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Tmem51 is upregulated in CD8 T cells derived from chronic infection. In acute infection, overexpression of it leads to downregulation of effector cytokine production without impacting T cell development. Exhausted CD8 T cells in chronic infection cannot be reactivated by deletion of Tmem51. PTPN2 was known to impact exhausted CD8 T cells subsets in chronic infection. In acute infection, deficiency of PTPN2 improves T cell survival by rendering T cells less dependent on survival-promoting cytokines. Tmem51 ist in CD8-T-Zellen, die von chronischen Infektionen stammen, hochreguliert. In akuter Infektion führt eine Überexpression von Tmem51 zu einer Herunterregulierungvon Effektorzytokinen, ohne die T-Zell-Entwicklung zu beeinträchtigen. Erschöpfte CD8-T-Zellen werden durch Tmem51-deletion nicht reaktiviert. PTPN2 hat in chronischen Infektionen einen Einfluss auf erschöpfte CD8-T-Zellen. Bei akuten Infektionen erhöht ein PTPN2-Mangel die Überlebensfähigkeit von CD8-T-Zellen.

Main task of this thesis was the development and evaluation of immunological screening protocols for a standardized mouse phenotyping. Therefore, established assays like ELISA and flow cytometry were adapted to "high-throughput" technologies, as well as innovative bead array systems. With the help of these screening protocols, more than 5000 ENU mutagenized mice were tested for the cellular composition of the peripheral blood and the concentration of immunoglobulin subclasses in the blood plasma, and more than 25 new mutant mouse lines with immunological alterations could be established. In addition, the prerequisites and the workflow for a Listeria monozytogenes "challenge screen" of ENU mutagenized was established, in order to be able to specifically identify mouse mutants with defects in the immune response. Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Evaluierung von immunologischen Testverfahren für eine standardisierte Maus-Phänotypisierung. Dabei wurden etablierte Messmethoden wie ELISA und Durchflusszytometrie an „High-Throughput“ Bedingungen angepasst, sowie innovative Bead Array Systeme in die Untersuchungen integriert. Mit Hilfe der entwickelten Screeningprotokolle konnten mehr als 5000 ENU-mutagenisierte Mäuse hinsichtlich der zellulären Zusammensetzung des peripheren Blutes und der Konzentration von Immunglobulin-Subklassen im Blutplasma charakterisiert, und mehr als 25 neue Mausmutantenlinien mit immunologischen Abnormalitäten etabliert werden. Zusätzlich wurden die Vorraussetzungen und Arbeitsabläufe für einen „Challengescreen“ von ENU mutagenisierten Mäusen nach Infektion mit Listeria monocytogenes etabliert, um zukünftig gezielt Mausmutanten mit Defekten in der Immunabwehr zu identifizieren.

The aim of this thesis was to investigate if and how repertoire focusing of epitope-specific T cells during chronic viral infection reflects selection based on structural avidity. Structural avidity decreased during chronic infection and was associated with expansion of low avidity T cells. Loss of immunodominance of high avidity T cells was likely caused by replicative senescence. Clonal succession towards lower avidity TCRs would in turn explain the observed reverse TCR repertoire evolution. Untersucht wurde, ob und wie die Fokussierung des Repertoires von Epitop-spezifischen T Zellen während einer chronischen Virusinfektion eine Selektion auf Basis der strukturellen Avidität widerspiegelt. Diese nahm während der chronischen Infektion ab und ging mit einer Expansion von T-Zellen mit niedriger Avidität einher. Der Verlust der Immundominanz von hochaviden T Zellen wurde wahrscheinlich durch replikative Seneszenz verursacht. Eine klonale Sukzession hin zu TCRs mit geringerer Avidität würde die beobachtete umgekehrte Evolution des TCR-Repertoires erklären.

In this work, the development of immune responses derived from single naive CD8+ T cells was studied. It was found that the precursors of central memory T cells displayed slower cell cycle speeds than those of short-lived effector T cells, already during the early stages of the clonal expansion phase. Upon premature depletion of antigen-presenting dendritic cells, the cell cycle of these central memory precursors was further delayed and the generation of secondary immune responses was impaired. In dieser Arbeit wurde die Entwicklung von Immunantworten ausgehend von einzelnen naiven CD8+ T-Zellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Vorläufer zentraler Gedächtnis-T-Zellen schon während der frühen Expansionsphase einen langsameren Zellzyklus aufweisen, als diejenigen kurzlebiger Effektor-T-Zellen. Nach vorzeitiger Depletion Antigen-präsentierender Dendritischer Zellen wurde der Zellzyklus dieser zentralen Gedächtnisvorläufer weiter verlangsamt und die Ausbildung sekundärer Immunantworten war gestört.

The transfer of regulatory T cells (Tregs) represents a promising therapeutic approach to dampen misdirected immune responses, like autoimmune diseases, chronic inflammatory syndromes and graft versus host disease. Clinical isolation of highly pure Treg populations is still challenging. The isolation reagents can influence their viability and functionality, potentially altering the potency of isolated Treg cell products. Reversible Fab multimer-based Treg purification can prevent these conventional antibody label-induced interferences in vitro and in vivo. Der Transfer regulatorischer T-Zellen (Treg) ist ein vielversprechender therapeutischer Ansatz, um fehlgeleitete Immunreaktionen wie Autoimmunerkrankungen, chronische Entzündungssyndrome und Graft-versus-Host-Erkrankungen zu dämpfen. Die klinische Isolierung von hochreinen Tregs ist immer noch eine Herausforderung, da Isolationsreagenzien die Lebensfähigkeit und Funktionalität von Tregs beeinflussen können. Reversible Fab-Multimer-basierte Treg-Aufreinigung kann diese Antikörpermarkierungs-induzierte Interferenzen der Funktionalität in vitro und in vivo verhindern.

IL-22 restores epithelial integrity upon injury in a wide array of tissues and diseases and is a prototypic mediator of ‚immuno-epithelial‘ signaling. We characterized the role of IL-22 in several different mouse models of human kidney disease and found disease- and time-point specific changes in gene expression of the Notch/Ahr/IL22 axis. The effect of IL-22 in the kidney is confined to tubular epithelial cells on which it acts both as a pro-survival and a pro-regenerative factor. IL-22 reguliert die Epithelfunktion in verschiedenen Organen und Erkrankungen und ist ein prototypischer Mediator der 'immuno-epithelialen' Signaltransduktion. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von IL-22 in Mausmodellen verschiedener Nierenerkrankungen untersucht. Es zeigten sich Krankheits- und Zeitpunkts-spezifische Veränderungen der Genexpression der Notch/Ahr/IL22-Achse.In der Niere wirkt IL-22 Tubuluszell-spezifisch positiv auf Überleben und Regeneration des Epithels.

The aim of the thesis work was to access rare antigen specific T cells from a healthy donor repertoire. With a combination of existing and recent methods for enrichment and extraction of TCRs (T cell receptors), we were successful in establishing a workflow for multimer based T cell identification, screening and extraction of TCR sequences. In conclusion, using a more economic workflow we were able to identify and isolate a broad spectrum of TCRs for different tumor and viral antigens for future applications. Das Ziel der Diplomarbeit war seltene Antigen-spezifische T-Zellen aus einem gesunden Spender Repertoire zuzugreifen. Mit einer Kombination aus bestehenden und kürzlich Verfahren zur Anreicherung und Gewinnung von TZR (T-Zell-Rezeptoren) waren wir erfolgreich in einen Workflow für Multimer basierte T-Zell-Identifizierung Festlegung, Screening und Extraktion von TCR-Sequenzen. Abschließend einen wirtschaftlicheren Workflow konnten wir ein breites Spektrum an TCRs für verschiedene Tumor und virale Antigene für zukünftige Anwendungen zu identifizieren und zu isolieren.

Cytomegalovirus (CMV) establishes a life-long latent infection and is still a major source of morbidity after transplantation. In this thesis we report the characterization of HLA-C*0702/IE-1309-317-specific T cells and the generation of reversible HLA-C7-StrepTamers, suitable for the ex vivo isolation of T cells and usage in adoptive T cell therapy. In addition, we analyzed the risk factors predisposing for CMV-infection and identified a correlation of cold ischemic time and primary CMV-infection after kidney transplantation. Eine Primärinfektion durch das Zytomegalievirus (CMV) führt zu einer lebenslangen Persistenz und zählt zu den häufigsten Begleiterkrankungen nach Transplantation. Diese Arbeit behandelt die Charakterisierung von HLA-C*0702/IE-1309-317-spezifischen T Zellen und die Herstellung von reversiblen HLA-C7-StrepTameren für die Isolierung von T Zellen und die anschließende Verwendung in der adoptiven T Zelltherapie. Des Weiteren wurde eine Korrelation von kalter Ischämiezeit und primärer CMV-Infektion nach Nierentransplantation identifiziert.

In this study, key parameters of the innate immune system were studied in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of 13 healthy volunteers aged 22 to 32 years before and after vaccination against the yellow fever virus, i.e. YF-17D, during a time window of 14 days. Using a combination of quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) analyses to determine the mRNA expression profiles of DDX58 (RIG-I) itself and of several IFN-inducible genes (ISGs), Western blot analyses to measure expression of RIG-I full length (RIG-I FL), RIG-I splice variant (RIG-I SV), and RIG-I short form (RIG-I SF) proteins, together with fluorescence-activated cell sorting (FACS) analyses to examine alterations in the relative number of key innate immune cells in the circulation, the following results were obtained: qRT-PCR analysis revealed a marked and transient induction of RIG-I mRNA and of the type I ISGs, i.e. IRF7 (IFN regulatory factor 7; IRF7), ISG15 (ISG15 ubiquitin-like modifier; ISG15), MX1 (MX dynamin-like GTPase 1; MX1), and CXCL10 (C-X-C motif ligand 10; IP-10): mRNAs of IRF7, ISG15, MX1, and CXCL10 were markedly and transiently up-regulated on days 3 and 7 after vaccination, while their expression returned to baseline levels on day 14; Western blot analyses revealed that RIG-I FL protein but not its isoforms RIG-I SV or RIG-I SF, were constitutively expressed before vaccination and its expression level was further transiently enhanced during the observation period. Both RIG-I SV and RIG-I SF were induced on day 3 with RIG-I SF peaking on day 7 with a still markedly elevated level on day 14. In contrast to RIG-I, protein expression of melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA5) revealed inhibition at day 3 and thereafter though the protein of the virus sensor laboratory of genetics and physiology 2 (LGP2) showed similar kinetics as RIG-I, i.e. induction at days 3 and 7 and return at day 14 to prevaccination levels. These data are the first to demonstrate that RIG-I SF is induced after yellow fever vaccination in vivo. The data are compatible with the hypothesis that both RIG-I SV and RIG-I SF are critical endogenous negative feedback regulators of the type I IFN response to prevent its toxic overexpression. FACS analyses revealed that the relative number of all mononuclear cells in the circulation did not show a significant change within 14 days after vaccination. The relative number of CD14+/CD16- classical monocytes, however, was transiently down-regulated whereas the relative number of CD14+/CD16+ proinflammatory monocytes was significantly up-regulated on day 7. The relative number of all dendritic cells (DCs) remained unchanged during the course of the study. However, CD141+ classical DCs (cDCs; the mouse homologue of CD8+ DCs) were significantly reduced on days 3 and 7. In sharp contrast, CD1c+ cDCs were elevated on day 14 whereas the relative number of plasmacytoid DCs (pDCs) among all DCs was markedly reduced on day 14. Moreover, we observed upregulation of HLA-DR and CD86 of CD14+/CD16- and in CD14+/CD16+ monocytes and of HLA-DR in CD141-/CD1c+ cDCs and of CD86 in CD141+/CD1c- cDCs. In summary, these data reveal that both RIG-I mRNA and RIG-I FL protein are constitutively expressed in young healthy individuals before vaccination with significant transient changes during the observation period after immunization. Moreover, vaccination led to a significant upregulation of RIG-I mRNA and their respective proteins though RIG-I SF remained markedly elevated on day 14. Furthermore, vaccination was associated with significant upregulation of a series of classical ISGs. These data show that yellow fever vaccination in healthy young adults is associated with significant upregulation of ISGs and their cellular constituents in a scenario to ensure strong IFN responses while restricting toxic and overshooting responses at later time points. Although the regulation of RIG-I is arguably complex, the data obtained in this study indicate that RIG-I SV and RIG-I SF may represent hitherto unrecognized physiologically important negative feedback regulators of the type I IFN response. These data open the possibility to test new therapeutic strategies in diseases with aberrant type I IFN responses to either promote or to inhibit expression of RIG-I SF. In dieser Arbeit wurden Schlüsselparameter des Immunsystems in mononukleären Zellen des peripheren Bluts (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) von 13 gesunden Probanden im Alter von 22-32 Jahren vor und nach einer Impfung mit dem Gelbfieberimpfstoff YF-17D innerhalb eines Zeitfensters von 14 Tagen untersucht. Durch eine Kombination von quantitativer Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) und Western Blot Analysen wurde die Expression der Isoformen des Virussensors Retinoic-acid inducible gene RIG-I full length (RIG-I FL); RIG-I splice variant (RIG-I SV) und RIG-I short form (RIG-I SF), der Typ I Interferon (IFN)-induzierbaren Gene (ISGs) IRF7 (IFN regulatory factor 7; IRF7), ISG15 (ISG15 ubiquitin-like modifier; ISG15), MX1 (MX dynamin-like GTPase 1; MX1) und CXCL10 (C-X-C motif ligand 10; IP-10) untersucht. Zusätzlich wurde die Frequenz zentraler zirkulierender Immunzellen des angeborenen Immunsystems mittels Durchflußzytometrie bestimmt. Die mRNA der Typ I IFN ISGs RIG-I, IRF7, ISG15, MX1 und CXCL10 wurden an den Tagen 3 und 7 signifikant induziert und kehrten am Tag 14 zum Ausgangsniveau zurück; vor der Impfung (Tag 0) wurde das RIG-I FL Protein, nicht aber die RIG-I SV oder RIG-I SF Proteine, konstitutiv exprimiert. Am Tag 3 nach der Gelbfieberimpfung zeigte sich ein Anstieg der RIG-I SV und der RIG-I SF Proteine mit einem Gipfel der RIG-I SF am Tag 7 und einem anhaltend signifikant erhöhten Niveau dieser RIG-I Variante am Tag 14. Im Gegensatz zur Regulation von RIG-I zeigte sich bei der Regulation des Virussensors melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA5) Proteins eine Inhibition am Tag 3, 7 und 14, während für das Protein des Virussensors laboratory of genetics and physiology 2 (LGP2) eine ähnliche Kinetik wie bei RIG-I beobachtet werden konnte, d.h. eine Aufregulation an den Tagen 3 und 7 und eine Rückkehr zum Ausgangsniveau am Tag. 14. Die Prozentsätze der Monozyten und dendritischen Zellen (DC) innerhalb der PBMCs sowie der unterschiedlichen Monozyten und DC Subpopulationen wurden am Tag 0, 1, 3, 7 und 14 durchflusszytometrisch bestimmt. Zum Zeitpunkt 7 Tage nach der Impfung konnte in Korrelation mit der höchsten Expression der ISGs eine signifikante relative Reduktion der klassischen cluster of differentiation (CD) 14+/CD16- Monozyten und ein signifikanter Anstieg der inflammatorischen CD14+/CD16+ Monozyten nachgewiesen werden. Weiterhin zeigte sich ein signifikanter Abfall der CD141+ cDCs (konventionelle DCs) am Tag 3 und 7, während CD1c+ cDCs am Tag 14 signifkant anstiegen und die plasmazytoiden DCs (pDCs) am Tag 14 deutlich abfielen. Außerdem konnte sowohl eine Aufregulation von HLA-DR als auch von CD86 bei CD14+/CD16- und bei CD14+/CD16+ Monozyten und von HLA-DR bei CD141-/CD1c+ cDCs und von CD86 bei CD141+/CD1c- cDCs nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass RIG-I FL konstitutiv in PBMCs nichtgeimpfter gesunder Probanden exprimiert wird und seine Expression sich während des Beobachtungszeitraums transient erhöht. Die Impfung mit dem Gelbfieberimpfstoff führt zu einer differentiellen Induktion der RIG-I SV und RIG-I SF Proteine, deren erhöhte Expression auch 14 Tage nach der Impfung, also über den Zeitpunkt der höchsten Expression der ISGs hinaus, anhielt. Da weder RIG-I SV noch RIG-I SF RNA Viren binden, sondern die Stimulation des Virussensors RIG-I durch virale RNA kompetitiv inhibieren, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass eine zu starke Typ I IFN Induktion durch die Induktion der endogenen Inhibitoren des RIG-I Signalwegs (RIG-I SV und RIG-I SF) verhindert werden kann. Diese Daten zeigen erstmals, dass RIG-I SF durch die Gelbfieberimpfung in vivo induziert wird und deshalb als negativer Feedbackmediator von RIG-I FL agieren könnte. Durch die Ergebnisse wird die Hypothese unterstützt, dass in der frühen Immunantwort auf die Gelbfieberimpfung die Typ I IFN Antwort durch die Autoregulation des RIG-I Signalwegs kontrolliert wird. Bei Erkrankungen, die mit einer aberranten Regulation von Typ I IFN einhergehen, könnte die Induktion oder Suppression der RIG-I SF eine bisher unerkannte Interventionsmöglichkeit darstellen.

The present study reveals high levels of the transcription factor HIF-1α in somatotroph pituitary tumors from patients with acromegaly. Further investigation shows that HIF-1α expression under hypoxic conditions increases PKA activity via the transcriptional repression of the PKA regulatory subunit IIβ (PRKARIIβ) through the sequestration of SP1, the major regulator of PRKARIIβ transcription. In primary cultures of somatotroph tumor tissue, hypoxic incubation could blunt the response to octreotide on GH secretion. Further analysis revealed that high HIF-1α expression is associated with lower rates of IGF-1 normalization in patients following treatment with somatostatin analogs. Die vorliegende Studie zeigt gesteigerte Expression des Transkriptionsfaktors HIF-1α im Tumorgewebe von Patienten mit Akromegalie. Es konnte gezeigt werden, dass unter Hypoxie, HIF-1α den Transkriptionsfaktor Sp1 bindet und von dem Promoter der PKA regulatorischen Untereinheit IIβ (PRKARIIβ) sequestriert. In Primärzellkulturen von Tumorgewebe von Patienten mit Akromegalie führte Hypoxie zu einem Wirkungsverlust von SSA auf GH Sekretion. Zudem war eine starke Expression von HIF-1α im Tumorgewebe von Patienten mit Akromegalie mit einem geringeren therapeutischen Effekt auf IGF-1 assoziiert.

We show here that CD4+ T cell immune responses occur within a probabilistic framework, in which T cell receptor avidity to cognate peptide modulates the likelihood of T cells to divide or differentiate. Wir zeigen hier, dass CD4+ T-Zell-Immunantworten in einem probabilistischen Rahmen stattfinden, in dem die T-Zellrezeptor-Avidität zu einem spezifischen Peptid die Wahrscheinlichkeit moduliert mit der sich eine T-Zelle teilt oder differenziert.

Platelets form thrombi at vascular injuries thereby preventing excessive bleeding. Platelets are considered to be immotile, firmly attaching to subendothelial matrix or plasma proteins. By single cell tracking in multicolor platelet reporter mice, we demonstrate autonomous locomotion of activated platelets within their physiological environment. Governed by the local adhesiveness of the microenvironment, platelet migration facilitates the redistribution of individual platelets towards regions of higher adhesiveness, thereby reorganizing thrombi in vivo. Blutplättchen bilden Thromben in verletzten Blutgefäßen und verhindern dadurch starke Blutungen. Man geht davon aus, dass diese Zellen unbeweglich sind und fest an subendotheliale Matrixproteine oder an Plasmaproteine binden. Mit Hilfe einer mehrfarbigen Plättchen-Reportermaus können wir nun zeigen, dass aktivierte Plättchen autonom in ihrer physiologischen Umgebung wandern können. Instruiert durch die Adhäsivität der Umgebung wandern einzelne Plättchen in Bereiche höherer Adhäsivität und tragen dadurch im lebenden Organismus zur Reorganisation von Thromben bei.

We tested the hypothesis that pulmonary exposure to sterile carbon nanoparticles (CNP), a main constituent of urban air pollution, generates an acute inflammatory response by involving the p50 subunit of NFkB1, a pathway generally crucial for inflammatory gene expression in sepsis. Exposing wt and p50-deficinet mice to CNP caused an acute, aseptic neutrophilic alveolitis. While the storm of acute phase cytokines was much more pronounced in p50 mice, no genotype related difference in the number of to the airspace recruited inflammatory leukocytes could be detected. Nuclear profiling of CNP exposed lung however detected NFkB activation only for WT and not p50 mice. Even the activation potential of alveolar macrophages (AM), which are known to be the primary source of inflammatory cytokine production in infected lungs, revealed a rather antiinflammatory skewed phenotype for p50 AMs. Finally our results indicate that inflammatory pathways described for infectious, septic triggers might differ from those during aseptic, sterile inflammation and may thus require further investigations. Die Inhalation von sterilen, Kohlenstoff-Nanoteilchen einem wichtigen Bestandteil urbanen Luftverschmutzung, bewirkt eine lokale Entzündungsreaktion. Da der NFkB Transkriptionsfaktor für septische Entzündungsreaktion bestens beschrieben ist, wurde hier untersucht inwieweit die NFkB p50-Untereinheit für die Ausprägung der aseptischen, Partikelinduzierten Entzündungsreaktion von Bedeutung ist. Partikelexposition von wt und p50-defizienten Mäusen bewirkte in Lungen von Mutanten eine verstärkte Expression und Freisetzung von Akutphase-Cytokinen. Die zelluläre Entzündungsreaktion, d.h. die Akkumulation von Leukozyten im Alveolarbereich war dagegen unabhängig vom Genotyp und NFkB-Aktivierung wurde nur in wt aber nicht p50-Lungen beobachtet. Die Aktivierbarkeit von Alveolarmakrophagen, den Zellen der Cytokinfreisetzung, zeigen ebenfalls einen antiinflammatorischen Phänotyp für p50 Mäuse auf. Die Signalwege der septischen Entzündungsreaktion scheinen damit denen der aseptischen nicht unbedingt zu entsprechen und bedürfen genauerer Untersuchung.

Universal varicella zoster vaccination programs have been adopted by several countries. Policy makers were hoping this would be cost saving to public health providers and society. The aim of this paper is to assess the vaccination program's economic effectiveness in a meta analysis. From payer's perspective, strategy “vaccination program” is not significantly superior to strategy “no vaccination program”. From society's perspective, strategy “vaccination program” is significantly superior. Allgemeine Varizella Zoster Impfungen wurden in einigen Ländern eingeführt. Davon wurden sich Einsparungen für Krankenkassen und die Gesellschaft versprochen. In dieser Arbeit wird die Wirtschaftlichkeit der allgemeinen Varizella Zoster Impfungen in einer Metaanalyse beurteilt. Aus der Perspektive der Krankenkassen ist die Strategie „Allgemeine VZV Impfungen“ nicht signifikant besser als die Strategie „keine allgemeinen VZV Impfungen“. Aus der Perspektive der Gesellschaft ist die Strategie „Allgemeine VZV Impfungen“ signifikant besser.

Bacteria systemically circulating in murine blood have been described to bind blood platelets. In this thesis the interaction of Listeria monocytogenes (L.m.) with blood platelets was examined and how complex-formation altered bacterial clearance from the bloodstream. It was found that circulating L.m. and L.m.-platelet complexes are cleared in the liver by two independent mechanisms, balancing rapid restoration of blood sterility and antigen-targeting to the spleen for the generation of a robust adaptive immune response. Systemisch zirkulierende Bakterien in der Maus binden an Blutplättchen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von Listeria monocytogenes (L.m.) mit Blutplättchen und der Einfluss dieser Interaktion auf die Entfernung von L.m. aus der Blutbahn untersucht. Es wurde gefunden, dass L.m. und L.m.-Blutplättchen-Komplexe in der Leber von zwei verschiedenen Mechanismen aufgenommen werden. Diese gewährleisten, dass ausreichend Bakterien in die Milz gelangen um eine robuste adaptive Immunantwort zu generieren, als auch eine rasche Sterilisierung des Blutes.

The microenvironment of solid tumors (TME) has a significant impact on all stages of tumorigenesis including response to treatment. Cancer associated fibroblasts (CAFs) are the most abundant cells in the TME, and through the secretion of multiple factors, they are known to be key effectors for many of the functions attributed to the TME. IKKβ driven NF-κB activation is a central driver for many inflammation-driven tumors. A pro-inflammatory NF-κB gene signature in CAFs has been suggested to promote tumorigenesis in models of pancreatic, mammary skin cancer. Using an autochthonous model of colitis-associated carcinogenesis (CAC) we provide evidence for a tumor suppressive function of IKKβ /NF-κB in CAFs. Fibroblast restricted deletion of Ikk stimulates intestinal epithelial cell proliferation, suppresses tumor cell death, enhances accumulation of CD4+Foxp3+ Treg cells and promotes angiogenesis ultimately promoting colonic tumor growth. In Ikkβ-deficient fibroblasts transcription of negative regulators of TGFβ signaling including Smad7, Smurf 1 and Smurf2 is impaired causing up-regulation of a TGFβ gene signature and elevated HGF secretion. Overexpression of Smad7 in Ikkβ-deficient fibroblasts prevents HGF secretion and pharmacological inhibition of Met during the CAC model confirms that enhanced tumor promotion is dependent on HGF/Met signaling in mucosa of Ikkβ-mutant animals. Collectively, these results highlight an unexpected tumor suppressive function of IKKβ/NF-κB in CAFs linked to HGF release and raise potential concerns about the use of IKK inhibitors in CRC patients. Die Tumor Mikroumgebung (TMU) spielt in allen Stadien der Tumorentwicklung eine essentiell wichtige Rolle, der Verlauf der Behandlung eingeschlossen. Der Großteil an Zellen in der TMU wird durch krebs-assoziierte Fibroblasten representiert. Durch die Sekretion diverser Faktoren spielen sie eine Schlüsselrolle in der Funktion der TMU. Die Aktivierung von NF-κB durch IKKβ ist ein zentraler Punkt in entzündungs-assoziierten Tumoren. Dadurch unterstützt die entzündungsfördernde NF-κB Signatur in krebs-assoziierten Fibroblasten die Tumorprogression in Modellen von Bauchspeicheldrüßenkrebs und Brustkrebs. Durch die intensive Charakterisierung und Analyse unseres etablierten kolitis-assoziierten Krebs(KAK)-models können wir eine tumorhemmende Funktion der IKKβ/NF-κB Aktivierung in krebs-assoziierten Fibroblasten zeigen. Eine auf Fibroblasten beschränkte IKKβ deletion stimuliert die Proliferation intestinaler Epithelialzellen, die Ansammlung von CD4+Foxp3+ Treg Zellen und die Gefäßneubildung und verringert zusätzlich den Zelltod der Tumorzellen, was letztendlich zur Unterstützung des Darmkrebswachstums beiträgt. In den IKKβ-defizienten Firbroblasten ist die Transkription von negativen Regulatoren von TGFβ, wie Smad7, Smurf1 und Smurf2 beeinträchtigt, was eine Hochregulation von TGFβ zur Folge hat und zu einer erhöhten HGF Sekretion führt. Die Überexpression von Smad7 in IKKβ-defizienten Fibroblasten hingegen, verhindert die HGF Sekretion und die pharmakologische Inhibition von Met während des KAK-models bestätigt, dass eine dramatischere Tumorentwicklung von der HGF/Met Produktion in der Mukosa in IKKβ mutierten Tieren abhängt. Zusammengefasst, zeigen diese Ergebnisse eine unerwartete tumorunterdrückende Funktion von IKKβ/NF-κB in krebs-assoziierten Fibroblasten, die auf die HGF Ausschüttung zurückzuführen ist. Diese Ergebnisse stellen die Behandlung von Patienten mit Dickdarmkrebs mit IKK Inhibitoren in Frage.

Schistosomiasis is a chronic infection caused by parasitic blood flukes (e.g. Schistosoma mansoni). Previous research has demonstrated how S. mansoni-derived soluble egg antigen (SEA) can dampen immune responses. The results presented within this thesis demonstrate that (glyco-)lipids within SEA dampen Toll-like receptor-mediated immune responses, whereas (glyco-)proteins activate the NLRP3 inflammasome and thus IL-1ß production. This SEA-mediated NLRP3 inflammasome activation depends on the Dectin-2/FcRγ receptor complex, spleen tyrosine kinase, Card9 complex, mitochondrial reactive oxygen species and potassium efflux. Further work described in this thesis display the critical role for NLRP3 inflammasome activation during the TH2 polarized immune responses of Schistosomiasis and allergic asthma. Schistosomiasis ist eine chronische Infektion, ausgelöst durch parasitisch lebende Pärchenegel (z.B. Schistosoma mansoni). Untersuchungen haben gezeigt, dass schistosomales Eierantigen (SEA) Immunantworten unterdrückt. Die in dieser Arbeit dargelegten Ergebnisse zeigen, dass im SEA enthaltende (Glyko-)Lipide Toll-like Rezeptor-vermittelte Immunantworten unterdrücken, wohingegen (Glyko-)Proteine das NLRP3 Inflammasom aktivieren, was zur IL-1ß Ausschüttung führt. Die SEA-vermittelte Aktivierung des NLRP3 Inflammasoms ist abhängig vom Dectin-2/FcRγ Rezeptorkomplex, der Milz-Tyrosin-Kinase, dem Card9 Komplex, reaktive Sauerstoffspezies aus dem Mitochondrium und Kaliumsekretion. Darüber hinaus konnte eine entscheidende Rolle des NLRP3 Inflammasoms während TH2 polarisierten Immunantworten der Schistosomiasis und allergischen Asthma aufgezeigt werden.

Recombinant viral MVA vectors are used for vaccination to induce antigen-specific cytotoxic T-cell responses. In this study, MVA expressed ovalbumin as model antigen which, by distinct genetic modifications, was targeted for rapid proteasomal degradation. Degradable ovalbumin induced low CTL responses in primary, but was an optimal inducer in secondary immunizations indicating alternative antigen presentation pathways and offering new options for prime/boost vaccination strategies with MVA. Rekombinante virale MVA Vektoren induzieren als Impfstoffe starke antigen-spezifische zytotoxische T-Zellantworten. In dieser Studie wurden Varianten des Modellantigens Ovalbumin von MVA produziert, welche durch genetische Modifikation einem schnelleren proteasomalen Abbau zugeführt wurden. Schnell degradiertes Ovalbumin induzierte schwache CTL-Antworten im Priming, aber signifikante Sekundärantworten, was auf verschiedene Antigenpräsentationswege hinweist und neue Möglichkeiten für Prime/Boost- Immunisierungsstrategien mit MVA eröffnet.

The novel Streptamer-based "koff-rate assay" enables accurate measurement of TCR-ligand dissociation- (koff-) rates on the surface of living T cells as a crucial parameter determining structural TCR avidity. For latent expressed ligands in chronic CMV infection, the frequency of T cell populations correlated to the mean koff-rates. This correlation indicates an expansion of low avidity T cells with decreased effector functions in response to continuous long-term antigen re-stimulation. Der neuartige Streptamer-basierte "koff-rate assay" ermöglicht eine akkurate Messung der TZR-Liganden Dissoziations- (koff-) Rate auf der Oberfläche von lebenden T Zellen als entscheidenden Parameter der strukturellen TZR Avidität. Für latent exprimierte Liganden in einer chronischen CMV Infektion korrelierte die Frequenz der T Zellen mit den koff-Raten. Diese Korrelation deutet auf eine Expansion von niedrig aviden T Zellen mit verminderten Effektor Funktionen als Antwort auf kontinuierliche Langzeit Antigen Re-Stimulation hin.

Important determinants of persistence and functionality of adoptively transferred T cells are attributed to the original cell phenotype. Therefore, the efficacy of T cell-based therapies might improve by developing strategies to purify defined cell populations. We successfully established a GMP-conform, multi-parameter cell selection strategy allowing to purify a most promising T cell subset (central memory T cells) to highest purities. Wichtige Eigenschaften, die Langlebigkeit und Funktionalität von adoptiv transferierten T-Zellen bestimmen, sind auf den jeweiligen Phänotyp der Ausgangszellen zurückzuführen. Deshalb könnte die Wirksamkeit von T-Zell-basierten Therapien durch Strategien zur Aufreinigung definierter Zellpopulationen verbessert werden. In dieser Arbeit wurde erfolgreich ein GMP-konformes Serienaufreinigungsverfahren zur Isolierung einer vielversprechenden T-Zell-Subpopulation (so genannte zentrale Gedächtnis-T-Zellen) etabliert.

Adoptive transfer of T cells that are engineered with antigen-specific receptors has shown to be effective in different clinical settings, but bear the risk of serious toxicities. A promising strategy to improve the quality and safety of gene-modified cell products is based on co-expression of a truncated cell surface marker derived from the human epidermal growth factor receptor (EGFRt). The aim of this PhD thesis was to evaluate and further develop the EGFRt for clinical cell selection, in vivo tracking and cell depletion. Der adoptive Transfer von T-Zellen, die mit antigen-spezifischen Rezeptoren ausgestattet wurden, zeigte klinische Erfolge, ist jedoch mit potentiell gefährlichen Nebenwirkungen assoziiert. Um die Qualität und Sicherheit von genmodifizierten Zellen zu verbessern, verfolgen wir die vielversprechende Strategie, eine trunkierte Version des humanen EGF Rezeptors (EGFRt) als Oberflächenmarker auf den Zellen zu exprimieren. Ziel dieser Doktorarbeit war es, den EGFRt im Hinblick auf klinische Zellsortierung, in vivo Monitoring und Zelldepletion weiterzuentwickeln.

Reprogramming of T cell specificity by T cell receptor (TCR)-transfer for therapeutic application represents a promising new approach for the treatment of cancers. First clinical trials clearly demonstrate this. The goal of this work is the development of novel methods for the isolation of antigen specific TCRs for this purpose. By identification of antigen specific T cells in the naïve repertoire and direct TCR isolation from single cells this goal is achieved. T-Zell-Rezeptor (TZR)-Transfer zur Umprogrammierung der Spezifität von T-Zellen zur therapeutische Verabreichung ist ein vielversprechendes neues Verfahren zu Behandlung von Krebserkrankungen. Erste klinische Studien belegen dies deutlich. Das Ziel dieser Arbeit ist es, neue Methoden zur Isolation antigenspezifischer TZR für diesen Zweck zu entwickeln. Durch Identifikation antigenspezifischer T-Zellen im naiven Repertoire und direkte Isolation des TZR aus Einzelzellen wird dieses Ziel erreicht.

Sphingosin-1-Phosphat (S1P) ist ein in der Evolution hochkonservierter, bioaktiver Metabolit des Sphingosin-Stoffwechsels, der eine bedeutende Rolle bei der Steuerung grundlegender zellulärer Funktionen wie Zellwachstum, Überleben, Differenzierung, Migration, Lymphozyten-Trafficking, Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität und Angiogenese spielt. S1P wird durch die von den beiden Sphingosin-Kinasen 1 (Sphk1) und 2 (Sphk2) katalysierte Phosphorylierung von Sphingosin gebildet. Extrazelluläres S1P vermittelt seine Signalwirkung durch Bindung an fünf verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, die mit S1P1-S1P5 bezeichnet werden, und reguliert dadurch eine Vielzahl biologischer Effekte. Zusätzlich zur Signalweiterleitung über die Bindung an die in der Plasmamembran vorkommenden S1P-Rezeptoren, kann S1P auch innerhalb der Zelle als sekundärer Botenstoff fungieren und somit zelluläre Antworten beeinflussen. Bis zum jetzigen Zeitpunkt ist nicht geklärt, ob S1P auch bei der Bildung und Reifung der Blutplättchen von Beutung ist. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir den Einfluss des S1P/S1P-Rezeptor-Signalweges und der Sphingosin-Kinasen auf die Thrombopoese. Im ersten Teil der Arbeit zeigten wir, dass der S1P1-Rezeptor von zentraler Bedeutung bei der Blutplättchenbildung ist, da ein Fehlen des Rezeptors im hämatopoetischen System oder spezifisch in der megakaryozytären Zellreihe der Maus zu einer Thrombozytopenie führt. Weiterhin zeigten wir zum ersten Mal, dass der zwischen Blut und Gewebe existierende S1P-Konzentrationsgradient sowohl die treibende Kraft für die Steuerung der gerichteten Bewegung von langen, zytoplasmatischen Zellausläufern der Megakaryozyten (Proplättchen), dem S1P-Gradienten folgend, in die Blutsinusoide ist, als auch für die Abschnürung von Proplättchen oder plättchenartigen Partikeln vom Megakaryozytenstamm innerhalb des Blutstroms. Mäuse, denen die S1P1-Expression im hämatopoetischen System fehlt, entwickeln demzufolge eine schwere Thrombozytopenie (1) aufgrund einer fehlgesteuerten Bildung von extravaskulären Proplättchen im Kochenmarksinterstitium und (2) aufgrund einer gestörten intravaskulären Abschnürung der Proplättchen. Im zweiten Teil der Arbeit zeigten wir, dass ein Fehlen der Sphingosin-Kinase 2 im hämatopoetischen System eine Reduktion der Thrombozytenzahlen im peripheren Blut zur Folge hat, was darauf hindeutete, dass die Sphingosin-Kinase 2 ebenfalls ein bedeutende Rolle bei der Thrombopoese spielt. Unsere weiterführenden Untersuchungen zeigten, dass ein Fehlen der Sphk2 eine verzögerte Fragmentierung der Proplättchen oder plättchenartigen Partikel im Blutstrom zur Folge hat, die letztlich für die verminderten Thrombozytenzahlen in Sphk2-Knock-out Mäusen verantwortlich ist. Zusammengefasst konnten wir mit den gewonnenen Erkenntnissen der vorliegenden Arbeit eine neue, noch unentdeckte Funktion des S1P-Systems bei der Proplättchenbildung und Thrombopoese aufzeigen, die neue Therapieoptionen für die Behandlung von Patienten mit Thrombozytopenie ermöglicht. Sphingosin-1-Phosphat (S1P) ist ein in der Evolution hochkonservierter, bioaktiver Metabolit des Sphingosin-Stoffwechsels, der eine bedeutende Rolle bei der Steuerung grundlegender zellulärer Funktionen wie Zellwachstum, Überleben, Differenzierung, Migration, Lymphozyten-Trafficking, Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität und Angiogenese spielt. S1P wird durch die von den beiden Sphingosin-Kinasen 1 (Sphk1) und 2 (Sphk2) katalysierte Phosphorylierung von Sphingosin gebildet. Extrazelluläres S1P vermittelt seine Signalwirkung durch Bindung an fünf verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, die mit S1P1-S1P5 bezeichnet werden, und reguliert dadurch eine Vielzahl biologischer Effekte. Zusätzlich zur Signalweiterleitung über die Bindung an die in der Plasmamembran vorkommenden S1P-Rezeptoren, kann S1P auch innerhalb der Zelle als sekundärer Botenstoff fungieren und somit zelluläre Antworten beeinflussen. Bis zum jetzigen Zeitpunkt ist nicht geklärt, ob S1P auch bei der Bildung und Reifung der Blutplättchen von Beutung ist. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir den Einfluss des S1P/S1P-Rezeptor-Signalweges und der Sphingosin-Kinasen auf die Thrombopoese. Im ersten Teil der Arbeit zeigten wir, dass der S1P1-Rezeptor von zentraler Bedeutung bei der Blutplättchenbildung ist, da ein Fehlen des Rezeptors im hämatopoetischen System oder spezifisch in der megakaryozytären Zellreihe der Maus zu einer Thrombozytopenie führt. Weiterhin zeigten wir zum ersten Mal, dass der zwischen Blut und Gewebe existierende S1P-Konzentrationsgradient sowohl die treibende Kraft für die Steuerung der gerichteten Bewegung von langen, zytoplasmatischen Zellausläufern der Megakaryozyten (Proplättchen), dem S1P-Gradienten folgend, in die Blutsinusoide ist, als auch für die Abschnürung von Proplättchen oder plättchenartigen Partikeln vom Megakaryozytenstamm innerhalb des Blutstroms. Mäuse, denen die S1P1-Expression im hämatopoetischen System fehlt, entwickeln demzufolge eine schwere Thrombozytopenie (1) aufgrund einer fehlgesteuerten Bildung von extravaskulären Proplättchen im Kochenmarksinterstitium und (2) aufgrund einer gestörten intravaskulären Abschnürung der Proplättchen. Im zweiten Teil der Arbeit zeigten wir, dass ein Fehlen der Sphingosin-Kinase 2 im hämatopoetischen System eine Reduktion der Thrombozytenzahlen im peripheren Blut zur Folge hat, was darauf hindeutete, dass die Sphingosin-Kinase 2 ebenfalls ein bedeutende Rolle bei der Thrombopoese spielt. Unsere weiterführenden Untersuchungen zeigten, dass ein Fehlen der Sphk2 eine verzögerte Fragmentierung der Proplättchen oder plättchenartigen Partikel im Blutstrom zur Folge hat, die letztlich für die verminderten Thrombozytenzahlen in Sphk2-Knock-out Mäusen verantwortlich ist. Zusammengefasst konnten wir mit den gewonnenen Erkenntnissen der vorliegenden Arbeit eine neue, noch unentdeckte Funktion des S1P-Systems bei der Proplättchenbildung und Thrombopoese aufzeigen, die neue Therapieoptionen für die Behandlung von Patienten mit Thrombozytopenie ermöglicht.

This thesis describes the development and application of a flow cytometry-based assay for efficient cell-associated detection of 37 of 39 murine chemokines with an emphasis on profiling of pathogen-specific T cells. A limited spectrum was expressed by these T cells and the “T cell chemokine response” was identified as the first step in a cascade of temporally regulated effector activities. Furthermore, aging CD8+ memory T cells (TM) progressively acquire the ability for accelerated XCL1-production and induced CCL1 expression by specific TM identified highly “polyfunctional” subsets. Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung einer auf Durchflusszytometrie basierenden Methode zur effizienten Detektion von nahezu allen Maus-Chemokinen (37 von 39) und die Charakterisierung der Chemokinexpression von pathogen-spezifische T Zellen. Die “T Zell Chemokinantwort” wurde als der erste Schritt in einer zeitlich regulierten Kaskade von Effektoraktivitäten etabliert. Zudem erwarben Gedächtnis-T-Zellen (TM) mit zunehmendem Alter die Fähigkeit der beschleunigten XCL1 Produktion während induzierte CCL1-Exprimierung "hochpolyfunktionale" TM Subpopulationen identifizierte.

T cells are a major component of the adaptive immune system. They recognize peptide antigens in the context of MHC molecules (pMHC) with their T cell receptor (TCR). The efficiency by which a T cell can react to antigen encounter is dependent on functional and structural factors, especially the physical binding strength of the TCR to the pMHC. Since this parameter could not be precisely determined before, we developed a novel assay system for the measurement of TCR binding strengths that is based on a reversible MHC multimer staining technique. Using this assay system we could show that T cell function is to a large degree dependent on TCR binding strength, and took first steps towards the use of highly functional T cells as therapeutic agents. T-Zellen stellen eine Hauptkomponente des adaptiven Immunsystems dar. Sie erkennen mit ihrem T-Zellrezeptor (TCR) Peptidantigene im Kontext von MHC Molekülen (pMHC). Die Effizienz mit der eine T-Zelle auf Antigenkontakt reagieren kann hängt von funktionellen und strukturellen Faktoren ab, insbesondere von der physikalischen Bindungsstärke zwischen TCR und pMHC. Da dieser Parameter bisher nicht präzise bestimmt werden konnte, haben wir eine neue Messmethode zur Bestimmung der TCR-Bindungsstärke entwickelt, die auf reversibler MHC-Multimerfärbung beruht. Mit Hilfe dieser neuen Methode konnten wir zeigen, dass T-Zellfunktion in hohem Masse von der TCR-Bindungsstärke abhängt und haben erste Schritte hin zu einer Nutzung von hochfunktionellen T-Zellen als Therapeutikum unternommen.

Differentiation of CD8 T cells into diverse effector- and memory populations is an important feature of these cells and necessary for the development of protective immunity against pathogens and certain tumors. In this work we analyzed the differentiation of naïve antigen-specific CD8 T cells after adoptive transfer of single cells into wildtype mice. With the help of this novel tool we could show that after activation, a single CD8 T cell harbors the potential to differentiate into all major subsets. Interestingly, we found in addition that the differentiation patterns of transferred and polyclonal endogenous T cells was almost identical in individual mice. This implicates that factors operative during the expansion phase play an important role in the development and shaping of CD8 T cell responses. These results are important for the development of more effective T cell-based vaccines and for adoptive immunotherapy. Differenzierung von CD8 T Zellen in diverse Effektor- und Gedächtnis Populationen ist eine Kerneigenschaft dieser Zellen und ist maßgeblich verantwortlich für den akuten und lang anhaltenden Immunschutz vor Pathogenen und einigen Tumoren. In dieser Arbeit untersuchten wir die Differenzierung naiver CD8 T Zellen mit definierter Antigenspezifität nach adaptivem Transfer einzelner Zellen in Wildtypmäuse. Durch Entwicklung dieses neuen in vivo Einzelzelltransfersystems konnten wir aufzeigen, dass nach initialer Aktivierung aus einer einzelnen CD8 T Zelle Tochterzellen differenzieren, die allen verschiedenen Subtypen angehören. Interessanterweise konnten wir zudem eine immunisierungsabhängige, aber annähernd identische Differenzierung zwischen transferierten Einzelzellen und dem endogenem polyklonalem T Zell Repertoire in individuellen Mäusen beobachten. Daher scheinen Faktoren während der Expansionsphase einen wichtige Rolle auf die Gestaltung einer CD8 Immunantwort auszuüben. Diese Ergebnisse sind insbesondere von Bedeutung für die Entwicklung effektiverer T Zell-basierender Impfstoffe und für adoptive Immuntherapie.

The predominantly on NK cells and CD8+ T cells expressed activating receptor NKG2D binds several structurally diverse ligands, which are poorly expressed on “normal” resting cells, but can become upregulated on tumors and otherwise stressed or infected cells. Until now, only similar redundant stimulatory effects have been described for all NKG2D ligands. With this thesis work we show for the first time that distinct NKG2D ligands (H60 and MICA-8) can also act as strong suppressors on the proliferation of CD8+ and CD4+ T cells independently of NKG2D itself. The inhibition leads to a reversible cell cycle arrest, suggesting a physiologically relevant regulatory function. Our novel findings provide new explanations, how the expression of distinct NKG2D ligands could become a selective advantage for tumor cells. Der vor allem auf NK und CD8+ T-Zellen exprimierte aktivierende Rezeptor NKG2D bindet mehrere strukturell verschiedene Liganden, die nur schwach auf “normalen” ruhenden Zellen exprimiert werden, jedoch auf Tumoren sowie anderweitig gestressten Zellen heraufreguliert werden. Bisher wurden für alle NKG2D Liganden nur ähnliche stimulatorische Effekte beschrieben. Mit dieser Dissertation zeigen wir zum ersten Mal, dass bestimmte NKG2D Liganden (H60 und MICA-8) auch stark supprimierend und unabhängig von NKG2D auf die Proliferation von CD8+ and CD4+ T-Zellen einwirken können. Die Hemmung erfolgt über einen reversiblen Zellzyklusarrest, der eine physiologisch relevante regulatorische Funktion impliziert. Unsere Erkenntnisse liefern neue Erklärungen dafür, wie die Expression bestimmter NKG2D Liganden einen selektiven Vorteil für Tumorzellen darstellen könnte.