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Diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) and follicular lymphoma (FL) are the 2 most common aggressive and indolent lymphomas. The tumor microenvironment (TME), both immune and non-immune, plays a key supportive role in these diseases. Although their impact on the prognosis and pathogenesis of B cell lymphoma has been acknowledged for years, to date tumor-associated macrophages (TAM) have not been extensively explored at the single cell level in reactive and tumor lymphoid organ from DLBCL and FL. Herein, we explore mononuclear phagocytes (MNP) heterogeneity and their potential co-regulation with the stromal and endothelial compartment in B cell lymphoma lymph nodes compared to reactive secondary lymphoid organs, by mass cytometry, scRNASeq, and in silico approaches. We show a co-regulation between TAM and blood endothelial cells (BEC) in lymphoma. We identify a specific interaction between ANXA1-expressing BEC and FPR1/2-expressing monocytes/macrophages in DLBCL, which we confirm in situ by multiplex immunofluorescence (mIF) and imaging mass cytometry (IMC). This crosstalk is associated to an adverse prognosis and an immunosuppressive TME in DLBCL.; Le lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL), agressif, et le lymphome folliculaire (FL), indolent, sont les deux lymphomes les plus fréquents. Le microenvironnement tumoral (TME) immun et non immun joue un rôle de soutien essentiel dans ces maladies. Bien que leur implication dans le pronostic et la pathogénie des lymphomes B soit reconnu depuis plusieurs années, les macrophages associés aux tumeurs (TAM) n'ont pas encore été caractérisés à l’échelle de la cellule unique dans le DLBCL et le FL. Nous explorons ici l'hétérogénéité des phagocytes mononucléés (MNP) et leur corégulation potentielle avec le compartiment stromal et endothélial dans les ganglions lymphatiques des lymphomes B, en comparaison à des organes lymphoïdes secondaires réactionnels, par cytométrie de masse, scRNASeq et des approches in silico. Nous mettons en évidence une co-régulation entre les TAM et les cellules endothéliales sanguines (BEC) dans les lymphomes. Nous identifions une interaction spécifique entre les BEC exprimant ANXA1 et les monocytes/macrophages exprimant FPR1/2 dans le DLBCL, confirmée in situ par immunofluorescence multiplex et imagerie par cytométrie de masse. Ce dialogue est associé à un pronostic défavorable et à un TME immunosuppressif dans le DLBCL, et pourrait constituer une cible thérapeutique.

Dengue virus (DENV). belonging to flavivirus genus (Flaviviridae family) is the etiologic agent of dengue disease which the most prevalent arboviral infection in humans. There are four antigenically different serotypes (DENV-1 to DENV-4) which are all transmitted to humans following the bite of female Aedes mosquitoes. More than half of the world's population is affected by dengue, and more particularly those living in the tropical and subtropical areas of the Americas, Asia and Oceania where the effective mosquito vectors have spread. The four serotypes of DENV serotypes can cause a wide spectrum of clinical manifestations which range from flu-like disease to dengue severe (or dengue hemorrhagic fever). Dengue became a concern in South West Indian Ocean (SWIO) region with an epidemic of DENV-2 in 2018 in La Reunion Island. The viral strain involved in epidemic La Reunion 2018 DENV-2 belongs to the “Cosmopolitan” genotype and was probably imported from the Seychelles. Little information is available on the biological characteristics of circulating “Cosmopolitan” DENV-2 strains in SWIO. In response to the DENV-2 epidemic of 2018, UMR PIMIT developed a complete study on clinical isolate RUN-18 viral strain which was isolated in Reunion. As part of my thesis project, I was more particularly interested with the non-structural glycoprotein NS1 of RUN-18 which contributes to viral RNA replication but which is also found released from infected cells as a soluble hexamer lipoprotein complexes. The secreted soluble form of NS1 may play a central role in dengue pathogenesis by disrupting the functions of the vascular endothelium. I developed a research project focused on the biological properties of NS1 RUN-18 protein using a recombinant protein rNS1 expressed in human hepatocyte Huh 7 cells. Expression of rNS1 RUN-18 was compared to rNS1 from DENV-2 DES-14 strain (Cosmopolitan genotype) that was isolated in Tanzania during an dengue outbreak in 2014. The major finding of my study was the weak expression level of rNS1 RUN-18 in Huh 7 cells as compared to rNS1 DES-14. Four amino acid changes at positions NS1-128/131/272/324 differentiate NS1 RUN-18 and NS1 DES-14. By site-directed mutagenesis, I demonstrated that the lysine residues at positions 272 and 324 may play a key role in the low level of expression and secretion of rNS1 RUN-18. The introduction of R272K and R324K substitutions in rNS1 DES-14 caused a marked reduction in protein expression level leading to a significant release of LDH associated with a decrease in mitochondrial metabolism, signatures of increased cytotoxicity. Analysis of rNS1 expression in Huh 7 cells revealed the ability of the protein to interact with the lipids in hepatocyte cells. Indeed, the soluble form of rNS1 can associate with apolipoproteins B and A1 produced in Huh7 cells. Furthermore, the secreted form of rNS1 has the ability to interact with endothelial cells leading to a marked decrease in the permeability of endothelial cell monolayers as well as an activation of inflammatory pathways associated with oxidative stress. My thesis project allowed to provide original information on biological properties of the NS1 protein from epidemic La Réunion 2018 DENV-2 strain.; La dengue est une arbovirose majeure en santé publique dont l’agent étiologique est le virus de la dengue (DENV) qui appartient au genre flavivirus (famille Flaviviridae). DENV est composé de 4 sérotypes (DENV-1 à DENV-4) qui sont tous transmis à l’homme suite à la piqûre par les moustiques du genre Aedes. Plus de la moitié de la population mondiale est concernée aujourd’hui par la dengue et plus particulièrement celles vivant dans les régions tropicales et subtropicales des Amériques, de l’Asie et de l’Océanie qui sont infestées par les moustiques vecteurs de la maladie. L’infection par les quatre sérotypes de DENV est responsable d’un large spectre de manifestations cliniques et certains individus développent une fièvre dengue qui peut aboutir à une dengue sévère (ou dengue hémorragique) pouvant entrainer la mort. La région du Sud-Ouest de l’océan Indien (SOOI) est concernée par la dengue avec une épidémie de DENV-2 qui a démarré en 2018 à La Réunion. La souche virale responsable de l’épidémie appartient au génotype « Cosmopolitan » et a été probablement importée des Seychelles. Peu d’informations sont disponibles sur les caractéristiques biologiques des DENV-2 « Cosmopolitan » présents dans le SOOI. En réponse à l’épidémie de DENV-2 de 2018, l’UMR PIMIT a lancé une étude générale sur la souche virale RUN-18 qui a été isolée à La Réunion. Dans le cadre de mon projet de thèse, je me suis plus particulièrement intéressée à la protéine non-structurale NS1 de RUN-18 qui participe à la réplication virale, mais qui est aussi retrouvée excrétée des cellules infectées sous la forme d’un hexamère associé aux lipides. La forme soluble sécrétée de NS1 contribue au pouvoir pathogène de DENV en perturbant les fonctions de l’endothélium vasculaire. J’ai développé un projet de recherche sur la caractérisation de la protéine NS1 RUN-18 produite sous la forme d’une protéine recombinante rNS1 exprimée dans les cellules hépatocytaires humaines Huh7. Une analyse comparative a été menée entre la rNS1 RUN-18 et celle de la souche épidémique de DENV-2 « Cosmopolitan » isolée en Tanzanie en 2014 (rNS1 DES-14). rNS1 RUN-18 est faiblement exprimée et sécrétée des cellules Huh7 en comparaison de ce qui est observé avec rNS1 DES-14. Quatre changements d’acides aminés aux positions NS1-128/131/272/324 différencient NS1 RUN-18 et DES-14. Par mutagenèse dirigée, j’ai démontré que les résidus lysine aux positions 272 et 324 jouent un rôle déterminant dans le faible niveau d’expression et de sécrétion de rNS1 RUN-18. L’introduction des substitutions R272K et R324K dans rNS1 DES-14 réduit fortement le niveau d’expression de la protéine dans les cellules Huh7 avec en parallèle une importante libération de LDH associée à une diminution du métabolisme mitochondrial, signatures d’une cytotoxicité accrue. Je me suis ensuite intéressée à l’interaction des rNS1 RUN-18 et DES-14 avec les lipides des cellules hépatocytaires. J’ai montré que la forme soluble de rNS1 peut s’associer aux apolipoprotéines B et A1 produites par les cellules Huh7. Aussi, la forme sécrétée de rNS1 a la capacité d’interagir avec les cellules endothéliales amenant à une diminution marquée de la perméabilité des monocouches de cellules endothéliales ainsi qu’une activation des voies de l’inflammation associé à un stress oxydatif. L’ensemble de mes travaux de thèse a permis d’apporter des informations originales sur la protéine NS1 de la souche épidémique Réunion 2018 DENV-2 en termes de données biochimiques, biologiques et physiopathologiques qui permettront de mieux comprendre le pouvoir pathogène des DENV-2 génotype « Cosmopolitan » retrouvées dans le SOOI.

Diabetes constitutes an enhanced prevalent disease, associated with a dramatic mortality rate due to its vascular complications. Chronic hyperglycemia in diabetes leads to enhanced oxidative stress and glycation phenomena affecting circulating components. Despite erythrocytes represent determinant actors in vascular complications, very little is known about how glycation can affect their structures, capacities to be phagocytosed and impair endothelial cell functioning. The objective of my thesis was to evaluate the impact of glycation on erythrocytes characteristics and capacities to affect endothelial cell function following erythrophagocytosis. In vitro glycated erythrocytes were prepared in the absence or presence of increasing concentrations of glucose. To get insight into the in vivo relevance of our results, these data were compared to that of erythrocytes purified from diabetic or non-diabetic subjects. Oxidative damages and deformability capacities were measured on the different erythrocyte preparations by using dot blot techniques and ektacytometry, respectively. Protective effects of Antirhea borbonica (Ab) extracts against erythrocyte glycation damages were tested in vitro and in vivo by using zebrafish animals. Human umbilical vascular endothelial cells and EA.hy926 cell lines were incubated with glycated or nonglycated erythrocytes, previously labelled with fluorescent probes. Erythrophagocytosis together with reactive oxygen species (ROS) production, iron accumulation and cellular permeability were determined in endothelial cells. Artificial microvessels were created to test the effects of circulating glycated erythrocytes on endothelial cells in a dynamic incubation condition. Structure alteration, redox status and oxidative modifications were found to be enhanced in glycated erythrocytes after determination of their deformability, hemolysis sensibility, ROS production and eryptosis phenomenon. These modifications were associated with reduced antioxidant defence enzymatic activities in glycated erythrocytes. Most of these oxidative damages identified in in vitro glycated erythrocytes were retrieved on erythrocytes from diabetic patients. Ab extract was shown to significantly preserve erythrocytes from methylglyoxal (MGO)-induced damages in terms of restored membrane deformability, reduced oxidative stress and eryptosis phenomenon. Antioxidant capacities of Ab extract on erythrocytes were retrieved in vivo in zebrafish previously infused with MGO. Erythrophagocytosis by endothelial cells was found to be about 2 fold increased when incubated in the presence of glycated erythrocytes compared with non-glycated erythrocytes. In addition, higher iron accumulation, ROS production and enhanced endothelial cell permeability were evidenced in cells previously incubated in the presence of glycated erythrocytes. Experiments in flow conditions evidenced a significant impact of glycated erythrocytes at specific zones of our 3D artificial micro vessel, the bifurcation zone preferential to vascular complication occurrence. This work highlights the impact of glycation on erythrocyte structure and capacity to interact with endothelial cells and open doors to research perspectives. Enhanced phagocytosis of glycated erythrocytes may impact endothelial cell function with putative consequences on the development of diabetic vascular complications. Further experiments are highly needed to reach better mechanistic insights on glycated erythrocytes impact on endothelial cell functioning and contributing to the research of therapeutic strategies against vascular disorders in diabetes., Le diabète, maladie de plus en plus prévalente, est associée à des complications vasculaires fortement augmentées et souvent mortelles. L’hyperglycémie chronique de la maladie induit la glycation de composés circulants dont les dommages, de type oxydatif, peuvent participer à l’altération des vaisseaux sanguins. Bien que les érythrocytes représentent les constituants majeurs du sang, peu de choses sont connues quant à l’impact de la glycation sur leur capacité à participer aux désordresvasculaires. L’objectif de mon travail de thèse a été de préciser l’impact de la glycation sur les caractéristiques morphologiques des érythrocytes et sur leur capacité à être phagocyté et altérer la fonctionnalité de cellules endothéliales humaines en culture. Des érythrocytes humains ont été glyqués par incubation en présence de concentrations croissantes en glucose. Aussi, des érythrocytes glyqués « in vivo » ont été purifiés de patients diabétiques. Les dommages oxydatifs et les capacités de déformabilité de nos préparations ont été mesurés par des techniques de biochimie, de cytométrie et d’ektacytométrie. L’emploi du modèle poisson zèbre a permis d’appréhender l’effet in vivo d’extrait d’Antirhea borbonica (Ab) sur la glycation des érythrocytes. Des cellules endothéliales humaines de lignée (EA.hy926) et purifiées à partir de cordons ombilicaux (HUVEC) ont été utilisées. Des microvaisseaux artificiels ont été développés pour l’étude de l’impact en condition de flux, des érythrocytes glyqués. Les érythrocytes glyqués, in vitro ou purifiés de patients diabétiques, présentent une augmentation deleurs dommages oxydatifs, une réduction de leur capacité de déformabilité ainsi que de leurs défenses antioxydantes et une éryptose accrue. Ces dommages oxydatifs induits par la glycation des érythrocytes sont prévenus par des extraits d’Ab à la fois in vitro et in vivo dans le modèle animal poisson zèbre. Une phagocytose significativement augmentée a été observée dans les cellules endothéliales incubées avec des érythrocytes glyqués. Cette érythrophagocytose accrue s’accompagne d’une accumulation de fer, d’un stress oxydant accru et d’une augmentation de la perméabilité des cellules endothéliales incubées avec les érythrocytes glyqués. Nos expériences d’incubation des microvaisseaux avec les érythrocytes en condition dynamique a révélé leur impact significatif sur l’endothélium à des points spécifiques, les bifurcations, zones préférentielles de l’apparition de complications vasculaires. Les résultats de ma thèse apportent quelques éléments d’information nouveaux quant à l’implication des phénomènes de glycation sur les propriétés des érythrocytes et sur leur capacité à altérer la fonctionnalité de cellules endothéliales et offrent des pistes de perspectives de recherche mécanistique. Une meilleure compréhension de l’impact des phénomènes de glycation et de leurs conséquences tissulaires, ainsi que des moyens de les limiter, pourrait participer dans l’effort de recherche des stratégies thérapeutiques contre les désordres vasculaires de la personne diabétique.

Diabetes constitutes an enhanced prevalent disease, associated with a dramatic mortality rate due to its vascular complications. Chronic hyperglycemia in diabetes leads to enhanced oxidative stress and glycation phenomena affecting circulating components. Despite erythrocytes represent determinant actors in vascular complications, very little is known about how glycation can affect their structures, capacities to be phagocytosed and impair endothelial cell functioning. The objective of my thesis was to evaluate the impact of glycation on erythrocytes characteristics and capacities to affect endothelial cell function following erythrophagocytosis. In vitro glycated erythrocytes were prepared in the absence or presence of increasing concentrations of glucose. To get insight into the in vivo relevance of our results, these data were compared to that of erythrocytes purified from diabetic or non-diabetic subjects. Oxidative damages and deformability capacities were measured on the different erythrocyte preparations by using dot blot techniques and ektacytometry, respectively. Protective effects of Antirhea borbonica (Ab) extracts against erythrocyte glycation damages were tested in vitro and in vivo by using zebrafish animals. Human umbilical vascular endothelial cells and EA.hy926 cell lines were incubated with glycated or nonglycated erythrocytes, previously labelled with fluorescent probes. Erythrophagocytosis together with reactive oxygen species (ROS) production, iron accumulation and cellular permeability were determined in endothelial cells. Artificial microvessels were created to test the effects of circulating glycated erythrocytes on endothelial cells in a dynamic incubation condition. Structure alteration, redox status and oxidative modifications were found to be enhanced in glycated erythrocytes after determination of their deformability, hemolysis sensibility, ROS production and eryptosis phenomenon. These modifications were associated with reduced antioxidant defence enzymatic activities in glycated erythrocytes. Most of these oxidative damages identified in in vitro glycated erythrocytes were retrieved on erythrocytes from diabetic patients. Ab extract was shown to significantly preserve erythrocytes from methylglyoxal (MGO)-induced damages in terms of restored membrane deformability, reduced oxidative stress and eryptosis phenomenon. Antioxidant capacities of Ab extract on erythrocytes were retrieved in vivo in zebrafish previously infused with MGO. Erythrophagocytosis by endothelial cells was found to be about 2 fold increased when incubated in the presence of glycated erythrocytes compared with non-glycated erythrocytes. In addition, higher iron accumulation, ROS production and enhanced endothelial cell permeability were evidenced in cells previously incubated in the presence of glycated erythrocytes. Experiments in flow conditions evidenced a significant impact of glycated erythrocytes at specific zones of our 3D artificial micro vessel, the bifurcation zone preferential to vascular complication occurrence. This work highlights the impact of glycation on erythrocyte structure and capacity to interact with endothelial cells and open doors to research perspectives. Enhanced phagocytosis of glycated erythrocytes may impact endothelial cell function with putative consequences on the development of diabetic vascular complications. Further experiments are highly needed to reach better mechanistic insights on glycated erythrocytes impact on endothelial cell functioning and contributing to the research of therapeutic strategies against vascular disorders in diabetes., Le diabète, maladie de plus en plus prévalente, est associée à des complications vasculaires fortement augmentées et souvent mortelles. L’hyperglycémie chronique de la maladie induit la glycation de composés circulants dont les dommages, de type oxydatif, peuvent participer à l’altération des vaisseaux sanguins. Bien que les érythrocytes représentent les constituants majeurs du sang, peu de choses sont connues quant à l’impact de la glycation sur leur capacité à participer aux désordresvasculaires. L’objectif de mon travail de thèse a été de préciser l’impact de la glycation sur les caractéristiques morphologiques des érythrocytes et sur leur capacité à être phagocyté et altérer la fonctionnalité de cellules endothéliales humaines en culture. Des érythrocytes humains ont été glyqués par incubation en présence de concentrations croissantes en glucose. Aussi, des érythrocytes glyqués « in vivo » ont été purifiés de patients diabétiques. Les dommages oxydatifs et les capacités de déformabilité de nos préparations ont été mesurés par des techniques de biochimie, de cytométrie et d’ektacytométrie. L’emploi du modèle poisson zèbre a permis d’appréhender l’effet in vivo d’extrait d’Antirhea borbonica (Ab) sur la glycation des érythrocytes. Des cellules endothéliales humaines de lignée (EA.hy926) et purifiées à partir de cordons ombilicaux (HUVEC) ont été utilisées. Des microvaisseaux artificiels ont été développés pour l’étude de l’impact en condition de flux, des érythrocytes glyqués. Les érythrocytes glyqués, in vitro ou purifiés de patients diabétiques, présentent une augmentation deleurs dommages oxydatifs, une réduction de leur capacité de déformabilité ainsi que de leurs défenses antioxydantes et une éryptose accrue. Ces dommages oxydatifs induits par la glycation des érythrocytes sont prévenus par des extraits d’Ab à la fois in vitro et in vivo dans le modèle animal poisson zèbre. Une phagocytose significativement augmentée a été observée dans les cellules endothéliales incubées avec des érythrocytes glyqués. Cette érythrophagocytose accrue s’accompagne d’une accumulation de fer, d’un stress oxydant accru et d’une augmentation de la perméabilité des cellules endothéliales incubées avec les érythrocytes glyqués. Nos expériences d’incubation des microvaisseaux avec les érythrocytes en condition dynamique a révélé leur impact significatif sur l’endothélium à des points spécifiques, les bifurcations, zones préférentielles de l’apparition de complications vasculaires. Les résultats de ma thèse apportent quelques éléments d’information nouveaux quant à l’implication des phénomènes de glycation sur les propriétés des érythrocytes et sur leur capacité à altérer la fonctionnalité de cellules endothéliales et offrent des pistes de perspectives de recherche mécanistique. Une meilleure compréhension de l’impact des phénomènes de glycation et de leurs conséquences tissulaires, ainsi que des moyens de les limiter, pourrait participer dans l’effort de recherche des stratégies thérapeutiques contre les désordres vasculaires de la personne diabétique.

Endothelial cells (EC) are at the crossroads of many physiopathological phenomena. In the specific context of cancers, they are both involved in angiogenesis and in the endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT). EndMT is defined as a process of phenotypic transition from an endothelial phenotype to a myofibroblastic one and whose implication in tumor development has been increasingly studied over the last decade. This transition results in the production of cancer-associated fibroblasts (CAFs) which greatly contribute to tumor development and the acquisition of an invasive phenotype, in particular by promoting the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), another phenotype transition process. Moreover, the excessive production of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of tumor development. Enzymes of the NADPH oxidase (NOX) family are the greatest contributors to ROS generation in EC. The ROS they generate have already been described as playing a role in EndMT in other pathologies (such as pulmonary and renal fibrosis), but their involvement in tumor EndMT is not fully understood. The objective of this thesis aims to determine the involvement of oxidative stress generated by NOXs in tumor EndMT by developing an in vitro model with HUVECs EC treated with a conditioned medium harvested from cultured human melanoma cells (SK-MEL 28). Our results show that inhibition of NOX1 & NOX2 leads to CM-induced reversion of EndMT. These results confirm the fundamental role of NOXs in the initiation of tumor EndMT., Les cellules endothéliales (CE) sont au carrefour de nombreux phénomènes physiopathologiques. Dans le contexte particulier des cancers elles sont à la fois impliquées dans l’angiogenèse et dans la transition endothélio-mésenchymateuse (EndMT). L’EndMT se définit comme un processus de transition phénotypique depuis un type endothélial vers un type myofibroblastique et dont l’implication dans le développement tumoral a été de plus en plus étudiée cette dernière décennie. Cette transition engendre la production de fibroblastes associés au cancer (CAFs) qui contribuent grandement au développement tumoral et à l’acquisition d’un phénotype invasif notamment en promouvant la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), un autre processus de transition phénotypique. Également, La production excessive d’espèces réactive de l’oxygène (ROS) est un des marqueurs du développement tumoral. Les enzymes de la famille des NADPH oxydase (NOX) sont les plus grands contributeurs à la génération de ROS dans les CE. Les ROS qu’elles génèrent ont déjà été décrit comme jouant un rôle dans l’EndMT dans le cadre d’autres pathologie (comme les fibroses pulmonaire et rénale), mais leur implication dans l’EndMT tumorale est encore mal connue. L’objectif de cette thèse vise à déterminer l’implication du stress oxydant généré par les NOX dans l’EndMT tumoral en développant un modèle in vitro sur des CE HUVECs traitées avec un milieu conditionné (CM) par des cellules de mélanome humain (SK-MEL 28). Nos résultats montrent que l’inhibition de NOX1 & NOX2 conduit à une réversion de l’EndMT induite par le CM. Ces résultats confirment le rôle fondamental des NOXs dans l’initiation de l’EndMT tumorale.

Endothelial cells (EC) are at the crossroads of many physiopathological phenomena. In the specific context of cancers, they are both involved in angiogenesis and in the endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT). EndMT is defined as a process of phenotypic transition from an endothelial phenotype to a myofibroblastic one and whose implication in tumor development has been increasingly studied over the last decade. This transition results in the production of cancer-associated fibroblasts (CAFs) which greatly contribute to tumor development and the acquisition of an invasive phenotype, in particular by promoting the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), another phenotype transition process. Moreover, the excessive production of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of tumor development. Enzymes of the NADPH oxidase (NOX) family are the greatest contributors to ROS generation in EC. The ROS they generate have already been described as playing a role in EndMT in other pathologies (such as pulmonary and renal fibrosis), but their involvement in tumor EndMT is not fully understood. The objective of this thesis aims to determine the involvement of oxidative stress generated by NOXs in tumor EndMT by developing an in vitro model with HUVECs EC treated with a conditioned medium harvested from cultured human melanoma cells (SK-MEL 28). Our results show that inhibition of NOX1 & NOX2 leads to CM-induced reversion of EndMT. These results confirm the fundamental role of NOXs in the initiation of tumor EndMT., Les cellules endothéliales (CE) sont au carrefour de nombreux phénomènes physiopathologiques. Dans le contexte particulier des cancers elles sont à la fois impliquées dans l’angiogenèse et dans la transition endothélio-mésenchymateuse (EndMT). L’EndMT se définit comme un processus de transition phénotypique depuis un type endothélial vers un type myofibroblastique et dont l’implication dans le développement tumoral a été de plus en plus étudiée cette dernière décennie. Cette transition engendre la production de fibroblastes associés au cancer (CAFs) qui contribuent grandement au développement tumoral et à l’acquisition d’un phénotype invasif notamment en promouvant la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), un autre processus de transition phénotypique. Également, La production excessive d’espèces réactive de l’oxygène (ROS) est un des marqueurs du développement tumoral. Les enzymes de la famille des NADPH oxydase (NOX) sont les plus grands contributeurs à la génération de ROS dans les CE. Les ROS qu’elles génèrent ont déjà été décrit comme jouant un rôle dans l’EndMT dans le cadre d’autres pathologie (comme les fibroses pulmonaire et rénale), mais leur implication dans l’EndMT tumorale est encore mal connue. L’objectif de cette thèse vise à déterminer l’implication du stress oxydant généré par les NOX dans l’EndMT tumoral en développant un modèle in vitro sur des CE HUVECs traitées avec un milieu conditionné (CM) par des cellules de mélanome humain (SK-MEL 28). Nos résultats montrent que l’inhibition de NOX1 & NOX2 conduit à une réversion de l’EndMT induite par le CM. Ces résultats confirment le rôle fondamental des NOXs dans l’initiation de l’EndMT tumorale.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est la structure formant les capillaires du système nerveux central (SNC). La BHE est responsable de maintenir l’homéostasie du cerveau en régulant précisé- ment les échanges entre le sang et le tissu cérébral. Elle est composée de trois types cellulaires : les cellules endothéliales (ECs), les péricytes (PCs) et les astrocytes (ACs). Du fait de ses propriétés très sélectives, la BHE est une des causes majeures des échecs observés dans le développement des médicaments destinés au SNC. En effet, ces médicaments en développement sont souvent in- capables de franchir la BHE pour atteindre leurs cibles thérapeutiques. C’est pour cette raison que la mise au point et l’utilisation de modèles de BHE sont cruciaux pour étudier la capacité de nou- veaux agents thérapeutiques à traverser la BHE mais également les mécanismes sous-jacents à leurs passages. Utilisé très tôt dans le développement pharmaceutique, un modèle de BHE infor- matif permettrait de réduire les échecs dans des phases de R&D plus avancées. Nous reportons dans cette thèse le développement et la validation d’un modèle de BHE réalisé sur un Transwell®, composé d’ECs extraites chez la souris. Les travaux ont été réalisés avec la perspective de fournir le plus d’informations possibles quant à la réalisation, l’utilisation et l’interprétation du modèle de BHE dans l’étude de la perméabilité de petites molécules en conditions saines et pathologiques. Dans un premier temps, nous avons établi un protocole permettant l’isolation chez la souris des trois types cellulaires composant la BHE, soit les ECs chez la souris adulte, et les PCs et les ACs chez les nouveau-nés. Les méthodes décrites sont efficaces pour obtenir rapidement un grand nombre de cellules pures à moindre coût. De plus, les essais préliminaires démontrent que les cellules endo- théliales isolées sont pertinentes pour la création d’un modèle de la BHE. Dans un deuxième temps, nous avons entrepris de valider un modèle sain de BHE. Pour ce faire, nous avons comparé les résultats de la perméabilité in vivo de 7 molécules à trois modèles de BHE composés respectivement d’ECs primaires, d’ECs immortalisées ou de lipides extraits du cerveau porcin. Le modèle de BHE composé des ECs primaires corrèle le mieux avec les résultats obtenus in vivo chez la souris. Dans un troisième temps, nous avons exploré la possibilité d’utiliser ce modèle de BHE validé comme modèle dans l’étude de la perméabilité lors d’une inflammation aiguë. Les résultats obtenus nous permettent de décrire les possibles voies empruntées par les molécules dont la perméabilité est augmentée lors de l’inflammation. Néanmoins, cette étude met aussi en lumière l’absence de généralisation possible quant à l’impact de l’inflammation aiguë sur le passage des petites molé- cules à travers la BHE. À l’issue de cette thèse, un modèle de BHE composé d’ECs primaire a été développé et validé. Ce modèle permettra l’étude systématique des nombreux paramètres impliqués dans le passage des molécules à travers la BHE très tôt dans le développement du médicament., The blood-brain barrier (BBB) is the structure that forms the capillaries of the central nervous system (CNS). BBB major role is to maintain brain homoeostasis by precisely regulating exchange between blood and brain tissues. Three cellular types constitute the BBB, namely: endothelial cells (ECs), perycites (PCs) and astrocytes (ACs). Due to the BBB selectivity, this barrier is the major cause of failing in the drug development of molecules targeting the CNS. Indeed, drugs developed for CNS pathologies are often unable to cross the BBB to reach their therapeutic targets. The use of a relevant BBB model is therefore critical to study drug permeability when developing new drugs. Used earlier in drug development, this kind of BBB model could allow reducing failure rates in more advanced R&D phases. In this thesis, we report the development and validation of a BBB model made from ECs extracted from mouse and seeded in a Transwell®. This work aimed at providing as much information as possible regarding the production, use and interpretation of the BBB model in the study of small molecule permeability under healthy and pathological conditions. First, we established a protocol allowing the isolation of the three cell types from mice : endothelial cells from adult mice, and pericytes and astrocytes from newborns. The methods described herein are effective to quickly obtain a large number of pure cells at a low cost. Furthermore, preliminary tests show that isolated endothelial cells are relevant for the creation of a BBB model. Next, we focused on validating a healthy BBB model. We have compared the results of the in vivo permeability of 7 molecules with three models of BBB composed respectively of primary ECs, immortalized ECs or extracted porcine brain lipids. The BBB model composed of primary ECs best correlates with the results obtained in vivo in mice. Finally, we studied the possibility of using our BBB model as a model of permeability under acute inflammation. Our results allowed describing the possible routes used by the molecules whose permeability was increased during inflammation. The inflamed BBB model is relevant for studying the permeability of small molecules; however, this work also shows that one cannot generalize the impact of inflammation on the passage of small molecules through the BBB. Overall, we have developed and validated a BBB model composed of primary endothelial cells. This model allows studying drug permeability and provides a better understanding of the mechanisms involved in the permeability. This model could be used to study many parameters involved in the passage of molecules through the BBB at very early stages of drug development.

Endothelial cells (ECs) and hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells (hPSc) are a promising tool for tissue engineering, cell therapy and drug discovery. ECs are involved in blood vessel formation, while mature hematopoietic cells participate in oxygen transport, hemostasis and immune response. In this study, we have differentiated hPSCs into a bipotent hemangioblast-like population to generate pure populations of these two lineages in vitro. This CD144+CD309+CD34+CD143+CD31+ population gives rise to an intermediate population in vitro, the blast colonies (BCs), which expresses the CD43 marker at 90%. BCs differentiate into myeloid and erythroid hematopoietic colonies and express transcription factors involved in definitive hematopoiesis (RUNX1c, GATA2, SCL, HOXB4). On the other hand, endothelial differentiation of the hemangioblast-like progenitors generates a population of more than 95% of functional CD309+CD34+CD144+CD31+ ECs in vitro, expressing arterial and venous specific markers of ECs. In vivo, we showed that the hemangioblast-like population generates a low but detectable hematopoietic reconstitution in immunodeficient mice. ECs transplanted in a mouse model of ischemia on a dorsal chamber were localized in the endothelium of the mouse blood vessels, suggesting an angiogenic potential of these cells. Finally, and as a proof of concept, ECs and hépatoblasts derived from hPSCs were cocultured to generate vascularized hepatic organoids in vitro.; Les cellules endothéliales (CE) et les cellules hématopoïétiques dérivées des cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) sont un outil prometteur pour l'ingénierie tissulaire, la thérapie cellulaire et pour la découverte de nouveaux médicaments. Les CE assurent la formation des vaisseaux sanguins, tandis que les cellules hématopoïétiques matures sont impliquées dans le transport de l'oxygène, l'hémostase et la réponse immunitaire entre autres. Dans cette étude, nous avons différencié des CSPh en une population bipotente de type hémangioblastique pour générer des populations pures de ces deux lignages in vitro. Cette population CD144+CD309+CD34+CD143+CD31+ donne une population intermédiaire in vitro, les colonies blastiques (CB), qui exprime le marqueur CD43 à 90%. Les CB se différencient en colonies hématopoïétiques myéloïdes et érythroïdes et expriment des facteurs de transcription impliqués dans l'hématopoïèse définitive (RUNX1c, GATA2, SCL, HOXB4). D’autre part, la différenciation endothéliale du progéniteur hémangioblastique génère une population à plus de 95% de CE CD309+CD34+CD144+CD31+ fonctionnelles in vitro, exprimant des marqueurs spécifiques des CE artérielles et veineuses. In vivo, nous avons démontré que la population hémangioblastique génère une reconstitution hématopoïétique faible mais détectable chez des souris immunodéficientes. Les CE transplantées dans un modèle murin d’ischémie dans une chambre dorsale se sont incorporées à l’endothélium des vaisseaux de la souris, démontrant leur potentiel angiogénique. Enfin, et comme preuve du concept, nous avons utilisé des CE et des hépatoblastes dérivées de la lignée de CSPh dans le but de créer des organoïdes hépatiques vascularisés in vitro.

Neurodegenerative diseases suchs as Alzheimer’s or Multiple Sclerosis are characterized by a progressive degeneration of the central or peripheral nervous system. The blood-brain barrier (BBB) plays a critical role in the pathophysiologie of the central nervous system, and its disruption contributes to the pathogenesis of neurodegenerative disease. Since Hedgehog (Hh) signalling is implicated in the maintenance of the BBB, and since discrepancies exist in the literature, the objective of this PhD’s thesis is to clarify the mechanisms underlying Hh ligands-dependent regulation of the BBB, in physiological and pathological (multiple sclerosis and Alzheimer’s) conditions, in the adult.We showed that Desert Hedgehog (Dhh) is expressed in endothelial cells (ECs), and is necessary to stabilize the BBB. Moreove, we showed that the deletion of Dhh in ECs, and the consequential opening of the BBB are sufficient to trigger the apparition of cognitive disorders. Our results also suggest that Dhh in ECs is downregulated in Alzheimer’s and multiple sclerosis.We also showed that in multiple sclerosis, Sonic Hedgehog (Shh) is induced in astrocytes and contributes to the opening of the BBB. Those results and other finally led us to demonstrate that depending on their post-translational maturation, Hh ligands have distinct effects on the BBB.Taken together, those results strengthen the hypothesis of using Hh signalling as a therapeutic target in the treatment of neurodegenerative diseases, and unveil new insights to consider when it comes to conceiving such therapeutical strategies., Les maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson ou la sclérose en plaques, sont des maladies chroniques progressives touchant le système nerveux central. La barrière hémato-encéphalique (BHE) joue un rôle critique dans la physiologie du système nerveux central et, de ce fait, sa perturbation participe à la pathogénèse des maladies neurodégénératives. Du fait de l’implication de la voie de signalisation Hedgehog (Hh) dans la régulation de la BHE, et de l’existence de résultats contradictoires dans la littérature, l’objectif de cette thèse est de revoir les mécanismes mis en jeu dans la régulation de l’intégrité de la BHE par les ligands de la voie Hh dans des conditions physiologiques et pathologiques (sclérose en plaque et maladie d’Alzheimer) chez l’adulte.Nous avons montré que Desert Hedgehog (Dhh), exprimé par les cellules endothéliales (CE), est nécessaire au maintien de l’intégrité de la BHE. De plus, nous avons montré que la perte de Dhh dans les CE et l’ouverture de la BHE qui s’ensuit suffisent à induire l’apparition de troubles cognitifs. De plus, nos résultats suggèrent que l’expression endothéliale de Dhh est réduite dans la maladie d’Alzheimer et la sclérose en plaquesPar ailleurs nous avons montré que dans la sclérose en plaque, une induction de l’expression de Sonic Hedgehog (Shh) dans les astrocytes participe à l’ouverture de la BHE. Ces résultats et d’autres nous ont finalement permis de montrer qu’en fonction de leur forme, les ligands de la voie Hh agissent différemment sur la BHE.Dans l’ensemble, ces résultats renforcent l’idée déjà existante que la voie de signalisation Hh constitue une cible d’intérêt dans la thérapeutique des maladies neurodégénératives, et apportent de nouvelles informations à prendre en compte dans l’élaboration de stratégies thérapeutiques.

Neurodegenerative diseases suchs as Alzheimer’s or Multiple Sclerosis are characterized by a progressive degeneration of the central or peripheral nervous system. The blood-brain barrier (BBB) plays a critical role in the pathophysiologie of the central nervous system, and its disruption contributes to the pathogenesis of neurodegenerative disease. Since Hedgehog (Hh) signalling is implicated in the maintenance of the BBB, and since discrepancies exist in the literature, the objective of this PhD’s thesis is to clarify the mechanisms underlying Hh ligands-dependent regulation of the BBB, in physiological and pathological (multiple sclerosis and Alzheimer’s) conditions, in the adult.We showed that Desert Hedgehog (Dhh) is expressed in endothelial cells (ECs), and is necessary to stabilize the BBB. Moreove, we showed that the deletion of Dhh in ECs, and the consequential opening of the BBB are sufficient to trigger the apparition of cognitive disorders. Our results also suggest that Dhh in ECs is downregulated in Alzheimer’s and multiple sclerosis.We also showed that in multiple sclerosis, Sonic Hedgehog (Shh) is induced in astrocytes and contributes to the opening of the BBB. Those results and other finally led us to demonstrate that depending on their post-translational maturation, Hh ligands have distinct effects on the BBB.Taken together, those results strengthen the hypothesis of using Hh signalling as a therapeutic target in the treatment of neurodegenerative diseases, and unveil new insights to consider when it comes to conceiving such therapeutical strategies., Les maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson ou la sclérose en plaques, sont des maladies chroniques progressives touchant le système nerveux central. La barrière hémato-encéphalique (BHE) joue un rôle critique dans la physiologie du système nerveux central et, de ce fait, sa perturbation participe à la pathogénèse des maladies neurodégénératives. Du fait de l’implication de la voie de signalisation Hedgehog (Hh) dans la régulation de la BHE, et de l’existence de résultats contradictoires dans la littérature, l’objectif de cette thèse est de revoir les mécanismes mis en jeu dans la régulation de l’intégrité de la BHE par les ligands de la voie Hh dans des conditions physiologiques et pathologiques (sclérose en plaque et maladie d’Alzheimer) chez l’adulte.Nous avons montré que Desert Hedgehog (Dhh), exprimé par les cellules endothéliales (CE), est nécessaire au maintien de l’intégrité de la BHE. De plus, nous avons montré que la perte de Dhh dans les CE et l’ouverture de la BHE qui s’ensuit suffisent à induire l’apparition de troubles cognitifs. De plus, nos résultats suggèrent que l’expression endothéliale de Dhh est réduite dans la maladie d’Alzheimer et la sclérose en plaquesPar ailleurs nous avons montré que dans la sclérose en plaque, une induction de l’expression de Sonic Hedgehog (Shh) dans les astrocytes participe à l’ouverture de la BHE. Ces résultats et d’autres nous ont finalement permis de montrer qu’en fonction de leur forme, les ligands de la voie Hh agissent différemment sur la BHE.Dans l’ensemble, ces résultats renforcent l’idée déjà existante que la voie de signalisation Hh constitue une cible d’intérêt dans la thérapeutique des maladies neurodégénératives, et apportent de nouvelles informations à prendre en compte dans l’élaboration de stratégies thérapeutiques.

The prevalence of diabetes and critical limb ischemia (CLI) is steadily increasing. These pathologies remain incurable and often intertwined. Results suggest that Hedgehog (Hh) signaling is involved in maintaining microvessel integrity, and downregulation of Desert Hh (Dhh) is associated with cardiovascular risk factors, such as age, diabetes, and obesity.The main objective of this thesis was to explore the pathophysiological mechanisms leading to CLI with the hypothesis that endothelial Dhh is essential for the maintenance of vascular integrity.We have shown that endogenous Sonic Hh (Shh) does not promote post-ischemic angiogenesis and that the absence of Shh leads to aberrant ischemic tissue inflammation and increased transient angiogenesis. In humans, CLI was associated with dysfunctional capillaries rather than a decrease in capillary density, and Dhh was expressed in endothelial cells (EC). In mice, Dhh knockdown was associated with EC activation and capillary leakage secondary to the alteration of adherent junctions. Dhh's agonist significantly improved EC function without promoting angiogenesis, which subsequently improved muscle perfusion.Thus, restoration of EC function leads to a significant recovery of perfusion and muscle repair in the context of CLI. The Hh signaling pathway, and more particularly Dhh, appears to be a promising therapeutic target for preventing the endothelial dysfunction involved in ischemic vascular pathologies.; La prévalence du diabète et de l’ischémie critique chronique (ICC) est en constante augmentation. Ces pathologies demeurent incurables et souvent intriquées. Des résultats suggèrent que la signalisation Hedgehog (Hh) participe au maintien de l'intégrité des microvaisseaux, et une régulation négative de Desert Hh (Dhh) est associée aux facteurs de risque cardiovasculaires, tels que l'âge, le diabète et l'obésité.L’objectif principal de cette thèse était d’explorer les mécanismes physiopathologiques conduisant à l’ICC avec pour hypothèse que la protéine Dhh dérivée de l'endothélium est essentielle au maintien de l'intégrité vasculaire.Nous avons démontré que Sonic Hh (Shh) endogène ne favorise pas l'angiogenèse post-ischémie et que l'absence de Shh conduit à une inflammation tissulaire ischémique aberrante et à une angiogenèse transitoire accrue. Chez l’homme, l'ICC était associée à des capillaires dysfonctionnels plutôt qu'à une diminution de la densité capillaire et Dhh était exprimé dans les cellules endothéliales (CE). Chez la souris, une carence en Dhh induisait une activation des CE et une fuite capillaire en raison d'une altération des jonctions adhérentes. L'agoniste de la signalisation Dhh améliorait significativement la fonction des CE sans favoriser l'angiogenèse, ce qui améliorait par la suite la perfusion musculaire.Ainsi, la restauration de la fonction des CE conduit à une récupération significative de la perfusion et de la réparation musculaire dans un contexte d’ICC de membre. La voie Hh, et plus particulièrement Dhh, semble être une cible thérapeutique prometteuse pour prévenir le dysfonctionnement endothélial impliqué dans les pathologies vasculaires ischémiques.

While endothelial keratoplasty has become the standard treatment for Fuchs dystrophy, the strategy for first-line surgery in patients with associated cataract is still debated. The purpose of this study was to evaluate the surgical outcomes of eyes with Fuchs endothelial corneal dystrophy (FECD) undergoing phacoemulsification alone, to ascertain preoperative factors that predict the need for endothelial keratoplasty (EK).Single-center retrospective study. Cataract surgery alone was performed in 64 eyes of 50 patients with FECD. This decision was made if the patient did not have morning blur, the central corneal thickness (CCT) was below 630 microns, and endothelial cells were visible in the periphery.Mean follow-up was 21 months (range 5-55 months). The mean preoperative CCT was 571±43μm. 6 months after surgery, it was 584±52μm (P=0.12). During follow-up, 14 eyes (22%) required an EK because of poor visual outcome after cataract surgery alone. Mean pre-operative CCT of these eyes (595±23μm) was significantly higher than eyes that did not require EK during follow-up (564±45μm, P=0.022). Over 570 microns, 34% of eyes required an endothelial keratoplasty after the cataract surgery alone.CCT below 630μm associated with the absence of morning blur are preoperative criteria allowing 78.1% eyes with FECD to obtain good visual outcomes after cataract surgery alone. In these eyes, EK can therefore be avoided while ensuring good results.

Le système lymphatique joue un rôle clé dans le transport du cholestérol hors de la paroi artérielle et une dysfonction lymphatique précède l'apparition de l'athérosclérose. Cette dysfonction est associée à une diminution de l’expression du récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLR) et est à priori indépendante des taux de cholestérol circulant. Il a été démontré que les souris dépourvues de la proprotéine subtilisine/kexine de type 9 (PCSK9), une proprotéine qui mène à la dégradation du LDLR, ont une fonction lymphatique améliorée, tandis que les souris dépourvues de LDLR développent une dysfonction lymphatique. Nous visons maintenant à mieux comprendre les mécanismes par lesquels la présence de PCSK9 dans la lymphe ou la modulation du LDLR sur les cellules endothéliales lymphatiques (CEL) affecte la fonction lymphatique. Les CEL sont incubées avec du PCSK9 ou traitées avec un ARN inhibant spécifiquement l’expression du LDLR afin d’évaluer comment la présence de PCSK9 ou la modulation du LDLR affecte l'intégrité des CEL. Nos résultats démontrent que le PCSK9 n’induit pas la sécrétion de cytokines inflammatoires et n'affecte pas l'expression des marqueurs lymphatiques. L’inhibition de l’expression du LDLR entraîne une diminution des marqueurs lymphatiques membranaires endothéliaux. La diminution du LDLR a aussi entrainé une diminution des taux de certains lipides intracellulaires et en particulier des phospholipides, des sphingolipides et des triglycérides. Ces résultats suggèrent qu'une perte du LDLR, mais pas la présence de PCSK9 en circulation, pourrait induire à une altération de l'endothélium lymphatique causée par une diminution de l’expression de protéines membranaires essentielles au bon transport de la lymphe., The lymphatic system plays a key role in the removal of cholesterol from the artery wall and lymphatic dysfunction is known to occur prior to the onset of atherosclerosis. This dysfunction is associated with reduced expression of the low-density-lipoprotein receptor (LDLR) and is first independent of circulating cholesterol levels. It has been shown that mice lacking proprotein subtilisin/kexin type 9 (PCSK9), a proprotein that degrades LDLR, have improved lymphatic function while mice lacking LDLR had a lymphatic dysfunction. We now aim to better understand the mechanisms by which the presence of PCSK9 in lymph or the modulation of LDLR on lymphatic endothelial cells (LECs) affects lymphatic function. Incubation of LECs with PCSK9 and specific targeting of LDLR expression with silencing RNAs were used to further evaluate how PCSK9 or modulation of LDLR affect the metabolism and integrity of LECs. Our results demonstrate that PCSK9 does not induce the secretion of inflammatory cytokines and does not affect the expression of lymphatic markers. LDLR silencing RNA leads to a decrease of membrane-bound lymphatic endothelial cell markers. A decrease in LDLR expression also led to a decrease in the content of some intracellular lipids and particularly phospholipids, sphingolipids and triglycerides. These results suggest that loss of LDLR expression, but not circulating PCSK9, could lead to alterations in the lymphatic endothelium caused by loss of membrane integrity which could in turn affect lymph transport.

La néphropathie diabétique est l’une des complications les plus fréquentes chez les patients diabétiques à long terme, et est la première cause du besoin de dialyse. Les lésions glomérulaires semblent jouer un rôle clé dans le développement de la néphropathie diabétique. L’épaississement de la membrane basale glomérulaire, l’hypertrophie des cellules glomérulaires et la perte de podocytes font partie des principaux changements pathologiques survenant au cours de la néphropathie diabétique et peuvent conduire à une protéinurie. Il a été suggéré que le dysfonctionnement endothélial joue un rôle important dans la pathogenèse des lésions glomérulaires au cours de la maladie rénale diabétique. En effet, l’altération de la fonction et de l’intégrité des cellules endothéliales glomérulaires est l’une des principales causes de la microalbuminurie observée dans l’insuffisance rénale diabétique précoce. Les lésions des cellules endothéliales glomérulaires peuvent endommager les podocytes et même induire une perte podocitaire ce qui aggrave d’avantage les liaisons des cellules endothéliales glomérulaires et ainsi de suite. Actuellement, les traitements de la néphropathie diabétique visent le contrôle de la glycémie et de la pression artérielle dans le but de maintenir un bon débit de filtration glomérulaire. Cependant, l’étude de traitements pouvant cibler les lésions endothéliales ou les interactions podocyte-cellule endothéliales, qui jouent un rôle essentiel dans la progression de la maladie rénale diabétique, est nécessaire. Les traitements ciblant l’endothélium glomérulaire pourraient offrir des avantages thérapeutiques pour la néphropathie diabétique. En effet, des facteurs anti-angiogéniques tels que les inhibiteurs du VEGF pourraient prévenir les lésions rénales et les altérations glomérulaires sur des modèles de souris diabétiques. Cependant, d’autres données ont montré que des injections d’inhibiteurs du VEGF pouvaient être néfastes pour les cellules endothéliales et podocytaires. Ainsi, de nouvelles molécules ciblant l’endothélium vasculaire pourraient améliorer le pronostic et la qualité de vie chez les patients présentant une insuffisance rénale diabétique à un stade précoce. Nous avons précédemment montré que Alk1, avec son ligand BMP9, joue un rôle important dans le maintien de l’intégrité vasculaire chez les animaux diabétiques. En effet, 4 la perte de signalisation d’Alk1 chez les animaux diabétiques conduit à la dissociation des jonctions vasculaires et à une augmentation des fuites vasculaires dans la rétine. Compte tenu de son rôle dans le maintien de la quiescence et de l’intégrité de l’endothélium, nous avons évalué les effets de la surpression d’Alk1 sur l’intégrité de l’endothélium glomérulaire et la fonction rénale chez la souris diabétique. Nous avons utilisé des souris avec délétion conditionnelle de Alk1 dans l’endothélium (Alk1ΔEC) pour évaluer le rôle de Alk1 dans la filtration glomérulaire chez des souris diabétiques induits par le STZ. Les souris ont été euthanasiées quatre mois après le début du diabète et des analyses sérologiques et urinaires ont été effectuées, ainsi que des études immunohistochimiques. Nous avons démontré que l’haplo-insuffisance d’Alk1 aggrave la microalbuminurie et induit une perte de podocytes chez des souris diabétiques. De plus, une augmentation significative de l’apoptose glomérulaire a été observée chez les souris Alk1ΔEC hétérozygotes diabétiques. L’analyse de souris Alk1ΔEC homozygotes non diabétiques a également révélé une perte importante de cellules endothéliales glomérulaires. Ensemble, ces données suggèrent que la signalisation du récepteur Alk1 joue un rôle essentiel dans le maintien des cellules endothéliales glomérulaires et participe au maintien de l’intégrité glomérulaire à travers un mécanisme de podocyte-endothelial cross-talk., Diabetic kidney disease one of the most frequent microvascular long-term complications in diabetic patients and is the first cause for the need for dialysis. The glomerular damage seems to play a key role in the development of diabetic nephropathy. Thickening of the glomerular basement membrane, glomerular cell hypertrophy, and podocyte loss is among the main pathological changes occurring during diabetic nephropathy and can lead to proteinuria. Endothelial dysfunction has been suggested to play an important role in the pathogenesis of glomerular damage during diabetic kidney disease. Indeed, alteration of the glomerular endothelial cell function and integrity is a leading cause of microalbuminuria observed in early diabetic kidney disease. Injury to glomerular endothelial cells may lead to podocyte damage, while podocyte loss further exacerbates glomerular endothelial cell injury, forming a vicious cycle. Currently, therapies in diabetic nephropathy are focusing on glycemia control and adequate arterial pressure levels in order to maintain an adequate glomerular filtration rate. However, the study of some treatments that may target endothelial lesions or podocyte-endothelial cell interactions, which play a vital role in the progression of diabetic kidney disease is necessary. It has been suggested that antiangiogenic treatments for diabetic kidney disease could provide therapeutic benefits. Indeed, anti-angiogenic factors such as VEGF inhibitors have been demonstrated to suppress renal damage and glomerular alterations in a diabetic mouse model. However, some other data have shown that anti-VEGF injections could be detrimental for podocytes and endothelial cells. Thus, new molecules targeting the vascular endothelium could possibly improve prognosis and quality of life in patients with early stages of diabetic kidney disease. We have previously shown that Alk1, along with its ligand BMP9, plays an important function to maintain vascular integrity in diabetic animals. Loss of Alk1 signaling in diabetic animals led to dissociation of vascular junctions and increased vascular leakage. Given its role in the maintenance of endothelial quiescence and integrity, we evaluated the effects of Alk1 suppression on kidney integrity and renal function in diabetic mice. 6 We used mice with conditional deletion of Alk1 in the endothelium (Alk1ΔEC) to evaluate the role of Alk1 in glomerular filtration in STZ-induced diabetic mice. Mice were euthanized four months after the onset of diabetes and urine, and serological analyzes were performed, along with immunohistochemical studies. We demonstrated that Alk1 haploinsufficiency worsens microalbuminuria and induces podocyte loss. Furthermore, a significant increase in glomerular apoptosis was observed in Alk1ΔEC mice. Analysis of homozygous Alk1ΔEC mice also revealed a significant loss of glomerular endothelial cells. Together, these data suggest that Alk1/BMP9 signaling plays a critical role in the maintenance of glomerular endothelial cells and has important functions to maintain glomerular integrity through a crosstalk podocyte-endothelial mechanism.

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), such as benzo[a]pyrene (B[a]P), are environmental pollutants associated with cancers and cardiovascular diseases. The aims of the present thesis have been : (1) to identify biomarkers of a risk of developing these pathologies due to PAHs, and (2) to test the preventing effects of natural products on HMEC-1 endothelial cells. In this context, extracellular vesicles (EV) : exosomes (EXO) and microvesicles (MV), accessible in biological fluids, seem to be promising non-invasive biomarkers. EV composition and production depend on the type and physiopathological state of the cell. Our results demonstrate that some PAHs stimulate in vitro and in vivo EV production and modify their content. We have further shown that the overproduction of EXO depends on the aromatic hydrocarbon receptor (AhR) unlike the MV. We have studied the influence of two extracts of microalgae, O. tauri and P. tricornutum, rich in omega-3 and pigments, on the toxicity of B[a]P. We have observed that O. tauri extract can influence the toxicity of B[a]P. Indeed, apoptosis and EV production were decreased likely through reduction of the expression of CYP1A1, a B[a]P bioactivation enzyme. In addition, the B[a]P-induced expression of the inflammatory cytokines IL-8 and IL1-β was reduced. The P. tricornutum extract only inhibited the expression of the B[a]P-induced cytokine IL-8 expression. Overall, this thesis suggests a potential application of EVs as biomarkers of PAH toxicity, and the possible use of O. tauri extract in the prevention of PAHs-mediated pathologies.; Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), e.g. benzo[a]pyrène (B[a]P), sont des polluants environnementaux associés aux cancers et aux maladies cardiovasculaires. Les objectifs de cette thèse ont été: (1) d’'identifier des biomarqueurs d’'un risque de développement de ces maladies dues aux HAP et (2) de tester des produits naturels en prévention, sur les cellules endothéliales HMEC-1. Dans ce contexte, les vésicules extracellulaires (VE) : exosomes (EXO) et microvésicules (MV), accessibles dans les fluides biologiques, semblent être des biomarqueurs prometteurs non invasifs. La composition et la production des VE dépendent du type et de l’'état physiopathologique de la cellule. Nos résultats démontrent que certains HAP stimulent in vitro et in vivo la production de VE et modifient leur contenu. Nous avons montré que la surproduction d’'EXO dépend du récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AhR) contrairement aux MV. Nous avons étudié l’'influence de deux extraits de microalgues, O. tauri et P. tricornutum, riches en oméga-3 et en pigments sur la toxicité du B[a]P. Nous avons observé que l'extrait d’'O. tauri peut influencer la toxicité du B[a]P. En effet, l'apoptose et la production de VE ont diminué probablement par réduction de l'expression du CYP1A1, une enzyme de bioactivation du B[a]P. En outre, l'expression des cytokines inflammatoires induite par le B[a]P a été réduite. L'extrait de P. tricornutum n'a inhibé que l'expression de la cytokine IL-8 induite par le B[a]P. Ces travaux de thèse suggèrent une application potentielle des VE comme biomarqueurs de toxicité des HAP et la possible utilisation d’'O. tauri dans la prévention de pathologies médiées par les HAP.

Acute kidney injury is a major cause of in-hospital morbidity and mortality because of the serious nature of the underlying illnesses and the high incidence of complications. The two major causes of acute kidney injury that occur in the hospital are prerenal disease and acute tubular necrosis. Acute tubular necrosis has a histological definition, even if a kidney biopsy is rarely performed. Kidney injuries occurring during acute tubular necrosis are underlined by different pathophysiological mechanisms that emphasize the role of hypoxia on the tubular cells such as apoptosis, cytoskeleton disruption, mitochondrial function and the inflammation mediated by innate immune cells. The microcirculation and the endothelial cells are also the targets of hypoxia-mediated impairment. Repair mechanisms are sometimes inadequate because of pro-fibrotic factors that will lead to chronic kidney disease. Despite all the potential therapeutic targets highlighted by the pathophysiological knowledge, further works remain necessary to find a way to prevent these injuries.

L’athérosclérose est caractérisée par l’accumulation de cholestérol dans la paroi des artères de gros et de moyens calibres, et est associée à une réponse immunitaire inadéquate dans laquelle l’activation et l’apoptose cellulaire jouent un rôle de premier plan. Ces activités cellulaires peuvent entraîner la formation de particules submicroniques appelées vésicules extracellulaires (VEs) qui ont des effets variables sur l’endothélium sanguin et l’évolution subséquente de la plaque. Nous avons démontré que le cholestérol présent dans la lésion athérosclérotique est drainé préférentiellement par les vaisseaux lymphatiques situés dans l’adventice de la paroi artérielle. Comme nous avons également démontré la présence de VEs d’origines hétérogènes dans la lymphe, nous émettons l’hypothèse que l’accumulation massive de VEs dans la paroi artérielle pourrait être à la fois une cause et une conséquence du faible drainage par le système lymphatique. Nous avons d’abord investigué les effets des VEs dérivées de globules rouges et de plaquettes sur l’intégrité des cellules endothéliales lymphatiques (lymphatic endothelial cells, LECs). Les LECs ont été traitées avec des concentrations physiologiques de VEs dérivées de globules rouges ou de plaquettes, et leur adhésion et internalisation aux LECs a été évaluée par immunofluorescence et cytométrie en flux. Les effets sur la prolifération des LECs, leur capacité de migration, leur production d’espèces réactives d’oxygène (ROS, reactive oxygen species), la mort cellulaire et la perméabilité ont été évaluées. Les deux types de VEs adhèrent aux LECs in vitro. Les VEs dérivées de globules rouges causent l’augmentation de la production de ROS et la diminution de l’activation de la caspase 3 et de la perméabilité chez les LECs, quant aux VEs dérivées de plaquettes, elles provoquent la diminution de la prolifération, de la production de ROS et de l’activation de la caspase 3 chez les LECs. Nos résultats suggèrent que des concentrations physiologiques de VEs dérivées de plaquettes pourraient contribuer au maintien de l’intégrité des LECs, alors que l’accumulation de VEs dérivées de globules rouges pourrait être néfaste. Finalement, ce projet est certes instigateur d’une meilleure compréhension du rôle des VEs dans la modulation de fonction lymphatique associée aux maladies cardiovasculaires., Atherosclerosis is characterized by the accumulation of cholesterol in the wall of large- and medium-sized arteries, and is associated with an inadequate immune response in which cellular activation and apoptosis play a major role. These cellular activities can lead to the formation of submicron particles, called extracellular vesicles (EVs), that have variable effects on the blood endothelium and the subsequent plaque evolution. We have shown that cholesterol preferentially travels through the lymphatic vessels located in the adventitia of the arterial wall in order to leave the atherosclerotic lesion. As we have also demonstrated the presence of EVs derived from different cell types in the lymph, we hypothesize that the massive accumulation of EVs in the arterial wall could be both a cause and a consequence of the poor clearance by the lymphatic system. We thus investigated the effects of red blood cell- and platelet-derived EVs on the integrity of lymphatic endothelial cells (LECs). LECs were treated with physiological concentrations of EVs derived from red blood cells and/or platelets, and their adhesion and internalization to LECs was assessed by immunofluorescence and flow cytometry. The effects of EVs on LECs' proliferation, migration capacity, production of reactive oxygen species (ROS), cell death and permeability were also evaluated. Both EV types adhered and were internalised by LECs in vitro. Red blood cell-derived EVs increased ROS production, and decreased proliferation, ROS production and the activation of caspase 3 in LECs integrity, whereas EVs derived from red blood cells could, in the long term, be harmful. Finally, we believe that this project is a great premise for a better understanding of the role of EVs is lymphatic function modulation in cardiovascular diseases.

International audience; Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a severe and incurable cardiopulmonary disorder. Research from the past 10 years illustrates the complex and multifactorial aspects of PAH pathophysiology. Furthermore, latest advances in the field have led to a better understanding of the key components underlying this inadequate accumulation of pulmonary vascular cells within the pulmonary arterial walls, leading to pulmonary vascular remodelling. Among the underlying molecular and cellular mechanisms, pulmonary endothelial dysfunction, alterations of the inter-cell communications within the pulmonary arterial walls as well as defects of the inflammatory component and the loss of BMPRII activity play critical roles in the pathogenesis of the disease.; Dans l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP), les récentes découvertes physiopathologiques illustrent bien la complexité et l’aspect multifactoriel des mécanismes impliqués dans l’accumulation inadéquate de cellules vasculaires pulmonaires dans les parois des artères pulmonaires. Néanmoins, ces dernières avancées dans le domaine ont aussi permis de mieux comprendre les trois composantes motrices à la base de ce remodelage vasculaire pulmonaire et apportent un éclairage nouveau sur les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents. Parmi ces acteurs au centre de la pathogenèse, les perturbations des fonctions de l’endothélium pulmonaire et des processus inflammatoires jouent des rôles critiques, tout comme la perte d’activité du BMPRII et les altérations des communications entre cellules au sein des parois des artères pulmonaires.

L’Angiopoïétine-1 (Ang-1) est un facteur de croissance pro-angiogénique qui agit sur les cellules endothéliales (CEs) et qui promeut la stabilisation des jonctions intercellulaires entre les CEs. L’Ang-1 contrôle, via l’activation du récepteur Tie2, la stabilité des vaisseaux sanguins et inhibe la perméabilité vasculaire aux macromolécules. Ces effets de l’Ang-1 sur les CEs sont essentiels pour la maturation finale des vaisseaux durant le processus de l’angiogenèse. Rap1, une petite GTPase, est impliquée dans l’adhésion intercellulaire. Grâce à des sondes biochimiques, nous avons pu montrer que l’Ang-1 active la GTPase Rap1 dans des CEs. Nous avons transfecté des CEs d’aortes bovines avec un ARN interférant (siRNA) contre Rap1 et nous avons trouvé que Rap1 contribue à la stabilisation des jonctions intercellulaires stimulées par l’Ang-1 en diminuant la perméabilité des jonctions endothéliales aux macromolécules. De plus, la transfection de siRNA contre Rap1 inhibe fortement l’induction du bourgeonnement angiogénique des CE lors d’essais de sphéroïdes. Cependant, la diminution de l’expression de Rap1 n’affecte pas la migration des CEs lors d’essais de réparation de blessures stimulées par l’Ang-1. De façon intéressante, une diminution de l’expression de la VE-cadhérine, une autre protéine essentielle des jonctions d’encrage, inhibe complètement la migration des CEs stimulée par l’Ang-1 ainsi que le bourgeonnement angiogénique. Finalement, la diminution de l’expression de la VE-cadhérine provoque une augmentation de l’adhésion des CEs à la matrice extracellulaire tandis qu’aucun effet n’est observé suite à la diminution de l’expression de Rap1. Ces résultats suggèrent que la fonction de Rap1 stimulée par l’Ang-1, est principalement associée à son rôle au niveau de l’adhésion intercellulaire des CEs contrairement à la VE-cadhérine qui est en plus impliquée dans leur adhésion à la matrice extracellulaire., Angiopoietin-1 (Ang-1), an important angiogenic factor, plays a key role in blood vessel formation. Ang-1 controls, via it’s Tie-2 receptor, the stability of blood vessels and inhibits vascular permeability to macromolecules. These effects of Ang-1 on endothelial cells (ECs) are essential for the maturation of blood vessel during the angiogenic process. Studies have shown that the small GTPase Ras-associated protein-1 (Rap1) is involved in promoting cell adhesion, such as cadherin-mediated adhesion and vessel stability. While many studies establish Rap1 activation as an important signaling event leading to adherens junctions (AJ) reinforcement, Rap1 has never been reported as a signaling target of Tie-2. We determine the contribution of Rap1 to Ang-1/Tie-2 stimulated angiogenic effect on ECs. Using a pull-down assay, we were able to show that Ang-1 rapidly activates Rap1 in ECs. We transfected bovine aortic endothelial cells (BAECs) with siRNA against Rap1 and we found that downregulation of Rap1 attenuated the anti-permeability effects of Ang-1 on ECs. Our results also reveal that Rap1 is necessary for EC sprouting stimulated by Ang-1 in our angiogenic in vitro model, but had no visible effect on EC migration. Although Rap1 and VE-cadherin are both essential in promoting the integrity of the endothelial barrier and cell sprouting, downregulation of VE-cadherin in BAECs transfected with siRNA against VE-cadherin abolished Ang-1 stimulated migration and promoted adhesion of ECs in contrast to Rap1. These results suggest that Ang-1 mostly activates Rap1 at the level of intercellular adhesions in EC whereas Ang-1 also induces VE-cadherin cell adhesion of ECs with the extracellular matrix.

Myeloproliferative neoplasms (MPN) are acquired hematologic diseases of the hematopoietic stem cell (HSC) characterized by blood cell proliferation. An activating mutation of the protein JAK2 (JAK2V617F) has been identified in more than 50% of patients. The occurrence of arterial and venous thrombosis is one of the main complications during these diseases. We first studied the consequences of the presence of the JAK2V617F mutation in endothelial cells (EC) on the physiopathology of thrombosis. We used two complementary approaches, in vitro with the use of human venous endothelial cells, and in vivo with the use of a mouse model allowing the presence of the JAK2V617F mutation only in the endothelial compartment: the PDGFb-iCreERT2;JAK2V617F/WT model. We first observed that PDGFbiCreERT2; JAK2V617F/WT mice displayed a higher propensity for thrombosis. This increased thrombus formation was mediated by an increased leukocyte adhesion in presence of JAK2V617F EC, secondary to an increase in P-Selectin expression at their surface. This work made it possible to highlight a new mechanism of the physiopathology of thrombosis during JAK2V617F MPN. Then we studied neutrophils and the phenomenon of NETosis (formation of neutrophil extracellular traps or NET) during MPN. We demonstrated that NET formation was increased in a cohort of patients with MPN, such as indirect markers of NETosis (plasmatic DNA and MPO-DNA). We found that plasma MPO-DNA levels were higher in patients with a history of thrombosis compared to patients without. We confirmed these results using two different mouse models in which we also found increased NET formation. We found that NET formation was involved in the physiopathology of thrombosis, as DNAse administration resulted in a reduction of thrombosis occurrence. Finally, we demonstrated that JAK2V617F platelets stimulated NET formation by JAK2V617F neutrophils, suggesting collaboration of these two cell types during the physiopathology of thrombosis during MPN., Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) sont des maladies hématologiques acquises de la cellule souche hématopoiétique (CSH) caractérisées par une prolifération accrue de cellules sanguines. Une mutation activatrice de la protéine JAK2 (JAK2V617F) a été identifiée chez plus de 50% des patients. La survenue de thromboses au niveau artériel et veineux constitue une des principales complications au cours de ces maladies. Au cours d’un premier axe de travail, nous avons souhaité étudier les conséquences sur la physiopathologie de la thrombose de la présence de la mutation JAK2V617F dans les cellules endothéliales (CE). Utilisant deux approches complémentaires, in vitro avec l’utilisation de cellules endothéliales veineuses, et in vivo avec l’utilisation d’un modèle murin permettant la présence de la mutation JAK2V617F dans le compartiment endothélial, nous avons démontré que la présence de CE JAKV617F favorisait la survenue de thrombose. Cette augmentation de la survenue de thrombose était médiée par une augmentation de l’adhésion des leucocytes au niveau des CE JAK2V617F, secondaire à une augmentation d’expression de P-Sélectine à leur surface. Ce travail a permis de mettre en évidence un nouveau mécanisme de la physiopathologie de la thrombose au cours des NMP JAK2V617F. Au cours d’un second axe de travail, nous avons étudié les polynucléaires neutrophiles (PNN) et le phénomène de NETose (formation de neutrophil extracellular traps ou NET) au cours des NMP. Nous avons démontré que la formation de NET était augmentée dans une cohorte de patients avec NMP, tout comme des marqueurs indirects de NETose (ADN plasmatique, MPO-ADN plasmatique). Nous avons mis en évidence que les taux de MPO-ADN plasmatique étaient plus élevés chez les patients avec antécédents de thrombose par rapport aux patients sans. Nous avons confirmé ces résultats à l’aide de deux modèles murins différents dans lesquels nous avons également retrouvé une formation de NET augmentée. Nous avons mis en évidence que cette formation de NET participait à la physiopathologie de la thrombose, l’administration de DNAse entraînant une réduction de la survenue de thrombose. Enfin, nous avons démontré que les plaquettes JAK2V617F stimulaient la production de NET par les PNN JAK2V617F, suggérant une collaboration de ces deux types cellulaires au cours de la physiopathologie de la thrombose des NMP.

Systemic sclerosis is a rare connective tissue disease characterized by skin and several internal organ fibrosis, systemic vasculopathy and immune abnormalities. Even if fibroblasts and endothelial cells dysfunction, as well as lymphocytes and other immune cells implication are now well described, the exact origin and chronology of the disease pathogenesis remain unclear. Oxidative stress, influenced by genetic and environmental factors, seems to play a key role. Indeed, it seems to be implicated in the early phases of fibrosis development, vasculopathy and in immune tolerance abnormalities shared by all patients, although disease expression is heterogeneous. To date, no curative treatment is available. Even if immunosuppressive treatment or drugs acting on vascular system are proposed for some patients, overall, treatment efficiency remains modest. Only autologous hematopoietic stem cells transplantation, reserved for patients with severe or rapidly progressive fibrosis, has recently demonstrated efficiency, with lasting regression of fibrosis. Nevertheless, this treatment can expose to important, life-threatening toxicity. In the last decade, new mechanisms implicated in the pathogenesis of systemic sclerosis have been unraveled, bringing new therapeutic opportunities. In this review, we offer to focus on recent insights in the knowledge of systemic sclerosis pathogenesis and its implication in current and future medical care.

Les angiopoïétines (Ang1 et Ang2) sont des protéines reconnues pour leur implication dans le processus angiogénique. La découverte de leur récepteur (Tie2) à la surface des neutrophiles a permis d’étudier leur rôle dans certaines activités pro-inflammatoires des neutrophiles comme leur adhésion aux cellules endothéliales (CE), l’augmentation de leur viabilité et la synthèse et relâche de diverses cytokines. Récemment, il a été démontré que les neutrophiles peuvent relâcher des Neutrophil Extracellular Traps (NETs), des filaments d’ADN sous forme de toile en réponse à une infection ou à l’inflammation. Puisque les angiopoïétines ont la capacité d’activer les neutrophiles, nous avons voulu déterminer leur effet sur la relâche de NETs, et le rôle de ceux-ci dans des situations pro-inflammatoires et pro-angiogéniques in vitro. Des neutrophiles humains ont été isolés à partir de sang de donneurs sains en accord avec le comité d’éthique de l’Institut de cardiologie de Montréal. Nous avons observé que l’Ang1 et l’Ang2, seules ou combinées (10 nM; 3 heures) augmentent la relâche de NETs (≈2,5 fois) comparativement aux neutrophiles stimulés au PBS. Cette NETose est dépendante du récepteur Tie2, et requiert la participation des voies de signalisation PI3K, p38 et p42/44 MAPK, de la production de dérivés réactifs de l’oxygène (ROS), de la relâche du calcium intracellulaire, et de l’activation de la protéine arginine déiminase 4 (PAD4). Ces NETs isolés induisent l’activation des neutrophiles et des CE, menant à l’adhésion des neutrophiles à la matrice extracellulaire humaine (hECM) et à des CE provenant des veines de cordons ombilicaux humains (HUVEC). Ces NETs induisent aussi la formation in vitro de tubules de type capillaire chez les HUVEC. Cette étude est la première à rapporter la capacité des deux angiopoïétines à induire la production de NETs et leur contribution dans les activités pro-inflammatoires et pro-angiogéniques des angiopoïétines., Angiopoietins (Ang1 and Ang2) are proteins known for their implication in angiogenesis. The discovery of their receptor (Tie2) on neutrophil surface led to numerous studies about their role in pro-inflammatory activities of neutrophils, like neutrophil adhesion onto endothelial cells (EC), pro-survival activity and synthesis and release of various cytokines. Recently, it has been reported that neutrophils have the capacity to release Neutrophil Extracellular Traps (NETs), nuclear DNA extruded in a web-like structure in response to infection or inflammation. Since angiopoietins can activate neutrophils, we address if they can induce NETs release, and if these NETs have an in vitro effect in pro-inflammatory and pro-angiogenic activities. Neutrophils were isolated from blood of healthy volunteers in accordance with the guidelines of the Montreal Heart Institute’s ethical committee. We observed that Ang1 and Ang2, alone or combined (10 nM; 3 hours) increase NETs release (≈2.5-fold) as compared to PBS-treated neutrophils. This NETosis is Tie2-dependent, and requires intracellular participation of PI3K, p38 and p42/44 MAPK pathways, ROS production, intracellular calcium release, and protein arginine deiminase 4 (PAD4) activation. These isolated NETs induced neutrophils and endothelial cells activation, leading to neutrophil adhesion onto human extracellular matrix (hECM) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and in vitro HUVEC capillary-like tube formation. This study is the first one to report the capacity of both angiopoietins to promote the release of NETs and to demonstrate that angiopoietins-mediated NETs contribute to pro-inflammatory and pro-angiogenic activities.

Preeclampsia is a major, frequent and potentially severe condition of pregnancy, characterized by severe hypertension and proteinuria. In this review, we describe recent advances in understanding the pathology, and discuss the long-term impacts on maternal vascular health. Next, we describe the genetic, epigenetic and immunological basis of preeclampsia. We describe the links between preeclampsia and oxidative stress in placental (trophoblast) and endothelial cells. We mention cellular and animal models commonly used to decipher modified pathophysiological pathways in a preeclamptic pregnancy compared to a normal pregnancy. Finally, we discuss the therapeutic options, readily available or in development, to improve the monitoring of pregnancies, the health of patients and that of children born from preeclamptic pregnancies.