modalities of temperature increase on mule ducks embryos. Our results showed that all the embryonic TM significantly increased liver weight (up to + 16.9%, P

Various studies have shown that events that occurred very early in the life of an animal could have "programming" effects on the physiology of the adult. Recently, it has been shown that embryonic thermal manipulation (TM) has an impact on hepatic metabolism in Pekin ducks, 15 days post hatch.The first objective of this thesis was to measure the impact of an embryonic TM on the performances of mule ducks, used for the production of “foie gras”. For that, we tested three experimental modalities of temperature increase on mule ducks embryos. Our results showed that all the embryonic TM significantly increased liver weight (up to + 16.9%, P